CN104586904A - 一种同步分离制备锁阳多糖和锁阳黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种同步分离制备锁阳多糖和锁阳总黄酮的方法。本发明的方法首先利用混合酶将锁阳的细胞壁和蛋白类化合物水解，使锁阳黄酮、锁阳多糖充分分散在提取溶剂体系内；然后将混合大孔吸附树脂模拟移动床应用于锁阳黄酮和锁阳多糖的分离。本发明方法对锁阳多糖、锁阳黄酮的提取率大于90％，纯度均达到90％以上，而且在生产过程中使用绿色溶剂，成本低、效率高、环境友好、工艺路线简单，可用作提高免疫力、缓解体力疲劳、抗氧化、抗衰老、提高缺氧耐受力、祛痤疮、祛黄褐斑、改善皮肤水份类药物、保健食品原料或新食品原料。

Description

一种同步分离制备锁阳多糖和锁阳黄酮的方法

技术领域

本发明属天然产物分离技术领域，具体涉及一种同步分离制备锁阳多糖和锁阳黄酮的方法。

背景技术

锁阳为锁阳科(Cynomoraceae)植物锁阳(Cynomorium Songaricum Rupr.)的干燥肉质茎，又名“不老药”、“金不换”、“沙漠人参”等，主要分布于内蒙古、宁夏、新疆、甘肃、青海等西北地区。锁阳味甘、性温，具补肾、助阳、益精、润肠之功效，中医常用于治疗肾阳不足、精血亏虚、腰膝萎软、阳痿滑精、肠燥便秘等。

锁阳多糖和锁阳黄酮是锁阳中最重要的两类活性成分，现代药理学研究表明，锁阳多糖具有提高免疫力，抗氧化，抗衰老，缓解体力疲劳等多种生理活性，黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、抗癌、抗菌等多种生理活性及药理作用。目前关于锁阳多糖和锁阳黄酮提取工艺分离已有一些研究，然而这些研究均是对锁阳中单一类型化合物的提取分离，在提取分离其中一类化合物的同时会造成另一类化合物的损失，对于同步分离制备锁阳多糖和锁阳黄酮方法的系统研究较少。此外，目前采用的锁阳黄酮、锁阳多糖分离纯化工艺普遍存在提取率低、含量低、不易工业化等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同步分离制备锁阳多糖和锁阳总黄酮的方法及工艺，能够高效同步提取分离锁阳多糖和锁阳黄酮，从而弥补现有技术的不足。

申请人在研究中发现，锁阳中除了锁阳黄酮、锁阳多糖外，还有大量的鞣质和蛋白质等，这些成分一方面影响在提取过程中锁阳黄酮和多糖的溶出，从而导致锁阳黄酮和多糖提取率的降低；另一方面，鞣质等水溶性杂质大量溶于提取液中，导致锁阳黄酮、锁阳多糖分离纯化困难，纯度降低。本发明首先利用混合酶将锁阳的细胞壁和蛋白类化合物水解，使锁阳黄酮、锁阳多糖充分分散在提取溶剂体系内；然后将混合大孔吸附树脂(MAR)模拟移动床应用于锁阳黄酮和锁阳多糖的分离。

本发明的同步分离制备锁阳多糖和锁阳黄酮的方法，包括有如下的步骤：

1)将锁阳粉碎，将纤维素酶水溶液加入到粉碎的锁阳中进行提取；所述的酶溶液的pH值为5.0，提取温度为55℃；

2)向步骤1)的提取液静置后过滤，弃去沉淀，得到上清液；

3)将步骤2)的上清液减压浓缩，然后加入到混合MAR模拟移动床进行吸附，流速为5～10BV/h(柱体积，简称BV)，收集吸附残液；吸附结束后，用10～40BV的水进行洗脱，流速为5～10BV/h，收集洗脱液，并与吸附残液合并，将合并液减压浓缩得到锁阳粗多糖溶液；

4)向将上述的锁阳粗多糖中加乙醇，调成体积百分比为70％浓度的乙醇溶液，静置24h，过滤，分离沉淀物，干燥，得锁阳多糖。

5)用10～40BV的70～80％的乙醇对步骤3)的水洗脱后的大孔吸附树脂柱进行洗脱，流速为5～10BV/h，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩、干燥后得到锁阳黄酮产品。

上述步骤1)中纤维素酶用量为5～20U/g，以锁阳的量作为基准；

上述步骤3)MAR模拟移动床是以顺、逆流连续操作方式，通过变换MAR固定床吸咐柱的物料进出口位置，产生相当于吸附剂连续向下移动，而物料连续向上移动的效果。这种吸附柱的配置方式可以使生产能力和分离效率比固定MAR吸附床高，又可避免MAR移动床吸附剂磨损、碎片或粉尘堵塞管道以及固体颗粒缝间的沟流

上述步骤3)中混合MAR模拟移动床中包含有2～4根MAR柱；每根MAR柱之间即可串联也可并联，其中至少有2根MAR柱串联，MAR柱径高比为1:4～1:12。所用MAR柱使用XDA-8、AB-8、D101、LSA-21中的一种或几种以不同比例混合的树脂；

为了获得更好的分离效果，上述步骤3)中的大孔吸附树脂为混合树脂，其中XDA-8：AB-8：LSA-21的质量比为5:1:1。

本发明方法对锁阳多糖、锁阳黄酮的提取率大于90％，纯度均达到90％以上，而且在生产过程中使用绿色溶剂，成本低、效率高、环境友好、工艺路线简单，可用作提高免疫力、缓解体力疲劳、抗氧化、抗衰老、提高缺氧耐受力、祛痤疮、祛黄褐斑、改善皮肤水份类药物、 保健食品原料或新食品原料。

具体实施方式

下面对本发明所涉及的锁阳总黄酮的检测方法记录如下：

A.1方法提要

利用紫外-可见光谱法测定锁阳黄酮提取物中总黄酮的含量，采用Al(NO₃)₃-NaNO₂-NaOH络合体系进行显色。锁阳黄酮提取物以Al(NO₃)₃-NaNO₂-NaOH体系显色后于500nm处可测得总黄酮的吸光度。

A.2仪器

A.2.1紫外-可见分光光度计

A.2.2分析天平(分度值0.0001g)

A.3试剂

A.3.1三氯化铝、亚硝酸钠、氢氧化钠：分析纯

A.3.2水：去离子水或二次蒸馏水

A.3.3乙醇：分析纯 

A.3.4芦丁对照品 

A.4芦丁对照品溶液的制备

取芦丁对照品约20mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，加60％乙醇适量，超声处理使之溶解，放置至室温，加60％乙醇至刻度，摇匀，即得芦丁对照品储备液。

A.5标准曲线的制作

分别精密量取芦丁对照品储备液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0ml置于25mL容量瓶中，用30％乙醇补足至6ml，加5％NaNO₂ 1ml，静置6min，然后加入10％AlNO₃ 1ml，静置6min，最后加入4％NaOH 10ml，30％乙醇定容后静置15min，并在500nm下测定吸光度，以芦丁对照品溶液浓度(x，mg/mL)为横坐标，吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线,得线性回归方程y＝k1x+b1。

A.6供试品溶液的制备

取本品约100mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加60％乙醇适量，超声处理使之溶解，放置至室温，加60％乙醇至25ml，摇匀，即得置于25ml供试品储备液。

A.7测定方法

精密量取2mL供试品储备液，置25ml容量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“用30％乙醇补足至6ml”起依法测定，吸光度记为A1。

A.8锁阳黄酮含量的计算

具体公式如下：

$W\%=\frac{A_1-b_1}{k_1}\×\frac{100\×n}{m}\×100\%$

式中A1为Al(NO₃)₃-NaNO₂-NaOH显色法测得的总黄酮吸光度值，控制在0.2～0.8范围内，如果吸光度超过此范围，则可通过稀释样品溶液来控制，n为样品溶液的稀释倍数。k₁和b₁分别为AlCl₃显色法标准曲线的斜率和截距，W为样品中锁阳黄酮的质量分数(％)，m为样品的称样量(mg)。

锁阳多糖的检测方法记录如下：

B.1方法提要本方法利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，然后利用紫外-可见光谱法在490nm处测定锁阳多糖中总多糖的的吸光度。

B.2仪器

B.2.1紫外-可见分光光度计

B.2.2分析天平(分度值0.0001g)

B.3试剂

B.3.1苯酚、铝片、碳酸氢钠：分析纯

B.3.2水：去离子水或二次蒸馏水

B.3.3乙醇：分析纯 

B.3.4无水葡萄糖对照品

B.3.5浓硫酸：分析纯

B.4对照品溶液的制备称取无水葡萄糖对照品约60mg，置100mL容量瓶中，以水定容至刻度，摇匀，即得对照品母液。精密量取对照品母液5mL于100mL容量瓶中，以水定容至刻度，摇匀，即得对照品储备液。

B.5苯酚溶液的配制精密量取苯酚100g，加入0.1g铝片和0.05g碳酸氢钠，200℃下蒸馏，馏分放冰箱中保存。取馏分4g于100mL量瓶中，水溶解定容至刻度，得4％苯酚溶液(现配现用)。

B.6供试品溶液的制备取本品约30mg，精密称定，置150mL容量瓶中，加水适量，超声处理使溶解，放置至室温，加水至150mL，摇匀，即得150mL供试品储备液。

B.7测定方法精密量取0.5mL供试品储备液(随行对照品：2mL对照品储备液，空白对照：2mL纯水)，置25mL具塞刻度试管中，用纯水补足至2mL，精密加入4％苯酚溶液1mL，摇匀，再迅速加入浓硫酸5mL，摇匀，置40℃水浴中保温30min，取出，冰浴5min，以葡萄糖对照品储备液为对照，相应试剂作空白溶液，于490nm处测定吸光度。

B.8锁阳多糖含量的计算

具体公式如下：

式中：

A——样品吸光度；

A₂——葡萄糖对照品吸光度；

C₂——葡萄糖对照品浓度，mg/mL；

m——样品质量，mg。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述

实施例1：

1)取100g锁阳，粉碎成黄豆粒大小的颗粒，以纤维素酶和α-淀粉酶的复合酶水溶液为提取溶剂，其中纤维素酶用量为15U/g(锁阳)，提取两次。第一次加所取锁阳量的10倍量的溶剂，第二次加 所取锁阳量的8倍量的溶剂，酶解时间均为1h，酶解温度为55℃，PH值为5.0，合并提取液；

2)向步骤1)的提取液静置2h后过滤，弃去沉淀，得到上清液；

3)将上述上清液减压浓缩至0.5mg/mL，分别称取0.1kg XDA-8，0.02kg AB-8，0.02kg LSA-21型大孔吸附树脂在水溶液中均匀混合，湿法装入两根内径5cm、柱高40cm串联的不锈钢柱中，利用泵将锁阳提取液由下端泵入大孔树脂混合柱中进行反复吸附5次，流速为10BV/h，收集吸附残液；吸附结束后，用20BV的水进行洗脱，流速为10BV/h，收集洗脱液，并与吸附残液合并，将合并液减压浓缩至相对密度为1.15(25℃)，得锁阳粗多糖，待用。

4)向将上述的锁阳粗多糖中加乙醇，调成体积百分比为70％浓度的乙醇溶液，静置24h，过滤，分离沉淀物，真空干燥，得锁阳多糖。

5)用20BV的70％的乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，流速为10BV/h，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩、喷雾干燥后得到锁阳黄酮产品。

本发明的方法在第2)步讲锁阳提取物干燥后，按照锁阳黄酮和锁阳多糖的检测方法对其进行检测，最终测得提取物中总黄酮的含量为9.35％，总多糖的含量为14.34％，锁阳提取物干燥后的重量为51.96g，按此计算，所得锁阳总黄酮的量为4.86g，锁阳总多糖的量为7.45g。而按照传统的提取方法对锁阳黄酮和锁阳多糖进行提取(取100g锁阳，粉碎成黄豆粒大小的颗粒，以水为提取溶剂提取三次，第一次加1L，提取2h，第二次和第三次加0.8L，提取2h，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10(25℃)，得到锁阳黄酮和锁阳多糖的提取物。将锁阳提取物干燥后，按照锁阳总黄酮和多糖的检测方法对其进行检测，最终测得提取物中总黄酮的含量为8.72％，总多糖的含量为11.57％，锁阳提取物干燥后的重量为35.22g，按此计算，所得锁阳总黄酮的量为3.07g，锁阳总多糖的量为4.07g。结果表明本发明使用纤维素酶来处理锁阳后，获得的提取物中黄酮的量是传统的提取方法所得黄酮量的1.58倍，是传统的提取方法所得多糖量的1.83倍，因此本发明对锁阳黄酮和锁阳多糖有较高的提取率。

从步骤2制备的锁阳黄酮粗提取物选用步骤3-6处理后，测得最 终锁阳总黄酮产品中黄酮含量为98.7％，锁阳总多糖产品中多糖含量为92.3％；锁阳总黄酮提取物干燥后的重量为4.79g，相比步骤2中锁阳黄酮的转移率为97.3％；锁阳总多糖提取物干燥后的重量为7.75g，相比步骤2中锁阳多糖的转移率为96.0％，因此，利用本发明的分离方法可以很大程度上提高总黄酮和总多糖的纯度，锁阳黄酮的损失只有2.7％，锁阳多糖的损失只有4.0％，。

实施例2：

1)取12kg锁阳，粉碎成黄豆粒大小的颗粒，以纤维素酶和α-淀粉酶的复合酶水溶液为提取溶剂，纤维素酶用量为7U/g(锁阳)，α-淀粉酶用量为60U/g(锁阳)，提取两次,合并提取液。第一次加所取锁阳量的10倍量的溶剂，第二次加所取锁阳量的8倍量的溶剂，酶解时间均为1h，酶解温度为55℃，PH值为5.0；

2)向步骤1)的提取液静置2h后过滤，弃去沉淀，得到上清液；

3)将上述上清液减压浓缩至0.5mg/mL，称取10kg XDA-8，2kg AB-8，2kg LSA-21型大孔吸附树脂在水溶液中均匀混合，湿法装入四根内径30cm、柱高300cm的不锈钢柱中，两组柱子分别串联后与其它一组柱子并联，利用泵将锁阳提取液由下端泵入大孔树脂混合柱中进行反复吸附5次，流速为5BV/h，收集吸附残液；吸附结束后，用20BV的水进行洗脱，流速为10BV/h，收集洗脱液，并与吸附残液合并，将合并液减压浓缩至相对密度为1.15(25℃)，得锁阳粗多糖，待用。

4)向将上述的锁阳粗多糖中加乙醇，调成体积百分比为70％浓度的乙醇溶液，静置24h，过滤，分离沉淀物，真空干燥，得锁阳多糖。

5)用20BV的70％的乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，流速为10BV/h，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩、喷雾干燥后得到锁阳黄酮产品。

按照锁阳总黄酮和多糖的检测方法对其进行检测，测得总黄酮含量为96.2％，总黄酮的转移率为95.3％；测得总多糖含量为91.4％，总多糖的转移率为96.8％。

实施例3:

1)取30kg锁阳，粉碎成黄豆粒大小的颗粒，以纤维素酶和α- 淀粉酶的复合酶水溶液为提取溶剂，纤维素酶用量为10U/g(锁阳)，α-淀粉酶用量为90U/g(锁阳)，提取两次,合并提取液。第一次加所取锁阳量的10倍量的溶剂，第二次加所取锁阳量的8倍量的溶剂，酶解时间均为1h，酶解温度为55℃，PH值为5.0；

2)向步骤1)的提取液静置2h后过滤，弃去沉淀，得到上清液；

3)将上清液减压浓缩至0.5mg/mL(该浓度按原药材计)。称取25kg XDA-8，5kg AB-8，5kg LSA-21型大孔吸附树脂在水溶液中均匀混合，湿法装入两根内径30cm、柱高360cm的串联不锈钢柱中，利用泵将锁阳提取液由上端泵入大孔树脂混合柱中进行反复吸附5次，流速为10BV/h，收集吸附残液；吸附结束后，用20BV的水进行洗脱，流速为10BV/h，收集洗脱液，并与吸附残液合并，将合并液减压浓缩至相对密度为1.15(25℃)，得锁阳粗多糖，待用。

4)向将上述的锁阳粗多糖中加乙醇，调成体积百分比为70％浓度的乙醇溶液，静置24h，过滤，分离沉淀物，真空干燥，得锁阳多糖。

5)用20BV的75％的乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，流速为10BV/h，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩、喷雾干燥后得到锁阳黄酮产品。

按照锁阳总黄酮和总多糖的检测方法对其进行检测，测得总黄酮含量为97.4％，总黄酮的转移率为94.6％；测得总多糖含量为93.2％，总多糖的转移率为92.1％。

实施例4：

1)取100g锁阳，粉碎成黄豆粒大小的颗粒，以纤维素酶和α-淀粉酶的复合酶水溶液为提取溶剂，纤维素酶用量为5U/g(锁阳)，α-淀粉酶用量为50U/g(锁阳)，提取两次，合并提取液。第一次加所取锁阳量的10倍量的溶剂，第二次加所取锁阳量的8倍量的溶剂，酶解时间均为1h，酶解温度为55℃，PH值为5.0；

2)向步骤1)的提取液静置2h后过滤，弃去沉淀，得到上清液；

3)将上述上清液减压浓缩至0.5mg/mL(该浓度按原药材计)。按照最佳混合树脂的比例分别称取0.14kg AB-8型大孔吸附树脂在水溶液中均匀混合，湿法装入内径10cm、柱高80cm的不锈钢柱中，利用泵将锁阳提取液由下端泵入大孔树脂混合柱中进行反复吸附5 次，流速为10BV/h，收集吸附残液；吸附结束后，用20BV的水进行洗脱，流速为10BV/h，收集洗脱液，并与吸附残液合并，将合并液减压浓缩至相对密度为1.15(25℃)，得锁阳粗多糖，待用。

4)向将上述的锁阳粗多糖中加乙醇，调成体积百分比为70％浓度的乙醇溶液，静置24h，过滤，分离沉淀物，真空干燥，得锁阳多糖。

5)用20BV的80％的乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，流速为10BV/h，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩、喷雾干燥后得到锁阳黄酮产品。

本实施例中的大孔吸附树脂的型号为单一的AB-8型，而且是用一根树脂柱进行分离的，按照锁阳黄酮和多糖的检测方法对其进行检测，测得黄酮含量为75.3％，总黄酮的转移率为64.3％；多糖含量为60.4％，总黄酮的转移率为72.6％，锁阳黄酮、锁阳多糖含量和转移率均小于实施例1。一方面是由于锁阳黄酮是几类黄酮的混合物，由于各类黄酮的功能团不同，因此需要含有不同官能团类型和比例的混合树脂对其进行分离。此外，采用串联模拟移动床对样品进行吸附，在样品吸附的过程中，一根树脂柱的上样过程是从顶部到底部，一根树脂的上样过程是从底部到顶部，属于逆流吸附，更有利于对锁阳黄酮和多糖的选择性吸附。

本发明中所得的锁阳黄酮和锁阳多糖还可以作为原料制成其它口服制剂，包括：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、微囊片剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂等多种剂型。

Claims (5)

1.一种同步分离制备锁阳多糖和锁阳黄酮的方法，包括有如下的步骤：

1)将锁阳粉碎，将纤维素酶水溶液加入到粉碎的锁阳中进行提取；所述的酶溶液的pH值为5.0，提取温度为55℃；

2)向步骤1)的提取液静置后过滤，弃去沉淀，得到上清液；

3)将步骤2)的上清液减压浓缩，然后加入到混合MAR模拟移动床进行吸附，流速为5～10BV/h，收集吸附残液；吸附结束后，用10～40BV的水进行洗脱，流速为5～10BV/h，收集洗脱液，并与吸附残液合并，将合并液减压浓缩得到锁阳粗多糖溶液；

4)向将上述的锁阳粗多糖中加乙醇，调成体积百分比为70％浓度的乙醇溶液，静置24h，过滤，分离沉淀物，干燥，得锁阳多糖；

5)用10～40BV的70～80％的乙醇对步骤3)的水洗脱后的大孔吸附树脂柱进行洗脱，流速为5～10BV/h，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩、干燥后得到锁阳黄酮产品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中纤维素酶用量为5～20U/g，以锁阳的量作为基准。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中混合MAR模拟移动床中包含有2～4根MAR柱；其中至少有2根MAR柱串联，MAR柱径高比为1:4～1:12。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的MAR柱使用XDA-8、AB-8、D101、LSA-21中的一种或几种以不同比例混合的树脂。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的MAR柱使用的树脂为混合树脂，其中XDA-8：AB-8：LSA-21的质量比为5:1:1。