CN111084837A - 一种治疗慢传输型便秘的中药组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗慢传输型便秘的中药组合物及其制备方法，属于中药组合物技术领域，所述中药组合物包括以下重量份的组分：当归25～90份、肉苁蓉40～150份、生白术20～100份、桃仁20～60份、枳壳25～100份、厚朴20～70份、蒲黄20～70份、五灵脂25～60份、全瓜蒌25～60份和甘草25～60份。本发明所述中药组合物在治疗便秘的同时注重全身调理，纠正机体亚健康状态，无骤泻之弊。

Description

一种治疗慢传输型便秘的中药组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于中药组合物技术领域，尤其涉及一种治疗慢传输型便秘的中药组合物及其制备方法。

背景技术

由于生活方式的改变、社会老龄化、刺激性泻药的过度使用等因素，便秘的发病率有逐年上升的趋势，严重影响人们的生活质量。慢性功能性便秘分为三种类型，出口梗阻型、慢传输型以及混合型便秘。作为慢性便秘的主要类型之一，慢传输型便秘，越来越受到临床医生和研究者的关注。慢传输型便秘(slow trsnsit constipation,STC)是以胃肠道传输功能障碍为特点的一种便秘，主要表现为大便次数减少、无便意及排便困难，目前病因及发病机制仍不明，可能与多种因素有关，因此临床疗效欠佳。

传统医学认为发病者多为中老年人或体虚者，证多以虚为主，故大多数属中医虚秘范畴，中医从脏腑、气血津液辨证入手，进一步分析便秘产生的病机，目前治疗学说主要是五脏论治及气血津液论治两个方向，气血津液论治学说认为便秘多是脾肺气虚所致，气虚无力推动，血虚肠道失润所致。目前尚没有针对气血虚型慢传输型便秘有效的中药组合物。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种治疗慢传输型便秘的中药组合物及其制备方法。本发明提供的中药组合物针对气血虚型慢传输型便秘，具有很好的治疗效果。

本发明提供了一种治疗慢传输型便秘的中药组合物，包括以下重量份的组分：当归25～90份、肉苁蓉40～150份、生白术20～100份、桃仁20～60份、枳壳25～100份、厚朴20～70份、蒲黄20～70份、五灵脂25～60份、全瓜蒌25～60份和甘草25～60份。

优选的，包括以下重量份的组分：当归30～60份、肉苁蓉50～60份、生白术25～45份、桃仁25～45份、枳壳30～45份、厚朴30～60份、蒲黄30～60份、五灵脂30～45份、全瓜蒌30～45份和甘草30～45份。

优选的，包括以下重量份的组分：当归30份、肉苁蓉60份、生白术30份、桃仁30份、枳壳30份、厚朴30份、蒲黄30份、五灵脂30份、全瓜蒌30份和甘草30份。

本发明提供了所述的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：

1)将当归、肉苁蓉、生白术、桃仁、枳壳、厚朴、蒲黄、五灵脂、全瓜蒌和甘草混合后进行水煎提取、过滤获得提取液；

2)浓缩所述提取液、干燥获得中药组合物。

优选的，所述水煎提取的次数为2～4次。

优选的，每一次水煎提取的时间为50～70min。

优选的，每一次水煎提取时水的质量为中药质量的10～15倍。

优选的，每一次水煎提取时水的质量为中药质量的11～13倍。

优选的，步骤2)中所述的中药组合物为浸膏。

本发明的有益效果：本发明提供的治疗慢传输型便秘的中药组合物，包括当归、肉苁蓉、生白术、桃仁、枳壳、厚朴、蒲黄、五灵脂、全瓜蒌和甘草。本发明所述中药组合物以当归、肉苁蓉共为君药，生白术、桃仁、厚朴、全瓜蒌为臣药，枳壳、蒲黄、五灵脂为佐药，甘草为使药。在养血润肠的同时，强调佐以活血化瘀之法。本发明提供的中药组合物作用缓和，补而不滞，润而不泻。中药组合物中的药物如白术、当归等现代研究证明具有增强机体免疫，促进核酸代谢及抗氧化作用。本发明所述中药组合物在治疗便秘的同时注重全身调理，纠正机体亚健康状态，无骤泻之弊。

附图说明

图1为小鼠结肠组织HE染色结果，正常组×400；

图2为小鼠结肠组织HE染色结果，模型组×400；

图3为小鼠结肠组织HE染色结果，莫沙必利组×400；

图4为小鼠结肠组织HE染色结果，中药组合物高剂量组×400；

图5为小鼠结肠组织HE染色结果，中药组合物中剂量组×400；

图6为小鼠结肠组织HE染色结果，中药组合物低剂量组×400；

图7为Western blot法检测本发明所述中药组合物AQP3表达的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种治疗慢传输型便秘的中药组合物，包括以下重量份的组分：当归25～90份、肉苁蓉40～150份、生白术20～100份、桃仁20～60份、枳壳25～100份、厚朴20～70份、蒲黄20～70份、五灵脂25～60份、全瓜蒌25～60份和甘草25～60份。

在本发明中，所述中药组合物优选的包括以下重量份的组分：当归30～60份、肉苁蓉50～60份、生白术25～45份、桃仁25～45份、枳壳30～45份、厚朴30～60份、蒲黄30～60份、五灵脂30～45份、全瓜蒌30～45份和甘草30～45份。

在本发明的一个具体实施过程中，所述中药组合物包括以下重量份的组分：当归30份、肉苁蓉60份、生白术30份、桃仁30份、枳壳30份、厚朴30份、蒲黄30份、五灵脂30份、全瓜蒌30份和甘草30份。

在本发明的另一个具体实施过程中，所述中药组合物包括以下重量份的组分：当归30份、肉苁蓉60份、生白术25份、桃仁25份、枳壳35份、厚朴30份、蒲黄30份、五灵脂30份、全瓜蒌30份和甘草30份。

在本发明的另一个具体实施过程中，所述中药组合物包括以下重量份的组分：当归60份、肉苁蓉60份、生白术45份、桃仁45份、枳壳45份、厚朴60份、蒲黄60份、五灵脂30份、全瓜蒌30份和甘草30份。

在本发明的另一个具体实施过程中，所述中药组合物包括以下重量份的组分：当归30份、肉苁蓉50份、生白术30份、桃仁30份、枳壳40份、厚朴30份、蒲黄30份、五灵脂30份、全瓜蒌45份和甘草45份。

在本发明中，所述中药组合物包括当归；所述当归：味甘、辛，性温，归肝、心、脾经。当归能补血活血，润肠通便，调经止痛，所述当归为本发明所述中药组合物的君药。当归为补血要药，适于血虚肠燥的虚秘，被历代医家推崇。《医碥》中提出当归治疗血虚肠燥之便秘当为君药，并配以生血药：“虚坐努责，血虚肠燥不能出，当归为君，生血药佐之。”《医门法律》中对当归治疗便秘有如此论述：“大便涩，隔一二日不见，致食少食不下，血中伏火而不得润也，加当归身、生地黄各五分”。《何氏虚痨心传》中认为大便越是干燥越应多用当归：“大便坚，血燥，当归宜多用”。可见，当归在治疗虚秘尤其是血虚秘者有极佳的作用。《本草备要》认为当归“血滞能通，血虚能补，血枯能润，血乱能扶”，可见当归长于治血。《本草新编》中肯定了当归对“燥结”“硬粪”的治疗功能：“功虽无定，然要不可谓非君药……大便燥结，非君之以当归，则硬粪不能下……”。现代药理研究表明，当归的主要功能是促进血红蛋白和红细胞的生成，与传统医学认为当归补血相类似。当归多糖、阿魏酸均是当归中的有效成分。研究表明当归多糖能明显提高小鼠干细胞、粒单系和红系祖细胞的产率，也说明当归有补血的作用。另一个有效成分阿魏酸有抗血小板聚集的作用。在血液流变学研究中发现，阿魏酸降低血浆纤维蛋白原，进一步降低血液粘稠度。当归可以通过抗血小板聚集，改善肠道微循环的方式，增加肠壁供血，提高肠道的传输能力，以此治疗便秘。

本发明提供的中药组合物中包括肉苁蓉，所述肉苁蓉：味甘、咸、性温，归肾、大肠经。补肾阳，益精血，润肠道。肉苁蓉共为君药。《本经逢原》中认为肉苁蓉长于治疗肾阳虚衰之便秘：“肉苁蓉，《本经》主劳伤补中者，是火衰不能生土，非中气之本虚也……老人燥结，宜煮粥食之。”《本草经疏》中指出肉苁蓉用于老年人便秘：“白酒煮烂顿食，治老人便燥闭结。”现代药理学实验证明野生肉苁蓉及肉苁蓉组织细胞培养物组可提高便秘小鼠的小肠推进率。

本发明提供的中药组合物中包括生白术，所述生白术：味苦、甘，性温，归脾、胃经。主要功效为补气健脾，燥湿利水，止汗，安胎。白术为本发明所述中药组合物的臣药，白术发挥补气健脾功效以推动排便。《本草汇要》中强调了白术补益脾胃祛湿的功效：“白术，乃扶植脾胃，散湿除痹，消食除痞之要药也。”《本草通玄》中认为白术为补益脾胃气机最好的药物，且白术通过补益脾胃来通降粪便：“补脾胃之药，更无出其右者，土旺则清气善升，而精微上奉浊气善降，而糟粕下降”。《本经逢原》中也强调了白术通过补益脾胃来帮助肠道粪便传输：“白术甘温味厚，阳中之阴，可升可降，入脾、胃二经……补脾胃药以之为君，脾土旺则清气升而精微上，浊气降而糟粕输。”白术健脾益气以助气血生化之源，以助大肠传导之功，符合虚便秘病机。白术对便秘的治疗效果己为临床及实验研究所证实，大剂量白术对胃肠的推进作用有显著的增强作用，现代研究发现，白术主要成分含挥发油、多糖、内酯类化合物等。而其中白术的挥发油能影响胃肠道神经递质，增加SP含量，减少NOS、VIP含量，以促进胃肠蠕动，增加小鼠肠道推进率作用。

本发明提供的中药组合物中包括桃仁，所述桃仁：味苦、甘，性平，归心、肝、大肠经。功能活血祛癖，润肠通便。桃仁共为本发明所述中药组合物的臣药，以发挥活血润肠通便的作用。《珍珠囊》中认为桃仁长于活血润肠：“治血结、血秘、血燥，通润大肠，破蓄血”。《本草衍义补遗》认为桃仁的药性“苦重于甘，阴中阳也。治大便血结、血秘、血燥，通润大便，破血不可无”。在现代研究中，发现桃仁润肠通除润肠通便的作用之外，还有抗肿瘤、保护呼吸系统、心血管保护、神经保护、免疫调节等作用。

本发明提供的中药组合物中包括枳壳，所述枳壳：味苦、辛、酸，微寒。归脾、胃经。《本草纲目》中有云：“枳实、枳壳，气味功用俱同，……，大抵其功皆能利气，气下则疲喘止，气行则痞胀消，气通则痛刺止，气利则后重除，故以积实利胸隔，枳壳利肠胃，然张仲景治胸痹痞满，以枳实为要药，诸方治下血痔痢，大肠秘塞，里急后重，又以枳壳为通用，则枳实不独治下，而枳壳不独治高也。”《医学启源·主治秘诀》认为枳壳“破心下坚痞，利胸中气，化痰，消食”，可见其理气宽中之力强而不破气，对于通导行滞确有其功。枳壳的现代研究中，它对胃肠平滑肌有双向调节作用；增强机体心肌的收缩和泵血能力，增加心血输出量，加强心肌活力，升高血压；利尿等作用。

本发明提供的中药组合物中包括厚朴，所述厚朴：苦、辛，性温，脾经、胃经、大肠经。功能行气消积，燥湿除满，降逆平喘食积气滞，腹胀便秘。厚朴为消除胀满的要药，在本发明所述中药组合物中为佐药，用力推动大肠气机，解除胀满，传输糟粕。

本发明提供的中药组合物中包括蒲黄和五灵脂；所述蒲黄：甘，平，归肝、心包经，止血，化瘀，通淋。五灵脂：甘、温，入肝、脾经，功用活血散瘀，炒炭止血。二者为佐药。《本草纲目》中认为蒲黄长于止痛：“凉血活血，止心腹诸痛。”五灵脂与蒲黄为临床常用对药：二者皆活血祛淤，二药生品相伍为用有通利血脉、祛淤止痛之功。便秘患者多夹瘀，方中用二者对药祛淤止痛。现代研究表明蒲黄有扩张血管、抗血小板聚集、止血、镇痛、抗菌消炎的作用。

本发明所述中药组合物中包括瓜蒌，所述瓜蒌：性寒，味甘、微苦，归肺、胃、大肠经。功用清热涤痰，宽胸散结，润肠。瓜蒌长于宽胸散结，肺与大肠相表里。本发明所述中药组合物方中用其梳理肺气之功调解大肠气机。

本发明所述中药组合物中包括甘草，所述甘草：味甘、性平，归心、脾、胃经。能补脾益气，润肺止咳，缓急止痛，缓和药性。甘草为本发明所述中药组合物中使药，用以调和药性。《冉氏本草》认为甘草有刺激肠内分泌的作用：“盖甘草能增加分泌，易使附着痰沫咳出，能刺激肠壁蠕动，使大便缓缓而下。”关于甘草的现代研究认为，水煎液还能松弛肠道，提高机体免疫力，此外，甘草还有抗炎、稳定心律、镇咳的功能。

本发明对所述中药组合物中的各种中药的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售中药即可。

本发明提供了所述的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：1)将当归、肉苁蓉、生白术、桃仁、枳壳、厚朴、蒲黄、五灵脂、全瓜蒌和甘草混合后进行水煎提取、过滤获得提取液；2)浓缩所述提取液、干燥获得中药组合物。

在本发明中，将当归、肉苁蓉、生白术、桃仁、枳壳、厚朴、蒲黄、五灵脂、全瓜蒌和甘草混合后进行水煎提取、过滤获得提取液。在本发明中，所述水煎提取的次数优选为2～4次，更优选为3次；每一次水煎提取的时间优选为50～70min，更优选为60min。在本发明中，每一次水煎提取时水的质量优选为中药质量的10～15倍，更优选为11～13倍，最优选为12倍。在本发明中，每一次水煎提取后进行过滤，获得提取液；然后将多次水煎提取获得的提取液合并。本发明对所述过滤没有特殊限定，采用本领域常规的过滤方式即可。

本发明在获得所述提取液后，浓缩所述提取液、干燥获得中药组合物。在本发明中，所述浓缩优选为减压浓缩，所述减压浓缩的温度优选为70～85℃，所述减压浓缩的时间优选为4～6h，更优选为5h。在本发明中，所述减压浓缩优选的在减压浓缩罐中进行。在本发明中，所述干燥优选为减压干燥，所述减压干燥的温度优选为50～65℃，所述减压干燥的时间优选为8～12h，更优选为10h；所述减压干燥优选的在减压干燥箱中进行。在本发明中，所述中药组合物优选为中药浸膏。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

取当归300g、肉苁蓉600g、生白术250g、桃仁250g、枳壳350g、厚朴300g、蒲黄300g、五灵脂300g、全瓜蒌300g、甘草300g，按以下步骤生产：

(1)提取药材，12倍水煎煮提取3次，每次1h，过滤，提取液85℃下减压浓缩5h(减压浓缩罐)，65℃减压干燥10h(减压干燥箱)，即得，出膏率32.6％。

实施例2

取当归300g、肉苁蓉600g、生白术300g、桃仁300g、枳壳300g、厚朴300g、蒲黄300g、五灵脂300g、全瓜蒌300g、甘草300g，按以下步骤生产：

(1)提取药材，12倍水煎煮提取3次，每次1h，过滤，提取液80℃下减压浓缩5h(减压浓缩罐)，60℃减压干燥10h(减压干燥箱)，即得，出膏率31.4％。

实施例3

取当归600g、肉苁蓉600g、生白术450g、桃仁450g、枳壳450g、厚朴600g、蒲黄600g、五灵脂300g、全瓜蒌300g、甘草300g，按以下步骤生产：

(1)提取药材，12倍水煎煮提取3次，每次1h，过滤，提取液85℃下减压浓缩5h(减压浓缩罐)，60℃减压干燥10h(减压干燥箱)，即得，出膏率33.9％。

实施例4

取当归300g、肉苁蓉500g、生白术300g、桃仁300g、枳壳400g、厚朴300g、蒲黄300g、五灵脂300g、全瓜蒌450g、甘草450g，按以下步骤生产：

(1)提取药材，12倍水煎煮提取3次，每次1h，过滤，提取液75℃下减压浓缩5h(减压浓缩罐)，55℃减压干燥10h(减压干燥箱)，即得，出膏率35.1％。

实施例5

药效学实验研究：

一、本发明所述中药组合物对气血虚型慢传输便秘小鼠肠道动力影响研究

材料与方法

实验动物健康KM小鼠96只SPF级，体重18～20g，雌雄各半，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，合格号：SCXK(辽)2015-0001。饲养于长春中医药大学实验动物中心。4只/笼，温度：20～25℃。相对湿度：40％～60％。每日明暗12h/12h，交替照明。自由饮水和饮食。

药品及试剂本发明实施例2制得的本发明所述中药组合物；当归、肉苁蓉缺失样品(制作方法及比例参照本发明实施例2，仅缺少当归、肉苁蓉)；枳壳、蒲黄、五灵脂缺失样品(制作方法及比例参照本发明实施例2，仅缺少枳壳、蒲黄、五灵脂)；阳性对照药：枸橼酸莫沙必利片，规格：1片/5mg，亚宝药业集团股份有限公司，H20090158、0.9％氯化钠注射液：100ml：0.9g、印度墨水：100ml/瓶，北京索莱宝科技有限公司。

实验器材电子天平、灌胃针、解剖台、烧杯、刻度尺。

实验方法将96只小鼠随机分成8组，正常组(Normal Control，NC)、模型组(ModelControl，MC)、本发明所述中药组合物低剂量组(Low Dosage，LD)、本发明所述中药组合物中剂量组(Medium Dosage，MD)、本发明所述中药组合物高剂量组(High Dosage，HD)、莫沙必利组(Positive Control，PC)，当归、肉苁蓉缺失样品组，枳壳、蒲黄、五灵脂缺失样品组，每组各12只，每组雌雄各半。适应3日后，除正常组外各组小鼠皮下注射盐酸吗啡注射液，2.5mg/(kg·d)，连续注射45天。同时用75％酒精棉球擦拭尾部，使血管扩张充血，剪去鼠尾尖端(0.25～0.3cm)，然后将鼠尾伤口浸入37℃左右温水中直至小鼠失去血液约0.15～0.2ml，每周1次，连续4周，复制血虚便秘模型。正常组注射等量生理盐水。隔日测量小鼠体重，根据体重调整注射剂量。

造模结束后第二天开始灌胃给药，按文献(何诚.实验动物学[M].中国农业大学出版社,2006.)制定剂量折算：本发明所述中药组合物低剂量组：生药量4.72g/kg，每日一次。本发明所述中药组合物中剂量组：生药量9.44g/kg，每日一次。本发明所述中药组合物高剂量组：生药量18.88g/kg，每日一次。莫沙必利组：给药剂量为1.15g/kg，每日一次。当归、肉苁蓉缺失样品组及枳壳、蒲黄、五灵脂缺失样品组参照高剂量组给药。正常组、模型组按同体积生理盐水灌胃，每日一次。各组均连续灌胃14日。期间隔日测量小鼠体重，根据体重调整给药剂量。在给药期间，所有小鼠自由摄食与饮水。

每周收集小鼠粪便1次，造模完成后再收集1次，收集粪便前24h每只小鼠单独置于笼中，各饲养笼中放置滤纸，期间自由饮食饮水，收集各笼中小鼠24h粪便，晾干称重。

给药14日结束后，给予各组禁食不禁水24h。禁食24h后，给予每只小鼠印度墨水0.5ml灌胃，灌胃结束同时开始计时30min，用颈椎脱臼法处死各组小鼠。摘除从幽门到肛门的所有肠道，轻轻牵拉肠道，使其拉直，使肠道处于无张力状态。测量幽门至肛门的肠道总长度及肠道推进距离(墨汁距幽门距离即肠道推进距离)。计算肠道推进距离占肠道全长的百分比。按照公式计算肠道推进的百分比，即：肠道推进率＝(肠道推进距离与幽门的距离/肠道总长度)×100％。

采用SPSS22.0软件进行数据统计分析，实验数据均以

表示，采用单因素方差分析和多重比较等。P<0.05具有统计学意义，P<0.01具有高度统计学意义。

实验结果

1.一般情况体征实验过程中，96只小鼠无死亡，说明实验方法安全可靠。模型组较正常组小鼠倦怠少动，背毛翻毛少光泽，粪便粒数较少，呈较小的颗粒状，枳壳、蒲黄、五灵脂缺失样品组表面干燥；本发明所述中药组合物低剂量组、中剂量组、高剂量组、莫沙必利组；较模型组，各组小鼠倦怠少动、背毛翻毛少光泽改善，排便粒数增多，粪便水分增多表面较湿润，粪便呈光滑软便；当归、肉苁蓉缺失样品组较模型组小鼠体征区别不明显，低剂量组及枳壳、蒲黄、五灵脂缺失样品组颗粒状粪便较多，中剂量组、高剂量组、莫沙必利组三组小鼠粪便差异不明显，粪便表面湿润，多呈长条状；8组小鼠饮食水、小便等，无均显著差异。

2.给药前后体重观察给药前，8组小鼠体重无明显差异(P>0.05)。给药后，正常组与模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、‘当归、肉苁蓉缺失样品组’、‘枳壳、蒲黄、五灵脂缺失样品组’、莫沙必利组各组间比较无明显差异(P>0.05)。模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、莫沙必利组各组间比较无明显差异(P>0.05)。详细结果见表1。

表1造模前后各组小鼠体重变化情况(g，

)

3.粪便重量变化给药前，模型组与正常组比较24h平均粪便干重显著减轻(P<0.01)。

给药14日后，与正常组比较，模型组、低剂量组、中剂量组、‘当归、肉苁蓉缺失样品组’、‘枳壳、蒲黄、五灵脂缺失样品组’24h平均粪便干重仍显著减轻(P<0.01)；高剂量组、莫沙必利组24h平均粪便干重减轻(P<0.05)。与模型组比较，本发明所述中药组合物中剂量组24h平均粪便干重增重(P<0.05)；本发明所述中药组合物高剂量组、莫沙必利组24h平均粪便干重增重显著(P<0.01)。详细结果见表2。

表2造模前后小鼠24h平均粪便干重比较(g/24h，

)

注：与正常组比较，※P<0.05；※※P<0.01；与模型组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01。

4.小鼠肠道推进实验模型组与正常组相比较，小鼠肠道推进率显著降低(P<0.01)；与模型组相比较，低剂量组及当归、肉苁蓉缺失样品组无明显差异(P>0.05)，中剂量组及枳壳、蒲黄、五灵脂缺失样品组肠道推进率增高(P<0.05)，高剂量组、莫沙必利组肠道推进率显著增高(P<0.01)；与高剂量组比较，低剂量组及当归、肉苁蓉缺失样品组推进率差异明显(P<0.01)，中剂量组及枳壳、蒲黄、五灵脂缺失样品组推进率有差异(P<0.05)，莫沙必利组推进率作用相似(P>0.05)。详细结果见表3。

表3给药后各组小鼠肠道推进率比较(％，

)

注：与正常组比较，※P<0.05；※※P<0.01；与模型组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与本发明所述中药组合物高剂量组比较，▲P<0.01，▲▲P<0.05。

二、本发明所述中药组合物对慢传输便秘小鼠多机制影响研究

材料与方法

实验动物健康KM小鼠72只SPF级，体重18～20g，雌雄各半，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，合格号：SCXK(辽)2015-0001。饲养于长春中医药大学实验动物中心。4只/笼，温度：20～25℃。相对湿度：40％～60％。每日明暗12h/12h，交替照明。自由饮水和饮食。

实验药品实施例2中制得样品，本发明所述中药组合物。阳性对照药：枸橼酸莫沙必利片，规格：1片/5mg，亚宝药业集团股份有限公司，H20090158。Ach试剂盒，美国R&D(201902015A)；SP试剂盒，美国R&D(201902015A)；NO试剂盒，美国R&D(201902015A)；VIP试剂盒，美国R&D(201902015A)；AQP3(SC-518001)，Santa Cruz(Lot#C1218)；m-IgGk-BP-HRP(SC-516102)，Santa Cruz(Lot#K2818)。

实验仪器STP120型旋转式组织处理机，Microm；Leica RM2255型石蜡切片机，德国Leica公司；Leica EG1140石蜡包埋机，德国Leica公司；OlympusBX51光学显微镜，日本Olympus公司；NIS-ELEMNT BR型图像分析系统，日本NIKON公司；IMS-40型雪花形制冰机，常熟市雪科电器有限公司；ELx800酶标仪，BioTek Instruments,Inc；HC-3618R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；DYY-6C六一电泳仪，北京市六一仪器厂生产；ChemiDoc-It 510Imager，Ultra-Violet Products Ltd生产；FA1004N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司生产；水浴恒温振荡器，太仓市实验设备厂生产；DT5-3型低速台式自动平衡离心机，北京时代北利离心机有限公司；DW-86L386型立式超低温保存箱，青岛海尔特种电器有限公司生产。

实验方法将每只小鼠脱颈椎处死，由腹腔下静脉抽取血液5ml，取部分结肠约5cm，将所取结肠组织分成2段，用生理盐水清洗去除残留物，每段约2.5cm，血液用于Elisa法检测Ach、SP、NO、VIP，一段用于Western blot法检测AQP3，一段用于检测AQP3的HE染色、免疫组化染色分析。将血液标本，4℃静置2h以上，3000rpm离心10min吸取上清液，移至管中，封口，置-80℃冰箱中保存。两段结肠组织标本，一段迅速放入液氮冷冻，后置-80℃冰箱中保存，另一段放入装有10％福尔马林溶液的小瓶中固定。

Elisa法测定本发明所述中药组合物对神经递质Ach、SP、NO、VIP影响。用Elisa法测定小鼠结肠血液中Ach、SP、NO、VIP水平，具体方法按试剂盒说明进行：

标准品的稀释与加样：在根据说明书操作，稀释后各孔加样量都为50μl。

NO：标准品浓度分别为25pg/ml，50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml，400pg/ml。

VIP：标准品浓度分别为15pg/ml，30pg/ml，60pg/ml，120pg/ml，240pg/ml。

Ach：标准品浓度分别为12.5pg/ml，25pg/ml，50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml。

SP：标准品浓度分别为25pg/ml，50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml，400pg/ml。

①加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

②温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。

③配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

④洗涤：轻轻揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。

⑤加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外，再次温育，再次洗涤。

⑥显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光温育10min。

⑦终止：每孔加终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

⑧测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15min以内进行。

HE染色。①脱蜡：组织切片浸入二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；

②梯度乙醇水化(100％、95％、90％、80％)；

③水冲洗；

④苏木精染色：水化后的切片放入苏木精染液中浸5-20min，细胞核染成紫蓝色，自来水冲洗3-5min；

⑤1％盐酸酒精分化5-30s，自来水冲洗1-3min；

⑥弱碱性水溶液返蓝30s-1min，自来水充分冲洗5-10min；

⑦伊红染色：充分水化后的切片直接入伊红染色液中，细胞质染成粉红色5-15min左右；

⑧梯度乙醇脱水(90％、95％、100％)；

⑨二甲苯透明；

⑩中性树胶封片。

免疫组化染色测定本发明所述中药组合物对AQP3的影响。①石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3min。

②根据抗体的要求，对组织进行相应的抗原修复。

③每张切片加1滴或50μl的过氧化氢阻断溶液，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化氢酶的活性。PBS冲洗3次，每次3min。

④除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清，室温下孵育10min。

⑤除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(AQP31：100)，室温下孵育4℃过夜，PBS冲洗3次，每次3min。

⑥除去PBS液，每张切片加1滴或50μlHRP标记的第二抗体，室温下孵育10min。PBS冲洗3次，每次3min。

⑦除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10min。

⑧自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗，返蓝。

⑨切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封封片。

正常组用PBS替代一抗，步骤同前。

Western blot法检测本发明所述中药组合物AQP3的影响。①将组织剪碎后加3ml裂解液(使用前3min加1％蛋白酶抑制剂)在冰上进行匀浆，冰浴静置20min，混匀后4℃，12000rpm离心10min后取上清。

②BCA法测定测定总蛋白浓度，并用蛋白裂解液将各样品的蛋白浓度调平后200μl/份分装-80℃冷藏备用。

③将loading buffer在加样前室温解冻后轻轻摇匀，按loading buffer与蛋白样品1：4的比例混匀后，置于沸水中加热5min，待蛋白样品充分性冷却至室温后，以小于2500rpm离心30s，离心后取适量上清直接加样，进行电泳。

④先将玻璃板固定，凹槽向内，向玻璃板之间注水6ml左右，将两块玻璃板之间注满水，静置20min，观察液面有无降低，如无降低或降低极为有限，则吸除水，开始加分离胶。

⑤根据待测蛋白的分子量选择合适浓度的分离胶，按说明说方法配制分离胶，分离胶配完后静置40-60min(加完分离胶后立即加入异丙醇100μl压平液面破碎气泡)，待分离胶盒异丙醇之间出现明显分界线后，用滤纸吸除异丙醇，加浓缩胶配完后插梳子，静置20-30min。

⑥在电泳内槽中加满电泳液，外槽加电泳液二分之一即可。每孔上样量在10μl，电压80V，20min，当条带到达分离胶后，将电压调至120V(每10分观察一次胶板)，电泳结束后进行转膜，转膜液中浸泡海绵、滤纸，NC膜，平衡10min，转膜顺序：黑色板在下，海绵，3层滤纸、胶板、NC膜、滤纸、海绵、透明板。在冰浴条件下，电压80V，300mA进行转膜，转膜时间100min。

⑦2g脱脂奶粉加40ml TBST配制5％的脱脂奶粉溶液。室温摇床下脱脂奶粉封闭4℃过夜。

⑧过夜后，将膜摇床37℃摇20min，封闭结束后脱脂奶粉溶液和一抗按200:1比例配制，进行37℃摇床孵育2h，摇床上TBST洗膜3次，每次10min。结束后脱脂奶粉溶液和二抗按2000：1配制，37℃摇床孵育1.5h，摇床上TBST洗膜3次，每次10min。

⑨二抗孵育结束后显影按试剂盒说明书配制显影液，将显影液均有滴于膜上，反应2min后进行显影并拍照。

实验结果1.本发明所述中药组合物对神经递质NO的影响模型组与正常组相比NO浓度明显升高(P<0.01)；与模型组比较，本发明所述中药组合物中剂量组、本发明所述中药组合物高剂量组、莫沙必利组各组血液中的NO均下降(P<0.05)；其中，本发明所述中药组合物高剂量组、莫沙必利组各组血液中的NO显著下降(P<0.01)。详细结果见表4。

表4本发明所述中药组合物对神经递质NO的影响(pg/ml，

)

注：与正常组比较，※P<0.05；※※P<0.01；与模型组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01。

2.本发明所述中药组合物对神经递质VIP的影响模型组与正常组相比VIP浓度明显升高(P<0.01)；与模型组比较，本发明所述中药组合物中剂量组、本发明所述中药组合物高剂量组、莫沙必利组各组血液中的VIP均下降(P<0.05)，其中，本发明所述中药组合物高剂量组、莫沙必利组下降显著(P<0.01)。

3.本发明所述中药组合物对神经递质VIP的影响模型组与正常组相比VIP浓度明显升高(P<0.01)；与模型组比较，本发明所述中药组合物中剂量组、本发明所述中药组合物高剂量组、莫沙必利组各组血液中的VIP均下降(P<0.05)，其中，本发明所述中药组合物高剂量组、莫沙必利组下降显著(P<0.01)。见表5。

表5本发明所述中药组合物对神经递质VIP的影响(pg/ml，

)

注：与正常组比较，※P<0.05；※※P<0.01；与模型组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01。

4.本发明所述中药组合物对神经递质SP的影响模型组与正常组相比SP浓度降低(P<0.05)；与模型组比较，本发明所述中药组合物中剂量组、本发明所述中药组合物高剂量组、莫沙必利组各组血液中的SP均显著升高(P<0.01)。见表6。

表6本发明所述中药组合物对神经递质SP的影响(pg/ml，

)

注：与正常组比较，※P<0.05；※※P<0.01；与模型组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01。

4.本发明所述中药组合物对神经递质Ach的影响模型组与正常组相比Ach浓度明显降低(P<0.01)；与模型组比较，本发明所述中药组合物低剂量组、本发明所述中药组合物中剂量组、本发明所述中药组合物高剂量组、莫沙必利组各组血液中的Ach均升高(P<0.05)；其中，本发明所述中药组合物中剂量组、本发明所述中药组合物高剂量组、莫沙必利组各组血液中的Ach显著升高(P<0.01)。见表7。

表7本发明所述中药组合物对神经递质Ach的影响(pg/ml，

)

注：与正常组比较，※P<0.05；※※P<0.01；与模型组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01。

5.小鼠结肠组织HE染色结果HE染色结果见图1～6，其中图1为正常组×400，图2为模型组×400；图3为莫沙必利组×400，图4为中药组合物高剂量组×400，图5为中药组合物中剂量组×400，图6为中药组合物低剂量组×400。可见，正常组结肠组织内杯状细胞分布均匀，未见明显杯状细胞胞浆扩张，未见明显的间质内炎症细胞浸润。模型组结肠组织内杯状细胞胞浆明显扩张，胞浆增大，间质内见较多以淋巴细胞为主的慢性炎症细胞浸润。莫沙必利组结肠组织内杯状细胞分布较为均匀，杯状细胞胞浆扩张程度减轻，局部少量杯状细胞胞浆增大，间质内少见以淋巴细胞为主的慢性炎症细胞浸润。本发明所述中药组合物高剂量组结肠组织内杯状细胞分布较为均匀，杯状细胞胞浆扩张程度减轻，局部少量杯状细胞胞浆增大，间质内少见以淋巴细胞为主的慢性炎症细胞浸润，比较莫沙必利组效果好。本发明所述中药组合物中剂量组结肠组织内杯状细胞分布较为均匀，杯状细胞胞浆扩张程度减轻，局部杯状细胞胞浆增大，间质内少见以淋巴细胞为主的慢性炎症细胞浸润，比较莫沙必利组效果相似。本发明所述中药组合物低剂量组结肠组织内杯状细胞分布较为均匀，杯状细胞胞浆扩张程度减轻，局部杯状细胞胞浆扩张较大、较多，间质内见以淋巴细胞为主的慢性炎症细胞浸润较多，比较莫沙必利组效果差。

6.Western blot法检测本发明所述中药组合物AQP3表达的影响与正常组比较，模型组的相对灰度值显著提高(P<0.01)，说明模型组AQP3含量显著增高。与模型组比较，本发明所述中药组合物中剂量组、本发明所述中药组合物高剂量组、莫沙必利组AQP3相对灰度值均降低(P<0.05)，其中本发明所述中药组合物高剂量组、莫沙必利组AQP3相对灰度值均显著降低(P<0.01)。见图7、表8。

表8AQP3蛋白表达(相对灰度值)比较

注：与正常组比较，※P<0.05；※※P<0.01；与模型组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种治疗慢传输型便秘的中药组合物，其特征在于，包括以下重量份的组分：当归25～90份、肉苁蓉40～150份、生白术20～100份、桃仁20～60份、枳壳25～100份、厚朴20～70份、蒲黄20～70份、五灵脂25～60份、全瓜蒌25～60份和甘草25～60份。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，包括以下重量份的组分：当归30～60份、肉苁蓉50～60份、生白术25～45份、桃仁25～45份、枳壳30～45份、厚朴30～60份、蒲黄30～60份、五灵脂30～45份、全瓜蒌30～45份和甘草30～45份。

3.权利要求1或2所述的中药组合物，其特征在于，包括以下重量份的组分：当归30份、肉苁蓉60份、生白术30份、桃仁30份、枳壳30份、厚朴30份、蒲黄30份、五灵脂30份、全瓜蒌30份和甘草30份。

4.权利要求1～3任意一项所述的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：

1)将当归、肉苁蓉、生白术、桃仁、枳壳、厚朴、蒲黄、五灵脂、全瓜蒌和甘草混合后进行水煎提取、过滤获得提取液；

2)浓缩所述提取液、干燥获得中药组合物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述水煎提取的次数为2～4次。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，每一次水煎提取的时间为50～70min。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，每一次水煎提取时水的质量为中药质量的10～15倍。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，每一次水煎提取时水的质量为中药质量的11～13倍。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述的中药组合物为浸膏。

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