CN112626012A - 一种促进干细胞生长的培养液及其制作方法 - Google Patents

一种促进干细胞生长的培养液及其制作方法 Download PDF

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张涛
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Abstract

本发明提出了一种促进干细胞生长的培养液，所述的培养液包括脂肪干细胞﹑白桦茸微粒和培养基，所述的白桦茸微粒的浓度数值为：0.2～50μg/ml；脂肪干细胞的数目的数值为：0.7～0.9×104个；培养基的浓度数值为：5～15μg/ml。本发明还公开了促进干细胞生长的培养液的制备方法。本发明提供的促进干细胞生长的培养液及其制作方法中，生长因子取自于自然界，成本较低，易于获得。

Description

一种促进干细胞生长的培养液及其制作方法
本申请案是申请号：201910893061.8﹑申请日：2019.09.20﹑发明名称：白桦茸水提取物在促进脂肪干细胞生长中的应用的发明案的分案申请。
技术领域
本发明涉及培养液技术领域，特别涉及一种促进干细胞生长的培养液及其制作方法。
背景技术
干细胞是具有无限的再生能力的未分化细胞，可以通过适当的生物信号和人体外部刺激分化成特定细胞，分为胚胎干细胞和成体干细胞。在受精后约14天从胚胎中提取的胚胎干细胞是能够在实验室中无限增殖的全能细胞，并且可以分化成身体的所有细胞和组织。然而，尽管具有这些优点，但在医学用途方面存在局限性，例如生物伦理学，其可以破坏可以生长为生命的胚胎，免疫不相容性，以及可能导致产生不受控制的肿瘤或畸胎瘤的问题。
与受精卵发育早期获得的胚胎干细胞不同，成体干细胞是指在发育过程后在身体各部分发现的具有各种形式再生能力的干细胞。未分化状态能够自我增殖，具有多能性，可以分化成不同组织的细胞。成体干细胞的缺点在于它们比胚胎干细胞更难增殖。然而，由于确定了分化细胞的类型和方向，因此在移植中具有安全性和相对较少局限性的优点，例如不易肿瘤形成和免疫排斥，但由于干细胞培养相对困难，体外培养受到限制难以进行大量增殖。
脂肪干细胞与人体中的其他组织细胞相比具有相对低的提取风险，可以通过简单的吸脂术获得大量的脂肪组织。此外，它在培养中表现出稳定的生长和增殖，因此当诱导分化时，可以根据生长信号刺激分化成各种细胞。然而，由于生长缓慢和分化差，脂肪干细胞通过添加生长因子来促进细胞生长，从而有助于细胞培养。要添加的生长因子包括VEGF(血管内皮生长因子)﹑FGF(成纤维细胞生长因子)﹑IGF(胰岛素样生长因子)﹑KGF(角质形成细胞生长因子)﹑HGF(肝细胞生长因子)和PDGF(血小板生长因子)，这些生长因子成本较高，而且，涉及人体组织，不易取得。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供一种具有自然界且成本较低的生长因子的促进干细胞生长的培养液及其制作方法。
本发明公开了一种促进干细胞生长的培养液，所述的培养液包括脂肪干细胞﹑白桦茸微粒和培养基，所述的白桦茸微粒的浓度数值为：0.2～50μg/ml；脂肪干细胞的数目的数值为：0.7～0.9×104个；培养基的浓度数值为：5～15μg/ml。
进一步地，所述的培养基成分为：胎牛血清和抗生素的混合液体组织。
进一步地，所述的白桦茸微粒的浓度数值为：0.25～50μg/ml。
进一步地，培养时长为18小时，所述的白桦茸微粒的浓度数值为：5～50μg/ml。
本发明公开了一种促进干细胞生长的培养液的制作方法，包括以下步骤：
S1、提取白桦茸蘑菇粉，将0.1g白桦茸蘑菇粉加入到100ml蒸馏水中浸泡，加热至100～120℃，浸泡时长为：30～50分钟，在5400RPM的转速下离心4～7分钟，取上层清液，过滤，制成10mg/ml浓度，在-80℃～-100℃的温度条件下进行保存；
S2、提取脂肪，通过吸脂术从人体腹部或大腿提取脂肪，将提取的脂肪和生理盐水以1：1的比例混合，离心处理，提取脂肪；
S3、分离脂肪干细胞，将1：1比例的胶原酶和生理盐水混合，获得胶原酶溶液，所述的胶原酶溶液与所述的脂肪以1：1的比例混合，在35℃～39℃的条件下进行酶反应，酶反应时长：30～60分钟，离心处理4～7分钟，分离出脂肪干细胞颗粒；
S4、增生细胞,将5～15μg/ml的培养基﹑0.2～50μg/ml的白桦茸微粒﹑0.7～0.9×104个脂肪干细胞颗粒，投入到细胞培养箱中，培养时长为：15小时～72小时。
进一步地，所述的培养基成分为：胎牛血清和抗生素的混合液体组织。
进一步地，所述的白桦茸微粒的浓度数值为：0.25～50μg/ml。
进一步地，培养时长为18小时，所述的白桦茸微粒的浓度数值为：5～50μg/ml。
实施本技术方案的一种促进干细胞生长的培养液及其制作方法，具有以下的技术效果：
区别于现有技术中生长因子取自人体，成本较高，不易获得，本发明提供的促进干细胞生长的培养液及其制作方法中，生长因子取自于自然界，成本较低，易于获得。
说明书附图
图1为本发明脂肪干细胞的鉴定结果图；
图2为本发明脂肪干细胞生长效果图；
图3为本发明脂肪干细胞培养24小时时，白桦茸提取物对细胞活力的影响的柱状图；
图4为本发明脂肪干细胞培养48小时时，白桦茸提取物对细胞活力的影响；的柱状图；
图5为本发明脂肪干细胞培养72小时时，白桦茸提取物对细胞活力的影响；的柱状图；
图6为本发明脂肪干细胞培养18小时时，白桦茸提取物对伤口闭合的影响的照片图。
具体实施方式
本发明提供了白桦茸水提取物在促进脂肪干细胞生长中的应用。
优选的，所述白桦茸水提取物的制备方法包括：将白桦茸与水混合，在100～110℃下浸泡35～45min，将得到的浸泡物离心，得到上层清液，将所述上层清液过滤，得到滤液，将所述滤液冷冻干燥，得到白桦茸水提取物。
优选的，所述白桦茸的质量与水的体积比为(0.05～0.15)g:(90～110)ml。
优选的，所述水为经过三次蒸馏得到的蒸馏水。
优选的，所述离心的时间为4～6min，所述离心的转速为5000～6000rpm。
优选的，所述过滤使用的尼龙注射器的孔径为0.45μm。
优选的，将所述白桦茸水提取物与脂肪干细胞、液体培养基混合，将得到的混合物培养24～72h。
优选的，所述混合物中白桦茸水提取物的浓度为0.25～50μg/ml。
优选的，所述混合物中脂肪干细胞的数量为0.7～0.9×104个；
优选的，所述液体培养基以DMEM为基础培养基，包括5％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
本发明提供了白桦茸水提取物在促进脂肪干细胞生长中的应用。在本发明中，所述桦茸提取物促进脂肪干细胞的机理：通过与细胞表面特异受体结合，调控脂肪干细胞的分裂、增殖和生长分化，促进细胞代谢。
本发明对所述白桦茸的来源没有特殊限定，采用常规即可。本发明优选将白桦茸粉碎后，将得到的白桦茸粉与水混合，本发明对所述白桦茸粉的粒径没有特殊限定。在本发明中，所述白桦茸的质量与水的体积比优选为(0.05～0.15)g:(90～110)ml，更优选为0.1g:100ml。在本发明中，所述水优选为经过三次蒸馏得到的蒸馏水。
本发明优选将白桦茸与水混合，在105℃下浸泡40min。
在本发明中，所述离心的时间优选为4～6min，所述离心的转速优选为5000～6000rpm。在本发明中，所述过滤使用的尼龙注射器的孔径优选为0.45μm。本发明对所述冷冻干燥的条件没有特殊限定，采用常规冷冻干燥的条件即可。
本发明优选将所述白桦茸水提取物与脂肪干细胞、液体培养基混合，将得到的混合物培养24～72h，更优选培养48h。
本发明对所述脂肪干细胞的来源没有特殊限定，采用常规市售或者常规培养方法培养得到即可。
在本发明中，所述混合物中白桦茸水提取物的浓度优选为0.25～50μg/ml，
更优选为0.5～50μg/ml，在该浓度下，白桦茸水提取物能够促进脂肪干细胞。
在本发明中，所述混合物中脂肪干细胞的数量优选为0.7～0.9×104个更优选为0.8×104个。
在本发明中，所述液体培养基优选以DMEM为基础培养基，包括5％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
白桦茸水提取物的准备：
将0.1g白桦茸蘑菇粉加入到三次蒸馏的100ml蒸馏水中，然后在105℃下热水浸泡40min，5400rpm离心5min，取上层清液，用0.45μm尼龙注射器过滤器过滤后，冷冻干燥，得到白桦茸水提取物。
脂肪的提取和脂肪干细胞的分离：
通过吸脂术从人体腹部或大腿提取脂肪。将提取的脂肪和生理盐水以1：1的比例混合，并以300g离心3min以除去油，血液和盐水。将新鲜的纯脂肪提取三次。将1:1比例的I型胶原酶(SIGMA)和生理盐水混合的胶原酶溶液与脂肪以1:1的比例混合，酶反应在37℃下进行30-60min。除了通常用于胶原酶溶液的I型胶原酶之外，也可以使用对人类无害的人胶原酶，在这种情况下，反应时间不设定为30至60min。特别是，人体胶原酶对人体无害，无毒性，因此不需要中和过程。酶促反应后，在2000-2500g离心5min，分离出油脂层和干细胞层。此时，干细胞呈颗粒形式，通过使用补充有10％胎牛血清(FBS)(HYCLONE)的DMEM(HYCLONE)溶解沉淀，然后获得脂肪干细胞并在细胞培养皿中培养。
细胞培养和脂肪干细胞的形态观察：
培养的人脂肪干细胞(ADSC)用含有10％胎牛血清(FBS)和链霉素-青霉素(100units/ml)的高葡萄糖DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)培养。在5％CO2、37℃培养箱中培养。通过光学显微镜进行测量以观察早期脂肪干细胞的形态特征，并在x40放大率下拍摄。
脂肪干细胞的鉴定：
使用RNA分离试剂盒(Sangon Biotech)从培养的脂肪干细胞中分离RNA，并通过DNA合成试剂盒(SangonBiotech)合成cDNA。通过RT-PCR鉴定脂肪干细胞的标记物。CD44﹑CD34﹑CD29和CD13(称为脂肪干细胞阳性标记物)的PCR引物设计显示在表1中。
表1 MSC阳性标记引物设计
使用MTS测定法测量细胞生长以比较脂肪干细胞的细胞增殖。在该实验中使用的培养基是补充有5％FBS(胎牛血清)和抗生素(100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)培养基。
在96孔细胞培养板中每孔接种0.8x104脂肪干细胞，在37℃，5％CO2培养箱中孵育。向对照组中加入蒸馏水，分别用终浓度为0﹑0.25﹑0.5﹑1﹑5﹑10﹑50和100μg/ml白桦茸水提取物(CHA)处理，然后培养24、48、72小时。用Cell Titer 96*Aqueous One Solution CellProliferation Assay[MTS,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium]在495nm波长下测量细胞生长，并基于此制备细胞生长曲线。
伤口愈合测定：
在6孔细胞培养皿中接种0.5×106个脂肪干细胞后，使用1000ul蓝色移液枪枪头均匀地刮擦一条线。用PBS洗涤细胞两次后，用终浓度为0﹑0.25﹑0.5﹑1﹑5﹑10﹑50和100μg/ml白桦茸水提取物(CHA)处理，18小时后，用LEICADMi1 Image view system观察并测量伤口愈合情况。
结果为：
脂肪干细胞培养的显微镜观察：
从初始培养和传代培养后的形态学外观观察从脂肪细胞分离的脂肪干细胞，并且使用光学显微镜在x40放大倍数下观察脂肪干细胞的分化和密度。
结果，初始脂肪干细胞的数量非常少并且细胞生长不稳定，但是通过培养过程改善了脂肪干细胞的产量和密度，当细胞条件充足时进行实验。
从图2中可以看出，细胞数和细胞密度增加，当其充分生长时进行实验。
检查脂肪干细胞标记：
已知CD44﹑CD34﹑CD29和CD13是脂肪干细胞阳性标记物(Alexander et al,2017)。
从脂肪干细胞中分离RNA，然后合成cDNA进行RT-PCR。电泳的结果鉴定了CD44﹑CD34﹑CD29。
从图1中可以得出，脂肪干细胞阳性标记物CD44﹑CD34﹑CD29和CD13的条带均在，鉴定其为脂肪干细胞。
细胞增殖试验：
使用90％增殖的脂肪干细胞，并且使用5％FBS DMEM培养物在24小时细胞饥饿状态下抑制细胞生长。在96孔细胞培养板上接种脂肪干细胞0.8x104后，使用5％FBS DMEM培养基，白桦茸水提取物(CHA)浓度为0﹑0.25﹑0.5﹑1﹑5﹑10﹑50和100μg/ml培养24,48和72小时后。将10μl MTS测定溶液应用于每个孔以测量2小时后495nm吸光度下的细胞生长效应。
白桦茸水提取物在脂肪干细胞中以各种浓度(0.25-100μg)处理，并培养24小时，48小时和72小时。通过MTS测定细胞生长情况。(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001versuscontrol)。
实验结果看出，细胞生长在0.25～50μg的浓度下促进，并且在100μg的高浓度下不促进细胞生长，但没有显着的细胞毒性。细胞生长24小时，0.5～10μg浓度下增加26-36％，细胞生长48小时，0.25～10μg浓度下增加54-86％，细胞生长72小时，0.25～10μg浓度下增加23-32％。最大效果为48h，0.5～10μg浓度最佳。
伤口愈合测定：
当脂肪干细胞增殖90％时，在6孔细胞培养板上进行0.5×106接种，并使用5％FBSDMEM培养物抑制24小时细胞生长。用1000μl蓝色移液枪枪头刮擦细胞，用PBS洗涤细胞两次，然后用5％FBS DMEM溶化白桦茸水提取物。用以终浓度为0﹑1﹑5﹑10﹑50﹑100μg/ml处理后培养18小时。
白桦茸水提取物在脂肪干细胞中以各种浓度(1～100μg)处理并培养0h和18h以测量伤口愈合情况。伤口愈合测定法测量细胞迁移区域长度(**p<0.01,***p<0.001versuscontrol)。
结果见图6，从图6中可以得出，对照组和1μg提取物0h和18h细胞生长不显著，白桦茸水提取物在5μg/ml时促进49％，在10μg/ml时促进55％，在50μg/ml时促进32％。最有效浓度为5μg/ml和10μg/ml。
由以上实施例可以得出，白桦茸水提取物具有促进脂肪干细胞生长的作用。
本发明公开一种促进干细胞生长的培养液，包括脂肪干细胞﹑白桦茸微粒和培养基，白桦茸微粒的浓度数值为：0.2～50μg/ml；脂肪干细胞的数目的数值为：0.7～0.9×104个；培养基的浓度数值为：5～15μg/ml。
培养基成分为：胎牛血清和抗生素的混合液体组织。
白桦茸微粒的浓度数值为：0.25～50μg/ml。
较佳地，培养时长为18小时，白桦茸微粒的浓度数值为：5～50μg/ml时生长效果较好。
下面介绍一种促进干细胞生长的培养液的制作方法。
实施例一，
S1、提取白桦茸蘑菇粉，将0.1g白桦茸蘑菇粉加入到100ml蒸馏水中浸泡，加热至100℃，浸泡时长为：30分钟，在5400RPM的转速下离心4分钟，取上层清液，过滤，制成10mg/ml浓度，在-80℃的温度条件下进行保存；
S2、提取脂肪，通过吸脂术从人体腹部或大腿提取脂肪，将提取的脂肪和生理盐水以1：1的比例混合，离心处理，提取脂肪；
S3、分离脂肪干细胞，将1：1比例的胶原酶和生理盐水混合，获得胶原酶溶液，所述的胶原酶溶液与所述的脂肪以1：1的比例混合，在35℃的条件下进行酶反应，酶反应时长：30分钟，离心处理4分钟，分离出脂肪干细胞颗粒；
S4、增生细胞,将5μg/ml的培养基﹑0μg/ml的白桦茸微粒﹑0.7×104个脂肪干细胞颗粒，投入到细胞培养箱中，培养时长为：24小时，制作产品1。
实施例二，
S1、提取白桦茸蘑菇粉，将0.1g白桦茸蘑菇粉加入到100ml蒸馏水中浸泡，加热至105℃，浸泡时长为：35分钟，在5400RPM的转速下离心5分钟，取上层清液，过滤，制成10mg/ml浓度，在-85℃的温度条件下进行保存；
S2、提取脂肪，通过吸脂术从人体腹部或大腿提取脂肪，将提取的脂肪和生理盐水以1：1的比例混合，离心处理，提取脂肪；
S3、分离脂肪干细胞，将1：1比例的胶原酶和生理盐水混合，获得胶原酶溶液，所述的胶原酶溶液与所述的脂肪以1：1的比例混合，在35℃的条件下进行酶反应，酶反应时长：40分钟，离心处理5分钟，分离出脂肪干细胞颗粒；
S4、增生细胞,将6μg/ml的培养基﹑0.25μg/ml的白桦茸微粒﹑0.7×104个脂肪干细胞颗粒，投入到细胞培养箱中，培养时长为：24小时，制作产品2。
实施例三，
S1、提取白桦茸蘑菇粉，将0.1g白桦茸蘑菇粉加入到100ml蒸馏水中浸泡，加热至107℃，浸泡时长为：45分钟，在5400RPM的转速下离心5分钟，取上层清液，过滤，制成10mg/ml浓度，在-90℃的温度条件下进行保存；
S2、提取脂肪，通过吸脂术从人体腹部或大腿提取脂肪，将提取的脂肪和生理盐水以1：1的比例混合，离心处理，提取脂肪；
S3、分离脂肪干细胞，将1：1比例的胶原酶和生理盐水混合，获得胶原酶溶液，所述的胶原酶溶液与所述的脂肪以1：1的比例混合，在37℃的条件下进行酶反应，酶反应时长：50分钟，离心处理5分钟，分离出脂肪干细胞颗粒；
S4、增生细胞,将10μg/ml的培养基﹑0.5μg/ml的白桦茸微粒﹑0.75×104个脂肪干细胞颗粒，投入到细胞培养箱中，培养时长为：24小时，制作产品3。
实施例四，
S1、提取白桦茸蘑菇粉，将0.1g白桦茸蘑菇粉加入到100ml蒸馏水中浸泡，加热至105℃，浸泡时长为：40分钟，在5400RPM的转速下离心5分钟，取上层清液，过滤，制成10mg/ml浓度，在-90℃的温度条件下进行保存；
S2、提取脂肪，通过吸脂术从人体腹部或大腿提取脂肪，将提取的脂肪和生理盐水以1：1的比例混合，离心处理，提取脂肪；
S3、分离脂肪干细胞，将1：1比例的胶原酶和生理盐水混合，获得胶原酶溶液，所述的胶原酶溶液与所述的脂肪以1：1的比例混合，在37℃的条件下进行酶反应，酶反应时长：45分钟，离心处理5分钟，分离出脂肪干细胞颗粒；
S4、增生细胞,将8μg/ml的培养基﹑1μg/ml的白桦茸微粒﹑0.8×104个脂肪干细胞颗粒，投入到细胞培养箱中，培养时长为：24小时，制作产品4。
实施例五，
S1、提取白桦茸蘑菇粉，将0.1g白桦茸蘑菇粉加入到100ml蒸馏水中浸泡，加热至105℃，浸泡时长为：50分钟，在5400RPM的转速下离心5分钟，取上层清液，过滤，制成10mg/ml浓度，在-95℃的温度条件下进行保存；
S2、提取脂肪，通过吸脂术从人体腹部或大腿提取脂肪，将提取的脂肪和生理盐水以1：1的比例混合，离心处理，提取脂肪；
S3、分离脂肪干细胞，将1：1比例的胶原酶和生理盐水混合，获得胶原酶溶液，所述的胶原酶溶液与所述的脂肪以1：1的比例混合，在37℃的条件下进行酶反应，酶反应时长：50分钟，离心处理5分钟，分离出脂肪干细胞颗粒；
S4、增生细胞,将12μg/ml的培养基﹑5μg/ml的白桦茸微粒﹑0.8×104个脂肪干细胞颗粒，投入到细胞培养箱中，培养时长为：24小时，制作产品5。
实施例六，
S1、提取白桦茸蘑菇粉，将0.1g白桦茸蘑菇粉加入到100ml蒸馏水中浸泡，加热至105℃，浸泡时长为：50分钟，在5400RPM的转速下离心6分钟，取上层清液，过滤，制成10mg/ml浓度，在-95℃的温度条件下进行保存；
S2、提取脂肪，通过吸脂术从人体腹部或大腿提取脂肪，将提取的脂肪和生理盐水以1：1的比例混合，离心处理，提取脂肪；
S3、分离脂肪干细胞，将1：1比例的胶原酶和生理盐水混合，获得胶原酶溶液，所述的胶原酶溶液与所述的脂肪以1：1的比例混合，在37℃的条件下进行酶反应，酶反应时长：55分钟，离心处理6分钟，分离出脂肪干细胞颗粒；
S4、增生细胞,将12μg/ml的培养基﹑10μg/ml的白桦茸微粒﹑0.85×104个脂肪干细胞颗粒，投入到细胞培养箱中，培养时长为：24小时，制作产品6。
实施例七，
S1、提取白桦茸蘑菇粉，将0.1g白桦茸蘑菇粉加入到100ml蒸馏水中浸泡，加热至120℃，浸泡时长为：50分钟，在5400RPM的转速下离心7分钟，取上层清液，过滤，制成10mg/ml浓度，在-100℃的温度条件下进行保存；
S2、提取脂肪，通过吸脂术从人体腹部或大腿提取脂肪，将提取的脂肪和生理盐水以1：1的比例混合，离心处理，提取脂肪；
S3、分离脂肪干细胞，将1：1比例的胶原酶和生理盐水混合，获得胶原酶溶液，所述的胶原酶溶液与所述的脂肪以1：1的比例混合，在39℃的条件下进行酶反应，酶反应时长：60分钟，离心处理7分钟，分离出脂肪干细胞颗粒；
S4、增生细胞,将15μg/ml的培养基﹑50μg/ml的白桦茸微粒﹑0.88×104个脂肪干细胞颗粒，投入到细胞培养箱中，培养时长为：24小时，制作产品7。
实施例八，
S1、提取白桦茸蘑菇粉，将0.1g白桦茸蘑菇粉加入到100ml蒸馏水中浸泡，加热至120℃，浸泡时长为：50分钟，在5400RPM的转速下离心7分钟，取上层清液，过滤，制成10mg/ml浓度，在-100℃的温度条件下进行保存；
S2、提取脂肪，通过吸脂术从人体腹部或大腿提取脂肪，将提取的脂肪和生理盐水以1：1的比例混合，离心处理，提取脂肪；
S3、分离脂肪干细胞，将1：1比例的胶原酶和生理盐水混合，获得胶原酶溶液，所述的胶原酶溶液与所述的脂肪以1：1的比例混合，在39℃的条件下进行酶反应，酶反应时长：60分钟，离心处理7分钟，分离出脂肪干细胞颗粒；
S4、增生细胞,将15μg/ml的培养基﹑100μg/ml的白桦茸微粒﹑0.9×104个的脂肪干细胞颗粒，投入到细胞培养箱中，培养时长为：24小时，制作产品8。
以上产品的培养的人脂肪干细胞(ADSC)用含有10％胎牛血清(FBS)和链霉素-青霉素(
Figure BDA0002827614290000131
)的高葡萄糖DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)培养。并在空气中含5％CO2,温度为37℃培养箱中培养。
通过光学显微镜进行测量以观察早期脂肪干细胞的形态特征，并在x40放大率下拍摄。
脂肪干细胞的鉴定
使用RNA分离试剂盒(Sangon Biotech)从培养的脂肪干细胞中分离RNA，并通过DNA合成试剂盒(Sangon Biotech)合成cDNA。通过RT-PCR鉴定脂肪干细胞的标记物。
CD44﹑CD34﹑CD29和CD13(称为脂肪干细胞阳性标记物)的PCR引物设计显示在表1中。
表1 MSC阳性标记引物设计
Figure BDA0002827614290000141
检查脂肪干细胞标记。
已知CD44﹑CD34﹑CD29和CD13是脂肪干细胞阳性标记物(Alexander et al,2017)。
从脂肪干细胞中分离RNA，然后合成cDNA进行RT-PCR。电泳的结果鉴定了CD44﹑CD34﹑CD29和CD13的所有条带并确认其为脂肪干细胞阳性。
如图1所示，通过RT-PCR进行脂肪干细胞的鉴定，脂肪干细胞阳性标记物CD44﹑CD34﹑CD29和CD13的条带均在，鉴定其为脂肪干细胞。
脂肪干细胞培养的显微镜观察。
从初始培养和传代培养后的形态学外观观察从脂肪细胞分离的脂肪干细胞，并且使用光学显微镜在x40放大倍数下观察脂肪干细胞的分化和密度。
结果，初始脂肪干细胞的数量非常少并且细胞生长不稳定，但是通过培养过程改善了脂肪干细胞的产量和密度，当细胞条件充足时进行实验。
图2脂肪干细胞的形态，可以看出，在初始状态(最左边)至中间状态再至最终状态，细胞数和细胞密度增加，当其充分生长时进行实验。
细胞增殖试验
使用MTS测定法测量细胞生长以比较脂肪干细胞的细胞增殖。
在该实验中使用的培养基是补充有5％FBS(胎牛血清)和抗生素(100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)培养基。
在96孔细胞培养板中每孔接种0.8x104脂肪干细胞，在37℃，5％CO2培养箱中孵育。
向对照组中加入蒸馏水，分别用0﹑0.25﹑0.5﹑1,5﹑10﹑50和100μl/ml白桦茸蘑菇提取物(CHA)处理，然后培养24﹑48﹑72小时，如以上制得的产品1-8。在495nm波长下测量细胞生长，并基于此制备细胞生长曲线。
将以上的产品1-8，培养48小时及72小时后，使用90％增殖的脂肪干细胞，并且使用5％FBS DMEM培养物在细胞饥饿状态下抑制细胞生长。
在96孔细胞培养板上接种脂肪干细胞0.8x104后，使用5％FBS DMEM培养基，通过10μlMTS测定溶液应用于每个孔以测量2小时后495nm吸光度下的细胞生长效应。
实验效果以图3至图5所示。
结果，细胞生长的情况，在0.25～50μg白桦茸颗粒的浓度下促进，并且在100μg的高浓度下不促进细胞生长，但没有显着的细胞毒性。
细胞生长24小时，0.5～10μg浓度下增加26～36％，细胞生长48小时，0.25～10μg浓度下增加54～86％，细胞生长72小时，0.25～10μg浓度下增加23～32％。最大效果为48h，0.5～10μg浓度最佳。
将以上的产品1﹑4﹑5﹑6﹑7﹑8，培养18小时后，当脂肪干细胞增殖90％时，在6孔细胞培养板上进行0.5×106接种，并使用5％FBS DMEM培养物抑制细胞生长。用1000μl蓝色移液枪枪头刮擦细胞，用PBS洗涤细胞两次，然后用5％FBS DMEM溶化白桦茸提取物(CHA)。
以测量伤口愈合情况，如图6所示。伤口愈合测定法测量细胞迁移区域长度。
结果证实，对照组和1μg提取物0h和18h细胞生长不显著，白桦茸提取物在5μg时促进49％，在10μg时促进55％，在50μg时促进32％。最有效浓度为5μg和10μg。
实施本技术方案的一种促进干细胞生长的培养液及其制作方法，具有以下的技术效果：
区别于现有技术中生长因子取自人体，成本较高，不易获得，本发明提供的茉莉花的促进干细胞生长的培养液及其制作方法中，生长因子取自于自然界，成本较低，易于获得。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002827614290000171

Claims (8)

1.一种促进干细胞生长的培养液，其特征在于，所述的培养液包括脂肪干细胞﹑白桦茸微粒和培养基，所述的白桦茸微粒的浓度数值为：0.2～50μg/ml；脂肪干细胞的数目的数值为：0.7～0.9×104个；培养基的浓度数值为：5～15μg/ml。
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述的培养基成分为：胎牛血清和抗生素的混合液体组织。
3.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述的白桦茸微粒的浓度数值为：0.25～50μg/ml。
4.根据权利要求3所述的培养液，其特征在于，培养时长为18小时，所述的白桦茸微粒的浓度数值为：5～50μg/ml。
5.一种促进干细胞生长的培养液的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取白桦茸蘑菇粉，将0.1g白桦茸蘑菇粉加入到100ml蒸馏水中浸泡，加热至100～120℃，浸泡时长为：30～50分钟，在5400RPM的转速下离心4～7分钟，取上层清液，过滤，制成10mg/ml浓度，在-80℃～-100℃的温度条件下进行保存；
S2、提取脂肪，通过吸脂术从人体腹部或大腿提取脂肪，将提取的脂肪和生理盐水以1：1的比例混合，离心处理，提取脂肪；
S3、分离脂肪干细胞，将1：1比例的胶原酶和生理盐水混合，获得胶原酶溶液，所述的胶原酶溶液与所述的脂肪以1：1的比例混合，在35℃～39℃的条件下进行酶反应，酶反应时长：30～60分钟，离心处理4～7分钟，分离出脂肪干细胞颗粒；
S4、增生细胞,将5～15μg/ml的培养基﹑0.2～50μg/ml的白桦茸微粒﹑0.7～0.9×104个脂肪干细胞颗粒，投入到细胞培养箱中，培养时长为：15小时～72小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的培养基成分为：胎牛血清和抗生素的混合液体组织。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的白桦茸微粒的浓度数值为：0.25～50μg/ml。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，培养时长为18小时，所述的白桦茸微粒的浓度数值为：5～50μg/ml。
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