CN112481216A - 一种人诱导多能干细胞及其培养方法和用途 - Google Patents

一种人诱导多能干细胞及其培养方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种人诱导多能干细胞及其培养方法和用途。本发明提供的技术方案带来的有益效果至少包括：使糖尿病患者减少或停止注射胰岛素；增强糖尿病患者的身体健康；有效预防并修复糖尿病患者的并发症。

Description

一种人诱导多能干细胞及其培养方法和用途
技术领域
本发明属于干细胞培养领域，具体涉及一种人诱导多能干细胞及其培养方法和用途。
背景技术
自从胰岛素被发现以来，就被用于日常注射来治疗胰岛素缺乏型糖尿病。但是，随着症状的加重，外源性胰岛素的给药需要加强，剂量越来越大，单纯使用胰岛素不能将血糖维持在狭窄的生理范围内，因为胰岛素注射无法精确模拟胰岛β细胞来调节胰岛素分泌以应对血糖水平的变化。目前，现有的糖尿病治疗方法在预防糖尿病并发症进展和修复现有组织损伤方面效果有限。
发明内容
为了获得能够在体外培养产生胰岛素的胰岛素分泌细胞，本发明提供了一种人诱导多能干细胞及其培养方法和用途，该细胞能够从人多能脂肪干细胞中培养出产生胰岛素的人诱导多能干细胞从而实现体外胰岛素分泌，用于治疗胰岛素缺乏型糖尿病，而且该人诱导多能干细胞能够替代并修复糖尿病并发症中损伤死亡的功能细胞，起到治疗及预防糖尿病并发症的作用。
为实现上述目的，本发明的一个目的在于提供一种人诱导多能干细胞，所述人诱导多能干细胞转染有人雌激素相关受体γ基因(human estrogen-related receptorγgene，ERRγ)和/或人胰岛素基因(human insulin gene,INS)。
本发明的另一目的在于提供一种制备人诱导多能干细胞的方法，所述方法包括：使用人雌激素相关受体γ基因和/或人胰岛素基因对人多能脂肪干细胞进行转染处理，得到人诱导多能干细胞。
作为本发明的一个实施例，所述人多能脂肪干细胞为脂肪间充质干细胞或分泌胰岛素的间充质干细胞中的至少一种。
作为本发明的一个实施例，所述人多能脂肪干细胞的提取方法如下：
S1：通过胶原酶时间梯度消化法分离提取出原代脂肪间充质干细胞；
S2：将所述原代脂肪间充质干细胞通过贴壁法用培养基筛选出脂肪间充质干细胞；
S3：通过单克隆培养法培养多代所述脂肪间充质干细胞，筛选得到所述人多能脂肪干细胞。
作为本发明的一个实施例，所述转染处理为慢病毒转染处理。
作为本发明的一个实施例，所述慢病毒转染处理包括：慢病毒载体的克隆构建、慢病毒载体DNA的纯化、慢病毒载体的生产包装以及慢病毒载体的感染。
作为本发明的一个实施例，步骤S1中，所述胶原酶时间梯度为18-22min。
作为本发明的一个实施例，步骤S2中，所述培养基为间充质干细胞无异种成分培养基(StemPro MSC SFM XenoFree)；以所述培养基为基准，干细胞因子(STem CellFacTor,SCF)的浓度为10ng/mL，非必需氨基酸(Non-Essential Amino Acids,NEAA)的含量为1体积％，胰岛素-转铁蛋白-硒(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)的含量为1体积％。
本发明的再一目的是提供一种用于治疗糖尿病的药物，该药物含有上述人多能干细胞。
本发明的再一目的是提供上述人多能干细胞在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
本发明提供的技术方案带来的有益效果至少包括：使糖尿病患者减少或停止注射胰岛素；增强糖尿病患者的身体健康；有效预防并修复糖尿病患者的并发症。
附图说明
图1为本发明实施例中倒置相差显微镜下的干细胞形态；
图2为本发明实施例中人脂肪干细胞的CD44表型；
图3为本发明实施例中人脂肪干细胞的CD34表型；
图4为本发明实施例中人脂肪干细胞诱导前染色照片；
图5为本发明实施例中人脂肪干细胞诱导后染色照片；
图6为本发明应用例中静脉血F-Glu的变化；
图7为本发明应用例中静脉血F-INS的变化；
图8为本发明应用例中静脉血F-C-P变化；
图9为本发明应用例中静脉血HbA1c变化。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
【实施例1】脂肪干细胞的提取及培养
(1)单个核细胞的分离提取
1)将5～10mL的脂肪组织静置8～12min后分层，移除下层红细胞聚集区的液体；
2)用添加有抗生素的磷酸盐缓冲液30～40ml重悬脂肪组织，1200～1800r/min离心3～7min洗涤上述去除红细胞后的脂肪组织一次；
3)用质量浓度为0.05～0.15％的Ⅰ型胶原酶悬浮上述洗涤后的脂肪组织，其中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为1.5:1～2.5:1，混匀后置于37℃水浴中消化，开始计时，并每隔1～3分钟摇匀该悬液；
4)上述消化18～22min后，加磷酸盐缓冲液15～30ml稀释，1400～1600r/min离心3～7min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(3),消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1300～1700r/min离心4～8min，弃上清液，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
5)将步骤4)中第二次消化的脂肪组织于消化后13～17min，加磷酸盐缓冲液20～30ml稀释，1400～1600r/min离心3～7min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(3)，消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1300～1700r/min离心4～8min，弃上清液，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
6)将步骤5)中第三次消化的脂肪组织于消化后8～12min，加磷酸缓充液20～30ml稀释，1400～1600r/min离心5～7min，倒掉上层脂肪油滴和液体，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1400～1600r/min离心5～7min，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
7)将步骤3)、5)和6)中收集的细胞悬液汇合，1400～1600r/min离心4～6min；弃上清液，加入完全培养基吹打均匀，台盼蓝染色，用计数板计数后，按1×105/mL的密度接种于25cm2培养瓶中，在37℃、5％CO2、95％湿度条件下培养；
8)每批细胞培养基须独立分装，各自独立使用，标记清楚培养基配制时间、培养细胞编号，以避免交叉污染；培养瓶上需清晰标记细胞的编码、细胞供体姓名、细胞分离提取时间、细胞代数，整个细胞培养过程都需标记细胞的编码、细胞供体姓名、细胞分离提取时间、细胞代数及细胞处理时间(换液、传代等)。
(2)干细胞的筛选及纯化
用干细胞特异培养体系培养上述非均一性单个核细胞，通过单克隆挑选得到高活力脂肪间充质干细胞。
干细胞特异培养体系为所述培养基为间充质干细胞无异种成分培养基，并且以该培养基为基准，干细胞因子的含量为10ng/mL，非必需氨基酸的含量为1体积％，胰岛素-转铁蛋白-硒的含量为1体积％。
1)原代细胞培养48小时后全换液。72(3d)小时后2/3换液，如果血细胞较多需全换液。以后根据细胞增殖情况2-3天半换液。并取培养过程中的细胞培养基进行细菌、真菌检测。
2)细胞传代：细胞融合度达到90％后按高比例(1:6-1:8)传代，细胞接近单克隆的密度接种，细胞成集落增殖，细胞集落达到90％的融合度后继续传代，以此筛选适合脂肪间充质干细胞特异培养体系的高活力脂肪间充质干细胞。细胞传代时间必须按集落细胞密集度达到90％为基准。
(3)干细胞的定性鉴定
1)干细胞的形态特征
倒置相差显微镜下观察培养的细胞呈梭形的成纤维细胞样，局部呈漩涡状，符合脂肪间充质干细胞的形态特征。如下图1所示。
2)干细胞的表型检测
用免疫荧光法检测以上得到的梭形细胞的表面标志的表达，细胞用藻红蛋白(P-phycoerythrin,PE)CD44和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyante,FITC)CD34标记后进行流式检测，流式细胞仪为BD FACScanto(购自Becton Dickinson公司)。结果表明，这种梭形细胞表达间充质干细胞的表面标志CD44(如下图2所示)，不表达造血干细胞的表面标志CD34(如下图3所示)，符合脂肪间充质干细胞的表型。
3)干细胞的多向分化潜能
a)干细胞向脂肪细胞分化及油红染色检测：
细胞传至第3代时将其以2*107/L的细胞数分别转入成脂诱导培养基中进行培养.诱导培养后不同时间段，对成脂诱导组进行油红O脂肪颗粒染色。成脂诱导培养基包含：基础培养基DMEM，10％胎牛血清、0.5mM异丁基-1-甲基黄原酮(isobulyl-1-methyl×anthione，IBMX)、0.1mM消炎痛、1uM地塞米松。在第6天、第12天和第16天分别进行油红O染色。结果显示：培养12天可见到；油红O染色发现培养中约60-80％细胞富含脂肪滴(下图1所示)。说明干细胞亚群可在体外诱导分化成脂肪细胞。
b)干细胞向成骨细胞分化及茜素红染色检测：
取培养后传至第3代的人干细胞，其诱导前染色照片如图4所示，培养在6孔板，待细胞长到90％左右时换用成骨诱导液培养，诱导液的成分包含：基础培养基DMEM，10％胎牛血清、10Mmβ-磷酸甘油、0.1mM抗坏血酸磷酸盐Vc、0.1uM地塞米松。每三天换液，培养3周，于2周、3周分别进行茜素红染色观察。结果显示：成骨诱导培养中细胞形态由原来的梭形变成了立方形，随着细胞生长密度的增长形成多层的结节结构，而对照中细胞仍是梭形且呈单层生长；2周之后已有矿化结节形成了，3周后结节比较多，染色比较明显(下图5所示)。说明干细胞亚群可在体外诱导分化为成骨细胞。
(4)脂肪干细胞中致病病毒的检测
将第3代脂肪干细胞培养基送至KingMed Diagnostics公司进行HIV、HBV、HCV、EBV和CMV污染检测，细胞培养物中所有病原体均为阴性。
1)急性毒性试验。采用尾静脉注射脂肪间充质干细胞悬液(ref)对KM小鼠LD50进行检测。将60km小鼠分为5个剂量组和空白对照组，每组10只。剂量分别为1.25×108个、2.50×108个、5.00×108个、l.00×109个、2.00×109个细胞，空白对照组采用细胞培养基。尾静脉注射细胞悬液或细胞培养基。在本实验条件下，脂肪间充质干细胞悬液对KM小鼠的LD50测定为2.30×l08/kg，95％可信区间为1.80×l08～2.94×l08/kg。
2)BALB/c裸鼠致瘤性试验。实验分为阳性、脂肪源性间充质干细胞组和空白对照组，每组16只雄性小鼠。在脂肪间充质干细胞组中，每只小鼠皮下注射1×107个细胞进入肋骨区，每只小鼠注射2×106个HeLa细胞作为阳性对照，空白对照组仅注射生理盐水。分别于第3天、1个月、3个月和6个月重复注射。肉眼观察和组织学检查显示，脂肪间充质干细胞组和空白组动物注射部位未见瘤样增生病理改变，阳性对照组所有动物均有大小不等的肿瘤形成。
3)免疫毒性试验评价全身过敏反应。将18只雄性DH豚鼠分为3组，每组6只，包括阴性对照组、阳性对照组和a细胞治疗组。脂肪间充质干细胞组，每只豚鼠在第1天、第3天和第5天分别腹腔注射5×106细胞进行免疫增敏，第14天静脉注射1×107细胞。
在实验条件下，细胞治疗组80％的动物出现咳嗽、气短等全身活动性过敏反应，阳性对照组100％动物均给予白蛋白5mg生理盐水注射，致过敏性休克死亡。
4)脂肪间充质干细胞悬液溶血试验。取15ml兔血，用玻璃珠在玻璃血管内旋转去除纤维蛋白原，用0.9％氯化钠溶液洗涤细胞，红细胞浓度调整为2％(vol/vol)。将高达5×106脂肪源性间充质干细胞加入含有2.5ml 2％兔红细胞的试管中，在37℃下培养4小时。经测定，脂肪源性间充质干细胞悬浮液不会引起红细胞溶血和凝血。
5)琼脂间充质干细胞软琼脂集落形成试验。将1％琼脂糖在42-45℃下与等量的含20％新生犊牛血清的2×细胞培养基混合，使琼脂糖的最终浓度达到0.5％，然后加入细胞培养基中。将0.7％琼脂糖在42℃条件下与等量的脂肪间充质干细胞混合在含有20％新生犊牛血清的2×细胞培养基中，最终细胞浓度分别为15000、7500、3000、1500、750和150个细胞/孔；将混合物加入下层琼脂糖上形成顶层。以每孔5000个hela细胞为阳性对照，空白对照为琼脂糖和细胞培养基混合液。培养21d后用0.2％结晶紫染色，显微镜下计数细胞克隆数。在实验条件下，脂肪间充质干细胞无致瘤倾向。
【实施例2】慢病毒载体的构建、生产和感染
以pWPI/hPLKWT/Neo(Addgene质粒#35385)为载体，构建了临床水平的第三代pWPI/INS和pWPI/ERRγ慢病毒载体，制备了pWPI/INS和pWPI/ERRγ慢病毒载体，并将其感染到直接生成的人多能干细胞脂肪间充质干细胞细胞中。
转染ERRγ载体(包括pWPI/INS和pWPI/ERRγ慢病毒感染)后24小时检测脂肪干细胞的胰岛素分泌转染72h后胰岛素分泌达到高峰，DTZ染色和胰岛素荧光免疫化学染色显示细胞呈棕红色，
用pWPI/ERRγ慢病毒或pWPI/INS慢病毒感染dgHPCs细胞，2天后检测细胞培养上清液中胰岛素的含量。pWPI/ERRγ慢病毒感染的dgHPCs(dgHPCs+ERRγ)(direct-generated human pluripotent stem cells,人多能干细胞)上清液中胰岛素浓度为30.84μIU/ml，而pWPI/INS慢病毒感染的dgHPSCs(dgHPSCs+INS+INS)上清液中胰岛素浓度为11.61μIU/ml，pWPI/INS+ERRγ感染的dgHPSCs(dgHPSCs+INS+ERRγ)上清液中胰岛素浓度为84.47μIU/ml，远远高于dgHPSCs+INS细胞或dgHPSCs+ERRγ细胞。因此，人多能干细胞过表达ERRγ可以在多能干细胞状态下高效合成和分泌人胰岛素，不需要分化为β样细胞，另外，人胰岛素和ERRγ基因的共表达可以协同进一步促进人胰岛素在dgHPSCs中的合成和分泌细胞。细胞培养上清液中分泌的胰岛素通过Kingmed Diagnostics公司的电化学发光法进行测试。
【应用例】
将pWPI/ERRγ慢病毒单独转染的dgHPSCs+ERRγ细胞或pWPI/ERRγ慢病毒共转染的dgHPSCs+INS+ERRγ细胞经静脉移植到糖尿病患者体内，每次移植3.5×107～1.0×108细胞，移植间隔时间不同；2018年1月20日至2018年6月30日，共进行了14次移植(表1)，未注射胰岛素。
从2018年1月20日开始，进行第一次干细胞移植，停止每日胰岛素注射。如图6所示，患者的F-Glu(快速葡萄糖)从7mmol/L(2018年1月20日前注射胰岛素时)增加到2018年1月20日的9.46mmol/L(2018年1月20日停止胰岛素日注射)。随着干细胞移植的持续进行，患者的F-Glu和HbA1c开始下降，即使在2018年3月20日至7月27日这段时间内，患者没有适当控制饮食，F-Glu水平和HbA1c值也逐渐下降；当患者后来开始节食时，2018年10月22日，他的F-Glu水平和HbA1c值显著下降(表2，图6、图7和图9)，接近表2所示的正常范围，HbA1c为6.58％，F-Glu为7.03mmol/L。这些结果表明，干细胞dgHPSCs+ERRγ和dgHPSCs+INS+ERRγ的移植可能替代每日注射的外源胰岛素。
在总共14次移植后，患者的F-INS从59.88pmol/L增加到69.27pmol/L，F-C-P(快速C肽)从0.584nmol/L增加到0.890nmol/L，然后增加到1.060nmol/L(表2，图8)。这些结果表明，胰岛β细胞分泌更多的胰岛素和C肽，可以改善胰岛β细胞的功能。
表1人干细胞移植时间表
时间 细胞类型 慢病毒含量(ml) 细胞数量
01-20-2018 dgHPSCs+ERRγ 50 8.1×10<sup>7</sup>
01-24-2018 dgHPSCs+ERRγ 50 1.4×10<sup>8</sup>
01-29-2018 dgHPSCs+ERRγ 50 9.36×10<sup>7</sup>
02-02-2018 dgHPSCs+ERRγ 50 1.53×10<sup>8</sup>
02-05-2018 dgHPSCs+ERRγ 50 1.12×10<sup>8</sup>
03-19-2018 dgHPSCs+INS+ERRγ 50+50 7.5×10<sup>7</sup>
03-26-2018 dgHPSCs+INS+ERRγ 50+50 3.49×10<sup>7</sup>
03-31-2018 dgHPSCs+INS+ERRγ 50+50 6.8×10<sup>7</sup>
05-31-2018 dgHPSCs+INS+ERRγ 50+50 6.3×10<sup>7</sup>
06-06-2018 dgHPSCs+INS+ERRγ 50+50 6.03×10<sup>7</sup>
06-12-2018 dgHPSCs+INS+ERRγ 50+50 6.75×10<sup>7</sup>
06-18-2018 dgHPSCs+INS+ERRγ 50+50 9.99×10<sup>7</sup>
06-24-2018 dgHPSCs+INS+ERRγ 50+50 7.2×10<sup>7</sup>
06-30-2018 dgHPSCs+INS+ERRγ 50+50 4.5×10<sup>7</sup>
表2静脉血F-C-P，F-INS，F-Glu和HbA1c水平
Figure BDA0002767009700000091
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人诱导多能干细胞，其特征在于，所述人诱导多能干细胞转染有人雌激素相关受体γ基因和/或人胰岛素基因。
2.一种培养权利要求1所述的人诱导多能干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：使用人雌激素相关受体γ基因和/或人胰岛素基因对人多能脂肪干细胞进行转染处理，得到所述人诱导多能干细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述人多能脂肪干细胞为脂肪间充质干细胞或分泌胰岛素的间充质干细胞中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述人多能脂肪干细胞的提取方法如下：
S1：通过胶原酶时间梯度消化法分离提取出原代脂肪间充质干细胞；
S2：将所述原代脂肪间充质干细胞通过贴壁法用培养基筛选出脂肪间充质干细胞；
S3：通过单克隆培养法培养多代所述脂肪间充质干细胞，筛选得到所述人多能脂肪干细胞。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述转染处理为慢病毒转染处理。
6.根据权利要求2所述的方法，其中，所述慢病毒转染处理包括：慢病毒载体的克隆构建、慢病毒载体DNA的纯化、慢病毒载体的生产包装以及慢病毒载体的感染。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤S1中，所述胶原酶时间梯度为18-22min。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤S2中，所述培养基为间充质干细胞无异种成分培养基；以所述培养基为基准，干细胞因子的浓度为10ng/mL，非必需氨基酸的含量为1体积％，胰岛素-转铁蛋白-硒的含量为1体积％。
9.一种用于治疗糖尿病的药物，该药物含有权利要求1所述的人多能干细胞或采用权利要求2～8中任意一项所述的方法培养得到的所述人多能干细胞。
10.权利要求1所述的人多能干细胞或采用权利要求2～8中任意一项所述的方法得到的所述人多能干细胞在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
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