CN114788842A - 一种具有降糖活性的组合物 - Google Patents

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CN114788842A CN202210497453.4A CN202210497453A CN114788842A CN 114788842 A CN114788842 A CN 114788842A CN 202210497453 A CN202210497453 A CN 202210497453A CN 114788842 A CN114788842 A CN 114788842A
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段志广
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Abstract

本申请公开了一种具有降糖活性的组合物，包含作为活性成分降糖的有效量的桑叶生物碱原料和稀有人参皂苷原料，公开了桑叶、人参降血糖药用活性物质提取工艺，得到的桑叶生物碱原料中桑叶生物碱含量不低于25％，人参提取物中稀有人参皂苷含量不低于40％。本申请的优点是：以桑叶为原料，提高桑叶总生物碱含量，获得具有强α‑葡糖苷酶抑制剂的药用活性成分，与以人参为原料，得到的抑制氧化应激的药用活性成分合理配比后，能够降低糖尿病患者空腹血糖、餐后血糖，并改善氧化应激对胰岛β细胞的氧化损伤，提高血清胰岛素水平，降低血脂水平，从而改善糖尿病及其并发症状。

Description

一种具有降糖活性的组合物
技术领域
本申请属于天然药物领域，具体涉及天然组合药物领域，在本领域内，本申请提供了一种具有降糖功效的组合物。
背景技术
糖尿病是一种与胰岛素的产生和作用异常相关、以高血糖为主要特征的代谢紊乱综合征，是一种危害巨大的慢性疾病，是当前人类所面临的一个主要健康问题之一。糖尿病可分为胰岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病)及非胰岛素依赖型糖尿病(II型糖尿病)，其中90％以上为II型糖尿病。国际糖尿病联盟(IDF)糖尿病概览数据显示，2019年全球约4.63亿20-79岁成人患糖尿病；预计到2030年，糖尿病患者会达到5.784亿；预计到2045年，糖尿病患者会达到7.002亿。
研究表明，氧化应激是引起II型糖尿病的发生及发展的重要因素。氧化应激是指活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的产生与机体内抗氧化防御系统的消除之间失衡，导致ROS和RNS产生过量，造成机体蛋白和核酸损伤。高血糖是产生氧化应激的主要原因，其会通过线粒体电子传递链、葡萄糖自氧化和多元醇通路等增加机体内的ROS与RNS含量。多项研究显示，氧化应激会导致胰岛β细胞功能损伤及外周胰岛素抵抗，诱发糖尿病的形成，严重者更会导致糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变和糖尿病心血管病变等多种并发症的形成。氧化应激标志物是指能反应机体内氧化应激水平的一系列生物化学物质，常用于糖尿病临床和实验检测的氧化应激标志物主要是活性氧(ROS)、活性氮(RNS)和脂质过氧化物(MDA)。
糖尿病患者需长期口服降糖药物以控制高血糖及并发症的发生和发展，现阶段治疗II型糖尿病的药物主要为传统抗糖尿病药物，包括磺酰脲类、格列奈类、双胍类、噻唑烷二酮类、α-葡萄糖苷酶抑制剂及胰岛素等，这些药物均存在不同程度的不良反应，如引发低血糖、胃肠道不适、肥胖等。
发明内容
随着对糖尿病基础理论研究的深入，开发出一种血糖控制水平佳、安全性高、对胰岛β细胞具有保护作用的糖尿病治疗新药成为国内外研究的热点。
有鉴于此，本申请的发明人进行了深入的研究，特提出本申请。
本申请提供了一种包含桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的用于降糖的组合物。
本申请提供的具体技术方案如下：
1.本申请提供的一种具有降糖活性的组合物，包含作为活性成分降糖的有效量的桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物，
其中，所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的重量比为1:3～2:1。
2.根据项1所述的具有降糖活性的组合物，所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的重量比为1:1～1:3。
3.根据项1所述的具有降糖活性的组合物，所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的重量比为1:1.5～1:3，优选的，重量比1:1.5～1:2.5，优选的，重量比为1:2。
4.一种制备上述具有降糖活性的组合物的方法，
制备桑叶生物碱提取物；
制备稀有人参皂苷提取物；
将所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物充分混合均匀。
5.根据项4所述的制备方法，所述桑叶生物碱提取物中桑叶生物碱的含量不低于25％。
6.根据项4或5所述的制备方法，所述稀有人参皂苷提取物中稀有人参皂苷总含量不低于40％。
7.根据项4～6任一所述的制备方法，所述桑叶生物碱提取物的制备方法包括如下步骤，
选择桑叶为原料；
将桑叶粉碎，加入有机溶剂，超声波提取；
提取完成合并滤液后细筛过滤去除滤渣，得到提取液进行离心，得到第一上清液；
将所述第一上清液旋蒸去除酒精，离心收集得第二上清液，第二上清液用酸型阳离子交换树脂吸附，自来水冲洗去杂后上样，洗脱，收集洗脱液旋蒸去除氨水，浓缩后离心得第三上清液；
将第三上清液用强碱性阴离子交换树脂吸附，并用去离子水洗脱，收集流出液，浓缩至后冷冻或喷雾干燥，得到桑叶生物碱原料粉。
8.根据项4～7任一所述的制备方法，所述稀有人参皂苷提取物的制备方法包括如下步骤，
取人参叶，用蒸馏水加热回流提取，过滤除杂，浓缩为人参叶提取液；
取大孔吸附树脂装柱，倒入人参叶提取液，反复吸附后先用蒸馏水洗脱，再用乙醇洗脱，洗脱液为原人参三醇组皂苷；
乙醇洗脱，洗脱液为原人参二醇组皂苷；
将原人参三醇组皂苷和原人参二醇组皂苷洗脱液合并，减压浓缩至，得到原人参皂苷浓缩液；
称取一定量所述原人参皂苷浓缩液，加入天冬氨酸水溶液，密封混匀，反应5～8h；
将反应后的样品取出，冷冻或喷雾干燥，过筛，得到稀有人参皂苷原料粉。
9.包含桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的组合物在制备用于降糖药物中的用途，所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的重量比为1:2～2:1。
10.根据项9所述的用途，其特征在于，所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的重量比为1:1.5-1.5:1，优选的，重量比1:1.3-1.2:1，优选的，重量比为1:1.2。
11.根据项9或10所述的用途，该具有降糖活性的组合物中包含桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物作为唯一降糖活性成分。
12.根据项9～11任一所述的用途，所述组合物可以选自片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、混悬剂、溶液剂中的一种或几种。
13.具体的，所述桑叶生物碱提取物的制备方法包括如下步骤，
①选择产地为云南、干燥温度不高于60℃的桑叶为原料；
②将桑叶粉碎；
③加入有机溶剂，超声波提取，提取完成合并滤液后细筛过滤去除滤渣，得到提取液进行离心，得到第一上清液；
④将第一上清液旋蒸去除酒精，离心收集得到第二上清液，第二上清液用酸型阳离子交换树脂吸附，自来水冲洗去杂后上样，洗脱，收集洗脱液旋蒸去除氨水，浓缩至后离心得第三上清液；
⑤将第三上清液用强碱性阴离子交换树脂吸附，并用去离子水洗脱，收集流出液，浓缩至后冷冻或喷雾干燥，得到桑叶生物碱原料粉。
具体的
所述步骤②中桑叶粒度为30目至80目，优选为80目；
所述步骤③中有机溶剂为酒精，体积分数为70-85％，优选的，体积分数为80％；
桑叶颗粒与有机溶剂的重量比为1:30-1:50，优选为1:40，
超声波提取时间优选为1小时，
超声波提取温度40-60℃，优选为50℃，
超声功率为1000-1200W，优选为1000W，
优选的，按此过程提取3次，
离心速率为8000-10000rpm，优选为8000rpm，离心时间为15min；
所述步骤④中使用酸型阳离子交换树脂吸附时间为10-12小时，优选的为12小时；
上样所用桑叶提取液pH调节为5.5，浓度为0.07mg/mL，并控制流速为1.0mL/min；
洗脱溶剂为1.0mol/L氨水:乙醇(50:50，v/v)；
所述步骤⑤中强碱性阴离子交换树脂为201×7，吸附2-4小时，优选为3小时。
14.具体的，所述稀有人参皂苷提取物的制备方法包括如下步骤，
①取人参叶，用蒸馏水加热回流提取，过滤除杂，浓缩为人参叶提取液；
②取大孔吸附树脂装柱，倒入人参叶提取液，反复吸附后先用蒸馏水洗脱，再用乙醇洗脱，洗脱液为原人参三醇组皂苷；
③乙醇洗脱，洗脱液为原人参二醇组皂苷；
④将原人参三醇组皂苷和原人参二醇组皂苷洗脱液合并，减压浓缩至100～200mL，得到原人参皂苷浓缩液；
⑤向步骤④所述原人参皂苷浓缩液中加入天冬氨酸水溶液，密封混匀，反应5～8h；
⑥将反应后的样品取出，冷冻或喷雾干燥，过筛，得到稀有人参皂苷原料粉。
具体的步骤①中所述蒸馏水为8倍量，
加热回流提取2次，每次2h，
浓缩的人参叶提取液相对密度为1.05～1.08，优选为1.06；
步骤②中所述大孔吸附树脂为40g，
倒入的人参叶提取液为300mL，
吸附时间为2h，
所述洗脱用蒸馏水体积为200mL，
所述洗脱用乙醇的体积分数40％，体积为250mL；
步骤③中所述洗脱用乙醇的体积分数80％，体积为250mL；
步骤⑤所述天冬氨酸水溶液体积分数5％，加入量为原人参皂苷浓缩液的10～20倍体积，优选的为15倍体积；
反应时间优选为6h，反应温度为120℃；
步骤⑥中所述筛的目数为80目。
发明效果
本申请提供的组合物，通过桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物两类药用活性物质的相互协同作用，在缓解糖尿病患者餐后血糖波动，改善胰岛素抵抗的同时，修复受损的胰岛β细胞功能，达到治疗糖尿病综合症的作用。降糖效果显著。本申请采用不同药理机制的天然产物提取物进行配伍制备降糖药物，降糖效果显著，对胰岛损伤具有一定的修复效果，且安全性更高，具有潜在临床应用价值和广阔的市场前景。
附图说明
图1：不同桑叶人参配比的降糖组合物对db/db小鼠空腹血糖的影响；
图2：不同桑叶人参配比的降糖组合物对db/db小鼠口服蔗糖耐量和胰岛素耐量的影响；
图3：不同桑叶人参配比的降糖组合物对db/db小鼠的降脂作用；
图4：不同桑叶人参配比的降糖组合物处理后的db/db小鼠胰腺组织H&E染色病理切片观察(200×)。
具体实施方式
下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
所述桑叶作为一味传统中药在古代就被用来治疗消渴症，《本草纲目》记载：桑叶乃手足阴阳之药，汁煎代茗，能止消渴。现代药理学研究发现桑叶中的多糖、黄酮、生物碱等成分具有降血糖的作用，其中生物碱的降血糖作用最显著，它可显著抑制α-糖苷酶(淀粉酶、麦芽糖酶和蔗糖酶)活性，降低碳水化合物的分解吸收，因此，在调节餐后血糖方面优于其他降糖药物，能有效延缓糖尿病前期患者向II型糖尿病的发展，降低糖尿病发病率，且对糖尿病并发症有很好的预防作用，桑叶提取物是控制餐后血糖的有效手段。
所述人参叶为人参的叶子，人参为五加科植物人参属的根茎，为多年生草本植物，是驰名中外的名贵药材。现代医学研究表明人参在免疫功能调节，抗糖尿病、增强肝功能作用、心脑血管障碍改善、抗动脉硬化作用、血压调节等均有明显的功效，人参皂苷作为人参的主要有效成分大量存在于人参叶当中，人参皂苷在抗糖尿病领域的应用正成为糖尿病新药开发的热点。稀有人参皂苷可以调节胰岛抵抗HepG2细胞的葡萄糖摄取，Sirt1特异性抑制剂EX527几乎逆转了稀有人参皂苷提高胰岛抵抗HepG2细胞葡萄糖摄取的能力，增加IR-HepG2细胞的胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗的效果与氧化应激通路中Sirt1的表达有关。
本申请提供的一种降具有降糖活性的组合物，包含作为活性成分降糖的有效量的桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物，其中，桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的重量比为1:3～2:1，例如，所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的重量比为可以为1:3、1:2.5、1:2、1:1.5、1:1、1.5:1、2:1或其之间的任意范围。优选的重量比为1:1～1:3，优选的，重量比为1:1.5～1:3，优选的，重量比1:1.5～1:2.5，优选的，重量比为1:2。
作为本申请优选的实施方案，所述组合物包含的桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物作为唯一降糖活性成分，通过本申请提供的配比，可以发挥优秀的降糖效果。
本申请提供了一种制备所述具有降糖活性的组合物的方法，分别制备桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物，然后将所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物充分混合均匀，所述制备桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的方法可以为本领域的任何一种制备方法，所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物可以为任何形式的物质形态，如粉末、颗粒、液体等。
在上述制备方法中，作为本申请的一种优选实施方式，所述桑叶生物碱提取物中桑叶生物碱的含量不低于25％，优选的，含量百分比为30％。
在上述制备方法中，作为本申请的一种优选实施方式，所述稀有人参皂苷提取物中稀有人参皂苷总含量不低于40％，优选的，含量百分比为45％。
在上述制备方法中，作为本申请的一种优选实施方式，所述桑叶生物碱提取物的制备方法包括如下步骤，
所述桑叶生物碱提取物的制备方法包括如下步骤，
①选择产地为云南、干燥温度不高于60℃的桑叶为原料；
②将桑叶粉碎；
③加入有机溶剂，超声波提取，提取完成合并滤液后细筛过滤去除滤渣，得到提取液进行离心，得到第一上清液；
④将第一上清液旋蒸去除酒精，离心收集得到第二上清液，第二上清液用酸型阳离子交换树脂吸附，自来水冲洗去杂后上样，洗脱，收集洗脱液旋蒸去除氨水，浓缩至后离心得第三上清液；
⑤将第三上清液用强碱性阴离子交换树脂吸附，并用去离子水洗脱，收集流出液，浓缩至后冷冻或喷雾干燥，得到桑叶生物碱原料粉。
作为优选的实施方式，在上述制备方法中：
所述步骤②中桑叶粒度为30目至80目，优选为80目；
所述步骤③中有机溶剂为酒精，体积分数为70-85％，优选的，体积分数为80％；
桑叶颗粒与有机溶剂的重量比为1:30-1:50，优选为1:40，
超声波提取时间优选为1小时，
超声波提取温度40-60℃，优选为50℃，
超声功率为1000-1200W，优选为1000W，
优选的，按此过程提取3次，
离心速率为8000-10000rpm，优选为8000rpm，离心时间为15min；
所述步骤④中使用酸型阳离子交换树脂吸附时间为10-12小时，优选为12小时；
上样所用人参叶提取物pH调节为5.5，浓度为0.07mg/mL，并控制流速为1.0mL/min；
洗脱溶剂为1.0mol/L氨水:乙醇(50:50，v/v)；
所述步骤⑤中强碱性阴离子交换树脂为201×7，吸附2-4小时，优选为3小时。
离子交换树脂，是带有官能团(有交换离子的活性基团)、具有网状结构、不溶性的高分子化合物。通常是球形颗粒物。离子交换树脂吸附各种离子的能力不一，有些离子易被交换树脂吸附，但吸着后要置换下来就比较困难；而另一些离子很难被吸着，但被置换下来却比较容易，这种性能称为离子交换的选择性。离子交换树脂对水中不同离子的选择性与树脂的交联度、交换基团、可交换离子的性质、水中离子的浓度和水的温度等因素有关。树脂中化学活性基团的种类决定了树脂的主要性质和类别。首先区分为阳离子树脂和阴离子树脂两大类，它们可分别与溶液中的阳离子和阴离子进行离子交换。阳离子树脂又分为强酸性和弱酸性两类，阴离子树脂又分为强碱性和弱碱性两类。离子交换树脂用途非常广泛，如用于水中的各种阴阳离子的去除，用于制糖、味精、酒的精造、生物制品等工业装置上，在有机合成中常用酸和碱作催化剂进行酯化、水解、酯交换、水合等反应等。
使用离子交换树脂的同时需要用到不同种类的洗脱液，根据不同的用途洗脱液可选择水、甲醇、乙醇、丙酮、不同浓度的酸碱液等。
超声波提取(也称为超声波萃取)以其提取温度低、提取率高、提取时间短的独特优势被具有创新意识者应用于中药材和各种动、植物有效含量的提取，是替代传统剪切工艺方法实现高效、节能、环保式提取的现代技术手段。超声波提取分离主要是依据物质中有效成分和有效成分群体的存在状态、极性、溶解性等设计的一项学科。合理利用超声波振动的方法进行提取的新工艺，使溶剂快速地进入固体物质中，将其物质所含的有机成分尽可能完全地溶于溶剂之中，得到多成分混合提取液。利用超声波技术来强化提取分离过程，可有效提高提取分离率，缩短提取时间、节约成本、甚至还可以提高产品的质量和产量。
在上述制备方法中，作为本申请的一种优选实施方式，所述稀有人参皂苷提取物的制备方法包括如下步骤，
①取人参叶，用蒸馏水加热回流提取，过滤除杂，浓缩为人参叶提取液；
②取大孔吸附树脂装柱，倒入人参叶提取液，反复吸附后先用蒸馏水洗脱，再用乙醇洗脱，洗脱液为原人参三醇组皂苷；
③乙醇洗脱，洗脱液为原人参二醇组皂苷；
④将原人参三醇组皂苷和原人参二醇组皂苷洗脱液合并，减压浓缩至100～200mL，得到原人参皂苷浓缩液；
⑤向步骤④所述原人参皂苷浓缩液中加入天冬氨酸水溶液，密封混匀，反应5～8h；
⑥将反应后的样品取出，冷冻或喷雾干燥，过筛，得到稀有人参皂苷原料粉。
作为优选的实施方式，在上述制备方法中：
步骤①中所述蒸馏水为8倍量，
加热回流提取2次，每次2h，
浓缩的人参叶提取液相对密度为1.05～1.08，优选为1.06；
步骤②中所述大孔吸附树脂为40g，
倒入的人参叶提取液为300mL，
吸附时间为2h，
所述洗脱用蒸馏水体积为200mL，
所述洗脱用乙醇的体积分数40％，体积为250mL；
步骤③中所述洗脱用乙醇的体积分数80％，体积为250mL；
步骤⑤所述天冬氨酸水溶液体积分数5％，加入量为原人参皂苷浓缩液的10～20倍体积，优选的为15倍体积；
反应时间优选为6h，反应温度为120℃；
步骤⑥中所述筛的目数为80目。
本申请还提供了包含桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的组合物在制备用于降糖药物中的用途，所述用途可以为医学上用于降糖的任何形式的用途，如注射药物、口服药物、配合辅助等，作为组合物的使用形态，可以为本领域内的任何形式，如片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、混悬剂、溶液剂等。
有益效果：
本申请提供的组合物包含桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物，可以有效缓解糖尿病患者餐后血糖波动，缓解甘油三酯和血清总胆固醇的升高，改善胰岛素抵抗的同时，修复受损的胰岛β细胞功能，改善胰腺组织形态，达到治疗糖尿病综合症的作用。
本申请提供的组合物中稀有人参皂苷提取物Rg5可以有效抑制了细胞中过量活性氧的产生。
本申请提供的制备降血糖组合物的方法，得到的组合物可以更好的发挥组合物的效果。
本申请提供的组合物在制备用于降糖药物中的用途，提供糖尿病治疗领域使用药品和技术的更多选择。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。
实施例
表1各实施例和对比例中所使用的主要实验原料比例
Figure BDA0003634088530000101
实施例1一种用于降糖的组合物的制备
(1)桑叶生物碱提取物的制备
①选择产地为云南、干燥温度不高于60℃的桑叶为原料；
②使用粉碎机将桑叶粉碎：粉碎粒度80目；
③加入酒精，然后超声波提取：酒精浓度80％，料液的重量比为1:40，提取时间1小时，提取温度50℃，超声功率：1000W，提取3次，提取完成合并滤液后使用200目细筛过滤去除滤渣，得到提取液进行8000rpm离心15min，得到上清液；
④将所述上清液使用旋蒸仪(上海亚华)旋蒸去除酒精，离心收集上清液，上清液用酸型阳离子交换树脂(天津巴斯夫树脂科技有限公司，732)，吸附12小时，自来水冲洗去杂后，调节桑叶提取液上柱pH为5.5，浓度为0.07mg/mL，并控制流速为1.0mL/min上样，洗脱溶剂为1.0mol/L氨水:乙醇(50:50，v/v)，收集洗脱液旋蒸去除氨水，浓缩至后离心得上清夜；
⑤将上清液用强碱性阴离子交换树脂(天津巴斯夫树脂科技有限公司，201×7)吸附3小时，并用去离子水洗脱，收集流出液，浓缩至后冷冻真空干燥，得到桑叶生物碱的原料粉1。
(2)所述人参降血糖药用活性物质提取方法，依次包括以下步骤：
①取人参叶，用8倍量蒸馏水加热回流提取2次，每次2h。过滤除杂，减压浓缩至相对密度为1.06的人参叶提取液；
②取大孔吸附树脂(河北沧州宝恩化工有限公司HPD-100)40g装柱，倒入人参叶提取液300mL，反复吸附2h后先用蒸馏水200mL洗脱，再用体积分数40％的乙醇250mL洗脱，洗脱液为原人参三醇组皂苷；
③用体积分数80％的乙醇250mL洗脱，洗脱液为原人参二醇组皂苷；
④将原人参三醇组皂苷和原人参二醇组皂苷洗脱液合并，减压浓缩(60℃、-0.08MPa、2h)至100mL，得到原人参皂苷浓缩液；
⑤向步骤④所述原人参皂苷浓缩液，准确加入1.5L 5％天冬氨酸水溶液，密封混匀，在120℃条件下反应6h；
⑥将反应后的样品取出，冷冻真空干燥，过80目筛，得到稀有人参皂苷的原料粉2。
(3)取桑叶生物碱原料粉10g，稀有人参皂苷原料粉10g，按照1:1比例充分混合均匀，得到混合物粉末。
实施例2-6和对比例1-2的组合物，其混合物粉末制备方式与实施例1相同，其中，桑叶生物碱原料粉和人参皂苷原料粉的比例见表1，其他未提及事宜与实施例1相同。
试验例1细胞活性氧(ROS)测定
取对数生长期的HepG2细胞进行布板，使用胰酶消化细胞，将细胞收集到离心管中，离心后使用新的培养液重悬细胞后进行布板。之后在细胞培养至合适的密度后，吸除孔板中上清液，分别加入含有不同胰岛素浓度(0.01、0.1和1μM)和含有高葡萄糖(30mM)的无血清DMEM诱导HepG2细胞24小时，葡萄糖氧化酶法试剂盒检测上清液葡萄糖浓度，计算葡萄糖消耗，筛选出最合适的胰岛素浓度。
确定最佳浓度后，重复上述布板工作，待HepG2细胞贴壁后，加入上述所得浓度的胰岛素和含有高葡萄糖(30mM)的无血清DMEM的培养液，分别诱导HepG2细胞12、24和48小时，葡萄糖氧化酶法检测孔板中上清液葡萄糖含量，筛选出最佳诱导时间。
取状态良好HepG2细胞进行消化、离心和计数。将细胞悬液稀释至2×105个细胞/孔，均匀地接种在24孔板中。
实验分为正常对照组(Con)，模型组(IR)和实验组。待细胞生长至合适密度后，正常组加入正常DMEM培养液，其他组换上含有胰岛素和高葡萄糖的无血清5％DMEM培养液，将实施例1-6和对比例2制备的混合物粉末溶解在DMSO中，配置成10mg/mL的母液，培养基稀释至50μg/mL工作液，取150μL分别加入到各实验组中，处理24小时后，吸除孔板上清液并使用冰冷的PBS洗涤，接着加入DCFH-DA(10mM)染色30分钟，之后使用PBS洗涤后通过流式细胞仪测定HepG2细胞中活性氧的产生。
结果显示，建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型，最合适的胰岛素浓度为1μM，最佳诱导时间为24h。使用活性氧检测试剂盒检测HepG2细胞中ROS的产生，结果如表1所示，与正常对照组HepG2细胞相比，模型组IR-HepG2细胞中ROS的产生显著增加(###P＜0.001)。然而使用本工艺制备的降糖组合物处理后的IR-HepG2细胞中ROS的产生显著降低，桑叶生物碱原料粉和稀有人参皂苷原料粉1:2、1.2.5和1:3组合优于1:1.5组合，优于1:1、2:1、3:1组合。
表1本工艺制备降血糖组合物对胰岛素抵抗HepG2细胞ROS的影响
Figure BDA0003634088530000121
Figure BDA0003634088530000131
注：与正常对照组相比，###P＜0.001，与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001试验例2胰岛β细胞INS-1保护作用
取对数生长期胰岛β细胞INS-1，用含10％FBS的RPMI 1640培养基调整1*105个/ml接种于96孔培养板中，每孔100μL。将接种细胞后的96孔板置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养，待细胞生长至80％融合时，加入含四氧嘧啶的药物处理。将实施例1-6和对比例1制备的混合物粉末溶解在DMSO中，配置成10mg/mL的母液，用含16mM四氧嘧啶培养基稀释至50μg/mL工作液，取100μL分别加入到各实验组中，同时设置正常对照组和模型组，每组设6复孔，每孔加入150μL。培养48h后，MTT比色法于570nM波长下测定各组吸光度值。按照如下公式INS-1细胞活力的增加率＝(给药组细胞活力-模型组细胞活力)/模型组细胞活力*100％，计算人参皂苷单体对INS-1损伤模型细胞活力的增加率。
采用本工艺制备的降血糖组合物均能有效地提高损伤模型的细胞活力，其中桑叶生物碱原料粉和稀有人参皂苷原料粉以1:2、1:2.5和1:3进行配比，修复效果最佳。
表2组合物对四氧嘧啶所致INS-1细胞损伤的修复作用
Figure BDA0003634088530000132
Figure BDA0003634088530000141
注：与正常对照组相比，###P＜0.001，与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001试验例3α-葡萄糖苷酶抑制活性
本实验以PNPG(对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷)为底物，通过高效液相色谱仪(岛津LC-2040)检测水解产物4-硝基酚(p-Nitrophenol，PNP)的变化，确定α-葡萄糖苷酶的活性。实验在1.5mL离心管中进行，根据所采用的反应体系(总体积为160μL)：25μL 0.067mol/LPH 6.8的磷酸盐缓冲溶液、5μL待测样品，30μL 0.1U/mLα-葡萄糖苷酶，振荡混匀，37℃孵育20min，加入20μL 4.0mmol/L PNPG开启反应，振荡混匀，37℃反应30min后，加入80μL0.2mol/L Na2CO3终止反应，加超纯水稀释至500μL，振荡混匀，经0.45μm膜过滤后，用HPLC检测，通过产物PNP的浓度变化，计算α-葡萄糖苷酶的活性。设置阿卡波糖为阳性对照，浓度为50μg/mL，待测样品为将实施例1-6和对比例1-2制备的混合物粉末溶解在含5％DMSO超纯水中，浓度为50ug/mL，同时设定空白对照(以等体积的磷酸盐缓冲溶液代替酶液)和阴性对照(以等体积的DMSO(二甲基亚砜)代替待测样品)，按照下式计算抑制率：
抑制率(％)＝(A-B)/A×100
式中，A为不加待测样品时PNP的浓度(扣除相应空白，mmol/L)；B为加入待测样品后PNP的浓度(扣除相应空白，mmol/L)。
结果如表3所示，采用本工艺制备的降血糖组合物均能有效地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其中桑叶生物碱原料粉和稀有人参皂苷原料粉以1:1.5、1:2和2:1进行配比，抑制效果最好。
表3组合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率(％)
Figure BDA0003634088530000142
Figure BDA0003634088530000151
试验例4db/db小鼠动物模型功效评价
动物实验：本实验所使用模型动物为7周龄雄性db/db小鼠，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司(动物合格证号：202011445)。动物均饲养在温度控制为22～25℃，湿度控制为40～60％和12小时黑暗/光照周期环境中，所有小鼠均给予相同的标准饮食。
动物适应性喂养一周后，db/db小鼠随机分为模型组(db/db)和三个实验组，同时设置正常对照组(db/m)，每组8只小鼠。实验组为本研究所制备的降血糖组合物体外优选出的配比，桑叶生物碱原料与稀有人参皂苷原料粉比例分别为1:1.5、1:2和1:2.5，给药剂量为50mg/kg，用40％PEG400水溶液进行配制，每天上午固定时间通过灌胃途径给药，其中对照组和模型组给予等体积溶媒，连续给药八周。
指标检测：
1)给药前和给药后每周测定一次小鼠的空腹血糖，测试空腹血糖前禁食12h，尾静脉缺血，使用血糖仪(ACCU-CHEK，罗氏，德国)测试空腹血糖；
2)在给药的第7周，将小鼠禁食12小时以上，小鼠当天给药后，口服蔗糖(4g·kg-1)，并在0、15、30、60、90和120分钟使用血糖仪测量每组小鼠血糖值。在给药的第8周，将小鼠禁食6小时以上，小鼠给药后，腹膜注射人胰岛素(0.75U·kg-1)，并在0、30、60、90和120分钟时使用血糖仪取测量小鼠血糖值。然后根据血糖水平绘制血糖与时间曲线，并计算每条曲线下的曲线下面积(AUC)。
3)给药结束，处死小鼠，取血分离血清，ELISA检测总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)。
4)取小鼠胰腺组织，在10％中性福尔马林溶液中固定48小时，使用苏木精和伊红(H&E)染色，将切片置于光学显微镜下观察胰腺组织形态，主要观察各组小鼠胰岛及胰岛细胞的形态变化。
试验结果：
1)如图1所示，与db/m小鼠相比，未治疗的db/db小鼠空腹血糖显著升高；与未治疗的db/db小鼠相比，连续灌胃给药8周，本工艺制备的降血糖组合物显著降低了db/db小鼠的空腹血糖，桑叶生物碱原料粉：稀有人参皂苷原料粉以1:2和1:2.5进行配比，其对空腹血糖的控制优于1:1.5组合。
2)在给药7周后和8周分别对小鼠进行了口服蔗糖耐量试验和胰岛素耐量试验(ITT)。结果如图2，本工艺制备的降血糖组合物可以有效的改善db/db小鼠的口服蔗糖耐量和胰岛素耐量，与未治疗的db/db小鼠相比，均具有显著性差异(*p＜0.05、**p＜0.01或***p＜0.001)，初步证明桑叶生物碱原料粉：稀有人参皂苷原料粉组合物可以有效降低糖尿病小鼠的餐后血糖，改善胰岛素抵抗。桑叶生物碱原料粉：稀有人参皂苷原料粉以1:2进行配比，其对餐后血糖和胰岛素抵抗的整体改善效果优于1:1.5和1:2.5组合。
3)使用ELISA试剂盒分析本工艺制备的降血糖原料对db/db小鼠血脂的影响，如图3所示，与db/m小鼠相比，db/db小鼠的TG(###p＜0.001)和TC(#p＜0.05)水平显著增加。db/db小鼠血脂异常现象能够被本工艺制备的降血糖组合物逆转，桑叶生物碱原料粉：稀有人参皂苷原料粉以1:2和1:2.5配比得到的组合物，对血脂异常改善效果优于1:1.5组合。
4)胰腺病理切片如图4所示，db/m正常小鼠组胰腺内胰岛结构清晰规则，边界分明，胰岛细胞排列有序，形态清晰，胞浆丰富；db/db小鼠组可见胰岛增生肥大，岛内β细胞核增多，胞浆减少，排列紊乱。采用本工艺制备的降血糖原料连续灌胃八周后，胰腺组织形态得到明显改善，桑叶生物碱原料粉：稀有人参皂苷原料粉以1:2和1:2.5配比得到的组合物，对胰岛组织改善效果优于1:1.5组合。
本次动物试验结果表明，桑叶生物碱原料粉：稀有人参皂苷原料粉以1:2比例组合，对空腹血糖和餐后血糖控制，以及对胰岛素抵抗和胰岛组织的改善效果最佳。
以上实施例与对比例是为了更好的证明本申请内容的效果及优势，但本申请的实施方式并不受实施例的限制，其他任何未背离本申请的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替代方式，都包含在本申请的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种具有降糖活性的组合物，其特征在于，包含作为活性成分降糖的有效量的桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物，
其中，所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的重量比为1:3～2:1。
2.根据权利要求1所述的具有降糖活性的组合物，其特征在于，所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的重量比为1:1～1:3。
3.根据权利要求1所述的具有降糖活性的组合物，其特征在于，所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的重量比为1:1.5～1:3，优选的，重量比1:1.5～1:2.5，优选的，重量比为1:2。
4.一种制备上述具有降糖活性的组合物的方法，其特征在于，
制备桑叶生物碱提取物；
制备稀有人参皂苷提取物；
将所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物充分混合均匀。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述桑叶生物碱提取物中桑叶生物碱的含量不低于25％。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述稀有人参皂苷提取物中稀有人参皂苷总含量不低于40％。
7.根据权利要求4～6任一所述的制备方法，其特征在于，所述桑叶生物碱提取物的制备方法包括如下步骤，
选择桑叶为原料；
将桑叶粉碎，加入有机溶剂，超声波提取；
提取完成合并滤液后细筛过滤去除滤渣，得到提取液进行离心，得到第一上清液；
将所述第一上清液旋蒸去除酒精，离心收集得第二上清液，第二上清液用酸型阳离子交换树脂吸附，自来水冲洗去杂后上样，洗脱，收集洗脱液旋蒸去除氨水，浓缩后离心得第三上清液；
将第三上清液用强碱性阴离子交换树脂吸附，并用去离子水洗脱，收集流出液，浓缩后冷冻或喷雾干燥，得到桑叶生物碱原料粉。
8.根据权利要求4～7任一所述的制备方法，其特征在于，所述稀有人参皂苷提取物的制备方法包括如下步骤，
取人参叶，用蒸馏水加热回流提取，过滤除杂，浓缩为人参叶提取液；
取大孔吸附树脂装柱，倒入人参叶提取液，反复吸附后先用蒸馏水洗脱，再用乙醇洗脱，洗脱液为原人参三醇组皂苷；
进一步使用乙醇洗脱，洗脱液为原人参二醇组皂苷；
将原人参三醇组皂苷和原人参二醇组皂苷洗脱液合并，减压浓缩至，得到原人参皂苷浓缩液；
称取一定量所述原人参皂苷浓缩液，加入天冬氨酸水溶液，密封混匀，反应5～8h；
将反应后的样品取出，冷冻或喷雾干燥，过筛，得到稀有人参皂苷原料粉。
9.包含桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的组合物在制备用于降糖药物中的用途，其特征在于，
所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的重量比为1:3～2:1。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物的重量比为1:1～1:3，优选的，重量比为1:1.5～1:3，优选的，重量比1:1.5～1:2.5，优选的，重量比为1:2。
11.根据权利要求9或10所述的用途，其特征在于，该具有降糖活性的组合物中包含桑叶生物碱提取物和稀有人参皂苷提取物作为唯一降糖活性成分。
12.根据权利要求9～11任一所述的用途，其特征在于，所述组合物可以选自片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、混悬剂、溶液剂中的一种或几种。
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