CN103667188B - 一种制备成熟红细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备成熟红细胞的方法，所述方法包括利用单个核细胞经过体外培养制备成熟红细胞的步骤，优选地，所述单个核细胞来自脐血或外周血的白膜层。本发明还涉及利用所述方法制备得到的成熟红细胞，以及单个核细胞用于制备成熟红细胞的用途。本发明的制备方法具有以下优点：原材料易得，可利用血液滤白后剩余的部分；节约成本，省却了纯化CD34⁺细胞的步骤。

Description

一种制备成熟红细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种制备成熟红细胞的方法，具体地说，本发明涉及利用单个核细胞经过体外培养制备成熟红细胞的方法。本发明还涉及利用所述方法制备得到的成熟红细胞，以及单个核细胞用于制备成熟红细胞的用途。

背景技术

在过去的一个世纪中，同种异体输血已经成为治疗严重缺血患者（例如，急性贫血、严重的血小板减少症、血友病）的救命手段，但是，同种异体输血导致疾病传播（例如，肝炎、AIDS、梅毒、疟疾以及其他血源性疾病）的风险依然存在。今天，在北美、西欧等发达国家以及某些发展中国家，同种异体输血一般都是安全的，这是因为现在已经使用了高敏感性的检测方法如核酸扩增技术来筛查AIDS和其他感染性疾病。在美国，单次输血感染HIV的风险大约为1/1,000,000（McCullough,J.在无病原血液供应方面取得的进步（Progresstowardapathogen-freebloodsupply）。ClinicalInfec.Dis.2003;37:88–95）。但是，通过输血发生感染的风险依然是存在的，因为微生物感染都有一个窗口期，在这个时期内，检测结果是阴性的。对于那些新出现的病原体来说（例如，各种克雅病、西尼罗河病毒、A5N1和其他禽流感病毒），目前还未纳入检测范围。在第三世界国家，血源性传播疾病普遍流行，这是由于供者血液筛选不严格、存在卖血现象以及依赖家庭供者献血等造成的。在2008年，全球共采集了93,000,000个单位的血液，其中约有50%的血液是由发展中国家采集的，但是有42个国家无法对所有的血液进行四种输血感染微生物（HIV、乙型肝炎、丙型肝炎和梅毒）中的一种或多种的筛查，在发展中国家，只有47%的血液是在标准质控条件下进行检测的（WorldHealthOrganization.(2010).全球血液安全性与可用性—关键事实和数据（Globalbloodsafetyandavailability—keyfactsandfigures），2010）。

除了疾病传播的风险以外，同种异体供者血液在世界范围内都处于短缺状态，并且这种短缺将长期存在。由于我国人口老龄化问题越来越突出，适于献血的人群所占比例也在不断下降，导致血源供应紧张。另外，供者红细胞只能储存约5周的时间，在有大量伤员（如自然灾害，战争）需要输血的情况下，供应短缺的问题将更加紧迫。再者，同种异体输血需要供者和受体具有相匹配的抗原/抗体状态，这也会导致血液供应出现结构性短缺。

因此，目前输血医学依然面临着很多问题，其中就包括血液供需矛盾突出、输血感染依然存在、临床输血反应时有发生以及稀有血型患者难以及时得到合适的血液等。这也使得从事输血医学研究的人一直在思考和研究如何能够获得更安全、更加标准化的血液制品，其中利用干细胞体外培养生产成熟的有功能的红细胞就是大家一直努力的目标，这些红细胞可被称为体外培养的红细胞（culturedredbloodcells,cRBC）。

从目前的研究现状来看，体外培养扩增红细胞主要利用的是造血干细胞（hematopoieticstemcells，HSCs）和胚胎干细胞（embryonicstemcells，ESCs）。

在体外利用造血干细胞生产成熟红细胞的方法大致包括如下步骤：首先利用细胞因子如EPO、SCF、IL-3等刺激造血干细胞的扩增并诱导其向红系分化，然后单独用EPO刺激使其进一步扩增，最后通过基质细胞的支持使细胞去核形成成熟的红细胞。利用这种方法已经成功地培养出了成熟的有功能的红细胞，其中比较成功的例子是利用造血干细胞（脐血、外周或骨髓来源的CD34⁺细胞）通过添加EPO、SCF、IL-3、羟皮质激素的无血清培养和基质细胞（小鼠骨髓基质细胞或人间充质干细胞）支持培养来获得红细胞，利用这种方法可以使脐血来源的造血干细胞扩增(2-6)×10⁶倍，并且所获得的细胞中90%以上的都是去核的成熟红细胞，这些细胞具有正常的变形能力和功能正常的血红蛋白（GiarratanaMC,KobariL,LapillonneH等人，利用造血干细胞体外制备完全成熟的人红细胞（Exvivogenerationoffullymaturehumanredbloodcellsfromhematopoieticstemcells）Nat.Biotechnol，2005,23(1):69-74）。

但是用基质细胞支持培养显然难以在体外大规模生产红细胞，以达到临床应用的水平，因此建立完全悬浮的液体培养体系来扩增成熟的红细胞是按照GMP标准生产红细胞的必然要求。Miharada等建立了一种四步液体培养方法从脐血CD34⁺细胞中扩增成熟红细胞，在这四个步骤中分别添加不同的细胞因子，但是不用任何滋养层细胞，结果使细胞的总扩增倍数达到6×10⁵，其中GPA⁺细胞（代表晚幼红细胞和成熟红细胞）占93.6％，去核的红细胞占50.0%（MiharadaK,HiroyamaT,SudoK等，造血干祖细胞经过体外分化形成的幼红细胞的有效脱核（Efficientenucleationoferythroblastsdifferentiatedinvitrofromhematopoieticstemandprogenitorcells），NatBiotechnol,2006,24:1255-1256）。另外一个试验小组利用SCF、EPO、IGF-1和类固醇激素刺激，也从外周动员（G-CSF刺激从外周血中分离）的CD34⁺细胞中扩增出了去核的红细胞，但是这种方法只能使细胞扩增几十倍，并且其中去核的红细胞只占细胞总数的48.8%（DornI,Lazar-KarstenP,BoieS,RibbatJ等，利用两种不同的细胞培养体系将外周血来源的人CD34⁺细胞在体外增殖和分化成成熟红细胞（InvitroproliferationanddifferentiationofhumanCD34⁺cellsfromperipheralbloodintomutureredbloodcellswithtwodifferentcellculturesystems），Transfusion,2008,48:1122-1132.）。从这些结果来看，目前所建立的液体培养体系无论是从细胞扩增倍数还是成熟红细胞所占比例都还无法达到支持培养体系的扩增效果。

到目前为止，人们利用了多种干细胞或祖细胞进行体外培养，试图能够大规模地生产红细胞，其中包括脐血、骨髓来源的和外周动员的CD34⁺细胞以及人胚胎干细胞，但是人们较少关注外周血来源的造血干/祖细胞，因为人们认为外周血来源的造血干/祖细胞增殖能力较弱，并且其中所含的CD34⁺细胞比例较低。然而，BoehmD等人研究发现，外周血来源的CD34⁺细胞在无基质细胞支持的培养体系中可以扩增1.5×10⁶倍，与脐血来源的CD34⁺细胞所达到的扩增效果相似。这说明外周血来源的CD34⁺细胞的增殖能力也是很强的（BoehmD，MurphyWG和Al-RubeaiM，人外周血来源的CD34⁺细胞用于体外生产红细胞的潜能（ThepotentialofhumanperipheralbloodderivedCD34+cellsforexvivoredbloodcellproduction），JBiotechnol.2009;144(2):127-134）。

由于外周血单个核细胞中CD34⁺细胞的含量确实很低，约为0.1%，并且从中分离CD34⁺细胞作为生产红细胞的起始材料，不仅费事费力，而且会额外增加许多成本，因此亟需一种原材料来源丰富且制备方法简便的红细胞生产方法。

发明内容

发明人通过大量的实验摸索，终于找到一种利用单个核细胞作为起始材料直接制备红细胞的方法，这样既可以利用血液处理时剩余的部分作为原材料，又可以省去分离CD34⁺细胞的步骤。本发明基于以上发现而完成。

本发明第一方面涉及一种制备成熟红细胞的方法，所述方法包括利用单个核细胞经过体外培养制备成熟红细胞的步骤。

根据本发明第一方面的方法，其中所述单个核细胞来自脐血或外周血；可以利用脐血或外周血的全血直接分离得到单个核细胞，也可以从脐血或外周血中分离出白膜层后再从白膜层制备得到单个核细胞。在本发明的一个实施方案中，所述单个核细胞来自脐血全血；在本发明的另一个实施方案中，所述单个核细胞来自外周血的白膜层。

在本发明的实施方案中，其中所述单个核细胞是根据血液中细胞的密度不同分离得到的。

在本发明的实施方案中，所述单个核细胞经过红细胞分化培养基和红细胞脱核培养基的培养得到成熟红细胞。

本发明第二方面涉及一种制备成熟红细胞的方法，其包括以下步骤：

a）取脐血或外周血，分离得到单个核细胞；

b）将步骤a）得到的单个核细胞接种到红细胞分化培养基中，添加羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3和红细胞生成素，培养8-11天；优选地，每3-5天（例如4天）将细胞转移到新鲜的上述培养基中继续培养；

c）收集步骤b）中的细胞，接种到红细胞分化培养基中，添加红细胞生成素，继续培养3-5天；

d）收集步骤c）中的细胞，用红细胞脱核培养基继续培养7-10天，即得到成熟红细胞；优选地，每3-5天（例如4天）将细胞转移到新鲜的培养基中继续培养。

根据本发明第二方面的方法，其中步骤a）中的单个核细胞可以利用脐血或外周血的全血直接分离得到，也可以从脐血或外周血中分离出白膜层后再从白膜层制备得到。在本发明的一个实施方案中，所述单个核细胞来自脐血全血；在本发明的另一个实施方案中，所述单个核细胞来自外周血的白膜层。

在本发明的实施方案中，其中所述单个核细胞是根据血液中细胞的密度不同分离得到的。根据本发明第二方面的方法，其中所述细胞因子的使用浓度为干细胞因子20-200ng/ml、白细胞介素3为5-20ng/mL和/或红细胞生成素2-10IU/mL。

根据本发明第二方面的方法，其中羟皮质激素的使用浓度为细胞诱导培养时的常用浓度，在本发明的一个实施方案中，羟皮质激素的使用浓度为10^-6M。

在本发明的实施方案中，所述干细胞因子的浓度为50-200ng/ml，例如为50、100、200ng/ml；所述白细胞介素3的浓度为5-20ng/mL，例如为5、10、20ng/ml；所述红细胞生成素的浓度为3-10IU/mL，例如为3、5、10IU/mL。

本发明第三方面涉及一种制备成熟红细胞的方法，其包括以下步骤：

a）取脐血或外周血，分离得到单个核细胞；

b）将步骤a）得到的单个核细胞接种到红细胞分化培养基中，添加羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3、红细胞生成素、骨形成蛋白4、白细胞介素11和FMS样酪氨酸激酶3配基，培养5～9天（例如7天）；优选地，每3-5天（例如4天）将细胞转移到新鲜的培养基中继续培养；

c）收集步骤b）中的细胞，接种到红细胞分化培养基中，添加羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3、红细胞生成素、骨形成蛋白4、白细胞介素11和胰岛素样生长因子1，继续培养5～9天（例如7天）；优选地，每2-3天将细胞转移到新鲜的培养基中继续培养，使细胞浓度保持在1×10⁶/ml以下；

d）收集步骤c）中的细胞，接种到红细胞分化培养基中，添加红细胞生成素，继续培养3～5天；

e）收集步骤d）中的细胞，用红细胞脱核培养基继续培养7-10天，即得到成熟红细胞；优选地，每3-5天（例如4天）将细胞转移到新鲜的培养基中继续培养。

根据本发明第三方面的方法，其中步骤a）中的单个核细胞可以利用脐血或外周血的全血直接分离得到，也可以从脐血或外周血中分离出白膜层后再从白膜层制备得到。在本发明的一个实施方案中，所述单个核细胞来自脐血全血；在本发明的另一个实施方案中，所述单个核细胞来自外周血的白膜层。

在本发明的实施方案中，其中所述单个核细胞是根据血液中细胞的密度不同分离得到的。

根据本发明第三方面的方法，其中所述细胞因子的使用浓度为干细胞因子20-200ng/ml、白细胞介素3为5-20ng/mL和/或红细胞生成素2-10IU/mL。在本发明的实施方案中，所述干细胞因子的浓度为50-200ng/ml，例如为50、100、200ng/ml；所述白细胞介素3的浓度为5-20ng/mL，例如为5、10、20ng/ml；所述红细胞生成素的浓度为3-10IU/mL，例如为3、5、10IU/mL。

根据本发明第三方面的方法，其中步骤b）所述细胞因子的使用浓度为：2-20ng/mL骨形成蛋白4、5-20ng/mL白细胞介素11和/或20-100ng/mLFlt3配基。在本发明的实施方案中，所述骨形成蛋白4的浓度为5-20ng/ml，例如为5、10、20ng/ml；所述白细胞介素11的浓度为5-20ng/mL，例如为5、10、20ng/ml；所述Flt3配基的浓度为20-100ng/ml，例如为20、40、100ng/ml。

根据本发明第三方面的方法，其中步骤c）所述细胞因子的使用浓度为：5-20ng/mL骨形成蛋白4、5-20ng/mL白细胞介素11和/或20-200ng/mL胰岛素样生长因子1。在本发明的实施方案中，所述骨形成蛋白4的浓度为5-20ng/ml，例如为5、10、20ng/ml；所述白细胞介素11的浓度为5-20ng/mL，例如为5、10、20ng/ml；所述胰岛素样生长因子1的浓度为20-200ng/mL，例如为20、40、100、200ng/ml。

根据本发明第三方面的方法，其中羟皮质激素的使用浓度为细胞诱导培养时的常用浓度，在本发明的一个实施方案中，羟皮质激素的使用浓度为10^-6M。

本发明第四方面涉及根据本发明第一至第三方面任一项所述方法制备得到的成熟红细胞。

在本发明的实施方案中，所述成熟红细胞的平均细胞体积（MCV）为108～123fl；在本发明的实施方案中，所述成熟红细胞的平均血红蛋白含量（MCH）为31～37pg；在本发明的实施方案中，所述成熟红细胞的最大变形指数（DI_max）为0.42～0.48；在本发明的实施方案中，所述成熟红细胞的葡萄糖6磷酸脱氢酶的含量为31～36U/gHb；在本发明的实施方案中，所述成熟红细胞的丙酮酸激酶含量为69～80U/gHb。

本发明第五方面涉及血液中的单个核细胞在制备成熟红细胞中的用途。

根据本发明第五方面的用途，其中的单个核细胞可以利用脐血或外周血的全血直接分离得到，也可以从脐血或外周血中分离出白膜层后再从白膜层制备得到。在本发明的一个实施方案中，所述单个核细胞来自脐血全血；在本发明的另一个实施方案中，所述单个核细胞来自外周血的白膜层。

在本发明的实施方案中，所述单个核细胞是根据血液中细胞的密度不同分离提到的。

本发明第六方面涉及细胞因子组合物，其包含羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3和红细胞生成素；优选地，其还包含骨形成蛋白4、白细胞介素11和FMS样酪氨酸激酶3配基，或者优选地，其还包含骨形成蛋白4、白细胞介素11和胰岛素样生长因子1。

在本发明的一个实施方案中，所述细胞因子组合物由羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3和红细胞生成素组成；在本发明的另一个实施方案中，所述细胞因子组合物由羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3、红细胞生成素、骨形成蛋白4、白细胞介素11和FMS样酪氨酸激酶3配基组成；在本发明的另一个实施方案中，所述细胞因子组合物由羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3、红细胞生成素、骨形成蛋白4、白细胞介素11和胰岛素样生长因子1组成。

本发明还涉及本发明第六方面任一项的细胞因子组合物在由单个核细胞制备成熟红细胞中的用途。

以下对本发明做进一步描述。

术语“单个核细胞”在本文中是指血液中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞，也包括造血干细胞和祖细胞。可以用本领域常用的方法制备单个核细胞，例如，可通过红细胞裂解液（由790mg/L的碳酸氢铵和7.7g/L的氯化铵混合而成）裂解红细胞以分离单个核细胞。在本发明中，单个核细胞是根据血液中细胞的密度不同分离得到的。其可以利用脐血或外周血的全血直接分离得到，也可以从脐血或外周血中分离出白膜层后再从白膜层制备得到。在本发明的一个实施方案中，所述单个核细胞来自脐血全血；在本发明的另一个实施方案中，所述单个核细胞来自外周血的白膜层。通过分离白膜层，可分离出浓缩红细胞和血浆以用于成分输血。

在本发明的实施方案中，分离方法是Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状（buffycoat），吸取该层细胞递经洗涤离心重悬可获得单个核细胞。在本发明的实施方案中，取外周血白膜层细胞或脐血全血用磷酸盐缓冲液稀释，然后用淋巴细胞分离液分离，吸取单个核细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，即得到单个核细胞。

术语“造血干细胞”是指造血干细胞是指骨髓中的干细胞，具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，它们也可以分化成各种其他细胞。造血干细胞有两个重要特征：其一，高度的自我更新或自我复制能力；其二，可分化成所有类型的血细胞。

术语“祖细胞”是指在一定的微环境和某些因素的调节下，增殖分化为各类血细胞的祖细胞，也称为造血祖细胞（hematopoieticprogenitorcells,HPCs），它也是一种相当原始的具有增殖能力的细胞，但已失去多向分化能力，只能向一个或几个血细胞系定向增殖分化，故也称定向干细胞（committedstemcell）。例如包括红细胞系造血祖细胞、中性粒细胞-巨噬细胞系造血祖细胞或巨核细胞系造血祖细胞。

术语“白膜层”在本文中是指抗凝血经过自然沉降、离心或密度梯度离心后形成的一个组分，主要由白细胞和血小板组成。抗凝血经过离心以后会形成上层的血浆、下层的红细胞以及二者之间薄薄的一层白色膜状物，约占血液总体积的1%，被称为白膜层。

术语“脐血”在本文中是指胎儿出生后留在胎盘和脐带中的血液，其中富含造血干细胞和祖细胞。

术语“成熟红细胞”在本文中是指血液中数量最多的一种血细胞，同时也是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介，同时还具有免疫功能。成熟的红细胞是无核的，这意味着它们失去了DNA。红细胞也没有线粒体，它们通过葡萄糖合成能量。

术语“干细胞因子”在本文中是指原癌基因c-kit表达产物的配体，主要由骨髓基质细胞产生，体内存在分泌型和跨膜型两种形式。有活性的干细胞因子为同源二聚体，可刺激干细胞分化为不同谱系血细胞，并刺激肥大细胞增殖。

术语“白细胞介素3”在本文中是指由活化的CD4⁺T细胞产生的一种细胞因子，其主要作用为促进骨髓中多能造血干细胞的定向分化与增殖，产生各种类型的血细胞。

术语“红细胞生成素”在本文中是指由骨髓中红细胞前体细胞分泌的一种细胞因子。在人体环境中，它由肝脏和肾产生，是调节红细胞生成数量的最重要细胞因子，它可以阻止红系祖细胞凋亡并诱导其进行有丝分裂，因此可以加速红系祖细胞的增殖，大大提高红细胞的生成数量。

术语“淋巴细胞分离液”可为本领域公知的淋巴细胞分离液，例如可以是HISTOPAQUE-1077（Sigma公司）。在本领域中，淋巴细胞分离液的成分是一致的，如在本发明的实施方案中是指由葡聚糖和泛影葡胺组成的混合物，是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，其密度为1.13。

术语“红细胞分化培养基”是指有利于造血干细胞和祖细胞的增殖和向红细胞分化的培养基，其可按照本领域的常规配方和方法制备。在本文中是指由无血清培养基、胎牛血清和各种小分子组成的用于培养红细胞的一种培养基。其中无血清培养基为适合造血细胞培养的无血清培养基，例如可以为StemSpanSFEM（StemcellTechnologiesInc.）、LONZAX-VIVO15（Lonza）或SFM（LifeTechnologies）。其中的小分子例如可包括生育酚、亚油酸、胆固醇、离子饱和的人转铁蛋白、重组人胰岛素、乙醇胺、二巯基乙醇、肝素钠、柠檬酸亚铁、维生素C、谷氨酰胺，在本发明的实施方案中，所述小分子包括生育酚、亚油酸、胆固醇、离子饱和的人转铁蛋白、重组人胰岛素、乙醇胺、二巯基乙醇。

术语“红细胞脱核培养基”是指有利于晚期幼红细胞向成熟红细胞分化并完成脱核过程的培养基，其可按照本领域的常规配方和方法制备。在本文中是指由IMDM、胎牛血清和各种小分子组成的用于培养红细胞的一种培养基。其中的IMDM可用本领域其它常用培养基替代，例如alpha-MEM或DMEM，其中的小分子例如可包括腺苷、D-甘露糖、磷酸氢二钠、米非司酮、硫代甘油、PluronicF68（Sigma公司）、肝素钠，在本发明的实施方案中，所述小分子包括腺苷、D-甘露糖、磷酸氢二钠和米非司酮。

在本发明中，“浓度”或“使用浓度”通常是指该细胞因子的终浓度。

在本发明中，各阶段细胞培养的密度通常应维持在1×10⁶/ml以下，以保证细胞的正常生长。

在本发明中，制备得到的成熟红细胞可进行形态、结构和功能鉴定，例如包括细胞离心涂片染色，荧光抗体染色流式细胞仪分析、血红蛋白含量测定、葡萄糖6磷酸脱氢酶和丙酮酸激酶含量测定等。

发明的有益效果

本发明直接利用血液中的单个核细胞制备得到成熟红细胞，该方法具有以下优点：1）可利用血液处理后的剩余部分作为单个核细胞的来源，充分利用了废弃物；2）省去了纯化CD34⁺细胞的步骤，不仅可以节约成本，而且可以避免因纯化而导致的CD34⁺细胞丢失；3）红细胞的得率较高，按照初始单个核细胞数计算，得到的成熟红细胞数增加约1000倍左右，由于外周血单个核细胞中CD34⁺细胞的含量很低（约0.1%），因此相当于扩增倍数达到了10⁶。

附图说明

图1为外周血单个核细胞生产红细胞的细胞生长曲线；

图2为外周血单个核细胞体外扩增过程中的活细胞形态（400×）；

图3为不同培养天数时细胞的形态学特征和去核过程（1000×Wrights-Giemsa染色）；

图4为红系细胞的不同发育阶段（Pro-E:原幼红细胞；Baso-E:嗜碱性幼红细胞；Poly-E:多染幼红细胞；Ortho-E:正染幼红细胞；Enucleated:去核红细胞）；

图5为不同天数的培养物中处于各个发育阶段的红系细胞所占的比例；

图6为FACS分析细胞的分化及去核过程；其中A为不同培养天数的细胞中红系细胞的比例变化（anti-glycophorinA抗体阳性）；B为细胞去核阶段去核细胞的比例变化（anti-glycophorinA抗体阳性且Sytodye16阴性）；

图7为细胞培养过程中集落形成细胞所占比例的变化；

图8为外周血单个核细胞增殖分化过程中的红系祖细胞增殖曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：红细胞分化培养基的配制

配制100mL红细胞分化培养基需要如下成分：

实施例2：红细胞脱核培养基的配制

配制100mL红细胞脱核培养基需要如下成分：

成分	储存液浓度	终浓度	体积（ml）
				IMDM（Invitrogen）			93.4
胎牛血清		0.5%	0.5
				腺苷	0.14g/ml	0.14mg/ml	0.1
D-甘露糖	1.457g/ml	14.57mg/ml	1
				磷酸氢二钠	0.94g/ml	0.94mg/ml	0.1
米非司酮	1mM	1μM	0.1

实施例3：外周血单个核细胞的分离

外周血用EDTA抗凝，取抗凝血，800g离心20分钟后可分为三层，分别为上层血清、下层红细胞和中间的白膜层，取出其中的白膜层用于分离单个核细胞。外周血滤白后的白膜层用1×PBS（pH=7.4，下同）按1:1稀释，然后小心地铺在淋巴细胞分离液Histopaque^TM（Sigma,cat#10771）上（体积比为1:1），2500rpm离心30分钟，用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。转移到另一试管中，加入5倍体积的1×PBS，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次，重悬细胞，即为单个核细胞悬液。

实施例:4：脐血单个核细胞的分离

抗凝脐血用于分离单个核细胞。脐血用1×PBS（pH=7.4，下同）按1:1稀释，然后小心地铺在淋巴细胞分离液Histopaque^TM（Sigma,cat#10771）上（体积比为1:1），2500rpm离心30分钟，用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。转移到另一试管中，加入5倍体积的1×PBS，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次，重悬细胞，即为单个核细胞悬液。

实施例5：利用外周血单个核细胞生产红细胞

1×10⁶/ml单个核细胞（利用实施例3方法制备）用红细胞分化培养基培养，添加的细胞因子为10^-6M羟皮质激素（Ca#:H0135，Sigma）、100ng/ml干细胞因子（Ca#PHC2116，Biosource），10ng/ml白细胞介素3（Ca#PHC0031，Biosource），和5IU/ml红细胞生成素（Ca#PHC2054，Invitrgen），5%CO₂、37℃培养8天；在第4天时，一份细胞培养物稀释到4份含上述细胞因子的新鲜红细胞分化培养基培养基中继续培养；第8天时，用红细胞分化培养基培养基将细胞稀释成5×10⁴/ml的浓度，添加的细胞因子为5IU/ml红细胞生成素，5%CO₂、37℃培养3天；在第11天时，用脱核培养基将细胞稀释成2×10⁵/ml的浓度，不添加任何细胞因子，5%CO₂、37℃培养10天，每4天换液一次，培养结束时收获细胞，磷酸盐缓冲液1×PBS（pH=7.4）洗涤两次，细胞用于形态、结构和功能鉴定。

实施例6：利用外周血单个核细胞生产红细胞

将2×10⁵/ml外周血单个核细胞（PBMNCs）接种到红细胞分化培养基中，添加的细胞因子包括10^-6M羟皮质激素、100ng/ml干细胞因子、40ng/mlFMS样酪氨酸激酶3配基（fms-liketyrosinekinase3ligand,Flt3-L，Ca#PHC9411，Biosource）、10ng/ml骨形成蛋白4（BoneMorphogeneticprotein-4，BMP4，Ca#PHC9534，Biosource）、10ng/mLIL-3、10ng/mlIL-11（Ca#PHC0115，Biosource）和5U/ml红细胞生成素（Erythropoietin，EPO，）。第四天是更换新鲜红细胞分化培养基，添加的细胞因子相同。第二步（8-14天），细胞在包含10^-6M羟皮质激素、100ng/3mlSCF、40ng/ml胰岛素样生长因子1（Insulin-likegrowthfactor1，IGF-1，Ca#PHG0071，10ng/mlBMP4、10ng/mLIL-3、10ng/mlIL-11和5U/mlEPO的红细胞分化培养基中培养，每2-3天更换一次培养基，使细胞浓度保持在10⁶/ml以下。第三步（15-17天），更换新鲜培养基，培养基为包含5IU/mlEPO的红细胞分化培养基。第四步（18-24天），细胞继续培养，培养基为不添加任何细胞因子的脱核培养基。培养结束时收获细胞，磷酸盐缓冲液1×PBS（pH=7.4）洗涤两次，细胞用于形态、结构和功能鉴定。图1为外周血单个核细胞生产红细胞的细胞生长曲线，图2为外周血单个核细胞体外扩增过程中的活细胞形态（400×）。可以看出，外周血单个核细胞随着培养天数的增加，细胞快速增殖，在第4步结束时细胞绝对数增加966±1002倍，从9×10⁵个细胞扩增出6.9±7.1×10⁸个细胞。并且开始接种的单个核细胞类似于淋巴细胞，经过培养以后，其中的成熟细胞（如淋巴细胞，单核细胞，粒细胞等）会逐渐死亡，而祖细胞会存活下来并逐渐扩增，在第3天时大部分细胞都已经死亡，到第5天时可见大的细胞出现，这些细胞就是存活下来的祖细胞增殖而成的，到第8天时培养物中基本上都是这种大细胞，并且细胞数快速升高。这些结果都说明利用外周血单个核细胞可以扩增出大量红细胞。

实施例7不同细胞因子组合对外周血单个核细胞生产红细胞扩增倍数的影响

表1不同细胞因子组合对红细胞扩增倍数的影响

其中扩增倍数=培养结束时的细胞总数/开始接种的细胞数

实施例8：细胞形态学分析：

为了监测外周血单个核细胞增殖分化过程中的形态学变化，取按照实施例6方法培养得到的各阶段（第7、14、17、20和24天）细胞离心涂片，然后用Hema3system（FisherScientificCompanyL.L.C.，Cat#122-911）染色，按厂家的说明书操作，显微镜下观察并拍照，结果如图3-图5所示。图3为不同培养天数时细胞的形态学特征和去核过程（1000×；Wrights-Giemsa染色）。图4为红系细胞的不同发育阶段（Pro-E:原幼红细胞；Baso-E:嗜碱性幼红细胞；Poly-E:多染幼红细胞；Ortho-E:正染幼红细胞；Enucleated:去核红细胞）。图5为不同天数的培养物中处于各个发育阶段的红系细胞所占的比例。

可以看出，随着培养天数的增加，细胞从原幼红细胞（Proerythroblast）向嗜碱性幼红细胞（Basophilicerythroblast）、多染幼红细胞（Polychromaticerythroblast）、正染幼红细胞（Orthochromaticerythroblast）分化，最后大多数细胞分化成去核的红细胞，其形态与正常红细胞相似。根据细胞图片对各种细胞进行分类计数，结果显示在第7天时，约有13%的细胞是原幼红细胞，而到第14天时，约90%的细胞为嗜碱性幼红细胞，随着细胞的进一步分化，到第20天时大部分细胞变成正染幼红细胞和去核红细胞（约40%），而到培养结束时，去核红细胞的比例达到约89%。这些结果说明通过四步培养，外周血单个核细胞中的祖细胞可以增殖分化成成熟红细胞，并且达到较高的去核比例。

实施例9：FACS分析：

收获按照实施例6方法培养得到的各阶段细胞后用1×PBS/2%FBS洗涤一次，然后重悬到100μl1×PBS/2%FBS中，添加1μl1:100稀释的（Invitrogen，Cat#S7578，用于染色有核细胞）和血型糖蛋白A抗体（anti-glycophorinA-PE，eBioscience，Cat#12-9987-82，用于染色红系细胞），4℃孵育20分钟，然后用1×PBS/2%FBS洗涤两次，重悬到500μlPBS/2%FBS中，FACS分析。

血型糖蛋白A（glycophorinA）是较成熟红系细胞的标志物，首先出现在嗜碱性幼红细胞阶段，其表达水平随着细胞的成熟而逐渐升高。可以利用抗血型糖蛋白A的抗体染色不同培养天数的细胞，然后通过FACS来分析单个核细胞向红系细胞的分化情况，结果如图6所示。图6为FACS分析细胞的分化及去核过程，其中图6A为不同培养天数的细胞中红系细胞的比例变化（anti-glycophorinA抗体阳性）。可以看出，随着培养天数的增加，血型糖蛋白A阳性细胞所占百分比不断提高，到17天时几乎100%的细胞都是血型糖蛋白A阳性的，这说明培养物中的绝大多数细胞已经分化成红系细胞。

利用（该染料可与DNA结合，发绿色荧光，用于染色有核细胞）和血型糖蛋白A抗体染色，通过FACS来分析去核细胞所占的比例，血型糖蛋白A阳性的红系细胞中染色阴性的为去核红细胞。从图6B中可以看出，在第17天时，只有少量细胞是无核的，但是随着细胞的进一步成熟，无核细胞的比例迅速升高，到第21天时达到约60%，而到培养结束时的第24天，无核细胞的比例可达90%左右。

实施例10：克隆形成分析

为了分析单个核细胞在增殖分化过程中祖细胞的含量变化，取第0、4、7、10和14天的细胞，分别取按照实施例6方法培养0、4、7、10和14天的细胞分析其形成CFU-E（红系集落形成细胞）、BFU-E（爆式集落形成细胞）和CFU-GM（粒细胞巨噬细胞集落生成单位）的能力，培养基为（Ca#04034，StemCellTechnologies），按照StemCellTechnologies提供的说明书进行操作。图7为细胞培养过程中集落形成细胞所占比例的变化；图8为外周血单个核细胞增殖分化过程中的红系祖细胞增殖曲线。

结果发现整个培养过程中细胞只能形成CFU-E和BFU-E，而没有CFU-GM集落形成，这说明我们的培养体系只是促使细胞向红系方向分化。随着培养天数的增加，CFU-E的数目逐渐增多，而BFU-E的数目在第7天时达到峰值，然后逐渐下降，说明这些BFU-E祖细胞逐渐分化成CFU-E细胞。

实施例11：红细胞结构和功能鉴定

取培养结束时得到的红细胞，利用红细胞计数仪测定平均细胞体积（MCV）、平均血红蛋白含量（MCH）。红细胞悬浮于4%聚乙烯吡咯烷酮溶液中，然后逐渐增加溶液的渗透压（从60到450mosm），记录其激光衍射模式，根据其检测值可得到变形指数（DI）。参考文献报道（GiarratanaMC,KobariL,LapillonneH,etal.Exvivogenerationoffullymaturehumanredbloodcellsfromhematopoieticstemcells.Nat.Biotechnol.2005;23(1):69-74.）的方法，通过分光光度法测定红细胞葡萄糖6磷酸脱氢酶和丙酮酸激酶的水平。不同细胞因子组合生产的红细胞结构和功能鉴定结果见表2。

表2不同细胞因子组合生产的红细胞结构和功能鉴定结果

利用细胞因子组合5培养红细胞时，培养24天后得到的红细胞的平均细胞体积（MCV）为118±4fl（正常红细胞为80-100fl），说明得到的红细胞体积稍大。平均血红蛋白含量（MCH）为36±1.2pg（正常值为27-31pg），比正常的红细胞水平稍高。红细胞的最大变形指数（DI_max）为0.46，接近正常红细胞水平。葡萄糖6磷酸脱氢酶的含量为35±3U/gHb，丙酮酸激酶的含量为75±6U/gHb，说明这些细胞与年轻红细胞的特性一致，能够还原谷胱甘肽，维持ATP的水平，避免2,3-DPG积聚，而2,3-DPG的积聚会降低血红蛋白的配基亲和力。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (7)

1.一种制备成熟红细胞的方法，其包括以下步骤：

a)取脐血或外周血，分离得到单个核细胞；

b)将步骤a)得到的单个核细胞接种到红细胞分化培养基中，添加羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3和红细胞生成素，培养8-11天；

c)收集步骤b)中的细胞，接种到红细胞分化培养基中，添加红细胞生成素，继续培养3-5天；

d)收集步骤c)中的细胞，用红细胞脱核培养基继续培养7-10天，即得到成熟红细胞；

其中所述干细胞因子的使用浓度为50-200ng/ml、白细胞介素3的使用浓度为5-20ng/mL，红细胞生成素的使用浓度为3-10IU/mL。

2.一种制备成熟红细胞的方法，其包括以下步骤：

a)取脐血或外周血，分离得到单个核细胞；

b)将步骤a)得到的单个核细胞接种到红细胞分化培养基中，添加羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3、红细胞生成素、骨形成蛋白4、白细胞介素11和FMS样酪氨酸激酶3配基，培养5～9天，其中所述干细胞因子的使用浓度为50-200ng/ml、白细胞介素3的使用浓度为5-20ng/mL，红细胞生成素的使用浓度为3-10IU/mL，骨形成蛋白4的使用浓度为5-20ng/mL、白细胞介素11的使用浓度为5-20ng/mL，Flt3配基的使用浓度为20-100ng/mL；

c)收集步骤b)中的细胞，接种到红细胞分化培养基中，添加羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3、红细胞生成素、骨形成蛋白4、白细胞介素11和胰岛素样生长因子1，继续培养5～9天，其中所述干细胞因子的使用浓度为50-200ng/ml、白细胞介素3的使用浓度为5-20ng/mL，红细胞生成素的使用浓度为3-10IU/mL，骨形成蛋白4的使用浓度为5-20ng/mL、白细胞介素11的使用浓度为5-20ng/mL，胰岛素样生长因子1的使用浓度为20-200ng/mL；

d)收集步骤c)中的细胞，接种到红细胞分化培养基中，添加红细胞生成素，继续培养3～5天，其中所述红细胞生成素的使用浓度为3-10IU/mL；

e)收集步骤d)中的细胞，用红细胞脱核培养基继续培养7-10天，即得到成熟红细胞。

3.权利要求1或2的方法，其中步骤a)中是从脐血或外周血的白膜层分离得到单个核细胞。

4.根据权利要求1-3任一项所述方法制备得到的成熟红细胞。

5.细胞因子组合物在由单个核细胞制备成熟红细胞中的用途，其中所述细胞因子组合物包含羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3和红细胞生成素，所述干细胞因子的使用浓度为50-200ng/ml、白细胞介素3的使用浓度为5-20ng/mL，红细胞生成素的使用浓度为3-10IU/mL。

6.权利要求5的用途，其中所述细胞因子组合物还包含骨形成蛋白4、白细胞介素11和FMS样酪氨酸激酶3配基，所述骨形成蛋白4的使用浓度为5-20ng/mL、白细胞介素11的使用浓度为5-20ng/mL，Flt3配基的使用浓度为20-100ng/mL。

7.权利要求5的用途，其中所述细胞因子组合物还包含骨形成蛋白4、白细胞介素11和胰岛素样生长因子1，所述骨形成蛋白4的使用浓度为5-20ng/mL、白细胞介素11的使用浓度为5-20ng/mL，胰岛素样生长因子1的使用浓度为20-200ng/mL。