CN113151153A - 一种小鼠腹膜血管周细胞的纯化方法和鉴定方法 - Google Patents
一种小鼠腹膜血管周细胞的纯化方法和鉴定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113151153A CN113151153A CN202110544566.0A CN202110544566A CN113151153A CN 113151153 A CN113151153 A CN 113151153A CN 202110544566 A CN202110544566 A CN 202110544566A CN 113151153 A CN113151153 A CN 113151153A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- medium
- purification method
- peritoneal
- pericyte
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 210000004786 perivascular cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 95
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 claims abstract description 65
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 23
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 37
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 29
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 27
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 22
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 claims description 15
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 claims description 9
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 6
- 108010051742 Platelet-Derived Growth Factor beta Receptor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000018967 Platelet-Derived Growth Factor beta Receptor Human genes 0.000 claims description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 4
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 abstract description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 5
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 abstract description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 23
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 18
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 206010034665 Peritoneal fibrosis Diseases 0.000 description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 8
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 6
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 description 4
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 239000012110 Alexa Fluor 594 Substances 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000008477 smooth muscle tissue growth Effects 0.000 description 2
- 210000001562 sternum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 101710151387 Serine protease 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100032491 Serine protease 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710119665 Trypsin-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010069568 Ultrafiltration failure Diseases 0.000 description 1
- 208000004608 Ureteral Obstruction Diseases 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 208000028208 end stage renal disease Diseases 0.000 description 1
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 210000000569 greater omentum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000505 parietal peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 238000012247 phenotypical assay Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037999 tubulointerstitial fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种腹膜血管周细胞的纯化方法，包括如下步骤：(1)肠系膜通过II型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶消化，培养，得到原代细胞；(2)步骤(1)所得原代细胞通过胰蛋白酶消化，再通过免疫磁珠分选，即得腹膜血管周细胞。与现有技术相比，本发明所提供的方法操作简单、节约成本、耗时短的同时获得高纯度的原代细胞，条件培养后原代周细胞纯度达88.5％，联合MACS分选后纯度达97.8％，填补了腹膜周细胞领域研究的空白并解决了现有其他组织周细胞提取技术存在的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及腹膜血管周细胞领域，具体涉及一种小鼠腹膜血管周细胞的纯化方法和鉴定方法。
背景技术
腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是终末期肾病替代治疗的主要手段之一。但随着透析时间的延长，在各种病理因素的刺激下，腹膜结构重塑，腹膜纤维化(peritonealfibrosis，PF)进行性加重，导致透析效能逐渐下降，最终超滤衰竭，患者不得不退出治疗，严重制约PD技术的普及与发展。目前，学界普遍认为作为构成间皮下基质主要成分的肌成纤维细胞(MyoF)，其活化、增殖是PF病理进程中的核心因素。
有关MyoF的来源国内外学者倡导5种学说：①上皮细胞间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)；②血管内皮细胞间充质转分化(endothelial-mesenchymal transition，EndoMT)；③固有成纤维细胞转分化；④骨髓来源细胞转分化；⑤血管周围的周细胞(pericyte)转分化(图1)。自从2003年以来，EMT一直是PF乃至纤维化疾病研究领域的热点。然而，近年的某些研究，特别是随着细胞追踪技术的发展，使得这一学说受到极大挑战。有学者在输尿管梗阻模型中多色标记细胞，发现PDGFRβ(+)/α-SMA(-)的周细胞是肾小管间质纤维化的主要来源，在病理过程中逐渐转化为α-SMA(+)的MyoF。还有学者发现损伤的肾间质中，35％的MyoF来源于骨髓，65％来源于包括周细胞在内的固有细胞，仅有大约5％的肾间质MyoF由内皮细胞EMT分化而来。在PF领域，探讨MyoF来源的研究较少，但Chen等的研究也质疑了EMT是PF病理核心的观点，他们发现小鼠腹膜仅有15％的MyoF来源于上皮，而大部分来源于固有成纤维细胞。尽管现有技术条件下并不能保证所有MyoF的前体细胞都被标记，但不可否认的是，固有成纤维细胞，特别是周细胞是MyoF的重要来源。由此可见，周细胞-肌成纤维细胞转分化(pericyte-myofibroblasttransition，PMT)是PF过程中MyoF活化的新途径，阻断PMT病理环节，可能为改善甚至拮抗PF提供新的思路。
目前周细胞的研究方法主要依靠动物模型，其虽能动态观察动物体内周细胞来源、生成、增殖、迁移、转分化的动态过程，但需要昂贵的实验成本、繁琐的造模过程、漫长的造模时间，且周细胞需要多个抗体标记鉴定，在复杂动物模型体内并不很容易实现。此外，细胞信号传导研究、转基因技术的开展在体外细胞系上更容易实现。因此，我们亟需构建一种动物来源的原代周细胞模型以供离体实验的开展。事实上，科学家也为此付出了很多努力，学者已然构建了纯化视网膜周细胞、脑血管周细胞、冠状动脉周细胞等的方法。然而，这些细胞的提取过程存在着耗时长、标记抗体复杂、成本高昂等问题。且在肾脏病腹膜透析领域，学界尚未报道成熟的腹膜血管周细胞提取方法。本发明首创小鼠原代腹膜周细胞的提取方法，省时、高效的完成细胞纯化及鉴定，为PF的离体研究提供了有力工具。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种腹膜血管周细胞的纯化方法。
本发明还要解决的技术问题是同上述腹膜血管周细胞的鉴定方法。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种腹膜血管周细胞的纯化方法。
其中，所述纯化方法是在无菌条件下进行的。
其中，腹膜组织包括壁层腹膜、大网膜、肠系膜等。腹膜透析患者腹腔注入腹透液，通过腹膜组织的血管进行水、溶质、毒素的交换与清除。依据研究靶点需要，选择血管分布丰富的肠系膜进行取材，以期获得最大量的腹膜血管周细胞。
其中，所述腹膜血管周细胞的纯化方法包括如下步骤：
(1)肠系膜通过II型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶消化，培养，得到原代细胞；
(2)步骤(1)所得原代细胞通过胰蛋白酶消化，再通过免疫磁珠分选，即得腹膜血管周细胞。
步骤(1)中，所述肠系膜包括但不限于来源于小鼠的肠系膜。
其中，小鼠肠系膜的提取方法为将5只小鼠用CO2处死，然后浸入75vt％乙醇溶液中消毒15分钟。将每只动物置于冰上仰卧，并在腹部备皮。从胸骨下至下腹部作十字切口，充分暴露腹腔。手术镊钳取、展开结肠及空肠肠管，沿肠壁剥脱肠系膜，置于含有1vt％青霉素-链霉素的冰磷酸盐缓冲溶液)中。
步骤(1)中，所述肠系膜为肠系膜碎片；优选地，所述肠系膜为0.2-1.8mm×0.2-1.8mm的肠系膜碎片；进一步优选地，所述肠系膜为1mm×1mm的肠系膜碎片。
步骤(1)中，所述肠系膜与II型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶的用量比为6-12g：1mg：30-40U；优选地，所述肠系膜与II型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶的用量比为9g：1mg：40U。
其中，所述II型胶原酶为C6885，Sigma-Aldrich，USA。
步骤(1)中，所述消化为将肠系膜与含II型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶的培养基中于30-44℃消化；优选地，所述消化为将肠系膜与含II型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶的培养基中于37℃消化。
其中，所述培养基包括但不限于DMEM培养基。
其中，所述肠系膜与培养基的用量没有具体要求；优选地，每5只小鼠所提取的肠系膜用10mL左右的培养基。
步骤(1)中，所述消化的转速为10-110rpm；优选地，所述消化的转速为40-80rpm；进一步优选地，所述消化的转速为60rpm。
步骤(1)中，所述消化的时间为0.5-3.5h；优选地，所述消化的时间为1-3h；进一步优选地，所述消化的时间为2h。
步骤(1)中，所述消化反应结束后，用含10％胎牛血清的DMEM的预冷培养基终止反应；优选地，所述培养基与消化过程所用培养基的体积比为1：0.5-1.5；进一步优选地，所述培养基与消化过程所用培养基的体积比为1：1。
步骤(1)中，所述消化反应结束后过滤；优选地，用20-120μm细胞过滤器过滤；进一步优选地，用40-100μm细胞过滤器过滤；更进一步优选地，用60-80μm细胞过滤器过滤；再更进一步优选地，用70μm细胞过滤器过滤。
步骤(1)中，所述消化反应终止后，过滤，所得滤液离心；优选地，在0-8℃下以100-500×g离心2-18min；进一步优选地，在4℃下以300×g离心10min。
步骤(1)中，所述消化反应终止后，过滤，所得滤液离心，所得沉淀物重悬于培养基；优选地，所得沉淀物重悬于DMEM培养基。
步骤(1)中，所述消化反应终止后，过滤，所得滤液离心，所得沉淀物重悬于培养基，培养，得到原代细胞。
步骤(1)中，所述培养的温度为37℃。
步骤(1)中，所述培养的时间为6-7天；优选地，在培养至具有良好生长状态的细胞时，停止培养。
步骤(1)中，所述培养的过程中，不同阶段的培养基不同，具体如下：
(i)初始为DMEM完全培养基；
(ii)在培养至微血管片段粘附时，用周细胞条件培养基置换原来的培养基；
(iii)后期每隔20-28h，用新鲜的周细胞条件培养基置换部分原来的培养基；
步骤(ii)中，优选地，在培养至微血管片段稳定粘附时，用周细胞条件培养基置换部分原来的培养基。
步骤(ii)中，用周细胞条件培养基将原来的培养基全部置换。
步骤(iii)中，优选地，后期每隔24h，用新鲜的周细胞条件培养基置换部分原来的培养基。
步骤(iii)中，所述部分培养基为原来培养基总体积的30％-70％；优选地，所述部分培养基为原来培养基总体积的50％。
步骤(ii)和步骤(iii)中，优选地，在换液前去除细胞碎片；进一步优选地，用含有青霉素-链霉素的PBS洗涤去除细胞碎片；更进一步优选地，所述PBS中青霉素-链霉素的含量为1vt％。
其中，所述周细胞条件培养基为含有体积比为2％FBS、1％青霉素-链霉素、1％周细胞生长补充因子的低葡萄糖DMEM培养基；其中，所述低葡萄糖DMEM培养基为成熟商品(DMEM medium low glucose)，含葡萄糖(1.0g/L)。
其中，肠系膜组成复杂，通过微血管片段获取周细胞会面临杂细胞的污染。其他领域的学者们往往正常培养酶解后获得的细胞，再通过流式/磁珠分选的方法纯化目标细胞。为了更好的提高后续MACS分选的阳性率，本发明在此之前采用周细胞条件培养基对贴壁细胞进行条件培养。区别于脑微血管，肠系膜微血管上脱落的除周细胞外，以内皮细胞为主。因此先用10％胎牛血清的完全培养基培养，促进微血管片段贴壁。于第二日后更换周细胞条件培养基。2％的胎牛血清浓度、低葡萄糖的DMEM培养液能有效抑制内皮细胞增殖，并提供周细胞必要的培养环境。此外，有学者在脑周细胞原代培养体系中添加肝素、胰岛素、平滑肌生长刺激因子等。为了保护腹膜周细胞的原始表型及形态，避免其在离体培养状态下发生肌成纤维转化，本发明使用了1％周细胞生长补充因子以代替平滑肌生长因子，使周细胞的分裂增殖成为主导。从流式细胞术鉴定结果来看该方法可以使内皮细胞的污染显著降低。
步骤(2)中，所述胰蛋白酶的用量为2.5g/L原代细胞。
其中，所述胰蛋白酶是成熟商品(胰蛋白酶-EDTA(0.25％)，即2.5g/L，含酚红，货号：25200072，胰蛋白1：250)。
步骤(2)中，所述消化为于37℃、5％CO2消化。
步骤(2)中，所述消化的时间为1-9min；优选地，所述消化的时间为3-7min。
步骤(2)中，所述消化后终止反应；优选地，用完全培养基终止消化；进一步优选地，所述完全培养基与胰蛋白酶的体积比为1：0.5-1.5；进一步优选地，所述完全培养基与胰蛋白酶的体积比为1：1。
步骤(2)中，所述消化终止后，离心，所得沉淀物重悬，得到细胞悬液；优选地，用完全培养基重悬；进一步优选地，用完全培养基重悬后，再用推荐溶剂重悬至细胞数为0.1-9×107/mL；再更进一步优选地，用完全培养基重悬后，再用推荐溶剂重悬至细胞数为1×107/mL。
其中，所述推荐溶剂为含有2vt％FBS和1mM EDTA的PBS。
步骤(2)中，所述消化终止后，离心，所得沉淀物重悬，得到细胞悬液，所得细胞悬液再通过免疫磁珠分选，即得腹膜血管周细胞。
步骤(2)中，所述免疫磁珠分选的标记物为PDGFR-β。
步骤(2)中，所述免疫磁珠分选为将细胞悬浮液、FcR阻断剂、CD140b/PDGFR-β单克隆抗体、Cocktail蛋白酶抑制剂和5μL RapidSpheresTM磁珠进行第一次孵育，再加入推荐培养基定容，进行第二次孵育，利用磁铁收集腹膜血管周细胞。
其中，所述细胞悬浮液、FcR阻断剂和CD140b/PDGFR-β单克隆抗体的用量比为100μL：0.2-1.8μL：2-4μL；优选地，所述细胞悬浮液、FcR阻断剂和CD140b/PDGFR-β单克隆抗体的用量比为100μL：1μL：3μL。
其中，所述细胞悬浮液、Cocktail蛋白酶抑制剂和RapidSpheresTM磁珠的用量比为100μL：5-15μL：1-9μL；优选地，所述细胞悬浮液、Cocktail蛋白酶抑制剂和RapidSpheresTM磁珠的用量比为100μL：8-12μL：4-6μL；优选地，所述细胞悬浮液、Cocktail蛋白酶抑制剂和RapidSpheresTM磁珠的用量比为100μL：10μL：5μL。
其中，所述第一次孵育的温度为20-30℃；优选地，所述第一次孵育的温度为室温。
其中，所述第一次孵育的时间为2-18min；优选地，所述第一次孵育的温度为10min。
其中，所述推荐培养基为含有BSA的PBS；优选地，所述推荐培养基为含有0.1％BSA的PBS。
其中，所述定容为定容指1-4mL；优选地，定容至2.5mL。
其中，所述第二次孵育的温度为20-30℃；优选地，所述第二次孵育的温度为室温。
其中，所述第二次孵育的时间为2-8min；优选地，所述第二次孵育的时间为5min。
其中，其免疫磁珠分选(MACS)是一种新型细胞分选技术。磁珠结合细胞表面抗原的特异性标记后通过阴选或阳选获得目标细胞。相较于流式细胞分选(FCS)的耗时长、易污染、后期培养细胞存活率低、离心分离机械性损伤大的弊端，该方法获得目的细胞具有操作简易、耗时短、纯度高、细胞活性损伤小等优点。本发明使用了无柱免疫磁珠分选平台，用周细胞抗体复合物(PDGFR-β)和磁珠标记靶细胞，然后以阳性选择通过磁极筛选细胞。然而，周细胞的表面分子标记较为复杂，其特异性标记物尚有争议，学者倾向于使用PDGFR-β、NG2、CD13、α-SMA等抗体中的一种或多种去标记不同组织来源的周细胞。本发明基于条件培养，只使用了一种标记物的磁珠进行分选，结果显示获得的细胞中PDGFR-β、NG2、a-SMA和CD13表达阳性，内皮标记物CD31阴性，PDGFR-β+NG2、PDGFR-β+a-SMA双阳性，捕获效率及纯度高，且极大节约了试剂成本。
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述腹膜血管周细胞的鉴定方法，
其中，所述鉴定方法为纯度鉴定，包括但不限于免疫荧光和流式细胞术。
其中，所述免疫荧光为将纯化的周细胞以每孔1×104的密度接种到96孔板中24小时。贴壁后用4vt％多聚甲醛固定15分钟，然后用PBS洗涤(3×5分钟)。在室温下用6mL含0.2vt％Triton x-100的PBS溶液使细胞通透30分钟，并用10mL含5wt％BSA的PBS溶液封闭非特异性结合1小时。然后将细胞与α平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，PDGFRβ单克隆抗体，NG2单克隆抗体，CD13单克隆抗体于4℃孵育过夜。在第二天，洗涤细胞，并分别与Alexa Fluor488荧光二抗，Alexa Fluor 594荧光二在室温下避光孵育1小时。用DAPI进行核染色15分钟，然后洗涤并通过倒置生物显微镜捕获图像。
其中，所述流式细胞术为将纯化得到的原代周细胞(105级)洗涤、离心并重悬于100μL染色缓冲液(0.1％g/mLBSA的PBS)后，将细胞与特定抗体，如CD31/PECAM-1-FITC、CD140b/PDGFR-PE单克隆抗体(1μg/管)，CD140b/PDGFR-PE单克隆抗体(1μg/管)，在4℃孵育30分钟。通过染色缓冲液洗涤细胞，并以300×g离心5分钟。丢弃细胞上清液后，将细胞重悬于0.5mL缓冲液中，然后通过流式细胞仪进行检测和分析。
其中，所述鉴定方法为细胞功能及表型鉴定。
其中，所述细胞功能及表型鉴定包括但不限于成管实验和Western blotting。
其中，所述成管实验为小鼠血管内皮细胞系(MVECs)和纯化的周细胞分别用DiO和Dil染色剂标记，然后在37℃黑暗中孵育5-20分钟。将冰上融化过夜的基质胶50μL添加到预冷的96孔板的每个孔中，并在37℃下孵育0.5至1小时。将荧光标记的内皮细胞和周细胞以2×105细胞/mL的密度溶解在所需的含有10％血清的培养基中。将每孔150μL的细胞悬浮液(1.5-3×104个细胞)接种到固化的基质胶基质上，并在37℃下孵育4至12小时。通过倒置生物显微镜检查血管的形成。
其中，所述Western blotting为使用WB技术检测TGF-β1刺激后纯化的周细胞的表型变化。该方法属于本领域的现有技术，本领域技术人员可以根据现有技术知识完成常规WB流程。检测PDGFR-β、α-SMA和纤维化标记物FN1、Coll1a1的蛋白质表达水平。
本发明中，所述“完全培养基”、“DMEM培养基”、“DMEM完全培养基”和“DMEM培养液”均是一样。
本发明中，所述“DMEM培养”，若无特殊说明，均指使用DMEM完全培养液来培养细胞(常规糖)。
本实施例中，所述“％”，若无特殊说明均为质量百分比。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)不论是人或动物来源的原代腹膜血管周细胞，目前提取方法均未见报道。申请人首创腹膜周细胞的纯化方法，并对其纯度、功能、表型的鉴定提供了途径。对小鼠肠系膜进行体外原代培养，因细胞刚从组织中分离且传代数较少所以能最大程度地保持细胞原有生物学特性，是周细胞体外研究的有力工具。
(2)本发明提供一种分离、纯化及鉴定小鼠腹膜组织中血管周细胞的方法，操作简单、节约成本、耗时短的同时获得高纯度的原代细胞，条件培养后原代周细胞纯度达88.5％，联合MACS分选后纯度达97.8％。填补了腹膜周细胞领域研究的空白并解决了现有其他组织周细胞提取技术存在的缺陷。
(3)本发明采用“双酶消化法”，即II型胶原酶联合I型DNase，并于台式浓缩器上(60rpm)37℃下反应2h，再通过筛孔过滤大部分脂肪及碎块，既充分消化解离组织，又可防止细胞分离降解出的DNA导致细胞凝集。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为MyoF的来源的5种学说。
图2为小鼠腹膜血管周细胞分选流程图。
图3为小鼠腹膜血管周细胞条件培养过程及MACS分选后的细胞图。
图4为酶解、条件培养、MACS各流程后的流式细胞分析图。
图5为小鼠腹膜血管周细胞免疫荧光染色图。
图6为小鼠血管内皮细胞系和原代小鼠腹膜血管周细胞共培养成管实验。
图7为Western blotting检测小鼠腹膜血管周细胞表型转化。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
1.实验材料
1.1小鼠选择
C57BL/6小鼠(维通利华实验动物技术有限公司，中国北京)
1.2所需试剂及实验仪器
细胞来源：ATCC细胞库(
CRL-2581TM)，小鼠血管内皮细胞系(MVECs，C166-ATCC，USA)，1％青霉素-链霉素(Invitrogen，USA)，磷酸盐缓冲溶液(PBS，Invitrogen，USA)，DMEM培养液(Invitrogen，USA)，DMEM低葡萄糖培养液(Invitrogen，USA)，II型胶原酶(C6885,Sigma-Aldrich，USA)，I型DNase(D5025，Sigma-Aldrich，USA)，胰蛋白酶(25200072，Invitrogen，USA)，EDTA(1340GR100，BioForxx，Germany)，胎牛血清(FBS，Invitrogen，USA)，周细胞生长补充因子(PGS，Science Cell，USA)，小鼠FcR阻断剂(STEMCELL,Canada)，CD140b/PDGFR-β单克隆抗体(12-1402-81，Invitrogen，USA)，Cocktail蛋白酶抑制剂(STEMCELL,Canada)，Triton x-100(ST795，BeyotimeBiotechnology，中国)，α-SMA单克隆抗体(ab7817，Abcam，England)，PDGFRβ单克隆抗体(#3169，Cell Signaling，USA)，NG2单克隆抗体(sc-53389，Santa CruzBiotechnology，USA)，CD13单克隆抗体(sc-13536，Santa Cruz Biotechnology，USA)，Alexa Fluor 488荧光二抗(4412，Cell Signaling，USA)，Alexa Fluor 594荧光二抗(8890，Cell Signaling，USA)，DAPI(P1045-2，Beyotisme Biotechnology，中国)，CD31/PECAM-1-FITC单克隆抗体(111-0311-81，Invitrogen，USA)，CD140b/PDGFR-PE单克隆抗体(12-1402-81，Invitrogen，USA)，DiO(C1993S，Beyotisme Biotechnology，中国)，Dil(C1991S，Beyotisme Biotechnology，中国)，基质胶(356230，Corning，USA)，RapidSpheresTM磁珠，EasySepTM无柱免疫磁珠分选平台(STEMCELL，Cannada)，磁力架(18000，EasySepTMMagnet，STEMCELL，Cannada)手术剪，手术钳，数控圆周摇床(SLK-O3000-S，SCILGEXSK，USA)，70μm细胞过滤器(431751，Corning，USA)，离心机(5702，Eppendorf，Germany)，流式细胞仪(FC500 MPL，Beckman，USA)，倒置生物显微镜(DMI3000B，LEICA，Germany)。
2.方法，如图2所示
2.1小鼠肠系膜提取
经南京中医药大学动物伦理委员会批准，依据实验室动物护理和使用指南(1985，NIH)，将5只小鼠用CO2处死，然后浸入75vt％乙醇溶液中消毒15分钟。将每只动物置于冰上仰卧，并在腹部备皮。从胸骨下至下腹部作十字切口，充分暴露腹腔。手术镊钳取、展开结肠及空肠肠管，沿肠壁剥脱肠系膜，置于含有1vt％青霉素-链霉素的冰磷酸盐缓冲溶液)中。
2.2双酶消化
用无菌手术剪刀将肠系膜组织切成1mm×1mm的组织碎片，并在10mL含有1.5mg/mLII型胶原酶和60U/mL I型DNase的DMEM培养液中消化，在数控圆周摇床(60rpm)37℃下放置2h。加入10mL含10％胎牛血清的DMEM的预冷培养基中终止反应，并用70μm细胞过滤器过滤。然后将细胞混合物(过滤所得液体，含有细胞的悬液)在4℃下以300×g离心10分钟，并除去上清液。最后，将细胞重悬于5mL DMEM完全培养基中，并均匀接种在10cm培养皿中(在每个培养皿中培养至少5只小鼠组织中获得的原代肠系膜细胞，以便获得足够数量的微血管片段)继续于37℃培养。
2.3基本培养基的选择和培养条件的优化(条件培养)(如图3)
在种板第二天，可观察到微血管片段稳定粘附(得到双酶消化后的原代周细胞)，此时将DMEM完整培养基替换为周细胞条件培养基，即含有体积比为2％FBS、1％青霉素-链霉素、1％周细胞生长补充因子(PGS)的低葡萄糖(1g/L)DMEM培养基。每隔一天置换一半等体积的新鲜培养基(周细胞条件培养基)。此外，每天观察细胞密度和形态。其中，换液前用含有1vt％青霉素-链霉素的2mL PBS洗涤去除培养皿中漂浮的细胞碎片。在第6-7天得到具有良好生长状态的原代细胞(得到双酶消化+条件培养后的原代周细胞)。
2.4MACS分离和纯化周细胞
用周细胞条件培养基筛选具有良好生长状态的原代细胞用于MACS。使用了EasySepTM的无柱免疫磁珠分选平台，用抗体复合物和磁珠标记靶细胞，然后以阴性或阳性选择通过EasySepTM磁极，即可以快速、轻松地分离细胞并立即用于下游应用。具体包括如下步骤：
向所得具有良好生长状态的原代细胞中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的用量为2.5g/L原代细胞，于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育5min进行消化，加入与胰蛋白酶用量等体积(2mL)的完全培养基终止消化，离心1000rpm，5min，弃上清，予1mL完全培养基重悬，细胞计数，最终将细胞数调整为1×107/mL，并重悬于100μL推荐溶剂(含有2vt％FBS和1mM EDTA的PBS)中。将1μL小鼠FcR阻断剂和3μL CD140b/PDGFR-β单克隆抗体添加到细胞悬液中并混合。然后将10μL Cocktail蛋白酶抑制剂和5μLRapidSpheresTM磁珠添加到悬液中，混合并于室温下孵育10分钟。加入推荐培养基(含有0.1％BSA的PBS)，将样品定容至2.5mL，然后转移至5mL聚苯乙烯圆底管中。将试管(无盖)放入磁力架中并于室温下孵育5min。拿起磁铁，然后倒置磁铁和试管，倒掉上清液，并从试管壁上收集小鼠腹膜血管周细胞(PDGFR-β(+)周细胞)，即纯化后的周细胞(双酶消化+条件培养和MAS纯化后的原代周细胞)。
3细胞纯度检测
3.1免疫荧光
将纯化后的周细胞以每孔1×104的密度接种到96孔板中24小时。贴壁后用4vt％多聚甲醛固定15分钟，然后用PBS洗涤(3×5分钟)。在室温下用6mL含0.2vt％Triton x-100的PBS溶液使细胞通透30分钟，并用10mL含5wt％牛血清白蛋白的PBS溶液封闭非特异性结合1小时。然后将细胞与α平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(1：100v/v)，PDGFRβ单克隆抗体(1：100v/v)，NG2单克隆抗体(1：100v/v)，CD13单克隆抗体(1：100v/v)于4℃孵育过夜。在第二天，洗涤细胞，并分别与Alexa Fluor 488荧光二抗(1：1000v/v)，Alexa Fluor 594荧光二抗(1：1000v/v)在室温下避光孵育1小时。用100μLDAPI室温下进行核染色15分钟，然后洗涤并通过荧光显微镜捕获图像。结果显示PDGFR-β、NG2、α-SMA和CD13单克隆阳性(图5A)，PDGFR-β+NG2，PDGFR-β+α-SMA双阳性(图5B)。
3.2流式细胞术
分别将双酶消化后的原代周细胞，双酶消化+条件培养后原代周细胞，以及双酶消化+条件培养和MAS纯化后的原代周细胞(105级)洗涤、离心并重悬于100μL染色缓冲液(0.1％g/mL BSA的PBS)后，将细胞与特定抗体在4℃孵育30分钟，如CD31/PECAM-1-FITC单克隆抗体(1μg/管)，CD140b/PDGFR-PE单克隆抗体(1μg/管)。通过染色缓冲液洗涤细胞，并以300×g离心5分钟。丢弃细胞上清液后，将细胞重悬于0.5mL缓冲液中，然后通过流式细胞仪进行检测和分析。结果显示条件培养后原代周细胞纯度达88.5％，联合MACS分选后纯度达97.8％(图4)。
4细胞功能及表型检测
4.1成管实验
小鼠血管内皮细胞系(MVECs)和纯化的周细胞分别用DiO和Dil染色剂标记，然后在37℃黑暗中孵育5分钟。将冰上融化过夜的基质胶50μL添加到预冷的96孔板的每个孔中，并在37℃下孵育0.5小时。将荧光标记的内皮细胞和周细胞以2×105细胞/mL的密度溶解在所需的含有10％血清的DMEM培养基中。将每孔150μL的细胞悬浮液(1.5-3×104个细胞)接种到固化的基质胶基质上，并在37℃下孵育12小时。通过相差显微镜检查血管的形成，如图6，展示了纯化的原代周细胞的促进血管生成的能力。
4.2Western blotting
检测TGF-β1刺激(用浓度为10ng/mL的TGF-β1干预原代腹膜周细胞细胞24h)后纯化的周细胞的表型变化。常规Western blotting设备及试剂即可实现检测。PDGFR-β、α-SMA和纤维化标记物FN1、Coll1a1的蛋白质表达水平在TGF-β1干预后显著增加(图7)，提示TGF-β1可以诱导周细胞向肌成纤维细胞转分化。免疫荧光染色同样证实，在TGF-β1刺激后，PDGFR-β和α-SMA的荧光强度显著增加，提示肌成纤维细胞的增多(图7)。
本发明提供了一种小鼠腹膜血管周细胞的纯化方法进和鉴定方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种腹膜血管周细胞的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)肠系膜通过II型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶消化，培养，得到原代细胞；
(2)步骤(1)所得原代细胞通过胰蛋白酶消化，再通过免疫磁珠分选，即得腹膜血管周细胞。
2.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述肠系膜与II型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶的用量比为6-12g：1mg：30-40U。
3.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消化为将肠系膜与含II型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶的培养基中于30-44℃消化。
4.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消化反应终止后，过滤，所得滤液离心，所得沉淀物重悬于培养基，培养，得到原代细胞。
5.根据权利要求1或4所述纯化方法，其特征在于，所述培养的过程中，不同阶段的培养基不同，具体如下：
(i)初始为DMEM完全培养基；
(ii)在培养至微血管片段粘附时，用周细胞条件培养基置换原来的培养基；
(iii)后期每隔20-28h，用新鲜的周细胞条件培养基置换部分原来的培养基；
其中，所述周细胞条件培养基为含有体积比为2％FBS、1％青霉素-链霉素、1％周细胞生长补充因子的低葡萄糖DMEM培养基。
6.根据权利要求5所述纯化方法，其特征在于，步骤(ii)中，用周细胞条件培养基将原来的培养基全部置换；步骤(iii)中，所述部分培养基为原来培养基总体积的30％-70％。
7.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述胰蛋白酶的用量为2.5g/L原代细胞。
8.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述消化为于37℃、5％CO2消化。
9.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述消化终止后，离心，所得沉淀物重悬，得到细胞悬液，所得细胞悬液再通过免疫磁珠分选，即得腹膜血管周细胞。
10.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述免疫磁珠分选的标记物为PDGFR-β。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110544566.0A CN113151153A (zh) | 2021-05-19 | 2021-05-19 | 一种小鼠腹膜血管周细胞的纯化方法和鉴定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110544566.0A CN113151153A (zh) | 2021-05-19 | 2021-05-19 | 一种小鼠腹膜血管周细胞的纯化方法和鉴定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113151153A true CN113151153A (zh) | 2021-07-23 |
Family
ID=76876481
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110544566.0A Pending CN113151153A (zh) | 2021-05-19 | 2021-05-19 | 一种小鼠腹膜血管周细胞的纯化方法和鉴定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113151153A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115161282A (zh) * | 2022-07-22 | 2022-10-11 | 邓超 | 一种小鼠脑微血管内皮细胞与周细胞联合提取培养方法 |
-
2021
- 2021-05-19 CN CN202110544566.0A patent/CN113151153A/zh active Pending
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| FLORIAN BERNARD-PATRZYNSKI等: "Isolation of endothelial cells, pericytes and astrocytes from mouse brain", 《PLOS ONE》 * |
| PAULA DORE-DUFFY等: "The Microvascular Pericyte: Approaches to Isolation, Characterization,and Cultivation", 《ADVANCES IN EXPERIMENTAL MEDICINE AND BIOLOGY》 * |
| 上海力敏实业有限公司: "1201-sciencell周边细胞培养基PM", 《化工仪器网》 * |
| 柴本甫: "微血管周细胞的功能及潜在成骨能力", 《国外医学.创伤与外科基本问题分册》 * |
| 王应利等: "免疫磁珠法原代分离培养大鼠视网膜微血管周细胞", 《眼科新进展》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115161282A (zh) * | 2022-07-22 | 2022-10-11 | 邓超 | 一种小鼠脑微血管内皮细胞与周细胞联合提取培养方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5965436A (en) | Method of isolating mesenchymal stem cells associated with isolated megakaryocytes by isolating megakaryocytes | |
| CN107475190B (zh) | 一种脂肪svf细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途 | |
| US20220380733A1 (en) | Method for culturing urine-derived kidney stem cells and use thereof | |
| CN109797132B (zh) | 一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法 | |
| US20190264179A1 (en) | Serum-free medium inducing differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cell into insulin-secretion-like cell and preparation method and use thereof | |
| CN106591224B (zh) | 高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的方法 | |
| CN103223194A (zh) | 一种用于软骨损伤修复的软骨移植物及其制备方法 | |
| WO2023016029A1 (zh) | 一种分离来源于人类诱导多能干细胞的成纤维细胞的方法及其应用 | |
| CN111961640A (zh) | 一种尿源性肾干细胞三维分化模型的构建方法及培养体系 | |
| CN113151153A (zh) | 一种小鼠腹膜血管周细胞的纯化方法和鉴定方法 | |
| CN116836933B (zh) | 肝胆癌类器官培养液、培养试剂组合及培养方法 | |
| CN113583952B (zh) | 一种提高干细胞外泌体产量的培养液 | |
| CN116836934B (zh) | 骨肉瘤类器官培养液、培养试剂组合及培养方法 | |
| CN111454896B (zh) | 一种提高间充质干细胞促进急性髓系白血病分化能力的诱导方法 | |
| CN110846273A (zh) | 一种脂肪组织来源的间充质干细胞培养及三系分化诱导方法 | |
| CN113073077B (zh) | 一种使用封闭式系统培养临床级脐带血间充质干细胞的方法 | |
| CN104818238B (zh) | 一种鸡肠上皮细胞分离培养方法 | |
| CN108034634B (zh) | 一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法 | |
| CN110917217A (zh) | 肌肉干细胞在制备抗炎药物中的应用 | |
| CN114752590B (zh) | 一种高效且经济的猪肌肉干细胞的分离方法及其应用 | |
| CN112159790B (zh) | 从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法 | |
| CN112680410B (zh) | 诱导多能干细胞分化培养心脏成纤维细胞的方法及其培养液 | |
| CN109666642B (zh) | 一种树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞体外分离纯化的方法 | |
| CN113322226A (zh) | 三维培养胚胎干细胞来源的外泌体及在制备治疗肝纤维化药物的应用 | |
| CN107012124B (zh) | 钠钙交换体1启动子联合丹参酚酸B诱导iPSCs定向心肌分化的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210723 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |