CN104263697B

CN104263697B - 一种诱导培养基及诱导人脂肪间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞的方法

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Publication number: CN104263697B
Application number: CN201410475810.2A
Authority: CN
Inventors: 胡振波
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-09-18
Filing date: 2014-09-18
Publication date: 2017-08-04
Anticipated expiration: 2034-09-18
Also published as: CN104263697A

Abstract

本发明公开了一种诱导培养基，包括溶剂DMEM‑高糖培养基、血小板、全反式维甲酸、激活素A、胰高血糖素样肽I、成纤维细胞生长因子、β细胞素、胰岛素样生长因子、烟酰胺、多肽、五肽胃泌素和巯基乙醇；采用物理震荡、胶原酶和胰酶双重消化法，从人脂肪组织中高效分离脂肪间充质干细胞；并将这些脂肪间充质干细胞培养增殖传代，然后使用诱导培养基诱导脂肪间充质干细胞成为胰岛素分泌细胞，能使40%以上的脂肪干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。

Description

一种诱导培养基及诱导人脂肪间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种诱导培养基，具体地说，涉及一种诱导培养基及诱导人脂肪间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞的方法，属于医学技术领域。

背景技术

我国目前糖尿病的患病率已超过12%。全世界有约2亿人患有轻重程度不等的糖尿病。糖尿病的发病机制主要是由于胰岛分泌细胞的损伤、功能障碍或机体免疫功能异常而导致胰岛素的分泌绝对或相对不足，从而使血糖升高，进而引起全身各脏器损伤，出现各种并发症。临床治疗通常是采用皮下注射胰岛素的方法来降低血糖，而对于I型及部分II型糖尿病的患者来说，这种治疗方法效果并不理想，因为其易使病人对胰岛素产生依赖性和耐药性，且难以阻止糖尿病并发症的发生及发展。胰岛移植虽然可以解决根本问题，但并不能避免免疫排斥反应，而且供源缺乏不易实施。因此，取自患者自体的干细胞经诱导分化成胰岛素分泌细胞才是治疗糖尿病最为理想和有效的治疗方法，它既可以修复体内损伤的胰岛素分泌细胞，又可以避免疫排斥反应和相关并发症，达到治疗糖尿病的效果，近些年来其已成为医学界关注的重点。因此研发新的胰岛素分泌细胞的来源也就成为了问题的关键所在。

根据干细胞发育阶段的不同，可将其分为胚胎干细胞和成体干细胞，胚胎干细胞具有全能性，它能够分化为体内几乎所有的组织和器官，早在2000年Reubinoft等就用胚胎干细胞诱导分化出造血细胞、神经细胞以及心肌细胞等多种细胞。但是胚胎干细胞因来源有限，且无法避免伦理学、法律、道德等问题，同时有报道称胚胎干细胞具有致瘤性，因此胚胎干细胞在临床上的应用受到了限制。近年来许多研究表明成体干细胞也保持着向多种组织细胞分化的潜能，如间充质干细胞可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元等，成体干细胞来源丰富，是目前研究的重点。近年来脂肪间充质干细胞的研究取得了一些突破性的进展，已有多项研究表明其能分化为心肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等。因其来源充足，而且可以变废为宝，故有着良好的应用前景。

如申请号为200980117365.X（以下称对比文件），申请人为SMT.G.R.多斯及SMT.KM玛塔肾病研究所及研究中心，名称为用于治疗糖尿病的源自人脂肪组织的胰岛素生产性间充质干细胞的专利，公开了一种用于从人脂肪组织中分离和分化胰岛素生产性间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：a)将脂肪组织切成碎末，b)向上述组织中加入1型胶原酶，c)将由上获得的内含物置于培养器里的摇动器上，d)将步骤c获得的全部内含物离心，e)将离心后得到的上清液和沉淀物分别在含有“无异种材料的”增殖培养基的培养皿中在37℃和CO₂气氛中培养约10天，所述增殖培养基由高葡萄糖DMEM(Dulbeccos改进的Eagles培养基)、人白蛋白、成纤维细胞生长因子、(FGF)、丙酮酸钠缓冲剂、抗生素和抗真菌剂组成，f)更新培养基但不进行连续传代，g)在9-10天结束时通过胰酶消化收集上述细胞，h)检查所收集细胞的活力、无菌性、细胞计数以及CD45阴性、CD90/CD73阳性细胞的流式细胞术分析，i)使用分化培养基使所有细胞分化成胰岛素表达细胞，所述分化培养基由DMEM-高葡萄糖、DMEM F12、烟酰胺、活化素A、Exendin 4、五肽胃泌素、HGF、h)B27、N2、血清添加物、抗生素和抗真菌剂组成，j)在至少3天后，使用常规技术分离步骤(i)的细胞，而后进行Pax-6、Isl-1、Ipf-1/pdx-1、C-肽、胰岛素的测量、无菌性和活力测定。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下不足：应用脐带间充质干细胞诱导生成胰岛素分泌细胞，因为间充质干细胞属异体细胞，有一定的抗原性，输给糖尿病病人后可能会产生免疫排斥反应，且间充质干细胞在体内的生存期较短，诱导胰岛素分泌细胞的效率也不理想。

申请号为200980117365.X的发明技术采用单一胶原酶消化法分离人脂肪间充干细胞。其诱导脂肪干细胞分化为胰岛素分泌细胞所用诱导因子包括烟酰胺、活化素A、Exendin 4、五肽胃泌素、HGF，其所获干细胞数量较低，诱导脂肪干细胞向胰岛素分泌细胞产生的阳性细胞率较低，诱导效果不理想。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种诱导培养基，克服现有培养基在诱导脂肪干细胞分化为胰岛素分泌细胞中诱导效果不理想的缺陷。采用本发明的诱导培养基，可以更有效地诱导脂肪干细胞分化为胰岛素分泌细胞。

本发明的第二个目的是提供一种分离人脂肪间充质干细胞方法，克服了现有分离方法细胞产率低的不足，本发明采用物理震荡，加胶原酶和胰酶双重消化法，可从人脂肪组织中高效分离脂肪间充质干细胞，细胞产率可达3.0*10⁶干细胞/ml脂肪组织。

本发明的第三个目的是提供一种诱导人脂肪间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞的方法，诱导分化的效果更好，能使40%以上的脂肪干细胞分化为胰岛素分泌细胞。

为了解决以上问题，本发明采用的技术方案如下：一种诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基包括溶剂DMEM-高糖培养基（DMEM-high glucose）和以下成份：

血小板溶液、全反式维甲酸（All-Trans Retinoic Acid）、激活素A（Activin A）、胰高血糖素样肽I（GLP-1, Glucagon-like peptide I）、成纤维细胞生长因子(FGF,Fibroblast growth factor）、β细胞素(β-cellulin)、胰岛素样生长因子（Insulin-likegrowth factor (IGF1)）、烟酰胺（Nicotinamide）、多肽（Exendin 4）、五肽胃泌素（Pentagastrin）和巯基乙醇（β-mercaptoethanol）。

一种优化方案，所述血小板的浓度为5-10%；

全反式维甲酸（All-Trans Retinoic Acid）的浓度为0.5-1.0µM；

激活素A（Activin A）的浓度为10-30ng/ml；

胰高血糖素样肽I（GLP-1, Glucagon-like peptide I）的浓度为200-600ng/ml；

成纤维细胞生长因子(FGF, Fibroblast growth factor）的浓度为10-50ng/ml；

β细胞素(β-cellulin) 的浓度为10-50ng/ml；

胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor (IGF1)）的浓度为10-40ng/ml；

烟酰胺（Nicotinamide）的浓度为0.5-1.0mg/ml；

多肽（Exendin 4）的浓度为0.5-2.0µg/ml；

五肽胃泌素（Pentagastrin）的浓度为5.0-30.0ng/ml；

巯基乙醇（β-mercaptoethanol）的浓度为0.1-0.2mM。

进一步地，所述血小板的浓度为5%；

全反式维甲酸（All-Trans Retinoic Acid）的浓度为1µM；

激活素A（Activin A）的浓度为10ng/ml；

胰高血糖素样肽I（GLP-1, Glucagon-like peptide I）的浓度为200ng/ml；

成纤维细胞生长因子(FGF, Fibroblast growth factor）的浓度为10ng/ml；

β细胞素(β-cellulin) 的浓度为10ng/ml；

胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor (IGF1)）的浓度为10ng/ml；

烟酰胺（Nicotinamide）的浓度为1mg/ml；

多肽（Exendin 4）的浓度为0.5µg/ml；

五肽胃泌素（Pentagastrin）的浓度为10ng/ml；

巯基乙醇（β-mercaptoethanol）的浓度为0.1mM。采用该诱导培养基，能使40%以上的脂肪干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。

基于以上诱导培养基，一种诱导人脂肪间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于，所述方法为：

采用物理震荡、胶原酶和胰酶双重消化法，从人脂肪组织中高效分离脂肪间充质干细胞；并将这些脂肪间充质干细胞培养增殖传代，然后使用诱导培养基诱导脂肪间充质干细胞成为胰岛素分泌细胞。

一种优化方案，所述方法包括人脂肪间充质干细胞的分离、培养步骤：

（1）采集糖尿病患者脂肪组织，移入离心管中，加入浓度0.25%胰蛋白酶和浓度0.1％胶原酶的混合液；

（2）应用旋涡振荡器，将以上脂肪组织悬液以1500rpm，震荡60秒钟；

（3）在37^oC恒温摇床中振荡消化60分钟，将所得下层液体移入含完全培养基的离心管中终止消化，完全培养基包括浓度10%胎牛血清与高糖DMEM培养基；

（4）在剩余脂肪中再次加入浓度0.25%胰蛋白酶和浓度0.1％胶原酶的混合液，重复步骤（3）继续消化60分钟，重复1次，将经消化的脂肪悬液离心，去除悬浮上清，得沉淀的脂肪间充质干细胞；

（5）在沉淀的脂肪干细胞中加入含浓度10%胎牛血清和高糖DMEM培养基重悬细胞，移入第一T75培养瓶中，37^oC、5% CO₂培养箱孵育，48h后半量换液2次，其后每3-5天换液一次去除未贴壁的细胞；

（6）当培养的细胞占满80％培养瓶底面积时，用浓度0.25%胰酶加0.04% EDTA消化传代，浓度0.25%胰酶和0.04% EDTA的体积比为1:1，使人脂肪间充质干细胞得以增殖传代。

采用以上分离人脂肪间充质干细胞方法，细胞产率可达3.0*10⁶干细胞/ml脂肪组织。

进一步地，所述方法包括人脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞诱导步骤：

（1）取第3-4代处于对数期生长的脂肪间充质干细胞，置于尖底离心管中，离心，弃上清，得沉淀脂肪干细胞并重悬于诱导培养基中，将所得脂肪干细胞的细胞密度调整为5x10⁵个细胞/ml诱导培养基；

（2）将所得人脂肪间充质干细胞悬液接种到第二T75培养瓶中；

（3）将第二T75培养瓶置于CO₂孵育箱中，37^oC培养；

（4）每隔3-4天更换诱导培养基1次，连续培养14天；

（5）弃掉第二T75培养瓶内诱导培养基上清，然后用PBS将贴壁细胞洗一次，弃上清；

加入0.25%胰蛋白酶置37^oC消化5-10分钟；

当贴壁细胞与培养瓶表面脱离后，加入PBS稀释；将细胞收集于尖底离心管中；

离心；弃上清得到诱导的胰岛素分泌细胞。

以上方法能使40%以上的脂肪干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。

进一步地，所述步骤（1）、步骤（4）混合液中浓度0.25%胰蛋白酶和浓度0.1％胶原酶的体积比为1:1。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：应用胰蛋白酶和胶原酶双重消化法对脂肪组织进行消化，外加物理震荡方法，可获得高达每毫升脂肪3x10⁶的脂肪间充质干细胞量；采用DMEM高糖培养基，以5%的人血小板溶液提供细胞生长因子的来源。以1uM的全反式维甲酸为主导的多种细胞生长因子组成的诱导培养基，诱导脂肪间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞，能使40%以上的脂肪干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。

从人脂肪组织中分离脂肪间充质干细胞，并在体外培养诱导为能分泌胰岛素的细胞。该发明在于探索出一套能诱导脂肪间充质干细胞向分泌胰岛素的细胞分化的培养条件和所需生长因子。采集糖尿病人自体脂肪间充质干细胞进行诱导，诱导的胰岛素分泌细胞用于病人自体不产生免疫排斥反应，也不涉及伦理问题。

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明不限于以下列举的特定例子。

实施例1，一种诱导人脂肪间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞的方法，包括以下步骤：

人脂肪间充质干细胞的分离、培养

（1）采集糖尿病患者脂肪组织100ml，用眼科剪尽量剪破脂肪组织中肉眼可见的细小血管，冲洗血液后剪碎脂肪组织，移入离心管中，加入浓度0.25%胰蛋白酶和浓度0.1％胶原酶的混合液，混合液中浓度0.25%胰蛋白酶和浓度0.1％胶原酶的体积比为1:1，混合液的用量为脂肪组织的体积的两倍；

（3）在37^oC恒温摇床中振荡消化1小时，液面分为三层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体，将下层液体吸出后移入含完全培养基的离心管中终止消化，完全培养基包括浓度10%胎牛血清与高糖DMEM；

（4）在剩余脂肪，即步骤（2）中所得上层+中层的脂肪细胞中再次加入浓度0.25%胰蛋白酶和浓度0.1％胶原酶的混合液，混合液中浓度0.25%胰蛋白酶和浓度0.1％胶原酶的体积比为1:1；

混合液的用量为脂肪组织的体积的两倍，重复步骤（2）继续消化，重复1次，将经消化的液体1500rpm离心10min，去除悬浮的脂肪细胞和脂滴，去上清，得沉淀的脂肪干细胞；

（5）在沉淀的脂肪干细胞中加入含浓度10%胎牛血清的高糖DMEM培养基重悬细胞，移入第一T75培养瓶中，37^oC、5% CO₂培养箱孵育，48h后连续半量换液2次，其后每3-5天换液一次去除未贴壁的细胞；

当培养的细胞占满80％培养瓶底面积时，用浓度0.25%胰酶加0.04% EDTA消化传代，浓度0.25%胰酶和0.04% EDTA的体积比为1:1，得到含人脂肪间充质干细胞的培养物，约3.0*10⁶干细胞/ml脂肪组织。

人脂肪间充质干细胞表面标志鉴定：

应用流式细胞术检测细胞表面标志以对其进行鉴定，取第3-4代稳定增殖细胞，此时细胞处于对数生长期，使用0.25%胰蛋白酶消化收集，10⁶个细胞悬浮在100ul含1%血清白蛋白的PBS中，依次加入下列鼠抗人单克隆抗体：FITC-CD13，FITC-CD29，FITC-CD34，FITC-CD44，FITC-CD73，PE-CD90，PE-CD105和FITC-HLA-DR，在4^oC标记20min，PBS洗1次，使用FACSCaliper流式细胞仪检测，分析确定是人脂肪间充质干细胞。

以上标志鉴定步骤是验证性的，即用来验证按照人脂肪间充质干细胞的分离、培养步骤是可行的，以后只要按照分离、培养步骤进行即可，可以不再进行。

人脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞诱导：

（1）在超净工作台内，取经过流式细胞进行表面标志鉴定的第3-4代处于对数期生长的脂肪间充质干细胞，置于尖底离心管中，离心300g，10分钟，弃上清，得沉淀脂肪干细胞细胞，将所得沉淀脂肪干细胞重悬于诱导培养基中，将所得脂肪干细胞的细胞密度调整为5x10⁵个细胞/ml。

（2）用10ml吸管，将所得人脂肪间充质干细胞悬液10ml接种到第二T75培养瓶中；

（3）在第二T75培养瓶右侧面上用记号笔标明脂肪间充质干细胞份号和诱导培养日期，将培养瓶置于CO₂孵育箱中，37^oC培养；

（4）诱导培养到第3-4天，如果细胞生长快，培养基颜色变黄，则更换诱导培养基；

（5）把第二T75培养瓶中已经变黄的培养基吸出弃入废液缸中，再用一支新的10ml移液管在培养瓶中加入10ml/瓶的新鲜诱导培养基；

（6）盖好换过液的第二T75培养瓶瓶盖，用记号笔在第二T75培养瓶上标明换液日期，把第二T75培养瓶放回原来的CO₂孵育箱继续培养；

（7）每3-4天换液一次，培养10-14天；

（8）将盛有诱导的胰岛素分泌细胞的第二T75培养瓶置于超净工作台内，弃掉诱导培养基上清，然后用5ml PBS将贴壁细胞洗一次，弃上清；加入0.25%胰蛋白酶置37^oC消化5-10分钟；倒置显微镜下观察到贴壁细胞与培养瓶表面脱离后，加入10ml PBS稀释；并用10ml吸管将细胞收集于50ml尖底离心管中；每4瓶T75培养瓶的细胞合并于1支50ml尖底离心管中；以300g离心10分钟；弃上清得到诱导的胰岛素分泌细胞。将诱导产生的胰岛素分泌细胞冻存于液氮中，日后可用于糖尿病病人的回输治疗。

诱导培养基含有以下成分：

DMEM-高糖培养基（DMEM-high glucose）；

浓度5-10%的血小板溶液；

浓度0.5-1.0uM的全反式维甲酸（All-Trans Retinoic Acid）；

浓度10-30ng/ml的激活素A（Activin A）；

浓度200-600ng/ml的胰高血糖素样肽I（GLP-1, Glucagon-like peptide I）；

浓度10-50ng/ml的成纤维细胞生长因子(FGF, Fibroblast growth factor）；

浓度10-50ng/ml的β细胞素(β-cellulin)；

浓度10-40ng/ml的胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor (IGF1)）；

浓度0.5-1.0mg/ml的烟酰胺（Nicotinamide）；

浓度0.5-2.0µg/ml的多肽（Exendin 4）；

浓度5.0-30.0ng/ml的五肽胃泌素（Pentagastrin）；

浓度0.1-0.2mM的巯基乙醇（β-mercaptoethanol）；

经试验，诱导培养基采用以下成分及配比的情况下，脂肪干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的效果为最佳：

血小板的浓度为5%；

全反式维甲酸（All-Trans Retinoic Acid）的浓度为1µM；

激活素A（Activin A）的浓度为10ng/ml；

β细胞素(β-cellulin) 的浓度为10ng/ml；

烟酰胺（Nicotinamide）的浓度为1mg/ml；

多肽（Exendin 4）的浓度为0.5µg/ml；

五肽胃泌素（Pentagastrin）的浓度为10ng/ml；

巯基乙醇（β-mercaptoethanol）的浓度为0.1mM。

在诱导人脂肪干细胞向胰岛素分泌细胞分化的过程中，传统的培养基没有诱导分化的作用；采用200980117365.X的培养基，则诱导脂肪干细胞向胰岛素分泌细胞产生的阳性细胞率较低。采用以上诱导培养基，能使40%以上的脂肪干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞，应用这些细胞，将提高对糖尿病患者的治疗效果。

以上成分均为市场上有售的现有产品。

试验：采用双硫腙（DTZ）染色对步骤2诱导所得胰岛素分泌细胞进行鉴定:将50mgDTZ溶于5ml二甲基亚砜中，混匀，过滤除菌，得DTZ染色液，备用；在细胞诱导10天后进行DTZ染色，染色时，取1ml诱导的细胞加到12孔培养板中，加入10ul DTZ染色液，于37度培养箱中培养20分钟，吸取染色孔内的少许细胞，PBS洗涤2次，显微镜下观察、拍照，胰岛素分泌细胞呈棕色。

如图1所示，对人脂肪间充质干细胞进行诱导培养，14天后，所诱导的脂肪间充质干细胞分化形成β细胞小簇，并具有胰岛素分泌能力。图1a，培养第四代的脂肪间充质干细胞。图1b，培养第四代的脂肪间充质干细胞经14天诱导，所诱导的脂肪间充质干细胞分化形成β细胞小簇。

如图2所示，用流式细胞术检测胰岛素阳性细胞百分率：取诱导第14天的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，PBS洗涤3次，离心，弃上清，用100ulPBS重悬细胞，分别加入10ulFITC标记的抗胰岛素抗体、C肽（C-Peptide）、Glut-1和PDX-1抗体（美国e-Bioscience公司生产），室温下避光孵育30分钟，流式细胞仪计数10⁵个细胞，阳性细胞率达40%。

可以看出，胰岛素（Insulin），C肽（C-Peptide），Glut-1和PDX-1

呈阳性。代表β细胞小簇具有胰岛素分泌功能。该诱导产生的胰岛素分泌细胞可用于临床糖尿病人的治疗。

以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基包括溶剂DMEM-高糖培养基（DMEM-high glucose）和：

血小板、全反式维甲酸（All-Trans Retinoic Acid）、激活素A（Activin A）、胰高血糖素样肽I（GLP-1, Glucagon-like peptide I）、成纤维细胞生长因子(FGF, Fibroblastgrowth factor）、β细胞素(β-cellulin)、胰岛素样生长因子（Insulin-like growthfactor (IGF1)）、烟酰胺（Nicotinamide）、Exendin 4、五肽胃泌素（Pentagastrin）和巯基乙醇（β-mercaptoethanol）；

所述诱导培养基中：血小板溶液的浓度为5%；

全反式维甲酸（All-Trans Retinoic Acid）的浓度为1μM；

激活素A（Activin A）的浓度为10ng/ml；

β细胞素(β-cellulin) 的浓度为10ng/ml；

烟酰胺（Nicotinamide）的浓度为1mg/ml；

Exendin 4的浓度为0.5μg/ml；

五肽胃泌素（Pentagastrin）的浓度为10ng/ml；

巯基乙醇（β-mercaptoethanol）的浓度为0.1mM。

2.一种利用权利要求1所述的诱导培养及诱导人脂肪间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于，所述方法为：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括人脂肪间充质干细胞的分离、培养步骤：

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括人脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞诱导步骤：

（3）将第二T75培养瓶置于CO₂孵育箱中，37^oC培养；

（4）每隔3-4天更换诱导培养基1次，连续培养14天；

加入0.25%胰蛋白酶置37^oC消化5-10分钟；

离心；弃上清得到诱导的胰岛素分泌细胞。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）、步骤（4）混合液中浓度0.25%胰蛋白酶和浓度0.1％胶原酶的体积比为1:1。