CN104480062A

CN104480062A - 一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法

Info

Publication number: CN104480062A
Application number: CN201410833788.4A
Authority: CN
Inventors: 钟赛意; 叶伟平; 徐萍萍; 谌素华; 秦小明; 王维民
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2015-04-01

Abstract

本发明涉及一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，属于细胞培养技术领域。该方法包括以下步骤：(1) 取材，新鲜人乳腺组织标本；（2）经机械剪切、胶原酶和透明质酸酶联合消化，制备乳腺组织细胞悬液；(3) 通过低速及差速离心使不同细胞组分分层、分离；（4）经多次离心、洗涤及贴壁培养进行纯化，得到乳腺组织的的不同细胞组分，分别为上皮细胞、基质细胞和前脂肪细胞。本发明可快速、简便和有效地从同一乳腺组织中分离纯化不同细胞组分，所培养各乳腺细胞数量充足、细胞活力和纯度达95％以上。可为乳腺及乳腺癌相关分子生物学研究提供非常有用的材料以及为乳腺微环境多细胞培养模型的构建奠定了基础。

Description

一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法

技术领域

本发明涉及一种组织细胞分离培养方法，具体涉及一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，属于细胞生物学及生物技术领域。

背景技术

乳腺癌是一种通常发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，是女性最常见的肿瘤之一，严重影响着妇女身心健康甚至危及生命。据WHO资料统计，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%，全世界每年大约有120万女性罹患乳腺癌，50万人死于该病。

肿瘤的发生发展是一个多因素参与的复杂的过程。在正常状态下，上皮组织内部的动态平衡由上皮细胞与其微环境之间动态的相互作用来维持。微环境是肿瘤在其发生发展过程中所处的内环境，是一个复杂的综合系统，由肿瘤细胞本身和在肿瘤细胞周围区域中与之相互作用的非肿瘤细胞和基质细胞等组成，包括各种基质细胞、前脂肪细胞、脂肪细胞以及一些血管细胞等多种细胞类型。一方面，这些细胞可以被肿瘤细胞诱导，促使其产生大量的细胞生长因子、趋化因子以及一些蛋白酶等，从而促进肿瘤细胞的增殖和侵袭；另一方面，一些基质细胞本身也可通过释放各种细胞外基质蛋白、生长因子、趋化因子、细胞因子、激素等到微环境介质中来影响肿瘤上皮细胞的行为。机体内的肿瘤细胞与微环境中的其他细胞存在所谓的“交叉对话”，错综复杂，其结果可能促进或抑制肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化及转移。然而以往的研究中大部分的细胞模型都是采用孤立的单一的细胞种类，没有考虑到与肿瘤细胞相连的其他细胞种类组成的微环境的影响。

女性乳腺是一个复杂的器官，成体乳腺组织包括许多种细胞类型，有乳腺上皮细胞、基质细胞、脂肪细胞、神经细胞、淋巴细胞等等。随着对乳腺组织的不断深入研究，发现基质细胞、脂肪细胞等细胞组分与肿瘤上皮细胞的相互作用在肿瘤的生长过程中具有重要作用。但以往对乳腺癌的研究采用的细胞模型大多只是针对乳腺癌上皮细胞，其他乳腺组织中其他细胞组分对乳腺癌的发生发展的影响研究较少，其原因之一是目前乳腺组织细胞的分离和培养多是针对单一细胞类型进行，未见对同一乳腺组织中的其他细胞组分进行分离和培养，大大限制了对乳腺癌细胞微环境多层细胞模型的构建和研究。

发明内容

本发明的目的是克服上述缺陷，提供一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，该方法简便有效，特别是针对以手术切除获得的人乳腺组织来进行的人乳腺组织中不同细胞组分的分离培养方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，以新鲜乳腺组织为材料，经机械剪切、胶原酶和透明质酸酶联合消化、差速离心、洗涤、贴壁培养纯化，分离培养人乳腺组织中的上皮细胞、基质细胞以及前脂肪细胞，包括以下步骤：

（1）取乳腺组织小块，剔除乳腺组织中的血块、血管及纤维组织，浸泡于75%的酒精中消毒30s，然后用DMEM/F12（1:1）培养液清洗三次，并将其剪碎，置于培养皿中，加入相当于乳腺组织量5-10倍体积的消化培养液（DMEM/F12（1:1）基础培养液中包含1.05mM CaCl₂, 5% BSA, 10ng/mL霍乱毒素，6000-6300 U/mL 胶原蛋白酶和80-110 U/mL 透明质酸酶），置于恒温恒湿培养箱中（5% CO₂，95% 空气，37℃），摇床80转/min，过夜消化12-17h；用不含血清的DMEM/F12溶液将消化液稀释1-2倍，反复轻轻吹打分散组织，经低速离心后吸出上层脂肪层，并去上清液，重复操作1-2次，将大部分脂肪去除后，加入DMEM/F12溶液分散即得乳腺组织细胞悬液；

（2）将所得乳腺组织细胞悬液转移至离心管进行第一次低速离心（500-800 rpm，5-10min），离心后可分为较明显的上、中和下三层，用移液管小心将其分别转移至不同的无菌试管中，分别用于进一步分离纯化前脂肪细胞、基质细胞和上皮细胞；

（3）以上各试管中分别加入无酚红无血清DMEM/F12（1:1）培养液，内含双抗（100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素）和 0.25 g/mL两性霉素B），用移液管上下吹吸，混匀，然后室温下进行第二次低速离心（1000-1200 rpm, 5-8min），弃去上清，底层沉淀为细胞团，再加入和上面相同的培养液，混匀，同样条件离心，如此分别反复操作3-5次，以去除杂质和其他种类细胞；

（4）将步骤（3）反复洗涤沉淀获得的细胞小球中分别加入三种类型细胞各自的生长培养液，吸打均匀成细胞悬液；调整细胞密度为1×10⁵/cm²，接种培养瓶中，置于培养箱中37℃恒温培养，贴壁后，换液除去死亡及未贴壁细胞，继续培养，分别培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的3种乳腺细胞；

（5）细胞的纯化：采用反复贴壁法，将步骤(4)得到的3种乳腺细胞分别经过滤、计数调整细胞密度至5×10⁴ /ml，种植在细胞培养瓶中，置37℃，5% CO₂培养箱培养；待细胞铺至板底80%时，再依次重复1-2次，分别得到预纯化的三种乳腺细胞；去除培养基，并用DMEM/F12液冲洗，随后加入EDTA-胰酶混合消化液消化细胞，至倒置显微镜下观察80-90%细胞回缩时终止，加入生长培养液，分别得到纯化的3种乳腺细胞；

（6）乳腺细胞的传代培养：将步骤(5)纯化后的各细胞组分分别离心（1000 rpm， 5 min），并用培养液洗涤细胞2-3遍，去掉上清，用培养液重新悬浮细胞，以5×10⁴ /ml的密度植入培养瓶中置37℃，5% CO₂培养箱培养，2-3天更换培养液，一般可传5～9代；

（7）三种乳腺细胞的生长培养液分别为：

a. 上皮细胞培养液：低钙无酚红DMEM/F12（1:1）（0.04 mM CaCl₂），含5ug/ml氢化可的松、5 μg/mL 胰岛素、200ng/ml霍乱毒素（CTX）、20 ng/mL表皮细胞生长因子（EGF），双抗（100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素）和 0.25 g/mL两性霉素B，加Chelex-100树脂处理过的10% 胎牛血清；

b.前脂肪细胞培养液：高钙无酚红DMEM/F12（1:1）（1.05 mM CaCl₂），含双抗（100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素），加10 % 胎牛血清；

c.基质细胞培养液：高钙无酚红DMEM/F12（1:1）（1.05 mM CaCl₂），含双抗（100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素）和5 μg/mL 胰岛素，加5 % 胎牛血清。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

（1）本发明的分离培养方法中，采用胶原酶和透明质酸酶联合消化、低速及差速离心、多次洗涤、贴壁培养纯化等相结合方法，并对各条件进行了优化，能从同一乳腺组织中分离培养不同的乳腺组织细胞成分；

（2）本发明建立的人乳腺组织不同细胞组分的分离培养方法简便易行，所获细胞活力和纯度达95％以上，可为相关研究提供较好的细胞模型。

附图说明

图1 从人乳腺组织中分离原代细胞的流程；

图2 原代培养人乳腺上皮细胞（A）、基质细胞（B）和前脂肪细胞（C）的形态 (×100)；

图3 原代培养人乳腺上皮细胞免疫荧光鉴定（1300X）. A．乳腺上皮细胞核（DAPI染色），荧光显微镜下呈蓝色；B. 同一视野下的乳腺上皮细胞Cytokeratin在细胞质中的表达，荧光显微镜下呈红色；C. 是A和B的叠加；

图4 原代培养人乳腺基质细胞免疫荧光鉴定（430X）. A．乳腺基质细胞核（DAPI染色），荧光显微镜下呈蓝色；B. 同一视野下的乳腺上皮细胞Vimentin在细胞质中的表达，荧光显微镜下呈红色；C. 是A和B的叠加；

图5 人乳腺前脂肪细胞的鉴定（200 X）.A. 分化后形成的脂肪滴; B. 脂肪细胞油红-O染色。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

乳腺组织不同细胞组分的分离培养过程如下：

（1）取材：取自肿瘤医院肿瘤切除手术（患者女性，48岁）的新鲜乳腺癌组织。

（2）分离培养步骤：将乳腺癌组织置于无酚红的DMEM/F12（1:1）培养液中，4℃保藏并于当天运至实验室。在无菌室中用外科手术剪刀剔除乳腺组织中的血块、血管及纤维组织，浸泡于75%的酒精中消毒30s，然后用DMEM/F12（1:1）培养液清洗三次，并将其剪碎，置于培养皿中，加入相当于乳腺组织量5-10倍体积的消化培养液（DMEM/F12（1:1）基础培养液中包含1.05mM CaCl₂, 5% BSA, 10ng/mL霍乱毒素，6000-6300 U/mL 胶原蛋白酶和80-110 U/mL 透明质酸酶），置于恒温恒湿培养箱中（5% CO₂，95% 空气，37℃），摇床80转/min，过夜消化12-17h；用不含血清的DMEM/F12溶液将消化液稀释1-2倍，反复轻轻吹打分散组织，经低速离心后吸出上层脂肪层，并去上清液，重复操作1-2次，将大部分脂肪去除后，加入DMEM/F12溶液分散即得乳腺组织细胞悬液；将所得乳腺组织细胞悬液转移至离心管进行第一次低速离心（800 rpm，5min），离心后可分为较明显的上、中和下三层，用移液管小心将其分别转移至不同的无菌试管中，分别用于进一步分离纯化前脂肪细胞、基质细胞和上皮细胞；以上各试管中分别加入无酚红无血清DMEM/F12（1:1）培养液，内含双抗（100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素）和 0.25 g/mL两性霉素B），用移液管上下吹吸，混匀，然后室温下进行第二次低速离心（1000-1200 rpm, 5-8min）。弃去上清，底层沉淀为细胞团，再加入和上面相同的培养液，混匀，同样条件离心，如此分别反复操作4次，以去除杂质和其他种类细胞；将以上反复洗涤沉淀获得的细胞小球中分别加入三种类型细胞各自的生长培养液，吸打均匀成细胞悬液。调整细胞密度为1×10⁵/cm²，接种培养瓶中，置于培养箱中37℃恒温培养，贴壁后，换液除去死亡及未贴壁细胞，继续培养。分别培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的3种乳腺细胞；

（3）细胞的纯化：采用反复贴壁法，将步骤(2)得到的3种乳腺细胞分别经过滤、计数调整细胞密度至5×10⁴ /ml，种植在细胞培养瓶中，置37℃，5% CO₂培养箱培养；待细胞铺至板底80%时，再依次重复1-2次，分别得到预纯化的三种乳腺细胞；去除培养基，并用DMEM/F12液冲洗，随后加入EDTA-胰酶混合消化液消化细胞，至倒置显微镜下观察80-90%细胞回缩时终止，加入生长培养液，分别得到纯化的3种乳腺细胞；

（4）乳腺细胞的传代培养：将步骤(3)纯化后的各细胞组分分别离心（1000 rpm， 5 min），并用培养液洗涤细胞2-3遍，去掉上清，用培养液重新悬浮细胞，以5×10⁴/ml的密度植入培养瓶中置37℃，5% CO₂培养箱培养，2-3天更换培养液，一般可传5～9代；

（5）三种乳腺细胞的生长培养液分别为：

c.基质细胞培养液：高钙无酚红DMEM/F12（1:1）（1.05 mM CaCl₂），含双抗（100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素）和5 μg/mL 胰岛素，加5 % 胎牛血清；

（6）形态观察及鉴定

每天用倒置显微镜直接观察贴壁的活细胞生长情况，并拍照。

采用细胞角蛋白（Cytokeratin）及波形蛋白(Vimentin)抗体分别对原代培养人乳腺上皮细胞及基质细胞进行免疫染色。操作按照说明书进行。一抗波形蛋白抗体的工作浓度为1:100，细胞角蛋白抗体的工作浓度为1:200。二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG，工作浓度为1:200，随后用DAPI染色液进行显色。观察鉴定分离培养的乳腺上皮细胞和基质细胞，同时判断其纯化程度。人乳腺前脂肪细胞采用成脂诱导分化进行鉴定，油红-O染色，在倒置显微镜下观察出现明显脂肪滴的细胞为分化阳性细胞，通过成脂情况判断细胞纯度。

Claims

1.一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：以新鲜乳腺组织为材料，经机械剪切、胶原酶和透明质酸酶联合消化、差速离心、洗涤、贴壁培养纯化，分离培养人乳腺组织中的上皮细胞、基质细胞以及前脂肪细胞；具体步骤如下：

（1）乳腺组织细胞悬液制备：取乳腺组织小块，剔除乳腺组织中的血块、血管及纤维组织，浸泡于75%的酒精中消毒30s，然后用培养液清洗三次，并将其剪碎，置于培养皿中，加入相当于乳腺组织量5-10倍体积的消化培养液，置于恒温恒湿培养箱中，摇床80转/min，过夜消化12-17h；用不含血清的DMEM/F12：1:1溶液将消化液稀释1-2倍，反复轻轻吹打分散组织，经低速离心后吸出上层脂肪层，并去上清液，重复操作1-2次，将大部分脂肪去除后，加入DMEM/F12：1:1溶液分散即得乳腺组织细胞悬液；

（2）将所得乳腺组织细胞悬液转移至离心管进行第一次低速离心，离心后细胞悬液可分为较明显的上、中、下三层，用移液管小心将这三层液体分别转移至三个不同的无菌试管中，用于进一步分离纯化前脂肪细胞、基质细胞和上皮细胞；

（3）以上各试管中分别加入无酚红无血清DMEM/F12：1:1培养液，用移液管上下吹吸，混匀，然后室温下进行第二次低速离心，弃去上清，底层沉淀为细胞团，再加入和上面相同的培养液，混匀，同样条件离心，如此分别反复操作3-5次，以去除杂质和其他种类细胞；

（4）将步骤（3）反复洗涤沉淀获得的细胞团中分别加入三种类型细胞各自的生长培养液，吸打均匀成细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁵/cm²，分别接种培养瓶中，置于培养箱中37℃恒温培养，贴壁后，换液除去死亡及未贴壁细胞，继续培养，分别培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的3种乳腺细胞；

（5）细胞的纯化：采用反复贴壁法，将步骤(4)得到的3种乳腺细胞分别经过滤、计数调整细胞密度至5×10⁴/ml，种植在细胞培养瓶中，置37℃，5% CO₂培养箱培养；待细胞铺至板底80%时，再依次重复1-2次，分别得到预纯化的三种乳腺细胞；去除培养基，并用DMEM/F12液冲洗，随后加入EDTA-胰酶混合消化液消化细胞，至倒置显微镜下观察80-90%细胞回缩时终止，加入生长培养液，分别得到纯化的3种乳腺细胞；

（6）乳腺细胞的传代培养：将步骤(5)纯化后的各细胞组分分别离心，并用培养液洗涤细胞2-3遍，去掉上清，用培养液重新悬浮细胞，以5×10⁴ /ml的密度植入培养瓶中置37℃，5% CO₂培养箱培养，2-3天更换培养液，一般可传5～9代。

2.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：步骤（1）所述的消化培养液为： DMEM/F12：1:1作为基础培养液，基础培养液中还包含1.05mM CaCl₂， 5% BSA, 10ng/mL霍乱毒素，6000-6300 U/mL 胶原蛋白酶和80-110 U/mL透明质酸酶。

3.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：步骤（1）所述的恒温恒湿培养箱的温度为条件37℃，培养箱的气体为5% CO₂和95%空气。

4.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：步骤（2）所述的低速离心为500-800 rpm离心5-10min。

5.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：步骤（3）所述的DMEM/F12培养液，内含双抗：100U/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素和0.25 g/mL两性霉素B。

6.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：步骤（3）所述的第二次低速离心为1000-1200 rpm离心5-8min。

7.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：步骤（6）所述的离心为1000 rpm离心5 min。

8.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：步骤（4）所述的三种乳腺细胞的生长培养液分别为：

a. 上皮细胞培养液：低钙无酚红DMEM∶F12（1:1），0.04 mM CaCl₂、含5ug/ml氢化可的松、5 μg/mL 胰岛素、200ng/ml霍乱毒素CTX、20 ng/mL表皮细胞生长因子EGF、双抗：100U/ml 青霉素和100ug/ml 链霉素、 0.25 g/mL两性霉素B，加Chelex-100树脂处理过的10% 胎牛血清；

b.前脂肪细胞培养液：高钙无酚红DMEM∶F12=1:1，1.05 mM CaCl₂、含双抗：100U/ml 青霉素和100ug/ml 链霉素，加10 % 胎牛血清；

c.基质细胞培养液：高钙无酚红DMEM∶F12=1:1，1.05 mM CaCl₂、含双抗：100U/ml 青霉素和100ug/ml 链霉素、5 μg/mL 胰岛素，加5 % 胎牛血清。

9.根据权利要求1所述的一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法，其特征在于：所述新鲜乳腺组织包括正常乳腺组织和乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织，取自乳腺肿瘤切除术、乳房成形术、乳腺增生区段切除术临床上手术切除的人体乳腺组织。