CN106554941A - 一种治疗脱发的脂肪间充质干细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗脱发的脂肪间充质干细胞，其由脂肪组织培养而来，培养成的脂肪间充质干细胞对脱发具有显著的疗效。

Description

一种治疗脱发的脂肪间充质干细胞

技术领域

本发明涉及一种治疗脂溢性脱发的脂肪间充质干细胞。

背景技术

脱发是一种很常见的人类疾病，而且在人群中有一定的发病率，其中病因和发病机制都尚未完全清楚。脱发不仅具有先天性遗传，而且后天也可能与内分泌、自身免疫、精神、感染等因素有关。然而脂溢性脱发又称作雄激素性脱发 （androgenic alopecia, AGA），是最常见的脱发原因之一，在男性群体中发生率很高，50%的男性在50 岁左右时会发生雄激素性脱发，并且随着年龄的不断增大发生几率上升至 70%。脂溢性脱发的主要特征是头发的生长期被大大的缩短，导致头发数量的不断减少，从而提前进入毛囊的微型化，使的毛囊转变成类毫毛毛囊，结果增加了休止期头发的大量脱落，提前终止了生长期从而进入了退化期。脂溢性脱发的发生主要与遗传因素和雄激素有关。人体分泌的雄激素主要为睾酮，睾酮在5α-还原酶的作用下转变为双氢睾酮，再与头皮部毛囊靶细胞内的雄激素受体结合，抑制毛乳头的生长发育，干扰毛囊细胞的生长代谢，使头发提前进入休止期，从而引起AGA。雄激素是影响毛囊发育的重要因素，雄激素改变与脂溢性脱发的原因有密切关系。

关于男性脱发治疗的策略目前已有很多人通过老鼠来做临床实验并且取得了很大成就。如中医治疗中的生发酊是临床研究研制而成的中药外用制剂，具有温肾通阳、养血生发之功，可应用于斑秃、脂溢性脱发等脱发疾病的治疗。徐春美研究报道显示的生发酊外擦对治疗本病有效，可是疗效不及斑秃。还有，中药复方-荣生汤的动物实验证实中药复方在治疗脱发性疾病方面有巨大的发展空间。中医中的针灸治疗有尹氏法，鲍氏法等方法，也取得了很大进步。目前西医治疗脱发的常用方法有：外用、局部注射及系统使用糖皮质激素，外用及系统使用免疫治疗、蒽林治疗、米诺地尔外用、光化学治疗等，其副作用较多。近年来对脱发的治疗方法研究较多，取得了一些可喜的成绩，有了新的进展，比如章光101治疗脱发取得了很大成就。但不少报道仍停留于一般疗效分析，对病因的探讨，药理作用的研究还应进一步深入。虽然中医治疗该病已经取得了很大成就，但是中医治理较慢，过程麻烦，疗效不甚显著。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种治疗脱发的脂肪间充质干细胞。

间充质干细胞（adipose derived stem cells,ADSCs）是来源于中胚层的一种成体的干细胞，最初是由Friedenstein等在骨髓中发现，其中广泛分布于肌肉、血管、胰腺和脂肪等各组织中，而且证实了可以在体外分化为成骨细胞和成脂细胞。脂肪来源的间充质干细胞是一类来自于脂肪组织的具有自我更新和分化潜能的干细胞。其中脂肪来源的间充质干细胞与其它干细胞相比，具有显著的优越性，它容易获取，对患者的痛苦小，并且在脂肪的抽吸术中可以获取的脂肪还可以达到变废为宝的目的。其次这种细胞在体外增殖较快，平均倍增的时间为16h/次，不必进行永生化就能获取足够的细胞进行移植。人来源的脂肪间充质干细胞能够进行自体移植，可以克服免疫排斥。因此有望成为脂肪组织工程和基因治疗的一种很好的细胞来源。因此，脂肪干细胞治疗脱发不仅来源广泛而且有很小的免疫排斥功能。

本发明通过小鼠的生理实验研究脂肪间充质干细胞对脂溢性脱发治疗的作用。通过给小鼠注射丙酸睾酮建立脂溢性脱发模型后，注射培养的脂肪间充质干细胞，来观察小鼠毛发的生长，毛囊细胞的增值和血管生成。证明脂肪干细胞可以有效促进毛囊细胞的增值，抑制细胞的凋亡，有效促进毛发的再生。

本发明提供的脂肪间充质干细胞，其制备包括脂肪间充质干细胞的获取分离，脂肪间充质干细胞的培养，脂肪间充质干细胞的传代，脂肪间充质干细胞注射浓度和注射量，脂溢性脱发雄性小鼠模型建立，脂溢性脱发小鼠治疗。

其具体技术方案如下：

（1）脂肪间充质干细胞的获取分离

取约500mg脂肪组织（自外科手术患者的皮下获取，患者已获知情权，并同意），然后用缓冲液PBS反复冲洗5遍，再向组织中加入胰酶，放入37°C恒温摇床，震荡消化；

（2脂肪间充质干细胞的培养

消化完成后，吸取下层的细胞加入生理盐水离心清洗两次，然后接种到培养瓶中培养；

（3）脂肪间充质干细胞的传代

脂肪间充质干细胞在培养瓶中长满后，消化传代；

（4）脂肪间充质干细胞注射浓度和注射量。脂肪间充质干细胞从培养瓶中消化下来，生理盐水离心清洗两遍，然后生理盐水重悬，制成细胞悬液，使浓度2×10⁶/ml，常规灭菌处理制备成待分装注射液；

（5）脂溢性脱发雄性小鼠模型建立

石蜡和松香1:1混合加热融化后，均匀涂于小鼠背部，涂抹面积约为2cm×2cm，待冷却凝固后揭去背部的毛发，然后给小鼠给小鼠注射配制好的丙酸睾酮（8.33mg/mL）0.05mL，隔天注射，两周，以背部涂抹处无毛光滑干净为成功标志。

（6）脂溢性脱发小鼠治疗。给脱发小鼠注射脂肪间充质干细胞悬液，采用局部皮下多点注射。注射总量200ul，隔天，共四次。

上述所述的脂肪间充质干细胞的获取分离还可以为：1)取约500mg脂肪组织（自外科手术患者的皮下获取），再将脂肪组织一次挤压进入准备好的15ml离心管中，每个离心管中的组织不超过5ml；2)吸取缓冲液PBS 7ml加入到上述装有组织的离心管中，用吸管吹打10~20次，然后静置1min左右，用吸管将组织下层的液体吸出。如此反复直到所吸出的液体呈透明状，不带有血细胞为止；3)向有脂肪组织的试管中加入与组织量相同大约5ml左右的消化液（胰酶0.25%，I型胶原酶0.1%，以1：1比例混合配制而成），将试管密封，放入37°C恒温摇床中，190r/min，震荡消化30min。

上述的脂肪间充质干细胞的培养还可以为：1）消化结束后此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体；2)吸出离心管中的下层液体移入含完全培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM）的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1500rpm离心10min；3）将收集到的有核细胞按照一定的密度接种到培养瓶中，放入37°C、5% CO2培养箱培养。

上述的脂肪间充质干细胞的传代还可以为：1)细胞在培养瓶中长到80%满时，在超净工作台内吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗2-3次，之后加入1-2mL消化液（0.25%胰酶和0.04% EDTA(v/v 1:1)）；2)培养箱内进行消化（0.5-3min），倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化；3) 用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞（动作要轻柔，注意不要产生气泡），使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；4)将单细胞悬液移至离心管中，离心，(1000rpm,5min)，弃上清，加入完全培养基，轻吹使之松散，按1:2传代培养。

本发明所用到的试剂或药学成分，如生理盐水、DMEM培养基、丙酸睾酮、胎牛血清（FBS）、酒精等，均是无菌、无热源的，均可适用于临床病人。

本发明的所有操作步骤，都是药典允许的常规操作方法，包括采用无菌操作、无菌生理盐水洗涤、灭菌、无菌细胞浓缩和纯化等，所应用的试剂或药学成分，如生理盐水、DMEM培养基、胎牛血清、丙酸睾酮等均是符合我国卫生机构的要求，操作完毕后做常规病毒、细胞检查及细菌、霉菌培养，只有合乎要求才能应用于临床。

本发明专利要求保护的细胞制备的方法和治疗手段的优点：

（1）该方案可简单快速获得大量的脂肪间充质干细胞。

（2）脂肪干细胞在人体内储量丰富，且目前的微创抽脂术技术成熟，无风险，可短时间获得大量细胞。

（3）采用自体的细胞治疗脱发，不会发生建议排斥反应。

（4）相较于传统的药物治疗手段，没有毒副作用，效果明显。

附图说明

图1小鼠脱发模型。

图2 正常饲喂小鼠背部毛发。

图3 对照组小鼠背部毛发。

图4 注射脂肪间充质干细胞治疗后小鼠背部毛发。

图5 正常小鼠皮肤组织H＆E染色。

图6 对照组小鼠皮肤组织H＆E染色。

图7 实验组小鼠皮肤组织H＆E染色。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1

（1）脂肪间充质干细胞的获取分离。取约500mg脂肪组织（自外科手术患者的皮下获取），再将脂肪组织一次挤压进入准备好的15ml离心管中，每个离心管中的组织不超过5ml；吸取缓冲液PBS 7ml加入到上述装有组织的离心管中，用吸管吹打10~20次，然后静置1min左右，用吸管将组织下层的液体吸出。如此反复直到所吸出的液体呈透明状，不带有血细胞为止；向有脂肪组织的试管中加入与组织量相同大约5ml左右的消化液（胰酶0.25%，I型胶原酶0.1%，以1：1比例混合配制而成），将试管密封，放入37°C恒温摇床中，190r/min，震荡消化30min。

（2脂肪间充质干细胞的培养。消化结束后此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体；2)吸出离心管中的下层液体移入含完全培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM）的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1500rpm离心10min；3）将收集到的有核细胞按照一定的密度接种到培养瓶中，放入37°C、5%CO₂培养箱培养。

（3）脂肪间充质干细胞的传代。细胞在培养瓶中长到80%满时，在超净工作台内吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗2-3次，之后加入1-2mL消化液（0.25%胰酶和0.04% EDTA(v/v 1:1)）；2)培养箱内进行消化（0.5-3min），倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化；3)用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞（动作要轻柔，注意不要产生气泡），使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；4) 将单细胞悬液移至离心管中，离心，(1000rpm,5min)，弃上清，加入完全培养基，轻吹使之松散，按1:2传代培养。

（4）脂肪间充质干细胞注射浓度和注射量。脂肪间充质干细胞从培养瓶中消化下来，生理盐水离心清洗两遍，然后生理盐水重悬，制成细胞悬液，浓度2×10⁶/ml。

（5）脂溢性脱发雄性小鼠模型建立。石蜡和松香1:1混合加热融化后，均匀涂于小鼠背部，涂抹面积约为2cm×2cm，待冷却凝固后揭去去掉背部的毛发，然后给小鼠给小鼠注射配制好的丙酸睾酮（8.33mg/mL）0.05mL，隔天注射，两周，以背部涂抹处无毛光滑干净为成功标志。

（6）脂溢性脱发小鼠治疗。小鼠放在超净工作台上，在注射前，用70％酒精棉球消毒，以左手的拇指、食指及中指将皮肤捏起，形成皱褶，右手将注射器针头刺入皮下，深约1.5~2cm，4位点注射0.05mL脂肪间充质干细胞溶液。注射完后，用酒精棉球轻按进针部位皮肤，拔出针头。

脂肪间充质干细胞治疗脱发的药理实验

脂肪组织来自于当地的医院整形科。首先，征得患者和其家属同意捐献脂肪组织后，查阅患者的所有检查报告，证实无任何的病毒、梅毒和血液有关的病毒感染，然后询问患者的家族病史、传染和感染病史。在确定一切正常后，采集脂肪组织，温度保持在4-10 ℃，在24小时内运送到实验室。

到实验室后将患者信息记录后，将脂肪小心的用镊子整体取出，平缓放置于无菌的50ml离心管中。

吸取缓冲液PBS 25ml加入到上述装有组织的50ml离心管中，用吸管吹打10~20次，然后静置1min左右，用吸管将组织下层的液体吸出。如此反复5次直到所吸出的液体呈透明状，不带有血细胞停止冲洗；然后用剪刀镊子剪取5g组织，并将其中的血管剥离，剪碎，剪碎的小碎块的大小在0.05g左右，将剪碎的组织块放置于50ml的离心管，向有脂肪组织的试管中加入大约25ml左右的消化液（0.25%胰酶和0.04% EDTA(v/v 1:1)），将试管密封，放入37°C恒温摇床中，190r/min，震荡消化30min。震荡消化的过程中，注意观察，保证所有的组织块，都浸润于消化酶中。

消化结束后，关闭摇床，讲离心管放置于无菌操作台中，此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体；吸出离心管中的下层液体移入含完全培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基）的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1200rpm离心10min；离心结束后，去掉上清液，敲打沉淀，然后加入培养基，重悬细胞，细胞的密度调整为1×106/ml，然后加入到培养瓶中，放入37°C、5% CO2培养箱培养。7)第一次换液：大约12-24小时后，观察细胞贴壁即可进行第一次换液，此后每隔3天换液。

细胞在培养瓶中长到80%满时，在超净工作台内吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS（提前预热37℃）冲洗2-3次，之后加入1mL消化液（0.25%胰酶和0.04% EDTA(v/v 1:1)）；培养箱内进行消化1min，倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化；用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞（动作要轻柔，注意不要产生气泡），使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；将单细胞悬液移至离心管中，离心，(1000rpm,5min)，离心结束后弃上清，加入完全培养基，轻吹使之松散，按1:2传代培养。

制备脂肪间充质干细胞注射液，在培养瓶中的细胞长到70%时候，在超净工作台内吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS（提前预热37℃）冲洗2-3次，之后加入1mL消化液（0.25%胰酶和0.04% EDTA(v/v 1:1)）；培养箱内进行消化1min，倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化；用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞，使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；将单细胞悬液移至离心管中，离心，(1000rpm,5min)，离心结束后弃上清后生理盐水重悬，制成细胞悬液，浓度2×106/ml。

取雄性健康的小白鼠30只，分为三组，正常组（不作处理），对照组（不注射脂肪间充质干细胞），实验组（注射脂肪间充质干细胞）。对照组和实验组用石蜡和松香1:1混合加热融化后，棉签均匀涂于小鼠背部，涂抹面积约为2cm×2cm，待冷却凝固后揭去去掉背部的毛发，然后给小鼠给小鼠注射配制好的丙酸睾酮（8.33mg/mL）0.05mL，每隔四天注射一次（对照组和实验组都注射），以背部涂抹处无毛光滑干净为成功标志。

治疗过程，将实验组小鼠放在超净工作台上，在注射前，用70％酒精棉球消毒，以左手的拇指、食指及中指将皮肤捏起，形成皱褶，右手将注射器针头刺入皮下，深约1.5~2cm，4位点注射0.05mL脂肪间充质干细胞溶液。注射完后，用酒精棉球轻按进针部位皮肤，拔出针头。间隔三天，注射四次。20天后观察小鼠的毛发生长状况和皮肤组织切片H＆E染色。其中，图1为小鼠脱发模型，是小鼠脂溢性脱发的模型造模成功的图片，背部光滑无毛。人为的造成脱发，然后注射睾酮，使该部位不再生长毛发，机制同脂溢性脱发相同；图2 正常饲喂小鼠背部毛发，正常饲喂小鼠背部毛发正常组的小鼠的背部毛发情况，毛发浓密；图3 对照组小鼠背部毛发，其注射睾酮，不做治疗，实验结束时小鼠的背部毛发生长，缓慢，基本上生长；图4 注射脂肪间充质干细胞治疗后小鼠背部毛发，注射脂肪间充质干细胞治疗后小鼠背部毛发，注射脂肪间充质干细胞后，脱发部位长出毛发，实验结束时，基本恢复正常。

从结果来看，直射脂肪间充质干细胞后小鼠脂溢性脱发小鼠明显正长出毛发。图5、图6和图7是由HE染色而成的，颜色较深的部位是细胞核，较密集的部位由很多细胞分化组成的毛囊。由图5和图6比较观察可看出：对照正常组的小鼠毛囊细胞较多，细胞核染色较深，说明大量的细胞处于细胞的分裂周期，小鼠的毛发生长旺盛。而图6观察可看处，细胞核较少，毛囊处于中空状态说明大量的细胞已经处于休止期，多数细胞已停止生长。由图5和图6可说明小鼠体内正常的雄激素含量可促进毛囊细胞的生长，而当外界注射大量的丙酸睾酮或体内分泌过多的雄性激素时，睾酮在5α-还原酶的作用下转变为双氢睾酮，再与头皮部毛囊靶细胞内的雄激素受体结合，抑制毛乳头的生长发育，干扰毛囊细胞的生长代谢，使头发提前进入休止期，导致脱发。由图7观察可看到毛囊周围细胞染色较深，细胞处于分裂期，促使毛囊的再生。大多数细胞都处在生长期，尤其是小鼠皮肤的表皮层处着色更深，说明脂肪间充质干细胞可促使皮肤里面的VEGF的增多，促使细胞毛囊的生长，更能证明脂肪间充质干细胞可以治疗脂溢性脱发。

脂肪间充质干细胞具有多分化功能的成体干细胞，它具有高度增殖分化及自我更新的能力，还具有分化内皮、神经等多种组织的潜能，并且还能分泌血管内皮生生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TGF-β）等细胞因子，刺激脂肪细胞和内皮细胞分化，其中VEGF、HGF是血管形成的重要细胞因子。脂肪间充质干细胞还具有促进细胞增殖、新血管的生成、抑制细胞凋亡等作用，有很强的促血管内皮细胞的有丝分裂，抑制细胞凋亡与组织重构，修复内皮损伤的作用。所以，脂肪间充质干细胞具有多分化功能，能促进局部血管的生成，促进血管微循环，极大地改善了被动脱发动物模型毛囊的周围环境，明显抑制了毛囊内细胞凋亡的数量。延长毛囊生长周期，促进毛发的生长。

Claims (3)

1.一种治疗脱发的脂肪间充质干细胞，其特征在于，由以下步骤制备而成：

（1）脂肪间充质干细胞的获取分离

取500mg脂肪组织，用PBS缓冲液反复冲洗5遍，再向组织中加入胰酶，放入37°C恒温摇床，震荡消化；

（2脂肪间充质干细胞的培养

消化完成后，吸取下层的细胞加入生理盐水离心清洗两次，然后接种到培养瓶中培养；

（3）脂肪间充质干细胞的传代

脂肪间充质干细胞在培养瓶中长满后，消化传代；

（4）脂肪间充质干细胞注射液制备

脂肪间充质干细胞从培养瓶中消化后，用生理盐水离心清洗两遍，后用生理盐水重悬，制成细胞悬液，使其浓度为2×10⁶/ml。

2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞，其特征在于，步骤（2）具体为：

1）消化结束后此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体；

2)吸出离心管中的下层液体移入含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1500rpm离心10min；

3）将收集到的有核细胞接种到培养瓶中，放入37°C、5% CO₂培养箱培养。

3.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞，其特征在于，步骤（3）的传代工艺为：1)细胞在培养瓶中长到80%满时，在超净工作台内吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗2-3次，之后加入1-2mL 体积比为1:1的0.25%胰酶和0.04% EDTA消化液；

2)培养箱内进行消化0.5-3min），倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化；

3)用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞，使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；

4)将单细胞悬液移至离心管中，离心，弃上清，加入完全培养基，轻吹使之松散，按1:2传代培养。