TW201512398A - 自組織獲得高純度幹細胞之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種自組織獲得高純度幹細胞之方法，包含：提供由一組織分離出之一含雜質之細胞群產物；提供一過濾裝置，該過濾裝置包括：一管狀結構，具有一入口及一出口，該出口位於低處，且該含雜質之細胞群產物經由該入口流入；及一容置物，形成於該管狀結構內的該入口及該出口之間，以過濾該含雜質之細胞群產物的雜質，使該細胞群產物通過該出口；回收一已去除雜質之該細胞群產物；將該已去除雜質之細胞群產物在一高分子薄膜上培養出一目標幹細胞，該目標幹細胞聚集形成一球體；以及從該高分子薄膜收集該球體而得到目標幹細胞。本發明只需少量的組織檢體，即可快速且有效地自組織分離出幹細胞，並可直接將分離出的幹細胞用在自體移植的臨床實用。
Description
本發明係關於一種自組織獲得高純度幹細胞之方法，尤其是有關一種分離雜質及應用高分子薄膜收集幹細胞的方法。
幹細胞是一種可自我更生(self-renewing)及具有多元性分化(multilineage differentiation)能力之尚未完全分化的細胞，幹細胞在生命體由胚胎發育到成熟個體的過程中，扮演關鍵性的角色，即使發育成熟之後，幹細胞仍普遍存在於生命體中，負責個體的各個組織及器官的細胞更新及受傷修復等。幹細胞普遍被認為可應用於多種疾病的治療，例如：癌症、帕金森氏症、阿茲海默氏症、心血管疾病、及免疫不全症等。而近年來，在幹細胞與生醫材料技術領域的研究不斷突破，幹細胞已成為再生醫學中，治療、修補、重建受損人體器官組織的重要來源。
就功能上而言，幹細胞具有多方面的潛能(multipotent)，即，可分化成不同種類的組織與器官。幹細胞依來源可分為胚胎幹細胞及成體幹細胞兩種。胚胎幹細胞源自胚胎早期囊胚的內層細胞團，保持在未分化的狀態，具有向胚胎三個胚層來源的所有細胞分化的能力，是一種複效性幹細胞(pluripotent stem cells)，然而，其雖具
有完美的自我更生及分化能力，但在取得及使用上仍存在極大的倫理道德爭議。成體幹細胞為存在於成熟的組織器官中的未分化細胞，現今已可自骨髓、皮膚、腦、骨骼肌、及肝臟等器官分離，其能自我複製且分化成具該組織器官功能的細胞。成體幹細胞的存在為補充在正常代謝下損失的組織細胞，這些未分化的組織細胞除了分化出其來源組織的功能細胞外，還可分化成其他組織的功能細胞。現今成體幹細胞的應用，尤其著重於臨床方面，因為成體幹細胞具高的細胞移植存活率，可減少在移植部位的免疫排斥反應。
就從組織中分離成體幹細胞而言，常見的方法為利用密度離心去除組織及組織液，再經酵素分解後萃取出初代細胞，經培養後進一步篩選而得貼附的幹細胞，此方法需繁瑣的離心、分離步驟，且易產生污染，目前雖有震盪混合機與離心機之無菌操作整合系統，或密閉的分離管裝置減少污染風險，但所得之幹細胞純度低且回收量少。因此，目前從組織中分離成體幹細胞的方法，但尚存在許多不足之處，例如：分離出的幹細胞純度不高、幹細胞污染及變異的風險等，皆起因於從組織分離收集幹細胞時，會混雜到雜質及其他異質的細胞亞群，如：內皮細胞或纖維細胞等，而影響所欲分離目標幹細胞的自我更新及多潛能分化能力。
為解決異質的細胞亞群衍生的問題，目前常以免疫篩選的方式，利用流式細胞儀或磁珠結合特定表面抗原蛋白的抗體進行幹細胞的篩選，然而，成體幹細胞的表面抗原並無專一性，亦缺乏一致性的定義，且不同組織、
物種所取得之成體幹細胞，其表面抗原的表現量不同，故，以表面抗原篩選成體幹細胞的方法並無法有效解決分離出的幹細胞純度的問題。此外，以抗體篩選需在初期放大培養較多的細胞進行分離，以克服篩選過程中因細胞與抗體間交互作用而造成的細胞活性降低與細胞量損失，增加整個分離篩選流程的時間及成本。
為了後續臨床應用的便利與實用性，自組織分離出的幹細胞需具有高純度，且分離過程中需防止被其他異質細胞和雜質污染及避免體外環境影響幹細胞之幹性(stemness)。因此，迫切地需要一種快速、簡單、有效的自組織分離高純度幹細胞的方法。
緣此，本發明提供一種自組織獲得高純度幹細胞之方法，包含：提供由一組織分離出之一含雜質之細胞群產物；提供一過濾裝置，該過濾裝置包括：一管狀結構，具有一入口及一出口，該出口位於低處，且該含雜質之細胞群產物經由該入口流入；及一容置物，位於該管狀結構內的該入口及該出口之間，以過濾該含雜質之細胞群產物的雜質，使該細胞群產物通過該出口；回收已去除雜質之該細胞群產物；將該已去除雜質之細胞群產物在一高分子薄膜上培養出一目標幹細胞，其中該目標幹細胞聚集形成一球體；以及從該高分子薄膜收集該球體而得到目標幹細胞，其中該容置物係選自於由基材(matrix)、濾膜、濾網及其任意組合所組成之群組；且該目標幹細胞經7天培養後至少增加3倍的數量，且該容置物的孔洞尺寸為50μm至
300μm，較佳為50μm至150μm。該組織可為骨髓、臍帶血、週邊血、或皮下脂肪，其中當該組織係為皮下脂肪時，該容置物係至少降低50%的油滴。該含雜質之細胞群產物的量為至少1mL，例如1mL-5mL，而該基材是至少一種材料選自於由幾丁聚醣、磺酸化幾丁聚醣、及幾丁聚醣/肝素所組成的群組。
本發明之一實施例中，該基材的形成包含溶解幾丁聚醣於一酸性溶液中形成一混合物，且該酸性溶液係選自於由醋酸、甲酸、硝酸、鹽酸、高氯酸、硫酸所組成之群組。其中，進一步包含把該混合物注入該管狀結構，並使該混合物固化。
本發明之一實施例中，該高分子薄膜的高分子係為幾丁聚醣、磺酸化幾丁聚醣、褐藻酸鹽、聚己內酯或其任一組合。
本發明之一實施例中，該過濾裝置係用來過濾該含雜質之細胞群產物的雜質。過濾後回收已去除雜質之細胞群產物，其包含幹細胞、纖維母細胞、紅血球、白血球、血小板、內皮細胞、外皮細胞、平滑肌細胞。
據此，本發明所提供的一種自組織分離高純度幹細胞之方法，以容置物過濾雜質的過程不需要昂貴的儀器或繁複的步驟，且透過高分子薄膜篩選，可使目標幹細胞聚集形成球體，而異質細胞亞群僅會貼附於高分子薄膜生長；故本發明方法能有效篩選出高純度且保有良好幹性及分化能力的目標幹細胞。同時，本發明所提供的一種自組織分離高純度幹細胞之方法不受限於檢體或初代細胞的多寡，少量的組織即可分離、篩選，之後直接進行臨床的
應用。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
10‧‧‧過濾裝置
11‧‧‧入口
12‧‧‧出口
2‧‧‧容置物
3‧‧‧組織
4‧‧‧含雜質之細胞群產物
5‧‧‧已去除雜質之細胞群產物
6‧‧‧高分子薄膜
61‧‧‧聚集形成球體之細胞
62‧‧‧異質細胞亞群
7‧‧‧目標幹細胞
第一圖係使用基材過濾與高分子薄膜收集獲得目標幹細胞之流程示意圖。
第二A圖係未經管柱去除雜質之產物於高分子薄膜上細胞的形態圖，比例尺為100μm。
第二B圖係經管柱去除雜質之產物於高分子薄膜上細胞的形態圖，比例尺為100μm。
第三圖係脂肪幹細胞幹性基因(Oct4、Sox2和Nanog)之mRNA表現量化結果。
第四圖係細胞倍增時間的比較，P是表示繼代之代數。
第五圖係細胞培養數量的時間比較圖。
第六圖(A)係脂肪幹細胞之硬骨細胞分化能力；(B)係脂肪幹細胞之脂肪細胞分化能力；(C)係脂肪幹細胞之軟骨細胞分化能力。
第七圖係經吸附膜去除雜質之產物於高分子薄膜上細胞的形態圖，比例尺為200μm。
本發明所使用之「過濾裝置」一詞，係具有過濾及/或吸附雜質之作用，其中，過濾過程會把含雜質之該細胞群產物通過基材及/或濾網而去除雜質；吸附過程是會把含雜質之該細胞群產物與濾膜接觸，而把雜質吸附於濾膜上。
本發明所使用之「濾膜」一詞，係包含高分子薄膜及/或吸附膜。
為證實本發明能以快速、簡單、有效的方式自組織獲得高純度之幹細胞，本發明首先提供由組織分出之含雜質之細胞群產物，並且提供一種含有基材的過濾裝置，以過濾該含雜質之細胞群產物的雜質，同時回收該已去除雜質之細胞群產物。接著，本發明提供一種高分子薄膜，將該已去除雜質之細胞群產物於該高分子薄膜上培養出聚集形成球體的目標幹細胞並收集。另外，也於獲得目標幹細胞後，評估分析目標幹細胞的形態、幹性基因表現、生長速率、及分化能力。
本發明之容置物可包含基材(matrix)、濾膜、濾網及其任意組合。在本發明之一實施例中，容置物係為基材，其以冷凍乾燥方法製備，製備方法為：首先，將基材溶於一酸性溶液中，配製成高分子溶液。該酸性溶液係選自於由醋酸、甲酸、硝酸、鹽酸、高氯酸、硫酸所組成之群組，且該酸性溶液較佳為醋酸或甲酸。基材可使用幾丁聚醣、磺酸化幾丁聚醣、或幾丁聚醣/肝素。在本發明之
一實施例中，係使用分子量為510kDa之幾丁聚醣(由美國Fluka購得)，溶於2vol%的醋酸溶液中，配製成幾丁聚醣溶液，並將所製備之幾丁聚醣溶液脫泡。再將該幾丁聚醣溶液倒入管狀結構例如針筒中，置於-20℃低溫環境中冷凍成形，接著將結凍物浸入50/50v/v的1N氫氧化鈉/乙醇(NaOH/EtOH)水溶液中。在低溫(-20℃)下進行溶劑交換與基材膠化後，再清洗矩陣基材殘餘的氫氧化鈉及鹽類。
由上述方法所製備的幾丁聚醣基材，其孔洞大小可為50μm至300μm，較佳為50μm至150μm。
本發明所提供之高分子薄膜，其高分子係為幾丁聚醣、褐藻酸鹽、聚己內酯或其任一組合。在一實施例中，以幾丁聚醣為例，首先，分子量為510kDa的幾丁聚醣粉末(由美國Fluka購得)，其去乙醯度為77.7%。秤取0.5g幾丁聚醣粉末溶入49.5mL二次水，室溫下攪拌半小時後加入0.5mL乙酸，並於室溫中輕拌12小時。隔天使用濾網過濾雜質為1%幾丁聚醣溶液。以100μm的網目過濾，再將300μL的1%幾丁聚醣溶液均勻塗佈於1.5cm的玻片上，待其乾燥後，浸泡在氫氧化鈉溶液5分鐘。浸泡後，再以大量的磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)沖洗，乾燥後即得幾丁聚醣薄膜。
本發明分析結果係以平均值±標準差表示之，並使用t檢定(t-test)作統計數據分析，當p值小於0.05則具有統計上意義的差異性。
請參考第一圖，該圖為本發明使用基材過濾與高分子薄膜收集目標幹細胞之流程示意圖。首先，從一組
織3分離出含雜質之細胞群產物4，以一過濾裝置10過濾該含雜質之細胞群產物4，該含雜質之細胞群產物4從一入口11注入，以過濾該含雜質之細胞群產物的雜質，使該細胞群產物通過一出口12，回收一已去除雜質之細胞群產物5，其中該過濾裝置10係包含一容置物2。接著，將該已去除雜質之細胞群產物5培養於一高分子薄膜6上，異質細胞亞群62如纖維母細胞、紅血球、白血球、血小板、內皮細胞、外皮細胞或平滑肌細胞僅會貼附於高分子薄膜6上生長，而目標幹細胞則會聚集形成球體61，之後便以拍打的方式收集之，即獲得高純度之目標幹細胞7。
本發明只需少量檢體短時間內即可分離出幹細胞，其中1mL的骨髓液與1mL的臍帶血可於3小時內分離出幹細胞、3mL的周邊血亦可於3小時內分離出幹細胞、5mL脂肪組織可於6小時內分離出幹細胞，所分離出來的幹細胞具有高度分化特性，且生長速度很快，利於之後放大培養。以下由脂肪組織分離出脂肪幹細胞為例說明。
首先，將由抽脂手術取出的皮下脂肪組織以PBS清洗數次，並且利用手術剪刀剪成碎塊。加入等體積的200U/mL第一型膠原蛋白酶(type I collagenase，由Sigma購得)/漢克斯平衡鹽溶液(HBSS)溶液(表二)，並置於37℃培養箱中震盪作用後，離心去除未清化完的脂肪塊。再使用70μm細胞篩選細胞後，得到初代培養的細胞，分盤後以培養液(表一)回溶細胞放入75T-flask培養皿(BD
Bioscience)。待其生長至約8分滿後，以0.5%胰蛋白酶(trypsin)/乙二胺四乙酸(EDTA)(Gibco)繼代培養細胞，即稱為本案的含雜質之細胞群產物。
將基材填充至管柱中，並以PBS清洗。將實施例1所得的含雜質之細胞群產物由管柱的入口處加入，其中當實施例1的組織為皮下脂肪時，該雜質大部分為油滴。控制流速為0.5-2mL/min，較佳為1mL/min，使該含雜質之細胞群產物通過該含有基材的管柱進行過濾，該過濾步驟約為5分鐘。
於該含容置物的管柱之出口處收集通過管柱後的液體，該液體係為已去除雜質之細胞群產物，其中當實施例1的組織係為皮下脂肪時，該容置物係至少降低50%的油滴。再以1x 10-4-1x 10-1細胞/cm2，較佳為5x10-4細胞/cm2的細胞密度種植該已去除雜質之細胞群產物於高分子薄膜上。待12-24小時後，將高分子薄膜放置在室溫下，接著以拍打的方式將聚集成球體的細胞收集下來，即獲得目標幹細胞。
請參考第二A圖，該圖係未經管柱去除雜質之產物於高分子薄膜上細胞的形態圖，其中在高分子薄膜上僅少部分細胞有聚集但沒有形成細胞球，大部分細胞為攤開貼附在膜上，無法用來篩選幹細胞；另一方面，參考第二B圖，該圖係經管柱去除雜質之產物於高分子薄膜上細胞的形態圖，其中明顯可觀察到約60%的細胞聚集形成球體，後續可以篩選出成球的幹細胞。
請參考第三圖，該圖係脂肪幹細胞幹性基因(Oct4、Sox2和Nanog)之mRNA表現量化結果，該表現係以RT-PCR進行分析，其中，脂肪幹細胞在此三種幹性基因較初代細胞呈現顯著優異的表現。
細胞倍增時間實驗使用第1至第15代的繼代培養細胞。所有細胞皆以倒立相位差顯微鏡(inverted phase contrast microscope)檢視其形態，並以DNA Hoechst 33528染劑染色分析及校調激發波長為365nm、發射波長為458nm的螢光光譜儀(Hitachi F2500)測量細胞增殖作用(生長曲線)。細胞倍增時間係由生長曲線計算而得。
請參考第四圖，該圖係細胞倍增時間的比較，其中本發明之方法以基材分離後的脂肪幹細胞可長時間繼代培養至10代以上，並維持其生長速度。因為不純的幹細胞，即習知混雜其他細胞的幹細胞經過培養後生長速度會變慢，且無法繼代培養太多代，例如脂肪幹細胞不會超過8-10代，如此在後續應用上有侷限。
請參考第五圖，該圖係細胞培養數量的時間比較圖，其中本發明之方法以基材分離後的脂肪幹細胞於培養後第7天，增加的倍數視培養狀況而定，通常至少3倍的數量，最佳情況例如可增加至10倍的數量，如圖中所示。
本發明之另一實施例，該容置物係使用基材搭配高分子薄膜之組合，其中該基材可為幾丁聚醣、磺酸化幾丁聚醣、或幾丁聚醣/肝素，該高分子薄膜可為幾丁聚
醣、磺酸化幾丁聚醣、褐藻酸鹽或聚己內酯，結果顯示分離後的脂肪幹細胞於培養後第7天，增加4倍的數量。
本發明之又一實施例，該容置物係使用基材搭配濾網之組合，其中該濾網購自BD Falcon，結果顯示分離後的脂肪幹細胞於培養後第7天，增加3.5倍的數量。
硬骨細胞分化分析中，選殖密度為3×104細胞/cm2的細胞在組織培養聚苯乙烯(Tissue Culture Polystyrene，TCPS)的α-最低必需培養基(Minimum Essential Medium，α-MEM)上，並添加10% FBS、10μM β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate)(由Sigma購得)、0.2μM抗壞血酸-2-磷酸酯(ascobate-2-phosphate)(由Sigma購得)，及10-8M地塞米松(dexamethasone)(由Sigma購得)。培養3週，且培養基每週更新2次。以即時聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)分析造骨細胞特有轉錄因子Runx2及骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)。
請參考第六(A)圖，該圖係脂肪幹細胞之硬骨細胞分化能力。分析結果顯示，脂肪幹細胞無論是經7天或14天培養後，硬骨細胞分化能力(Runx2及OCN)均較初代細胞為佳，其中，脂肪幹細胞經過14天培養後，其硬骨細胞分化能力約為初代細胞經過14天培養後的2倍。
脂肪細胞分化分析中，選殖密度為3×104細胞
/cm2的細胞在高葡萄糖的Dulbecco氏調整之Eagle氏培養基(DMEM)上，並添加10% FBS、0.5μM異丁基甲基黃嘌呤(isobutyl-methylxanthine)(由Sigma購得)、200μM吲哚美辛(indomethacin)(由Sigma購得)、10-6M地塞米松(dexamethasone)(由Sigma購得)、及10μg/mL胰島素，培養3週，培養基每週更新2次。以即時聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)分析過氧化體增生劑活化受體γ2(proliferator-activated receptorγ2，PPARγ2)及脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)基因。
請參考第六(B)圖，該圖係脂肪幹細胞之脂肪細胞分化能力。其中，脂肪幹細胞在經過7天或14天的培養後，均較同樣天數培養的初代細胞具有較佳的脂肪細胞分化能力，尤其是以表現PPARγ2的結果較表現LPL的結果顯著。
首先，以丸狀培養(pellet culture)評估軟骨細胞分化的潛力。選殖高濃度細胞(50×104細胞於20μL)在一含聚酯類培養孔(polyester Transwells)(孔徑大小為0.4μm，Corning)的24-孔組織培養盤並於37℃培養4小時，使得細胞囊封並覆蓋於軟骨分化誘導培養基維持3週。該軟骨分化誘導培養基係為低葡萄糖DMEM，且含有10% FBS,10ng/mL TGF-β3(由Peprotech購得)、0.1μM地塞米松、50μg/mL L-抗壞血酸-2-磷酸酯(L-ascobate-2-phosphate)、40μg/ml L-脯胺酸(L-proline，由Sigma購得)、1%胰島素轉鐵蛋白硒(insulin transferrin selenium，ITS+premix 100×，由Sigma購得)、及1%青黴
素/鏈酶素(penicillin-streptomycin)，培養基每週更新2次。以即時聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)分析Sox9及聚集蛋白聚糖(aggrecan，Aggr)基因。
請參考第六C圖，該圖係脂肪幹細胞之軟骨細胞分化能力。脂肪幹細胞在經過7天或14天的培養後，均較同樣天數培養的初代細胞具有較佳的軟骨細胞分化能力，其中與經過同天數培養的初代細胞比較，經過7天培養的脂肪幹細胞在表現Sox9與Aggr基因上較經過14天培養的脂肪幹細胞具有優異性。
本發明之另一實施例中，該容置物係為一吸附膜，吸附膜的材料係為幾丁聚醣、磺酸化幾丁聚醣、褐藻酸鹽、聚己內酯或其任一組合。本發明以吸附膜吸附含雜質之細胞群產物，並以高分子薄膜獲得目標幹細胞。參考第七圖，該圖係經吸附膜吸附雜質，進而去除雜質之細胞產物於高分子薄膜上細胞的形態圖，其中明顯可觀察到約65%的細胞聚集形成球體，後續可以篩選出成球的幹細胞。
經由上述實施例顯示，本發明之一種自組織獲得高純度幹細胞之方法，該容置物可去除雜質，使得從組織而來的細胞群產物於高分子薄膜上聚集形成球體，進一步收集獲得目標幹細胞；其中，本案只需少量檢體短時間內即可分離出幹細胞，其中1mL的骨髓液與1mL的臍帶血可於3小時內分離出幹細胞、3mL的周邊血亦可於3小時內分離出幹細胞、5mL脂肪組織可於6小時內分離出幹細胞，且只需並經由上述實施例之分析結果證實所獲得的
目標幹細胞具有良好的幹性，且可有效地分化為硬骨細胞、脂肪細胞、及軟骨細胞。
綜上所述，本發明之一種自組織獲得高純度幹細胞之方法，可快速、有效地分離出幹細胞，不需要昂貴的儀器或繁複的步驟，且該分離出的幹細胞具有幹性及分化能力。僅需少量的組織即可獲得幹細胞，並且可直接用於臨床應用。即，在一次性手術中，可由手術取下的檢體中分離出高純度有效的幹細胞，不再經過體外擴增直接進行自體移植。
10‧‧‧過濾裝置
11‧‧‧入口
12‧‧‧出口
2‧‧‧容置物
3‧‧‧組織
4‧‧‧含雜質之細胞群產物
5‧‧‧已去除雜質之細胞群產物
6‧‧‧高分子薄膜
61‧‧‧聚集形成球體之細胞
62‧‧‧異質細胞亞群
7‧‧‧目標幹細胞
Claims (10)
- 一種自組織獲得高純度幹細胞之方法，包含：(a)提供由一組織分離出之一含雜質之細胞群產物；(b)提供一過濾裝置，該過濾裝置包括：一管狀結構，具有一入口及一出口，該出口位於低處，且該含雜質之細胞群產物經由該入口流入；及一容置物，位於該管狀結構內的該入口及該出口之間，以過濾該含雜質之細胞群產物的雜質，使該細胞群產物通過該出口；(c)回收已去除雜質之該細胞群產物；(d)將該已去除雜質之細胞群產物在一高分子薄膜上培養出一目標幹細胞，其中該目標幹細胞聚集形成一球體；以及(e)從該高分子薄膜收集該球體而得到目標幹細胞；其中該容置物係選自於由基材(matrix)、濾膜、濾網及其任意組合所組成之群組；且該目標幹細胞經7天培養後至少增加3倍的數量。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該含雜質之細胞群產物的量為至少1mL。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該基材是至少一種材料選自於由幾丁聚醣、磺酸化幾丁聚醣、及幾丁聚醣/肝素所組成的群組。
- 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該基材的形成包含溶解幾丁聚醣於一酸性溶液中形成一混合物，且該酸性溶液係選自於由醋酸、甲酸、硝酸、鹽酸、高氯酸、 硫酸所組成之群組。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該基材的形成進一步包含把該混合物注入該管狀結構，並使該混合物固化。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該容置物的孔洞尺寸為50μm至300μm。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該已去除雜質之該細胞群產物係包含幹細胞、纖維母細胞、紅血球、白血球、血小板、內皮細胞、外皮細胞或平滑肌細胞。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該組織係為骨髓、臍帶血、週邊血、或皮下脂肪。
- 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中當該組織係為皮下脂肪時，該容置物係至少降低50%的油滴。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該高分子薄膜的高分子係為幾丁聚醣、磺酸化幾丁聚醣、褐藻酸鹽、聚己內酯或其任一組合。
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