CN107974476B - 一种虫草素转化为3’-脱氧肌苷的生物转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及活性物质的生物转化，具体为一种虫草素转化为3’‑脱氧肌苷的生物转化方法。将虫草素溶解于水得终浓度为0.25‑1.0mg/mL的虫草素溶液，而后加入1‑5g L.casei菌体混匀，置于28‑37℃条件下厌氧培养12‑72h，即得使虫草素转化为3’‑脱氧肌苷。本发明利用L.casei能够将虫草素进行生物转化，进而生成新的化学成分3’‑脱氧肌苷，经高效液相色谱(HPLC)、液质联谱(LC/MS)和核磁共振波谱(NMR)检测后证明虫草素被生物转化后生成了3’‑脱氧肌苷(3’‑Deoxyinosine)，其转化率达98.3％。

Description

一种虫草素转化为3’-脱氧肌苷的生物转化方法
技术领域
本发明涉及活性物质的生物转化，具体为一种虫草素转化为3’-脱氧肌苷的生物转化方法。
背景技术
虫草素(Cordycepin)又名3’-脱氧腺苷(3’-Deoxyadenosine)，是蛹虫草中的主要活性成分，也是第一个从真菌中提取分离出的一种核苷类抗菌素，分子式为C10H13N5O3。虫草素具有抗菌、抗病毒、干扰人体RNA及DNA合成和显著抑制多种肿瘤细胞生长的作用。此外，虫草素还有免疫调节、抗炎、抗衰老、扩张支气管等药理作用。
人们通常通过食用冬虫夏草(或蛹虫草)来达到保健及治疗的目的，而作为虫草核心功能成分的虫草素在人体肠道中的代谢尚不清楚。大量研究表明，中药中的某些化学成分可由肠道菌群对其化学成分进行代谢，从而形成新的活性成分并被人体吸收。杨秀伟等发现，罗汉果皂苷Ⅲ经人肠内细菌转化后生成罗汉果皂苷ⅡA1和罗汉果醇，进而在体内体现出生物学活性。刘铁汉等发现淫羊藿苷易被肠道内菌丛所代谢。因此，可以推测虫草素极有可能被肠道菌群代谢，从而产生新的化学成分进入人体发挥作用。
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，L.casei)属于乳杆菌属(Lactobacillus)，是一种重要的肠道益生菌。L.casei广泛存在于食物与肠道中，因其能够耐受有机体的防御机制，其中包括口腔中的酶、胃液中低pH值和小肠的胆汁酸等，所以L.casei进入人体后可以在肠道内大量定植。近年来对乳杆菌的研究发现，乳杆菌能够调节机体胃肠道的正常菌群，保持肠道微生态平衡，提高食物消化率和生物效价，并能够抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生。以L.casei为主要成分制成的系列产品(如食品、饮料、保健品等)深受广大消费者青睐，市场需求量巨大。近年来，虫草与L.casei复合发酵形成的新的食品与保健品相继出现，开辟了虫草功能食品的新领域。然而L.casei发酵过程对虫草素是否有代谢，代谢后的产物对人体健康是否有影响，这是目前虫草新产品开发过程中亟待解决的关键问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种虫草素转化为3’-脱氧肌苷的生物转化方法
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种虫草素转化为3’-脱氧肌苷的生物转化方法，将虫草素溶解于水得终浓度为0.25-1.0mg/mL的虫草素溶液，而后加入1-5g L.casei菌体混匀，置于28-37℃条件下厌氧培养12-72h，即得使虫草素转化为3’-脱氧肌苷。
所述厌氧培养48-72h，即使得98.0％以上的虫草素被转化为3’-脱氧肌苷。
所述L.casie菌体的活菌数为1.0×107—9.9×109cfu/g。
所述L.casei菌体的制备：将干酪乳杆菌按1-20％体积比的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧条件下培养12-72h，培养菌液于5000-10000rpm离心5-20min，去掉上清，菌体沉淀用无菌生理盐水反复洗涤，离心收集沉淀于4℃保存备用；其中，菌体沉淀用无菌生理盐水洗3次，每次洗涤后由5000-10000rpm×5-20min离心。
所述转化后溶液中的产物(3’-脱氧肌苷)经半制备液相色谱仪分离纯化，冻干，-20℃保存，即可。
本发明具有如下优点：
本发明利用L.casei能够将虫草素进行生物转化，进而生成新的化学成分3’-脱氧肌苷，可进一步为研究肠道菌对虫草素的生物转化以及口服虫草素的药理作用提供化学依据，为开拓虫草新功能、开发虫草新产品提供线索。
附图说明
图1为本发明实施例提供的虫草素标准品HPLC图谱。
图2为本发明实施例提供的生物转化后溶液HPLC图谱。
图3为本发明实施例提供的虫草素与CA标准曲线图。
图4为本发明实施例提供的转化过程中底物与产物含量分析图。
图5为本发明实施例提供的虫草素的生物转化结果图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的解释说明。
实施例1
1.1生物转化
L.casei菌体制备：取干酪乳杆菌菌种，按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧条件下培养24h。菌液于6000rpm离心10min，去掉上清，菌体沉淀用无菌生理盐水洗3次，每次洗涤后以6000rpm*10min进行离心，收集沉淀后于4℃保存备用。
L.casei对虫草素的生物转化：50mg虫草素溶解于200mL纯净水中，终浓度为0.25mg/mL。将2g上述获得L.casei(活菌数为3.6×109cfu/g)菌体转移至上述虫草素溶液中混匀，置于37℃条件下厌氧培养72h，定时取样以HPLC法测定不同时间虫草素和代谢物，每每12h取样一次，由HPLC法测定虫草素和CA(参见图4)，根据标准曲线计算虫草素和CA浓度，结果如图4所示。随培养时间延长，虫草素含量逐渐降低，CA含量上升，24h-48h的转化效率最高，在72h时CA含量最高，此时虫草素的转化率达98.3％，转化过程基本完成。
1.2转化产物的HPLC检测
将上述培养后的溶液经0.22μm的无菌滤膜过滤，收集滤液，采用YL9100型高效液相色谱设备对虫草素与代谢物进行检测。
HPLC色谱条件：Welch
Figure BDA0001543876560000031
AQ-C18,5μm,4.6*250mm色谱柱，柱温35℃，流动相为8％乙腈，UV 260nm，流速为1mL/min，进样量为5μL。
HPLC检测结果显示，虫草素标准品的保留时间为8.45min(图1)。虫草素经由L.casei转化后，在保留时间4.95min时得到一个新的产物(图2)，标记为CA。转化产物CA经半制备液相色谱仪分离纯化，得到26mg白色粉末状纯品。通过峰面积与浓度绘制标准曲线图(图3)，拟合方程分别为：虫草素，Y＝21520X+34.328，R2＝0.9973；CA，Y＝21980X+24.974，R2＝0.9964。
转化后溶液中的新产物经戴安半制备液相色谱仪分离纯化，冻干，-20℃保存。
取虫草素标准品与制备型液相色谱仪分离出产物纯品，经水分别配置成0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL溶液，经HPLC进行检测，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并根据标准曲线计算对应浓度。
1.3转化产物的LC-MS分析
利用LC-MS设备对上述生物转化后的滤液进行检测。
液相色谱条件：Welch
Figure BDA0001543876560000032
AQ-C18,5μm,4.6*250mm色谱柱，流动相为8％乙腈，UV 260nm，流速为0.8mL/min。
质谱条件：离子源为ESI源，喷雾电压3500V，离子源温度270℃，雾化气压30psi，辅助气压10psi，毛细管温度320℃，质量扫描范围50.00～500.0m/z。
产物CA为白色粉末，ESI-MS m/z 253[M+H]+,275[M+Na]+；1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:8.42(1H,s,H-2),8.08(1H,s,H-8),5.87(1H,d,J＝1.56Hz,H-1’),4.50(1H,m,H-2’),4.37(1H,m,H-4’),3.70(1H,dd,J＝3.18Hz,J＝12.06Hz,H-5’a),3.53(1H,dd,J＝3.84Hz,J＝12Hz,H-5’b),2.21(1H,m,H-3’a),1.89(1H,m,H-3’b)；13C-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:156.5(C-6),147.7(C-4),146.1(C-8),138.3(C-2),123.8(C-5),91.0(C-1’),81.3(C-4’),75.3(C-2’),62.2(C-5’),33.8(C-3’)。核磁数据与文献【1】中3’-脱氧肌苷的数据一致，故鉴定化合物CA为3’-脱氧肌苷(3’-deoxyinosine)(图5)。参考文献1：Qiu W,Wu J,Choi JH,etal.Cytotoxic compounds against cancer cells from Bombyx mori inoculated withCordyceps militaris[J].Biosci Biotechnol Biochem,2017,81(6):1224-1226.
实施例2：
步骤1：L.casei菌体制备：取干酪乳杆菌菌种，按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧条件下培养24h。菌液于6000rpm离心10min，去掉上清，菌体沉淀用无菌生理盐水洗3次，每次洗涤后以6000rpm*10min进行离心，收集沉淀后于4℃保存备用。
步骤2：L.casei对虫草素的生物转化：50mg虫草素溶解于200mL纯净水中，终浓度为0.25mg/mL。将步骤1中获得的2g L.casei(活菌数为3.6×109cfu/g)菌体转移至上述虫草素溶液中混匀，置于37℃条件下厌氧培养72h，定时取样以HPLC法测定不同时间虫草素和代谢物产物的含量，根据标准曲线计算对应的物质含量。
步骤3.把步骤2中获得的转化后溶液中的新产物经半制备液相色谱仪分离纯化，冻干，-20℃保存，即可。

Claims (5)

1.一种虫草素转化为3’-脱氧肌苷的生物转化方法，其特征在于：将虫草素溶解于水得终浓度为0.25-1.0mg/mL的虫草素溶液，而后加入1-5g L. casei菌体混匀，置于28-37℃条件下厌氧培养12-72h，即使得虫草素转化为3’-脱氧肌苷。
2.按权利要求1所述的虫草素转化为3’-脱氧肌苷的生物转化方法，其特征在于：所述厌氧培养48-72h，即使得98.0%以上的虫草素被转化为3’-脱氧肌苷。
3.按权利要求1所述的虫草素转化为3’-脱氧肌苷的生物转化方法，其特征在于：所述L. casie菌体的活菌数为1.0×107—9.9×109cfu/g。
4.按权利要求3所述的虫草素转化为3’-脱氧肌苷的生物转化方法，其特征在于：所述L. casei菌体的制备：将干酪乳杆菌按1-20%体积比的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧条件下培养12-72h，培养菌液于5000-10000rpm离心5-20min，去掉上清，菌体沉淀用无菌生理盐水反复洗涤，离心收集沉淀于4℃保存备用。
5.按权利要求1所述的虫草素转化为3’-脱氧肌苷的生物转化方法，其特征在于：所述转化后溶液中的产物3’-脱氧肌苷经半制备液相色谱仪分离纯化，冻干，-20℃保存，即可。
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