CN111803533A - 降血糖、降血脂组合物、制备方法及其应用 - Google Patents
降血糖、降血脂组合物、制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种降血糖、降血脂组合物、制备方法及其应用。所述降血糖、降血脂组合物包含稀有人参皂苷和益生菌粉,所述益生菌粉含有冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌。本发明所述的组合物能够充分发挥稀有人参皂苷及冠突散囊菌的降血糖、降血脂功效,与单纯冠突散囊菌或经转化后的稀有人参皂苷作用相比,组合物具有相互促进、协同增效的效果。并且所述的组合物能够实现一药多治,能够减少同时患有糖尿病、高血脂症患者的服药种类,增强患者的医从性,方便患者服药;同时可以兼顾调节肠道菌群中益生菌比例,补充益生菌,促进吸收等多重功效。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种降血糖、降血脂组合物、制备方法及其应用。
背景技术
糖尿病是一种与胰岛素的产生和作用异常相关、以高血糖症为主要特征的代谢紊乱综合征,是一种严重危害健康的慢性疾病,是当前人类所面临的一个主要健康问题之一;高血脂症是由于脂肪代谢或运转异常而导致的血液中脂质高于正常水平的临床症状,通常表现为高脂蛋白血症即高胆固醇血症、高甘油三酯血症或两者兼有,此外高血脂症还可以诱导糖尿病、糖耐量异常的发病,同时又是脂肪肝、肝硬化、胆石症、胰腺炎的重要诱发因素,因此预防、缓解、治疗糖尿病、高血脂症已刻不容缓。
茯茶是我国西北部边区传统茶饮,为六大茶类中的黑茶中特色产品,研究表明,茯茶在降血脂降血糖方面具有良好的功效。冠突散囊菌,属“益生菌”,是茯砖茶在特定温湿度条件下,通过"发花"工艺长成的自然益生优势菌体,俗称"金花",是茯茶与众不同的地方,茯茶的多种功效需要依托冠突散囊菌来实现。“金花”的降血脂降血糖活性也已被研究肯定。
人参是一种我国传统的名贵药材,具有大补元气、补脾益肺、生津、安神益智等功效。人参皂苷是人参的主要活性成分,全世界各国科学家们已经发现人参含有128种单体皂苷,能够被现代高科技技术提取并掌握其临床功效的达四十种。稀有人参皂苷的差别仅在于糖链末端的糖苷键,可以通过水解其糖苷侧基进行高活性人参皂苷,大量药理研究表明,稀有人参皂苷在某些难治性疾病例如肿瘤治疗、糖尿病及高血脂症方面能够表现出独特的疗效,因此稀有人参皂苷作为候选药物被证明具有更为卓越的临床应用价值。
目前,得到稀有人参皂苷的制备方法主要有加热法、酸解法、碱解法、Smith降解法、微生物转化法和酶法。化学法可以使皂苷水解。但它们的水解条件都十分剧烈,苷元容易发生脱水或环合,使得苷元结构发生改变,副产物增加,导致产物不易纯化,而且污染环境。微生物转化法制备稀有人参皂苷的方法,存在微生物的安全性尚难以保证、过程繁琐、得到的产品需要分离纯化而无法直接食用、生产周期长、转化率有待提高等问题,以传统纯培养微生物作为获取化合物来源已不能满足新型药物开发的需求。
发明内容
为了解决上述问题,本发明人经过长期而艰苦的研究和实践,提供了一种利用通过食品安全的益生菌复合发酵,具体而言采用冠突散囊菌与枯草芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌共培养,使其三种菌株形成竞争性生态压力和激活沉默基因簇等非传统方法转化稀有人参皂苷,由此,共培养形成压力诱导,激活真菌复杂的调节机制和沉默的基因簇而生物合成结构类型丰富、活性多样的次生代谢产物,该工艺简单,周期较短,环境污染小,生产成本低等优点,且得到的发酵组合物具有优异的降血脂降血糖效果,服用该组合物能够实现降低血糖、控制血脂同时可以兼顾调节肠道菌群中益生菌比例,补充益生菌,促进吸收等多重功效,同时其主要成分为益生菌与中药活性物,安全性高,具有良好的应用前景。
本发明提供的组合物能够充分发挥稀有人参皂苷RH4及冠突散囊菌的降血糖、降血脂效果,并相互促进、彼此增效,实现优于单独作用的治疗效果,同时可以兼顾调节肠道菌群中益生菌比例,补充益生菌,促进吸收等多重功效,并提供该组合物中两种物质的比例及含有该组合物制品的用途。
本发明具体技术方案如下:
1.一种稀有人参皂苷的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括通过益生菌发酵活性原料。
2.根据项1所述的制备方法,其特征在于,所述益生菌包括冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌。
3.根据项1至2任一项所述的制备方法,其特征在于,所述活性原料选自人参、三七、三七花、西洋参、绞股蓝或其提取物的一种或两种以上,优选为人参或其提取物。
4.根据项1至3任一项所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
将冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌,分别进行活化以及扩大化培养得到种子液;
发酵:将冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌种子液,分别接种到发酵罐中,并在发酵罐中加入活性原料,进行发酵得到发酵液;
将发酵液进行固液分离,收集上清液浓缩得稀有人参皂苷。
5.根据项4所述的制备方法,其特征在于,发酵步骤中,先将冠突散囊菌种子液接种到发酵罐中的培养基中;而后加入活性原料发酵;再将保加利亚乳杆菌、枯草芽孢杆菌种子液分别接种到发酵罐中的培养基中进一步发酵,获得发酵液。
6.根据项4或5所述的制备方法,其特征在于,发酵温度为28-30℃,发酵pH为4-8。
7.根据项4或5所述的制备方法,其特征在于,发酵pH为5-7。
8.根据项4或5所述的制备方法,其特征在于,在发酵步骤中,溶氧量≥20%,优选为50-70%。
9.一种益生菌粉的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括通过益生菌发酵活性原料。
10.根据项9所述的制备方法,其特征在于,所述益生菌包括冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌。
11.根据项9至10任一项所述的制备方法,其特征在于,所述活性原料选自人参、三七、三七花、西洋参、绞股蓝或其提取物的一种或两种以上,优选为人参或其提取物。
12.根据项9至11任一项所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
将冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌,分别进行活化以及扩大化培养得到种子液;
发酵:将冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌种子液,分别接种到发酵罐中,并在发酵罐中加入活性原料,进行发酵得到发酵液;
将发酵液进行固液分离,收集固形物冻干得益生菌粉。
13.根据项12所述的制备方法,其特征在于,发酵步骤中,先将冠突散囊菌种子液接种到发酵罐中的培养基中;而后加入活性原料发酵;再将保加利亚乳杆菌、枯草芽孢杆菌种子液分别接种到发酵罐中的培养基中进一步发酵,获得发酵液。
14.根据项12或13所述的制备方法,其特征在于,发酵温度为28-30℃,发酵pH为4-8。
15.根据项12或13所述的制备方法,其特征在于,发酵pH为5-7。
16.根据项12或13所述的制备方法,其特征在于,在发酵步骤中,溶氧量≥20%,优选为50-70%。
17.根据项1-8任一项所述的制备方法制备得到的稀有人参皂苷。
18.根据项9-16任一项所述的制备方法制备得到的益生菌粉。
19.一种益生菌粉,其特征在于,所述益生菌粉含有冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌;优选的,在单位体积内,所述冠突散囊菌的活菌总数与所述枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌的活菌总数之和比例为1:1-10,优选为1:1-5,进一步优选为1:1-2。
20.根据项19所述的益生菌粉,其特征在于,所述枯草芽孢杆菌的活菌总数和所述保加利亚乳杆菌的活菌总数的比例为1-5:1,优选为1-2:1。
21.一种组合物,其特征在于,所述组合物包括稀有人参皂苷和根据项19或20所述的益生菌粉。
22.根据项21所述的组合物,其特征在于,所述稀有人参皂苷为Rh4。
23根据项21或22所述的组合物,其特征在于,所述稀有人参皂苷与所述益生菌粉的质量比例为1:1-10,优选为1:1-5,更优选为1:2-3。
24.根据项21至23任一项所述的组合物在食品、保健品或者药物中的用途,优选在药物中的用途,进一步优选在制备用于预防或治疗糖尿病、高血脂或者糖尿病和高血脂引起的并发症药物中的用途。
25.一种保健品组合物,其特征在于,所述保健品组合物包含有效剂量的根据项21至24任一项所述的组合物以及添加剂。
26.一种食品组合物,其特征在于,所述食品组合物包含有效剂量的根据项21至24任一项所述的组合物以及添加剂。
27.一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含有效剂量的根据项21至24任一项所述的组合物以及药学上可接受的辅料。
28.根据权利要求27所述的药物组合物,其特征在于,所述药学上可接受的辅料包括药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂。
29.一种用于预防或治疗糖尿病、高血脂症或者糖尿病和高血脂症引起的并发症的制剂,其特征在于,所述制剂通过包含项27或28所述的药物组合物的原料制成。
30.根据项29所述的制剂,其特征在于,所述制剂剂型为固体制剂或者液体制剂。
31.根据项30所述的制剂,其特征在于,所述固体制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂或颗粒剂。
32.根据项30所述的制剂,其特征在于,所述液体制剂为混悬剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂或悬浮液。
33.根据项25至28任一项所述的组合物或者权利要求29至32任一项所述的制剂在降低血液中血糖浓度、总胆固醇、甘油三酯或脂蛋白载量中的用途。
发明的效果
(1)本发明中稀有人参皂苷是通过益生菌枯草芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌与冠突散囊菌三种菌复合发酵产生的外源酶作用转化,安全性较高。
(2)通过本发明制得的降血糖降血脂组合物能够充分发挥稀有人参皂苷及冠突散囊菌的降血糖、降血脂功效,与单纯冠突散囊菌或经转化后的稀有人参皂苷作用相比,组合物具有相互促进、协同增效的效果。
(3)本发明提供的组合物能够实现一药多治,能够减少同时患有糖尿病、高血脂症患者的服药种类,增强患者的医从性,方便患者服药;同时可以兼顾调节肠道菌群中益生菌比例,补充益生菌,促进吸收等多重功效。
具体实施方式
下面对本发明做以详细说明。虽然显示了本发明的具体实施例,然而应当理解,可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反,提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明,并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是,在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解,技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式,而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语,故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式,然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的,并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明提供了一种稀有人参皂苷的制备方法,其中,所述制备方法包括通过益生菌发酵活性原料。
其中,益生菌是通过定殖在人体内,改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡,促进营养吸收保持肠道健康的作用,从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。
在本发明优选的一种具体实施方式中,所述益生菌包括冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌。
所述冠突散囊菌俗称“金花”,属于散囊菌目发菌科散囊菌属的一种真菌,由子囊果和菌丝组成,营养要求低,可在马铃薯葡萄糖琼脂培养基、孟加拉红培养基生长,适应性强,能利用多种氮源、碳源,是茯砖茶发酵过程中的优势菌种,其从茶叶中获取营养物质,通过自身代谢,产生多种酶催化茶叶中各种物质发生转化,形成了茯砖茶特有的色、香、味品质,故其是评价茯砖茶品质的重要指标。
所述的冠突散囊菌选自冠突散囊菌经大规模发酵培养所制得的菌丝体、孢子或两者的组合,菌丝体、孢子可以是经过物理、生物或化学方法处理破除细胞壁形态释放胞内含物的破壁状态,也可以是不处理的非破壁状态,优选为破壁状态。所述的物理、生物、化学方法处理破除细胞壁是指本领域技术人员所经常采用的破壁方法,如:高压匀浆、超声波破壁、生物酶法破壁及酸碱破壁等;
所述枯草芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌菌粉分别为枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌发酵培养所得。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,所述活性原料选自人参、三七、三七花、西洋参、绞股蓝或其提取物的一种或两种以上,优选为人参或其提取物。
在本发明较优选的一种具体实施方式中,其中,所述制备方法包括:
将冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌,分别进行活化以及扩大化培养得到种子液;
发酵:将冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌种子液,分别接种到发酵罐中,并在发酵罐中加入活性原料,进行发酵得到发酵液;
将发酵液进行固液分离,收集上清液浓缩得稀有人参皂苷。
在本发明较优选的一种具体实施方式中,其中,发酵步骤中,先将冠突散囊菌种子液接种到发酵罐中的培养基中;而后加入活性原料发酵;再将保加利亚乳杆菌、枯草芽孢杆菌种子液分别接种到发酵罐中的培养基中进一步发酵,获得发酵液,其中,发酵温度为28-30℃,发酵pH为4-8,优选为5-7,在发酵步骤中,溶氧量≥20%,优选为50-70%。
在本发明较优选的一种具体实施方式中,冠突散囊菌的菌株活化及扩大化培养的步骤为:将冠突散囊菌菌种接种到PDA培养基斜面上,置于28℃培养进行活化,等菌丝长满斜面后,将菌丝用无菌生理盐水5ml洗涤,接种0.2ml到装有200mL PDA液体培养基的500mL三角瓶中,置于28℃,160rpm的摇床上培养120h;然后按10%的接种量转接二级摇瓶种子置于28℃,160rpm的摇床上培养72h备用;
保加利亚乳杆菌的菌株活化扩大化培养步骤为:将保加利亚乳杆菌的菌种接种到改良MRS琼脂培养基平板上,置于37℃活化培养48h,用接种环刮取1环接种到装有80mL MRS液体培养基的250mL三角瓶中,置于30℃、160r/min的摇床上培养48h备用;
枯草芽孢杆菌菌株活化以及扩大化培养步骤为:将枯草芽孢杆菌菌种接种到琼脂培养基(培养基的成分为:1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+0.5g牛肉膏+20g琼脂)斜面上,置于30℃活化培养48h,用接种环刮取1环接种到装有80mL液体培养基(培养基的成分为:1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+0.5g牛肉膏)的250mL三角瓶中,置于30℃、160r/min的摇床上培养36h备用。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,在发酵步骤中,所述冠突散囊菌的接种量为5-15%,优选的,发酵温度为28-30℃,进一步优选的,发酵pH为4-7,进一步优选的,发酵时间为66-78h。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,在发酵步骤中,所述保加利亚乳杆菌的接种量为2-5%,优选的,发酵温度为28-30℃,进一步优选的,发酵pH为5-8。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,在发酵步骤中,所述枯草芽孢杆菌的接种量为2-5%,优选的,发酵温度为28-30℃,进一步优选的,发酵pH为5-8。
在本发明较优选的一种具体实施方式中,其中,在发酵步骤中,将发酵培养基(1%的糖和奶粉)按照60%左右的装液量装入发酵罐中高压蒸汽灭菌,发酵培养基冷却后接入10%扩培后的冠突散囊菌种,发酵全程流加活性原料,控制DO不低于20%,温度28-30℃,pH5~6培养66-78h,再将扩培后的保加利亚乳杆菌、枯草芽孢杆菌菌种分别按照3%的接种量接入,发酵培养的温度控制在28-30℃、pH 6~7、转速控制在140-160r/min、控制溶氧不低于20%,继续培养60-80h,即获得复合发酵液。
其中,所述的DO为水中氧气溶解量(单位:mg/L)。发酵中常用空气饱和度百分数来表示溶氧浓度(28℃时氧在发酵液中的100%的空气饱和浓度只有0.25mmol/L左右)。
在本发明优选的一种具体实施方式中,在固液分离步骤中,上清液含有稀有人参皂苷。其中固液分离步骤可以通过板框、超滤、陶瓷膜等设备实现固液分离后收集固形物得到益生菌,上清液进行浓缩分离纯化得到稀有皂苷。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,活性原料是采用流加的方式进行,通过将活性原料与超纯水配成合适的母液,其中活性原料的流加量是以固体活性物质的质量与流加后的体积来判断,最终的活性原料的比例为5%~50%(w/v),优选为10%~30%,更优选为25%,通过发酵全程流加方式添加进混合培养液中。
本发明提供了一种益生菌粉的制备方法,其中,所述制备方法包括通过益生菌发酵活性原料。
在本发明优选的一种具体实施方式中,所述益生菌包括冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌。
所述冠突散囊菌俗称“金花”,属于散囊菌目发菌科散囊菌属的一种真菌,由子囊果和菌丝组成,营养要求低,可在马铃薯葡萄糖琼脂培养基、孟加拉红培养基生长,适应性强,能利用多种氮源、碳源,是茯砖茶发酵过程中的优势菌种,其从茶叶中获取营养物质,通过自身代谢,产生多种酶催化茶叶中各种物质发生转化,形成了茯砖茶特有的色、香、味品质,故其是评价茯砖茶品质的重要指标。
所述的冠突散囊菌选自冠突散囊菌经大规模发酵培养所制得的菌丝体、孢子或两者的组合,菌丝体、孢子可以是经过物理、生物或化学方法处理破除细胞壁形态释放胞内含物的破壁状态,也可以是不处理的非破壁状态,优选为破壁状态。所述的物理、生物、化学方法处理破除细胞壁是指本领域技术人员所经常采用的破壁方法,如:高压匀浆、超声波破壁、生物酶法破壁及酸碱破壁等;
所述枯草芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌菌粉分别为枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌发酵培养所得。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,所述活性原料选自人参、三七、三七花、西洋参、绞股蓝或其提取物的一种或两种以上,优选为人参或其提取物。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,所述制备方法包括:
将冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌,分别进行活化以及扩大化培养得到种子液;
发酵:将冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌种子液,分别接种到发酵罐中,并在发酵罐中加入活性原料,进行发酵得到发酵液;
将发酵液进行固液分离,收集固形物冻干得益生菌粉。
在本发明较优选的一种具体实施方式中,其中,发酵步骤中,先将冠突散囊菌种子液接种到发酵罐中的培养基中;而后加入活性原料发酵;再将保加利亚乳杆菌、枯草芽孢杆菌种子液分别接种到发酵罐中的培养基中进一步发酵,获得发酵液。发酵温度例如为28-30℃,发酵pH例如为4-8,优选为5-7,溶氧量≥20%,例如为50-70%。
在本发明较优选的一种具体实施方式中,冠突散囊菌的菌株活化及扩大化培养的步骤为:将冠突散囊菌菌种接种到PDA培养基斜面上,置于28℃培养进行活化,等菌丝长满斜面后,将菌丝用无菌生理盐水5ml洗涤,接种0.2ml到装有200mL PDA液体培养基的500mL三角瓶中,置于28℃,160rpm的摇床上培养120h;然后按10%的接种量转接二级摇瓶种子置于28℃,160rpm的摇床上培养72h备用;
保加利亚乳杆菌的菌株活化扩大化培养步骤为:将保加利亚乳杆菌的菌种接种到改良MRS琼脂培养基平板上,置于37℃活化培养48h,用接种环刮取1环接种到装有80mL MRS液体培养基的250mL三角瓶中,置于30℃、160r/min的摇床上培养48h备用;
枯草芽孢杆菌菌株活化以及扩大化培养步骤为:将枯草芽孢杆菌菌种接种到琼脂培养基(培养基的成分为:1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+0.5g牛肉膏+20g琼脂)斜面上,置于30℃活化培养48h,用接种环刮取1环接种到装有80mL液体培养基(培养基的成分为:1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+0.5g牛肉膏)的250mL三角瓶中,置于30℃、160r/min的摇床上培养36h备用。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,在发酵步骤中,所述冠突散囊菌的接种量为5-15%,优选的,发酵温度为28-30℃,进一步优选的,发酵pH为4-7,进一步优选的,发酵时间为66-78h。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,在发酵步骤中,所述保加利亚乳杆菌的接种量为2-5%,优选的,发酵温度为28-30℃,进一步优选的,发酵pH为5-8。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,在发酵步骤中,所述枯草芽孢杆菌的接种量为2-5%,优选的,发酵温度为28-30℃,进一步优选的,发酵pH为5-8。
在本发明较优选的一种具体实施方式中,其中,在发酵步骤中,将发酵培养基(1%的糖和奶粉)按照60%左右的装液量装入发酵罐中高压蒸汽灭菌,发酵培养基冷却后接入10%扩培后的冠突散囊菌种,发酵全程流加活性原料,控制DO不低于20%,温度28-30℃,pH5~6培养66-78h,再将扩培后的保加利亚乳杆菌、枯草芽孢杆菌菌种分别按照3%的接种量接入,发酵培养的温度控制在28-30℃、pH 6~7、转速控制在140-160r/min、控制溶氧不低于20%,继续培养60-80h,即获得复合发酵液。
其中,所述的DO为水中氧气溶解量(单位:mg/L)。发酵中常用空气饱和度百分数来表示溶氧浓度(28℃时氧在发酵液中的100%的空气饱和浓度只有0.25mmol/L左右)。
在本发明优选的一种具体实施方式中,在固液分离步骤中,上清液含有稀有人参皂苷。其中固液分离步骤可以通过板框、超滤、陶瓷膜等设备实现固液分离后收集固形物得到益生菌,上清液进行浓缩分离纯化得到稀有皂苷。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,活性原料是采用流加的方式进行,通过将活性原料与超纯水配成合适的母液,其中活性原料的流加量是以固体活性物质的质量与流加后的体积来判断,最终的活性原料的比例为5%~50%(w/v),优选为10%~30%,更优选为25%,通过发酵全程流加方式添加进混合培养液中。
本发明提供了上述所述的方法制备得到的稀有人参皂苷。
本发明提供了上述所述的方法制备得到的益生菌粉。
本发明提供了一种益生菌粉,其中,所述益生菌粉含有冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌;优选的,在单位体积内,所述冠突散囊菌的活菌总数与所述枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌的活菌总数之和比例为1:1-10,优选为1:1-5,进一步优选为1:1-2。
在单位体积内,所述冠突散囊菌的活菌总数与所述枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌之和的活菌总数比例例如可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10或其之间的任意范围。
所述冠突散囊菌为冠突散囊菌富硒菌株(Eurotium Cristatum XD-01),于2018年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.15395,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,所述菌株首次出现在中国专利申请号为CN201911381242.9的公开文件中。
所述枯草芽孢杆菌商购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC),保藏编号为CICC10071的菌株,其保藏地址为北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼。
所述保加利亚乳杆菌商购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(CICC),保藏编号为ACCC03598的菌株,其保藏地址为北京市海淀区中关村南大街12号中国农业科学院农业资源与农业区划研究所资源楼206。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其中,所述枯草芽孢杆菌的活菌总数和保加利亚乳杆菌的活菌总数的比例为1-5:1,优选为1-2:1。
例如,所述枯草芽孢杆菌的活菌总数与保加利亚乳杆菌的活菌总数的比例例如可以1:1、2:1、3:1、4:1、5:1或其之间的任意范围。
本发明提供了一种组合物,其包括稀有人参皂苷和上述所述的益生菌,所述稀有人参皂苷与所述益生菌的质量比例为1:1-10,优选为1:1-5,更优选为1:2-3。
所述稀有人参皂苷与所述益生菌的质量比例例如可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10或其之间的任意范围。
在本发明优选的一种具体实施方式中,所述稀有人参皂苷为Rh4。
本发明提供了上述所述的组合物在食品、保健品或者药物中的用途,优选在药物中的用途,进一步优选在制备用于预防或治疗糖尿病、高血脂或者糖尿病和高血脂引起的并发症药物中的用途。
本发明提供了上述所述的组合物在降低血液中血糖浓度、总胆固醇、甘油三酯或脂蛋白载量中的用途。
本发明提供了一种保健品组合物,其包含有效剂量的上述所述的组合物以及添加剂。
其中,“有效剂量”指的是发挥所需功能所对应的剂量,该有效剂量是本领域技术人员能够根据实际需要,在有限次的实验下能够获得的剂量,所述的添加剂是本领域技术人员所公知的,例如可以为硬脂酸镁、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素或羧甲淀粉钠。
本发明提供了一种食品组合物,其包含有效剂量的上述所述的组合物以及添加剂。
其中,“有效剂量”指的是发挥所需功能所对应的剂量,该有效剂量是本领域技术人员能够根据实际需要,在有限次的实验下能够获得的剂量,所述的添加剂是本领域技术人员所公知的,例如可以为硬脂酸镁、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素或羧甲淀粉钠。
本发明提供了一种药物组合物,其包含有效剂量的上述所述的组合物以及药学上可接受的辅料。
其中,“有效剂量”指的是作为药物时发挥药学功能时的使用剂量。
所述药学上可接受的辅料包括药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂等,它们与活性成分相容。所述药学上可接受的辅料是本领域技术人员所公知的,例如可以为硬脂酸镁、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素或羧甲淀粉钠。
本发明提供了一种用于预防或治疗糖尿病、高血脂症或者糖尿病和高血脂症引起的并发症的制剂,其通过包括上述所述的药物组合物的原料制成。
在本发明优选的一种具体实施方式中,其剂型为固体制剂或液体制剂,所述固体制剂为片剂、丸剂、胶囊剂(包括持续释放或延迟释释放形式)、粉剂或颗粒剂,所述液体制剂为混悬剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂或悬浮液。
在本发明较优选的一种具体实施方式中,其剂型为固体制剂。
本发明提供了上述所述的保健品组合物在降低血液中血糖浓度、总胆固醇、甘油三酯或脂蛋白载量中的用途。
本发明提供了上述所述的食品组合物在降低血液中血糖浓度、总胆固醇、甘油三酯或脂蛋白载量中的用途。
本发明提供了上述所述的药物组合物在降低血液中血糖浓度、总胆固醇、甘油三酯或脂蛋白载量中的用途。
本发明提供了上述所述的制剂在降低血液中血糖浓度、总胆固醇、甘油三酯或脂蛋白载量中的用途。
本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述,在下面的实施例中,如果无其他特别的说明,%表示wt%,即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品或者常规的实验仪器。
实施例1稀有人参皂苷和益生菌的制备
实施例1.1
a.菌种活化及扩培
1)冠突散囊菌:将冠突散囊菌菌种接种到PDA培养基斜面上,置于28℃培养进行活化,等菌丝长满斜面后,将菌丝用无菌生理盐水5ml洗涤,接种0.2ml到装有200mL PDA液体培养基的500mL三角瓶中,置于28℃,160rpm的摇床上培养120h;然后按10%的接种量转接二级摇瓶种子置于28℃,160rpm的摇床上培养72h,测得活菌数为2.0×102cfu/g;
2)保加利亚乳杆菌:将保加利亚乳杆菌菌种接种到改良MRS琼脂培养基平板上,置于37℃活化培养48h,用接种环刮取1环接种到装有80mL MRS液体培养基的250mL三角瓶中,置于30℃、160r/min的摇床上培养48h,测得活菌数为1.8×103cfu/g;
3)枯草芽孢杆菌:将枯草芽孢杆菌菌种接种到固体培养基(培养基成分为:1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+0.5g牛肉膏+20g琼脂)斜面上,置于30℃活化培养48h,用接种环刮取1环接种到装有80mL液体培养基(培养基成分为:1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+0.5g牛肉膏)的250mL三角瓶中,置于30℃、160r/min的摇床上培养36h,测得活菌数为2.4×103cfu/g;
b.发酵
将发酵培养基(1%的糖和奶粉)按照60%左右的装液量装入发酵罐中高压蒸汽灭菌,发酵培养基冷却后接入10%扩培后的冠突散囊菌种,发酵全程以3~12mL/L/H速率流加活性原料,控制溶氧为50%,温度28℃,pH 5,培养66h,再将扩培后的保加利亚乳杆菌、枯草芽孢杆菌种子液分别按照3%的接种量接入,继续培养60h,发酵培养的温度控制在28℃、转速控制在140r/min、控制溶氧60%,获得复合发酵液。
c.发酵产物收集:通过板框过滤实现固液分离后收集固形物冻干得益生菌粉,收集上清液然后浓缩得人参皂苷Rh4。
d.相关指标检测:
①活性的稀有人参皂苷:经美国SSI液相色谱仪检测其中人参皂苷Rh4纯度95%,含量118mg/mL。
②活菌数检测:准备称量1g冻干粉,稀释后在超净工作台上分别涂布PDA平板、改良的MRS琼脂培养基平板、枯草芽孢杆菌固体培养基平板,经培养菌落计数可知,三种菌株在发酵过程中存在共生,相互促进现象。
表1:菌落计数
冠突散囊菌 | 保加利亚乳杆菌 | 枯草芽孢杆菌 | |
发酵前菌落数cfu/g | 2.0×10<sup>2</sup>cfu/g | 1.8×10<sup>3</sup>cfu/g | 2.4×10<sup>3</sup>cfu/g |
发酵结束菌落数cfu/g | 2.3×10<sup>8</sup>cfu/g | 2.0×10<sup>8</sup>cfu/g | 1.8×10<sup>8</sup>cfu/g |
实施例1.2
a.菌种活化及扩培
1)冠突散囊菌:将冠突散囊菌菌种接种到PDA培养基斜面上,置于28℃培养进行活化,等菌丝长满斜面后,将菌丝用无菌生理盐水5ml洗涤,接种0.2ml到装有200mL PDA液体培养基的500mL三角瓶中,置于28℃,160rpm的摇床上培养120h;然后按10%的接种量转接二级摇瓶种子置于28℃,160rpm的摇床上培养72h,测得活菌数为2.5×102cfu/g;
2)保加利亚乳杆菌:将保加利亚乳杆菌菌种接种到改良MRS琼脂培养基平板上,置于37℃活化培养48h,用接种环刮取1环接种到装有80mL MRS液体培养基的250mL三角瓶中,置于30℃、160r/min的摇床上培养48h,测得活菌数为1.9×103cfu/g;
3)枯草芽孢杆菌:将枯草芽孢杆菌菌种接种到固体培养基(具体为1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+0.5g牛肉膏+20g琼脂)斜面上,置于30℃活化培养48h,用接种环刮取1环接种到装有80mL液体培养基(具体为1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+0.5g牛肉膏)的250mL三角瓶中,置于30℃、160r/min的摇床上培养36h,测得活菌数为2.7×103cfu/g;
b.发酵
将发酵培养基(1%的糖和奶粉)按照60%左右的装液量装入发酵罐中高压蒸汽灭菌,发酵培养基冷却后接入15%扩培后的冠突散囊菌种,发酵全程以3~12mL/L/H速率流加活性原料,控制溶氧为70%,温度30℃,pH 6.5,培养70h,再将扩培后的保加利亚乳杆菌、枯草芽孢杆种子液分别按照4%和3%的接种量接入,继续培养70h,发酵培养的温度控制在28℃、转速控制在150r/min、控制溶氧70%,获得复合发酵液。
c.发酵产物收集:通过板框过滤实现固液分离后收集固形物冻干得益生菌粉,收集上清液浓缩得人参皂苷Rh4。
按照与实施例1.1相同的方法对相关指标进行检测,其中,
①活性的稀有人参皂苷:经美国SSI液相色谱仪检测其中人参皂苷Rh4纯度92%,含量108mg/mL。
②活菌数检测数目如下。
表2菌落计数
冠突散囊菌 | 保加利亚乳杆菌 | 枯草芽孢杆菌 | |
发酵前菌落数cfu/g | 2.5×10<sup>2</sup>cfu/g | 1.9×10<sup>3</sup>cfu/g | 2.7×10<sup>3</sup>cfu/g |
发酵结束菌落数cfu/g | 2.9×10<sup>8</sup>cfu/g | 4.0×10<sup>8</sup>cfu/g | 1.1×10<sup>9</sup>cfu/g |
实施例1.3
a.菌种活化及扩培
1)冠突散囊菌:将冠突散囊菌菌种接种到PDA培养基斜面上,置于28℃培养进行活化,等菌丝长满斜面后,将菌丝用无菌生理盐水5ml洗涤,接种0.2ml到装有200mL PDA液体培养基的500mL三角瓶中,置于28℃,160rpm的摇床上培养120h;然后按10%的接种量转接二级摇瓶种子置于28℃,160rpm的摇床上培养72h,测得活菌数为2.3×102cfu/g;
2)保加利亚乳杆菌:将保加利亚乳杆菌菌种接种到改良MRS琼脂培养基平板上,置于37℃活化培养48h,用接种环刮取1环接种到装有80mL MRS液体培养基的250mL三角瓶中,置于30℃、160r/min的摇床上培养48h,测得活菌数为2.5×103cfu/g;
3)枯草芽孢杆菌:将枯草芽孢杆菌菌种接种到固体培养基(具体为1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+0.5g牛肉膏+20g琼脂)斜面上,置于30℃活化培养48h,用接种环刮取1环接种到装有80mL液体培养基(具体为1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+0.5g牛肉膏)的250mL三角瓶中,置于30℃、160r/min的摇床上培养36h,测得活菌数为2.8×103cfu/g;
b.发酵
将发酵培养基(1%的糖和奶粉)按照60%左右的装液量装入发酵罐中高压蒸汽灭菌,发酵培养基冷却后接入5%扩培后的冠突散囊菌种,发酵全程以3~12mL/L/H速率流加活性原料,控制溶氧不低于20%,温度29℃,pH4,培养78h,再将扩培后的保加利亚乳杆菌、枯草芽孢杆菌种子液分别按照2%和5%的接种量接入,继续培养80h,发酵培养的温度控制在30℃、转速控制在160r/min、控制溶氧70%,获得复合发酵液。
c.发酵产物收集:通过板框过滤实现固液分离后收集固形物冻干得益生菌粉,收集上清液浓缩得人参皂苷Rh4。
按照与实施例1.1相同的方法对相关指标进行检测,其中,
①活性的稀有人参皂苷:经美国SSI液相色谱仪检测其中人参皂苷Rh4纯度90%,含量105mg/mL。
②活菌数检测如下。
表3菌落计数
冠突散囊菌 | 保加利亚乳杆菌 | 枯草芽孢杆菌 | |
发酵前菌落数cfu/g | 2.3×10<sup>2</sup>cfu/g | 2.5×10<sup>3</sup>cfu/g | 2.8×10<sup>3</sup>cfu/g |
发酵结束菌落数cfu/g | 2.3×10<sup>8</sup>cfu/g | 4.0×10<sup>8</sup>cfu/g | 1.9×10<sup>9</sup>cfu/g |
实施例1.4
a.菌种活化及扩培
1)冠突散囊菌:将冠突散囊菌菌种接种到PDA培养基斜面上,置于28℃培养进行活化,等菌丝长满斜面后,将菌丝用无菌生理盐水5ml洗涤,接种0.2ml到装有200mL PDA液体培养基的500mL三角瓶中,置于28℃,160rpm的摇床上培养120h;然后按10%的接种量转接二级摇瓶种子置于28℃,160rpm的摇床上培养72h,测得活菌数为2.0×102cfu/g;
2)保加利亚乳杆菌:将保加利亚乳杆菌菌种接种到改良MRS琼脂培养基平板上,置于37℃活化培养48h,用接种环刮取1环接种到装有80mL MRS液体培养基的250mL三角瓶中,置于30℃、160r/min的摇床上培养48h,测得活菌数为1.5×103cfu/g;
3)枯草芽孢杆菌:将枯草芽孢杆菌菌种接种到固体培养基(具体为1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+0.5g牛肉膏+20g琼脂)斜面上,置于30℃活化培养48h,用接种环刮取1环接种到装有80mL液体培养基(具体为1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+0.5g牛肉膏)的250mL三角瓶中,置于30℃、160r/min的摇床上培养36h,测得活菌数为2.1×103cfu/g;
b.发酵
将发酵培养基(1%的糖和奶粉)按照60%左右的装液量装入发酵罐中高压蒸汽灭菌,发酵培养基冷却后接入5%扩培后的冠突散囊菌种,发酵全程以3~12mL/L/H速率流加活性原料,控制溶氧为40%,温度30℃,pH 7,培养70h,再将扩培后的保加利亚乳杆菌、枯草芽孢杆菌种子液分别按照2%和3%的接种量接入,继续培养70h,发酵培养的温度控制在29℃、转速控制在150r/min、控制溶氧30%,获得复合发酵液。
c.发酵产物收集:通过板框过滤实现固液分离后收集固形物冻干得益生菌粉,收集上清液浓缩得人参皂苷Rh4。
按照与实施例1.1相同的方法对相关指标进行检测,其中,
①活性的稀有人参皂苷:经美国SSI液相色谱仪检测其中人参皂苷Rh4纯度90%,含量101mg/mL。
②活菌数检测如下。
表4活菌计数
冠突散囊菌 | 保加利亚乳杆菌 | 枯草芽孢杆菌 | |
发酵前菌落数cfu/g | 2.0×10<sup>2</sup>cfu/g | 1.5×10<sup>3</sup>cfu/g | 2.1×10<sup>3</sup>cfu/g |
发酵结束菌落数cfu/g | 3.0×10<sup>8</sup>cfu/g | 1.0×10<sup>8</sup>cfu/g | 2.0×10<sup>8</sup>cfu/g |
实施例2剂型的制备
实施例2.1片剂的制备
按照如下配比制备
将上述主药和辅料分别过80目筛,充分混匀,采用80%乙醇为粘合剂,用16目筛网制粒,55-60℃干燥,14目筛网整粒,压片,每片0.4g,其中,所使用的菌粉是实施例1.1制备的益生菌菌粉。
实施例2.2片剂的制备
按照如下配比制备
将上述主药和辅料分别过80目筛,充分混匀,采用80%乙醇为粘合剂,用16目筛网制粒,55-60℃干燥,14目筛网整粒,压片,每片0.4g,其中,所使用的菌粉是实施例1.1制备的益生菌菌粉。
实施例2.3
按照如下配比制备
将上述主药和辅料分别过80目筛,充分混匀,采用80%乙醇为粘合剂,用16目筛网制粒,55-60℃干燥,14目筛网整粒,压片,每片0.4g,其中,所使用的菌粉是实施例1.4制备的益生菌菌粉。
实施例2.4
按照如下配比制备
将上述主药和辅料分别过80目筛,充分混匀,采用80%乙醇为粘合剂,用16目筛网制粒,55-60℃干燥,14目筛网整粒,压片,每片0.4g,其中,所使用的益生菌菌粉和人参皂苷Rh4均由实施例1.2得到。
实施例2.5
按照如下配比制备
将上述主药和辅料分别过80目筛,充分混匀,采用80%乙醇为粘合剂,用16目筛网制粒,55-60℃干燥,14目筛网整粒,压片,每片0.4g,其中,所使用的益生菌菌粉和人参皂苷Rh4均由实施例1.2得到。
实施例2.6
按照如下配比制备
将上述主药和辅料分别过80目筛,充分混匀,采用80%乙醇为粘合剂,用16目筛网制粒,55-60℃干燥,14目筛网整粒,压片,每片0.4g,其中,所使用的益生菌菌粉和人参皂苷Rh4均由实施例1.3得到。
实施例2.7
按照如下配比制备
将上述主药和辅料分别过80目筛,充分混匀,采用80%乙醇为粘合剂,用16目筛网制粒,55-60℃干燥,14目筛网整粒,压片,每片0.4g,其中,所使用的益生菌菌粉和人参皂苷Rh4均由实施例1.3得到。
实验例1
实施例2.1所制备的片剂在治疗高血脂体内药效学实验
1.实验材料
1.1药品与试剂
待试药品:实施例2.1中所制得的片剂,0.4g/片,其中有效成分为稀有人参皂苷Rh4及益生菌粉;
阳性药:血脂康购自北大维信生物科技有限公司,批号:20171001;
总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)测试盒购自南京建成生物工程研究所;
1.2仪器 7150型全自动生化分析仪(日本日立公司)。
1.3动物 SPF级SD大鼠,88只,雌雄各半,体重160~190g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司;饲养条件:SPF级动物实验室,室温23~25℃,相对湿度40%~70%,12h光照/黑暗交替,自由摄食和饮水。
2.试验方法
2.1造模方法
将88只SD大鼠随机分出12只作空白对照,其余76只用于模型的复制。参照文献《脂肪乳剂建立高脂血症模型小鼠的比较研究》(周桢昊赵璐杨旋曾南)制备高脂乳剂(其中,高脂乳剂含有胆固醇10%、猪油20%、胆酸钠2%、丙硫氧嘧啶1%、山梨醇甲酯20%、丙二醇20%),按照10mL/kg灌胃给予高脂乳剂,空白对照组灌胃给予生理盐水,每天1次,连续3周。断尾取血,测定其血清TC值,以TC值显著高于空白对照组为模型复制成功,从中选出60只作为高血脂模型大鼠。
2.2分组及给药
除外空白对照(等容生理盐水)组,将60只高血脂模型大鼠按体重、性别随机分为5组,即模型组(等容生理盐水)、血脂康组(300mg/kg)、实施例2.1的片剂组(90mg/kg)、人参皂苷Rh4组(90mg/kg)及冠突散囊菌丝冻干粉组(90mg/kg)。灌胃给药,每天1次,持续28天。
2.3指标的测定
末次给药后眼眶取血,分离血清,用试剂盒检测血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、SOD和MDA含量。
其中,TC、TG、LDL-C、HDL-C含量的测定采用氧化酶法;SOD活性的测定采用黄嘌呤氧化法;MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸法。
2.4统计学方法
实验数据以x±s表示,用SPSS17.0统计软件进行分析。两独立样本均数比较用t检验,多组样本均数比较用单因素方差分析,组间两两比较用LSD法。P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。
3.试验结果
3.1降血糖降血脂组合物片剂对高血脂模型大鼠血脂的影响
与空白对照组比较,模型组大鼠血清TG、TC、LDL-C含量显著增加(P<0.01),HDL-C含量显著减少(P<0.05),说明高脂乳剂可诱发大鼠血脂紊乱,增加动脉粥样硬化的风险。与模型组比较,血脂康组、人参皂苷Rh4组的TG、TC、LDL-C显著减少(P<0.05),HDL-C显著增加(P<0.05);与模型组比较,实施例2.1的片剂组的TG、TC、LDL-C极显著减少(P<0.01),HDL-C显著增加(P<0.05)。结果表明实施例2.1片剂明显改善高血脂症,减少动脉粥样硬化发生风险的作用,且效果优于血脂康、人参皂苷RH4和冠突散囊菌组。试验结果见表5。
表5:降血糖降血脂组合物片剂对高血脂模型大鼠血脂的影响(x±s)
注:与空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较:#P<0.05,##P<0.01
3.2实施例2.1的片剂对高血脂模型血清SOD活性及MDA含量的影响
与空白对照组比较,模型组大鼠体重及MDA含量显著增加(P<0.01),SOD活性显著下降(P<0.01),说明高脂乳剂可降低大鼠的抗氧化能力。与模型组比较,血脂康、人参皂苷Rh4及实施例2.1的片剂组,SOD活性显著增加,MDA含量显著减少(P<0.05),且实施例2.1的片剂组效果最佳,证明实施例2.1的片剂组在提高SOD活性及降低MDA含量方面具有更优的效果。具体结果见表6。
表6降血糖降血脂组合物片剂对高血脂模型大鼠血清SOD活性及MDA含量的影响(x±s)
注:与空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较:#P<0.05;##P<0.01
通过本实施例显示,实施例2.1的片剂在应用于治疗高血脂症时,表现出极强的药效,其效果优于单独使用人生皂苷Rh4及冠突散囊菌粉,且降血脂效果明显优于阳性药血脂康,因此具有极强的成药性。
实验例2实施例2.2-2.7的片剂在治疗高血脂体内药效学实验
采用与实施例1相同的方法进行药效学实验,其对高血脂模型大鼠血脂的影响结果以及对高血脂模型血清SOD活性及MDA含量的影响分别如表7和表8所示。
表7降血糖降血脂组合物片剂对高血脂模型大鼠血脂的影响(x±s)
注:与空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较:#P<0.05;##P<0.01
表8降血糖降血脂组合物片剂对高血脂模型大鼠血清SOD活性及MDA含量的影响(x±s)
注:与空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较:#P<0.05;##P<0.01
从表7和表8可以看出,实施例2.2-2.7所得到的片剂具有类似的技术效果。
实验例3实施例2.1-2.7的片剂对Ⅱ型糖尿病小鼠模型的治疗作用
造模:健康雄性、清洁级5~6周龄的C57BL/6小鼠(体重18±2g)120只,购买于西安交通大学医学院动物中心。小鼠适应性饲养7天,随机分为两组,一组10只,给予基础饲料;一组110只,给予高脂高糖饲料(购自北京博泰宏达生物技术有限公司)。6周后,高脂高糖饮食组禁食不禁水12h后,腹腔注射链脲佐菌素(STZ,购自Sigma,柠檬酸缓冲液配制)30mg/kg,每天一次,连续注射5天,建立糖尿病模型。将小鼠禁食(不禁水)12h,每只小鼠眼底静脉丛取血0.2mL,分离血清。取10μL血清于样品管中按照血糖测定试剂盒(GOD-PAP法)测定小鼠的空腹血糖值。空腹血糖值≥11.1mmol/L的小鼠视为糖尿病模型小鼠,可用于后续实验。
动物分组:高血糖小鼠随机分成11组,每组10只动物,即模型组(等容生理盐水)、阳性药二甲双胍组(购自中美上海施贵宝制药有限公司)(100mg/kg)、实施例2.1片剂(90mg/kg)、实施例2.2片剂(90mg/kg)、实施例2.3片剂(90mg/kg)、实施例2.4片剂(90mg/kg)、实施例2.5片剂(90mg/kg)、实施例2.6片剂(90mg/kg)、实施例2.7片剂(90mg/kg)、人参皂苷Rh4组(90mg/kg)及冠突散囊菌菌丝冻干粉组(90mg/kg)。药物溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液,所有小鼠每天灌胃相应剂量的药物一次,对照组和模型组小鼠给予同等体积溶剂0.5%羧甲基纤维素钠溶液,连续给药三周。
指标检测:给药前和给药后每周测定一次小鼠的空腹血糖,具体操作如下:动物禁食(不禁水)12h,尾静脉采血检测葡萄糖水平即为空腹血糖。从造模开始,到给药结束,每周一次称量小鼠体重。
实验结果:
1)血糖检测结果如表9所示,可以看出所有组都能够显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平,改善血糖代谢,但是实施例2.1-2.7的片剂组降血糖效果优于其他组别。与已有降血糖药二甲双胍相比,实施例2.1-2.7的片剂改善葡萄糖代谢能力稍弱于二甲双胍。
这说明了组合物能够明显提高各单体的改善血糖代谢的效果,与临床一线药二甲双胍相当。给药3周受试动物未见与药物毒性相关的毒性反应,表明该组合物安全性良好。
表9人参皂苷单体及药物组合对Ⅱ型糖尿病小鼠的治疗作用
注:#与空白组相比P<0.05;*与模型组相比P<0.05。
2)体重监测:各组小鼠给药前初始体重无明显差异,灌胃3周后,正常组小鼠体重稳定增加,模型组小鼠体重较正常组显著降低。其他组小鼠体重与模型组基本相当,说明药物本身不会造成小鼠体重明显下降,其结果如表10。
表10人参皂苷单体及药物组合对Ⅱ型糖尿病小鼠体重影响
注:#与空白组相比P<0.05;
综上所述,本发明提供的组合物同时可以实现两者之间在降血糖降血脂功效的相互促进、协同增效,相比于两者单独治疗,效果提升明显。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种稀有人参皂苷的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括通过益生菌发酵活性原料。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述益生菌包括冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌。
3.根据权利要求1至2任一项所述的制备方法,其特征在于,所述活性原料选自人参、三七、三七花、西洋参、绞股蓝或其提取物的一种或两种以上,优选为人参或其提取物。
4.根据权利要求1至3任一项所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
将冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌,分别进行活化以及扩大化培养得到种子液;
发酵:将冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌种子液,分别接种到发酵罐中,并在发酵罐中加入活性原料,进行发酵得到发酵液;
将发酵液进行固液分离,收集上清液浓缩得稀有人参皂苷。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,发酵步骤中,先将冠突散囊菌种子液接种到发酵罐中的培养基中;而后加入活性原料发酵;再将保加利亚乳杆菌、枯草芽孢杆菌种子液分别接种到发酵罐中的培养基中进一步发酵,获得发酵液。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法,其特征在于,发酵温度为28-30℃,发酵pH为4-8。
7.根据权利要求4或5所述的制备方法,其特征在于,发酵pH为5-7。
8.根据权利要求4或5所述的制备方法,其特征在于,在发酵步骤中,溶氧量≥20%,优选为50-70%。
9.一种益生菌粉的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括通过益生菌发酵活性原料。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,所述益生菌包括冠突散囊菌、枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌。
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