CN104622772A

CN104622772A - 一种含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品

Info

Publication number: CN104622772A
Application number: CN201510014835.7A
Authority: CN
Inventors: 陈镇洲; 黄启明
Original assignee: 陈镇洲
Current assignee: Guangzhou Sai Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2015-01-13
Filing date: 2015-01-13
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2035-01-13
Also published as: CN104622772B

Abstract

本发明提供了一种含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品的制备方法，其中，所述方法包括通过从自体外周血中获取富含血小板血浆和培养获得自体内皮祖细胞，将获取的自体内皮祖细胞加入到自体血浆中制备成生物美容制剂，自体血浆促使内皮祖细胞分化为内皮细胞形成血管。同时提供了由自体内皮祖细胞和自体血浆制备成医学美容产品，可用于皮肤暗斑、粉刺瘢痕以及烧伤、外伤引起的疤痕等修复改善。

Description

一种含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品

技术领域

本发明涉及一种制备自体外周血内皮祖细胞的方法以及通过所述方法获得的含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品。特别地，本发明涉及采用自体外周血来源的富含血小板血浆和内皮祖细胞，将获取的自体内皮祖细胞加入到富含血小板血浆中制备成生物美容制剂，富含血小板血浆促使内皮祖细胞分化为内皮细胞形成血管。同时提供了由自体内皮祖细胞和自体血浆制备成医学美容产品，可用于皮肤暗斑、粉刺瘢痕，以及烧伤、外伤引起的疤痕等修复改善。

背景技术

目前，市场上已经出现一些活细胞医学美容产品，但这些活细胞来源多数为同源异体的。尽管皮肤免疫反应低下，但是作为异体的活细胞应用到皮肤上，还是容易发生过敏反应，所以需要在应用前进行皮试，观察两个小时以上，无过敏反应方可应用。

内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。内皮祖细胞主要来源骨髓，但骨髓采集需要麻醉且较痛苦，存在创伤，不易为人们接受。在人循环血液中已经证明存在内皮祖细胞，可以分化成内皮细胞和/或平滑肌细胞，其主要功能是参与血管新生。表皮和真皮层细胞之所以能使得皮肤保持活力，主要是因为皮肤中毛细血管提供了足够的养分，促使细胞不断增殖、分裂和分化，新生细胞增多，使皮肤增厚，逐渐恢复皮肤正常结构和生理功能。

本发明利用外周血内皮祖细胞及其血管生成的功能，配合富含血小板血浆中大量细胞因子和营养成分，有效令内皮祖细胞分化为内皮细胞和平滑肌细胞，应用到皮肤中形成新生血管，保持皮肤丰富的营养成分，促使细胞不断增殖、分裂和分化。特别是，对于皮肤暗斑、粉刺瘢痕，以及烧伤、外伤引起的疤痕等，具有良好修复作用。

发明内容

为了促使皮肤新生细胞增多，使皮肤增厚，逐渐恢复皮肤正常结构和生理功能，本发明利用自体外周血来源富含血小板血浆和内皮祖细胞的生物学作用，可以有效地促使内皮祖细胞分化为内皮细胞和平滑肌细胞，形成新生毛细血管，为皮肤供应充足养分。本发明通过采集抗凝外周血获得自体血浆，抗凝外周血来源单核细胞培养获得内皮祖细胞。自体血浆富含血小板和富含各种生长因子，其中成纤维细胞生长因子：激发新活细胞，加速组织修复；表皮生长因子：修复上皮细胞，加速血管生长，加快组织修复；转化生长因子：促进血管上皮细胞修复再生；血小板衍生生长因子：产生胶原蛋白，促进血管生长，激活细胞再生；血管内皮生长因子：强力修复组织，产生胶原蛋白，刺激产生透明质酸。

本发明中内皮祖细胞存在骨髓和外周血中，加速新生血管的形成，完善组织的血液循环，改善组织的血供，最终达到防止组织缺血坏死。内皮祖细胞可以直接作用于终末血管，增加皮瓣局部毛细血管及小静脉的数量和总面积，以增加皮片及随意皮瓣的成活面积。烧伤、外伤等引起的疤痕，内皮祖细胞可以加速创伤愈合的速度，减少瘢痕增生的发生，促进脂肪细胞增殖和存活。内皮祖细胞通过对血管内皮细胞的作用，促进皮肤组织不断形成新的毛细血管，供应充足营养，使得成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞等不断增殖、分裂和分化，新生细胞增多，使皮肤增厚，逐渐恢复皮肤正常结构和生理功能。

本发明提供了一种含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品的制备方法，其中，所述方法包括通过从自体外周血中获取富含血小板血浆和培养获得自体内皮祖细胞，将获取的自体内皮祖细胞加入到自体血浆中制备成生物美容制剂。

所述自体内皮祖细胞高表达其特异性标志物；所述自体内皮祖细胞高表达CD34、CD133和FLK-1分子；所述自体内皮祖细胞高表达CD34+≥90％、CD133+≥90％和FLK-1+≥80％。

本发明提供了的富含血小板血浆由抽取人自体抗凝外周血，经两次离心去除红细胞和白细胞后获得的富含血小板血浆，放置4℃冰箱存放备用。

本发明提供了的自体内皮祖细胞，其特征在于由离心获取自体血浆后的血细胞，经Ficoll密度分离液离心获得单核细胞，用内皮细胞培养基(EGM-2)(含2％胎牛血清、10U/ml肝素、12μg/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、1μg/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管内皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子-1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β)重悬，按5×10⁶细胞/ml加入到重组人纤连蛋白包被的25cm²培养瓶中5ml，于37℃，5％CO₂培养箱中生长48小时。

48小时后对培养的内皮祖细胞进行换液，用5ml移液管吸弃培养液，加入5ml新鲜的EGM-2(含2％胎牛血清、10U/ml肝素、12μg/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、1μg/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管表皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子-1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β)，重组人纤连蛋白包被的25cm²培养瓶中继续在37℃，5％CO₂培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液。

内皮祖细胞在25cm²培养瓶中生长融合达到80％以上，用5ml移液管吸弃培养液，加入0.5ml 0.25％(质量体积比)胰酶(含质量体积比0.01％EDTA)消化后1000转每分钟离心5分钟收集内皮祖细胞；用5ml移液管加入10ml新鲜的EGM-2(含2％胎牛血清、10U/ml肝素、12μg/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、1μg/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管表皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子-1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β)，加入到1瓶用纤连蛋白包被的75cm²培养瓶中继续在37℃，5％CO₂培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液。如此连续传代1-5(优选连续传代3代)代培养经胰酶消化离心后，获得4×10⁷以上的内皮祖细胞，用4ml生理盐水重悬，计数，即获得内皮祖细胞，放置冰箱4℃存放备用。

所述自体内皮祖细胞高表达其特异性标志物，其表型检测方法为：取苔盼兰染色计数后的2×10⁶细胞，分两组，第一组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人FLK-1单抗、20μLPE标记鼠抗人CD133单抗和20μL Percp标记鼠抗人CD34单抗；第二组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μL PE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓中液洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur临床型流式细胞仪检测，所述自体内皮祖细胞高表达CD34+≥90％、CD133+≥90％和FLK-1+≥80％。

所述自体内皮祖细胞可用40％内皮祖细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液，储存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用。

本发明还提供了一种含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品，其中，该产品主要由如下成分组成：

1)5ml自体富含血小板血浆；

2)5×10⁶自体内皮祖细胞；

装入10ml无菌的密封塑料针管中，共5ml，包装后形成产品，可保存在4℃冰箱条件下，保质期为24小时。

本发明提供了含有自体血浆和自体内皮祖细胞的医学美容产品，

通过本发明的方法，通过获取的富含血小板血浆和自体内皮祖细胞制备成的医学美容制剂。由本发明提供的方法得到含有自体富含血小板血浆和自体内皮祖细胞的医学美容产品，能够对皮肤暗斑、粉刺瘢痕，以及烧伤、外伤引起的疤痕等产生良好修复和填充作用，以及具有祛皱、抗氧化、皮肤修复、除斑和抗衰老。

附图说明

图1表示由实施例1所培养的内皮祖细胞图片。

图2表示由实施例1所培养的内皮祖细胞流式细胞图片。

图3表示36岁男性经含自体内皮祖细胞的医学美容制剂1个疗程美容前后外伤疤痕改善的图片。

具体实施方式

本发明提供了一种含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品的制备方法，其中，所述方法包括通过从自体外周血中获取富含血小板血浆，然后培养获得自体内皮祖细胞，将获取的自体内皮祖细胞加入到自体血浆中制备成生物美容制剂。

所述自体血浆通过两步离心分离法得到，由抽取人50-200ml肝素或EDTA抗凝外周血，经1000转每分钟离心10分钟得到的10-80ml血浆，再次3000转每分钟离心10分钟获得10-80ml富含血小板血浆，放置4℃冰箱存放备用。

优选地，自体抗凝外周血使用肝素和乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K)作为抗凝剂。

本发明所述的自体内皮祖细胞，其特征在于由离心获取自体血浆后的血细胞，经Ficoll密度分离液离心获得单核细胞，用内皮细胞培养基(EGM-2)(含2％胎牛血清、10U/ml肝素、12μg/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、1μg/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管内皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子-1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β)重悬，按5×10⁶细胞/ml加入到重组人纤连蛋白包被的25cm²培养瓶中5ml，于37℃，5％CO₂培养箱中生长48小时。

内皮祖细胞在25cm²培养瓶中生长融合达到80％以上，用5ml移液管吸弃培养液，加入0.5ml 0.25％(质量体积比)胰酶(含质量体积比0.01％EDTA)消化后1000转每分钟离心5分钟收集内皮祖细胞；用5ml移液管加入10ml新鲜的EGM-2(含2％胎牛血清、10U/ml肝素、12μg/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、1μg/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管表皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子-1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β)，加入到1瓶用纤连蛋白包被的75cm²培养瓶中继续在37℃，5％CO₂培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液。如此连续传代1-5代(优选连续传代3代)培养经胰酶消化离心后，获得4×10⁷以上的内皮祖细胞，用4ml生理盐水重悬，计数，即获得内皮祖细胞，放置冰箱4℃存放备用。

所述自体内皮祖细胞高表达其特异性标志物，其表型检测方法为：取苔盼兰染色计数后的2×10⁶细胞，分两组，第一组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人FLK-1单抗、20μL PE标记鼠抗人CD133单抗和20μL Percp标记鼠抗人CD34单抗；第二组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μL PE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur临床型流式细胞仪检测，即CD34+≥90％、CD133+≥90％和FLK-1+≥80％。

作为本发明制造方法中使用的重组人纤连蛋白包被的培养瓶，在超净台中包被前用PBS预先湿润培养瓶，吸弃PBS，加入FN(25-200μg/ml，1ml)，室温包被30-60min；吸弃包被液，在超净台中开风机吹干，使用的培养瓶可例举为25cm²细胞培养瓶、75cm²细胞培养瓶、175cm²细胞培养瓶、细胞培养皿和细胞培养板等细胞培养用器材(容器)，均可用于本发明，优选细胞培养瓶。

本发明的制造方法中对内皮祖细胞进行冻存，对冻存液无特殊限制，但优选例如为50％小牛血清、40％细胞培养液和10％二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为内皮祖细胞培养液。复苏后培养的内皮祖细胞仍高表达CD34、CD133和FLK-1。

1)5ml自体富含血小板血浆；

2)5×10⁶自体内皮祖细胞；

在医学美容产品中用密封塑料针管包装，使用含肝素的动脉血气针或不含肝素的有密封盖的塑料针管，优选地，使用含肝素的动脉血气针，可以保持内皮祖细胞不凝聚在一起。

本发明提供了含有自体血浆和自体内皮祖细胞的医学美容产品，能够对皮肤暗斑、粉刺瘢痕，以及烧伤、外伤引起的疤痕等产生良好修复和填充作用，还能够对皮肤具有祛皱、抗氧化、皮肤修复、除斑和抗衰老。本发明还提供了该美容制剂使用方法，即美容针局部注射，选择人暗斑、粉刺瘢痕、疤痕以及皱纹等部位皮肤真皮层注射，为皮肤产生修复、填充、祛皱、抗氧化和除斑等功效。具体方法如下：美容者使用洁面乳清洗面部皮肤，晾干后脸部涂上皮肤外用麻醉剂，根据麻醉剂使用要求，一般约15分钟麻醉剂起效。将装有本发明生物美容制剂的塑料注射器安装上20G有侧开口的美容针，取暗斑、瘢痕和疤痕等部位进行真皮层注射500ul，缓慢撤出美容针后用无菌棉棒轻轻压住2-5分钟，对于面积较大的暗斑、瘢痕和疤痕等可以多点注射，注射完毕后冰覆20-40分钟，也可以用于皱纹的除皱美容。

美容者本发明生物美容制剂处理之后当天不使用其他化妆品和洗脸，一般需间隔1个月连续使用4次，可达到更佳的医学美容效果，对皮肤可以去除暗斑、粉刺瘢痕减少、疤痕填充和修复以及抗氧化的作用。

以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。

制备例1 富含血小板血浆的制备

用两支50ml注射器分别抽取1000U/ml肝素2ml(河北常山生化药业股份有限公司)，采集人100ml抗凝经脉血后摇匀，将采集的肝素抗凝血加入到两支50ml无菌离心管中，经1000转每分钟速度离心10分钟，用5ml移液管吸取离心后上层血浆置新的50ml离心管中，获得40ml左右自体血浆。自体血浆再次3000转每分钟离心10分钟，获得40ml左右富含血小板血浆，分装至15ml无菌离心管中，置4℃冰箱存放备用。

制备例2 自体内皮祖细胞制备

取制备例1中离心获取自体血浆后的60ml血细胞，用60ml1×PBS(pH值为7.4)稀释，加入到Ficoll密度分离液中经1800rpm密度梯度离心30min，获得单核细胞，苔盘兰染色后倒置显微镜下计数。计数后单核细胞用内皮细胞培养基(EGM-2)(含2％胎牛血清、10U/ml肝素、12μg/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、1μg/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管内皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子-1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β)重悬，按5×10⁶细胞/ml加入到重组人纤连蛋白包被的25cm²培养瓶中5ml，于37℃，5％CO₂培养箱中生长48小时。

内皮祖细胞在25cm²培养瓶中生长融合达到80％以上，用5ml移液管吸弃培养液，加入0.5ml 0.25％(质量体积比)胰酶(含质量体积比0.01％EDTA)消化后1000转每分钟离心5分钟收集内皮祖细胞；用5ml移液管加入10ml新鲜的EGM-2(含2％胎牛血清、10U/ml肝素、12μg/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、1μg/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管表皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子-1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β)，加入到1瓶用纤连蛋白包被的75cm²培养瓶中继续在37℃，5％CO₂培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液。如此连续传代3代培养经胰酶消化离心后，获得4×10⁷以上的内皮祖细胞，用4ml生理盐水重悬，苔盘兰染色计数，即获得内皮祖细胞，放置冰箱4℃存放备用。

图1A中为内皮祖细胞原代培养时的细胞图片，15-20天后形成迅速生长的梭形细胞出现典型的线性排列，相邻的细胞簇之间相互连接形成血管网样结构；B中为内皮祖细胞传代培养时的细胞图片，细胞形态逐渐变大，呈现典型铺路石样改变。

实施例3自体内皮祖细胞的流式细胞鉴定

取制备例1中制备的经苔盼兰染色计数后的2×10⁶内皮祖细胞，分两组，第一组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人FLK-1单抗、20μL PE标记鼠抗人CD133单抗和20μL Percp标记鼠抗人CD34单抗；第二组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μL PE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur临床型流式细胞仪检测。图2流式细胞仪检测，制备例1中制备的内皮祖细胞表达CD34+为96.67％、CD133+为92.97％和FLK-1+为83.28％。

实施例4 含自体内皮祖细胞医学美容制剂的制备

取制备好的自体血浆5ml，加入制备好的5×10⁶内皮祖细胞，混匀，形成自体美容制剂，装入10ml无菌动脉血气针管中，贴上标签(包括美容者姓名、性别、年龄、细胞名称、数量和生产时间等信息)，放置冰箱4℃冷藏中存放。

实施例5含自体内皮祖细胞医学美容制剂应用

美容者躺卧在手术台上，使用洁面乳进行皮肤清洁(包括暗斑、粉刺瘢痕、疤痕以及皱纹等)，清水擦洗干净；先用皮肤麻醉剂-达克罗宁乳膏对面部进行处理，进行局部麻醉，大约15分钟左右起效，即可进行美容针真皮层注射。

选择美容者暗斑、粉刺瘢痕、疤痕和皱纹(如鱼尾纹、鼻背纹、眼周细纹、额头纹、川字纹、法令纹和颈纹等)等部位，使用有侧开口的20G美容针进行皮下真皮层注射，用长度38mm的美容针注射500ul的实施例4中制备的含自体内皮祖细胞的医学美容制剂。

注射完之后缓慢撤出美容针，用无菌棉棒轻轻压住2-5分钟，完毕后冰覆40分钟。美容者本发明生物美容制剂处理之后当天不使用其他化妆品和洗脸，间隔1个月后连续使用4次，作为一个疗程。

图3中是一名36岁男性经含自体内皮祖细胞的医学美容制剂4次美容后外伤疤痕的图片，发现该患者一个疗程后外伤疤痕得到很好的改善，疤痕得以很好填充，变得光滑细腻。

Claims

1.一种含自体外周血内皮祖细胞的自体医学美容产品的制备方法，其特征在于，所述方法包括通过从自体外周血中获取富含血小板血浆，然后培养获得自体内皮祖细胞；将获取的自体内皮祖细胞加入到自体血浆中制备成生物美容产品；所述自体血浆促使所述内皮祖细胞分化为内皮细胞形成血管；所述自体内皮祖细胞高表达其特异性标志物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自体内皮祖细胞高表达其特异性标志物；所述自体内皮祖细胞高表达CD34+≥90％、CD133+≥90％和FLK-1+≥80％。

3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述自体血浆由抽取人50-200ml肝素或EDTA抗凝外周血，经1000转每分钟离心10分钟得到的10-80ml血浆，再次3000转每分钟离心10分钟获得10-80ml富含血小板血浆，放置4℃冰箱存放备用。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述自体内皮祖细胞由离心获取血浆后的40-120ml血细胞，经Ficoll密度分离液密度梯度离心获得单核细胞，用内皮细胞培养基EGM-2重悬，按5×10⁶细胞/ml加入到重组人纤连蛋白包被的25cm²培养瓶中5ml，于37℃，5％CO₂培养箱中生长48小时；

48小时后对培养的内皮祖细胞进行换液，用5ml移液管吸弃培养液，加入5ml新鲜的EGM-2，重组人纤连蛋白包被的25cm²培养瓶中继续在37℃，5％CO₂培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液；

内皮祖细胞在25cm²培养瓶中生长融合达到80％以上，用5ml移液管吸弃培养液，加入0.5ml 0.25％(质量体积比)胰酶消化后1000转每分钟离心5分钟收集内皮祖细胞，其中，胰酶含质量体积比0.01％EDTA；用5ml移液管加入10ml新鲜的EGM-2，加入到1瓶用纤连蛋白包被的75cm²培养瓶中继续在37℃，5％CO₂培养箱中生长，每隔2天换一次新鲜培养液；如此连续传代1-5代培养经胰酶消化离心后，获得4×10⁷以上的内皮祖细胞，用4ml生理盐水重悬，计数，即获得内皮祖细胞，放置冰箱4℃存放备用。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述EGM-2含有：2％胎牛血清、10U/ml肝素、12μg/ml牛脑提取物、10ng/ml重组人表皮生长因子、1μg/ml氢化可的松、50ng/ml重组人血管表皮生长因子、50ng/ml重组人R3-胰岛素样生长因子-1和50ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子-β。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述自体内皮祖细胞高表达CD34+≥90％、CD133+≥90％和FLK-1+≥80％；

优选，其表型检测方法为：取苔盼兰染色计数后的2×10⁶细胞，分两组，第一组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人FLK-1单抗、20μL PE标记鼠抗人CD133单抗和20μL Percp标记鼠抗人CD34单抗；第二组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgGl、20μL PE标记鼠IgGl和20μL PerCP标记鼠IgGl；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓中液洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur临床型流式细胞仪检测。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述自体内皮祖细胞可用40％内皮祖细胞培养液、10％二甲基亚砜和50％胎牛血清组成的冻存液，储存在-196℃液氮罐中，以备今后复苏后使用。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述内皮祖细胞表达CD34+为96.67％、CD133+为92.97％和FLK一1+为83.28％。

9.一种含自体外周血内皮祖细胞的医学美容产品，其中，该产品主要由如下成分组成：

1)5ml自体富含血小板血浆；

2)5×10⁶如权利要求1-8任一项所述的自体内皮祖细胞；

装入10ml无菌的密封塑料针管中，共5ml，包装后形成产品，保存在4℃冰箱条件下，保质期为24小时。

10.一种权利要求1-9中任一项所述的医学美容产品的用途。