CN115125196A - 一种脂肪干细胞成脂诱导分化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种脂肪干细胞成脂诱导分化方法，它包括以下步骤：1）取新鲜脂肪组织，2）剪碎组织，3）消化组织，4）分离出脂肪干细胞层，5）培养皿中进行培养，6）脂肪组织诱导，7）更换培养基，8）维持培养基两天换液一次，持续10‑14天后取出细胞，经过油红o染色鉴定，成功诱导脂肪干细胞变为脂肪细胞。本发明使用较少的诱导剂，不存在试剂污染，并且能缩短诱导周期，加快实验进程，更好满足实验需求。

Description

一种脂肪干细胞成脂诱导分化方法
技术领域：
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体地说就是一种脂肪干细胞成脂诱导分化方法。
背景技术：
脂肪组织主要由脂肪细胞组成，对保持能量和代谢平衡非常重要。脂肪组织有两种，一种为白色脂肪组织（WAT），主要分布在皮下和内脏，内脏白色脂肪与肥胖、病理验证和胰岛素抵抗相关，皮下白色脂肪则可提高葡萄糖耐受性；另一种为棕色脂肪组织（BAT），主要呈离散状分布在脊椎旁、锁骨和肾上腺，功能是产热。这两种脂肪组织有相同的分化特征，都是由间充质干细胞分化而来，大量实验已经证实人体脂肪组织中含有脂肪干细胞并得到验证。
现有技术中多是采用胶原酶消化法提取人脂肪干细胞后需进行成脂诱导分化，以鉴别是否成功提取脂肪干细胞。目前公认的干细胞成脂诱导实验采用的均是化学试剂诱导方法，诱导方法单一，涉及到的诱导剂有：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松、吲哚美辛、罗格列酮、甲状腺激素等，诱导周期在两周左右。
此化学诱导方法存在诱导周期长、使用诱导试剂过多、诱导试剂存在潜在污染等问题，常导致脂肪干细胞诱导成脂效果不理想。
发明内容：
本发明就是为克服现有技术中的不足，提供一种脂肪干细胞成脂诱导分化方法。
本申请提供以下技术方案：
一种脂肪干细胞成脂诱导分化方法，其特征在于：它包括以下步骤：步骤1）取新鲜脂肪组织：放入培养皿中，再使用Hanks缓冲液清洗脂肪组织，剔除血管及纤维组织，仅留黄色的脂肪团块，再用Hanks液清洗至无明显血迹；
步骤2）剪碎组织：将完成步骤1）的脂肪组织放入一个新的培养皿中，将脂肪组织剪碎，每片组织大小为1mm3，整体呈稀糊状；
步骤3）消化组织：将一部分剪碎组织放入50毫升的离心管中，而后再加入I型胶原酶配置液，将恒温水浴箱中反复振荡以充分消化组织，得到脂肪消化液；
步骤4）分离出脂肪干细胞层：将脂肪消化液进行离心，可见脂肪组织分离为3层，底部沉淀为脂肪干细胞层；
步骤5）培养皿中进行培养：取沉淀加入红细胞裂解液进行裂解，裂解完成后再次离心弃上清，根据沉淀大小加入适量培养基，混匀后用滤网过滤，收集滤液于培养皿中进行培养；
步骤6）脂肪组织诱导：当脂肪干细胞铺满培养皿后，弃去步骤5）中的旧培养基，将脂肪干细胞分入新的培养皿中，而后用PBS清洗，在培养皿中加入新鲜培养基及0.1g新鲜脂肪组织，诱导三天期间不换液；
步骤7）更换培养基：弃去步骤6）中的旧培养基，丢弃用PBS清洗后加入脂肪细胞维持培养基，维持培养基为：胎牛血清10mL +青霉素链霉素混合液0.5mL+胰岛素50μL，使用DMEM/F12培养基补足至50mL；
步骤8）维持培养基两天换液一次，持续 10-14天后取出细胞，经过油红o染色鉴定，成功诱导脂肪干细胞变为脂肪细胞。
在上述技术方案的基础上，还可以有以下进一步的技术方案：
所述步骤3）中I型胶原酶配置液为称取I型胶原酶0.25g, 加入100ml Hanks液，充分混匀，0.2μm的滤器无菌过滤，分装于15ml离心管中，每管10ml，置于-20℃保存，每次I型胶原酶配置液添量为10ml。
所述步骤3）中恒温水浴箱温度为37℃，反复振荡一小时。
在所述步骤5）中的培养基为：DMEM/F12培养基500mL + 胎牛血清55mL + 青霉素链霉素混合液5.5mL，胎牛血清浓度为10%，青链霉素混合液为100X。
所述步骤7）中所述维持培养基中胎牛血清浓度为20%、青链霉素混合液为100X、胰岛素浓度为10 mg/mL。
发明优点：
本发明使用较少的诱导剂，不存在试剂污染，并且能缩短诱导周期，加快实验进程，更好满足实验需求。
附图说明：
图1是采用本方法将脂肪干细胞成脂诱导后的影像图；
图2是采用常规的化学诱导后的影像图；
图3是采用本发法但在步骤6中没有加入新鲜脂肪组织诱导后的影像图。
具体实施方式：
一种脂肪干细胞成脂诱导分化方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤1）取新鲜脂肪组织：放入培养皿中，使用Hanks缓冲液清洗脂肪组织，剔除血管及纤维组织，仅留黄色的脂肪团块，再次用Hanks液清洗至无明显血迹。
步骤2）剪碎组织：将完成步骤1）的脂肪组织放入一个新的培养皿中，使用眼科剪将脂肪组织剪碎，每片组织大小为1mm3，整体呈稀糊状；
步骤3）消化组织：将10毫升稀糊状的脂肪组织放入50毫升的离心管中，而后再加入配置好的I型胶原酶配置液10ml。
I型胶原酶配置液的配置方法如下：称取I型胶原酶0.25g, 加入100ml Hanks液，充分混匀，0.2μm的滤器无菌过滤，分装于15ml离心管中，每管10ml，置于-20℃保存。而后将离心管置于37℃恒温水浴箱中反复振荡一小时，以便充分消化组织，得到脂肪消化液。
步骤4）分离出脂肪干细胞层：将脂肪消化液进行离心，可见脂肪组织分离为3层，底部沉淀为脂肪干细胞层；
步骤5）培养皿中进行培养：取沉淀加入红细胞裂解液进行裂解，裂解完成后再次离心弃上清，根据沉淀大小加入适量培养基，混匀后用滤网过滤，收集滤液于培养皿中进行培养。该步骤中使用的培养基为DMEM/F12培养基500mL + 胎牛血清55mL + 青霉素链霉素混合液5.5mL，胎牛血清浓度为10%，青链霉素混合液为100X。
步骤6）脂肪组织诱导：当脂肪干细胞铺满培养皿后，弃去步骤5）中的旧培养基。为了对本发明提供的脂肪干细胞成脂诱导分化方法与对照组进行比较，因此将脂肪干细胞分入到三个新的培养皿中，分别为第一、二、三培养皿。
而后用PBS缓冲液对三个培养皿中的脂肪干细胞进行清洗，而后再在第一培养皿中加入新鲜培养基及0.1g新鲜脂肪组织，在第二培养皿中加入诱导剂和培养基形成化学诱导培养基，第三培养皿中不加任何物质，诱导三天期间不换液。
所述的化学诱导培养基为胎牛血清10mL +青霉素链霉素混合液0.5mL+胰岛素50μL+罗格列酮50μL +地塞米松50μL + 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤50μL，使用DMEM/F12培养基补足至50mL，其中胎牛血清浓度为20%、青链霉素为100X、胰岛素为10 mg/mL、罗格列酮为10mmol/L、地塞米松为1mmol/L、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤为0.2mol/L。
步骤7）更换培养基：三天后弃去旧培养基，用PBS缓冲液对三个培养皿中清洗后，在三个培养皿中加入脂肪细胞维持培养基，维持培养基为：胎牛血清10mL +青霉素链霉素混合液0.5mL+胰岛素50μL，使用DMEM/F12培养基补足至50mL。这其中胎牛血清浓度为20%、青链霉素混合液为100X、胰岛素浓度为10 mg/mL。
步骤8）维持培养基两天换液一次，持续 12天后取出细胞，经过油红o染色鉴定。
如图1-3所示，第三培养皿中脂肪干细胞几乎没有变为脂肪细胞，而第二和第一培养皿中均成功诱导脂肪干细胞变为脂肪细胞，但第一培养皿的效果明显大于第二培养皿的情况。可见，本发明提供的技术方案与现有技术中的常规化学诱导相比拥有显著的进步。

Claims (5)

1.一种脂肪干细胞成脂诱导分化方法，其特征在于：它包括以下步骤：步骤1）取新鲜脂肪组织：放入培养皿中，再使用Hanks缓冲液清洗脂肪组织，剔除血管及纤维组织，仅留黄色的脂肪团块，再用Hanks液清洗至无明显血迹；
步骤2）剪碎组织：将完成步骤1）的脂肪组织放入一个新的培养皿中，将脂肪组织剪碎，每片组织大小为1mm3，整体呈稀糊状；
步骤3）消化组织：将一部分剪碎组织放入50毫升的离心管中，而后再加入I型胶原酶配置液，将恒温水浴箱中反复振荡以充分消化组织，得到脂肪消化液；
步骤4）分离出脂肪干细胞层：将脂肪消化液进行离心，可见脂肪组织分离为3层，底部沉淀为脂肪干细胞层；
步骤5）培养皿中进行培养：取沉淀加入红细胞裂解液进行裂解，裂解完成后再次离心弃上清，根据沉淀大小加入适量培养基，混匀后用滤网过滤，收集滤液于培养皿中进行培养；
步骤6）脂肪组织诱导：当脂肪干细胞铺满培养皿后，弃去步骤5）中的旧培养基，将脂肪干细胞分入新的培养皿中，而后用PBS清洗，在培养皿中加入新鲜培养基及0.1g新鲜脂肪组织，诱导三天期间不换液；
步骤7）更换培养基：弃去步骤6）中的旧培养基，丢弃用PBS清洗后加入脂肪细胞维持培养基，维持培养基为：胎牛血清10mL +青霉素链霉素混合液0.5mL+胰岛素50μL，使用DMEM/F12培养基补足至50mL；
步骤8）维持培养基两天换液一次，持续 10-14天后取出细胞，经过油红o染色鉴定，成功诱导脂肪干细胞变为脂肪细胞。
2.根据权利要求1中所述的一种脂肪干细胞成脂诱导分化方法，其特征在于：所述步骤3）中I型胶原酶配置液为称取I型胶原酶0.25g, 加入100ml Hanks液，充分混匀，0.2μm的滤器无菌过滤，分装于15ml离心管中，每管10ml，置于-20℃保存，每次I型胶原酶配置液添量为10ml。
3.根据权利要求1中所述的一种脂肪干细胞成脂诱导分化方法，其特征在于：所述步骤3）中恒温水浴箱温度为37℃，反复振荡一小时。
4.根据权利要求1中所述的一种脂肪干细胞成脂诱导分化方法，其特征在于：在所述步骤5）中的培养基为：DMEM/F12培养基500mL + 胎牛血清55mL + 青霉素链霉素混合液5.5mL，胎牛血清浓度为10%，青链霉素混合液为100X。
5.根据权利要求1中所述的一种脂肪干细胞成脂诱导分化方法，其特征在于：所述步骤7）中所述维持培养基中胎牛血清浓度为20%、青链霉素混合液为100X、胰岛素浓度为10 mg/mL。
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