CN107468835A - 微生物发酵蒲黄的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物发酵蒲黄的组合物及其应用，所述的微生物发酵蒲黄的组合物是将药材蒲黄浸泡、配料、灭菌后，经红曲霉菌、双歧杆菌、乳杆菌发酵制得。显微镜下观察结果显示：微生物发酵使蒲黄花粉粒细胞壁破裂，有利于提取内容物；未发酵蒲黄花粉粒较完整。成分比较实验结果显示：本发明的发酵蒲黄组合物多糖含量明显高于未发酵蒲黄组合物。镇痛作用试验结果显示：发酵蒲黄组合物镇痛效果明显高于未发酵蒲黄组合物，说明本发明的发酵蒲黄组合物可用于预防和治疗瘀血性疼痛疾病。

Description

微生物发酵蒲黄的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及中药发酵组合物及中药加工技术，特别是涉及中药蒲黄经微生物发酵达到增效目的，属于医药技术领域。

背景技术

蒲黄 (Pollen Typhae) 为香蒲科植物水烛香蒲 Typha angustifolia L. 东方香蒲 Typha orientalis Presl 或同属植物的干燥花粉。蒲黄是一味经典中药，从汉代起就开始使用，始载于《神农本草经》，被其列为上品，味甘，微辛，性凉，有凉血止血、活血祛瘀、止痛利尿等功效，主治血瘀所致的经闭、痛经、产后瘀滞腹痛、跌打损伤和各种出血证。

近年来，人们对蒲黄的化学成分和药理活性的研究越来越深入，化学成分的研究主要集中在多糖、甾类、黄酮类、脂肪烃类化合物、酸性成分和无机成分等。蒲黄具有多种药理作用，使用安全，无明显的毒副作用，具有镇痛、抗凝促凝(与浓度有关)、促进血液循环、降低血脂、防止动脉硬化、保护高脂血症所致的血管内皮损伤，提高体内环磷酸腺苷(CAMP)水平，防治冠心痛、高脂血症和心肌梗死，兴奋收缩子宫、增强免疫力等作用，还有促进肠蠕动、抗炎、抗低压低氧等药理作用。

蒲黄属于花粉类中药，花粉粒坚硬的外壁阻止人体对其活性成分的吸收，将花粉粒破壁有利于对其进行深层开发与利用。历代以来，人们对蒲黄的炮制方法进行了多种探索，有蒸、焙、炒黄、纸包炒、炒黑等，其中以炒黄、炒炭为主，并一直沿用至今。已有的炮制技术不能充分利用其活性成分，或者因加热温度过高，破坏了蒲黄的活性成分。

发明内容

本发明提供了一种微生物发酵蒲黄的组合物及其制备方法，是将优选的菌种，加入到经预处理的蒲黄中，利用微生物生长活动产生活性物质，有效破除蒲黄花粉粒细胞壁和果胶类物质形成的物理屏障，打通蒲黄花粉粒内外壁的部分通道(萌发孔、萌发沟)，从而使得内壁中的内含物从此通道释放出来，并实现对蒲黄成分的结构性修饰，同时，微生物在生长过程中产生的代谢产物与蒲黄成分产生协同作用，以达到提高药效的目的。本发明采用的技术方案如下：

将药材蒲黄浸泡、配料、灭菌后，经红曲霉菌、双歧杆菌、乳杆菌发酵制得，具体制备方法步骤如下：

（1）浸泡：加入药材蒲黄重量的3-30倍水，浸泡0.5-2.0小时，得到蒲黄水浸混悬液；

（2）配料：在步骤（1）得到的混悬液中加入葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、磷酸氢二钾、７水合硫酸镁、７水合硫酸亚铁，调整pH值至6.5±0.5；

（3）灭菌： 105-121℃高温高压灭菌10-120min；

（4）接种：步骤（3）得到的灭菌后的蒲黄混合液，温度降至25-37℃，分级接种预培养好的红曲霉菌种中至少一种菌体培养液、双歧杆菌菌种中至少一种菌体培养液和乳杆菌菌种中至少一种菌体培养液；

（5）发酵：将步骤（4）得到的已接种的蒲黄混合液，在25-37℃环境下，按常规发酵条件培养3-15天，结束发酵，即得到所述的微生物发酵蒲黄的组合物。

所述的微生物发酵蒲黄的组合物中蒲黄的质量百分比为3-25%。

步骤（2）中所述的葡萄糖的加入量为0.1-2%（质量g/体积mL）；所述的蛋白胨的加入量为0.1-1.0%（质量g/体积mL）；所述的酵母提取物的加入量为0.1-0.5%（质量g/体积mL）；所述的磷酸氢二钾的加入量为0.05-0.2%（质量g/体积mL）；所述的７水合硫酸镁的加入量为0.02-0.07%（质量g/体积mL）；所述的７水合硫酸亚铁的加入量为0.001-0.005%（质量g/体积mL）。

步骤（4）中所述红曲霉菌、双歧杆菌及乳杆菌的接种量分别为体积百分比1-10%，菌种来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）（中国，北京）或者中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)（中国，北京）。

根据本发明的优选实施方案，用于发酵蒲黄的红曲霉菌选自红色红曲霉 、紫色红曲霉、普通红曲霉 ；双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌；乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。

红曲霉菌(Monascus spp．)接种于米饭培养基经发酵后的产物称为红曲，也被称为神曲或丹曲，在我国有上千年的应用历史，主要用作食品发酵剂、着色剂、防腐剂、增香剂及中药配伍。随着红曲研究的深入，红曲中的多种有益代谢产物如色素、monacolin K、γ-氨基丁酸(GABA)、麦角固醇等成分已被广泛应用于现代食品、医药、饲料和化妆品等领域中。红曲霉菌能产生淀粉酶、葡萄糖苷酶、纤维素酶等丰富的酶系，能有效破除花粉类中药细胞壁和果胶类物质形成的物理屏障，使有效活性成分溶出。monacolin K是红曲中能降低人体血液中胆固醇的有效物质。γ-氨基丁酸(GABA)对哺乳动物的中枢神经具有普遍抑制作用，是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，具有镇静作用。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。双歧杆菌和乳杆菌都属于乳酸菌，乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且乳酸菌的特殊生理活性和营养功能，正日益引起人们的重视。大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。也正因为如此，乳酸菌被广泛用于轻工业、食品、医药及饲料工业等许多行业上。

微生物发酵中药技术，既可用于中药炮制领域，也可用于中药成分转化领域，是目前中药研究的热点，利用微生物强大的生物转化能力，对中药进行破壁或活性成分转化，利于有效成分的提取与分离，提高疗效，甚至增加新功效。

微生物发酵花粉粒是利用发酵过程中微生物产生的各种酶，在常温下，打通花粉内外壁的部分通道(萌发孔、萌发沟)，从而使得内壁中的内含物从此通道释放出来，利于有效成分的吸收利用。并且微生物在生长过程中产生的某些代谢产物与中药成分产生协同作用，起到增效目的。

微生物发酵中药机理可概括为4个方面：（1）微生物在生长过程中产生生物活性物质能转化或修饰中药化学成分。（2）微生物在次生代谢过程中产生的活性化合物和中药中的成分发生反应，产生新的化合物。（3）中药所含的某些成分可以改变微生物的代谢途径，形成新的成分或改变各成分的相互比例。（4）微生物的代谢产物可以改善中药成分在体内的吸收利用度。

本发明还提供了所述的微生物发酵蒲黄的组合物在制备预防和治疗瘀血性疼痛疾病的药物中的应用。

可按照制药工业中已知的方法将本发明的发酵组合物固液分离或干燥与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂或稀释剂按适当的比例混合，并按已知方法除菌后制成含本发明发酵组合物的中药配方颗粒或制剂。

根据给药途径的不同，可按照已知的常规方法，将本发明的发酵组合物配制成适于口服给药的合剂、口服液、乳剂、散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂。

根据使用目的的不同，本发明的发酵组合物制剂除含有作为基本活性成分的发酵组合物外，还可含有一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性，并对基本活性成分表现有辅助或协同作用，但彼此又互不拮抗的天然或合成的其他药物成份或其混合物。

一般说来，本发明的发酵组合物的口服给药剂量可根据待治疗的病症或病理状态的性质、严重程度、病人的年龄、体重、一般健康状态，以及病人对所用药物的敏感性、耐受性和给药方式等因素，按照个体化的原则由临床医生确定。

有益效果：为检测本发明制备的微生物发酵蒲黄组合物先进性，分别进行了花粉粒显微镜下观察对比以及成分比较实验和镇痛作用比较试验。显微镜下观察结果显示：发酵蒲黄花粉粒破壁明显，未发酵蒲黄花粉粒较完整。成分比较实验结果显示：本发明的发酵蒲黄组合物多糖含量明显高于未发酵蒲黄组合物。镇痛作用试验结果显示：发酵蒲黄组合物镇痛效果明显高于未发酵蒲黄组合物。

附图说明

图1为本发明未经微生物发酵的蒲黄显微镜镜像图；

图2为本发明实施例1发酵蒲黄的显微镜镜像图；

图3为本发明实施例2发酵蒲黄的显微镜镜像图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1：发酵蒲黄的组合物A的制备

取中药蒲黄50g，加水1000ml浸泡1.0 小时，加入葡萄糖50ｇ，蛋白胨10ｇ，酵母提取物1g，磷酸氢二钾１g，７水合硫酸镁 0.5g，７水合硫酸亚铁 0.01ｇ，调整pH值为6.5。于115℃下灭菌50分钟，待温度降至30℃时，接种预培养的体积百分比5%的红曲霉（CGMCC 3.567）的菌液，置于30℃转速 180 r / min 的旋转式摇床培养 72小时，再接种预培养的体积百分比各为1.0%的短双歧杆菌（CGMCC 1.2213）、青春双歧杆菌（CGMCC 1.2190），37℃培养6小时，再接种预培养的体积百分比各为1.0%的植物乳杆菌（CGMCC 1.19）、干酪乳杆菌（CGMCC1.3206），37℃培养24小时，然后，温度降至28℃培养7天，取样检测，蒲黄花粉粒破壁明显（如图2），结束发酵，得到发酵蒲黄的组合物A。

实施例2：发酵蒲黄的组合物B的制备

取中药蒲黄200g，加水1000ml浸泡2.0 小时，加入葡萄糖20ｇ，蛋白胨5ｇ，酵母提取物5g，磷酸氢二钾2g，７水合硫酸镁 0.2g，７水合硫酸亚铁 0.02ｇ，调整pH值为6.0。于115℃下灭菌50分钟，待温度降至30℃时，接种预培养的体积百分比6%的红曲霉（CGMCC 3.4701）的菌液，置于30℃转速 180 r / min 的旋转式摇床培养 48小时，再接种预培养的体积百分比2.0%的两歧双歧杆菌（CGMCC 1.5090）的菌液，37℃培养12小时，再接种预培养的体积百分比2.0%的鼠李糖乳杆菌（ CGMCC 1.104）的菌液，37℃培养24小时，然后，温度降至28℃培养5天，取样检测，蒲黄花粉粒破壁明显（如图3），结束发酵，得到发酵蒲黄的组合物B。

实验例1：发酵蒲黄与未发酵蒲黄花粉粒显微镜下观察

取实施例1、2制备的发酵蒲黄组合物A、B和按相似方法制备的未经微生物发酵的蒲黄组合物，作为供试样品。

分别取少量供试品按常规涂片方法，经结晶紫溶液、碘试液染色，乙醇脱色，置于光学显微镜下放大400倍观察。

结果：未发酵蒲黄花粉粒边缘清晰，花粉粒完整（见附图1）；发酵蒲黄花粉粒边缘模糊，花粉粒已破壁，内容物大量渗出（见附图2、3）。

结论：微生物发酵使蒲黄花粉粒细胞壁破裂，有利于提取内容物。

实验例2：发酵蒲黄组合物与未发酵蒲黄组合物多糖含量比较

取实施例1、2制备的发酵蒲黄的组合物A、B和按相似方法制备的未经微生物发酵的蒲黄的组合物，稀释相同浓度，作为供试样品。

对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水溶解，制成每1ml约含80μg的溶液。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置10ml具塞试管中，各加水至1.0ml，精密加入5％苯酚溶液1ml（临用前配制），摇匀，再精密加硫酸5ml，摇匀，置沸水浴中加热20分钟，取出，置冰水浴中冷却15分钟，以相应的试剂作空白，照紫外-可见分光光度法，在490nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

测定法：取供试样品适量，离心（转速为每分钟4000转）20分钟，精密量取上清液5ml，缓缓加入无水乙醇20ml，边加边振摇，密封，放置20分钟，离心（转速为每分钟4000转）20分钟，上清液弃去，沉淀加少量95%乙醇轻轻洗沉淀表面及管壁2次，尽量挥尽乙醇，沉淀加热水溶解（必要时超声），转移至250ml容量瓶中，放冷，并定容至刻度。精密吸取1.0ml，置10ml具塞试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“精密加入5％苯酚溶液1ml”起，依法操作，以相应的试剂作空白，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中无水葡萄糖的量，计算，即得，结果见表1。

表1：发酵蒲黄组合物与未发酵蒲黄组合物多糖含量

结论：经发酵蒲黄多糖含量明显高于未发酵蒲黄。

实验例3：发酵蒲黄与未发酵蒲黄镇痛实验比较

取实施例1、2制备的发酵蒲黄的组合物A、B和按相似方法制备的未经微生物发酵的蒲黄组合物，分别分离上清液并浓缩至相同浓度（药液﹕药材=1ml﹕1g），作为供试样品。

化学刺激法

取雌性小白鼠 50只，随机分成 5组，每组 10 只。发酵蒲黄A、B组分别以实施例1、2制备的发酵蒲黄的组合物浓缩溶液灌胃，每只0．2 mL；未发酵蒲黄组以未经微生物发酵的蒲黄组合物浓缩溶液灌胃，每只0．2 mL；阳性对照组小白鼠给予吗啡0．2 mL，腹腔注射；阴性对照组每只小鼠腹腔注射0．9%氯化钠注射液0．2 mL。30min后，分别腹腔注射0.05%酒石酸锑钾 0.1ml/10g，记录各鼠在30min 内的扭体次数，并计算出各组扭体反应抑制率。

表2：小鼠对化学刺激的反应

由表2结果可见，给予发酵蒲黄的组合物浓缩液和未发酵蒲黄浓缩液后，小鼠对化学刺激的反应得到不同程度抑制，扭体次数明显低于正常组，发酵蒲黄A、B组扭体次数明显少于未发酵蒲黄组，说明本发明经微生物发酵蒲黄的组合物镇痛效果明显提高。

Claims (8)

1.一种微生物发酵蒲黄的组合物，其特征在于，将药材蒲黄浸泡、配料、灭菌后，经红曲霉菌、双歧杆菌、乳杆菌发酵制得，制备方法步骤如下：

（1）浸泡：加入药材蒲黄重量的3-30倍水，浸泡0.5-2.0小时，得到蒲黄水浸混悬液；

（2）配料：在步骤（1）得到的混悬液中加入葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、磷酸氢二钾、７水合硫酸镁、７水合硫酸亚铁，调整pH值至6.5±0.5；

（3）灭菌： 105-121℃灭菌10-120min；

（4）接种：步骤（3）得到的灭菌后的蒲黄混合液，温度降至25-37℃，分级接种预培养好的红曲霉菌种中至少一种菌体培养液、双歧杆菌菌种中至少一种菌体培养液、乳杆菌菌种中至少一种菌体培养液；

（5）发酵：将步骤（4）得到的已接种的蒲黄混合液，在25-37℃环境下，按常规发酵条件培养3-15天，结束发酵，即得到所述的微生物发酵蒲黄的组合物。

2.根据权利要求1所述的微生物发酵蒲黄的组合物，其特征在于，所述的微生物发酵蒲黄的组合物中蒲黄的质量百分比为3-25%。

3.根据权利要求1所述的微生物发酵蒲黄的组合物，其特征在于，步骤（2）中所述的葡萄糖的加入量为质量g/体积mL比0.1-2%；所述的蛋白胨的加入量为质量g/体积mL比0.1-1.0%；所述的酵母提取物的加入量为质量g/体积mL比0.1-0.5%；所述的磷酸氢二钾的加入量为质量g/体积mL比0.05-0.2%；所述的７水合硫酸镁的加入量为质量g/体积mL比0.02-0.07%；所述的７水合硫酸亚铁的加入量为质量g/体积mL比0.001-0.005%。

4.根据权利要求1所述的微生物发酵蒲黄的组合物，其特征在于，步骤（4）中所述红曲霉菌、双歧杆菌及乳杆菌的接种量分别为体积百分比1-10%。

5.根据权利要求1所述的微生物发酵蒲黄的组合物，其特征在于，所述的红曲霉菌选自红色红曲霉 、紫色红曲霉、普通红曲霉；所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌；所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。

6.权利要求1-5任一项所述的微生物发酵蒲黄的组合物在制备预防和治疗瘀血性疼痛疾病的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，按照制药工业中已知的方法将所述的发酵蒲黄的组合物固液分离或干燥，与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂或稀释剂按适当的比例混合，按已知方法除菌后制成中药配方颗粒或制剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的制剂还添加有一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性，并对基本活性成分表现有辅助或协同作用，但彼此又互不拮抗的天然或合成的其他药物成份或其混合物。