CN102816736A - 一种单个核细胞移植前状态的准备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单个核细胞在移植前状态的准备方法，无菌收集废弃的健康人脐带血，分离出血浆，再使用生理盐水稀释细胞层，用密度梯度分离法进行分离单个核细胞，单个核细胞洗涤后，使用分离出的脐带血血浆进行稀释重悬，调整单个核细胞的浓度，密封于血浆袋中使单个核细胞处于应用前状态；此方法与即往的方法在处理程序和方法上有所不同，本方法减少了与单个核细胞接触的试剂种类、数量和时间，不需要培养、传代、冻存等步骤，避免了其他试剂接触对单个核细胞生存和生长的影响；本方法使用脐带血血浆最后稀释重悬分离洗涤后的脐带血单个核细胞，使脐带血单个核细胞在应用前处于采集前的生长环境和状态，并且使脐带血单个核细胞在体外的时间最短能减少到1.5小时，对保证细胞的活力、生存和生长具有巨大的促进作用，在应用前的各项检查中均符合单个核细胞应用的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种单个核细胞在移植前状态的准备方法，特别涉及脐带血单个核细胞在进行细胞移植前状态的准备方法。
背景技术
细胞移植进行治疗和预防疾病已经成为一门新兴的学科和医学发展的前沿科学，近来的研究表明细胞移植不仅可以治疗心血管疾病、血液病、内分泌疾病、神经疾病等疑难疾病，还可以起到对疾病的预防和保健作用。细胞的种类繁多，来源多样，有成体细胞和胚胎细胞，骨髓和外周血单个核细胞、间充质干细胞，脂肪细胞，脐带间充质干细胞，体外诱导干细胞，脐血间充质干细胞和单个核细胞，这为探讨人类的生长发育、组织细胞分裂分化、蛋白表达，基因调控等生物学问题提供了理想的模型研究系统，也为临床组织缺陷疾病和遗传性疾病的细胞替代治疗和基因治疗开拓了新研究途径。随着细胞研究和应用的发展，间充质干细胞做为一种具有多向分化潜能的干细胞越来越多的应用于细胞的治疗，但无论是从骨髓、脐带血、外周血、脂肪、脐带或是胚胎等组织提取的间充质干细胞都需要在体外经过长时间的分离、消化、培养、传代、冻存等一系列的过程，要加入多种有利于细胞生长、保存、传代等各种试剂，对这种长时间接触多种试剂培养出来的细胞在最终移植入体内进行治疗疾病的同时是否会对机体产生不利因素还不十分明确。人脐带血是出生后留存在胎盘和脐带中的血液，长期以来一直做为废物丢弃，近几年研究发现其中存在着大量丰富的原始干细胞，已经有许多学者对其进行了大量研究，脐带血单个核细胞包含了脐带血中多种原始干细胞，其来源丰富、容易采集、不需要体外培养、接触试剂少、从采集到应用在体外存放时间短、免疫原性弱等优点受到了研究者的青睐。既有的单个核细胞采集制备方法多数是以实验为目的，制备方法和最终的使用前状态的准备多种多样，在以移植为目的进行研究时各研究单位在移植前对脐带血单个核细胞的制备和存放状态也不一致，目前也没有统一的标准，所以现在需要解决的问题是脐带血单个核细胞在移植前的制备方式和制备后处于一种什么样的状态才能最符合细胞移植的需要，才能达到最理想的效果是我们寻找的一种方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种脐带血单个核细胞制备和移植前存放状态的方法，按照本发明方法在细胞移植前准备的脐带血单个核细胞在体外的时间短，接触的试剂少，不需要培养，免疫原性弱，无污染，移植前状态更符合体内环境，能达到最佳的移植效果。
实现本发明目的的技术方案为，使用无菌的方法收集废弃的人脐带血，使用密度梯度法分离提取脐带血单个核细胞，将脐带血单个核细胞重悬后进行移植应用。分离提取脐带血单个核细胞并制备脐带血单个核细胞在移植前达到最佳状态的方法为：无菌收集废弃的健康人脐带血置于抗凝血浆收集袋中，温度为0～8摄氏度在4小时内运送至细胞处置室，在无菌环境下根据脐带血的体积将脐带血移入多个50毫升离心管中，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500～2500转/分钟，离心10～15分钟，此时离心管中的脐带血分为两层：上层为血浆层，下层为细胞层，将上层血浆层轻轻移入新的离心管中备用，在含剩余细胞的离心管中再加入生理盐水，加入生理盐水的量为剩余细胞体积的3～6倍，充分混匀，形成细胞悬液，可增加离心管的数量来进行分装多出的液体量；在新的50毫升离心管中加入密度为1.077的淋巴细胞分离液25毫升，再将25毫升细胞悬液沿离心管壁缓慢的加入淋巴细胞分离液的上方，使上层细胞悬液与下层淋巴细胞分离液体积的比例为1：1，分装完成后，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1000～1500转/分钟，离心时间为25～40分钟；此时离心管中液体分层，中间的白细胞层即为脐带血单个核细胞层，使用移液管轻轻吸出脐带血单个核细胞层置一新的离心管中，并在此新的离心管中加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀；再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟；弃上清液；再加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀，形成脐带血单个核细胞悬液，脐带血单个核细胞悬液再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃上清；再加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀，形成脐带血单个核细胞悬液，脐带血单个核细胞悬液再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃上清；此时余下的细胞为洗过三遍的脐带血单个核细胞；将放置备用的血浆的三分之二体积加入装有洗过三遍的脐带血单个核细胞的离心管中，使用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与血浆充分混匀，形成脐带血单个核细胞血浆悬液，取出0.5毫升使用细胞计数仪进行计数，根据计数的结果，使用余下的三分之一体积的血浆调整脐带血单个核细胞血浆悬液的浓度为1×106～2×106/毫升，20～40毫升脐带血单个核细胞血浆悬液装于一个血浆袋中密封，并同时取脐带血单个核细胞血浆悬液2毫升进行细菌、支原体、内毒素、乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体、艾滋病抗体检测；密封于血浆袋中的脐带血单个核细胞血浆悬液于8小时内进行使用。
用于准备的脐带血单个核细胞的来源为健康产妇废弃的脐带血。健康产妇是指在产妇生产前所做的孕检结果均为正常范围，符合正常分娩条件的产妇；废弃的脐带血是指在分娩后脐带血对产妇和婴儿均无任何作用，是要做丢弃处理的。生理盐水是指浓度为0.9%的无菌医用生理盐水。
无菌收集的脐带血盛装于抗凝血浆收集袋中于0～8摄氏度不低于4小时运送至细胞处置室。
作为优化将脐带血的血浆分离出来备用，分离时离心机转速为1500～2500转/分钟，离心10～15分钟，进入下一工序。
作为优化，将离心取出血浆后的细胞层加入生理盐水，加入生理盐水的量为细胞层体积的3～6倍，充分混匀，形成细胞悬液，进入下一工序。
作为优化，将含生理盐水的细胞悬液加入含淋巴细胞分离液的离心管中，分离细胞时离心机的转速为1000～1500转/分钟，离心时间为25～40分钟，进入下一工序。
作为优化，取出离心管中的中间白细胞层加到生理盐水中充分混匀，再离心洗涤，离心机的转速为1500转/分钟，离心时间10分钟，弃上清，进入下一工序。
作为优化，再加入生理盐水充分混匀，离心洗涤，离心机的转速为1500转/分钟，离心时间10分钟，弃上清，此过程共进行2遍，进入下一工序。
作为优化，将备用的血浆加入离心后的细胞中充分混匀，计数，调整脐带血单个核细胞的浓度为1×106～2×106/毫升，每20～40毫升装一个血浆袋中，进入下一工序。
作为优化，将准备好的脐带血单个核细胞血浆悬液在时间不大于8小时内进行应用。
按本发明上述方法在脐带血单个核细胞应用前准备的脐带血单个核细胞表现出以下技术特征：
① 脐带血单个核细胞从采集到应用时间短，最长时间不超过12小时，最短时间仅1.5小时，不需要在体外冻存，保证了细胞的活性，细胞活力达99%～100%。
② 脐带血单个核细胞不需要在体外培养、传代，接触试剂种类少，降低了污染机率，减少了接触其他试剂对细胞生存和生长的影响。
③ 脐带血单个核细胞经分离后再融于脐带血血浆环境，保证了细胞生存环境统一，减少了不利因素的影响，更有利于细胞的生存和生长。
④ 脐带血单个核细胞血浆悬液在应用前进行安全性检查：细菌检查阴性、支原体检查阴性、内毒素检查阴性、乙肝表面抗原检测阴性，丙肝抗体检测阴性，梅毒抗体检测阴性，艾滋病抗体检测阴性。
脐带血单个核细胞来源丰富、容易采集、免疫原性弱、体外经过的处理步骤少、应用范围广，上述脐带血单个核细胞在应用前状态的准备方法所处理的脐带血单个核细胞活性高、准备时间短、无接触过多的体外试剂、应用前环境与采集时细胞所处的环境一致、包装规范、无生物学污染，无传染性污染，上述技术特征可以作为按本发明方法在细胞应用前所准备的脐带血单个核细胞的合格标准。
具体实施方式
以下列举4个实施例，本发明的实施方法并不限于这4种。对于实施过程中实验材料的选用、部分可调整的工艺技术参数的实际应用，以及各实施例所得成品部分检测指标如下：
实施例1：无菌收集废弃的健康人脐带血于抗凝血浆收集袋中，温度为2摄氏度在1小时内运送至细胞处置室，在无菌环境下根据脐带血的体积将脐带血移入多个50毫升离心管中，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心15分钟，此时离心管中的脐带血分为两层：上层为血浆层，下层为细胞层，将上层血浆层轻轻移入新的离心管中备用，在含剩余细胞的离心管中再加入生理盐水，加入生理盐水的量为剩余细胞体积的6倍，充分混匀，形成细胞悬液，可增加离心管的数量来进行分装多出的液体量；在新的50毫升离心管中加入密度为1.077的淋巴细胞分离液25毫升，再将25毫升细胞悬液沿离心管壁缓慢的加入淋巴细胞分离液的上方，使上层细胞悬液与下层淋巴细胞分离液体积的比例为1:1，分装完成后，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1000转/分钟，离心时间40分钟；此时离心管中液体分层，中间的白细胞层即为脐带血单个核细胞层，使用移液管轻轻吸出脐带血单个核细胞层置一新的离心管中，并在此新的离心管中加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀；再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟；弃上清液；再加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀，形成脐带血单个核细胞悬液，脐带血单个核细胞悬液再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃上清；再加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀，形成脐带血单个核细胞悬液，脐带血单个核细胞悬液再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃上清；此时余下的细胞为洗过三遍的脐带血单个核细胞；将放置备用的血浆的三分之二体积加入装有洗过三遍的脐带血单个核细胞的离心管中，使用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与血浆充分混匀，形成脐带血单个核细胞血浆悬液，取出0.5毫升使用细胞计数仪进行计数，根据计数的结果，使用余下的三分之一体积的血浆调整脐带血单个核细胞血浆悬液的浓度为1×106/毫升，20毫升脐带血单个核细胞血浆悬液装于一个血浆袋中密封，并同时取脐带血单个核细胞血浆悬液2毫升进行检测：细菌检查阴性、支原体检查阴性、内毒素检查阴性、乙肝表面抗原检测阴性，丙肝抗体检测阴性，梅毒抗体检测阴性，艾滋病抗体检测阴性；密封于血浆袋中的脐带血单个核细胞血浆悬液于4小时内进行使用。
实施例2：无菌收集废弃的健康人脐带血于抗凝血浆收集袋中，温度为4摄氏度在2小时内运送至细胞处置室，在无菌环境下根据脐带血的体积将脐带血移入多个50毫升离心管中，将离心管放入低速离心机中离心，转速为2000转/分钟，离心12分钟，此时离心管中的脐带血分为两层：上层为血浆层，下层为细胞层，将上层血浆层轻轻移入新的离心管中备用，在含剩余细胞的离心管中再加入生理盐水，加入生理盐水的量为剩余细胞体积的5倍，充分混匀，形成细胞悬液，可增加离心管的数量来进行分装多出的液体量；在新的50毫升离心管中加入密度为1.077的淋巴细胞分离液25毫升，再将25毫升细胞悬液沿离心管壁缓慢的加入淋巴细胞分离液的上方，使上层细胞悬液与下层淋巴细胞分离液体积的比例为1:1，分装完成后，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心时间30分钟；此时离心管中液体分层，中间的白细胞层即为脐带血单个核细胞层，使用移液管轻轻吸出脐带血单个核细胞层置一新的离心管中，并在此新的离心管中加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀；再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟；弃上清液；再加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀，形成脐带血单个核细胞悬液，脐带血单个核细胞悬液再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃上清；再加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀，形成脐带血单个核细胞悬液，脐带血单个核细胞悬液再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃上清；此时余下的细胞为洗过三遍的脐带血单个核细胞；将放置备用的血浆的三分之二体积加入装有洗过三遍的脐带血单个核细胞的离心管中，使用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与血浆充分混匀，形成脐带血单个核细胞血浆悬液，取出0.5毫升使用细胞计数仪进行计数，根据计数的结果，使用余下的三分之一体积的血浆调整脐带血单个核细胞血浆悬液的浓度为2×106/毫升，25毫升脐带血单个核细胞血浆悬液装于一个血浆袋中密封，并同时取脐带血单个核细胞血浆悬液2毫升进行检测：细菌检查阴性、支原体检查阴性、内毒素检查阴性、乙肝表面抗原检测阴性，丙肝抗体检测阴性，梅毒抗体检测阴性，艾滋病抗体检测阴性；密封于血浆袋中的脐带血单个核细胞血浆悬液于1小时内进行使用。
实施例3：无菌收集废弃的健康人脐带血于抗凝血浆收集袋中，温度为6摄氏度在3小时内运送至细胞处置室，在无菌环境下根据脐带血的体积将脐带血移入多个50毫升离心管中，将离心管放入低速离心机中离心，转速为2500转/分钟，离心13分钟，此时离心管中的脐带血分为两层：上层为血浆层，下层为细胞层，将上层血浆层轻轻移入新的离心管中备用，在含剩余细胞的离心管中再加入生理盐水，加入生理盐水的量为剩余细胞体积的4倍，充分混匀，形成细胞悬液，可增加离心管的数量来进行分装多出的液体量；在新的50毫升离心管中加入密度为1.077的淋巴细胞分离液25毫升，再将25毫升细胞悬液沿离心管壁缓慢的加入淋巴细胞分离液的上方，使上层细胞悬液与下层淋巴细胞分离液体积的比例为1:1，分装完成后，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1300转/分钟，离心时间30分钟；此时离心管中液体分层，中间的白细胞层即为脐带血单个核细胞层，使用移液管轻轻吸出脐带血单个核细胞层置一新的离心管中，并在此新的离心管中加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀；再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟；弃上清液；再加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀，形成脐带血单个核细胞悬液，脐带血单个核细胞悬液再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃上清；再加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀，形成脐带血单个核细胞悬液，脐带血单个核细胞悬液再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃上清；此时余下的细胞为洗过三遍的脐带血单个核细胞；将放置备用的血浆的三分之二体积加入装有洗过三遍的脐带血单个核细胞的离心管中，使用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与血浆充分混匀，形成脐带血单个核细胞血浆悬液，取出0.5毫升使用细胞计数仪进行计数，根据计数的结果，使用余下的三分之一体积的血浆调整脐带血单个核细胞血浆悬液的浓度为1.5×106/毫升，35毫升脐带血单个核细胞血浆悬液装于一个血浆袋中密封，并同时取脐带血单个核细胞血浆悬液2毫升进行检测：细菌检查阴性、支原体检查阴性、内毒素检查阴性、乙肝表面抗原检测阴性，丙肝抗体检测阴性，梅毒抗体检测阴性，艾滋病抗体检测阴性；密封于血浆袋中的脐带血单个核细胞血浆悬液于3小时内进行使用。
实施例4：无菌收集废弃的健康人脐带血于抗凝血浆收集袋中，温度为 4摄氏度在2小时内运送至细胞处置室，在无菌环境下根据脐带血的体积将脐带血移入多个50毫升离心管中，将离心管放入低速离心机中离心，转速为2000转/分钟，离心10分钟，此时离心管中的脐带血分为两层：上层为血浆层，下层为细胞层，将上层血浆层轻轻移入新的离心管中备用，在含剩余细胞的离心管中再加入生理盐水，加入生理盐水的量为剩余细胞体积的3倍，充分混匀，形成细胞悬液，可增加离心管的数量来进行分装多出的液体量；在新的50毫升离心管中加入密度为1.077的淋巴细胞分离液25毫升，再将25毫升细胞悬液沿离心管壁缓慢的加入淋巴细胞分离液的上方，使上层细胞悬液与下层淋巴细胞分离液体积的比例为1:1，分装完成后，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心时间30分钟；此时离心管中液体分层，中间的白细胞层即为脐带血单个核细胞层，使用移液管轻轻吸出脐带血单个核细胞层置一新的离心管中，并在此新的离心管中加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀；再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟；弃上清液；再加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀，形成脐带血单个核细胞悬液，脐带血单个核细胞悬液再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃上清；再加入生理盐水，用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与生理盐水充分混匀，形成脐带血单个核细胞悬液，脐带血单个核细胞悬液再离心，将离心管放入低速离心机中离心，转速为1500转/分钟，离心10分钟，弃上清；此时余下的细胞为洗过三遍的脐带血单个核细胞；将放置备用的血浆的三分之二体积加入装有洗过三遍的脐带血单个核细胞的离心管中，使用移液管轻轻抽吸吹打，使脐带血单个核细胞与血浆充分混匀，形成脐带血单个核细胞血浆悬液，取出0.5毫升使用细胞计数仪进行计数，根据计数的结果，使用余下的三分之一体积的血浆调整脐带血单个核细胞血浆悬液的浓度为2×106/毫升，30毫升脐带血单个核细胞血浆悬液装于一个血浆袋中密封，并同时取脐带血单个核细胞血浆悬液2毫升进行检测：细菌检查阴性、支原体检查阴性、内毒素检查阴性、乙肝表面抗原检测阴性，丙肝抗体检测阴性，梅毒抗体检测阴性，艾滋病抗体检测阴性；密封于血浆袋中的脐带血单个核细胞血浆悬液于2小时内进行使用。
以上实施方法表明按本发明方法进行准备的脐带血单个核细胞应用前状态更有利于细胞功能的保持和细胞使用及对预期结果的实现，实施例4确定了本发明一种较好的脐带血单个核细胞移植前状态的准备方法。
Claims (9)
1.一种单个核细胞移植前状态的准备方法，其特征在于，它是采用以下工艺方法完成的：无菌收集废弃的健康人脐带血置于抗凝血浆收集袋中，温度为0～8摄氏度在时间不大于4小时运送至细胞处置室，将脐带血移入离心管中，1500～2500转/分钟离心10～15分钟，将上层血浆层移出备用，在剩余细胞层中加入生理盐水，加入生理盐水的量为细胞层体积的3～6倍，充分混匀，形成细胞悬液；在新的50毫升离心管中加入密度为1.077的淋巴细胞分离液，再将细胞悬液沿离心管壁缓慢的加入淋巴细胞分离液的上方，使上层细胞悬液与下层淋巴细胞分离液体积的比例为1:1，分装完成后，离心，转速为1000～1500转/分钟，离心时间为25～40分钟；离心管中液体分层，中间的白细胞层即为单个核细胞层，使用移液管轻轻吸出单个核细胞层置一新的离心管中，加入生理盐水充分混匀；洗涤三遍，将放置备用的血浆加入洗过三遍的单个核细胞中充分混匀，制备成脐带血单个核细胞血浆悬液，调整脐带血单个核细胞血浆悬液的浓度为1×106～2×106/毫升，20～40毫升脐带血单个核细胞血浆悬液装于一个血浆袋中密封，并同时取脐带血单个核细胞血浆悬液2毫升进行细菌、支原体、内毒素、乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体、艾滋病抗体检测；密封于血浆袋中的脐带血单个核细胞血浆悬液在时间不大于8小时进行使用。
2.根据权利1所述的单个核细胞移植前状态的准备方法，其特征在于，无菌收集废弃的健康人脐带血在运送温度为0～8摄氏度、时间不大于4小时运送至细胞处置室。
3.根据权利1所述的单个核细胞移植前状态的准备方法，其特征在于，在离心分离血浆时离心机转速为1500～2500转/分钟，离心时间为10～15分钟。
4.根据权利1所述的单个核细胞移植前状态的准备方法，其特征在于，用生理盐水稀释已分离出血浆的细胞层时，加入生理盐水的量为细胞层体积的3～6倍。
5.根据权利1所述的单个核细胞移植前状态的准备方法，其特征在于，在离心分离单个核细胞时离心机转速为1000～1500转/分钟，离心时间为25～40分钟。
6.根据权利1所述的单个核细胞移植前状态的准备方法，其特征在于，洗涤三遍的单个核细胞使用脐带血分离出的血浆进行稀释和重悬。
7.根据权利1、6所述的单个核细胞移植前状态的准备方法，其特征在于，用脐带血的血浆稀释的脐带血单个核细胞血浆悬液浓度为1×106～2×106/毫升。
8.根据权利1、6、7所述的单个核细胞移植前状态的准备方法，其特征在于，脐带血单个核细胞血浆悬液用血浆袋分装时，每袋分装容量为20～40毫升，在时间不大于8小时进行使用。
9.按权利要求1～8任一权利要求所述方法准备的脐带血单个核细胞，在安全性检测中，具有以下技术特征：细菌检查、支原体检查、内毒素检查、乙肝表面抗原检测、丙肝抗体检测、梅毒抗体检测、艾滋病抗体检测均为阴性。
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