CN111808802B

CN111808802B - 白桦茸水提取物在促进脂肪干细胞生长中的应用

Info

Publication number: CN111808802B
Application number: CN201910893061.8A
Authority: CN
Inventors: 成大一; 李承根; 张涛; 徐源
Original assignee: Shenzhen Future Cell Life Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Future Cell Life Technology Co ltd
Priority date: 2019-09-20
Filing date: 2019-09-20
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2039-09-20
Also published as: CN112626012A; CN111808802A

Abstract

本发明提供了白桦茸水提取物在促进脂肪干细胞生长中的应用，属于干细胞培养技术领域。白桦茸水提取物具有促进脂肪干细胞生长的作用。

Description

白桦茸水提取物在促进脂肪干细胞生长中的应用

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域，尤其涉及白桦茸水提取物在促进脂肪干细胞生长中的应用。

背景技术

干细胞的重要性：干细胞是具有无限的再生能力的未分化细胞，可以通过适当的生物信号和人体外部刺激分化成特定细胞，分为胚胎干细胞和成体干细胞(eong In Kimand Il-Hoan Oh.Cell Biological Characteristics of Adult Stem Cells.J KoreanMed Assoc.2005 Oct；48(10):993-1002)。在受精后约14天从胚胎中提取的胚胎干细胞是能够在实验室中无限增殖的全能细胞，并且可以分化成身体的所有细胞和组织。然而，尽管具有这些优点，但在医学用途方面存在局限性，例如生物伦理学，其可以破坏可以生长为生命的胚胎，免疫不相容性，以及可能导致产生不受控制的肿瘤或畸胎瘤的问题(ThomsonJA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,Waknitz MA,Swiergiel JJ,Marshall VS,JonesJM.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science 1998；282:1145-1147；S Holm.Embryonic stem cell research and the moral status of humanembryos.Reprod.Biomed.Online,1:63-67,2005).

与受精卵发育早期获得的胚胎干细胞不同，成体干细胞是指在发育过程后在身体各部分发现的具有各种形式再生能力的干细胞。未分化状态能够自我增殖，具有多能性，可以分化成不同组织的细胞(YI Kim,IH Oh.Adult mesenchymal stem cell therapy instroke.Tissue Eng.Regen,Med.,2:219,2005)。成体干细胞的缺点在于它们比胚胎干细胞更难增殖。然而，由于确定了分化细胞的类型和方向，因此在移植中具有安全性和相对较少局限性的优点，例如不易肿瘤形成和免疫排斥(Broxmeyer HE.Biology of cord bloodcells and future prospects for enhanced clinical benefit.Cytotherapy,7:209-218,2005；Broxmeyer HE.Biology of cord blood cells and future prospects forenhanced clinical benefit.Cytotherapy,7:209-218,2005)。但由于干细胞培养相对困难，体外培养受到限制难以进行大量增殖。

促进脂肪干细胞培养的必要性：脂肪干细胞(ADSCs)与人体中的其他组织细胞相比具有相对低的提取风险，可以通过简单的吸脂术获得大量的脂肪组织。此外，它在培养中表现出稳定的生长和增殖，因此当诱导分化时，可以根据生长信号刺激分化成各种细胞(Nagata,T.,Kawano,A.,Koyama,M.,Na kamura,T.,Hirahara,F.,Nakajima,T.,Sato,T.and Sakakibara,H.Efficacy of fibrobla st growth factor(FGF)onepithelialization of the neovagina in patients with Mayer-Rok itansky-Küster-Hauser syndrome(MRKHS)who underwent vaginoplasty.J Pediatr Adole scGynecol.pii:S1083-3188(15)00428-3 2015；Nagata,T.,Kawano,A.,Koyama,M.,Nakamura,T.,Hirahara,F.,Nakajima,T.,Sato,T.and Sakakibara,H.Efficacy of fibroblast growth factor(FGF)on epithelialization of the neovagina in patientswith Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser syndrome(MRKHS)who underwentvaginoplasty.J Pediatr A dolesc Gynecol.pii:S1083-3188(15)00428-32015.)。

然而，由于生长缓慢和分化差，脂肪干细胞通过添加生长因子来促进细胞生长，从而有助于细胞培养。要添加的生长因子包括VEGF(血管内皮生长因子)，FGF(成纤维细胞生长因子)，IGF(胰岛素样生长因子)，KGF(角质形成细胞生长因子)，HGF(肝细胞生长因子)和PDGF(血小板生长因子)(Shen,M.,Liu,X.,Zhang,H.and Guo,S.W.Transforming growthfactorβ1 signaling coincides with epithelial mesenchymal transition andfibroblast-to-myo fibroblast transdifferentiation in the development ofadenomyosis in mice.Hum Reprod.Feb；31(2):355-69.doi:10.1093/humrep/dev314.2016.；Nagata,T.,Kawano,A.,Koyama,M.,Nakamura,T.,Hirahara,F.,Nakajima,T.,Sato,T.and Sakakibara,H.Efficacy of fibroblast growth factor(FGF)onepithelialization of the neovagina in patients with Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser syndrome(MRKHS)who underwent vaginoplasty.J Pediatr AdolescGynecol.pii:S1083-3188(15)00428-32015.)。这些生长因子是昂贵的产品，是增加脂肪干细胞的产品成本的因素。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供白桦茸水提取物在促进脂肪干细胞生长中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了白桦茸水提取物在促进脂肪干细胞生长中的应用。

优选的，所述白桦茸水提取物的制备方法包括：将白桦茸与水混合，在100～110℃下浸泡35～45min，将得到的浸泡物离心，得到上层清液，将所述上层清夜过滤，得到滤液，将所述滤液冷冻干燥，得到白桦茸水提取物。

优选的，所述白桦茸的质量与水的体积比为(0.05～0.15)g:(90～110)ml。

优选的，所述水为经过三次蒸馏得到的蒸馏水。

优选的，所述离心的时间为4～6min，所述离心的转速为5000～6000rpm。

优选的，所述过滤使用的尼龙注射器的孔径为0.45μm。

优选的，将所述白桦茸水提取物与脂肪干细胞、液体培养基混合，将得到的混合物培养24～72h。

优选的，所述混合物中白桦茸水提取物的浓度为0.25～50μg/ml。

优选的，所述混合物中脂肪干细胞的数量为0.7～0.9×10⁴个；

优选的，所述液体培养基以DMEM为基础培养基，包括5％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

本发明提供了白桦茸水提取物在促进脂肪干细胞生长中的应用。在本发明中，所述桦茸提取物促进脂肪干细胞的机理：通过与细胞表面特异受体结合，调控脂肪干细胞的分裂、增殖和生长分化，促进细胞代谢。

附图说明

图1为脂肪干细胞的形态；

图2为通过RT-PCR进行脂肪干细胞的鉴定；

图3为白桦茸水提取物对细胞活力的影响；

图4为白桦茸水提取物对伤口闭合的影响。

具体实施方式

在本发明中，所述白桦茸水提取物的制备方法优选包括：将白桦茸与水混合，在100～110℃下浸泡35～45min，将得到的浸泡物离心，得到上层清液，将所述上层清夜过滤，得到滤液，将所述滤液冷冻干燥，得到白桦茸水提取物。

本发明对所述白桦茸的来源没有特殊限定，采用常规即可。本发明优选将白桦茸粉碎后，将得到的白桦茸粉与水混合，本发明对所述白桦茸粉的粒径没有特殊限定。在本发明中，所述白桦茸的质量与水的体积比优选为(0.05～0.15)g:(90～110)ml，更优选为0.1g:100ml。在本发明中，所述水优选为经过三次蒸馏得到的蒸馏水。

本发明优选将白桦茸与水混合，在105℃下浸泡40min。

在本发明中，所述离心的时间优选为4～6min，所述离心的转速优选为5000～6000rpm。在本发明中，所述过滤使用的尼龙注射器的孔径优选为0.45μm。本发明对所述冷冻干燥的条件没有特殊限定，采用常规冷冻干燥的条件即可。

本发明优选将所述白桦茸水提取物与脂肪干细胞、液体培养基混合，将得到的混合物培养24～72h，更优选培养48h。

本发明对所述脂肪干细胞的来源没有特殊限定，采用常规市售或者常规培养方法培养得到即可。

在本发明中，所述混合物中白桦茸水提取物的浓度优选为0.25～50μg/ml，更优选为0.5～50μg/ml，在该浓度下，白桦茸水提取物能够促进脂肪干细胞的生长。

在本发明中，所述混合物中脂肪干细胞的数量优选为0.7～0.9×10⁴个，更优选为0.8×10⁴个。

在本发明中，所述液体培养基优选以DMEM为基础培养基，包括5％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

白桦茸水提取物的准备：

将0.1g白桦茸蘑菇粉加入到三次蒸馏的100ml蒸馏水中，然后在105℃下热水浸泡40min，5400rpm离心5min，取上层清液，用0.45μm尼龙注射器过滤器过滤后，冷冻干燥，得到白桦茸水提取物。

脂肪的提取和脂肪干细胞的分离：

通过吸脂术从人体腹部或大腿提取脂肪。将提取的脂肪和生理盐水以1：1的比例混合，并以300g离心3min以除去油，血液和盐水。将新鲜的纯脂肪提取三次。将1:1比例的I型胶原酶(SIGMA)和生理盐水混合的胶原酶溶液与脂肪以1:1的比例混合，酶反应在37℃下进行30-60min。除了通常用于胶原酶溶液的I型胶原酶之外，也可以使用对人类无害的人胶原酶，在这种情况下，反应时间不设定为30至60min。特别是，人体胶原酶对人体无害，无毒性，因此不需要中和过程。酶促反应后，在2000-2500g离心5min，分离出油脂层和干细胞层。此时，干细胞呈颗粒形式，通过使用补充有10％胎牛血清(FBS)(HYCLONE)的DMEM(HYCLONE)溶解沉淀，然后获得脂肪干细胞并在细胞培养皿中培养。

细胞培养和脂肪干细胞的形态观察：

培养的人脂肪干细胞(ADSC)用含有10％胎牛血清(FBS)和链霉素-青霉素(100units/ml)的高葡萄糖DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)培养。在5％CO₂、37℃培养箱中培养。通过光学显微镜进行测量以观察早期脂肪干细胞的形态特征，并在x40放大率下拍摄。

脂肪干细胞的鉴定：

使用RNA分离试剂盒(Sangon Biotech)从培养的脂肪干细胞中分离RNA，并通过DNA合成试剂盒(SangonBiotech)合成cDNA。通过RT-PCR鉴定脂肪干细胞的标记物。CD44，CD34，CD29和CD13(称为脂肪干细胞阳性标记物)的PCR引物设计显示在表1中。

表1 MSC阳性标记引物设计

细胞增殖试验：

使用MTS测定法测量细胞生长以比较脂肪干细胞的细胞增殖。在该实验中使用的培养基是补充有5％FBS(胎牛血清)和抗生素(100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)培养基。在96孔细胞培养板中每孔接种0.8x10⁴脂肪干细胞，在37℃，5％CO₂培养箱中孵育。向对照组中加入蒸馏水，分别用终浓度为0,0.25,0.5,1,5,10,50和100μg/ml白桦茸水提取物(CHA)处理，然后培养24、48、72小时。用Cell Titer96*Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay[MTS,3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium]在495nm波长下测量细胞生长，并基于此制备细胞生长曲线。

伤口愈合测定：

在6孔细胞培养皿中接种0.5×10⁶个脂肪干细胞后，使用1000ul蓝色移液枪枪头均匀地刮擦一条线。用PBS洗涤细胞两次后，用终浓度为0,0.25,0.5,1,5,10,50,100μg/ml白桦茸水提取物(CHA)处理，18小时后，用LEICA DMi1 Image view system观察并测量伤口愈合情况。

结果为：

脂肪干细胞培养的显微镜观察：

从初始培养和传代培养后的形态学外观观察从脂肪细胞分离的脂肪干细胞，并且使用光学显微镜在x40放大倍数下观察脂肪干细胞的分化和密度。

结果，初始脂肪干细胞的数量非常少并且细胞生长不稳定，但是通过培养过程改善了脂肪干细胞的产量和密度，当细胞条件充足时进行实验。

从图1中可以看出，细胞数和细胞密度增加，当其充分生长时进行实验。

检查脂肪干细胞标记：

已知CD44，CD34，CD29和CD13是脂肪干细胞阳性标记物(Alexander et al,2017)。从脂肪干细胞中分离RNA，然后合成cDNA进行RT-PCR。电泳的结果鉴定了CD44，CD34，CD29和CD13的所有条带并确认其为脂肪干细胞阳性。

从图2中可以得出，脂肪干细胞阳性标记物CD44，CD34，CD29和CD13的条带均在，鉴定其为脂肪干细胞。

细胞增殖试验：

使用90％增殖的脂肪干细胞，并且使用5％FBS DMEM培养物在24小时细胞饥饿状态下抑制细胞生长。在96孔细胞培养板上接种脂肪干细胞0.8x10⁴后，使用5％FBS DMEM培养基，白桦茸水提取物(CHA)浓度为0,0.25,0.5,1,5,10,50,100μg/ml培养24,48和72小时后。将10μl MTS测定溶液应用于每个孔以测量2小时后495nm吸光度下的细胞生长效应。

白桦茸水提取物在脂肪干细胞中以各种浓度(0.25-100μg)处理，并培养24小时，48小时和72小时。通过MTS测定细胞生长情况。(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001versuscontrol)。

结果见图3，从图3中可以看出，细胞生长在0.25～50μg的浓度下促进，并且在100μg的高浓度下不促进细胞生长，但没有显着的细胞毒性。细胞生长24小时，0.5～10μg浓度下增加26-36％，细胞生长48小时，0.25～10μg浓度下增加54-86％，细胞生长72小时，0.25～10μg浓度下增加23-32％。最大效果为48h，0.5～10μg浓度最佳。

伤口愈合测定：

当脂肪干细胞增殖90％时，在6孔细胞培养板上进行0.5×10⁶接种，并使用5％FBSDMEM培养物抑制24小时细胞生长。用1000μl蓝色移液枪枪头刮擦细胞，用PBS洗涤细胞两次，然后用5％FBS DMEM溶化白桦茸水提取物。用以终浓度为0,1,5,10,50,100μg/ml处理后培养18小时。

白桦茸水提取物在脂肪干细胞中以各种浓度(1～100μg)处理并培养0h和18h以测量伤口愈合情况。伤口愈合测定法测量细胞迁移区域长度(**p<0.01,***p<0.001versuscontrol)。

结果见图4，从图4中可以得出，对照组和1μg提取物0h和18h细胞生长不显著，白桦茸水提取物在5μg/ml时促进49％，在10μg/ml时促进55％，在50μg/ml时促进32％。最有效浓度为5μg/ml和10μg/ml。

由以上实施例可以得出，白桦茸水提取物具有促进脂肪干细胞生长的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 深圳市未来细胞生命科技有限公司

<120> 白桦茸水提取物在促进脂肪干细胞生长中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatgaggcca caacaaacat caca 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgtccttct taaactccgc acagc 25

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggcacaatc cacacgtag 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcacggtgga taccagcac 19

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccacagatgc cgggtttcac tttg 24

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccttcgcttt ggcattcaat tca 23

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gacacatatt gcttcaatgc ttcagc 26

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatgccaaga tgatcagcca ttctggaat 29

Claims

1.白桦茸水提取物在促进脂肪干细胞生长中的应用；

所述白桦茸水提取物的制备方法包括：将白桦茸与水混合，在100～110℃下浸泡35～45min，将得到的浸泡物离心，得到上层清液，将所述上层清液过滤，得到滤液，将所述滤液冷冻干燥，得到白桦茸水提取物；

所述白桦茸的质量与水的体积比为(0.05～0.15)g:(90～110)ml；

所述离心的时间为4～6min，所述离心的转速为5000～6000rpm；

将所述白桦茸水提取物与脂肪干细胞、液体培养基混合，将得到的混合物培养24～72h；

所述混合物中白桦茸水提取物的浓度为0.25～50μg/ml。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水为经过三次蒸馏得到的蒸馏水。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过滤使用尼龙注射器；所述尼龙注射器的孔径为0.45μm。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述混合物中脂肪干细胞的数量为0.7～0.9×10⁴个。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述液体培养基以DMEM为基础培养基，包括5％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。