CN102258549A - 一种锁阳提取物在制备治疗女性更年期综合症药物的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及锁阳提取物在制备治疗女性更年期综合症药物的新用途,可有效解决制备治疗更年期综合症的药物,以用于更年期综合症的用药治疗的问题,其解决的技术方案是,取锁阳药材,粉碎成粉,用乙醇浸泡,回流提取二次,合并提取液,滤去药渣,减压回收乙醇至无醇味,用水分散提取液,得药液,调节药液的pH为4.5,过大孔树脂柱,上样量与树脂体积的比例为1∶10,先用水洗脱,继用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收乙醇,浓缩至干,即得锁阳提取物,提取物中总黄酮质量含量按芦丁计为≥71%,本发明方法简单,易制备,所得锁阳提取物总黄酮,有效用于治疗更年期综合症作用的药物,是锁阳提取物的新用途,开拓了锁阳的药用价值,是中药上的创新。
Description
技术领域
本发明涉及医药,特别是一种锁阳提取物在制备治疗女性更年期综合症药物的新用途。
背景技术
锁阳(Cynomorium songaricum Rupr.)是锁阳科(Cynomoriaceae)锁阳属的单科单属单种植物,多寄生于蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺属(Nitraria L.)植物根部,是全寄生种子植物。中医把植物锁阳的去花序干燥茎用做中药锁阳,又名“不老药”、“金不换”和“沙漠人参”等。性温,味甘,归脾、肾、大肠经。具有补肾阳、益精血、润肠通便、养筋之功效,常用于治疗肾阳不足、精血亏虚、不孕、腰膝痿弱、肠燥便秘、神经衰弱等症状。现代药理研究发现锁阳具有增强人体性功能、增强动物免疫功能、清除自由基、抗氧化及抗衰老、耐缺氧、抗应激、抗疲劳、对糖皮质激素具有双向调节作用、抗血小板聚集、润肠通便、抗肿瘤、抗胃溃疡作用及抑制艾滋病病毒的增殖等多种药理作用。锁阳的主要成分是锁阳总黄酮、锁阳多糖等,锁阳总黄酮的药理作用有清除自由基、抗氧化及抗衰老、耐缺氧、抗应激、抗疲劳和增强动物免疫功能等。锁阳性温味甘,补肾但其性温而不燥,其效补而不峻,且锁阳为滋阴补肾,助阳而不伤阴,能平衡阴阳,无论是阳虚还是阴虚皆可用之。临床有报道将锁阳入复方治疗女性更年期综合征,疗效确切,如涩精止遗类中成药“锁阳固精丸”,以锁阳为主药,临床验证其可用于治疗更年期综合征。更年期综合征临床表现常有月经紊乱、烘热汗出、记忆力减退、眩晕耳鸣、心悸失眠、腰背酸困、皮肤蚁行感、情绪不宁等,多属于中医所讲得“热证”。
更年期综合征(Climacteric Syndrome,CS),是妇女常见病和多发病之一。主要是由于卵巢功能逐渐衰退,引起机体内分泌失调、免疫力低下和植物神经紊乱的症候群,导致全身多个系统出现功能以及病理病变。卵巢功能衰退是CS的核心病机和病理基础。目前中老年女性中更年期综合症患病率约为70%,其中约有40%需要治疗,已成为严重影响中老年女性生活质量的主要疾患之一。现代医学认为妇女更年期综合征是由于年龄增长、操劳、产育、体弱多病、卵巢切除或放射治疗等因素,因雌激素水平过度降低引起下丘脑-垂体-卵巢轴或肾上腺功能紊乱所致的神经递质、激素、细胞因子等失衡是更年期发病的主要原因。故神经内分泌免疫与更年期综合征的关系最为密切。更年期综合征患者,卵巢功能衰退,卵巢中的卵泡群明显减少,雌激素水平明显降低。内分泌平衡状况发生变化,可导致下丘脑及植物神经系统功能失调,特别是因植物神经系统功能变化而产生不同程度的临床症状,一般认为症状的出现与雌激素分泌减少的速度和程度相一致。
西医常采用激素替代疗法(Hormon Replacement Therapy,HRT),临床上常用尼尔雌醇、谷维素双维B片、谷维素注射液、复方炔雌醇甲羟孕酮胶囊、复方盐酸普鲁卡因胶囊、戊酸雌二醇、氯烯雌醚滴丸等,HRT虽有很好的疗效,但临床实践发现,长期使用雌激素可增加子宫内膜癌和乳腺癌的发病率。2002年7月,美国国立卫生研究院心脏、肺和血液研究所宣布,妇女健康初始行动(WHI)在健康绝经后妇女中使用雌激素加孕激素的临床试验,由于乳腺癌发病相对风险增加26%,且并无总体益处予以提前终止。除了生殖系统增殖性病变外,近期所发现HRT可增加心脑血管危险性等严重副作用的发生,更是明显限制了此法的临床应用。
中医学对本病的认识已有数千年的历史。《素问·上古天真论》曰:“女子七七,任脉虚,太冲脉衰少,天癸竭,地道不通,故形坏而无子也。”女性进入更年期会发生一系列的生理、病理变化。肾气亏虚,天癸将竭,任冲脉衰,月经出现紊乱,以至绝经。同时,也出现一系列因肾精亏虚而导致的肾水不足,虚火内生的证候。如潮热、汗出、五心烦热、失眠多梦、腰膝酸软等。从中医的观点来看,“肾气衰”是其主要内因,因此补肾就是治疗本病最基本的法则,至今用锁阳提取物治疗更年期综合症未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况,为克服现有技术之缺陷,本发明之目的就是提供一种锁阳提取物在制备治疗女性更年期综合症药物的新用途,可有效解决制备治疗更年期综合症的药物,以用于更年期综合症的用药治疗的问题。
本发明解决的技术方案是,取锁阳药材,粉碎成粉,用乙醇浸泡,回流提取二次,合并提取液,滤去药渣,减压回收乙醇至无醇味,用水分散(稀释)提取液,得药液,调节药液的pH为4.5,过大孔树脂柱,上样量与树脂体积的比例为1∶10(树脂柱径高比为1∶12),先用水洗脱,继用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压回收乙醇,浓缩至干,即得锁阳提取物,提取物中总黄酮质量含量按芦丁(C27H30O16)计为≥71%。
本发明方法简单,易制备,所得锁阳提取物总黄酮,有效用于治疗更年期综合症作用的药物,是锁阳提取物的新用途,开拓了锁阳的药用价值,是中药上的创新。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的实施方式作详细说明。
本发明在具体实施时,取锁阳药材,粉碎成粉,加入药材重量10倍的质量浓度为70%的乙醇(又称为70%乙醇,以下同),浸泡半小时,回流提取两次,第一次1.5h,第二次1h,合并两次提取液,滤去药渣,减压回收乙醇至无醇味,用水分散(稀释)提取液的浓度为0.3g/mL;调节药液的pH为4.5,过D-101型大孔树脂柱,上样量与树脂体积的比例为1∶10(树脂柱径高比为1∶12),先用10倍柱体积水洗脱,继用6倍柱体积10%乙醇洗脱,然后用30%乙醇洗脱,收集30%乙醇洗脱液,减压回收乙醇,浓缩至干,即得锁阳提取物,提取物中总黄酮质量含量按芦丁(C27H30O16)计为≥71%。
本发明提取物总黄酮具有治疗更年期综合症作用,可有效用于制备治疗更年期综合症作用的药物,并经试验得到了充分的证明,有关试验资料如下:
锁阳总黄酮对小鼠更年期模型的影响
1实验材料
1.1实验动物
清洁级小鼠,昆明种,雌性,27~30g,由河北省实验动物中心提供,合格证号1004053。
1.2实验药物
本发明锁阳提取物总黄酮(简称为锁阳总黄酮)。
更年安胶囊,长春英平药业有限公司生产,成份:地黄、熟地黄、泽泻、麦冬、玄参、牡丹皮、茯苓、珍珠母、仙茅、五味子、磁石、首乌藤、钩藤、浮小麦、制何首乌,功能主治:滋阴潜阳,除烦安神,用于更年期潮热汗出,眩晕耳鸣,烦躁失眠,规格:每粒装0.3g,用法用量:口服,一次3粒,一日3次,批号2010020104。大豆异黄酮软胶囊,康乐福(美国)健康事业投资公司生产,成份:每粒含大豆异黄酮50mg、浓缩大豆蛋白粉25mg、维生素D3、乳酸钙、大豆磷脂、大豆油、乳化剂、明胶、甘油、着色剂,规格:每粒500mg,用法用量:口服,一次1粒,一日2次,批号00683209。
1.3实验试剂
水合氯醛,天津市科密欧化学制剂开发中心生产,批号20071018;甲醛,天津市科密欧化学制剂有限公司生产,批号20080110;氯化钠注射液,郑州永和制药股份有限公司生产,批号100923033;注射用头孢唑林钠,珠海联邦制药股份有限公司中山分公司生产,批号90801302;血清雌二醇放射免疫分析药盒,北京普尔伟业生物科技有限公司生产,批号20100423;血清促黄体生成激素放射免疫分析药盒,北京普尔伟业生物科技有限公司生产,批号20100423;血清促卵泡生成激素放射免疫分析药盒,北京普尔伟业生物科技有限公司生产,批号20100423。
1.4实验与仪器
电子分析天平,奥豪斯(上海)公司生产,型号AR1140/C;高速台式离心机,上海安亭科学仪器厂生产,型号TGL-168;小鼠自主活动测试仪,成都泰盟科技有限公司生产,型号ZZ-6;小鼠避暗仪,成都泰盟科技有限公司生产,型号BA-200;电热恒温水浴锅,上海一恒科学仪器有限公司生产,型号HWS12;可调式移液器,Thermo Scientific;智能放免γ测量仪,上海原子核研究所四环仪器一厂生产,型号Sn-895B。
2实验方法
2.1造模与给药
造模方法:取昆明种小鼠84只,雌性,25~28g,随机选出10只为空白组,其他小鼠进行造模:腹腔注射10%水合氯醛(0.033mL/10g)麻醉后腹位固定,然后从小鼠背部最末肋骨下,在腋中线和距脊柱外侧约1cm交叉处剪毛,消毒后切开皮肤和背肌约0.5~1cm,切口视野中可见一乳白色发亮的脂肪团,卵巢即包埋其中。用小镊子轻轻夹住脂肪团拉出切口外,分离脂肪团,即可见到一团细线状不规则呈黄红色的卵巢。剪取时先将卵巢下输卵管(包括脂肪)用细线结扎,再摘除卵巢,术后顺势将子宫角放回腹腔中,缝合肌肉及皮肤,同法摘除双侧卵巢。术后精心饲养,肌肉注射注射用头孢唑林钠(20万单位/mL,每只0.1mL)以防感染,连续3d,每天1次。手术5d后开始逐只进行小鼠阴道涂片检查,每天1次,连续5d,以确定卵巢是否完全切除。涂片呈现动情反应的小鼠弃去不用,选择60只去势完全的小鼠随机均匀分为6组供实验用,分别为模型组,更年安胶囊组,大豆异黄酮软胶囊组,高、中、低剂量锁阳总黄酮组。
给药方法:将以下各药物混悬于蒸馏水中。于手术后第5天给予相应药物。取高、中、低剂量锁阳总黄酮:20mg·mL-1、10mg·mL-1、5mg·mL-1,按400mg·kg-1、200mg·kg-1、100mg·kg-1灌胃(相当于生药临床用量的30倍,15倍,7.5倍);更年安胶囊:33.75mg·mL-1,按675mg·kg-1灌胃(相当于临床用量的15倍);大豆异黄酮软胶囊:12.5mg·mL-1,按250mg·kg-1灌胃(相当于临床用量的15倍);模型组和空白组给予同体积的蒸馏水,给药体积为0.2mL/10g,每天1次,连续21d。
2.2观察项目及检测方法
各组小鼠于给药19天时测定5min内自主活动次数,于给药20-21天时测定小鼠首次进入暗室的潜伏期及5min内进入暗室遭电击的次数。于末次灌胃后2h(禁食15小时),摘眼球取血,分离血清,采用放射免疫法测定血清中E2、LH、FSH的含量;解剖小鼠,摘除胸腺、脾脏、子宫组织,称量其湿重并计算脏器指数(脏器指数=脏器湿重mg/小鼠体重g),然后取脑;将胸腺、脾脏、子宫、脑组织固定于10%甲醛溶液中,石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察各组的组织形态学变化。
2.2.1自主活动次数测试
将各组小鼠放入自主活动仪中,先适应环境1min,然后测定5min内自主活动次数。
2.2.2避暗法测试
将各组小鼠尾部对着进入暗室的小口放入测定盒中,进行训练,24h后重新测定小鼠首次进入暗室的潜伏期及5min内进入暗室遭电击的次数。
2.2.3雌二醇的测定方法
测定原理:本实验采用放射免疫分析方法。先将校准品或样品、标记物和抗体按程序规定依次加入试管中,使标记和非标记抗原与有限量抗体互相竞争结合,待反应平衡后,加入分离剂,离心沉淀,使游离抗原与抗原抗体复合物分离,测量沉淀物的放射性强度。随E2含量增加,其放射性强度则相应降低。
药盒组成:
1.125I-E2,溶液,1瓶,直接使用;
2.E2抗体,溶液,1瓶,直接使用;
3.E2校准品,溶液,7瓶,浓度为0、5、20、80、320、1280、4000pg/mL;
4.免疫分离剂(第二抗体),1瓶;
5.质控血清,溶液,2瓶,含低、高两个剂量。
操作步骤:将圆底聚苯乙烯试管编号(按复管操作),按下表程序操作
E2RIA操作步骤 体积单位:μL
室温15分,3500转/分离心15分钟,吸弃上清,测各管沉淀计数(CPM)
结果计算:以N/T、B/T计算NSB、S0结合百分率,以B/B0计算标准及待测物结合百分率,由自动γ-计数仪器直接读出结果。
2.2.4促黄体生成素的测定方法
测定原理:本实验采用非平衡放射免疫分析方法,使校准品或待测血清中的LH先与抗体进行免疫反应,在反应未达到平衡时加入一定量的125I-LH,使其和非标记的LH对尚未结合的抗体发生竞争性结合。样品中的LH含量越高,尚未结合的抗体就越少,所能结合的125I-LH也就越少。加入分离剂,离心沉淀,使游离抗原与抗原抗体复合物分离,测量沉淀物的放射性强度。随LH含量增加,其放射性强度则相应减少。
药盒组成:
1.LH标记1瓶(冻干品);用10mL蒸馏水溶解。
2.LH抗体1瓶(冻干品);用14mL蒸馏水溶解。
3.分离剂(第二抗体),1瓶。
4.LH标准品7瓶:0、5、10、25、50、100、200mIU/mL。
5.质控血清,2瓶(液体),含低、高两个剂量。
测定方法:将圆底聚苯乙烯试管编号(按复管操作),按下表程序操作
LH RIA操作程序(单位:μL)
混匀,3500转/分离心15分钟,去上清,测各管沉淀计数(CPM)值
结果计算:以N/T、B/T计算NSB、S0结合百分率,以B/B0计算标准及待测物结合百分率,由自动γ-计数仪器直接读出结果。
2.2.5促卵泡生成素的测定方法
测定原理:本实验采用非平衡放射免疫分析方法,使校准品或待测血清中的FSH先与抗体进行免疫反应,在反应未达到平衡时加入一定量的125I-FSH,使其和非标记的FSH对尚未结合的抗体发生竞争性结合。样品中的FSH含量越高,尚未结合的抗体就越少,所能结合的125I-FSH也就越少。加入分离剂,离心沉淀,使游离抗原与抗原抗体复合物分离,测量沉淀物的放射性强度。随FSH含量增加,其放射性强度则相应减少。
药盒组成:
1.125I-FSH1瓶(冻干品),用10mL蒸馏水溶解。
2.FSH抗体1瓶(冻干品),用11mL蒸馏水溶解。
3.FSH标准品7瓶,浓度为:0、2.5、5、10、25、50、100mIU/mL。
4.分离剂(第二抗体),1瓶。
5.质控血清,2瓶(液体),含低、高两个剂量。
操作步骤:将圆底聚苯乙烯试管编号(按复管操作),按下表程序操作
FSH RIA操作程序(单位:μL)
混匀,室温15分钟,4℃3500转/分离心15分钟,去上清,测各管沉淀计数(CPM)值
结果计算:以N/T、B/T计算NSB、S0结合百分率,以B/B0计算标准及待测物结合百分率,由自动γ-计数仪器直接读出结果。
2.3统计学处理方法
结果
1对更年期模型小鼠自主活动的影响
实验各组小鼠自主活动测试结果,见表1。
表1锁阳总黄酮对更年期模型小鼠自主活动的影响
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
由上表可看出,与空白组比,模型组小鼠的活动、站立次数均显著减少(P<0.01),反映了更年期模型小鼠对新鲜环境的好奇程度降低。与模型组比,低剂量锁阳总黄酮可明显提高小鼠活动、站立次数(P<0.05),大豆异黄酮软胶囊、中、高剂量锁阳总黄酮组均可显著提高小鼠的活动次数(P<0.01),以高剂量锁阳总黄酮组效果最好。
2对更年期模型小鼠避暗法潜伏期和受电击次数的影响
实验各组小鼠避暗法测试结果,见表2。
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
由上表可看出,与空白组比,模型组小鼠的受电击次数显著增加(P<0.01),反映了更年期模型小鼠记忆力降低。与模型组比,更年安胶囊、高剂量锁阳总黄酮可明显延长小鼠潜伏期(P<0.05);大豆异黄酮软胶囊、更年安胶囊、低剂量锁阳总黄酮可明显减少小鼠受电击次数(P<0.05),中、高剂量锁阳总黄酮组均可显著减少小鼠受电击次数(P<0.01),以中剂量锁阳总黄酮组效果最好。
3对更年期模型小鼠脏器指数的影响
实验各组小鼠胸腺、脾脏、子宫指数,见表3。
表3锁阳总黄酮对更年期小鼠胸腺、脾脏、子宫指数的影响
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
从上表可以看出,与空白组比,模型组小鼠的子宫指数显著降低(P<0.01),说明摘除卵巢导致更年期模型小鼠子宫萎缩。与模型组比,更年安胶囊、中剂量锁阳总黄酮可明显提高胸腺指数(P<0.05),高剂量锁阳总黄酮可显著提高胸腺指数(P<0.01);大豆异黄酮软胶囊、低剂量锁阳总黄酮可明显提高脾脏指数(P<0.05),更年安胶囊、中、高剂量锁阳总黄酮可显著提高脾脏指数(P<0.01);更年安胶囊可明显提高子宫指数(P<0.05),高、中、低剂量锁阳总黄酮与大豆异黄酮软胶囊可显著提高子宫指数(P<0.01),以高剂量锁阳总黄酮组效果最佳。
4对更年期模型小鼠血清性激素含量的影响
各组小鼠血清中E2、FSH、LH含量,见表4。
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
从上表可以看出,与空白组比,模型组小鼠血清中E2水平显著下降(P<0.01),LH、FSH水平均显著升高(P<0.01),说明摘除卵巢导致更年期模型小鼠血清中的性激素水平紊乱,更年期小鼠模型复制成功。与模型组比,各给药组均可显著升高血清E2水平(P<0.01);中、低剂量锁阳总黄酮与大豆异黄酮软胶囊可明显降低升高的LH水平(P<0.05),更年安胶囊及高剂量锁阳总黄酮可显著降低LH水平(P<0.01);各给药组均可显著降低升高的FSH水平(P<0.01),高剂量锁阳总黄酮组效果较好。
5对更年期模型小鼠器官组织形态的影响
实验各组小鼠子宫、下丘脑、胸腺、脾脏的病理组织学观察结果如下,病理照片见附录1中更年期模型小鼠病理照片。
5.1对更年期模型小鼠子宫组织形态的影响
根据实验各组小鼠子宫内膜出现的不同程度的改变,采用半定量标准,将病理组织形态分为四个级别,对实验各组小鼠子宫进行测定,观察结果见表5。
表5锁阳总黄酮对更年期模型小鼠子宫病理变化的影响 单位:个
“-”子宫内膜上皮细胞、腺体、肌层、浆膜均正常;“+”子宫内膜上皮细胞、腺体少部分萎缩,肌层、浆膜均正常;“++”子宫内膜上皮细胞、腺体部分萎缩,肌层稍变薄,浆膜均正常;“+++”子宫内膜上皮细胞、腺体明显萎缩,肌层部分变薄,浆膜均正常
经Ridit检验,从上表可知,与空白组比,模型组小鼠子宫出现显著的病理组织病变(P<0.01)。与模型组比,各药物均可显著的改善小鼠的病理组织病变(P<0.01),其中高剂量锁阳总黄酮组效果最好。
5.2对更年期模型小鼠下丘脑组织形态的影响
根据实验小鼠下丘脑神经细胞的不同程度的病理改变,采用半定量的标准,将分为四个级别,对实验各组小鼠下丘脑进行测定,观察结果见表6。
表6锁阳总黄酮对更年期模型小鼠下丘脑病理变化的影响 单位:个
“-”下丘脑的脑神经细胞核团的细胞胞浆、细胞体积无异常改变;“+”下丘脑的脑神经细胞核团的少数细胞胞浆减少体积缩小;“++”下丘脑的脑神经细胞核团的部分细胞胞浆减少体积缩小;“+++”下丘脑的脑神经细胞核团的大部分细胞胞浆明显减少体缩小
经Ridit检验,从上表可知,与空白组比,模型组小鼠下丘脑出现显著的病理组织病变(P<0.01)。与模型组比,各给药组均可显著的改善小鼠的病理组织病变(P<0.01),高剂量锁阳总黄酮组效果最好。
5.3对更年期模型小鼠胸腺组织形态的影响
采用测微尺,对实验各组每只小鼠胸腺皮质最厚处和最窄处测定其厚度求得均数,然后用测微尺的基线测得压在基线上的胸腺皮质最厚处和最窄处的淋巴细胞数求得均数,结果见表7。
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
从上表可知,与空白组比,模型组小鼠胸腺皮质厚度与皮质淋巴细胞个数显著减少(P<0.01),说明小鼠造更年期模型后胸腺体积萎缩。与模型组比,各给药组均可显著增厚胸腺皮质,并显著增加皮质淋巴细胞个数(P<0.01),其中中剂量锁阳总黄酮组效果最好。
5.4对更年期模型小鼠脾脏组织形态的影响
采用测微尺的基线落在脾小结上,以中央动脉为中心分别测定两侧的脾小结厚度大小,求均数;同时计算落在基线上两侧的淋巴细胞数的个数,求均数,结果见表8。
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
从上表可知,与空白组比,模型组小鼠脾小结体积与淋巴细胞个数显著降低(P<0.01),说明小鼠造更年期模后脾脏萎缩。与模型组比,大豆异黄酮软胶囊、各剂量锁阳总黄酮均能显著增大脾小结体积(P<0.01);大豆异黄酮软胶囊可明显提高淋巴细胞数量(P<0.05),更年安胶囊、各剂量锁阳总黄酮均能显著提高淋巴细胞数量(P<0.01),并与剂量呈正相关。
Claims (1)
1.一种锁阳提取物在制备治疗更年期综合症药物中的应用,所述的锁阳提取物是,取锁阳药材,粉碎成粉,加入药材重量10倍的70%乙醇,浸泡半小时,回流提取两次,第一次1.5h,第二次1h,合并两次提取液,滤去药渣,减压回收乙醇至无醇味,用水分散提取液的浓度为0.3g/mL,调节药液的pH为4.5,过D-101型大孔树脂柱,上样量与树脂体积的比例为1∶10,先用10倍柱体积水洗脱,继用6倍柱体积10%乙醇洗脱,然后用30%乙醇洗脱,收集30%乙醇洗脱液,减压回收乙醇,浓缩至干,即得锁阳提取物,提取物中总黄酮质量含量按芦丁计为≥71%。
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