CN108103018B - 一种富集人血液MNCs的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种富集人血液MNCs的方法，包括以下步骤：S1：采集血样本；S2：通过血样本离心后吸出富集单个核细胞MNCs；S3：富集MNCs利用密度梯度离心法分离得到MNCs。本发明有益效果：不仅能够减少铺管和移液操作量，而且能减少淋巴细胞分离液使用量，最终有效降低劳动强度和制备成本。

Description

一种富集人血液MNCs的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体来说，涉及一种富集人血液MNCs的方法。
背景技术
单个核细胞(Mononuclear cells，以下简称MNCs)是不分叶的单核细胞，一般指脐带血、胎盘血、骨髓、外周血中的淋巴细胞、单核巨噬细胞。事实上，血液中MNCs的成分十分复杂，不同组织来源的MNCs包含不同比例的造血干/祖细胞、间充质干细胞、神经前体细胞、内皮前体细胞、内皮细胞、多潜能干细胞、小胚胎样细胞等。因此，人血液MNCs在再生医学和组织工程领域的应用十分广阔。随着脐带血移植、免疫细胞治疗技术的发展，脐带血、外周血MNCs的分离方法受到广泛重视。
目前，个体化分离脐带血、外周血MNCs的方法常用密度梯度离心法，其原理在于血液中红细胞和白细胞等细胞密度为1.090g/mL，而MNCs的密度为1.077g/mL，因此采用密度在1.077g/mL的等渗ficoll溶液，经密度梯度离心使不同密度的细胞按密度梯度分布，从而分离MNCs，其中，密度梯度离心法分离MNCs分为几个步骤：首先将抗凝血与缓冲液1:1混匀，然后小心铺在分离液液面上，400g水平离心20分钟，取中间第二层环状乳白色MNCs层，洗涤2次，收取沉淀即可。其他诸如脐带血、骨髓MNCs的密度梯度分离方法以及其他品牌的ficoll或淋巴细胞分离液的操作方法也与此类似。
对于实验室条件下少量血液MNCs分离可以不追求工作效率和操作难度，对于超过100mL的血液MNCs分离而言，按照说明书的方法，我们核算样本量、分离液量以及操作时间：血液样本100mL，稀释后时200mL；分离液量需要160mL(8支50mL尖底离心管，20mL/支)；铺管约2.5分钟/支，离心约20分钟，洗涤约30分钟，共计70分钟。因此，批量制备血液MNCs是比较耗时、耗力，且成本较高。
针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种富集人血液MNCs的方法，不仅能够减少铺管和移液操作量，而且能降低分离液使用量，最终有效降低劳动强度和制备成本。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种富集人血液MNCs的方法，包括以下步骤：
S1：采集脐带血或外周血样本；
S2：通过脐带血或外周血样本离心后吸出富集单个核细胞MNCs；
S3：富集MNCs利用密度梯度离心法分离得到MNCs。
进一步地，所述步骤S2进一步包括如下步骤：将脐带血或外周血样本转移至50ml离心管离心，其中，50ML离心管中由上到下分为两层，下层为细胞层，上层为血浆层，距离血浆层1cm至距离细胞层0.5cm之间的血浆层和细胞层为富集MNCs层，以无菌巴氏吸管吸出富集MNCs，合并细胞悬液。
进一步地，所述步骤S3进一步包括如下步骤：在50ml离心管中加入淋巴分离液20ml，将富集MNCs以生理盐水定容至25ml，铺到淋巴细胞分离液液面上，25ml/支，取400g水平离心20分钟，吸出中间环状白膜层，以生理盐水洗涤2次，收集沉淀细胞。
进一步地，所述脐带血或外周血样本为血量和抗凝剂之和。
进一步地，脐带血或外周血样本的提供者无乙肝、丙肝、梅毒、HIV-I/II病毒感染，无细菌、支原体感染，采集后行CD34表型检测、淋巴细胞计数检验。
本发明的有益效果：通过预先富集MNCs再采用密度梯度离心法分离人血MNCs，不仅能够减少铺管和移液操作量，而且能降低分离液使用量，最终有效降低劳动强度和制备成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明实施例所述的离心管的结构示意图；
图2是对照组半固体培养CFU-GM形态图；
图3是实验组半固体培养CFU-GM形态图。
图中：1、血浆层；2、细胞层；3、富集MNCs层。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中所使用的各种试剂及实验器材均可以从商业途径获得。
首先，对本发明实施例中出现的英文词汇及涉及的试剂材料作出说明：
鼠抗人CD34(581)单抗-PE：生产厂商为BD，货号为55749；
甲基纤维素完全培养基：生产厂商为STEMCELL TECHNOLOGIES INC，货号为04045；
IMDM：是一种细胞培养基，生产厂商为GIBCO，货号为12440053。
实施例一：采集脐带血或外周血样本
采集脐带血或外周血样本30份，血量75-135mL，无乙肝、丙肝、梅毒、HIV-I/II病毒感染，无细菌、支原体感染。30份样本随机分为两组，每组15份，行CD34表型检测、淋巴细胞计数检验，其中，一组为对照组，按“人外周血淋巴细胞分离液说明书”分离MNCs；另外一组为实验组，按MNCs富集后密度梯度离心法分离MNCs实施。
实施例二：富集脐带血MNCs
将实验组15份，分别转移至50mL离心管(型号373687，生产厂商NUNC)，调节离心机降速为0，200g水平离心10分钟，离心管中由上到下分为两层，下层为细胞层2，上层为血浆层1，距离血浆层约1cm至距离细胞层约0.5cm之间的细胞层和血浆层为富集MNCs层3(参见图1)，以无菌巴氏吸管小心吸出富集MNCs，合并细胞悬液。
实施例三：密度梯度离心法分离MNCs
50mL离心管中加入淋巴细胞分离液20mL，将15例对照组脐带血或外周血样本以生理盐水按1:1稀释，将15例实验组富集MNCs以生理盐水定容至25mL，分别小心铺到淋巴细胞分离液液面上，25mL/支；400g水平离心20分钟，小心吸出中间环状白膜层，以生理盐水洗涤2次，收集沉淀细胞。
实施例四：流式细胞术分析
以生理盐水悬浮MNCs，调整细胞密度至1X106/mL，加入鼠抗人CD34(581)单抗-PE，室温孵育15分钟，上机检测。
实施例五：CFU-GM分析
以1mL一次性注射器吸取甲基纤维素完全培养基并转移至35mm培养皿(型号271001，生产厂商STEMCELL TECHNOLOGIES INC)，1mL/皿。以IMDM悬浮MNCs，调整细胞密度至1X105/mL，吸取100uL添加至甲基纤维素完全培养基中，轻轻震动混匀，与37℃,5％CO2，饱和湿度培养12天，计数，挑出单个CFU-GM集落行瑞氏-吉姆萨染色。
实施例六：统计学分析
采用统计软件SPSS17.0进行分析。数据以
Figure BDA0001520037350000041
表示，均值比较采用独立样本t-test，频数资料比较采用Chi-square test，P<0.05有统计学意义。
统计结果如下：
如表1所示，两组样本量、淋巴细胞含量之间相比没有统计学差异。样本量是血量和28mL抗凝剂之和。对照组样本经生理盐水稀释后密度梯度离心分离MNCs，使用50mL离心管9-13支，消耗淋巴细胞分离液180-260mL，用时93-109分钟，与实验组相比有显著性差异(P<0.05)。
如表1所示，对照组样本经稀释后采用密度梯度离心法分离MNCs，实验组经MNCs富集后采用密度梯度离心法分离MNCs，两组实验MNCs计数、MNCs分离率、CD34+百分比、CFU-GM(参见图2和图3)形成率之间相比没有显著性差异。
表1对照组、实验室MNCs分离结果
Figure BDA0001520037350000051
实施例七：结果讨论
本发明了预先富集脐带血、外周血MNCs，再采用密度梯度离心法纯化提取MNCs，能缩短制备时间、节约试剂耗材和降低工作量。
既往采用常规密度梯度离心法分离人血MNCs，首先需要稀释样本，再经过密度梯度离心采集富集MNCs的环状白膜层，一份100mL的血液样本，稀释后为200mL，需要铺到8支预先加了20mL淋巴细胞分离液的50mL离心管中，经20分钟离心，再吸取白膜层，洗涤2次，采用此法，各个步骤所需要的时间，除比较恒定的离心、洗涤时间外，稀释、铺样、采集白膜层耗时大约33.36分钟，占分离MNCs总耗时的42.26±0.04％；而采用本发明的预先富集MNCs的方法，仅有一次铺细胞，仅需采集1管白膜层，除离心、洗涤时间外，富集、铺样、采集白膜层耗时大约17.33分钟，占分离MNCs总耗时的±0.01％。而且实验组不论多少人血样本，密度梯度离心时都仅消耗1根50mL离心管、25mL淋巴细胞分离液，成本分别是对照组的9.50％和11.87％。
对于细胞分离而言，额外的操作步骤可能会影响目的细胞得率、效应细胞比例和生物学活性。分离人血MNCs的参比参数是血常规的淋巴细胞绝对值。对照组淋巴细胞绝对值为1.82±0.54X109/L，实验组为1.84±0.57X109/L，理论上MNCs含量分别为2.34±0.92X108和2.44X108，实际MNCs得率分别为1.89±0.70X108和2.02±0.84X108，差异没有显著性(P＝0.316)，说明采用富集MNCs的方法没有损失人血MNCs。人血MNC的效应细胞一般参考CD34+细胞的比例，对照组和实验组CD34+细胞百分比分别为1.74±0.85％和1.77±0.77％，二者相比没有显著性差异(P＝0.457)，说明采用富集MNCs的方法也没有损失人血效应细胞。更进一步我们检测了两组MNCs代表人血生物学活性的的CFU-GM，发现，每104个MNCs，对照组形成33.67±11.71CFU-GM克隆，而实验组形成34.67±13.17个克隆，二者相比没有显著性差异(P＝0.411)，说明采用富集MNCs的方法不会损失人血MNCs的生物学活性。当然，这些检测指标都是常规检测指标，针对不同用途或适应症还需要更多的检测，比如淋巴细胞亚群、内皮祖细胞克隆形成率、长期培养始动细胞检测、间质细胞克隆形成率等属于专业的定向检测范畴，本研究没有深入。
综上所述，本发明提供了一种富集MNCs的方法，预先富集MNCs再采用密度梯度离心法分离人血MNCs，没有降低人血MNCs得率，也没有损失人血MNCs的效应细胞比例、生物学活性，减轻了工作强度，缩短了制备时间，降低了制备成本。

Claims (4)

1.一种富集人血液MNCs的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：采集血样本；
S2：通过血样本离心后吸出富集单个核细胞MNCs；
S3：富集MNCs利用密度梯度离心法分离得到MNCs，
所述步骤S2进一步包括如下步骤：将血样本转移至50mL离心管离心，其中，50mL离心管中由上到下分为两层，下层为细胞层，上层为血浆层，距离血浆层1cm至距离细胞层0.5cm之间的血浆层和细胞层为富集MNCs层，以无菌巴氏吸管吸出富集MNCs，合并细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的富集人血液MNCs的方法，其特征在于，所述步骤S3进一步包括如下步骤：在50mL离心管中加入淋巴分离液20mL，将富集MNCs以生理盐水定容至25mL，铺到淋巴细胞分离液液面上，25mL/支，取400g水平离心20分钟，吸出中间环状白膜层，以生理盐水洗涤2次，收集沉淀细胞。
3.根据权利要求1所述的富集人血液MNCs的方法，其特征在于，所述血样本为血量和抗凝剂之和。
4.根据权利要求1-3任一项所述的富集人血液MNCs的方法，其特征在于，血样本的提供者无乙肝、丙肝、梅毒、HIV-I/II病毒感染，无细菌、支原体感染，采集后行CD34表型检测、淋巴细胞计数检验。
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