CN106616945A - 一种以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物及其制备方法 - Google Patents
一种以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物及其制备方法。将益生菌接种于含有虫草腺苷提取物的发酵培养基中进行发酵培养，即获得以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合发酵物；其中，虫草腺苷提取物从虫草或蛹虫草培养残基中提取获得。本发明从虫草或虫草固体培养残基提取虫草腺苷，以上述虫草腺苷提取物为底物，进行益生菌发酵，获得的发酵产物中既包含大量益生菌，又同时保留了大部分虫草活性物质，还获得虫草腺苷经由益生菌代谢后的新活性物质，从而具有调整肠道菌群生态平衡、提高免疫力、促进人体健康等功效。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物及其制备方法。
背景技术
冬虫夏草主要指子囊菌门中虫草属真菌，是我国传统名贵中药，具有止咳、化痰、降低胆固醇、调节和增强免疫力、抗肿瘤等药理作用。冬虫夏草悠久的应用历史和丰富多彩的生物活性激起许多科学工作者的高度研究热情。大量的现代药理研究表明虫草菌丝体、生药、醇和水或乙酸乙酯等提取物具有广泛药理活性，其活性涉及到对免疫系统、心血管系统、神经系统、呼吸系统、内分泌系统、肝脏和肾脏功能、机体代谢等各个方面，具有调节免疫、降血脂、保护肝脏肾脏和心脑组织、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、降血糖、抗菌、抗氧化、抗炎、镇静和抗辐射等多方面作用。到目前为止，除了常见的甘露醇、腺苷、麦角甾醇、氨基酸、脂肪酸、维生素、微量元素等外，还发现冬虫夏草中含一些特有的活性成分，如虫草素、虫草酸以及虫草多糖。然而，对上述各个活性成分的确切功效尚未有清晰的研究结论。
目前普遍认为虫草中的核苷类物质(腺苷、尿苷、鸟苷)是冬虫夏草的主要有效成分之一，尤其是虫草腺苷，它具有明显的药理作用，如改善心脑血液循环、防止心律失常、抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性等。虫草素(cordycepin)又称虫草菌素、3’-脱氧腺苷,也是一种腺苷，它具有中医医理中的阴阳同补和双向调节人体平衡的功能，可以护肝、保肾、润肺、大补气血。从西医医理角度看，虫草素具有抗肿瘤、抗衰老、抗菌、抗病毒、免疫调节、改善新陈代谢、清除自由基等多种药理作用，有良好的临床应用前景。
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的微生物的总称。益生菌主要包括：双歧杆菌、乳杆菌、放线菌、酵母菌等，随着研究手段的进步，近年来又有许多益生菌被陆续发现。
人体肠道内益生菌的主要作用包括：
1.帮助营养物质的消化吸收。许多益生菌株在胃肠道内可产生消化酶，这些酶可帮助人体更好地消化所摄入的食品及吸收食品中的营养成分。益生菌还可竞争性抑制有害微生物吸收营养物质及进入血液循环系统。嗜酸乳杆菌是这方面的代表菌株，可分泌消化乳糖的乳糖酶，从而缓解乳糖不耐症。
2.产生重要的营养物质。益生菌能产生维生素，包括泛酸、尼克酸、B1,B2,B6及维生素K等，同时能产生短链脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸等等，对骨骼成长和心脏健康有重要作用。
3.抵抗细菌病毒的感染，提升免疫通过三大步骤，益生菌可清除有害菌对身体的伤害：1)抑制有害菌的生长。益生菌通过产生杀灭有害菌的化学物质，及与有害菌竞争空间和资源而遏制它们的生长。2)抑制有害菌产生毒素。3)清除有害菌产生的毒素。
4.预防和治疗某些疾病，如肠道综合症、呼吸道感染、生殖系统感染、过敏、口臭、胃溃疡等。人体许多健康问题都是由体内菌群失衡引起，可通过使体内菌群重新达到生态平衡来实现缓解与治疗的目的。例如腹泻、便秘、阴道感染等症状，经过多年的研究和实践，证明使用经临床证实的特定益生菌可有效地进行治疗。
目前，益生菌已被广泛应用于食品、医药、农业等领域。
代生素(Postbiotic)是益生菌代谢产物中的非生命物质，它可以发挥益生菌的生物学作用。代生素是近年来国际益生菌研究领域出现的一个新词汇，对于究竟有哪些物质可以称作代生素？代生素的有效成分有哪些？代生素由哪些益生菌产生？目前学术界对上述问题尚了解得极少。通常地，我们可以把益生菌生长到一定阶段后提取的有生物学作用的有效成分作为代生素。
尽管人们认识到虫草腺苷是虫草的主要有效成分之一，也认识到益生菌及代生素对人体肠道微生态平衡的重要调节作用，但迄今为止并没有把虫草腺苷与益生菌及代生素相关联起来的研究报道。申请人研究结果证实了虫草腺苷被益生菌转化后的产物可以发挥代生素的作用。鉴于此，本专利提供了一种以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物及其制备方法。
发明内容
本发明目的在于提供了一种以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物，将益生菌接种于含有虫草腺苷提取物的发酵培养基中进行发酵培养，即获得以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合发酵物；其中，虫草腺苷提取物从虫草或虫草培养残基中提取获得，虫草提取物的添加量占发酵培养基体积的0.1-5.0％。用于发酵接种的益生菌种子液中的益生菌含量不少于1×108CFU/ml，接种量在发酵培养基体积的1-20％。
所述虫草为冬虫夏草、蛹虫草、虫草菌丝体中的一种或多种的混合物；
所述虫草腺苷提取物为粗提液或将粗提液进一步纯化、浓缩的浓缩液；所述虫草腺苷提取物中包含虫草素与虫草腺苷等。
其中，粗提液为将所述虫草或蛹虫草固体培养残基粉碎，而后与水按体积比1:2-20的比例混合，混合后经20-60℃浸提1-10小时，然后过滤，滤渣重复上述提取2-3次，将所得滤液合并，即为粗提液；或蛹虫草液态培养发酵液过滤后，即得粗提液；浓缩液为将粗提液过滤后经反相ODS填料柱吸附洗脱，每升滤液添加20-60g的填料，而后依次用5-15个柱体积的水、5-15个柱体积的乙醇水溶液和乙醇洗脱，收集洗脱液再经浓缩即为虫草腺苷浓缩液；其中，所述乙醇水溶液为体积百分比5-30％的乙醇水溶液；ODS填料粒径小于等于150μm。收集洗脱液再经浓缩即得到含量约1-20％的虫草腺苷浓缩液。
所述益生菌发酵分为活化阶段、前期发酵和后期发酵，益生菌的活化阶段采用活化培养基，28-37℃，厌氧培养6-36小时；益生菌的前期发酵采用发酵培养基，28-37℃，厌氧培养6-36小时；在益生菌的后期发酵阶段向发酵培养集中加入虫草腺苷粗提液(包括虫草素与虫草腺苷等)，粗提液的加入量占发酵体积的0.5-25％，继续发酵24-72小时至发酵结束。
所述益生菌活化培养基，其配方为：酪蛋白胨10g，酵母浸出粉2.5g，葡萄糖5g，大豆蛋白胨5g，吐温-80 1.0ml，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，混合盐溶液5ml和蒸馏水995ml，经过115℃、30分钟灭菌，待用；其中，混合盐溶液：K2HPO4 20.0g，MgCl2·6H2O 5.0g，ZnSO4·7H2O2.5g，CaCl21.5g和FeCl3 0.5g，加蒸馏水至100ml。。
所述益生菌发酵培养基为：蛋白胨5.0g,牛肉膏5.0g,胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐温-80 1.0ml，K2HPO4 2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，ZnSO4·7H2O 0.25g，MgSO4·7H2O0.1g，加蒸馏水至1000ml；经115℃、30分钟灭菌，待用。
所述益生菌为双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、酵母菌中的一种或多种混合物。用于发酵接种的益生菌种子液中的益生菌含量不少于1×108CFU/ml，接种量在发酵培养基体积的1-20％。
所述的虫草腺苷提取物的粗提液或浓缩液，在使用前需经115℃、30分钟灭菌。
所述以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合发酵物经机械加工方法，制成液体、膏剂、颗粒剂或片剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明通过益生菌在含有虫草腺苷提取物的发酵培养基中进行发酵，利用虫草腺苷为底物，将虫草腺苷被益生菌转化后的产物可以发挥代生素的作用，即能获得大量益生菌，又能保留大部分虫草活性物质，还能产生由益生菌转化虫草腺苷而成的新代谢产物，从而发挥益生菌与虫草活性物质的双重功效，起到调整肠道菌群生态平衡、提高免疫力、促进人体健康等作用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述本发明的内容作出的一些非本质的改进和调整也属于本发明保护的范围。
本发明从虫草或虫草固体培养残基提取虫草腺苷，以上述虫草腺苷提取物为底物，进行益生菌发酵，获得的发酵产物中既包含大量益生菌，又同时保留了大部分虫草活性物质，还获得虫草腺苷经由益生菌代谢后的新活性物质，从而具有调整肠道菌群生态平衡、提高免疫力、促进人体健康等功效。
实施例1：
1)虫草腺苷粗提液的获得：将蛹虫草子实体粉碎后，与水按体积比1:5的比例混合，混合后经40℃浸提6小时，然后过滤，滤渣重复上述提取2次，将所得滤液合并，得虫草腺苷粗提液。
2)益生菌发酵：采用婴儿双歧杆菌作为益生菌进行发酵，发酵分为三个阶段，即活化阶段、前期发酵和后期发酵。益生菌的活化阶段采用活化培养基，在37℃，厌氧培养24小时；益生菌的前期发酵采用发酵培养基，在37℃，厌氧培养36小时。在益生菌的后期发酵阶段加入虫草素与上述获得虫草腺苷粗提液，虫草素与上述获得虫草腺苷粗提液的加入量约占发酵培养基体积的5％，在37℃下继续厌氧发酵36小时至发酵结束，即获得发酵产物。
上述用于发酵接种的婴儿双歧杆菌种子液中的益生菌含量为5×108CFU/ml，接种量为发酵培养基体积的8％。
实施例2：
1)虫草腺苷浓缩液的获得：将冬虫夏草子实体粉碎后，与水按体积比1:5的比例混合，混合后经40℃浸提6小时，然后过滤，滤渣重复上述提取3次，将所得滤液合并，得粗提液。
把上述粗提液过滤，滤液经反相ODS填料柱吸附，每升滤液添加40g的填料，而后依次用6个柱体积的水、6个柱体积的乙醇水溶液和乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩后成为虫草腺苷浓缩液；其中，所述乙醇水溶液为体积百分比10％的乙醇水溶液；ODS填料粒径小于等于60μm。收集洗脱液后采用乙醇对柱子再生，循环利用。
2)益生菌发酵：采用嗜酸乳杆菌作为益生菌进行发酵，发酵分为三个阶段，即活化阶段、前期发酵和后期发酵。活化阶段采用活化培养基，37℃，厌氧培养12小时；前期发酵采用发酵培养基，37℃，厌氧培养24小时。在后期发酵阶段加入虫草素与上述获得虫草腺苷提取物的浓缩液，虫草腺苷提取物的浓缩液约占发酵液体积的2％，在37℃下继续发酵24小时至发酵结束，即获得发酵产物。在该发酵产物中获得大量嗜酸乳杆菌，又能保留大部分虫草活性物质，还能产生由益生菌转化虫草腺苷而成的新代谢产物。
上述用于发酵接种的嗜酸乳杆菌种子液中的益生菌含量为1×109CFU/ml，接种量为发酵培养基体积的10％。
实施例3：
1)虫草腺苷粗提液的获得：将蛹虫草培养基(含有虫草菌丝体及小麦或大米)粉碎后，与水按体积比1:3的比例混合，混合后经30℃浸提8小时，然后过滤，滤渣重复上述提取2次，将所得滤液合并，得粗提液。
2)益生菌发酵：采用酵母菌作为益生菌进行发酵，发酵分为三个阶段，即活化阶段、前期发酵和后期发酵。活化阶段采用活化培养基，28℃，厌氧培养12小时；前期发酵采用发酵培养基，28℃，厌氧培养12小时。在后期发酵阶段加入上述获得虫草腺苷提取物粗提液，上述获得虫草腺苷提取物粗提液约占发酵体积的5％，继续发酵48小时至发酵结束，即获得发酵产物。在该发酵产物中获得大量酵母菌，又能保留大部分虫草活性物质，还能产生由益生菌转化虫草腺苷而成的新代谢产物。
上述用于发酵接种的酵母菌种子液中的益生菌含量为5×108CFU/ml，接种量为发酵培养基体积的10％。
实施例4：
1)虫草腺苷浓缩液的获得：将蛹虫草子实体粉碎后，与水按体积比1:10的比例混合，混合后经40℃浸提8小时，然后过滤，滤渣重复上述提取3次，将所得滤液合并，得粗提液。
把上述粗提液过滤，滤液经反相ODS填料柱吸附，每升滤液添加50g的填料，而后依次用8个柱体积的水、8个柱体积的乙醇水溶液和乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩后成为虫草腺苷浓缩液；其中，所述乙醇水溶液为体积百分比25％的乙醇水溶液，ODS填料粒径小于等于80μm，收集洗脱液后采用乙醇对柱子再生。
2)益生菌发酵：采用长双歧杆菌和嗜热链球菌作为益生菌进行发酵，发酵分为三个阶段，即活化阶段、前期发酵和后期发酵。活化阶段采用活化培养基，37℃，厌氧培养8小时；在益生菌的发酵阶段加入虫草腺苷提取物浓缩液，占发酵体积的2％，继续发酵36小时至发酵结束，即获得发酵产物。在该发酵产物中既获得了大量长双歧杆菌和嗜热链球菌，又能保留大部分虫草活性物质，还产生由益生菌转化虫草腺苷而成的新代谢产物。
上述用于发酵接种的长双歧杆菌和嗜热链球菌种子液中的益生菌含量为1×109CFU/ml，接种量为发酵培养基体积的5％。
同时，将上述实施例1-4获得的以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合发酵物经机械加工方法，制成液体、膏剂、颗粒剂或片剂。
上述实施例1-4中的活化培养基和发酵培养基配方如下：
活化培养基，其配方为：酪蛋白胨10g，酵母浸出粉2.5g，葡萄糖5g，大豆蛋白胨5g，吐温-80 1.0ml，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，混合盐溶液5ml和蒸馏水995ml，经过115℃、30分钟灭菌，待用；其中，混合盐溶液：K2HPO4 20.0g，MgCl2·6H2O 5.0g，ZnSO4·7H2O2.5g，CaCl21.5g和FeCl3 0.5g，加蒸馏水至100ml。。
发酵培养基为：蛋白胨5.0g,牛肉膏5.0g,胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐温-80 1.0ml，K2HPO4 2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，ZnSO4·7H2O0.25g，MgSO4·7H2O 0.1g，加蒸馏水至1000ml；经115℃、30分钟灭菌，待用。
上述实施例1-4中发酵产物提高小鼠免疫力的实验如下：
1.小鼠血清溶血素测定
试验动物：昆明种雌性小白鼠，体重18-22g。
试验方法：取雄性小鼠随机分组：空白对照组、试验组，小鼠每天灌胃给药1次，每次给药量为1.5g/kg，空白对照组给予等容量的蒸馏水。连续30d后分别对动物进行血清溶血素指标测定。
血清溶血素测定：于灌胃第25天给小鼠腹腔注射2％SRBC(0.2ml/只)，于免疫后第5天摘眼球采血，分离血清并在微量血凝板上进行血清溶血素测定：37℃孵育3h，统计血球凝集度，计算相应抗体积数。试验结果见表1。
2.小鼠抗体生成细胞检测
试验方法：取雄性小鼠随机分组：空白对照组、试验组，小鼠每天灌胃给药1次，每次给药量为1.5g/kg，空白对照组给予等容量的蒸馏水。连续30d后分别对动物进行抗体生成细胞(PFc)检测指标测定。
抗体生成细胞(PFc)检测：于灌胃第25天给小鼠腹腔注射2％SRBC0.2ml/只，于免疫后第5天处死，解剖取脾制备脾细胞悬液，用RPMI1640完全培养液调整脾细胞浓度为5x109个/L。按程序方法制备琼脂糖玻片，在CO2培养箱(37℃、5％CO2)中温育1.5h后加补体，再温育1.5h，计数每张琼脂薄层玻片上形成的溶血空斑数。试验结果见表1。
上述小鼠免疫力指标的试验结果表明，本发明所获得的代生素与益生菌复合物具有很好提高免疫力的作用。
表1.对小鼠血清溶血素和抗体生成细胞检测结果
| 组别 | 动物数(只) | 抗体积数 | 溶血空斑数(个/106脾细胞) |
| 对照组 | 9 | 135.2±6.3 | 595±104 |
| 实施例1 | 9 | 174.4±11.7 | 667±132 |
| 实施例2 | 9 | 181.9±15.3 | 815±201 |
| 实施例3 | 9 | 165.5±15.6 | 724±198 |
| 实施例4 | 9 | 213.1±20.8 | 833±220 |
Claims (8)
1.一种以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物，其特征在于：将益生菌接种于含有虫草腺苷提取物的发酵培养基中进行发酵培养，即获得以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合发酵物；其中，虫草腺苷提取物为从虫草或蛹虫草培养残基中提取获得。
2.按权利要求1所述的以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物，其特征在于：所述虫草为冬虫夏草、蛹虫草、虫草菌丝体中的一种或多种的混合物。
3.一种按权利要求1所述的以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物的制备方法，其特征在于：将益生菌接种于含有虫草腺苷提取物的发酵培养基中进行发酵培养，即获得以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合发酵物；其中，虫草腺苷提取物从虫草或蛹虫草培养残基中提取获得。
4.按权利要求3所述的以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物的制备方法，其特征在于：所述虫草腺苷提取物为粗提液或将粗提液进一步纯化、浓缩的浓缩液；其中，粗提液为将所述虫草或虫草固体培养残基粉碎，而后与水混合，浸提后即为粗提液；或蛹虫草液态培养发酵液过滤后，即得粗提液；浓缩液为将粗提液过滤后经反相ODS填料柱吸附洗脱，而后依次用水、乙醇水溶液和乙醇洗脱，收集洗脱液再经浓缩即得到虫草腺苷含量约1-20％的虫草腺苷浓缩液。
5.按权利要求3所述的以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物的制备方法，其特征在于：所述益生菌发酵培养分为活化阶段、前期发酵和后期发酵，益生菌的活化阶段采用活化培养基，28-37℃，厌氧培养6-36小时；益生菌的前期发酵采用发酵培养基，28-37℃，厌氧培养6-36小时；在益生菌的后期发酵阶段向发酵培养基中加入虫草腺苷提取物，提取物的加入量占发酵培养基的0.1-5.0％，继续发酵24-72小时至发酵结束，获得以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合发酵物。
6.按权利要求5所述的以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物的制备方法，其特征在于：所述益生菌活化培养基，其配方为：酪蛋白胨10g，酵母浸出粉2.5g，葡萄糖5g，大豆蛋白胨5g，吐温-80 1.0ml，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，混合盐溶液5ml和蒸馏水995ml，经过115℃、30分钟灭菌，待用；其中，混合盐溶液：K2HPO4 20.0g，MgCl2·6H2O 5.0g，ZnSO4·7H2O2.5g，CaCl21.5g和FeCl3 0.5g，加蒸馏水至100ml；
所述益生菌发酵培养基为：蛋白胨5.0g,牛肉膏5.0g,胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐温-80 1.0ml，K2HPO4 2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，ZnSO4·7H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.1g，加蒸馏水至1000ml；经115℃、30分钟灭菌，待用。
7.按权利要求4所述的以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物的制备方法，其特征在于：所述益生菌为双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、酵母菌中的一种或多种混合物；用于发酵接种的益生菌种子液中的益生菌含量不少于1×108CFU/ml，接种量为发酵培养基体积的1-20％。
8.按权利要求1所述的以虫草腺苷为底物的代生素与益生菌复合物的制备方法，其特征在于：所述以虫草腺苷提取物为底物的代生素与益生菌复合发酵物经机械加工方法，制成液体、膏剂、颗粒剂或片剂。
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