CN105777930B - 一种海带多糖及其提取分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种海带多糖及其提取分离方法。先采用高温高压水提法提取海带多糖粗提物，得率为3.6%，优于传统水提法；多糖粗提物经DEAE‑阴离子交换层析和Sephacryl S‑300凝胶层析二步分离后得到海带纯化多糖PS‑3‑1，其分子量为132 KDa。所得海带纯化多糖具有自由基清除活性，其对羟自由基和超氧阴离子清除率均大于70%，可开发为自由基清除剂药物；同时，该纯化多糖对血管平滑肌细胞具有增殖抑制活性，其增殖抑制率达到75%以上，可用于制备血管平滑肌细胞增殖抑制剂药物。

Description

一种海带多糖及其提取分离方法

技术领域

本发明涉及海藻有效成分提取领域，具体涉及一种海带多糖及其提取分离方法。

背景技术

海带（Laminaria japonica）分布于我国东部沿海区域，是一种药食同源类经济型海藻。海带的药用历史悠久，其药学功效在诸多传世经典药学典著中均有记载。多糖是海带主要活性成分之一，现代药学研究结果表明，海带多糖具有降血脂、抗凝血、抗动脉粥样硬化、抗氧化等生物药理学活性，是海带活性成分研究的热点之一。

热水提取法是常用的海带活性多糖提取方法，具有操作方便、工艺简单、保持活性多糖结构稳定等特点。但是，因热水提取法难以释放大量胞内成分，使其提取效率低、耗时长，也成为阻碍其实践应用的瓶颈。高温、高压条件可增强溶剂的细胞穿透力，提高其对海带细胞壁破坏力，从而促进胞内多糖释放，提高多糖提取效率，改善热水提取法的瓶颈问题。

海带活性多糖分离提取及活性筛选通常采取先提取分离、再进行活性筛选鉴定，在多糖活性筛选上缺乏针对性，影响多糖活性筛选效率。在活性多糖提取分离过程中追踪多糖活性，选择合适的分离纯化方法，可在很大程度上提高活性多糖筛选效率。目前，以活性追踪多糖提取分离过程的报道较少，而且，文献报道水提海带活性多糖多为粗组分，较少见单一多糖组分的活性研究报道，未见同时具有自由基清除活性和血管平滑肌细胞增殖抑制活性的海带单一多糖组分的相关研究报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种海带多糖及其提取分离方法。所制得的海带多糖对自由基清除率达到70%以上，对血管平滑肌细胞增殖抑制率达到75%以上。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种可作为自由基清除剂和血管平滑肌增殖抑制剂的海带多糖提取分离方法，包括如下步骤：

（1）取海带干粉，用无水乙醇在50 ℃水浴脱色4 h，过滤取滤渣，室温静置风干即得脱色海带干粉；

（2）取脱色海带干粉，置于高压灭菌锅内，加入超纯水进行提取；过滤，收集滤液并浓缩至原体积1/3-1/5；

（3）在步骤（2）浓缩后的水提液中加入无水乙醇进行分级沉淀，收集乙醇终体积浓度为75-80 %的沉淀物，即为多糖粗提物；

（4）取多糖粗提物溶于Tris-HCl缓冲溶液中，经DEAE阴离子交换层析法分离，洗脱液为含0-2 mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲溶液，洗脱方式为连续洗脱；分别测定各洗脱峰组分对羟自由基清除活性，收集对羟自由基清除活性较高的第三洗脱峰组分，经透析、浓缩、冷冻干燥，得到多糖粗组分PS-3；

（5）取多糖粗组分PS-3，溶于pH值为7.0-7.5的PBS缓冲液，经Sephacryl S-300凝胶层析分离，洗脱液为含0.1 mol/L NaCl 的pH值为7.0-7.5 PBS缓冲液，测定洗脱峰组分对羟自由基清除活性，收集洗脱峰组分，经透析、浓缩、冷冻干燥，得到多糖纯化组分PS-3-1。

步骤（2）中海带干粉与超纯水的重量比为1: 55-70，提取条件为：压力0.1-0.14MPa，时间50-60 min。

一种如上所述的提取分离方法得到的可作为自由基清除剂和血管平滑肌细胞增殖抑制剂的海带多糖，其分子量为132 Kda，对自由基清除率大于70%，对血管平滑肌细胞增殖抑制率大于75%。

所述的海带多糖在制备自由基清除剂或血管平滑肌细胞增殖抑制剂药物中的应用。

本发明的有益技术效果在于：

1）本发明以自由基清除活性追踪多糖提取分离过程，采用高温高压水提法

提取海带多糖，得率为3.6%，优于传统水提法；

2）本发明提取方法获得的海带纯化多糖分子量分布均一，具有自由基清除

活性，对羟自由基和超氧阴离子清除率均大于70%，同时具有血管平滑肌细胞增殖抑制活性，增殖抑制率大于75%，为海带活性多糖在自由基清除剂和血管平滑肌细胞增值抑制剂类药物制剂开发提供新途径。

具体实施方式

为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。

实施例 1

一种海带多糖的分离提取方法，具体步骤为：

1）取海带干粉60g，加入1.5 L无水乙醇，50℃水浴4 h，过滤，收集滤渣，室温静置风干得脱色海带干粉；

2）取脱色海带干粉50 g，加入2.75 L超纯水，置于高压灭菌锅内，压力为0.1 MPa，处理时间50 min；过滤，收集滤液并浓缩至600 mL；

3）加入无水乙醇调整至乙醇终体积浓度为25%、50%、75%，进行分级沉淀，收集体积浓度为75%乙醇沉淀物，干燥得海带多糖粗提物，得率为3.5%；

4）将多糖粗提物溶于0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.5），DEAE-Sephadex阴离子交换层析分离，洗脱液为含2mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液，洗脱方式为连续洗脱，洗脱体积为3柱体积；分别收集各洗脱峰组分，测定对羟自由基清除活性；其中，第三洗脱峰组分羟自由基活性达到54%，收集第三洗脱峰组分，即为PS-3，透析、浓缩、冻干保存；

5）取多糖粗组分PS-3溶于PBS缓冲溶液（pH 7.2），Sephacryl S-300 凝胶层析分离，洗脱液为含0.1 mol/L NaCl的PBS缓冲溶液（pH 7.2），收集洗脱峰组分，测得其对羟自由基清除活性为70%。收集洗脱峰组分，即为多糖纯化组分PS-3-1，透析、浓缩、冻干保存。

多糖浓度测定采用苯酚-硫酸法，测得海带纯化多糖PS-3-1多糖含量为93%。

多糖分子量测定采用HPGPC色谱法，测得海带多糖纯化组分PS-3-1多糖分子量为132 KDa。

实施例2

一种海带多糖的分离提取方法，具体步骤为：

1）取海带干粉60g，加入1.5 L无水乙醇，50℃水浴4 h，过滤，收集滤渣，室温静置风干得脱色海带干粉；

2）取脱色海带干粉50 g，加入3.5 L超纯水，置于高压灭菌锅内，压力为0.14 MPa，处理时间60 min，过滤，收集滤液并浓缩至体积为1000 mL；

3）加入无水乙醇调整至乙醇终体积浓度为25%、50%、75%，进行分级沉淀，收集75%乙醇沉淀物，干燥得海带多糖粗提物，得率为3.6%；

4）将多糖粗提物溶于0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5），DEAE-Sephadex离子交换层析分离，洗脱液为含1mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液，洗脱方式为连续洗脱，洗脱体积为3柱体积；分别收集各洗脱峰组分，测定对羟自由基清除活性；其中，第三洗脱峰组分羟自由基活性达到52%，收集第三洗脱峰组分，即为PS-3，透析、浓缩、冻干保存；

5）取多糖粗组分PS-3溶于PBS缓冲溶液（pH 7.2），Sephacryl S-300 凝胶层析分离，洗脱液为含0.1 mol/L NaCl的PBS缓冲溶液（pH 7.2），收集洗脱峰组分，测得其对羟自由基清除活性为71%。收集洗脱峰组分，即为多糖纯化组分PS-3-1，透析、浓缩、冻干保存。

多糖浓度测定采用苯酚-硫酸法，测得海带纯化多糖PS-3-1多糖含量为94%。

多糖分子量测定采用HPGPC色谱法，测得海带多糖纯化组分PS-3-1多糖分子量为132 KDa。

应用实施例1

体外自由基清除活性测定

（1）超氧阴离子清除活性测定：采用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶法生成体外超氧

阴离子，分别测定海带多糖粗组分PS-3和海带多糖纯化组分PS-3-1对超氧阴离子清除活性，结果如表1所示。其中，海带多糖粗组分PS-3对超氧阴离子最大清除率为50.338%，海带多糖纯化组分PS-3-1对超氧阴离子最大清除率为72.086%。

表1 海带多糖对超氧阴离子清除率（%）

（2）羟自由基清除活性测定：采用Fenton反应生成体外羟自由基，分别测定海带多糖粗组分PS-3和海带多糖纯化组分PS-3-1对羟自由基清除活性，结果如表2所示。其中，海带多糖粗组分PS-3对羟自由基最大清除活率为79.398 %，海带多糖纯化组分PS-3-1对羟自由基最大清除活率为95.301 %。

表2 海带多糖对羟自由基清除率（%）

应用实施例2

体外血管平滑肌细胞增殖抑制活性测定

按常规方法培养血管平滑肌细胞。取对数生长期细胞（5×10⁵个/mL）接种于96孔板，二氧化碳培养箱内孵育过夜。吸弃细胞培养液，加入浓度分别为0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL海带纯化多糖PS-3-1样品，37 ℃，5% CO₂培养箱孵育 24 h，加入浓度为50 µmol/LH₂O₂，继续孵育48 h后加入浓度为0.5 mg/mL MTT，孵育4 h后吸弃上清液，加入DMSO充分溶解后于578 nm下测定吸光值。结果表明，1 mg/mL海带纯化多糖PS-3-1对血管平滑肌细胞增殖抑制率为78%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种可作为自由基清除剂和血管平滑肌增殖抑制剂的海带多糖，其特征在于：其分子量为132 KDa，其制备方法包括如下步骤：

（1）取海带干粉，用无水乙醇在50 ℃水浴脱色4 h，过滤取滤渣，室温静置风干即得脱色海带干粉；

（2）取脱色海带干粉，置于高压灭菌锅内，加入超纯水进行提取；过滤，收集滤液并浓缩至原体积的1/3-1/5；海带干粉与超纯水的重量比为1: 55-70，提取条件为：压力0.1-0.14MPa，时间50-60 min；

（3）在步骤（2）浓缩后的水提液中加入无水乙醇进行分级沉淀，收集乙醇终体积浓度为75-80 %的沉淀物，即为多糖粗提物；

（4）取多糖粗提物溶于Tris-HCl缓冲溶液中，经DEAE阴离子交换层析法分离，洗脱液为含0-2 mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲溶液，洗脱方式为连续洗脱；分别测定各洗脱峰组分对羟自由基清除活性，收集对羟自由基清除活性较高的第三洗脱峰组分，经透析、浓缩、冷冻干燥，得到多糖粗组分PS-3；

（5）取多糖粗组分PS-3，溶于pH值为7.0-7.5的PBS缓冲液，经Sephacryl S-300凝胶层析分离，洗脱液为含0.1 mol/L NaCl 的pH值为7.0-7.5 PBS缓冲液，测定洗脱峰组分对羟自由基清除活性，收集洗脱峰组分，经透析、浓缩、冷冻干燥，得到多糖纯化组分PS-3-1。