CN111034994A - 一种功能性发酵海带多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种功能性发酵海带多糖制备方法，属于生物技术和保健食品领域，所述的制备方法是以特定分子量组成的海带多糖为基质，利用益生菌进行微生物固态发酵，发酵结束后进行干燥，即可获得功能性发酵海带多糖制品。本发明提高了海带多糖的生物活性，使其成为具有降血脂、清除自由基、提高免疫力和改善肠道菌群功能的复合活性多糖，可应用于功能性保健食品的开发。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和保健食品领域，涉及一种健康营养保健食品的研制及其应用，具体涉及一种功能性海带多糖的制备方法。
背景技术
近年来，随着社会经济发展与人们生活水平提升，心血管疾病发病率呈逐年上升趋势，已严重威胁人类健康。动脉粥样硬化是心血管系统疾病中最常见的疾病之一，也是心血管疾病共同的病理基础。积极预防和控制动脉粥样硬化是预防心血管疾病、降低疾病发病率的重要手段。
海带是我国东南沿海常见的经济型养殖海藻，具有药食同源性，在我国多部古代医学典籍中均有记载其药学功效。现代科学研究表明，多糖是海带活性主要的功效成分之一，具有抗氧化、降血脂、抗凝血、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等生物学活性。海带多糖主要由三种多糖组成：褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉。褐藻胶，主要存在于海带的细胞壁和细胞间质，由α-1,4-L-古罗糖醛酸和β-1,4-D-甘露糖醛酸组成，是三种海带多糖中含量最高的多糖。褐藻淀粉，主要存在于海带细胞质中，由1,3或1,6-β-D-葡聚糖构成，其含量约占1％。褐藻糖胶，主要存在于海带细胞间质，主要由岩藻糖、甘露糖、半乳糖、木糖等单糖组成，其含量一般在0.3-1.5％。目前，海带多糖的提取工艺已有众多研究报道，一般采用溶剂提取粗多糖，再经过物理破碎，化学处理或生物酶降解等方法进行细胞壁、膜成分分解，以上方法都可以提取并获得一定组成的多糖。
已有发明专利申请公开了一种海带多糖及其提取分离方法(公开号:CN105777930A)，采用高温高压水提法提取海带多糖粗提物，多糖粗提物经 DEAE-阴离子交换层析和Sephacryl S-300凝胶层析二步分离后得到海带纯化多糖PS-3-1，其分子量为132KDa。所得海带纯化多糖具有自由基清除活性，其对羟自由基和超氧阴离子清除率均大于70％，可开发为自由基清除剂药物。但利用海带多糖活性组分进行生物发酵，提高海带多糖生物活性，进而开发成具有降血脂、清除自由基、提高免疫力和改善肠道菌群功能的功能性保健食品的方法尚无研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有营养保健功能的发酵海带多糖制剂，使其成为具有降血脂、清除自由基、提高免疫力和改善肠道菌群功能的复合活性多糖，进而开发成一种含有益生菌的功能性保健食品。
本发明技术方案如下：
先采用溶剂提取法制备海带多糖粗组分，再经大孔树脂分离洗脱后收集特定组分的海带多糖，并以该多糖组成为主要固态发酵基质，接种特定微生物进行生物发酵，最后干燥制成特定的剂型。
其中所述特定分子量组成的海带多糖制备工艺如下，将海带干粉碎，粗粉用蒸馏水进行溶解，料水比为1:15～1:20，搅拌均匀后置于高压灭菌锅内，压力为0.1-0.15Ma，温度100～105℃，水解时间30～60min。提取液浓缩后采用乙醇沉淀，使乙醇终浓度为70～75％，沉淀1～2小时，其沉淀物为海带多糖粗组分。海带多糖粗组分进一步采用SephadexG-100凝胶层析柱进行层析分离，采用pH 7.0的PBS缓冲液洗脱收集第二峰组分，浓缩后进行喷雾干燥即得特定分子量的海带多糖活性组分干粉，海带多糖组分的分子量范围为100～200 KDa。
其中所述发酵海带多糖固态发酵基质的成分及配比为：海带多糖活性组分70～80％，葡萄糖3～5％、麸皮1～20％、蛋白胨3～5％，氯化钠0.1～1.0％，磷酸氢二钾0.1～0.5％，硫酸铵0.1～0.5％，上述百分比均表示重量比。
其中所述的发酵微生物菌种为地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和酵母菌其中的两种以上。微生物菌株均采用液体发酵制备种子液，种子液菌体数量均达到1×108个/mL以上，微生物菌株接种量体积按固态发酵基质重量的比例添加，分别为：地衣芽孢杆菌1～10％、嗜酸乳杆菌 1～10％、保加利亚乳杆菌1～10％、嗜热链球菌1～10％和酵母菌1～5％。
其中所述的固态发酵工艺为：将上述发酵微生物发酵种子液接种至固态发酵培养基后混合均匀，固态发酵基质的含水量为40～50％，厌氧发酵，发酵温度为32～35℃，发酵时间48-72小时。
进一步的，所述的功能性海带多糖制品在制备功能性保健食品中的应用。
本发明的优点在于：
(1)本发明以海带为提取多糖为对象，采用优化的提取工艺和分离预处理方法，加速多糖的释放，达到较好的多糖提取效果。
(2)本发明结合微生物发酵技术，对海带多糖活性组分进行生物发酵，提高了海带多糖的生物活性。
(3)本发明发酵的海带多糖具有降血脂、清除自由基、提高免疫力和改善肠道菌群功能的效果，可以开发成一种含有益生菌的功能性保健食品。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案进行详细说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1海带多糖组分的制备
海带干粉碎后过80目筛网，再准确称取干粉1.0kg，加入20L蒸馏水，搅拌均匀后，置于高压灭菌锅内，控制压力0.1MPa，温度100℃，高压降解 60min。过滤，收集滤液，滤液浓缩至原来体积的30％左右，加入一定量95％工业食用酒精进行沉淀，使其乙醇终浓度达到70％，离心收集沉淀物，干燥后得海带多糖粗提物。将多糖粗提物用水溶解，采用SephadexG-100凝胶层析分离，洗脱液为pH 7.0的PBS缓冲液，收集第二洗脱峰组分，即为所需要的特定分子量的海带多糖组分，浓缩、干燥后备用。
本工艺制备的海带多糖组分经苯酚-硫酸法测定糖含量为91.5％，采用高效液相色谱法测得海带多糖组分的分子量为145KDa。
实施例2发酵微生物菌种的制备
菌种：地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和酵母菌。地衣芽孢杆菌购买自保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(菌种编号CGMCCNo.7349)。嗜酸乳杆菌(菌种编号CICC6075)、嗜热链球菌(菌种编号CICC20376)、保加利亚乳杆菌(菌种编号CICC20537)和酵母菌(菌种编号CICC32203)均购买自中国工业微生物菌种保藏中心。
按下面方法分别进行扩培，制备种子液：
1、地衣芽孢杆菌种子液的制备：取地衣芽孢杆菌试管斜面，在超净工作台上接种入内装200mL培养基的1000mL三角瓶中，200转/分钟，32℃下振荡培养24小时，备用。地衣芽孢杆菌液体培养基配方为：葡萄糖100g、蛋白胨50g、氯化钠5g、硫酸镁1.0g、氯化钾0.5g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸铵1.0g，水1000mL，pH 6.5。
2、嗜酸乳杆菌种子液的制备：取嗜酸乳杆菌试管斜面，在超净工作台上接种入内装200mL培养基的1000mL三角瓶中，150转/分钟，37℃下振荡培养24小时，备用。嗜酸乳杆菌液体培养基配方为：葡萄糖20g、蛋白胨5g、牛肉膏10g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、醋酸钠5.0g、柠檬酸铵2.0g、硫酸镁0.5g、吐温80 1.0g，水1000mL，pH 6.0。
3、嗜热链球菌种子液的制备：取嗜热链球菌试管斜面，在超净工作台上接种入内装200mL培养基的1000mL三角瓶中，150转/分钟，37℃下振荡培养24小时，备用。嗜热链球菌液体培养基配方为：葡萄糖15g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、磷酸二氢钾1.0g、醋酸钠2.0g、柠檬酸铵1.0g、吐温80 1.0g，水 1000mL，pH 6.0。
4、保加利亚乳杆菌种子液的制备：取保加利亚乳杆菌试管斜面，在超净工作台上接种入内装200mL培养基的1000mL三角瓶中，100转/分钟，40℃下振荡培养24小时，备用。保加利亚乳杆菌培养基配方为：蛋白胨10g 牛肉膏10g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾2g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.2g、吐温80 1mL，水1000mL，pH 6.5。
5、酵母菌种子液的制备：取酵母菌试管斜面，在超净工作台上接种入内装200mL培养基的1000mL三角瓶中，150转/分钟，37℃下振荡培养24小时，备用。酿酒酵母菌液体培养基配方为：葡萄糖30g、蛋白胨5g、氯化钾0.5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、硫酸锌0.1g、硫酸亚铁0.1g，水1000mL，pH7.0。
本工艺发酵得到的种子液的菌体数量均达到1×108个/ml以上。
实施例3海带多糖的发酵
在2L烧杯中加入分离提取的特定组分海带多糖700g、葡萄糖100g、麸皮90g、蛋白胨50g、氯化钠50g、磷酸氢二钾5g和硫酸铵5g，加入500mL 蒸馏水，搅拌混匀，用纱布和牛皮纸密封后，放入高压灭菌锅中，100℃加热灭菌30分钟。冷却至室温，将烧杯移置超净工作台上，在无菌条件下移种接入地衣芽孢杆菌菌液100mL、嗜酸乳杆菌菌液50mL和嗜热链球菌菌液50mL，再加入150mL无菌蒸馏水，使固态发酵基质含水量达到45％左右。再次搅拌均匀，用纱布和塑料薄膜密封杯口。将烧杯转入恒温培养箱内，控制温度在32℃，发酵72小时。固态发酵结束后，进行冷冻干燥即可得到功能性发酵海带多糖制品。
本工艺最终得到的功能性发酵海带多糖950g，采用苯酚-硫酸法测得糖含量为60％，每克样品含地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌总益生菌数可达到25亿个。
实施例4海带多糖的发酵
在2L烧杯中加入分离提取的特定组分海带多糖700g、葡萄糖100g、麸皮90g、蛋白胨50g、氯化钠50g、磷酸氢二钾5g和硫酸铵5g，加入500mL 蒸馏水，搅拌混匀，用纱布和牛皮纸密封后，放入高压灭菌锅中，100℃加热灭菌30分钟。冷却至室温，将烧杯移置超净工作台上，在无菌条件下移种接入地衣芽孢杆菌菌液100mL、嗜酸乳杆菌菌液100mL、保加利亚乳杆菌菌液 50mL、嗜热链球菌菌液50mL和酵母菌菌液50mL，使固态发酵基质含水量达到45％左右。再次搅拌均匀，用纱布和塑料薄膜密封杯口。将烧杯转入恒温培养箱内，控制温度在32℃，发酵72小时。固态发酵结束后，进行冷冻干燥即可得到功能性发酵海带多糖制品，制品的主要成分见表1
表1发酵海带多糖的主要成分
本工艺最终得到的功能性发酵海带多糖870g，采用苯酚-硫酸法测得糖含量为60.2％，高效液相色谱法测得发酵海带多糖的分子量为120～145KDa，每克样品含地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和酵母菌总益生菌数可达到25亿个。
实施例5片剂
将功能性海带多糖制品100mg，与适量助剂淀粉、玉米浆、硬脂酸镁混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物制粒压片。
实施例6胶囊剂
将功能性海带多糖制品100mg，与适量助剂淀粉、硬脂酸镁混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊。
综上，功能性海带多糖制品可制备成片剂、胶囊剂等剂型，还可进一步开发成功能性保健食品，用于降血脂、清除自由基、提高免疫力和改善肠道菌群功能。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (7)
1.一种功能性发酵海带多糖的制备方法，其特征在于：所述的制备方法是以分子量100-200KDa的海带多糖为基质，利用益生菌进行微生物固态发酵，发酵结束后进行干燥，即可获得功能性发酵海带多糖制品。
2.根据权利要求1所述的功能性发酵海带多糖的制备方法，其特征在于：所述的特定分子量组成的海带多糖的制备方法为：将海带干粉碎，粗粉用蒸馏水进行溶解，料水质量比为1:10～1:20，搅拌均匀后进行高温高压水解，压力为0.1-0.15Ma，温度100～105℃，水解30～60min；冷却、浓缩后，加入乙醇，使乙醇终浓度为70～75％，沉淀1～2小时，其沉淀物为海带多糖粗品；柱层析分离，洗脱收集第二峰组分，浓缩后进行干燥，即得海带多糖活性组分干粉。
3.根据权利要求1所述的功能性发酵海带多糖的制备方法，其特征在于：所述的用于固态发酵的益生菌菌种包括地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌或酵母菌其中的两种以上。
4.根据权利要求1所述的功能性发酵海带多糖的制备方法，其特征在于：所述的微生物固态发酵的方法为：益生菌菌株的种子液接入固态发酵基质中，固态发酵基质的含水量为40～50％，厌氧发酵，发酵温度为32～35℃，发酵时间48-72小时。
5.根据权利要求4所述的功能性发酵海带多糖的制备方法，其特征在于：所述的益生菌菌株采用液体发酵制备种子液，种子液菌体数量达到1×108个/ml以上，种子液接入固态发酵基质的体积按固态发酵基质重量的1～10％。
6.根据权利要求4所述的功能性发酵海带多糖的制备方法，其特征在于：所述的固态发酵基质的成分包括海带多糖活性组分70～80％，葡萄糖3～5％、麸皮1～20％、蛋白胨3～5％，氯化钠0.1～1.0％，磷酸氢二钾0.1～0.5％，硫酸铵0.1～0.5％，上述百分比均表示重量比。
7.根据权利要求1所述的功能性发酵海带多糖的制备方法制备得到的功能性海带多糖制品在制备功能性保健食品中的应用。
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