CN115960273A

CN115960273A - 一种模拟移动色谱纯化红缘层孔菌多糖的方法

Info

Publication number: CN115960273A
Application number: CN202211642167.9A
Authority: CN
Inventors: 李良玉; 何天枫; 曹荣安; 李朝阳; 王元开; 林欣梅; 包荣鹏
Original assignee: Mudanjiang Food And Biotechnology Innovation Research Institute Of Heilongjiang Bayi Agricultural Reclamation University; Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Mudanjiang Food And Biotechnology Innovation Research Institute Of Heilongjiang Bayi Agricultural Reclamation University; Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2022-12-20
Filing date: 2022-12-20
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2042-12-20
Also published as: CN115960273B

Abstract

本发明公开了一种模拟移动色谱纯化红缘层孔菌多糖的方法，涉及食品工业领域。该方法包括以下步骤：(1)对红缘层孔菌进行脱脂，除蛋白后，提取得到多糖提取液；(2)利用模拟移动色谱对所述多糖提取液进行纯化，得到纯化液；(3)所述纯化液浓缩后干燥，即得精制红缘层孔菌多糖。利用本发明提供的方法纯化得到的红缘层孔菌多糖，纯度和收率均较高，纯度可达60％～80％，收率可达80～90％，并且本发明纯化得到的红缘层孔菌多糖多糖还具有激活巨噬细胞产生NO的作用。

Description

一种模拟移动色谱纯化红缘层孔菌多糖的方法

技术领域

本发明涉及多糖提取领域，特别是涉及一种模拟移动色谱纯化红缘层孔菌多糖的方法。

背景技术

红缘层孔菌为多孔菌科真菌松生拟层孔菌的子实体，是一种广泛分布的木腐真菌，生长在多种针叶树、阔叶树活立木、倒木、腐朽木上，危害多种阔叶树木，在中国东北地区较为常见，春、夏、秋季均出现。其味微苦、性平，能祛风除湿、解热、强心，无毒，有滋补强壮作用，能补肺益肾、和胃健脾、安神定志、扶正培本，对癌症、脑溢血、心脏病、糖尿病、贫血、肾炎、支气管炎有一定疗效，民间用于治疗矿工“寒腿”病。现代药理学研究证明，该菌提取物有抗菌、调节中枢神经系统、降血糖、调节人体免疫以及抗氧化和清除游离基的作用。目前，由于缺乏先进的提取纯化技术，红缘层孔菌并未进行深入研究，对多糖的利用也不足，造成资源浪费。

目前，多糖提取纯化方法的研究较多，常用的方法有热水提取法、表面活性剂—超声波协同提取法、超临界CO₂萃取法、大孔树脂柱层析法、高速逆流色谱等方法。但现有的方法存在成本高，效率低，纯度不稳定，操作复杂等问题，不能进行产业化生产。大孔吸附树脂柱层析采用的是单柱色谱，为间歇式的操作工艺，溶剂消耗大、树脂利用率低、生产效率低下，已不适宜目前市场竞争的需要，急需高效的工业化红缘层孔菌多糖纯化技术。

模拟移动床色谱(SMB)纯化技术是一种高效的纯化手段，相对于单柱色谱，模拟移动床色谱纯化技术的树脂利用率高，进料量大、洗脱剂用量小，可连续化生产，生产效率较高。目前，尚未见模拟移动床色谱纯化红缘层孔菌多糖技术研究的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种模拟移动色谱纯化红缘层孔菌多糖的方法，以解决上述现有技术存在的问题，利用本发明提供的方法纯化得到的红缘层孔菌多糖，纯度和收率均较高，并且本发明纯化得到的多糖还具有激活巨噬细胞产生NO的作用。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种模拟移动色谱纯化红缘层孔菌多糖的方法，包括以下步骤：

(1)对红缘层孔菌进行脱脂，除蛋白后，提取得到多糖提取液；

(2)利用模拟移动色谱对所述多糖提取液进行纯化，得到纯化液；

所述模拟移动色谱包含20根色谱柱，分为精制区、解吸区、水洗区三个区域，三个区的色谱柱数量分别为12根、4根、4根，各区均具有进料口1个，出料口1个，所述精制区和所述解吸区的进料口为该区的第一根色谱柱，所述水洗区的进料口为该区的最后一根色谱柱，各区之间均采用串联的连接方式，即所述水洗区的出料口连接所述解吸区的进料口，所述解吸区的出料口连接所述精制区的进料口；在运行过程中各区同时工作，当运行时间到达切换时间后，每根色谱柱顺时针移动一个柱位；

(3)所述纯化液浓缩后干燥，即得精制红缘层孔菌多糖。

进一步地，所述切换时间为1000-2000s。

进一步地，所述色谱柱的固定相为弱极性或非极性大孔树脂。

进一步地，所述固定相为AB-8、X-5或D101。

进一步地，在步骤(2)中，所述色谱柱的工作温度为20-30℃。

进一步地，在步骤(2)中，所述精制区、所述解吸区和所述水洗区的进料液分别为所述多糖提取液、体积分数80-90％的乙醇水溶液和去离子水。

进一步地，所述多糖提取液的浓度为30-50mg/mL。

进一步地，在步骤(2)中，所述吸附区、所述解吸区和所述水洗区的流速分别为1-5BV/h、5-10BV/h和5-10BV/h。

本发明还提供一种根据上述的方法制备得到的红缘层孔菌多糖。

本发明还提供上述的红缘层孔菌多糖在制备激活巨噬细胞产生NO的产品中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供的方法，运行成本低，进料浓度高，纯化得到的产品纯度(60％～80％)、收率(80～90％)均较高，与制备色谱工艺对比可节约乙醇用量60％-100％、节约用水量150％-200％，降低后续浓缩成本，简化操作步骤，设备20根色谱柱，增加树脂利用率，能够连续化生产，提升生产效率。

本发明纯化得到的红缘层孔菌多糖具有激活巨噬细胞RAW264.7产生NO的作用，并且作用显著。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

多糖提取液的制备：红缘层孔菌子实体，粉碎后，再经采用石油醚脱脂，超声波提取，超声功率300W，超声温度40℃，超声时间20min，加入无水乙醇使最终乙醇的质量浓度为80％，醇沉除蛋白得到该多糖提取液，浓度调配为30-50mg/mL备用。

以下实施例中使用的模拟移动色谱包含20根色谱柱，分为精制区、解吸区、水洗区三个区域，三个区的色谱柱数量分别为12根、4根、4根。各区均具有进料口1个，出料口1个，精制区、解吸区的进料口为该区的第一根色谱柱，水洗区进料口为该区的最后一根色谱柱，各区之间均采用串联的连接方式，即水洗区的出料口连接解吸区的进料口，解吸区的出料口连接精制区的进料口；在运行过程中各区同时工作，当运行时间到达切换时间后，每根色谱柱顺时针移动一个柱位，按照此方式依次运行实现连续操作。

本发明采用弱极性大孔树脂为固定相对红缘层孔菌多糖提取液进行纯化。红缘层孔菌多糖为极性大分子物质，其在弱极性的大孔树脂上基本无吸附，而多糖中的色素及小分子物质(多酚、黄酮等)为弱极性物质，可以吸附在弱极性的大孔树脂上。通过极性不同，从而实现多糖与色素及小分子物质分离。

实施例1

(1)利用模拟移动色谱对多糖提取液进行纯化。其中精制区、解吸区和水洗区的进料液分别为浓度30mg/mL的多糖提取液、体积分数90％的乙醇水溶液和去离子水；精制区、解吸区和水洗区的流速分别为2BV/h、6BV/h、5BV/h；切换时间为1380s；SMB色谱柱固定相为X-5大孔树脂；工作温度为30℃。

(2)将步骤(1)得到的纯化液进行真空浓缩，浓缩温度45℃，浓缩后进行冷冻干燥，即得精制红缘层孔菌多糖。

本实施例制备得到的精制红缘层孔菌多糖，纯度75.2％，收率87.6％。

实施例2

(1)利用模拟移动色谱对多糖提取液进行纯化。其中精制区、解吸区和水洗区的进料液分别为40mg/mL的多糖提取液、体积分数80％的乙醇水溶液和去离子水；精制区、解吸区和水洗区的流速分别为1.0BV/h、5BV/h、8BV/h；切换时间为2000s；SMB色谱柱固定相为AB-8大孔树脂；工作温度为30℃。

本实施例制备得到的精制红缘层孔菌多糖，纯度79.3％，收率84.7％。

实施例3

(1)利用模拟移动色谱对多糖提取液进行纯化。其中精制区、解吸区和水洗区的进料液分别为50mg/mL的多糖提取液、体积分数90％的乙醇水溶液和去离子水；精制区、解吸区和水洗区的流速分别为5BV/h、10BV/h、10BV/h；切换时间为1420s；SMB色谱柱固定相为D-101大孔树脂；工作温度为20℃。

本实施例制备得到的精制红缘层孔菌多糖，纯度68.6％，收率88.2％。

实施例4

(1)利用模拟移动色谱对多糖提取液进行纯化。其中精制区、解吸区和水洗区的进料液分别为30mg/mL的多糖提取液、体积分数80％的乙醇水溶液和去离子水；精制区、解吸区和水洗区的流速分别为1.5BV/h、6BV/h、8BV/h；切换时间为1000s；SMB色谱柱固定相为AB-8大孔树脂；工作温度为30℃。

本实施例制备得到的精制红缘层孔菌多糖，纯度75.9％，收率82.3％。

效果说明：

分别利用实施例1-4制备得到的精制红缘层孔菌多糖刺激巨噬细胞RAW264.7，测定其产生NO的浓度，结果见表1。

具体实验方法：100μLRAW264.7细胞(1×10⁶cells/mL)加入96微孔板中在37℃5％CO₂培养箱中预培养24h，弃去上清液，细胞中加入200μL 5μg/mL的多糖溶液，培养液作为阴性对照，1μg/mL脂多糖(LPS)作为阳性对照，培养24h。上清液中NO含量的测定，即100μL上清液加入100μL Griess试剂，室温下避光反应10min后在540nm下用酶标仪(BioTekinstruments,Winooski,VT,USA)测定吸光度，以亚硝酸钠做为标准品，将样品吸光值带入标准曲线中计算出NO产量。

表1

实施例	NO产量
		实施例1	36.82μmol/L
实施例2	38.24μmol/L
		实施例3	26.41μmol/L
实施例4	36.95μmol/L
		阳性对照组	41.06μmol/L

注：表1中的数据均为减去阴性对照后的数据。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种模拟移动色谱纯化红缘层孔菌多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)所述纯化液浓缩后干燥，即得精制红缘层孔菌多糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述切换时间为1000-2000s。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的固定相为弱极性或非极性大孔树脂。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述固定相为AB-8、X-5或D101。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述色谱柱的工作温度为20-30℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述精制区、所述解吸区和所述水洗区的进料液分别为所述多糖提取液、体积分数80-90％的乙醇水溶液和去离子水。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多糖提取液的浓度为30-50mg/mL。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述吸附区、所述解吸区和所述水洗区的流速分别为1-5BV/h、5-10BV/h和5-10BV/h。

9.一种根据权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的红缘层孔菌多糖。

10.一种如权利要求9所述的红缘层孔菌多糖在制备激活巨噬细胞产生NO的产品中的应用。