CN110484492A - 内皮祖细胞培养制剂、培养液及内皮祖细胞分离培养方法 - Google Patents

内皮祖细胞培养制剂、培养液及内皮祖细胞分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种内皮祖细胞培养制剂、培养液及内皮祖细胞分离培养方法。该培养液添加有与待培养的内皮祖细胞同源的PRP，并配合特别设计的细胞生长因子组合，经过试验发现，可以显著提高内皮祖细胞的增殖效果。并且使用自体外周血制备的血浆，减少了避免另外提取全血制备血浆的步骤，有利于减少人机体损伤。使用该内皮祖细胞培养液培养的内皮祖细胞可以更为安全地进行临床试验，可以减少外源动物血清的污染和一些潜在的风险，可以让内皮祖细胞更好的生长。

Description

内皮祖细胞培养制剂、培养液及内皮祖细胞分离培养方法
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种内皮祖细胞培养制剂、培养液及内皮祖细胞分离培养方法。
背景技术
内皮祖细胞(Endothelial progenitor cell，EPC)是一种能增殖分化为血管内皮细胞的内皮前体细胞，别称血管母细胞和血管内皮干细胞，属于CD34阳性细胞的亚群，它来自于骨髓，且存在于脐带血、成人外周血和骨髓中。1997年EPC首次被Asahara等人利用免疫磁珠法从人外周血中成功分离纯化出来，此后有关于EPC的分离、纯化、扩增及其临床研究备受关注。EPC对新生血管的形成和修复内皮组织有着重要作用，研究表明EPC的数量与患心脑血管疾病风险成反比，在肿瘤血管形成中占重要作用，EPC移植能促进心肌缺血和后肢体缺血恢复。
目前得到内皮祖细胞的来源主要是由骨髓、外周血、脐血经过Ficoll分离获得单个核细胞，然后将其接种于用纤维粘连蛋白(fibronectin)包被的培养器具内，再加入含有生长因子如VEGF、EGF、bFGF等的培养液中培养，或者用细胞表面粘附分子CD34、KDR、CD133等，用磁珠分选或流式细胞仪分选的方式，得到所需细胞再用上述培养液进行培养扩增。然而，目前对EPC培养的方法操作得到的细胞数量、活性等不理想，大多存在着问题使EPC无法在体外稳定的扩增繁殖，例如：易老化、传代次数少、增殖数量少、细胞表面粘附分子表达低等，一系列问题导致了EPC数量无法稳定获得，大大地限制了其在研究和临床应用的需求。
发明内容
基于此，有必要提供一种有利于提高EPC体外扩增繁殖稳定性的内皮祖细胞培养制剂、培养液及内皮祖细胞分离培养方法。
一种内皮祖细胞培养液，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的富血小板血浆和细胞生长因子，其中，所述富血小板血浆的体积添加量为每10mL基础培养基中添加0.1mL～0.5mL，所述细胞生长因子包括终浓度为5ng/mL～50ng/mL的血管内皮生长因子、终浓度为5ng/mL～50ng/mL的碱性成纤维生长因子、终浓度为0.1μg/mL～1.0μg/mL的氢化可的松、终浓度为5ng/mL～30ng/mL的胰岛素样生长因子和终浓度为2ng/mL～20ng/mL的表皮细胞生长因子。
在其中一个实施例中，所述富血小板血浆是将外周血离心后收集血浆，对收集的血浆再次进行离心收集得到的。
在其中一个实施例中，对外周血离心时速度为400g～600g，离心时间为10min～20min；
再次对得到的血浆进行分离纯化得到所述富血小板血浆。
在其中一个实施例中，所述基础培养基选自DMEM高糖培养基、M-199培养基或EBM-2MV培养基。
一种内皮祖细胞分离培养方法，包括如下步骤：
对外周血进行离心处理，收集白膜层和红细胞；
对收集的白膜层和红细胞重悬混匀后，分离得到单个核细胞；
对收集的单个核细胞使用上述任一实施例所述的内皮祖细胞培养液进行培养。
在其中一个实施例中，在对外周血离心时，离心速度为400g～600g，离心时间为10min～20min；和/或
所述对收集的白膜层和红细胞混匀是使用pH为7.0～8.0的PBS缓冲液将收集白膜层和红细胞重悬混匀，PBS缓冲液与收集的白膜层和红细胞的体积比为(2.5～3.5):2；和/或
所述分离得到单个核细胞是使用Ficoll分离方法分离得到，包括将重悬混匀的白膜层和红细胞加到淋巴细胞分离液中，以400g～600g离心20min～30min，升降速控制在0～3挡，其中，重悬混匀的白膜层和红细胞溶液与淋巴细胞分离液的体积比为(2.5～3.5):2。
在其中一个实施例中，所述内皮祖细胞分离培养方法还包括在对收集的单个核细胞进行培养之前对收集的单个核细胞进行清洗的步骤，在清洗时，将收集的单个核细胞与pH为7.0～8.0的PBS缓冲液按照体积比为1:(2.5～3.5)混合，以400g～600g的离心速度下离心10min～15min，收集下层的单个核细胞。
在其中一个实施例中，在使用所述内皮祖细胞培养液进行培养时，调整细胞密度为1×105～1×106个细胞/mL后，接种进新的包被有人纤维连接蛋白的容器中进行扩大培养。
在其中一个实施例中，在扩大培养时，培养24h后去除内皮祖细胞培养液和未贴壁的细胞，再使用新的内皮祖细胞培养液培养，每3天更换所述内皮祖细胞培养液一次，培养至细胞70％～90％融合时，传代。一种内皮祖细胞培养制剂，所述内皮祖细胞培养制剂包括上述任一实施例所述的内皮祖细胞培养液以及培养在所述内皮祖细胞培养液中的与所述富血小板血浆同源的内皮祖细胞；或者所述内皮祖细胞培养制剂为使用上述任一实施例所述的内皮祖细胞分离培养方法培养的细胞液。
本发明经过研究发现，传统的内皮祖细胞培养方法增殖效果不理想的原因主要在于培养液的配方，传统的培养液配方中为了保持内皮祖细胞的活性一般要加入异源血清，异源血清虽然有细胞生长的营养，但是对保持细胞活性作用不太理想，而且，异源血清会加大了人体发生排异反应的危险，无法满足临床的需求。
研究发现，富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物。PRP中含有大量的生长因子如血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)等，PRP还含有大量纤维蛋白，为可以为细胞生长提供良好的支架。基于此，本发明的上述内皮细胞培养液添加有与待培养的内皮祖细胞同源的PRP，并配合特别设计的细胞生长因子组合，经过试验发现，可以显著提高内皮祖细胞的增殖效果。并且使用自体外周血制备的PRP，减少了避免另外提取全血制备PRP的步骤，有利于减少人机体损伤。使用该内皮祖细胞培养液培养的内皮祖细胞可以更为安全地进行临床试验，可以减少外源动物血清的污染和一些潜在的风险，可以让内皮祖细胞更好的生长。
在内皮祖细胞分离培养时，优选地，采用密度梯度离心获得单个核细胞，对细胞的损伤小，并且操作简单，适用性强，有利于降低单个核细胞的分离成本。
在内皮祖细胞分离培养时，更优选地，利用细胞贴壁的时差可以更快地分离内皮祖细胞，有利于快速获得比较纯的内皮祖细胞，提高了细胞培养的效率。
进一步，在内皮自细胞分离培养时，通过优化各步骤的处理参数，可以最大限度的提高细胞的存活率和纯度。
附图说明
图1为细胞培养7d后形态图；
图2为培养7d后细胞表面标志表达量；
图3为MTT法测量法的EPC生长曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种内皮祖细胞培养液，其包括基础培养基和添加在基础培养基中的PRP和细胞生长因子，其中，PRP的体积添加量为每10mL基础培养基中添加0.1mL～0.5mL，细胞生长因子包括终浓度为5ng/mL～50ng/mL的血管内皮生长因子、终浓度为5ng/mL～50ng/mL的碱性成纤维生长因子、终浓度为0.1μg/mL～1.0μg/mL的氢化可的松、终浓度为5ng/mL～30ng/mL的胰岛素样生长因子和终浓度为2ng/mL～20ng/mL的表皮细胞生长因子。
在一个具体示例中，该PRP是将外周血离心后收集血浆，对收集的血浆再次离心收集得到的。优选地，对外周血离心时速度为400g～600g，离心时间为10min～20min；对血浆再次离心时速度为2000g～3000g，离心时间为10min～20min。
在一个具体示例中，该基础培养基可以是但不限于DMEM高糖培养基、M-199培养基或EBM-2MV培养基。
在一个优选的示例中，基础培养基为DMEM高糖培养基，PRP的添加量为0.2ml，氢化可的松的终浓度为0.3mg/L、血管内皮生长因子的终浓度为30ng/mL、碱性成纤维生长因子的终浓度为10ng/mL、胰岛素样生长因子的终浓度为10ng/mL、表皮细胞生长因子的终浓度为10ng/mL。
本发明进一步还提供了一种内皮祖细胞分离培养方法，包括如下步骤：
步骤一：对外周血进行离心处理，收集白膜层和红细胞；
步骤二：对收集的白膜层和红细胞重悬混匀后，分离得到单个核细胞；
步骤三：对收集的单个核细胞使用上述内皮祖细胞培养液进行培养。
具体地，在一个示例中，在步骤一的对外周血离心时，离心速度为400g～600g，离心时间为10min～20min。
在步骤二中，对收集的白膜层和红细胞混匀是使用pH为7.0～8.0的PBS缓冲液将收集白膜层和红细胞重悬混匀，PBS缓冲液与收集的白膜层和红细胞的体积比为(2.5～3.5):2，优选按照体积比为3:2的比例进行重悬混匀。
在步骤二中，分离得到单个核细胞是使用Ficoll分离方法分离得到，包括将重悬混匀的白膜层和红细胞加到淋巴细胞分离液中，以400g～600g离心20min～30min，升降速控制在0～3挡，其中，重悬混匀的白膜层和红细胞溶液与淋巴细胞分离液的体积比为(2.5～3.5):2，优选按照白膜层和红细胞溶液与淋巴细胞分离液的体积比为3:2的比例将重悬混匀的白膜层和红细胞加到淋巴细胞分离液中。
优选地，在步骤三之前还包括在对收集的单个核细胞进行培养之前对收集的单个核细胞进行清洗的步骤，在清洗时，将收集的单个核细胞与pH为7.0～8.0的PBS缓冲液按照体积比为1:(2.5～3.5)混合，以400g～600g的离心速度下离心10min～15min，收集下层的单个核细胞。进一步优选地，清洗至少两次。
在步骤三中，在使用内皮祖细胞培养液进行培养时，调整细胞密度优选为1×105～1×106个细胞/mL后，接种进新的包被有人纤维连接蛋白的容器中进行扩大培养，例如接种进事先用人纤维连接蛋白包被的六孔板中，该六孔板优选事先在37℃下放置4小时。
优选地，在扩大培养时，培养24h后去除内皮祖细胞培养液和未贴壁的细胞，再使用新的内皮祖细胞培养液培养，每3天更换内皮祖细胞培养液一次，培养至细胞70％～90％融合时，传代。
细胞培养时放入温度为37℃、饱和5％二氧化碳的培养箱中培养。
本发明进一步还提供了一种内皮祖细胞培养制剂，该内皮祖细胞培养制剂包括上述内皮祖细胞培养液以及培养在内皮祖细胞培养液中的与PRP同源的内皮祖细胞；或者该内皮祖细胞培养制剂为使用上述内皮祖细胞分离培养方法培养的细胞液。
本发明的上述内皮细胞培养液添加有与待培养的内皮祖细胞同源的PRP，并配合特别设计的细胞生长因子组合，经过试验发现，可以显著提高内皮祖细胞的增殖效果。并且使用自体外周血制备的PRP，减少了避免另外提取全血制备血浆的步骤，有利于减少人机体损伤。使用该内皮祖细胞培养液培养的内皮祖细胞可以更为安全地进行临床试验，可以减少外源动物血清的污染和一些潜在的风险，可以让内皮祖细胞更好的生长。
在内皮祖细胞分离培养时，优选地，采用密度梯度离心获得单个核细胞，对细胞的损伤小，并且操作简单，适用性强，有利于降低单个核细胞的分离成本。
在内皮祖细胞分离培养时，更优选地，利用细胞贴壁的时差可以更快地分离内皮祖细胞，有利于快速获得比较纯的内皮祖细胞，提高了细胞培养的效率。
进一步，在内皮自细胞分离培养时，通过优化各步骤的处理参数，可以最大限度的提高细胞的存活率和纯度。
以下结合具体实施例对本发明内皮细胞培养制剂、培养液及内皮细胞分离培养方法作进一步详细的说明。
实施例1
收集100mL人外周血，在2h内将血液离心，得到血浆、白膜层和红细胞，再次对得到的血浆进行分离纯化得到PRP。
同时用pH为7.0～8.0的PBS溶液与白膜层和红细胞混匀，使用Ficoll梯度离心法对细胞混合物进行离，得到单个核细胞，Ficoll梯度离心法分离的离心力为500g，离心时间为20min。
用pH为7.0～8.0的PBS溶液重悬单个核细胞，调整细胞密度为1×106个细胞/mL，接种于已包被人纤维连接蛋白的六孔板内，细胞悬液2mL/孔。
于24h后，去掉上清和未贴壁细胞，用PBS清洗贴壁细胞1～2遍后，加入DMEM高糖培养基、0.2mL/10mLDMEM高糖培养基的PRP、终浓度为0.3mg/L的氢化可的松、终浓度为30ng/mL血管内皮生长因子、终浓度为10ng/mL碱性成纤维生长因子、终浓度为10ng/mL胰岛素样生长因子、终浓度为10ng/mL表皮细胞生长因子，继续培养已贴壁的细胞，每3天更换培养基一次，更换4次培养基即可筛选得到内皮祖细胞。
实施例2
收集50mL人外周血，在2h内将血液离心，得到血浆、白膜层和红细胞，再次对得到的血浆进行分离纯化得到PRP。
同时用pH为7.0～8.0的PBS溶液与白膜层和红细胞混匀，使用Ficoll梯度离心法对细胞混合物进行离，得到单个核细胞，Ficoll梯度离心法分离的离心力为500g，离心时间为15min。
用pH为7.0～8.0的PBS溶液重悬单个核细胞，调整细胞密度为1×105个细胞/mL，接种于已包被人纤维连接蛋白的六孔板内，细胞悬液2mL/孔。
于24h后，去掉上清和未贴壁细胞，用PBS清洗贴壁细胞1～2遍后，加入DMEM高糖培养基、0.2mL/10mL的PRP、终浓度为0.3mg/L的氢化可的松、终浓度为30ng/mL血管内皮生长因子、终浓度为10ng/mL碱性成纤维生长因子、终浓度为10ng/mL胰岛素样生长因子、终浓度为10ng/mL表皮细胞生长因子，继续培养已贴壁的细胞，每3天更换培养基一次，更换4次培养基即可筛选得到内皮祖细胞。
实施例3
将实施例1所得细胞分别用下表1中的三种培养基培养。
表1
采用表1提供的培养基培养分离得到的内皮祖细胞，扩增传代培养至20天，记录各培养基培养细胞的增殖情况，结果如表2所示。
表2
组别 活细胞数(ells) 总细胞数(ells) 细胞活率(％) CD34+、CD133+表达(％)
培养基1 1.45×10<sup>8</sup> 1.47×10<sup>8</sup> 98.63 98.4
培养基2 1.34×10<sup>8</sup> 1.38×10<sup>8</sup> 97.10 97.3
培养基3 1.02×10<sup>8</sup> 1.08×10<sup>8</sup> 94.44 88.7
培养基1是市售的全培养基，效果非常好，但价格昂贵，一般不能用做大批量生产。由表2可以看出，使用培养基2可以获得接近全培养基的培养效果，大大优于传统的使用FBS等异体血清的培养效果。
图1、图2和图3为使用培养基2的一些培养结果。其中，图1为细胞培养7d后形态图，可见细胞贴壁生长且形态以梭型为主，形成细胞集落及线装结构。图2为培养7d后细胞表面标志表达量，可见CD133:(26.94±3.05)％，CD34:(16.46±2.74)％,KDR(56.54±7.18)％。图3为MTT法测量法的EPC生长曲线，表明内皮祖细胞潜伏期为1-3天，到4-12天达到对数期，13-15天达到平台期，可见细胞增值期长。
对比例1
收集100mL人外周血，在2h内将血液离心，得到血浆、白膜层和红细胞，再次对得到的血浆进行分离纯化得到PRP。
同时用pH为7.0～8.0的PBS溶液与白膜层和红细胞混匀，使用Ficoll梯度离心法对细胞混合物进行离，得到单个核细胞，Ficoll梯度离心法分离的离心力为500g，离心时间为20min。
用pH为7.0～8.0的PBS溶液重悬单个核细胞，调整细胞密度为1×106个细胞/mL，接种于未包被人纤维连接蛋白的六孔板内，细胞悬液2mL/孔。
于24h后，去掉上清和未贴壁细胞，用PBS清洗贴壁细胞1～2遍后，加入DMEM高糖培养基、终浓度为0.2mL/10mL的PRP、终浓度为0.3mg/L的氢化可的松、终浓度为30ng/mL血管内皮生长因子、终浓度为10ng/mL碱性成纤维生长因子、终浓度为10ng/mL胰岛素样生长因子、终浓度为10ng/mL表皮细胞生长因子，继续培养已贴壁的细胞，每3天更换培养基一次，更换4次培养基即可筛选得到内皮祖细胞。
对比例2
收集100mL人外周血，在2h内将血液离心，得到血浆、白膜层和红细胞，再次对得到的血浆进行分离纯化得到PRP。
同时用pH为7.0～8.0的PBS溶液与白膜层和红细胞混匀，使用Ficoll梯度离心法对细胞混合物进行离，得到单个核细胞，Ficoll梯度离心法分离的离心力为500g，离心时间为10min。
用pH为7.0～8.0的PBS溶液重悬单个核细胞，调整细胞密度为1×106个细胞/mL，接种于已包被人纤维连接蛋白的六孔板内，细胞悬液2mL/孔。
于24h后，去掉上清和未贴壁细胞，用PBS清洗贴壁细胞1～2遍后，加入DMEM高糖培养基、终浓度为0.05mL/10mL的PRP、终浓度为0.3mg/L的氢化可的松、终浓度为30ng/mL血管内皮生长因子、终浓度为10ng/mL碱性成纤维生长因子、终浓度为10ng/mL胰岛素样生长因子、终浓度为10ng/mL表皮细胞生长因子，继续培养已贴壁的细胞，每3天更换培养基一次，更换4次培养基即可筛选得到内皮祖细胞。
对比例3
收集100mL人外周血，在2h内将血液离心，得到血浆、白膜层和红细胞，再次对得到的血浆进行分离纯化得到PRP。
同时用pH为7.0～8.0的PBS溶液与白膜层和红细胞混匀，使用Ficoll梯度离心法对细胞混合物进行离，得到单个核细胞，Ficoll梯度离心法分离的离心力为500g，离心时间为20min。
用pH为7.0～8.0的PBS溶液重悬单个核细胞，调整细胞密度为1×106个细胞/mL，接种于已包被人纤维连接蛋白的六孔板内，细胞悬液2mL/孔。
于24h后，去掉上清和未贴壁细胞，用PBS清洗贴壁细胞1～2遍后，加入DMEM高糖培养基、终浓度为0.7mL/10mL的PRP、终浓度为0.3mg/L的氢化可的松、终浓度为30ng/mL血管内皮生长因子、终浓度为10ng/mL碱性成纤维生长因子、终浓度为10ng/mL胰岛素样生长因子、终浓度为10ng/mL表皮细胞生长因子，继续培养已贴壁的细胞，每3天更换培养基一次，更换4次培养基即可筛选得到内皮祖细胞。
效果检测
对实施例1～2和对比例1～3方法培养的细胞进行检测，结果如表3：
表3
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种内皮祖细胞培养液，其特征在于，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的富血小板血浆和细胞生长因子，其中，所述富血小板血浆的体积添加量为每10mL基础培养基中添加0.1mL～0.5mL，所述细胞生长因子包括终浓度为5ng/mL～50ng/mL的血管内皮生长因子、终浓度为5ng/mL～50ng/mL的碱性成纤维生长因子、终浓度为0.1μg/mL～1.0μg/mL的氢化可的松、终浓度为5ng/mL～30ng/mL的胰岛素样生长因子和终浓度为2ng/mL～20ng/mL的表皮细胞生长因子。
2.如权利要求1所述的内皮祖细胞培养液，其特征在于，所述富血小板血浆是将外周血离心后收集血浆，对收集的血浆进行再次离心收集得到的。
3.如权利要求2所述的内皮祖细胞培养液，其特征在于，对外周血离心时速度为400g～600g，离心时间为10min～20min；
再次对得到的血浆进行分离纯化得到所述富血小板血浆。
4.如权利要求1～3中任一项所述的内皮祖细胞培养液，其特征在于，所述基础培养基选自DMEM高糖培养基、M-199培养基或EBM-2MV培养基。
5.一种内皮祖细胞分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
对外周血进行离心处理，收集白膜层和红细胞；
对收集的白膜层和红细胞重悬混匀后，分离得到单个核细胞；
对收集的单个核细胞使用如权利要求1～4中任一项所述的内皮祖细胞培养液进行培养。
6.如权利要求5所述的内皮祖细胞分离培养方法，其特征在于，在对外周血离心时，离心速度为400g～600g，离心时间为10min～20min；和/或
所述对收集的白膜层和红细胞混匀是使用pH为7.0～8.0的PBS缓冲液将收集白膜层和红细胞重悬混匀，PBS缓冲液与收集的白膜层和红细胞的体积比为(2.5～3.5):2；和/或
所述分离得到单个核细胞是使用Ficoll分离方法分离得到，包括将重悬混匀的白膜层和红细胞加到淋巴细胞分离液中，以400g～600g离心20min～30min，升降速控制在0～3挡，其中，重悬混匀的白膜层和红细胞溶液与淋巴细胞分离液的体积比为(2.5～3.5):2。
7.如权利要求5或6所述的内皮祖细胞分离培养方法，其特征在于，还包括在对收集的单个核细胞进行培养之前对收集的单个核细胞进行清洗的步骤，在清洗时，将收集的单个核细胞与pH为7.0～8.0的PBS缓冲液按照体积比为1:(2.5～3.5)混合，以400g～600g的离心速度下离心10min～15min，收集下层的单个核细胞。
8.如权利要求5或6所述的内皮祖细胞分离培养方法，其特征在于，在使用所述内皮祖细胞培养液进行培养时，调整细胞密度为1×105～1×106个细胞/mL后，接种进新的包被有人纤维连接蛋白的容器中进行扩大培养。
9.如权利要求8所述的内皮祖细胞分离培养方法，其特征在于，在扩大培养时，培养24h后去除内皮祖细胞培养液和未贴壁的细胞，再使用新的内皮祖细胞培养液培养，每3天更换所述内皮祖细胞培养液一次，培养至细胞70％～90％融合时，传代。
10.一种内皮祖细胞培养制剂，其特征在于，所述内皮祖细胞培养制剂包括如权利要求1～4中任一项所述的内皮祖细胞培养液以及培养在所述内皮祖细胞培养液中的与所述富血小板血浆同源的内皮祖细胞；或者所述内皮祖细胞培养制剂为使用如权利要求5～9中任一项所述的内皮祖细胞分离培养方法培养的细胞液。
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