JP4854199B2 - 液化酒粕を再発酵して得られる機能性素材 - Google Patents
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Description
(1)液化酒粕を再発酵することを特徴とする機能性素材の製造方法;
(2)さらにプロテアーゼ処理することを特徴とする(1)記載の方法;
(3)(1)または(2)記載の方法により得られる機能性素材;
(4)(3)記載の機能性素材を含む機能性食品、医薬組成物または化粧組成物;
(5)抗酸化、肝機能改善およびアンジオテンシン変換酵素阻害からなる群より選択される機能または効能を有するものである、(3)記載の機能性素材、あるいは(4)記載の機能性食品、医薬組成物または化粧組成物;ならびに
(6)(2)記載の方法により得られる機能性素材を含有する、高血圧の予防または治療に用いられる機能性食品または医薬組成物
を提供するものである。
12.5kg液化酒粕と12.5Lの酵母懸濁液(1.0x108個/ml)を混合する。これに6.25g(酒粕の1/2000量)の酵素剤(グルク100:アマノエンザイム製)を加え、15℃一定で13日間醗酵させた。醗酵終了後、加熱処理(120℃、10分間)を行いドラムドライと凍結乾燥で粉末化した。また、対照として再醗酵前の液化酒粕も同様に粉末化した。
ドラムドライ粉末サンプル0.5gを8%TCA10ml(20倍容)に懸濁後よく攪拌する。室温で30分間抽出後、14000rpm、20分後の遠心上清に含まれる遊離アミノ酸をLC−10A高速アミノ酸分析システム(島津製作所製)により分析した。
酒粕を再発酵することによる抗酸化能を評価するために、以下に示す方法でDPPHラジカル消去能及びSOD様活性を測定した。
粉末サンプル0.5gを50%EtOH(20倍容)10mlに懸濁し、1時間おきに攪拌し3時間室温で抽出後、3000rpm、5分間の遠心分離を行い、0.45μmのフィルターろ過液を測定サンプルとする。以下の組成で抽出サンプルと試薬を混合し、30分後のOD517nmを測定する。
DPPH 125μl
2M 酢酸緩衝液 25μl
99.5%EtOH 475μl
サンプル 500μl
ラジカル消去能(%)算出は以下の計算式で算出する。
消去能(%)=100−(OD517B/OD517A)x100
OD517A:水(コントロール)
OD517B:サンプル
粉末サンプルを5倍容の蒸留水によく懸濁し、14000rpm、20分間の遠心分離後、0.45μmフィルターろ過液を測定サンプルとした。
活性測定は以下に示すフローチャートに従い、行った。
[式1]
(実験方法)
試料には実施例1で調製した酒粕と酒粕再発酵物の凍結乾燥粉末を用いた。脂肪肝を起こすために、全ての群に0.4%のオロチン酸を添加し、飼料中には酒粕及び再発酵粉末を5%添加した。実験動物には、4週齢の雄性Wistarラットを用いた。実験期間は14日間とし、実験試料と水道水は自由摂取とした。実験終了後、エーテル麻酔下にて断頭、頚部より採血、直ちに臓器を摘出し、重量を測定した。血清脂質、肝機能評価、肝臓脂質、糞中代謝物についての分析は、酵素法により比色定量した。
各群とも実験終了時の体重、体重増加量、飼料摂取量に有意な差は認められなかった。また、解剖時の血清の総コレステロール、HDL−コレステロール、リン脂質では有意な差は認められなかったが、血清(VLDL+LDL)コレステロール、動脈硬化指数では、有意に低くなった。GOP、GPTは肝機能評価の指標となっており、GOTでは対照群と比較して再発酵物群で71.4%抑制した。GPTでは酒粕群で44.7%、再発酵物群で50.3%抑制した。GPTはほぼ肝臓特異性であるのに対して、GOTは肝臓以外に心臓、骨格筋に多量に存在する。したがって、GOT、GPTともに低下した再発酵物群には、肝機能障害抑制効果が期待できる。肝臓脂質では、総コレステロールに有意な差は認められなかった。肝臓トリグリセリド、再発酵物群で有意に上昇を抑制した。肝脂肪を呈するトリグリセリドの蓄積を抑制することから、再発酵物は脂肪肝の発症に対して予防効果が期待される。糞中への総コレステロール排出量、総コレステロール排出率では、再発酵物群で有意に高くなった。胆汁酸、胆汁酸排泄率に有意差はなかったが、増加する傾向が見られた。これらは再発酵物の何らかの成分がステロール排泄を促進し、これが血清や肝脂質代謝に関与したことを支持した。本実験では、再発酵物を添加することによって、血清(VLDL+LDL)コレステロールの上昇抑制効果、動脈硬化指数低下作用、肝機能障害抑制効果、肝臓トリグリセリド上昇抑制効果、糞中総コレステロール排泄促進効果が観られた。
酒粕を再発酵することによりアミノ酸含量が大幅に増えることが明らかになった。これに伴いオリゴペプチド含量も増えていることは十分に期待できる。そこで実施例1で調製した酒粕と酒粕再発酵物のドラムドライ粉末に含まれるオリゴペプチドを有効成分とするACE阻害活性の増強の程度を評価した。
50mM Na2BO7と200mM H3BO3を混合して調製したホウ酸緩衝液(pH8.3)にウサギ肺由来ACE(シグマ社)を溶解し、60mU/mLの酵素溶液を調製した。また、Hip−His−Leu[(株)ペプチド研究所]及びNaClを前記ホウ酸緩衝液に溶解し、それぞれの濃度が7.6mM及び608mM(反応液中での終濃度は、それぞれ5mM及び400mMになる)である基質溶液を調製した。1.5mL容量のプラスチックチューブに、試料溶液15μLと酵素溶液50μLとを入れ、37℃で5分間保温した後、基質溶液125μLを加えてよく混合し、37℃で30分間の反応を行なった。その後、10%トリフルオロ酢酸20μLを添加することにより、反応を停止させた。反応停止後、酵素反応により遊離した馬尿酸をHPLCにより定量した。なお、カラムはTSKgel ODS−80TS(4.6mm x 14.6mm; 東ソー社製)を使用し、溶出液として0.1%トリフルオロ酢酸を含む0〜63%のアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配(20分間)を使用し、流速1mL/分の条件で228nmの紫外部吸収を検出することにより実施した。なお、ポジティブコントロールは、試料液15μLの代わりに水15μLを加えて反応し、ネガティブコントロールは、水15μLと10%トリフルオロ酢酸20μLを同時に加えて反応した。
阻害率(%)=[(A−B−C)/(A−C)] X 100
(式中、Aはポジティブコントロールの馬尿酸ピーク面積、Bは、試料溶液添加の馬尿酸ピーク面積、Cは、ネガティブコントロールの馬尿酸ピーク面積を示す)
により算出した。また、阻害率が50%になる試料濃度(mg/mL)をIC50値で表した。
一般的にACE阻害物質は、オリゴペプチドである場合が多く報告されている。そこで、ACE阻害活性を更に高めることを目的として、各種市販プロテアーゼ剤について検討した。
実施例1で調製した酒粕と酒粕再発酵物のドラムドライ粉末25mgに40倍容の水1mLを加え、この懸濁液に粉末サンプルの1/50量(0.5mg)のプロテアーゼ剤を添加後、50℃、24時間反応させ、100℃、30分間酵素失活処理を行い、14000rpm、10分間の遠心上清を阻害活性測定に用いた。なお、表7で示す酵素剤は、P−1、2はエイチビィアイ(株)、P−3、4は天野エンザイム(株)、P−5、6、7は新日本化学工業(株)より購入した。
プロテアーゼ剤の添加時期及び反応条件により、その効果に影響がどの程度生じるのか検討した。
以下に示す2種類の方法で酒粕再発酵物を調製した。
≪調製法1≫
50g液化酒粕と50mLの酵母懸濁液(1.0x108個/ml)を混合する。これに25mg(酒粕の1/2000量)の酵素剤(グルク100:アマノエンザイム製)と1g(酒粕の1/50量)のプロテアーゼ剤を加え、25℃で1日、15℃で更に4日間醗酵させた。醗酵終了後、加熱処理(120℃、10分間)を行い凍結乾燥で粉末化した。また、対照として再醗酵前の液化酒粕も同様に粉末化した。ACE阻害活性のIC50は、この粉末を任意の濃度で100℃、3分間熱水抽出後の遠心上清を測定することにより算出した。
≪調製法2≫
プロテアーゼ剤を再発酵時に添加しないこと以外は、調製法1と同様に行い凍結乾燥粉末を得た。この粉末25mgに40倍容の水1mLを加え、更に粉末サンプルの1/50量(0.5mg)のプロテアーゼ剤を添加後、50℃、24時間反応させ、100℃、30分間酵素失活処理の遠心上清のACE阻害活性を同様に測定した。
また、今回の調製法では、初日の醗酵温度を25℃にすることにより酵母の活性化をもたらし、大幅に醗酵期間を短縮できることも確認できた。
実施例5において、酒粕再発行物の1/50量のプロテアーゼ剤で処理することにより、明らかなACE阻害活性増強効果が確認できた。そこで次に、製造コストを考慮してプロテアーゼ剤添加量とACE阻害活性の関係について検討した。
Claims (1)
- 液化酒粕を再発酵することにより得られる機能性素材を含む、抗酸化用の医薬組成物または化粧組成物であって、機能性素材が、醗酵終了後加熱処理を行いドラムドライで粉末化したものである医薬組成物または化粧組成物。
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