CN103145863A - 酶处理提取锁阳多糖的方法及锁阳多糖抗肿瘤制剂的制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种锁阳多糖的制备方法和锁阳多糖抗肿瘤制剂的制备方法，锁阳多糖主要存在与细胞内或细胞壁中，本发明方法在提取过程中添加酶制剂，可在比较温和的条件下降解细胞壁，并通过高速搅拌造成无细胞壁细胞破碎，促进多糖的释放，达到提高提取率的效果。本发明方法相对于传统的水提醇沉法可使锁阳多糖提取率提高10-65％，并可使锁阳多糖含量提高5-40％。本发明方法工艺简单、提取成本较低，适合于工业化生产。采用本发明所述的方法制备锁阳多糖提取物纯度高，可直接制备锁阳多糖制剂，具有提高免疫力、抗疲劳、抗肿瘤等多种功效，适用于肿瘤患者。

Description

酶处理提取锁阳多糖的方法及锁阳多糖抗肿瘤制剂的制备

技术领域

本发明涉及中药有效成分的提取方法，具体的涉及一种锁阳多糖的制备方法和锁阳多糖抗肿瘤制剂的制备。 

背景技术

锁阳(Cynomorium songaricum Rupr.)，又名铁棒槌、锈铁棒、地毛球、乌兰高腰(蒙语)，是锁阳科(Cynomoriaceae)锁阳属的单科单属单种植物，多寄生于蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺属(Nityaria L)植物根部，全寄生种子植物，主产于甘肃、新疆、青海、宁夏、内蒙古等地，其中尤其以甘肃河西走廊地区分布最广。在中医上，把锁阳植物的去花序干燥茎用做传统的中药锁阳，又名“不老药”等。明代《本草纲目》记述：“锁阳性温，补肾，益精血，润燥养精治痿弱”。《本草原始》：“锁阳补阴血、祛虚火、兴阳固精、强阳益髓”，中医临床用锁阳补阳气，治阳痿精虚，阴衰血竭，老年气弱阴虚等。现代药理学研究证明，锁阳具有清除自由基、调节免疫等多种药理活性。 

多糖是锁阳重要的有效成分，具有提高免疫力，抗衰老，抗疲劳等多种活性。苏韫等研究表明锁阳多糖对D-半乳糖所致衰老模型大鼠脾脏病理变化、脾淋巴细胞免疫功能、自由基代谢相关指标等具有明显改善作用（可参考文献《锁阳对衰老模型大鼠脾淋巴细胞转化能力、脾病理学变化及血清SOD、MDA、NO水平的影响》，＜中国老年学杂志＞，2009年，第8期)。熊正英等研究结果表明锁阳多糖可以提高运动训练大鼠不同组织SOD（超氧化物歧化酶）和CAT(过氧化氢酶)活性，降低MDA（丙二醛）含量，延长大鼠跑台运动至力竭时间，具有抗疲劳作用（可参考文献《锁阳多糖对运动训练大鼠抗氧化水平与运动能力的影响》，＜辽东学院学报＞，2011年，第4期)。本发明人研究表明锁阳多糖 在体外对宫颈癌HeLa肿瘤细胞、结肠癌SW620肿瘤细胞有明显的生长抑制作用。 

目前关于锁阳多糖提取工艺已有较多研究，已公开的发明专利，授权公告号为CN 101580553 B，专利名称为《一种锁阳多糖的制备方法》，该专利的技术以中药锁阳为材料，采用以超声波辅助、微波高效提取锁阳多糖。已公开的发明专利，申请号为201210119296.X，专利名称为《一种从锁阳中制备锁阳萜和锁阳多糖的方法》，该专利的技术是将干燥的锁阳药材粉碎成粒状物进行超临界萃取提取锁阳萜和锁阳多糖。再如本行业的业类技术人员刘晔玮等以浸膏得率和浸膏中多糖质量分数综合评价，利用L₉(3³)正交实验，从水提和醇沉两方面优选锁阳中水溶性多糖的最佳提取工艺条件；（可参考文献《锁阳多糖提取工艺的研究》，＜天然产物研究与开发＞，2006年，1007-1009)。王晋等以锁阳多糖提取率为考察指标对水提醇沉提取锁阳多糖的工艺条件进行优化，锁阳多糖的提取最佳工艺：提取温度为90℃，料液比为1∶10，提取时间为2h；（可参考文献《不同条件对锁阳多糖提取率的影响》，＜内蒙古医学院学报＞，2008年，第6期，540-542)。李贵文等以多糖得率为指标，采用正交试验考察超声提取时间、提取温度、料液质量比、超声波功率４个因素对超声提取锁阳多糖的影响，筛选超声辅助提取锁阳多糖的最佳工艺；（可参考文献《超声辅助提取锁阳多糖的工艺优化》，＜甘肃农业大学学报＞，2011年，第5期，157-160)。罗光宏等采用水提醇沉法，利用L₉(3³)正交试验优选锁阳多糖的提取工艺，用硫酸苯酚比色法对甘肃河西沙区不同地区锁阳中多糖含量进行测定。提取最佳工艺条件为料液比1:15(g/mL)、提取时间90min、提取次数为2次，甘肃河西沙区不同地区锁阳多糖含量差别显著；（可参考文献《甘肃河西沙区锁阳多糖提取工艺优化及含量测定》，＜食品科学＞，2011年，第10期，79-83)。上述方法均对锁阳多糖提取工艺进行研究，为锁阳活性多糖的开发提供科学依据和实验基础，但是在工艺推广至工业化生产上仍存在以下不足：①传统水提法产率较低，提取时间较长，耗能较大，提取成本较高；②微波和超声波辅助提取锁阳多糖有提取时间短，提取率高的特点，但相对成本较高，并且目前适合于工 业生产的设备尚未成熟；③超临界萃取锁阳多糖具有原料利用率高，产品收率高等优点，但设备复杂，运行成本高。 

多糖等植物活性成分通常被包含在植物材料（如细胞壁、果胶等）中，在多糖的提取过程中，使用酶可在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取，达到提高提取率的效果。已授权的发明专利CN 101580553 B，专利名称为《酶法辅助提取蒺藜多糖的方法》，该专利采用酶法(纤维素酶、木聚糖酶及果胶酶)辅助提取蒺藜多糖，可使多糖的提取率比不加酶处理的提高18-40.67％，纯度提高15-42％。已授权的发明专利CN02158188.6，专利名称为《酶处理提取黄芪多糖》，该专利的技术使用纤维素酶、半纤维素酶及蛋白酶提取黄芪多糖，相对于水提醇沉法和微波法，提取速度和提取效率均有明显的提高。但尚未见到酶处理法提取锁阳多糖和锁阳多糖抗肿瘤制剂的报道。 

发明内容

基于上述现有技术存在的缺陷，本发明经试验设计提供一种利用生物酶提取锁阳多糖的方法，该方法工艺简单，可提高锁阳多糖的提取率及其多糖含量，具有条件温和、杂质易除和得率高等优点，可实现锁阳多糖低成本的工业化生产。采用本发明所述的方法制备锁阳多糖提取物纯度高，可直接制备锁阳多糖制剂，具有提高免疫力，抗疲劳、抗肿瘤等多种功效，适用于肿瘤患者。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 

一种酶处理提取锁阳多糖的方法及锁阳多糖抗肿瘤制剂的制备，其特征在于包含以下步骤： 

1)粉碎过筛：将干燥的锁阳粉碎后过60目筛； 

2)浸泡：按质量份数取1份过筛后的锁阳粉末放入带搅拌的提取罐内，添加10-25份的蒸馏水，然后升温至75-90℃，并在75-90℃保温静置15-60分钟； 

3)酶解：浸泡结束后降温至25-55℃后添加酶制剂，并打开搅拌装置，转速调至20-40转/分，25-55℃保温搅拌1-6小时，进行酶解反应； 

4)灭酶和高速搅拌：将浸泡液加热至80-95℃，转速调至120-2000转/分，并保温10-20分钟，使加入的酶制剂变性失活，并通过高速搅拌破碎细胞； 

5)浓缩、醇沉、过滤及干燥：将步骤4)结束后搅拌转速调至10-40转/分，80-95℃保温20-60分钟，随后冷却至室温，过滤，收集滤液；得到的滤液减压浓缩至原质量的40-60%，加入95%乙醇，使溶液中乙醇终浓度为75-85%，静置2-4小时过滤后得到锁阳湿多糖，真空干燥或低温冷冻干燥，然后粉碎，即获得锁阳多糖成品。 

所述步骤3)中酶制剂为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或几种，酶的加入量为锁阳粉末质量5‰-10％；蛋白酶可使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们对原料的结合力，有利于多糖的浸出；纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶水解纤维素、半纤维素和果胶，使植物组织细胞的细胞壁破裂，多糖易从胞内或细胞壁释放。     

一种酶处理提取锁阳多糖的方法及锁阳多糖抗肿瘤制剂的制备，其特征是采用本发明所述的方法制备锁阳多糖提取物纯度高，可加入赋型剂或矫味剂和防腐剂制成抗肿瘤胶囊制剂或抗肿瘤口服液。 

本发明的有益效果是： 

1)锁阳多糖主要存在与细胞内或细胞壁中，本发明方法在提取过程中添加酶制剂，可在比较温和的条件下降解细胞壁，并通过高速搅拌造成无细胞壁细胞破碎，促进多糖的释放，达到提高提取率的效果。本发明方法相对于传统的水提醇沉法可使锁阳多糖提取率提高10-65％，并可使锁阳多糖含量提高5-40％。 

2)本发明方法工艺简单、提取成本较低，适合于工业化生产。 

采用本发明所述的方法制备锁阳多糖提取物纯度高，可直接制备锁阳多糖制剂，具有提高免疫力、抗疲劳、抗肿瘤等多种功效，适用于肿瘤患者。 

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 

实验例1   锁阳多糖对肿瘤细胞的抑制效果实验 

供试细胞：结肠癌SW620细胞和子宫颈癌HeLa细胞 

实验方法：取处于对数生长期的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化、Hank’s液洗涤后，用含10％小牛血清RPMI1640培养液调整细胞至1×10⁵/ml。向96孔培养板各孔中分别加入上述细胞悬液100μl，在5％CO₂、37℃和饱和湿度的培养箱中培养24h后，实验组每孔加入用含10％小牛血清RPMI1640培养液配制的不同浓度的锁阳多糖100μl，对照组每孔加入10％小牛血清RPMI1640培养液100μl，每个浓度设6个复孔，培养72h。终止实验前4h，取培养板，每孔加入5mg/mL MTT试剂20μl，继续培养4h，弃上清，PBS冲洗，加DMSO 100μl，振荡混匀15min，使结晶物充分溶解，酶标仪492nm测值（OD值的大小与活细胞数的多少成线性正比），重复3次，取平均值。按公式“抑制率＝(1-药物孔OD值/对照孔OD值)×100％”，计算体外对SW620细胞和HeLa细胞增殖的抑制率。 

实验结果：锁阳多糖在10-160μg/ml剂量下对SW620细胞和HeLa细胞具有直接抑制作用，而且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强。 

表1锁阳多糖对两种肿瘤细胞的抑制作用 

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不意味对本发明保护范围的限制。 

对比例1： 

将干燥的锁阳粉碎后过60目筛，取1kg锁阳干粉，加入蒸馏水15kg混合，在温度为85℃下提取1.5h，共提取2次，合并2次浸提液过滤，滤液减压浓缩至20kg，在浓缩液中加入95%乙醇，使溶液中乙醇终浓度为80%，混匀后静置4小时离心，沉淀物经冷冻干燥后得到锁阳多糖54.3g，锁阳多糖含量为64.6％。 

实施例1： 

1)将干燥的锁阳粉碎后过60目筛，取1kg锁阳干粉放入带搅拌的提取罐内，添加15kg的蒸馏水，然后升温至75℃静置40分钟。 

2)酶解：浸泡结束后降温至35℃，添加纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶，并打开搅拌装置，转速调至30转/分，35℃保温搅拌2小时，纤维素酶加入量为锁阳粉末质量3％，半纤维素酶加入量为锁阳粉末质量5‰，果胶酶加入量为锁阳粉末质量1％，中性蛋白酶加入量为锁阳粉末质量5‰。 

3)灭酶和高速搅拌：将浸泡液加热至85℃，转速调至200转/分，并保温10分钟。 

4)浓缩及醇沉：步骤4)结束后搅拌转速调至20转/分，85℃保温40分钟，随后冷却至室温过滤，收集滤液；得到的滤液减压浓缩至8kg，加入95%乙醇，使溶液中乙醇终浓度为80%，静置4小时； 

5)过滤及干燥：将步骤4)静置的乙醇沉淀物过滤后得到锁阳湿多糖，沉淀物经冷冻干燥后得到锁阳多糖81.6g，锁阳多糖含量为86.7％。取锁阳多糖干粉100g，加入赋型剂100g，拌匀，按每粒200mg装入空心胶囊，制成锁阳多糖抗肿瘤胶囊制剂。 

实施例2  

步骤同实施例1，不同点为：浸泡结束后添加纤维素酶、木瓜蛋白酶，纤维素酶加入量为锁阳粉末质量8％，木瓜蛋白酶加入量为锁阳粉末质量8‰。得到锁阳多糖71.6g，锁阳多糖含量为84.6％。取锁阳多糖干粉200g溶解于800ml纯化水中，按药物质量要求加入适量矫味剂及防腐剂，摇匀，按10ml规格装瓶，制成锁阳多糖抗肿瘤口服液制剂。 

实施例3 

步骤同实施例1，不同点为：浸泡结束后添加纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，纤维素酶加入量为锁阳粉末质量4％，半纤维素酶加入量为锁阳粉末质量8‰，果胶酶加入量为锁阳粉末质量3％。得到锁阳多糖89.1g，锁阳多糖含量为68.6％。取锁阳多糖干粉150g，加入赋型剂50g，拌匀，按每粒200mg装入空心胶囊，制成锁阳多糖抗肿瘤胶囊制剂。 

实施例4： 

1)将干燥的锁阳粉碎后过60目筛，取1kg锁阳干粉放入带搅拌的提取罐内，添加25kg的蒸馏水，然后升温至80℃静置30分钟。 

2)酶解：浸泡结束后添加纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶，并打开搅拌装置，转速调至30转/分，30℃保温搅拌60分钟，纤维素酶加入量为锁阳粉末质量4％，半纤维素酶加入量为锁阳粉末质量5‰，中性蛋白酶加入量为锁阳粉末质量5‰。 

3)灭酶和高速搅拌：将浸泡液加热至85℃，转速调至300转/分，并保温10分钟。 

4)浓缩及醇沉：步骤4)结束后搅拌转速调至10转/分，85℃保温30分钟，随后冷却至室温过滤，收集滤液；得到的滤液减压浓缩至9kg，加入95%乙醇，使溶液中乙醇终浓度为80%，静置4小时； 

5)过滤及干燥：将步骤4)静置的乙醇沉淀物过滤后得到锁阳湿多糖，沉淀物经冷冻干燥后得到锁阳多糖82.6g，锁阳多糖含量为74.6％。取锁阳多糖干粉180g溶解于720ml纯化水中，按药物质量要求加入适量矫味剂及防腐剂，摇匀，按10ml规格装瓶，制成锁阳多糖抗肿瘤口服液制剂。 

实施例5： 

1)将干燥的锁阳粉碎后过60目筛，取1kg锁阳干粉放入带搅拌的提取罐内，添加15kg的蒸馏水，然后升温至85℃静置40分钟。 

2)酶解：浸泡结束后添加纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶， 并打开搅拌装置，转速调至30转/分，50℃保温搅拌90分钟，果胶酶加入量为锁阳粉末质量2％，木瓜蛋白酶加入量为锁阳粉末质量9‰。 

3)灭酶和高速搅拌：将浸泡液加热至85℃，转速调至200转/分，并保温15分钟。 

4)浓缩及醇沉：步骤4)结束后搅拌转速调至10转/分，85℃保温40分钟，随后冷却至室温过滤，收集滤液；得到的滤液减压浓缩至9kg，加入95%乙醇，使溶液中乙醇终浓度为80%，静置4小时； 

5)过滤及干燥：将步骤4)静置的乙醇沉淀物过滤后得到锁阳湿多糖，沉淀物经冷冻干燥后得到锁阳多糖68.6g，锁阳多糖含量为84.7％。取锁阳多糖干粉120g，加入赋型剂80g，拌匀，按每粒200mg装入空心胶囊，制成锁阳多糖抗肿瘤胶囊制剂。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (3)

1.一种酶处理提取锁阳多糖的方法，其特征在于，所述酶处理提取锁阳多糖的方法包含以下步骤：

1)粉碎过筛：将干燥的锁阳粉碎后过60目筛；

2)浸泡：按质量份数取1份过筛后的锁阳粉末放入带搅拌的提取罐内，添加10-25份的蒸馏水，然后升温至75-90℃，并在75-90℃保温静置15-60分钟；

3)酶解：浸泡结束后降温至25-55℃后添加酶制剂，并打开搅拌装置，转速调至20-40转/分，25-55℃保温搅拌1-6小时，进行酶解反应；

4)灭酶和高速搅拌：将浸泡液加热至80-95℃，转速调至120-2000转/分，并保温10-20分钟，使加入的酶制剂变性失活，并通过高速搅拌破碎细胞；

5)浓缩、醇沉、过滤及干燥：将步骤4)结束后搅拌转速调至10-40转/分，80-95℃保温20-60分钟，随后冷却至室温，过滤，收集滤液；得到的滤液减压浓缩至原质量的40-60%，加入95%乙醇，使溶液中乙醇终浓度为75-85%，静置2-4小时过滤后得到锁阳湿多糖，真空干燥或低温冷冻干燥，然后粉碎，即获得锁阳多糖成品。

2.如权利要求1所述的酶处理提取锁阳多糖的方法，其特征在于，所述酶制剂为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或几种，酶的加入量为锁阳粉末质量5‰-10％。

3.一种利用权利要求1所述的酶处理提取锁阳多糖的方法制备的锁阳多糖用于制备抗肿瘤制剂。