CN111253460A - 一种具有抗炎活性的三萜类药物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然药物领域，具体涉及一种具有抗炎活性的三萜类药物及其制备方法和应用。本发明经研究表明式I所示的化合物能够抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生NO，因此表明该化合物能够用于制备具有抗炎作用的食品和/或药品。该化合物来源于药用真菌桦褐孔菌，经验证，其副作用小，安全，在抗炎药物开发方面具有良好的应用前景。

Description

一种具有抗炎活性的三萜类药物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及天然药物技术领域，尤其涉及一种具有抗炎活性的三萜类药物及其制备方法和应用。

背景技术

炎症本身是一种生物防御反应，为了消除有害刺激、清除坏死的细胞、并修复受损的组织而产生的一系列生理反应，例如红肿、发热、疼痛以及功能障碍等等，这些反应是免疫系统在感染和组织损伤过程中维持正常组织稳态的基本行为。炎症在分子水平上是一个复杂的过程，炎症期间由巨噬细胞促进产生促炎因子，所述促炎因子包括肿瘤坏死因子(TNF-α)，各种白细胞介素，前列腺素(PG)，一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)等。研究表明哮喘，癌症，关节炎和其他相关的慢性退行性疾病均与这些促炎介质的过量产生有关。为了治愈炎症性疾病，需要调节整个过程中分泌的各种化学介质的产生。世界范围内，最常见的用于炎症和相关疾病的药物代表有阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬、酮洛芬、氟比洛芬等。然而，现有的炎症药物并非在所有病例中都有效，而且长期服用这些药物会引起一些不良反应，如失眠、呕吐、头痛、高血压等。因此，有必要寻找新的抗炎活性物质，为新型抗炎药物的研发提供先导物。

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)，也称作桦树茸、白桦茸，是俄罗斯的一种民间药用真菌，主产于北纬40°～50°的高寒地区，在我国主要分布于吉林和黑龙江省，其寄生于白桦树上，生长期达15～20年，可耐零下40℃的极寒。桦褐孔菌入药部位主要是菌核，大量药理实验表明其有治疗糖尿病、抗癌(乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、宫颈癌)、抗病毒和增强免疫力等作用。化学成分研究表明，桦褐孔菌中含有丰富的活性三萜类化合物，可能是其主要的有效成分。有研究发现从桦褐孔菌中分离得到的桦褐孔菌醇能够保护PC12细胞免受氧葡萄糖剥夺－再恢复引起的损伤，表明其具有用于治疗中风的潜力。而目前关于桦褐孔菌中具有抗炎活性物质的报道较少。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种具有抗炎活性的三萜类药物及其制备方法和应用，所述三萜类药物来自药用真菌桦褐孔菌，能有效抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生NO，具有抗炎的作用，且具有良好的安全性。

本发明提供了一种具有抗炎活性的三萜类药物，具有式I所示结构：

在本发明实施例中，以LPS诱导RAW264.7细胞产生NO为模型，对式I所示化合物进行抗炎活性评价，结果表明，所述式I所示化合物可有效抑制NO的产生。

所述RAW264.7细胞指小鼠单核巨噬细胞白血病细胞。

所述LPS为脂多糖，是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分。

本发明提供了上述具有抗炎活性的三萜类药物的制备方法，包括以下步骤：

S1)将桦褐孔菌子实体粉碎后，以体积分数不低于95％的乙醇水溶液浸提，优选浸提3次，所得浸提液过滤后合并浓缩得浸膏A；

S2)将所述浸膏A加水制成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；

S3)取浸膏B，过减压柱，经石油醚、乙酸乙酯的混合液以及氯仿、甲醇的混合液梯度洗脱，得到20个流分，记为Fr.1～Fr.20；

S4)取Fr.19经反相硅胶柱色谱进行洗脱，得到32个流份，记为Fr.19-1～Fr.19-32；

S5)取Fr.19-25经硅胶柱色谱洗脱得到17个流份，记为Fr.19-25-1～Fr.19-25-17；

S6)取Fr.19-25-14经硅胶柱色谱洗脱得到6个流份，记为Fr.19-25-14-1～Fr.19-25-14-6；

S7)取Fr.19-25-14-5经制备TLC，得到式I所示化合物。

本发明优选的，所述步骤S4)中，反相硅胶柱色谱采用的流动相为甲醇、水体系，所述甲醇和水的体积比为3:7～1:0。

本发明优选的，所述步骤S5)中，硅胶柱色谱采用的流动相为石油醚、氯仿、甲醇体系，所述石油醚、氯仿、甲醇的体积比为20:5:0.1。

本发明优选的，所述步骤S6)中，硅胶柱色谱采用的流动相为石油醚、丙酮体系，所述石油醚和丙酮的体积比为20:1。

本发明优选的，所述步骤S7中，制备TLC采用的流动相为氯仿、甲醇体系，所述氯仿和甲醇的体积比为10:1。

本发明提供了上述三萜类药物或上述制备方法制备的三萜类药物在制备抗炎活性抑制剂中的应用。

本发明提供了上述三萜类药物或上述制备方法制备的三萜类药物在缓解炎症反应的药物中的应用。

优选的，所述炎症为脂多糖引起的炎症。

优选的，所述缓解炎症反应包括缓解机体发红、肿胀、发热、疼痛等症状，抑制产生促炎因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素、前列腺素(PG)、一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)中的一种或多种。

本发明提供了一种抗炎药物，包括上述三萜类药物或上述制备方法制备的三萜类药物和药学上可接受的辅料。

本发明对所述抗炎药物的剂型并无特殊限定，可以为片剂、胶囊剂、粉针剂或混悬剂等本领域技术人员熟知的剂型。

本发明发现了一种新的、具有良好抗炎活性的三萜类化合物，研究表明式I所示的化合物能够抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生NO，因此表明该化合物能够用于制备具有抗炎作用的食品和/或药品。该化合物来源于药用真菌桦褐孔菌，经验证，其副作用小，安全，在抗炎药物开发方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1是式(1)所示化合物的¹H NMR图谱；

图2是式(1)所示化合物的¹³C NMR图谱；

图3是式(1)所示化合物的HSQC图谱；

图4是式(1)所示化合物的¹H-¹³C HMBC图谱；

图5是式(1)所示化合物的¹H-¹H COSY图谱；

图6是式(1)所示化合物的ROESY图谱。

具体实施方式

本发明提供了一种具有抗炎作用的药物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1.1仪器与试剂

Bruker AV-500型超导核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司)；Autospec300质谱仪(英国VG公司)；分析型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；半制备高效液相色谱仪(美国Dionex公司)；N-1000(2L)立式旋转蒸发仪和CA-1111冷却水循环装置(上海爱朗仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环真空泵(上海隆拓仪器设备有限公司)；AS 220.R2万分之一电子秤(RADWAG Wagi Elektroniczne)；Sephadex LH-20凝胶(Merck Co.Ltd)；C18反相硅胶(20～45μm，日本Fuji Silysia Chemical Ltd公司)；柱层析用硅胶和薄层层析硅胶板(青岛海洋化工厂)；氘代试剂和色谱甲醇(德国Merck公司)；95％乙醇、重蒸甲醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、丙酮等常用有机试剂(天津科密欧、天津福晨、广州光华等公司)。

1.2化合物的制备和结构鉴定

桦褐孔菌样品于2017年6月购买自俄罗斯，标本存放于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。

取桦褐孔菌子实体粉碎成粉末后，采用95％以上的乙醇水溶液浸提3次，所得浸提液过滤后合并浓缩成浸膏。之后加水搅拌制成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，各萃取层萃取至萃取液无色。各萃取层蒸发浓缩制成浸膏待用。

取乙酸乙酯层浸膏，过减压柱(硅胶H)，采用石油醚：乙酸乙酯(1:0→1:1)→氯仿：甲醇(20:1→0:1)系统梯度洗脱，并将所得馏分分别点板浓缩合并，得到20个流份(Fr.1～Fr.20)。

Fr.19(7.4g)经反相硅胶柱色谱，以30％～100％甲醇水梯度洗脱，得到32个流份(Fr.19-1～Fr.19-32)。Fr.19-25(539.0mg)经硅胶柱(石油醚：氯仿：甲醇＝20:5:0.1)洗脱得到17个流份(Fr.19-25-1～Fr.19-25-17)。Fr.19-25-14(87.7mg)经硅胶柱(石油醚：丙酮＝20:1)洗脱得到6个流份(Fr.19-25-14-1～Fr.19-25-14-6)。Fr.19-25-14-5(15.5mg)经制备TLC(氯仿：甲醇＝10:1)得到式I化合物：

式(1)所示结构鉴定数据如下：高分辨质谱m/z:601.3774[M+Na]⁺，分子式为C₃₇H₅₄O₅；¹H NMR(500MHz)和¹³C NMR(125MHz)数据如表1所示：

表1式(1)所示化合物的NMR数据(溶剂为氘代甲醇)

¹H-¹H COSY和关键的¹H-¹³C HMBC相关如式(2)所示：

粗线表示¹H-¹H COSY相关，箭头表示¹H-¹³C HMBC相关。

实施例2：式I化合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO抑制作用。

2.1仪器与材料

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)、非洲绿猴肾细胞(Vero)由中国科学院干细胞库提供；SW-40超净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；CO₂培养箱(英国RSBiotech公司)；ELX-800酶标仪(美国宝特公司)；胎牛血清FBS，DMEM培养液购自Gibco，USA；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自amresco，USA；吲哚美辛购自Sigma公司。

2.2细胞毒活性评价

采用MTT法测定化合物的细胞毒活性，分别在96孔板上接种100μL浓度约5×10⁴个/mL的待测细胞，于37℃，5％CO₂，90％以上湿度条件下培养24h，加入100μL待测化合物溶液，继续培养72h后，向每孔细胞中加入15μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，4h后吸走上清液，再向每孔加入100μL DMSO，使其充分溶解。在490nm波长下测定每孔的OD值，按下面公式计算肿瘤细胞生长抑制率。阳性对照组为盐酸阿霉素，阴性对照组为DMSO，待测化合物设为5个浓度梯度，横坐标表示待测化合物浓度，纵坐标表示抑制率，作图求出待测化合物的半数抑制浓度(IC₅₀)值。

抑制率＝(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值)×100％

表2化合物对RAW264.7以及Vero细胞的细胞毒活性

2.3抗炎活性评价

选取RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)，在96孔平底细胞培养板上接种100μL浓度为5×10⁴个/mL的细胞，培养于37℃，5％CO₂，90％以上湿度的条件下，24h后加入50μL配制好的待测化合物溶液，继续在该条件下培养，1h后加入50μL配制的LPS(终浓度500ng/mL)溶液，24h后每孔取上清100μL于新的96孔板中，之后向每孔加入100μL(40mg/mL)的Griess试剂，十字交叉法混匀。于酶标仪540nm波长下测定并记录每孔的吸光度，按下面公式计算NO抑制率。对照组为吲哚美辛，阴性对照组为DMSO，把待测化合物倍半稀释6个浓度梯度。用横坐标表示待测化合物浓度，纵坐标表示抑制率，作图求出待测化合物的IC₅₀值。结果如表3所示，化合物能抑制RAW264.7细胞产生NO的含量，且效果显著。

抑制率(％)＝(A₂-A₁)/(A₂-A₀)×100％

式中：A₀、A₁、A₂分别为540nm下测得的空白对照组(不加LPS)、实验组、阴性(加LPS)对照组的吸光值。计算各浓度下的抑制率并绘制化合物浓度—抑制率曲线图，计算得到化合物对LPS诱导RAW264.7产生NO的半抑制浓度(IC₅₀值)。

表3化合物对RAW264.7产生NO的抑制作用

测试样品	抗炎(IC<sub>50</sub>±SDμM)
		吲哚美辛(阳性对照)	42.87±1.64
化合物I	49.29±0.31

以上实施例仅是本发明的优选实施方式，只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和润饰，这些改进和润饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种具有抗炎活性的三萜类药物，具有式I所示结构：

2.权利要求1所述的具有抗炎活性的三萜类药物的制备方法，包括以下步骤：

S1)将桦褐孔菌子实体粉碎后，以体积分数不低于95％的乙醇水溶液浸提，所得浸提液过滤后合并浓缩得浸膏A；

S2)将所述浸膏A加水制成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；

S3)取浸膏B，过减压柱，经石油醚、乙酸乙酯的混合液以及氯仿、甲醇的混合液梯度洗脱，得到20个流分，记为Fr.1～Fr.20；

S4)取Fr.19经反相硅胶柱色谱进行洗脱，得到32个流份，记为Fr.19-1～Fr.19-32；

S5)取Fr.19-25经硅胶柱色谱洗脱得到17个流份，记为Fr.19-25-1～Fr.19-25-17；

S6)取Fr.19-25-14经硅胶柱色谱洗脱得到6个流份，记为Fr.19-25-14-1～Fr.19-25-14-6；

S7)取Fr.19-25-14-5经制备TLC，得到式I所示化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4)中，反相硅胶柱色谱采用的流动相为甲醇、水体系，所述甲醇和水的体积比为3:7～1:0；

所述步骤S5)中，硅胶柱色谱采用的流动相为石油醚、氯仿、甲醇体系，所述石油醚、氯仿、甲醇的体积比为20:5:0.1；

所述步骤S6)中，硅胶柱色谱采用的流动相为石油醚、丙酮体系，所述石油醚和丙酮的体积比为20:1；

所述步骤S7中，制备TLC采用的流动相为氯仿、甲醇体系，所述氯仿和甲醇的体积比为10:1。

4.权利要求1所述的三萜类药物或权利要求2～3任一项所述的制备方法制备的三萜类药物在制备抗炎活性抑制剂中的应用。

5.权利要求1所述的三萜类药物或权利要求2～3任一项所述的制备方法制备的三萜类药物在制备缓解炎症反应的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述炎症为脂多糖引起的炎症。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述缓解炎症反应包括缓解机体发红、肿胀、发热、疼痛，抑制产生促炎因子肿瘤坏死因子、白细胞介素、前列腺素、一氧化氮和活性氧中的一种或多种。

8.一种抗炎药物，包括权利要求1所述的三萜类药物或权利要求2～3任一项所述的制备方法制备的三萜类药物和药学上可接受的辅料。

9.根据权利要求8所述的抗炎药物，其特征在于，所述抗炎药物的剂型为片剂、胶囊剂、粉针剂或混悬剂。

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