CN102344909B - 一种分离人精原干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，提供了一种分离人精原干细胞的方法，包括机械分离睾丸组织，将睾丸组织加工成半液态，然后在半液态的睾丸组织中加入消化酶液I，将睾丸组织消化成单个的曲细精管，还包括在曲细精管中加入消化酶液II的步骤，将曲细精管消化为单个细胞，还包括将单个细胞中的生殖细胞和支持细胞分离的步骤，还包括采用免疫磁珠细胞分选术分离GPR125阳性精原干细胞和GFRA1阳性精原干细胞的步骤，还包括采用免疫细胞化学法鉴定分离的GPR125阳性精原干细胞和GFRA1阳性精原干细胞的步骤。本发明的方法能获得纯度高、数量多的人精原干细胞，为人精原干细胞的研究及在生殖医学和再生医学中的应用提供了充足的细胞来源。

Description

一种分离人精原干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种干细胞的分离方法，具体来说是一种分离人精原干细胞的方法。

背景技术

干细胞是指原始的未分化的细胞，既能自我更新，又能分化为有功能的子代细胞。目前干细胞研究已经成为迄今国内外生命科学研究的前沿，对治疗人类疾病中的细胞移植、组织工程和基因治疗都具有重大意义。精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是指A型精原细胞的一种亚型细胞。精原干细胞是雄性动物和人类将遗传物质传递至后代唯一的成体干细胞。精原干细胞也是雄性动物和人类生精过程中的基础，哺乳动物的生精过程在曲细精管内完成，并包含精原干细胞自我更新和分化为成熟精子的复杂过程。经过近几年的研究，动物精原干细胞的的相关研究已经有了很大的突破和发现。相关研究证实GFRA1(GDNF family receptor alpha 1)是小鼠精原干细胞和祖细胞的细胞表面分子标志。最近，研究发现GPR125(G protein-coupled receptor，GPR125)也是小鼠精原干细胞及其祖细胞的细胞表面分子标志。现在国内外关于精原干细胞的研究正在逐渐从动物向人类转变，也为人类疾病的治疗提供新的研究方向。

随着环境与生活方式改变、生育年龄推迟、癌症治疗等诸多因素影响，人们生育能力明显下降。据世界卫生组织(WHO)统计，不孕不育疾病将会成为继癌症、心血管疾病之后的第三大严重影响人类健康的疾病。2009年，中国人口协会公布的《中国不孕不育现状调研报告》显示：我国不孕不育率已高达15％-20％，其中由男性原因引起的不孕约占50％，男性不育已经成为影响我国生殖健康的重大疾病。精原干细胞的分离和纯化将为治疗男性不育方面提供了广阔的临床应用前景，解决非梗阻性无精子症患者自身生育后代的医学难题，以及为放疗、化疗导致不育的男性癌症患者提供了男性生育保障。

近年来，研究发现精原干细胞体外培养可获得全能性(Pluripotency)成为类胚胎干细胞(ES-like cells)。小鼠精原干细胞能产生心肌细胞、内皮细胞、血液细胞和胰岛细胞。人类精原干细胞能生成肌细胞、成骨细胞、神经细胞和胰岛细胞，这将为再生医学和人类疾病的细胞治疗提供新的途径。现在关于小鼠精原干细胞的分离方法主要是酶消化法结合密度梯度离心，这种方法多得到的精原干细胞纯度有限。人精原干细胞的分离刚刚开始。如何能够获得大量的、高纯度的人精原干细胞，已经成为精原干细胞在基础研究与今后临床应用的主要问题。为了得到高纯度的人类精原干细胞，本发明将应用人精原干细胞表面所具有的特异性的标记物通过免疫细胞学原理将精原干细胞与其他种类生殖细胞分离，从而获得高纯度的精原干细胞以满足其基础研究和临床应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种分离人精原干细胞的方法，所述的这种分离人精原干细胞的方法要解决现有技术人类精原干细胞分离的方法中存在的分离细胞少、纯度不高的技术问题。

本发明一种分离人精原干细胞的方法，包括机械分离睾丸组织的步骤，将睾丸组织加工成半液态，然后在半液态的睾丸组织中加入消化酶液I，将睾丸组织消化成单个的曲细精管，还包括在曲细精管中加入消化酶液II的步骤，将曲细精管消化为单个细胞，还包括将单个细胞中的生殖细胞和支持细胞分离的步骤，还包括采用免疫磁珠细胞分选术分离GPR125阳性精原干细胞和GFRA1阳性精原干细胞的步骤，还包括采用免疫细胞化学法鉴定分离的GPR125阳性精原干细胞和GFRA1阳性精原干细胞的步骤。

机械分离睾丸组织的步骤包括：

1)称取1～2克睾丸组织置于8～12ml DMEM/F12中，剪成体积(1～2)×(1～2)×(1～2)mm³组织小块，用DMEM/F12清洗2～5次，除去残留的血细胞；

2)用眼科剪刀将睾丸组织剪至半液态，另外添加15～40ml DMEM/F12，然后将组织转移到玻璃容器内；

3)向步骤2)的睾丸组织中加入消化酶液I，置于34℃水浴摇床中，孵育10～15min。

4)镜检，确保所有睾丸组织块均已消化成单个曲细精管，将含有曲细精管的消化液转移至另一新的离心管中，加入新鲜的DMEM/F12终止消化。

在曲细精管中加入消化液酶II的步骤包括：

1)将含有曲细精管的消化液静置，用移液管移除上清液，加入新鲜DMEM/F12清洗曲细精管。重复操作2～5次，除去所有的肌样细胞(Myoid cells)和莱氏细胞(Leydig cells)；

2)向步骤1)得到的曲细精管中加入消化酶液II；.

3)将步骤2)中的混合液用玻璃移液管转移至另一新的玻璃容器中，置于34℃水浴摇床，孵育8-15min；

4)消化后，用玻璃移液管轻轻吹打10～15次，镜检；如还有曲细精管，再于34℃水浴摇床孵育8-15min，确保曲细精管全部消化为单个细胞。

将单个细胞中的男性生殖细胞和支持细胞分离的步骤包括：

1)1)在消化液中加入新鲜DMEM/F12终止消化，静止，收集上清液离心；

2)离心后，弃上清液，加入50ml DMEM/F12重悬细胞，静止8-12min，收集上清液离心；

3)离心后，弃上清液，加入适量新鲜DMEM/F12重悬细胞，用30-45μm尼龙网过滤，除去细胞团；

4)将步骤3)得到的细胞悬液离心，弃上清液，然后加入新鲜8-12ml含10％的胎牛血清的DMEM/F12；

5)将步骤4)中得到的细胞悬液在0.05～0.2％明胶预处理的培养瓶培养后，分离男性生殖细胞和支持细胞。

采用免疫磁珠细胞分选术分离收集GPR125阳性精原干细胞或GFRA1阳性精原干细胞，其步骤包括：

1)将生殖细胞重悬于DMEM培养液，在细胞悬液中加入GPR125抗体或GFRA1抗体，1～7℃旋转培养过夜；

2)孵育后，用0.4％台盼蓝法检测细胞活率，然后用BSA-EDTA-PBS缓冲液将细胞洗涤，离心后将细胞重悬于80～100μl的BSA-EDTA-PBS缓冲液中；

3)将20～30μl免疫磁珠加入细胞悬液，1～7℃旋转培养，时间不超过20min，补加400μl BSA-EDTA-PBS缓冲液，终体积为500μl；

4)取5μl细胞悬液用0.4％台盼蓝法检测细胞活率；

5)将步骤3)得到的细胞悬液经免疫磁珠柱预分离器过滤后，转入BSA-EDTA-PBS缓冲液平衡的分离柱中，同时将分离柱置于磁场中；

6)用BSA-EDTA-PBS缓冲液冲洗分离柱，收集未被标记的细胞GPR125或GFRA1阴性细胞；

7)将分离柱脱离磁场，添加BSA-EDTA-PBS缓冲液，收集GPR125阳性精原干细胞或GFRA1阳性精原干细胞。

采用免疫细胞化学法鉴定分离GPR125阳性精原干细胞或GFRA1阳性精原干细胞，其步骤包括：

1)将收集的GPR125阳性精原干细胞或GFRA1阳性精原干细胞和GPR125-或GFRA1-阴性生殖细胞经细胞甩片机，离心进行细胞涂片，用4％多聚甲醛固定；

2)室温下，用PBS将细胞涂片冲洗，用200μl 10％正常山羊血清封闭；

3)将一抗用100μl PBS按1∶100～1∶500稀释，34℃孵育1小时或4℃孵育过夜，所述的一抗有GPR125、或GFRA1、或THY1、或UCHL1、或ITGA6，或正常兔IgG、或小鼠IgG，阴性对照由PBS代替一抗；

4)孵育后，细胞用PBS冲洗；

5)细胞用荧光素标记的羊抗兔IgG、或罗丹明标记的羊抗兔、或罗丹明标记的羊抗小鼠IgG二抗孵育，并用DAPI进行细胞核染色，在荧光显微镜下观察细胞。

所述的消化酶溶液I由终浓度为2mg/ml的IV型胶原酶或XI型胶原酶溶液和终浓度为1μg/μl的DNase I组成，配制后过滤除菌。

所述的消化酶溶液II由终浓度为4mg/ml的IV型胶原酶或XI型胶原酶溶液，终浓度为2.5mg/ml的透明质酸酶和1μg/μl的DNase I，终浓度为2mg/ml的胰蛋白酶组成，配制后过滤除菌。

所述的BSA-EDTA-PBS缓冲液为含有终浓度为0.5％的BSA和终浓度为2mM的EDTA的冰冷PBS缓冲液组成，配制后过滤除菌。

本发明中提供的人精原干细胞的分离方法主要应用了两步酶消化法和免疫磁珠细胞分选术(MACS)两种方法。本发明为人精原干细胞的分子机理研究与将来的临床应用提供了大量的、高纯度的细胞来源，本发明中提供的人精原干细胞的分离方法主要应用了两步酶消化法和免疫磁珠细胞分选术(MACS)两种方法。

本发明为人精原干细胞的分子机理研究与将来的临床应用提供了大量的、高纯度的细胞来源，为人精原干细胞的研究及在生殖医学和再生医学中的应用提供了充足的细胞来源。

与现有的分离技术相比，本发明建立的人精原干细胞的分离法的优点在于：能够获得高产量、高纯度的人精原干细胞。1克的成人睾丸组织可以获取3万以上的人精原干细胞，且纯度高达95％以上。

附图说明

图1显示了人精原干细胞分离过程中的曲细精管。

图2显示了人精原干细胞分离过程中的人男性生殖细胞。

图3显示了人精原干细胞分离过程中的人精原干细胞。

图4显示了免疫细胞化学鉴定：荧光显微镜下GPR125阳性精原干细胞的GPR125表达。

图5显示了免疫细胞化学鉴定：荧光显微镜下GPR125阴性生殖细胞的GPR125表达。

图6显示了免疫细胞化学鉴定：荧光显微镜下GPR125阳性精原干细胞的ITGA6表达。

图7显示了免疫细胞化学鉴定：荧光显微镜下GPR125阴性生殖细胞的ITGA6表达。

图8显示了免疫细胞化学鉴定：荧光显微镜下GPR125阳性精原干细胞的GFRA1表达。

图9显示了免疫细胞化学鉴定：荧光显微镜下GPR125阴性生殖细胞的GFRA1表达。

图10显示了免疫细胞化学鉴定：荧光显微镜下GPR125阳性精原干细胞的THY1表达。

图11显示了免疫细胞化学鉴定：荧光显微镜下GPR125阴性生殖细胞的THY1表达。

图12显示了免疫细胞化学鉴定：荧光显微镜下GPR125阴性生殖细胞的阴性对照(加入PBS但没有一抗)。

图13显示了免疫细胞化学鉴定：荧光显微镜下GPR125阳性精原干细胞的GPR125、ITGA6、GFRA1、THY1表达的放大图。

具体实施方式

实施例1

一种人精原干细胞的分离方法，其步骤如下：

1)称取约1克新鲜人睾丸组织置于10ml DMEM/F12中，剪成体积约1×1×1mm³组织小块，用DMEM/F12洗涤3次，除去组织中残留的血细胞。

2)用剪刀将睾丸组织剪至半液态，另外添加20ml DMEM/F12，然后将组织转移到150ml容器内。

3)向步骤2)中的剪碎的组织中加入消化酶液I(由终浓度为2mg/ml IV型胶原酶或XI型胶原酶溶液和1μg/μl DNase I组成)，置于34℃水浴摇床，孵育10～15min。

4)镜检，确保所有组织块均已消化成曲细精管(如图1所示)，将含有曲细精管的消化液转移至另一新的50ml离心管，加入30ml新鲜的DMEM/F12终止消化。

5)静置5min，用25ml移液管移除上清液，加入50ml新鲜的DMEM/F12充分清洗曲细精管，重复操作3次。

6)向步骤5)得到的曲细精管中加入酶消化液II(包含终浓度为4mg/ml IV型胶原酶或XI型胶原酶溶液，2.5mg/ml透明质酸酶，2mg/ml胰蛋白酶和1μg/μl DNase I)。

7)将步骤6)中的混合液用10ml玻璃移液管转移至另一新的离心管中，置于34℃水浴摇床，孵育15min。

8)消化后，用10ml玻璃移液管轻轻吹打10～15次，镜检，确保曲细精管全部消化为单个细胞。

9)加入30ml新鲜DMEM/F12终止消化，静止10min，收集上清液1000r/min离心5min。

10)弃上清液，加入50ml DMEM/F12重悬细胞，静止10min收集上清液1000r/min离心5min。

11)弃上清液，加入新鲜DMEM/F12重悬细胞，用40μm尼龙网过滤。

12)将步骤11)细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清液，加入新鲜DMEM/F12。

13)根据支持细胞贴壁时间短于生殖细胞，将步骤12)中得到的细胞悬液在经0.1％明胶预处理的15cm²培养瓶培养3小时后，支持细胞贴壁后，分离生殖细胞和支持细胞。(如图2所示)

14)将步骤13)中得到的生殖细胞重悬于1ml DMEM培养液，在1ml细胞悬液中加入25μl GPR125或GFRA1抗体，4℃旋转培养过夜。

15)孵育后，用0.4％台盼蓝法检测细胞活率，然后用BSA-EDTA-PBS缓冲液将细胞洗涤3次，5min/次，最后将细胞重悬于80μl BSA-EDTA-PBS缓冲液中。

16)将20μl免疫磁珠加入细胞悬液，4℃旋转培养，时间不超过20min，补加400μl BSA-EDTA-PBS缓冲液，终体积为500μl。

17)取5μl细胞悬液用0.4％台盼蓝法检测细胞活率。

18)将步骤16)得到的细胞悬液经MACS预分离器(30μm)过滤后，转入BSA-EDTA-PBS缓冲液平衡的分离柱中，同时将分离柱置于磁场中。

19)用BSA-EDTA-PBS缓冲液冲洗分离柱3次，0.5ml/次，收集未被标记的细胞(GPR125-和GFRA1-阴性生殖细胞)。

20)将分离柱脱离磁场，添加1ml BSA-EDTA-PBS缓冲液，收集GPR125阳性精原干细胞或GFRA1阳性精原干细胞，为提高细胞纯度，可将收集的细胞进行二次免疫磁珠分离，得到高纯度的人精原干细胞(如图3所示)。

实施例2

按照实施例1中分离人精原干细胞。

经免疫细胞化学方法鉴定此精原干细胞，其步骤如下：

1)将收集的GPR125阳性精原干细胞或GFRA1阳性精原干细胞和GPR125-或GFRA1-阴性生殖细胞经细胞甩片机，离心进行细胞涂片，用4％多聚甲醛固定；

2)室温下，用PBS将细胞涂片冲洗，用200μl 10％正常山羊血清封闭30min；

3)将一抗(GPR125、GFRA1、THY1、UCHL1或ITGA6，或正常兔IgG、小鼠IgG，阴性对照由PBS代替一抗)按1∶200稀释，34℃孵育1小时；孵育后，细胞用PBS冲洗；

4)细胞用荧光素标记的羊抗兔IgG、或罗丹明标记的羊抗兔、或罗丹明标记的羊抗小鼠IgG二抗孵育，并用DAPI进行细胞核染色，在荧光显微镜下观察细胞。其中图4显示GPR125阳性精原干细胞的GPR125表达。图5显示GPR125阴性生殖细胞的GPR125表达。图6显示了GPR125阳性精原细胞的ITGA6表达。图7显示了GPR125阴性生殖细胞的ITGA6表达。图8显示了GPR125阳性精原干细胞的GFRA1表达。图9显示了GPR125阴性生殖细胞的GFRA1表达。图10显示了GPR125阳性精原干细胞的THY1表达。图11显示了GPR125阴性生殖细胞的THY1表达。图12显示了GPR125阴性生殖细胞的阴性对照(加入PBS但没有一抗)。图13显示了GPR125阳性精原干细胞的GPR125、ITGA6、GFRA1、THY1表达的放大图。

Claims (3)

1.一种分离人精原干细胞的方法，其特征在于：包括一个机械分离睾丸组织的步骤，在该步骤中，将睾丸组织加工成半液态，然后在半液态的睾丸组织中加入消化酶液I，将睾丸组织消化成单个的曲细精管，还包括一个在曲细精管中加入消化酶液II的步骤，在该步骤中，将曲细精管消化为单个细胞，还包括一个将单个细胞中的生殖细胞和支持细胞分离的步骤、一个采用免疫磁珠细胞分选术分离GPR125阳性精原干细胞和GFRA1阳性精原干细胞步骤和一个采用免疫细胞化学法鉴定分离的GPR125阳性精原干细胞和GFRA1阳性精原干细胞的步骤；

所述的消化酶液I由终浓度为2mg/ml IV型胶原酶或XI型胶原酶溶液和终浓度为1μg/μl DNase I组成，配制后过滤除菌；

所述的酶消化液II由终浓度为4mg/ml的IV型胶原酶或XI型胶原酶溶液、终浓度为2.5mg/ml的透明质酸酶、终浓度为的2mg/ml胰蛋白酶、终浓度为1μg/μl的DNase I组成，配制后过滤除菌；

所述的机械分离睾丸组织的步骤包括：

1)称取1～2克睾丸组织置于8～12ml DMEM/F12中，剪成体积（1～2）×（1～2）×（1～2）mm³组织小块，用DMEM/F12清洗2～5次，除去残留的血细胞，

2）用眼科剪刀将睾丸组织剪至半液态，另外添加15～40ml DMEM/F12，然后将组织转移到玻璃容器内，

3）向步骤2）的睾丸组织中加入消化酶液Ⅰ，置于34℃水浴摇床中，孵育10～15min，

4）镜检，确保所有睾丸组织块均已消化成单个曲细精管，将含有曲细精管的消化液转移至另一新的离心管中，加入新鲜的DMEM/F12终止消化；

所述的在曲细精管中加入消化液酶II的步骤包括：

1）将含有曲细精管的消化液静置，用移液管移除上清液，加入新鲜DMEM/F12清洗曲细精管，重复操作2～5次，除去所有的肌样细胞和莱氏细胞，

2）向步骤1）得到的曲细精管中加入消化酶液Ⅱ，

3）将步骤2）中的混合液用玻璃移液管转移至另一新的玻璃容器中，置于34℃水浴摇床，孵育8－15min，

4）消化后，用玻璃移液管轻轻吹打10～15次，镜检；如还有曲细精管，再于34℃水浴摇床孵育8－15min，确保曲细精管全部消化为单个细胞；

所述的将单个细胞中的生殖细胞和支持细胞分离的步骤包括：

1）在消化液中加入新鲜DMEM/F12终止消化，静止，收集上清液离心，

2）离心后，弃上清液，加入50ml DMEM/F12重悬细胞，静止8－12min，收集上清液离心，

3）离心后，弃上清液，加入适量新鲜DMEM/F12重悬细胞，用30－45μm尼龙网过滤，除去细胞团，

4）将步骤3）得到的细胞悬液离心，弃上清液，然后加入新鲜8－12ml含10%的胎牛血清的DMEM/F12，

5）将步骤4）中得到的细胞悬液在0.05～0.2%明胶预处理的培养瓶培养后，分离男性生殖细胞和支持细胞；

所述的采用免疫磁珠细胞分选术分离GPR125阳性精原干细胞和GFRA1阳性精原干细胞的步骤包括：

1)将生殖细胞重悬于DMEM培养液，在细胞悬液中加入GPR125抗体或GFRA1抗体，1～7℃旋转培养过夜，

2)孵育后，用0.4%台盼蓝法检测细胞活率，然后用BSA-EDTA-PBS缓冲液将细胞洗涤，离心后将细胞重悬于80～100μl的BSA-EDTA-PBS缓冲液中，

3)将20～30μl免疫磁珠加入细胞悬液，1～7℃旋转培养，时间不超过20min，补加400μl BSA-EDTA-PBS缓冲液，终体积为500μl，

4)取5μl细胞悬液用0.4%台盼蓝法检测细胞活率，

5)将步骤3）得到的细胞悬液经免疫磁珠柱预分离器过滤后，转入BSA-EDTA-PBS缓冲液平衡的分离柱中，同时将分离柱置于磁场中，

6)用BSA-EDTA-PBS缓冲液冲洗分离柱，收集未被标记的细胞GPR125或GFRA1阴性细胞，

7)将分离柱脱离磁场，添加BSA-EDTA-PBS缓冲液，收集GPR125阳性精原干细胞或GFRA1阳性精原干细胞；

所述的采用免疫细胞化学法鉴定分离的GPR125阳性精原干细胞和GFRA1阳性精原干细胞的步骤包括：

1)将收集的GPR125阳性精原干细胞或GFRA1阳性精原干细胞和GPR125-或GFRA1-阴性生殖细胞经细胞甩片机，离心进行细胞涂片，用4%多聚甲醛固定；

2)室温下，用PBS将细胞涂片冲洗，用200μl10%正常山羊血清封闭；

3)将一抗用100μl PBS按1:100～1:500稀释，34℃孵育1小时或4℃孵育过夜，所述的一抗采用GPR125、或GFRA1、或THY1、或UCHL1、或ITGA6，或正常兔IgG、或小鼠IgG，阴性对照由PBS代替一抗；

4)孵育后，细胞用PBS冲洗；

5)细胞用荧光素标记的羊抗兔IgG、或罗丹明标记的羊抗兔、或罗丹明标记的羊抗小鼠IgG二抗孵育，并用DAPI进行细胞核染色，在荧光显微镜下观察细胞。

2.如权利要求1所述的分离人精原干细胞的方法，其特征在于：在所述的将单个细胞中的男性生殖细胞和支持细胞分离的步骤5）中，将细胞悬液接种于培养瓶中，34℃培养1～5小时，支持细胞首先贴于瓶底，而生殖细胞仍悬浮于培养基中，收集培养基后500～1500r/min离心，弃上清液，收集生殖细胞。

3.如权利要求1所述的分离人精原干细胞的方法，其特征在于：所述的BSA-EDTA-PBS缓冲液为含有终浓度为0.5%的BSA和终浓度为2mMEDTA的冰冷PBS缓冲液组成，配制后过滤除菌。

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