CN106176763B - 翻白草三萜化合物在治疗糖尿病中的应用 - Google Patents

翻白草三萜化合物在治疗糖尿病中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106176763B
CN106176763B CN201610510766.3A CN201610510766A CN106176763B CN 106176763 B CN106176763 B CN 106176763B CN 201610510766 A CN201610510766 A CN 201610510766A CN 106176763 B CN106176763 B CN 106176763B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
compound
potentilla discolor
acid
application
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610510766.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106176763A (zh
Inventor
谈景福
朱光明
俞磊明
朱俊杰
王立会
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI TRADITIONAL CHINESE MEDICINE CO Ltd
Original Assignee
SHANGHAI TRADITIONAL CHINESE MEDICINE CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI TRADITIONAL CHINESE MEDICINE CO Ltd filed Critical SHANGHAI TRADITIONAL CHINESE MEDICINE CO Ltd
Priority to CN201610510766.3A priority Critical patent/CN106176763B/zh
Publication of CN106176763A publication Critical patent/CN106176763A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106176763B publication Critical patent/CN106176763B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J63/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by expansion of only one ring by one or two atoms
    • C07J63/008—Expansion of ring D by one atom, e.g. D homo steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/73—Rosaceae (Rose family), e.g. strawberry, chokeberry, blackberry, pear or firethorn

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明提出一种如式(I)所示的三萜类化合物，该化合物具有制备治疗2型糖尿病的药物的用途。

Description

翻白草三萜化合物在治疗糖尿病中的应用
技术领域
本发明涉及一种翻白草三萜化合物及其在治疗糖尿病中的应用。
背景技术
中药翻白草是蔷薇科委陵菜属植物翻白草(Potentilla discolor Bunge)的干燥全草，始载于《救荒本草》。翻白草广泛分布于北半球的温带和寒带，我国以山东、辽宁、安徽三省该药材产量最大，此外，河北、河南、内蒙古、湖南、江苏和广西等省份也有分布。其性甘、苦、平，具有清热解毒、止血消肿之功效，可用于治疗痢疾、疟疾、肺痈等症。
目前国内外对翻白草的研究集中于单一环节的疗效评价方面，针对翻白草的化学成分、分离提取、药理活性、药效物质基础等方面的系统性研究较少，有待进一步深入。
发明内容
本发明提供一种翻白草三萜化合物(20S)-3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸，其结构如式(I)所示：
本发明提供结构如式(I)所示翻白草三萜类化合物(20S)-3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸的应用，具体地说，是指该化合物在制备治疗2型糖尿病的药物中的应用。
本发明还提出了所述药物用于非胰岛素状态下促进脂肪细胞对糖的摄取利用。
附图说明
图1为翻白草提取分离过程示意图；
图2-1、2-2为(20S)-3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸1H NMR谱图；
图3-1、3-2、3-3为(20S)-3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸13C NMR谱图；
图4-1、4-2为(20S)-3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸2D-NMR谱图；
图5-1、5-2、5-3为(20S)-3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸ROESY谱图。
具体实施方式
(一)化合物的提取
1、实验方法
1.1实验仪器与材料
熔点用X-4型双目镜显微熔点测定仪(温度未校正，北京泰克仪器有限公司制造)测定；UV用Shimadzu UV-2501PC型可见-紫外分光光度计测定；NMR：Bruker AV-500型核磁共振仪，δ为ppm，J为Hz。
薄层层析硅胶H、薄层色谱硅胶GF254、柱层析硅胶(100-200目，200-300目，青岛海洋化工厂)；ODS柱(40-60μm，Fuji)，Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(购自Pharmacia公司)；MCI柱(日本三菱化工株式会社)。
所用试剂均为分析纯级。
1.2植物来源
翻白草(Potentilla discolor Bunge)药材采自广西，植物标本经鉴定为蔷薇科委陵菜属植物翻白草，标本存放于中国药科大学中药分析教研室。
1.3提取分离
取采自广西的干燥翻白草全草14kg，如图1所示，用90％乙醇水溶液加热回流提取3次，每次3h，合并提取液，减压蒸去大部分乙醇，用水混悬，然后用石油醚萃取三次，回收溶剂后得到石油醚部分160g，然后用乙酸乙酯萃取三次，回收溶剂后，得乙酸乙酯部分300g。
乙酸乙酯部分(300g)用400g硅胶(100-300目)拌样，3.0kg(200-300目)进行硅胶柱层析，氯仿-甲醇(1:0-0:1，v：v)梯度洗脱，薄层层析(TLC)检测合并相同流分。
将30-50体积％和50-70体积％的流分合并后减压干燥，进行小孔树脂(MCI)柱层析，用水-甲醇(10：0-0:10，v：v)梯度洗脱，收集70％-90％甲醇洗脱的成分，减压回收溶剂至浸膏状，得到有效部位。取少量该有效部位，经颜色反应、Libermann-Burchard、Molish反应，提示为三萜类化合物。再用甲醇溶解有效部位，进行反向C18柱层析，丙酮-水(1:0-0:1，v：v)梯度洗脱，反复纯化，得化合物1(17mg)，2(25mg)，3(8mg)，4(20mg)，5(8mg)，6(100mg)，7(5mg)，8(4mg)，9(5mg)，10(120mg)。
化合物5较多地来自于反相C18柱层析的50-70体积％丙酮-水洗脱的流分。
翻白草分离流程如图1所示。
依据与对照品TLC比对以及各种谱图数据[IR、MS、1H NMR、13C NMR和2D NMR(HMQC、HMBC、COSY)]最终确证了所得到的化合物分别为：蔷薇酸(euscaphic acid,1)、2α-羟基乌苏酸(corosolic acid,2)、2α,3β,19α-三羟基-熊果酸(tormentic acid,3)、3α,30-二羟基-20(29)-烯-27-白桦酸(3α,30-dihydroxylup-20(29)-en-27-oic acid,4)、(20S)-3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸((20S)-3α-hydroxy-29-dimethoxy-lupan-27-oic acid,5)和熊果酸(ursolic acid,6)、山楂酸(maslinic acid,7)、19α-羟基熊果酸(pomolic acid,8)、2α,3α-二羟基-12-烯-28-乌苏酸(2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid,9)、齐墩果酸(oleanolic acid,10)。
其中，化合物(20S)-3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸((20S)-3α-hydroxy-29-dimethoxy-lupan-27-oic acid,5)未见文献报道，为新化合物。
2、结构鉴定
化合物5：性状：白色无定形粉末(MeOH)，易溶于甲醇；
颜色反应：10％硫酸乙醇溶液反应显紫红色，Libermann-Burchard反应呈阳性，Molish反应阴性，以上信息提示为三萜类化合物。HR-TOF-MS给出分子量m/z[M-H]-517.3900(calcd for C32H53O5，517.3898)，结合13C-NMR和1H-NMR谱推测其分子式为C32H54O5。
IR(KBr)νmax cm-1 3447,1685；
1H-NMR(C5D5N),δ(ppm):1.79–1.56(m,2H,H-1),2.00–1.72(m,2H,H-2),3.54(s,H-3),1.73(m,1H,H-5),1.49–1.20(m,2H,H-6),1.99–1.96(m,2H,H-7),2.21(m,1H,H-9),1.71–1.36(m,2H,H-11),2.71–1.82(m,2H,H-12),1.89(m,1H,H-13),2.29–1.68(m,2H,H-15),1.76–1.72(m,2H,H-16),1.61(m,1H,H-18),1.93(m,1H,H-19),2.50(m,1H,H-20),1.72–1.50(m,2H,H-21),1.41–1.05(m,2H,H-22),1.04(s,3H,CH3-23),0.87(s,3H,CH3-24),0.97(s,3H,CH3-25),1.21(s,3H,CH3-26),0.88(s,3H,CH3-28),4.18(d,J＝8.15Hz,1H,H-29),1.05(d,J＝5.6Hz,3H,CH3-30),3.30(s,3H,CH3-31),3.38(s,3H,CH3-32)；
13C-NMR(C5D5N),δ(ppm):34.23(C-1),26.63(C-2),75.06(C-3),38.91(C-4),49.57(C-5),18.75(C-6),38.21(C-7),40.92(C-8),51.23(C-9),37.41(C-10),21.20(C-11),28.22(C-12),38.38(C-13),60.79(C-14),25.73(C-15),38.04(C-16),42.60(C-17),50.57(C-18),39.38(C-19),38.07(C-20),22.66(C-21),40.98(C-22),29.10(C-23),22.78(C-24),16.96(C-25),17.59(C-26),178.31(C-27),18.96(C-28),108.75(C-29),9.31(C-30),53.01(C-31),53.58(C-32).
1H NMR谱上有六个角甲基信号(如图2-1)：δ0.87、0.88、0.97、1.04、1.21(s,3H,each)及1.05(d,J＝5.60Hz)，另外在δ3.30附近还有两个明显的甲基单峰信号3.30(3H,s)、3.38(3H,s)，提示含有两个甲氧基。质子信号δ5.30(H,s)、4.18(H,d，J＝8.15Hz)、3.54(H,s)暗示与羟基等含氧基团相连(如图2-2)。
13C NMR谱中有32个碳信号，包括六个角甲基碳信号δC9.31、16.61、17.59、18.75、18.96和21.20(如图3-1)，两个甲氧基碳信号δC53.01、53.58(如图3-2)，两个连氧碳信号δC75.06和60.79以及一个羧基碳信号δC178.31(如图3-2和3-3)。
综合以上信息，推定该化合物为3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸(3α-hydroxy-29-dimethoxy-lupan-27-oic acid)，结构如式(I)所示。
根据2D-NMR可以对其结构进行确证和全归属，如下：
在1H–1H COSY谱中2H-1(δ1.56/1.79)与2H-2(δ1.72/2.00)相关，而后者同时与H-3(δ3.54)相关；H-5(δ1.73)与2H-6(δ1.49/1.40)相关，同时后者也与2H-7(δ1.96/1.99)信号发生耦合；H-9(δ2.21)与2H-11(δ1.71/1.36)相关，2H-12(δ2.71/1.82)与H-13(δ1.89)相关，而2H-11(δ1.71/1.36)与2H-12(δ2.71/1.82)也同时相关。H-13(δ1.89)与H-19(δ1.93)相关，后者同时与2H-21(δ1.50/1.72)相关，同时2H-21也与2H-22(δ1.05/1.41)相关。
在1HMBC谱中(图4-1、4-2)，羧基碳信号δc178.31与H-13(δ1.89)相关；δ1.21(3H-26)、δ1.89(H-13)及δ1.61(H-18)与C-14(δ60.78)相关；C-28(δ18.96)与H-18(δ1.61)、H-22(δ1.41)相关。
在ROESY谱中(图5-1、5-2、5-3)、δ0.88(3H-28)与13β、15β、16β、19β、21β和22βH相关。结合文献，以上信息确证了该化合物为C-27羧基。
在1H-NMR中,H-3(δ3.54,s)表明H-3处于e键上。ROESY中(图5-1、5-2、5-3)H-3(δ3.54)与H-1β(δ1.79)、H-2β(δ2.0)、3H-24β(δ0.87)相关，可归属A环上的H，同时也确证了该构型。
此外，HMBC谱中(图4-1、4-2)、3H-31(δ3.30,s)、3H-32(δ3.38,s)与108.7(C-29)相关，表明C-29上连有两个甲氧基。
另外，通过C-30的化学位移大小来确定C-20的绝对构型，因为如果C-20为S构型，则C-30的化学位移为δc10.3；如果C-20为R构型，则C-30的化学位移处于较低场，为δc17.7。因此，化合物5中C-20为S构型。
综所上述，化合物5的结构确定为(20S)-3α-hydroxy-29-dimethoxy-lupan-27-oic acid。经文献检索，化合物5为一新化合物，波谱数据如下(表1)。
表1化合物5的1H-NMR、13C-NMR数据(C5D5N,δppm,J Hz).
根据文献查阅，从委陵菜属中分离得到的三萜类化合物几乎都是游离苷元，主要是五环三萜，按其分类，主要有乌苏烷型、齐墩果烷型和羽扇豆烷型；其结构中大多有双键、羟基和羧基，且双键的位置几乎都是12(13)位，羧基的位置大多都是28位；其结构的变化就主要体现在羟基数量、取代位置和立体化学的变化上，最常见的羟基取代模式为2α，2β，3α，3β，19α，23，24位，其它位置则少见。
值得一提的是，在发明人得到的10个三萜类化合物中有两个为羽扇豆烷型三萜(其中一个为新化合物)，且羧基都存在于C-27位。根据文献检索，大多数天然存在的羽扇豆烷型三萜多为C-28位羧基，C-27位羧基的天然化合物仅有七个，分别是从唇形科植物Hyptis suaveolens，鼠李科植物Gouania microcarpa以及本植物翻白草中分离得到。现在发明人又从翻白草中也分离得到一个新的C-27羧基的羽扇豆烷型三萜，极大地丰富了这一类型的化合物。
二、化合物活性研究
(一)糖消耗
AMP蛋白激酶(AMPK,AMP即腺苷—磷酸)主要控制细胞新陈代谢：它会决定身体中的脂肪是储存还是燃烧，这主要取决于细胞中总能量。当细胞能量水平较高时，细胞中存在高浓度的能量分子ATP(三磷酸腺苷)，因此AMPK会促使细胞进行“合成代谢”，将多余能量作为脂肪储存下来；当ATP水平较低时，AMPK将关闭合成代谢，反而激发分解代谢，让脂肪燃烧为能量。已有研究表明，AMPK能作为治疗2型糖尿病的一种有效手段。当AMPK探测到细胞中ATP浓度较低时，它们会利用各种机制使细胞中的葡萄糖变为ATP。对于啮齿类动物的实验已经表明，AMPK对于降低血糖是有效的。
本实验就是利用糖消耗实验来探索翻白草总三萜部位和其中的三萜单体能否通过AMPK途径对2型糖尿病实现治疗作用。
1、实验材料
1.1样品
①3α,30-二羟基-20(29)-烯-27-白桦酸，②本发明的新化合物(即(20S)-3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸)，③科罗索酸，④翻白草总三萜，其中样品④用少量DMSO(二甲亚砜)溶解(确保DMSO在培养体系中的终浓度不大于0.1％)，再用PBS(磷酸盐缓冲液)稀释，使细胞上清液中样品最终浓度依次为10μmol/L，10μmol/L，10μmol/L和100μg/ml，二甲双胍用PBS溶解，使细胞上清液中样品终浓度为1mmol/L。
1.2试剂
DMEM培养基(Gibco公司，批号：1115806)；
应用液另加0.06g/L青霉素(80万单位)和0.1g/L硫酸链霉素(100万单位)及3.7g/L碳酸氢钠，pH调至7.2；
注射用青霉素钠(苏州二叶制药有限公司，批号100501)；
硫酸链霉素(南京生兴生物技术有限公司，批号：0E100E10)；
碳酸氢钠(南京化学试剂有限公司，批号：11022610211)；
新生小牛血清(Newborn calfserum,NCS)(上海微科生化试剂有限公司，批号：A10110-0904)；
胰蛋白酶(Sunshine公司，批号：1C221H04)；
DMSO(Snshine公司，批号：2A022A02)；
二甲双胍(ALEXIS BIOCHEMICALS，批号：L20508/a)
葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20101115)；
葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司，批号：20120701)；
1.3细胞株
前脂肪细胞3T3-L1，小鼠源。
1.4动物
ICR小鼠，雄性，18-22g，由南京青龙山实验动物养殖场提供。
2、实验过程
2.1条件培养液CM(conditioned-medium)的制备
取小鼠脱颈椎处死，75％的酒精中浸泡3-5min，移至超净台中，腹腔注射PBS 5ml/只，轻揉小鼠的腹部2min，用移液枪吸出以6×105接种于6孔板内，于5％CO2，37℃细胞培养箱内孵育，4h后吸弃未贴壁细胞，以PBS洗2次，贴壁细胞换以KRH(Krebs'-Ringer's-Henseleit)液培养，每孔加KRH液2ml，并在每孔加入10μl的LPS(终溶度为5μg/ml)，48h后收集上清液作为巨噬细胞条件培养液(conditioned-medium，CM)，滤菌，分装，贮于-70℃超低温冰箱中保存备用。
2.2细胞复苏与培养
取出冻存的3T3-L1细胞置37℃水浴中，使其快速融化，转入5ml含10％新生小牛血清的DMEM培养基中，重悬细胞，再转入75ml培养瓶中于5％CO2，37℃的细胞培养箱中培养，每天换液。前脂肪细胞3T3-L1细胞为贴壁细胞，接种后1-2天，表现为单层密集生长，细胞呈梭形，有分支。待细胞达到80％融合时，用PBS清洗两遍，0.25％胰蛋白酶消化30s，按1：6传代。取对数生长期的细胞，台盼蓝排斥法进行活细胞计数，调节细胞浓度为106/ml接种于48孔培养板，5％CO2，37℃细胞培养箱内孵育24h，当细胞基本融合时，用KRH清洗两遍换用KRH液饥饿，每孔200μL饥饿4h后进行实验。
2.3药物处理与测定
2.3.1生理条件下筛选
实验设空白组、样品组及阳性对照(二甲双胍)组。先将饥饿好的细胞用KRH液清洗两遍，然后用KRH体系加样品，培养板孔内分别加入预定浓度的样品①②③④(①②③终浓度10μmol/L，④终浓度100μg/ml)和二甲双胍(终浓度25μmol/L)，空白组加入同体积的KRH液；各组均加入葡萄糖溶液，使其终浓度为11mmol/L，5％CO2，37℃细胞培养箱内孵育4h，用葡萄糖试剂盒测定。
2.3.2炎性条件下筛选
实验设空白组、模型组、样品组及阳性对照(二甲双胍)组。培养板孔内分别加入预定浓度的样品①②③④(①②③终浓度10μmol/L，④终浓度100μg/ml)和二甲双胍(终浓度1mmol/L)，5％CO2，37℃细胞培养箱内孵育0.5h，培养板孔内模型组、样品组及阳性对照加入相同体积的CM，空白组加入同体积的KRH液，各组均加入葡萄糖溶液，使其终浓度为11mmol/L，5％CO2，37℃细胞培养箱内孵育4h，用葡萄糖试剂盒测定。
2.4实验结果
2.4.1生理条件下筛选结果
细胞孵育4h后，用葡萄糖测定试剂盒于492nm波长下测OD值，由此，计算出细胞上清中的糖含量，进而得出糖消耗量。结果见表2-1。
表2-1生理条件下糖消耗量(n＝6)
*与空白组相比P<0.05
2.4.2炎性条件下筛选结果
细胞孵育4h后，用葡萄糖测定试剂盒于492nm波长下测OD值，由此，计算出细胞上清中的糖含量，进而得出糖消耗量。结果见表2-2。
表2-2炎性条件下糖消耗量(n＝8)
*与模型组相比P<0.05
3、结论
由表2-1可看出，阳性对照组与空白组有显著差异，提示了实验的可靠性。三种样品与空白组相比，糖消耗虽均有升高，但无显著差异，提示药物在激活AMPK方面无显著作用。二甲双胍为AMPK特异性抑制剂，抑制生理条件下糖的消耗，提示这一途径与AMPK活化有关系。
由表2-2可看出，模型组与空白组有显著差异，显示造模成功，提示实验的可靠性。四种样品中，①、②、③号样品的糖消耗量升高，且与模型组相比有显著差异，说明它们在炎性条件下显著促进3T3-L1对葡萄糖的摄取，提示这三种样品在炎性条件下可能激活AMPK，进而促进糖消耗，②号样品的糖消耗量接近阳性对照二甲双胍。二甲双胍作为一胰岛素敏感性具有AMPK活性，同时亦具有抗炎活性(可能通AMPK途径所介导)，作为一阳性药，显著增加糖消耗，提示了AMPK途径的参与。
糖消耗实验表现的是非胰岛素状态下脂肪细胞对糖的摄取利用，这一过程主要是通过AMPK途径而介导。炎性刺激可通过抑制AMPK的活化而抑制细胞对糖的氧化利用。
(二)细胞毒活性研究
肿瘤是全世界医药研究的热点，目前使用的抗肿瘤药物多是通过干扰细胞的生长、死亡、分化以及功能等相关的机制，来达到抑制细胞的生长甚至杀死细胞的目的。抗肿瘤药物的筛选包括体内和体外两种方法。对于样品量极少时，一般以样品对体外培养的肿瘤细胞生长的抑制作用作为初筛。由于癌细胞生长具有相对的独立性，故可在体外建立具有无限增殖能力的细胞系，该法具有耗药量少(2-10mg)，周期短，费用低等特点。该实验中我们采用MTT法研究从翻白草中分离得到的三萜成分化合物(20S)-3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸和3α,30-二羟基-20(29)-烯-27-白桦酸对人体HepG2，MCF-7和Hela癌细胞株系的细胞毒性。
1、实验材料
1.1仪器及设备
超净工作台(吴县实验动物器材厂)恒温CO2培养箱(德国Heraeus)96孔培养板(NUNCLON)酶标仪(Tecan Sunrise)倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)全自动双蒸水机(上海玻璃仪器一厂)超速离心机OPTIMAXL-100K(贝克曼公司)。
1.2试剂与化合物
RPMI1640培养基(GIBCO)；胰蛋白酶(SIGMA)；胎牛血清(HYCLONE)；MTT(SIGMA)；DMSO(SIGMA)。
3α,30-二羟基-20(29)-烯-27-白桦酸由本实验室分离鉴定，化合物经HPLC分析，纯度≥98％。
(20S)-3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸由本实验室分离鉴定，化合物经HPLC分析，纯度≥98％。
1.3细胞株及培养
人乳腺癌细胞株(MCF-7)、人子宫癌细胞株(Hela)和人肝癌细胞株(HepG2)(均由北京协和药物所提供)培养于RPMI1640培养基中，含10％小牛血清，37℃，5％CO2。
2、实验部分
2.1实验原理
MTT比色法是一种经典的检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚矾(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法己广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验等。
2.2实验过程
分别取处于对数生长期的贴壁人乳腺癌细胞株(MCF-7)、人子宫癌细胞株(Hela)、人肝癌细胞株(HepG2)，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI1640培养基配成5000个/ml的细胞悬液，以8×103个/孔接种在96孔细胞培养板中，每孔接种200μl，37℃，5％CO2培养24小时。设置一系列不同浓度，同时对照组换含有等体积的PBS培养基，每组设3平行孔，37℃，5％CO2培养2天。1500r/min离心，弃去上清液，每孔加入5mg/ml新鲜配置的含MTT工作液20μl，37℃，继续培养4小时。小心弃去上清液，用胰酶消化后，每孔加入150μl DMSO溶解MTT甲臜沉淀，用微型超声震荡器混匀后，在酶标仪上以试验波长为490nm测定光密度值。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率＝(1-药物组A490值/对照组A490)×100％。然后求得该化合物的半数杀伤浓度IC50。
3、结果
经过初步的细胞毒活性测试，计算得3α,30-二羟基-20(29)-烯-27-白桦酸对人乳腺癌细胞株(MCF-7)、人子宫癌细胞株(Hela)、人肝癌细胞株(HepG2)的IC50分别为24.9，17.5和20.1mmol/L，(20S)-3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸对人乳腺癌细胞株(MCF-7)、人子宫癌细胞株(Hela)、人肝癌细胞株(HepG2)的IC50分别为21.7，13.8和14.9mmol/L。提示(20S)-3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸对人乳腺癌细胞株(MCF-7)、人子宫癌细胞株(Hela)、人肝癌细胞株(HepG2)具有良好的抑制活性，可用于乳腺癌、子宫癌、肝癌的临床治疗。
表3翻白草三萜化合物的细胞毒活性(n＝8)

Claims (3)

1.如式(I)所示翻白草三萜类化合物在制备治疗2型糖尿病的药物中的应用
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于非胰岛素状态下促进脂肪细胞对糖的摄取利用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物通过激活腺苷-磷酸蛋白激酶，进而促进糖消耗。
CN201610510766.3A 2016-07-01 2016-07-01 翻白草三萜化合物在治疗糖尿病中的应用 Active CN106176763B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610510766.3A CN106176763B (zh) 2016-07-01 2016-07-01 翻白草三萜化合物在治疗糖尿病中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610510766.3A CN106176763B (zh) 2016-07-01 2016-07-01 翻白草三萜化合物在治疗糖尿病中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106176763A CN106176763A (zh) 2016-12-07
CN106176763B true CN106176763B (zh) 2019-01-18

Family

ID=57463940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610510766.3A Active CN106176763B (zh) 2016-07-01 2016-07-01 翻白草三萜化合物在治疗糖尿病中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106176763B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110384705B (zh) * 2019-08-15 2024-04-05 中国人民解放军海军军医大学第一附属医院 山楂酸在制备治疗2型糖尿病胰岛细胞损伤药物中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101172109A (zh) * 2006-11-01 2008-05-07 中国医药研究开发中心有限公司 委陵菜属植物总三萜提取物的医药用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101172109A (zh) * 2006-11-01 2008-05-07 中国医药研究开发中心有限公司 委陵菜属植物总三萜提取物的医药用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Antidiabetic and antioxidant effects of extracts from Potentilla discolor;Li Zhang等;《Journal of Ethnopharmacology》;20100915;第132卷;518-524 *
Anti-Diabetic Effect of Standardized Extract of Potentilla discolor Bunge and Identification of its Active Components;Jie Yang等;《DRUG DEVELOPMENT RESEARCH》;20101231;第71卷;127-132 *
Metabonomic analysis of the therapeutic effect of Potentilla discolor in the treatment of type 2 diabetes mellitus;Yi Li等;《Molecular BioSystems》;20141231;第10卷;2898-2906 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106176763A (zh) 2016-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wu et al. Triterpenoid saponins from the seeds of Celosia argentea and their anti-inflammatory and antitumor activities
Shi et al. Cardiac glycosides from Antiaris toxicaria with potent cardiotonic activity
CN102229598B (zh) 一种对映-贝壳杉型二萜类化合物及其制备方法和应用
Xue-Jian et al. Synthesis and hypoglycemic activity of esterified-derivatives of mangiferin
Zhang et al. Steroidal saponins from the stem of Yucca elephantipes
CN110627861A (zh) 一种知母甾体皂苷化合物及其制备方法和应用
Verotta et al. Cycloartane saponins from Astragalus peregrinus as modulators of lymphocyte proliferation
Zhang et al. Rearranged oleanane type saponins, astraisoolesaponins A1–A3 and B, from the stems of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao
CN115894591A (zh) 一种赤芝菌丝体中三萜化合物及其应用
Su et al. Highly oxygenated lanostane triterpenoids from Ganoderma applanatum as a class of agents for inhibiting lipid accumulation in adipocytes
Shi et al. Separation and purification and in vitro anti-proliferative activity of leukemia cell K562 of Galium aparine L. petroleum ether phase
Li et al. Two new triterpene glycosides with antiproliferative activities on HepG2 from Phytolacca acinosa fruit fermentation broth
CN106176763B (zh) 翻白草三萜化合物在治疗糖尿病中的应用
CN109232684A (zh) 17-aag葡萄糖苷及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用
Xie et al. Ypsilandrosides CG, five new spirostanol saponins from Ypsilandra thibetica
CN110511202B (zh) 多环多异戊烯基酰基间苯三酚类化合物及其制备方法与应用
CN106138064B (zh) 翻白草三萜化合物在抗肿瘤中的应用
Carbone et al. Structure of onchidione, a bis-γ-pyrone polypropionate from a marine pulmonate mollusk
Zhang et al. Cytotoxic cholestane-type and ergostane-type steroids from the aerial parts of Euphorbia altotibetic
CN102391352B (zh) 救必应酸氨基酸衍生物及其在制备抗肿瘤的药物中的应用
CN106083987B (zh) 翻白草三萜化合物
CN106083986B (zh) 翻白草三萜化合物的制备方法
Sang et al. Tuberoside M, a new cytotoxic spirostanol saponin from the seeds of Allium tuberosum
Ye et al. Four new C-21 steroidal glycosides from the roots of Stephanotis mucronata and their immunological activities
CN103610682A (zh) 3α-羟基-30-齐墩果-12,20(29)-二烯-28-酸的制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant