CN115894590A - 一种紫芝发酵菌丝体中三萜化合物及其抗炎应用 - Google Patents

一种紫芝发酵菌丝体中三萜化合物及其抗炎应用 Download PDF

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CN115894590A CN202211286894.6A CN202211286894A CN115894590A CN 115894590 A CN115894590 A CN 115894590A CN 202211286894 A CN202211286894 A CN 202211286894A CN 115894590 A CN115894590 A CN 115894590A
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冯娜
戴玉成
张劲松
滕李铭
汪旵
唐庆九
周帅
吴芳
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Beijing Forestry University
Shanghai Academy of Agricultural Sciences
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Beijing Forestry University
Shanghai Academy of Agricultural Sciences
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Abstract

本发明提供了一种紫芝发酵菌丝体中三萜化合物，该三萜化合物的结构式为结构式1、3、4、7。本发明还提供了紫芝发酵菌丝体中三萜化合物作为预防或治疗炎症的药物的应用；所述的紫芝菌丝体中三萜化合物为结构式1‑8的化合物中的一种或一种以上。本发明首次对紫芝菌丝体中分离纯化的三萜化合物进行了抗炎活性测试，发现结构式1‑8的化合物均能抑制TNF‑α和IL‑6释放，具有显著的抗炎活性。

Description

一种紫芝发酵菌丝体中三萜化合物及其抗炎应用
技术领域
本发明涉及食用菌应用领域，具体的说涉及一种紫芝发酵菌丝体中三萜化合物及其抗炎应用。
背景技术
“灵芝”是灵芝属Ganoderma P.Karst.真菌统称，隶属于担子菌门Basidiomycota，蘑菇纲Agaricomycetes，多孔菌目Polyporales，灵芝科Ganodermataceae。紫芝Ganodermasinense J.D.Zhao,L.W.Hsu&X.Q.Zhang是中国药典中规定可作为药物服用的灵芝的一种(中华人民共和国药典，2020版)。目前，由于商品化品种少，菌种抗性低等条件的限制，国内人工栽培的紫芝产量远远低于赤芝。相较于子实体的栽培，紫芝的发酵具有生产周期短、条件可控、发酵产物独特的特性。此外，紫芝的发酵菌丝体中，富含三萜类活性化合物。
炎症是活体组织对病原体、受损细胞或刺激物等有害刺激的一种生理防御反应。当机体受到炎症因子刺激后，会激活体内的巨噬细胞等合成并释放多种炎症介质，如一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)等，增加血管通透性，促进炎症细胞趋化，从而诱导炎症的发生。
从紫芝的发酵产物中寻找抗炎药物或先导化合物，将是紫芝资源开发的一个具有前景的方向。
发明内容
本发明首先提供了一种紫芝发酵菌丝体中三萜化合物，其结构式为如下结构式1、3、4、7的化合物或其药用盐、晶体或水合物：
Figure BDA0003900299290000011
Figure BDA0003900299290000021
本发明还提供了一种用于抗炎的制剂，其含有结构式1-8所示的一种或一种以上化合物或其药用盐以及医学上可接受的载体；
其中所述的结构式1-8的化合物为：
Figure BDA0003900299290000022
Figure BDA0003900299290000031
本发明还提供了紫芝发酵菌丝体中三萜化合物作为预防或治疗炎症的药物的应用；其中所述的紫芝发酵菌丝体中三萜化合物为如下结构式1-8的化合物中的一种或一种以上：
其中所述的结构式1-8的化合物为：
Figure BDA0003900299290000032
Figure BDA0003900299290000041
上述结构式1-8的化合物其化学命名如下：
化合物1：(22S,24E)-3,7-dioxo-15α,22β-dihydroxylanosta-8,24-dien-26-oicacid
化合物2：(22S,24E)-3-oxo-15α,22β-dihydroxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid
化合物3：(22S,24E)-3β-acetoxy-15α,22β-dihydroxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid
化合物4：(22S,24E)-3,7,11-trioxo-15α-hydroxy-22β-acetoxylanosta-8,24-dien-26-oic
acid
化合物5：(22S,24E)-3-oxo-15α-hydroxy-22β-acetoxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid
化合物6：(22S,24E)-3-oxo-15α,22β-diacetoxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid
化合物7：(22S,24E)-15α-hydroxy-3β,22β-diacetoxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid
化合物8：lanosta-7,9(11),24-trien-3β,15α,22β-triacetoxy-26-oic acid
本发明所提供的结构式1-8的化合物还可以作为用于预防和/或治疗炎症或在炎症治疗过程之中或之后起辅助作用的制剂或食品。
本发明提供的从紫芝菌丝体中分离出的八个三萜类化合物均具有显著的抗炎作用，特别是化合物2、7、8抗炎效果突出，具有广阔的市场应用前景。
附图说明
图1Fr3半制备液相色谱图
图2Fr5半制备液相色谱图
图3Fr8半制备液相色谱图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
紫芝Ganoderma sinense(菌种编号：Dai20076)，菌种现保存于北京林业大学生态与自然保护学院微生物所。
小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，产品目录号为SCSP-5036。
DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)：购自美国Gibco公司；
青霉素和链霉素：购自美国Amresco公司；
鼠源TNF-α、IL-6试剂盒：购自北京四正柏生物科技有限公司；
葡萄糖马铃薯琼脂(PDA)：购自北京索莱宝科技有限公司；
葡萄糖、蔗糖、琼脂、MgSO4·H2O、KH2PO4、CaSO4以及分析级甲醇、氯仿、石油醚、丙酮、乙醇、乙醇、乙腈、冰醋酸：均购自国药集团化学试剂有限公司；
色谱级甲醇、乙腈：购自上海安谱实验科技股份有限公司；
水飞蓟素、氘代甲醇、氘代氯仿：购自Sigma公司；
YMC*GEL C18硅胶(50μm,12nm)：北京元宝山色谱科技有限公司；
Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(5μm,4.6mm×250mm)：美国Agilent公司；
Zorbax Eclipse Plus-C18半制备色谱柱(5μm,21.2mm×250mm)：美国Agilent公司；
GF254硅胶板(0.2-0.25mm)：青岛海洋化工厂；
LC3000型高效液相色谱仪：北京创新通恒科技有限公司；
Agilent LC1290 infinity II超高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；
Agilent 6495三重四级杆质谱仪：美国安捷伦公司；
BruBer AB II-600核磁共振波谱仪：德国布鲁克公司；
Synergy HT多功能酶标仪：美国BIO-TEK公司；
Thermo Scientific Q Exactive HF Orbitrap-FTMS高分辨质谱仪：美国赛默飞公司
实施例1紫芝菌丝体发酵
培养基配方：可溶性淀粉3％，葡萄糖1.2％，酵母粉1％，MgSO4·7H2O 0.15％，KH2PO4 0.3％(上述均为重量百分比)，pH自然。
保存在4℃冰箱中的菌种，经过活化，黑暗条件下在摇瓶中进行一级振荡培养7d(150r/min，25℃)，后转接到二级摇瓶中静态培养21d，获得菌丝体。
实施例2紫芝菌丝体的提取和萃取
将干燥的菌丝体用95％乙醇的水溶液常温下浸泡提取3次，每次24小时，合并提取液，浓缩得到紫芝菌丝体醇提物。
进一步将紫芝菌丝体醇提物用等体积的石油醚萃取三次，弃去石油醚相，再用等体积乙酸乙酯萃取剩余相三次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩干燥得到乙酸乙酯相。
实施例3化合物的制备
乙酸乙酯相通过中压层析色谱分离，以YMC C18(50μm,12nm)为填料，以乙腈(A)-0.01％冰醋酸水梯度洗脱(0-15min，A：55％-55％；15-85min，A：55％-75％；85-105min，A：75％-85％；105-115min，A：85％-100％；115-135min，A：100％-100％)，流速为200ml/min，每500mL收集一个流份，共收集60个流份，按照接收顺序进行编号并进行薄层色谱分析，合并薄层色谱板上具有相同比移值(Rf)的流份，共得到Fr1-Fr13。
60个流分经薄层色谱分析后，合并为13个组分：Fr1(1-10，5.02g)、Fr2(11-14，1.14g)、Fr3(15-16，1.65g)、Fr4(17-18，2.68g)、Fr5(19-20，3.89g)、Fr6(21-22，3.95g)、Fr7(23-24，4.3g)、Fr8(25-33，24.88g)、Fr9(34-36，2.78g)、Fr10(36-38，2.46g)、Fr11(39-41，1.33g)、Fr12(42-46，1.72g)、Fr13(47-60，3.17g)。
将Fr1-Fr13进行HPLC检测，根据液相检测结果可知，Fr3、Fr5、Fr8富含三萜化合物的特征吸收峰，因此将Fr3、Fr5、Fr8进行进一步的分离纯化。
Fr3的分离纯化
选择Zorbax Eclipse Plus-C18半制备色谱柱，以乙腈(A)-0.01％冰醋酸水进行梯度洗脱(0.0-18.0min，A：50％-50％；18.0-18.5min，A：50％-100％；18.5-23.0min，A：100％-100％)，240nm波长进行检测。反复制备多次，收集15.5min的色谱峰，得到Fr3-8。
Fr3-8选择Zorbax Eclipse Plus-C18半制备色谱柱，以乙腈(A)-0.01％冰醋酸水梯度洗脱(0.0-12.0min，A：52％-52％；12.0-12.5min，A：52％-75％；12.5-20.0min，A：75％-75％；20.0-21.0min，A：75％-100％；21.0-26.0min，A：100％-100％)，240nm波长进行检测，反复制备多次，收集8.2min的色谱峰，得到化合物1(100.00mg)；收集18.0min的色谱峰，得到化合物2(140.00mg)。
Fr5的分离纯化
Fr5选择Zorbax Eclipse Plus-C18半制备色谱柱，以乙腈(A)-0.01％冰醋酸水进行梯度洗脱(0.0-19.0min，A：80％-80％；19.0-19.5min，A：80％-83％；19.5-25.0min，A：83％-83％；25.0-25.5min，A：83％-100％；25.5-30.0min，A：100％-100％)，240nm波长进行检测。收集15.0min的色谱峰，得到Fr5-4；收集20.8min的色谱峰，得到化合物3(101.00mg)，收集23.0min的色谱峰，得到Fr5-6。
Fr5-4选择Zorbax Eclipse Plus-C18半制备色谱柱，以乙腈(A)-0.01％冰醋酸水进行梯度洗脱(0.0-18.0min，A：53％-53％；18.0-18.5min，A：53％-79％；18.5-27.0min，A：79％-79％；27.0-28.0min，A：79％-100％；28.0-32.0min，A：100％-100％)，240nm波长进行检测，反复制备多次，收集12.2min的色谱峰，得到化合物4(100.00mg)，收集25.0min的色谱峰，得到化合物5(110.00mg)。
Fr5-6选择Zorbax Eclipse Plus-C18半制备色谱柱，以乙腈(A)-0.01％冰醋酸水进行梯度洗脱(0.0-17.0min，A：89％-89％；17.0-17.5min，A：89％-100％；17.5-22.0min，A：100％-100％)，240nm波长进行检测。反复制备多次，收集15.0min的色谱峰，得到化合物6(280.00mg)。
Fr8分离纯化
Fr8选择Zorbax Eclipse Plus-C18半制备色谱柱，以乙腈(A)-0.01％冰醋酸水进行梯度洗脱(0.0-20.0min，A：80％-80％；20.0-20.5min，A：80％-85％；20.5-32.0min，A：85％-85％；32.00-40.5min，A：85％-100％；40.50-45.0min，A：100％-100％)，240nm波长进行检测。反复制备多次，收集35.0min色谱峰，得到化合物7(612.00mg)，收集40.0min色谱峰，得到化合物8(109.00mg)。
实施例3化合物1-8的确认。
利用质谱以及核磁检测等手段，对紫芝菌丝体中得到8个化合物进行结构解析，确定其精准的化学结构，具体的八个化合物的确认信息如下：
化合物1[(22S,24E)-3,7-dioxo-15α,22β-dihydroxylanosta-8,24-dien-26-oicacid]
分子式为C30H44O6，淡黄色无定型粉末，易溶于甲醇、氯仿。HRTOFMS m/z:501.3216[M+H]+(C30H45O6,计算值501.3211)。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δ:6.83(1H,m,H-24),4.24(1H,dd,J＝5.0,10.0Hz,H-15),3.75(1H,m,H-22),2.80(1H,m,H-2),2.77(1H,m,H-6),2.50(2H,m,H-11),2.40(2H,m,H-2,6),2.28(1H,m,H-23),2.19(1H,m,H-1),2.18(1H,m,H-5),2.05(1H,m,H-17),2.04(1H,m,H-16),1.95(1H,m,H-12),1.92(1H,m,H-16),1.84(1H,m,H-1),1.83(1H,m,H-23),1.83(3H,s,H-27),1.81(1H,m,H-12),1.41(1H,m,H-20),1.40(3H,s,H-19),1.14(3H,s,H-29),1.08(3H,s,H-28),0.95(3H,s,H-30),0.92(3H,d,J＝5.0Hz,H-21),0.78(3H,s,H-18)；13C-NMR(CD3OD,125MHz)δ:217.0(C-3),203.6(C-7),171.9(C-26),171.3(C-9),141.2(C-24),140.1(C-8),130.5(C-25),74.0(C-15),73.4(C-22),53.0(C-14),51.7(C-5),48.5(C-4),47.2(C-13),46.4(C-17),42.7(C-20),41.5(C-10),38.1(C-6),37.6(C-16),36.4(C-1),36.0(C-23),35.6(C-2),32.3(C-12),25.8(C-28),25.5(C-11),22.2(C-29),19.0(C-30),16.9(C-18),18.1(C-19),13.1(C-27),12.5(C-21)。
化合物2[(22S,24E)-3-oxo-15α,22β-dihydroxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid]
分子式C30H44O5，淡黄色无定型粉末，易溶于甲醇。负离子ESI MS m/z:483.0[M-H]–。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δ:6.83(1H,m,H-24),5.95(1H,d,J＝10.0Hz,H-7),5.46(1H,d,J＝5.0Hz,H-11),4.24(1H,dd,J＝5.0,10.0Hz,H-15),3.75(1H,m,H-22),2.85(1H,m,H-2),2.43(1H,m,H-23),2.35(2H,m,H-1,12),2.28(2H,m,H-2,23),2.23(1H,m,H-6),2.12(1H,m,H-6),2.09(2H,m,H-12,16),2.09(1H,m,H-17),1.89(1H,m,H-16),1.83(3H,s,H-27),1.71(1H,m,H-1),1.54(1H,dd,J＝5.0,10.0Hz,H-5),1.38(1H,m,H-20),1.22(3H,s,H-19),1.13(3H,s,H-29),1.07(3H,s,H-28),0.96(3H,s,H-30),0.90(3H,d,J＝5.0Hz,H-21),0.67(3H,s,H-18).13C-NMR(CD3OD,125MHz)δ:219.4(C-3),171.8(C-26),146.5(C-9),142.9(C-8),141.3(C-24),130.4(C-25),122.5(C-7),118.5(C-11),75.3(C-15),73.6(C-22),53.5(C-14),52.5(C-5),48.8(C-4),46.7(C-17),45.5(C-13),42.5(C-20),40.0(C-11,16),38.8(C-10),38.1(C-1),36.0(C-2,23),26.2(C-28),24.9(C-6),23.2(C-29),22.8(C-19),18.2(C-30),16.8(C-18),13.1(C-27),12.5(C-21)。
化合物3[(22S,24E)-3β-acetoxy-15α,22β-dihydroxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid]
分子式为C32H48O6，淡黄色无定型粉末，易溶于甲醇。HRTOFMS m/z:551.3350[M+Na]+(C32H48O6Na,计算值551.3343)。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δ:6.83(1H,m,H-24),5.91(1H,d,J＝10.0Hz,H-7),5.37(1H,d,J＝5.0Hz,H-11),4.45(1H,m,H-3),4.23(1H,dd,J＝10.0,10.0Hz,H-15),3.73(1H,m,H-22),2.41(1H,m,H-23),2.35(1H,m,H-12),2.28(1H,m,H-23),2.13(1H,m,H-6),2.08(1H,m,H-17),2.07(3H,m,H-6,12,16),2.04(1H,m,H-1),2.04(3H,s,OCOCH3-3),1.87(1H,m,H-16),1.83(3H,s,H-27),1.72(1H,m,H-2),1.47(2H,m,H-1,2),1.37(1H,m,H-20),1.18(1H,m,H-5),1.03(3H,s,H-19),0.99(3H,s,H-29),0.97(3H,s,H-30),0.90(3H,s,H-28),0.90(3H,d,J＝5.0Hz,H-21),0.64(3H,s,H-18).13C-NMR(CD3OD,125MHz)δ:173.0(OCOCH3-3),171.9(C-26),147.6(C-9),142.7(C-8),141.3(C-24),130.4(C-25),122.5(C-7),117.7(C-11),82.6(C-3),75.4(C-15),73.6(C-22),53.6(C-14),51.0(C-5),46.7(C-17),45.6(C-13),42.5(C-20),40.1(C-16),40.0(C-12),38.9(C-4),38.8(C-10),36.9(C-1),36.0(C-23),28.9(C-28),25.5(C-2),24.1(C-6),23.7(C-19),21.4(OCOCH3-3),18.3(C-30),17.7(C-29),16.8(C-18),13.1(C-27),12.5(C-21)。
化合物4[(22S,24E)-3,7,11-trioxo-15α-hydroxy-22β-acetoxylanosta-8,24-dien-26-oic acid]
分子式为C34H44O8，黄色晶体，易溶于甲醇。HRTOFMS m/z:557.3114[M+H]+(C32H45O8,计算值557.3109)。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δ:6.68(1H,m,H-24),5.07(1H,m,H-22),4.33(1H,m,H-15),2.93(1H,m,H-12),2.87(1H,m,H-1),2.80(1H,m,H-6),2.68(1H,m,H-2),2.54(2H,m,H-12,23),2.47(1H,m,H-6),2.45(1H,m,H-2),2.40(1H,m,H-23),2.39(1H,m,H-5),2.04(3H,s,OCOCH3-22),1.98(1H,m,H-17),1.97(1H,m,H-16),1.86(1H,m,H-1),1.84(3H,s,H-27),1.62(1H,m,H-20),1.27(3H,s,H-19),1.16(3H,s,H-30),1.12(3H,s,H-28),1.11(3H,s,H-29),0.99(1H,m,H-16),0.99(3H,d,J＝5.0Hz,H-21),0.91(3H,s,H-18).13C-NMR(CD3OD,125MHz)δ:218.3(C-3),206.6(C-7),202.5(C-11),171.2(C-26),153.9(C-9),152.0(C-8),138.3(C-24),131.5(C-25),75.9(C-22),73.5(C-15),54.0(C-14),52.8(C-12),50.1(C-5),48.7(C-13),47.8(C-4),46.3(C-17),40.6(C-20),40.4(C-10),37.7(C-6),36.8(C-16),36.3(C-1),35.0(C-2),32.5(C-23),27.6(C-28),20.7(C-29),20.4(C-30),18.2(C-19),17.5(C-18),13.1(C-21),12.7(C-27)。
化合物5[(22S,24E)-3-oxo-15α-hydroxy-22β-acetoxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid]
分子式为C32H46O6，淡黄色无定型粉末，易溶于甲醇。负离子ESI MS m/z:525.1[M-H]–。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δ:6.69(1H,m,H-24),5.95(1H,d,J＝10.0Hz,H-7),5.45(1H,d,J＝5.0Hz,H-11),5.07(1H,m,H-22),4.24(1H,d,J＝5.0,10.0Hz,H-15),2.84(1H,m,H-2),2.57(1H,m,H-23),2.40(1H,m,H-23),2.34(1H,m,H-1),2.33(1H,m,H-12),2.27(1H,m,H-2),2.23(1H,m,H-6),2.11(2H,m,H-6),2.10(1H,m,H-12),2.04(3H,s,OCOCH3-22),1.95(1H,m,H-16),1.86(1H,m,H-16),1.84(1H,s,H-27),1.80(1H,m,H-17),1.71(1H,m,H-1),1.55(1H,m,H-20),1.53(1H,m,H-5),1.22(3H,s,H-19),1.13(3H,s,H-29),1.06(3H,s,H-28),1.00(3H,d,J＝5.0Hz,H-21),0.91(3H,s,H-30),0.67(3H,s,H-18).13C-NMR(CD3OD,125MHz)δ:219.1(C-3),171.2(C-26),146.3(C-9),142.4(C-8),138.5(C-24),131.3(C-25),122.5(C-7),118.1(C-11),76.2(C-22),74.9(C-15),53.2(C-14),52.2(C-5),48.6(C-4),46.8(C-17),45.3(C-13),40.6(C-20),40.0(C-16),39.7(C-12),38.5(C-10),37.9(C-1),35.8(C-2),32.6(C-23),25.9(C-28),24.6(C-6),22.9(C-29),22.5(C-19),17.9(C-30),16.4(C-18),13.2(C-21),12.7(C-27)。
化合物6[(22S,24E)-3-oxo-15α,22β-diacetoxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid]
分子式为C34H48O7，白色固体，易溶于甲醇。负离子ESI MS m/z:567.1[M-H]–。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δ:6.67(1H,m,H-24),5.58(1H,d,J＝5.0Hz,H-7),5.49(1H,d,J＝5.0Hz,H-11),5.07(1H,dd,J＝5.0,10.0Hz,H-15),5.03(1H,m,H-22),2.84(1H,m,H-2),2.56(1H,m,H-23),2.39(1H,m,H-23),2.36(1H,m,H-16),2.35(1H,m,H-12),2.29(1H,m,H-2),2.23(1H,m,H-6),2.15(1H,m,H-12),2.14(1H,m,H-16),2.11(1H,m,H-6),2.07(3H,s,OCOCH3-15),2.04(3H,s,OCOCH3-22),1.84(3H,s,H-27),1.83(1H,m,H-17),1.82(1H,m,H-1),1.70(1H,m,H-1),1.61(1H,m,H-20),1.52(1H,dd,J＝5.0,10.0Hz,H-5),1.22(3H,s,H-19),1.13(3H,s,H-29),1.06(3H,s,H-28),1.01(3H,d,J＝5.0Hz,H-21),1.01(3H,s,H-30),0.72(3H,s,H-18).13C-NMR(CD3OD,125MHz)δ:218.9(C-3),173.0(OCOCH3-15),172.6(OCOCH3-22),171.5(C-26),146.0(C-9),141.7(C-8),138.2(C-24),131.6(C-25),122.5(C-7),118.4(C-11),78.4(C-15),76.1(C-22),52.7(C-14),52.1(C-5),48.5(C-4),46.9(C-17),45.1(C-13),40.8(C-20),39.2(C-12),38.5(C-10),37.8(C-16),37.7(C-1),35.7(C-2),32.6(C-23),25.9(C-28),24.6(C-6),22.9(C-29),22.5(C-19),21.2(OCOCH3-15),20.9(OCOCH3-22),18.8(C-30),16.3(C-18),13.1(C-21),12.8(C-27)。
化合物7[(22S,24E)-15α-hydroxy-3β,22β-diacetoxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid]
分子式为C34H50O7，白色无定型粉末，易溶于甲醇。HRTOFMS m/z:569.3485[M-H]-(C34H49O7,计算值569.3484)。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δ:6.71(1H,m,H-24),5.94(1H,d,J＝5.0Hz,H-7),5.38(1H,d,J＝5.0Hz,H-11),5.08(1H,t,J＝5.0Hz,H-22),4.47(1H,m,H-3),4.24(1H,dd,J＝5.0,10.0Hz,H-15),2.58(1H,m,H-23),2.41(1H,m,H-23),2.34(1H,m,H-12),2.16(1H,m,H-6),2.10(1H,m,H-6),2.08(1H,m,H-1),2.09(1H,m,H-12),2.06(3H,s,OCOCH3-3),2.06(3H,s,OCOCH3-22),1.94(1H,m,H-16),1.86(3H,s,H-27),1.85(1H,m,H-16),1.82(1H,m,H-17),1.74(1H,m,H-2),1.62(1H,m,H-20),1.49(2H,m,H-1,2),1.19(1H,m,H-5),1.05(3H,s,H-19),1.01(3H,s,H-29),1.01(3H,d,J＝5.0Hz,H-21),0.94(3H,s,H-30),0.92(3H,s,H-28),0.67(3H,s,H-18).13C-NMR(CD3OD,125MHz)δ:172.8(OCOCH3-3),172.5(OCOCH3-22),171.2(C-26),147.4(C-9),142.3(C-8),138.5(C-24),131.3(C-25),122.5(C-7),117.3(C-11),82.3(C-3),76.2(C-22),75.0(C-15),53.3(C-14),50.7(C-5),46.8(C-13,17),40.6(C-20),40.0(C-16),39.6(C-12),38.7(C-4),38.6(C-10),36.6(C-1),32.6(C-23),28.7(C-28),25.2(C-2),23.8(C-6),23.4(C-19),21.2or20.9(OCOCH3-3),20.9or 21.2(OCOCH3-22),18.0(C-30),17.4(C-29),16.4(C-18),13.2(C-21),12.7(C-27)。
化合物8[lanosta-7,9(11),24-trien-3β,15α,22β-triacetoxy-26-oic acid]
分子式为C36H52O8，白色晶体，易溶于甲醇。负离子ESI MS m/z:611.2[M-H]–。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δ:6.67(1H,m,H-24),5.53(1H,d,J＝5.0Hz,H-7),5.40(1H,d,J＝5.0Hz,H-11),5.06(1H,m,H-15),5.03(1H,m,H-22),4.45(1H,m,H-3),2.57(1H,m,H-23),2.38(1H,m,H-23),2.35(1H,m,H-12),2.13(1H,m,H-16),2.12(1H,m,H-12),2.09(1H,m,H-6),2.07(3H,s,OCOCH3-15),2.06(1H,m,H-6),2.05(1H,m,H-1),2.04(3H,s,OCOCH3-3),2.04(3H,s,OCOCH3-22),1.83(1H,m,H-16),1.83(3H,s,H-27),1.81(1H,m,H-17),1.73(1H,m,H-2),1.59(1H,m,H-20),1.47(1H,m,H-1),1.16(1H,m,H-5),1.03(3H,s,H-19),1.00(3H,d,J＝5.0Hz,H-21),1.00(3H,s,H-30),0.98(3H,s,H-29),0.90(3H,s,H-28),0.69(3H,s,H-18).13C-NMR(CD3OD,125MHz)δ:173.3(OCOCH3-15),173.1(OCOCH3-3),172.8(OCOCH3-22),171.4(C-26),147.3(C-9),141.8(C-8),138.7(C-24),131.6(C-25),122.8(C-7),117.8(C-11),82.5(C-3),78.8(C-15),76.3(C-22),52.9(C-14),50.9(C-5),47.1(C-17),45.4(C-13),41.0(C-20),39.4(C-12),38.9(C-4),38.8(C-10),38.0(C-16),36.9(C-1),32.9(C-23),28.9(C-28),25.5(C-2),24.1(C-6),23.6(C-19),21.4(OCOCH3-15,22),21.1(OCOCH3-3),19.2(C-30),17.7(C-29),16.6(C-18),13.4(C-21),13.0(C-27)。
经过结构解析后，4个新的化合物，4个已知的化合物，均为羊毛甾烷型三萜化合物。其名称和结构式如下所示：
化合物1，(22S,24E)-3,7-dioxo-15α,22β-dihydroxylanosta-8,24-dien-26-oicacid，为新化合物。
Figure BDA0003900299290000121
化合物2，(22S,24E)-3-oxo-15α,22β-dihydroxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid。
Figure BDA0003900299290000122
化合物3，(22S,24E)-3β-acetoxy-15α,22β-dihydroxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid，为新化合物。
Figure BDA0003900299290000123
化合物4，(22S,24E)-3,7,11-trioxo-15α-hydroxy-22β-acetoxylanosta-8,24-dien-26-oic acid，为新化合物。
Figure BDA0003900299290000124
化合物5，(22S,24E)-3-oxo-15α-hydroxy-22β-acetoxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid。
Figure BDA0003900299290000131
化合物6，(22S,24E)-3-oxo-15α,22β-diacetoxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid。
Figure BDA0003900299290000132
化合物7，(22S,24E)-15α-hydroxy-3β,22β-diacetoxylanosta-7,9(11),24-trien-26-oic acid，新化合物。
Figure BDA0003900299290000133
化合物8，lanosta-7,9(11),24-trien-3β,15α,22β-triacetoxy-26-oic acid。
Figure BDA0003900299290000134
         
Figure BDA0003900299290000141
实施实例4化合物的抗炎活性检测
本实施例采用LPS刺激诱导的RAW264.7细胞模型，通过Griess试剂法检测细胞外NO含量，测定上述结构式1-8的化合物对NO释放的抑制作用。
小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的培养与处理
使用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素混合液的DMEM高糖酚红培养液，在37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养RAW264.7细胞。
(1)化合物1～8对LPS刺激的RAW264.7细胞释放NO的影响
取对数时期的RAW264.7细胞，用无色RPMI1640培养液稀释成1×105个/mL的单细胞悬液，接种于96孔板中(每孔194μL)，每组设三个平行孔。CO2培养箱中培养24h后分别加入1μL浓度为2μmol/mL的化合物1-6和阳性对照水飞蓟素(样品终浓度均为10nmol/mL)，继续孵育1h后加入5μL浓度为100μg/mL的LPS，同时设定LPS组(加入1μL PBS+5μL LPS)和空白对照组(加入1μL PBS+5μL PBS)。培养48h后，吸取100μL培养上清于酶标板，各孔加入50μLGriess试剂，室温避光孵育10min后，用酶标仪在543nm处测定OD值。根据NaNO2标准曲线计算各组细胞培养上清液中NO的浓度以及对NO释放的抑制率，测定样品对细胞抑制率计算按公示1计算。
Figure BDA0003900299290000142
实验结果如下表1所示：
表1化合物对NO释放的抑制率比较
Figure BDA0003900299290000143
实验结果表明，化合物1-8均具有较强的抑制NO产生的活性。
(2)化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞炎性因子表达的影响
取对数时期的RAW264.7巨噬细胞，将其接种于96孔培养板中，控制细胞数量约为1×105个/mL。之后置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h。CO2培养箱中培养24h后分别加入1μL浓度为2μmol/mL的化合物1-6和阳性对照水飞蓟素(样品终浓度均为10nmol/mL)，继续孵育1h后加入5μL浓度为100μg/mL的LPS，同时设定LPS组(加入1μL PBS+5μL LPS)和空白对照组(加入1μL PBS+5μL PBS)。培养48h后，收集细胞培养上清，用ELISA法检测TNF-α和IL-6含量。
实验结果分别如表2、3所示，需要说明的是，在表2和表3中，*P<0.05，**P<0.01与模型组的差异，#P<0.05，##P<0.01与空白组的差异。
表2化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α释放的影响
Figure BDA0003900299290000151
表3化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6释放的影响
Figure BDA0003900299290000152
实验结果(表2、3)表明：模型组中TNF-α和IL-6显著升高，结构式1-8的化合物都能显著抑制TNF-α释放的活性，其中明显优于阳性对照水飞蓟素的有化合物1、化合物2、化合物7、化合物8。除化合物6外，化合物1-5，7和8都能显著抑制IL-6释放的活性，其中抑制能力明显优于阳性对照水飞蓟素的有化合物2、化合物7、化合物8。以上结果说明，化合物1-8能有效抑制炎症因子的表达。

Claims (3)

1.一种紫芝发酵菌丝体中三萜化合物，其特征在于其结构式为如下结构式1、3、4、7的化合物或其药用盐、晶体或水合物：
Figure FDA0003900299280000011
2.一种用于抗炎的制剂，其特征在于其含有结构式1-8所示的一种或一种以上化合物或其药用盐以及医学上可接受的载体；
其中所述的结构式1-8的化合物为：
Figure FDA0003900299280000012
Figure FDA0003900299280000021
3.紫芝发酵菌丝体中三萜化合物作为预防或治疗炎症的药物的应用；其中所述的紫芝发酵菌丝体中三萜化合物为如下结构式1-8的化合物中的一种或一种以上：
其中所述的结构式1-8的化合物为：
Figure FDA0003900299280000031
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