CN110982779B - 一种提高脐带血利用率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种提高脐带血利用率的方法，所述包括以下步骤：(1)淋巴细胞分离液(ficoll)分离脐带血；(2)提取单个核细胞：脐带血在淋巴细胞分离液离心后，取体积比例为70～95％的白膜层上层液体分离单个核细胞；(3)制备内皮祖细胞外泌体：取剩下的白膜层液体，通过贴壁培养得到原代内皮祖细胞；分离的单个核细胞可诱导分化为巨核祖细胞，内皮祖细胞扩增培养后可进一步制备内皮祖细胞外泌体；本发明的制备方法可以充分利用同一份脐带血资源，制备过程简单可靠，重复性好，不易受污染，兼顾了制备成本的经济性和操作安全性，对临床治疗有积极意义，具有重要的应用价值。

Description

一种提高脐带血利用率的方法
技术领域
本发明属于细胞生物学、分子生物学及药物研发技术领域，具体涉及提高脐带血利用率的方法。
背景技术
脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在脐静脉中的血液，1970s的研究发现，脐带血中含有丰富的造血干细胞，可以重建人体造血和免疫系统，1989年世界首例脐带血造血干细胞移植成功后，各国科学家经过30年的探索和发展，目前脐带血可以治疗80多种疾病。因此，脐带血造血干细胞已成为重要的生物医学资源，相对于骨髓造血干细胞，脐带血造血干细胞对供者无创，免疫原性低，而且是实体储存，不会产生悔捐等严重影响临床治疗的情况，因此具有巨大的医学价值。但目前同一份脐带血，通常用于单一制备用途，如MKPC或者MNC或者整份进行移植等，利用率低，远不能满足日益多样的临床治疗需求。
由于脐带血造血干细胞可以构建血液细胞的全体系，因此深入挖掘不同细胞的差异，进行分别诱导区别培养等综合利用，从而更充分利用脐带血这一宝贵的生物医学资源，更充分地转化为临床治疗的有效制剂，有直接的医学意义。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足之处而提供一种提高脐带血利用率的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种提高脐带血利用率的方法，包括以下步骤：
(1)脐带血处理：取脐带血，加入淋巴细胞分离液进行离心分离；
(2)提取单个核细胞：取体积为白膜层70～95％的白膜层上层液体，离心分离得到其中的单个核细胞；
(3)制备内皮祖细胞：取剩下的分层液，离心后收集其中的细胞，重悬于内皮祖细胞培养基中，进行原代培养得到内皮祖细胞。
Ficoll是蔗糖的多聚体，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/mL仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜，Ficoll密度梯度离心法，可用来分离人脐带血单个核细胞(MNC)，脐带血MNC含有脐带血造血干细胞(HSC)等丰富的干/祖细胞。红细胞离心后沉于管底；淋巴细胞以及其他单个核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后位于分层液的液面上，形成白膜层，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取白膜层的细胞，就可分离到单个核细胞。操作技术良好的状态下，抽取用于诱导培养的单个核细胞(MNC)的白膜层上层液体，极限值为95％。
在利用Ficoll分离制备单个核细胞时，为了避免提取体积混杂下层分层液体影响后续培养(单个核细胞分为悬浮细胞，下层分层液体的杂质成分会干扰悬浮细胞培养)，抽取白膜层时仅抽取白膜层的上层液体，不会抽取白膜层的全部液体，剩下的少量白膜层通常废弃；这对于宝贵的脐带血来说是一种浪费。本发明将这部分的通常被废弃的白膜层液体用于培养内皮祖细胞，有效增加了脐带血的综合利用的程度，对临床治疗提供了更大的支持。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)中取体积为白膜层70～80％的白膜层上层液体分离单个核细胞。
仅取白膜层总体积的70～80％即可有效分离单个核细胞，操作简便快捷，对精细程度要求不高，保证了批量生产过程的高效率。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(1)中脐带血处理的具体方法为：脐带血在采集后24小时内，轻缓地加到淋巴细胞分离液的液面上，所述脐带血与所述淋巴细胞分离液体积比为2：1，800g离心20分钟。
作为本发明的优选实施方式，将所述步骤(2)的单个核细胞分化为巨核祖细胞。
分离得到的单个核细胞为可用于分化为巨核祖细胞或其他类型的细胞。如果不需要直接进行分化培养，可加入细胞保护液，经程控降温冷冻于液氮中保存备用；所述的细胞保护液为含有体积百分比为55％二甲基亚砜(DMSO)和体积百分比为5％低分子右旋糖酐(Dextran)的注射用水溶液。使用冻存细胞时，取细胞解冻，加3倍左右体积生理盐水重悬洗涤，离心速度200g，离心8分钟，收集细胞沉淀，重悬于培养基中。
作为本发明的优选实施方式，所述巨核祖细胞的制备方法为：将所述单个核细胞接种于巨核祖细胞诱导培养基，连续培养7天，在第4天加入50％原始体积的巨核祖细胞诱导培养基。
作为本发明的优选实施方式，所述巨核祖细胞诱导培养基为Stemspan培养基，所述Stemspan培养基含有如下组分：15μmol/L白黎芦醇、20ng/mL IL-3、40ng/mL IL-6、50ng/mL SCF和40ng/mL TPO。
Stemspan培养基购于STEMCELL公司；所述的白藜芦醇的纯度≥99％，可溶于细胞保护液中，制备成溶液浓度为10mmol/L的储存液，4℃遮光保存。该条件的巨核祖细胞定向分化数量较高，可获得大量的巨核祖细胞。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)中内皮祖细胞的制备方法为：完全吸取剩余白膜层细胞，生理盐水混合清洗离心，600g离心4分钟，洗涤去除部分吸取时混入的红细胞，然后接种于内皮祖细胞原代培养基，连续培养四天，第五天更换培养基；以后每3天更换培养基，并观察内皮祖细胞集落的生长情况，单个集落的细胞数大于1000个，即进行传代培养。
步骤(2)后，剩余部分的白膜层液体与下层分层液体(主要是含有杂质细胞的ficoll)，比较容易混杂在一起，抽取的时候也很容易把下层分层液体中的红细胞一并吸取，这些成分在细胞培养体系中均为悬浮状态，因此对于悬浮培养的细胞如：巨核祖细胞、红系祖细胞、NK细胞等的培养是有负面作用，随着培养时间的延伸，杂质细胞凋亡后的细胞碎片等会严重影响悬浮细胞的培养。但由于内皮祖细胞是贴壁细胞，因此可通过后续培养过程中更换培养基从而去除这些杂质，而不影响内皮祖细胞生长。
优选地，取得的所述白膜层细胞在内皮祖细胞原代培养的初始接种密度为5×105个/mL；所述内皮祖细胞按1:6的比例进行传代。
作为本发明的优选实施方式，所述内皮祖细胞原代培养基为含有EGM-2MV的EBM培养基。
所述EBM培养基购于Lonza公司，EGM-2MV为购买培养基自带的添加物，使用时需要加至EBM培养基中。
作为本发明的优选实施方式，所述方法还包括步骤(4)制备内皮祖细胞外泌体：扩增培养步骤(3)的内皮祖细胞，收集并分离培养基中的内皮祖细胞外泌体。
EPC外泌体的分离可选用Thermo Fisher外泌体离心试剂盒进行提取。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(4)中内皮祖细胞外泌体的制备方法为：取传代培养至第四代的内皮祖细胞，继续培养24小时后加入IL-8并使其终浓度为12ng/mL，再培养72小时；收集培养基，通过超高速离心即得到所述内皮祖细胞外泌体。
由于干/祖细胞在培养传代过程中，其干/祖细胞特性会随着传代次数增加而衰减，即会分化为成体细胞，从而失去了干细胞的治疗作用，因此，理论上原代的干/祖细胞对于临床治疗是最有保障的，但是由于原代细胞的获得困难以及数量较少，不足以用于临床，所以综合细胞传代次数对干/祖细胞的特性的影响以及临床需要的数量，内皮祖细胞传代到P4进行外泌体提取最合理。
本发明的有益之处在于：
1、本发明组合物的制备方法可以充分利用同一份脐带血：脐带血来自于断脐后的脐静脉，因此体积较小，但含有丰富的造血干/祖细胞，可以治疗血液系统疾病、代谢性疾病等，替代骨髓移植成为临床治疗的重要生物资源，具有巨大的临床价值。通过本发明的操作，可以把脐带血中单个核细胞的大部分用于制备MKPC，剩下的小部分残留体积用于培养EPC和获得EPC外泌体。由于脐带血在淋巴细胞分离液处理后，会有部分体积混杂下层分层液体以及杂质细胞，如红细胞，这些悬浮成分对于同样是悬浮细胞的MKPC的培养有制约，但由于EPC是贴壁细胞，所以该部分体积可用于培养EPC，这对于充分利用脐带血资源有实质性意义。
2、按照常规方法，制备MKPC和EPC来源于不同的脐带血，那么这些细胞本身的免疫原性使有差别的，当临床使用时，患者自身的免疫系统同时会对两个来源的细胞制剂产生免疫反应，这对于患者是额外的健康负担。所以，本发明利用同一份脐带血同时制备的MKPC和EPC外泌体，获得的两种细胞制品其免疫原性一致，可以最大限度的减少患者免疫系统对外源细胞的免疫反应，对于临床治疗有实质性意义。
3、本发明的制备过程简单可靠，重复性好，不易受污染，兼顾了制备成本的经济性和操作安全性；本发明还进一步制备得到EPC的外泌体，所述EPC外泌体通过超高速离心等方法获得，更全面的利用生物资源，简便安全和高效；
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
作为本发明制备一种用于慢性出血辅助治疗的组合物的一种实施例，本实施例脐带血采自健康产妇孕婴，经检测乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋、巨细胞病毒、支原体、衣原体、G-6PD和地贫均为阴性；标本自采集到运回血库的运输温度保持在4～8℃，24小时内运输到脐带血库；按以下方法进行组合物制备：
(1)脐带血ficoll分离：
采集新鲜的脐带血，24小时内运输回广东省脐带血库，加到离心管内的淋巴细胞分离液上，脐带血和淋巴细胞分离液体积比为2:1，800g离心时间为20分钟。离心后去除上层血浆，采集中间富含单个核细胞的白膜层。
(2)制备单个核细胞：
取体积为白膜层70～95％的白膜层上层液体，加入生理盐水，30mL体积定容，600g离心4分钟，沉淀即为单个核细胞。
制备的单个核细胞可加入冻存液，冻存待用；或者直接诱导成多种不同类型的祖细胞。
(3)制备内皮祖细胞：
吸取剩余的白膜层液体，加入生理盐水，30mL定容，600g离心4分钟，洗涤去除部分吸取时混入的红细胞；将剩余的细胞用内皮祖细胞原代培养(含有EGM-2MV的EBM培养基)重悬细胞，并按5×105个/mL的密度接种于培养瓶/六孔板，放入培养箱培养，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。连续培养四天，第五天将六孔板中液体混匀，用巴氏吸管吸出培养基及不贴壁细胞等，重新加入2mL内皮祖细胞原代培养，放入培养箱继续培养。每3天更换等体积培养基，并观察内皮祖细胞集落的生长情况，单个集落的细胞数大于1000个，按1:6的比例传代培养。
对步骤(3)中的内皮祖细胞通过流式进行鉴定，结果如表1。
表1流式检测EPC的结果
Figure BDA0002335766610000061
(4)制备内皮祖细胞外泌体：
取传代培养至第四代的内皮祖细胞，继续培养24小时后加入IL-8并使其终浓度为12ng/mL，再培养72小时；收集培养基，通过超高速离心即得到所述内皮祖细胞外泌体。
实施例2制备巨核祖细胞
将步骤(2)分离的单个核心细胞重悬于巨核祖细胞诱导培养基(含有15μmol/L白黎芦醇、20ng/mL IL-3、40ng/mL IL-6、50ng/mL SCF和40ng/mL TPO的Stemspan培养基)，连续培养7天，在第4天加入50％原始体积的巨核祖细胞诱导培养基。培养条件为：37℃，二氧化碳浓度为5％。
对巨核祖细胞进行鉴定：
①巨核祖细胞的形态学分析及细胞计数：将培养的细胞在倒置显微镜观察细胞状态并拍照；
②流式细胞仪的表型测定：分别取培养后第7天，14天的细胞，进行CD41+和CD34+检测。
巨核祖细胞鉴定结果及细胞活性分析：
①倒置显微镜下观察接种后第1天的脐带血造血干细胞分化状况：倒置显微镜下观察接种后第1天的脐带血造血干细胞，细胞数量充足，呈分散状，形态比较单一，细胞胞体透亮且圆。
②倒置显微镜下观察接种后第7天的脐带血造血干细胞分化状况：与第1天相比，细胞数量略有变化，形态开始出现分化，当中的大部分为散状的造血干/祖细胞，小部分开始分化，聚集成簇，胞膜不清晰，排列紧密呈团块状，略呈粉红色。
流式细胞仪检测结果：CD41+细胞比例：5.22％。综上所述，有效扩增得到巨核祖细胞，操作过程简单、安全。
实施例3
以一份体积为120mL，TNC(总有核细胞数)为6*108个的脐带血作为制备基础，白膜层溶液按照8：2的提取比例进行MKPC和EPC培养，通过MKPC诱导分化培养基及EPC贴壁培养后，可获得MKPC 30*108个，以及P4代EPC6*108个，P4代EPC培养基中可提取的外泌体约为800μg。
实施例4
通过不同体积分配比例的脐带血白膜层进行MKPC和EPC培养，比较最终的MKPC和EPC以及EPC外泌体的获得数量。脐带血分3组，每组3份。结果下表2。
表2使用不同体积分配比例的脐带血白膜层的培养结果
MKPC/EPC比 7：3 8：2 9：1
脐带血平均体积(mL) 122.5 123.2 122.8
TNC(*10<sup>8</sup>) 6.02 6.01 6.01
获得MKPC(*10<sup>8</sup>) 24 30 31
获得EPC(*10<sup>8</sup>) 10.1 6.5 4.2
获得EPC外泌体(μg) 1340 810 500
*MKPC/EPC比指进行MKPC和EPC培养时所使用的白膜层体积比。
通过本发明方法能够获得数量充足的MKPC、EPC及EPC外泌体，充分利用了脐带血资源。当用于制备MKPC和EPC的白膜层溶液体积比为8:2时，MKPC与EPC的综合数量达到最大，且能获得数量较充足的外泌体。
所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种提高脐带血利用率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）脐带血分离处理：取脐带血，加入淋巴细胞分离液进行离心分离；
（2）提取单个核细胞：取体积为白膜层70~95%的白膜层上层液体，再离心分离得到其中的单个核细胞；
（3）制备内皮祖细胞：取剩下的白膜层分层液，收集其中的细胞，重悬于内皮祖细胞培养基中，进行原代培养得到内皮祖细胞；
所述步骤（3）中内皮祖细胞的制备方法为：将取得的白膜层细胞接种于内皮祖细胞原代培养基，连续培养四天，第五天更换培养基；以后每3天更换培养基，并观察内皮祖细胞集落的生长情况，单个集落的细胞数大于1000个，即进行传代培养；
所述内皮祖细胞原代培养基为含有EGM-2MV的EBM培养基。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中取体积为白膜层70~80%的白膜层上层液体分离单个核细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中脐带血处理的具体方法为：脐带血在采集后24小时内进行实验操作，轻缓地加到淋巴细胞分离液的液面上，所述脐带血与所述淋巴细胞分离液体积比为2：1，800g离心20分钟。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将所述步骤（2）的单个核细胞诱导培养，分化为巨核祖细胞；所述巨核祖细胞的制备方法为：将所述单个核细胞接种于巨核祖细胞诱导培养基，连续培养7天，在第4天加入50%原始体积的巨核祖细胞诱导培养基；
所述巨核祖细胞诱导培养基为Stemspan培养基，所述Stemspan培养基含有如下组分：15 μmol/L白黎芦醇、20 ng/mL IL-3、40 ng/mL IL-6、50 ng/mL SCF和40 ng/mL TPO。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤（4）制备内皮祖细胞外泌体：扩增培养步骤（3）的内皮祖细胞，收集培养基中的内皮祖细胞外泌体；
所述步骤（4）中内皮祖细胞外泌体的制备方法为：取传代培养至第四代的内皮祖细胞，继续培养24小时后加入IL-8并使其终浓度为12ng/mL，再培养72小时；收集培养基，通过超高速离心即得到所述内皮祖细胞外泌体。
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