CN113322226A - 三维培养胚胎干细胞来源的外泌体及在制备治疗肝纤维化药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三维培养胚胎干细胞来源的外泌体及其在制备治疗肝纤维化疾病的药物中的应用。胚胎干细胞的三维培养方法包括以下步骤：用普兰尼克‑F68预铺孔板；将人胚胎干细胞加入无钙镁PBS缓冲液清洗细胞，再加入细胞解离试剂GCDR，孵育后加入mTeSR^TM1培养基，吹打成单细胞悬液；在孔板中加入mTeSR^TM1培养基，然后接种单细胞悬液。本发明采用胚胎干细胞三维生长技术，高度模拟了人体细胞体内生理状态下的立体生长方式，让细胞在生理行为上与机体实际的生理环境更接近，这样状态下的细胞产生的外泌体在组成成分上与体内细胞生理状态下产生的外泌体一致或高度相似，其外泌体原始性和真实性得到保障。

Description

三维培养胚胎干细胞来源的外泌体及在制备治疗肝纤维化药 物的应用

技术领域

本发明涉及一种三维培养胚胎干细胞来源的外泌体及其在制备治疗肝纤维化疾病的药物中的应用。

背景技术

外泌体在生理病理上起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能。来源于受精卵发育一周的人胚胎干细胞可以分化成人体所有200多种细胞，具有超强的分化和再生能力，是人体所有细胞的起源细胞，对组织器官的发育和再生起着重要的调控作用。MSC(间充质干细胞)来源于人体出生后的细胞，如来自成人组织包括骨髓、脂肪组织、脐带，只能分化成人体十几个细胞，因此，从发育层次来看，人胚胎干细胞源外泌体包含MSC源外泌体不具备的特定生长因子和细胞因子。

细胞增殖、分化和代谢等生理活动都严格受到微环境的影响。细胞在二维平面生长培养的生长方式与机体内三维立体环境差别很大，导致细胞与体内生理条件下三维生长的细胞的行为、生理特点和功能存在明显差异。

中国专利申请CN105535022A和CN109913407A分别报道了用二维生长培养的人经血间充质干细胞和脂肪来源间充质干细胞分泌的外泌体对急性肝衰竭治疗及炎症调控作用。

另外，中国专利申请CN109913409A报道利用三维支架材料作为载体培养间充质干细胞，其实质是在三维支架材料上的细胞还是二维生长，仅仅通过三维培养提高培养面积来增加间充质干细胞外泌体的产量，不能改变外泌体内含物成分及功能。因此，该二维生长的细胞与体内三维生长的细胞这些显著的差异导致它们产生的外泌体在成分和功能上是无法保持一致性的，前者的外泌体原始性和真实性欠缺。

发明内容

本发明的目的是建立体外胚胎干细胞三维生长和三维培养的技术体系，这种体系可以模拟体内的生理环境，让细胞在生理行为上与机体实际的生理环境更接近。同时进一步提取三维培养胚胎干细胞外泌体，制备治疗肝纤维化疾病药物。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

胚胎干细胞的三维培养方法，包括以下步骤：

(1)用普兰尼克(Pluronic)-F68(ThermoFisher,24040032)预铺细胞培养孔板至少2小时；

(2)选取传代培养中的人胚胎干细胞(hESC)，吸弃培养基后加入无钙镁PBS缓冲液(procell，PB180327)清洗细胞，吸弃后加入细胞解离试剂GCDR(STEMCELL，Catalog#100-0485)，孵育5-10分钟后，吸弃GCDR，加入mTeSRTM1(STEMCELL，Catalog#85850)培养基，将细胞吹打成单细胞悬液；其中细胞解离试剂GCDR是一种无酶试剂，适用于分离人胚胎干细胞(ES)细胞或人诱导多能干细胞(iPS)细胞为细胞聚集物的常规传代或单细胞悬浮液。

(3)取步骤(1)的孔板，吸弃Pluronic-F68，加入mTeSRTM1培养基，然后接种步骤(2)的单细胞悬液；培养48h后每孔每天半量换液；

步骤(1)所述的Pluronic-F68，先用DMEM/F12培养基对半稀释(DMEM/F12:Pluronic-F68＝1:1(体积比))，用于预铺细胞培养孔板，置于CO₂培养箱中孵育；其中，Pluronic-F68是一种表面活性剂，具有抗吸附功能，能显著抑制细胞的附着，有助于细胞的悬浮培养。

步骤(2)所述选取传代培养中的人胚胎干细胞，是选取覆盖率70％-80％，克隆边缘规整且无分化细胞的培养孔；

步骤(2)所述加入mTeSR^TM1培养基，还同时加入10μM的Y-27632(Rocki)。

一种胚胎干细胞来源的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

上述步骤(3)中，mTeSR^TM1培养基接种单细胞悬液，培养3-6天，从第3天开始每天收集换弃的培养基，从培养基中分离纯化外泌体，得到胚胎干细胞来源的外泌体；

所述的分离纯化外泌体，包括以下步骤：

收集培养基，过滤，4℃、1000g离心10min，收集上清；再于4℃、2000g离心20min，收集上清；再于4℃、10000g离心30min，收集上清；再于110000g离心70min，弃上清，使用磷酸盐缓冲液重悬沉淀；再于110000g离心70min，弃上清，少量磷酸盐缓冲液重悬沉淀，0.22μm滤膜过滤除菌，得到胚胎干细胞来源的外泌体。

上述方法制得的三维培养胚胎干细胞来源的外泌体可以用于治疗肝纤维化疾病，具体体现在：在增强新生血管形成、肝细胞存活和减少纤维化方面表现出显著的治疗效果；更重要的是，外泌体在促进肝细胞存活、增殖和逆转肝星状细胞活化方面也表现出明显的优势。

本发明三维生长培养是将人胚胎干细胞培养成三维细胞球，细胞成立体式生长，模拟体内的细胞生理生长方式；同时采用三维悬浮培养方式，实现了无支架材料负载的三维生长三维培养模式，更加模拟体内的细胞生理生长方式和环境。

通过外泌体给药治疗，本发明证实三维生长的细胞产生的外泌体能够在增强新生血管形成、肝细胞存活和减少纤维化方面表现出比二维生长的细胞产生的外泌体更为显著的治疗效果，更重要的是，三维生长的细胞产生的外泌体在促进肝细胞存活、增殖和逆转肝星状细胞活化方面也表现出更明显的优势。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明采用的是受精卵发育一周的人体起源细胞，这种细胞具有超强的多能性和分化及再生能力，要维持这些特性必须采用有别于发育后期的细胞培养方法，必须使用人胚胎干细胞特有的培养体系。另一方面，由于处于发育的最早期，起源细胞分泌的外泌体在成分和功能上有别于发育后期的细胞。

2、本发明采用胚胎干细胞三维生长技术，高度模拟了人体细胞体内生理状态下的立体生长方式，让细胞在生理行为上与机体实际的生理环境更接近，这样状态下的细胞产生的外泌体在组成成分上与体内细胞生理状态下产生的外泌体一致或高度相似，其外泌体原始性和真实性得到保障。

正因为上述特点，将人胚胎干细胞分泌的外泌体通过给药治疗，能够在增强新生血管形成、肝细胞存活和减少纤维化方面表现出显著的治疗效果，更重要的是，外泌体在促进肝细胞存活、增殖和逆转肝星状细胞活化方面也表现出明显的优势。

附图说明

图1是人胚胎干细胞在2D和3D培养条件下的细胞形态(上，比例尺为100μm)和免疫荧光染色结果(下，比例尺为50μm)。

图2是外泌体的透射电镜图(A)和蛋白免疫杂交(Western Blot)鉴定结果(B)。

图3是外泌体进入靶细胞的荧光显微镜图，比例尺为50μm。

图4是人肝脏星状细胞中α-SMA和Collagen I的表达；*表示p<0.05；**表示p<0.01；ns表示p>0.05。

图5是各组小鼠血清中的生理生化指标的测定结果；*表示p<0.05；**表示p<0.01；ns表示p>0.05。

图6是各组小鼠肝脏中α-SMA和Collagen I的表达；*表示p<0.05；**表示p<0.01；ns表示p>0.05。

图7是注射后的第1天各脏器中外泌体的富集情况；比例尺为100μm。

图8是注射后的第7天各脏器中外泌体的富集情况；比例尺为100μm。

图9是外泌体在各脏器中的累积量分析；其中，(A)注射后的第1天，(B)注射后的第7天，(C)各脏器中PKH26荧光强度的统计分析；*表示p<0.05；**表示p<0.01；ns表示p>0.05。

图10是注射后外泌体在肝脏中的累积变化荧光图；比例尺为100μm。

图11是注射后外泌体在肝脏中的累积变化量化分析；*表示p<0.05；**表示p<0.01；ns表示p>0.05。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

人胚胎干细胞的二维生长二维培养(2D)和三维生长和三维培养(3D)

①2D培养

预铺Matrigel制备人胚胎干细胞专用培养板：在六孔板中以2mL/孔的体积预铺稀释好的Matrigel(DMEM/F12:Matrigel＝100:1)，将孔板放回CO₂培养箱中孵育24小时以上；

消化传代：选取状态良好的人胚胎干细胞一孔(状态良好：在hESC传代后4-5天时，细胞覆盖率达70％-80％左右，克隆边缘规整且无分化细胞的hESC)，吸弃培养基后加入1mL无钙镁PBS清洗细胞，吸弃后加入1mL ReLeSR^TM(STEMCELL)，并在1分钟内吸出，再将细胞放回CO₂培养箱中孵育2-3分钟，之后每孔加入1mL mTeSR^TM1培养基，轻轻拍打培养板，尽量将消化好的细胞从板底脱落下来，再用1mL的一次性移液管轻轻地将细胞吸打成小的细胞团(约十几个hESCs)。

接种：取出预铺好Matrigel的孔板，吸弃Matrigel稀释液，加入3mL mTeSR^TM1并加入10μM的Y-27632(Rocki)以提高细胞接种的存活率，吸取细胞团悬液并在包被好并加入2.5mL无血清mTeSR^TM1培养基的孔内(1:6-1:10的比例)进行培养，十字交叉摇晃孔板以使细胞均匀悬浮在培养液中，每天换液。上清收获：从第三天开始，收取细胞上清，存放于-80℃，用于外泌体的分离。

②3D培养

预铺Pluronic-F68制备低粘附孔：采用DMEM/F12培养基稀释Pluronic-F68，获得稀释的Pluronic-F68(DMEM/F12:Pluronic-F68＝1:1(体积比))；将稀释的Pluronic-F68铺在孔板中，将孔板置于CO₂培养箱中孵育至少2小时。

消化传代：在hESC传代时，选取覆盖率达70％-80％，克隆边缘规整且无分化细胞的培养孔，吸弃培养基后加入1mL无钙镁PBS缓冲液清洗细胞，吸弃后加入1mL GCDR(细胞解离试剂)，放回CO₂培养箱中孵育5-10分钟，之后吸弃孔中的GCDR，加入1mL mTeSR^TM1培养基，将细胞吹打下来并用移液器吹成单细胞悬液。

接种：吸取10μL单细胞悬液，台盼蓝染色后利用血球计数板进行计数；取出预铺好Pluronic-F68的孔板，吸弃Pluronic-F68稀释液，加入5mL mTeSR^TM1并加入10μM的Y-27632(Rocki)以提高细胞接种的存活率，吸取含有50万单细胞的细胞悬液并接种到孔中，十字交叉摇晃孔板以使细胞均匀悬浮在培养液中；

换液：在48h后每孔每天半量换液，在随后的培养过程中，Rocki不再加入培养基中；

上清收获：培养到第3天开始，收集每次换液的废旧培养基，0.22μm无菌膜过滤后，装入到50mL无菌离心管中，进行后续外泌体的分离纯化。

2D和3D培养3天后所得hESC的细胞形态如图1所示，2D培养的人胚胎干细胞呈现贴壁克隆生长，3D培养细胞则在培养基中呈球状悬浮生长。并且通过对胚胎干细胞特异性标记物Oct4和Sox4进行免疫荧光染色，结果显示2D和3D培养的胚胎干细胞都表达Oct4和Sox4，表明以上细胞符合胚胎干细胞的表型特征。

实施例2

2D和3D培养的人胚胎干细胞的外泌体的分离与鉴定

(1)外泌体(exosome)分离纯化包括：按实施例1的方法，人胚胎干细胞进行2D和3D培养，每代细胞共培养6天，从第3天开始到第6天，每天收集换弃的培养基。过滤，然后4℃，1000g离心10min，收集上清；收集的上清液4℃，2000g离心20min，收集上清；收集的上清液4℃，10000g离心30min，收集上清；收集的上清液，110000g离心70min，弃上清，使用磷酸盐缓冲液重悬沉淀；再次110000g离心70min，弃上清，少量磷酸盐缓冲液重悬沉淀，0.22μm滤膜过滤除菌，得到2-D和3-D培养人胚胎干细胞来源exosome。

(2)将2D和3D培养的人胚胎干细胞的外泌体20μL充分混匀后滴加于2mm的载样铜网上，于室温静置1min后，用滤纸轻轻吸去铜网边缘残余液体，然后将磷钨酸滴一滴于铜网上，室温下负染10分钟，最后将铜网在白炽灯下烘干。置于透射显微镜下观察并拍照。

(3)用BCA蛋白质定量试剂盒法进行外泌体的蛋白质定量检测，直接用预制的10％电泳胶，将上述提取的外泌体充分蛋白裂解后加入5倍体积的上样缓冲液(6x LoadingBuffer)，煮沸10min，按30μg蛋白质总量上样，电转移(200mA，70min)将蛋白质转至PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭1h，分别与兔抗人CD9抗体和兔抗人CD63抗体于4℃反应过夜，第二天用TBST洗膜3次，每次10分钟后，与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗室温孵育1h,TBST洗膜3次，每次10分钟后，加入ECL化学发光底物，用化学发光凝胶成像系统进行检测并拍照。

实验结果如图2所示：(A)在透射电子显微镜(TEM)下，2D-hESC外泌体和3D-hESC外泌体都表现为直径约120-140nm的圆形和杯状囊泡，颗粒状，显示出清晰的膜结构，内含低密度物质。(B)收集2D-hESC外泌体和3D-hESC外泌体，提取蛋白后进行western blot检测，结果显示：2D-hESCs和3D-hESCs来源的外泌体都表达CD9和CD63蛋白。以上结果证实从2D-hESC和3D-hESC培养基上清离心收集到的是外泌体。

实施例3

2D和3D培养人胚胎干细胞外泌体可进入靶细胞

(1)PKH26(Sigma,MIDI26)分别标记2D和3D培养人胚胎干细胞外泌体：配制PKH26染色工作液：将PKH26染液和Diluent稀释液C按体积比1:9比例混匀(常温避光操作)；外泌体染色：向实施例2步骤(1)所得外泌体加入PKH26染色工作液，充分混匀后静置孵育10min即可(常温避光操作)。

(2)人肝脏星状细胞的培养：用DMEM-高糖完全培养基(加入终浓度分别为10％FBS和1％青霉素-链霉素-庆大霉素)培养LX2细胞，约3天后细胞覆盖率达到70％-80％时进行传代。

(3)2D和3D培养人胚胎干细胞外泌体的加入：在LX2细胞传代时，选取覆盖率达70％-80％，吸弃培养基后加入1mL无钙镁PBS清洗细胞，吸弃后加入1mL 0.25％胰蛋白酶，放回CO₂培养箱中孵育5分钟，之后吸弃孔中的0.25％胰蛋白酶，加入1mL DMEM-高糖完全培养基，将细胞吹打下来并用移液器吹成单细胞悬液。按照每孔2万细胞接种到低粘附的每个孔中，贴壁培养1天后，向孔板中加入PKH26标记的2D和3D培养人胚胎干细胞外泌体。

(4)检测方法：将细胞进行多聚甲醛固定，TritonX-100通透以及山羊血清封闭后，用兔源α-tublin抗体对各组肝星状细胞进行孵育后，用IF488标记羊抗兔IgG二抗进行孵育以及DAPI标记细胞核后，对样品进行激光共聚焦检测。

实验结果如图3所示，红色为PKH26标记的2D和3D培养的人胚胎干细胞的外泌体，绿色为细胞骨架a-Tubulin，蓝色为细胞核DAPI。可以看出，PKH26标记2D和3D培养的人胚胎干细胞的外泌体穿过靶细胞的细胞膜进入到细胞质中。

实施例4

外泌体作用于TGFβ激活的正常人肝脏星状细胞

(1)人肝脏星状细胞的培养：同实施例3步骤(2)。

(2)TGFβ活化LX2细胞：培养正常人肝脏星状细胞，将P3-5代细胞以适当密度种植于6孔板，待细胞融合达70％，饥饿细胞12小时，空白组不作任何处理，实验组1加入10ng/mLTGFβ和1μg 2D培养的人胚胎干细胞的实施例2步骤(1)所得外泌体，实验组2加入10ng/mLTGFβ和1ug 3D培养的人胚胎干细胞的实施例2步骤(1)所得外泌体，分别作用48小时后，收集细胞，提取蛋白，用qPCR检测α-SMA(α-平滑肌动蛋白)，Collagen I(I型胶原蛋白)的表达。

实验结果如图4所示。

TGFβ(Transforming Growth Factor Beta1，转化生长因子β1)刺激可导致正常人肝脏星状细胞a-SMA(α-平滑肌动蛋白)、Collagen I(I型胶原蛋白)的表达明显升高，在体内这些指标的升高显示肝脏损伤的纤维化状态。2D和3D培养人胚胎干细胞外泌体可部分抑制TGFβ激活的正常人肝脏星状细胞α-SMA,Collagen I的表达，而3D培养人胚胎干细胞外泌体可较明显抑制TGFβ激活的正常人肝脏星状细胞a-SMA、Collagen I的表达，在体内这些指标的降低显示肝脏纤维化程度得到改善。

实施例5

肝纤维化模型小鼠的建立及给外泌体治疗

(1)肝纤维化模型小鼠的建立:取6-8周龄SPF级ICR小鼠经四氯化碳(CCL4)(0.2mL/kg，矿物油稀释2:3；Sigma-Aldrich)每两天腹腔注射一次，每只小鼠每天灌胃0.2mL 58％的酒精，正常对照组小鼠仅注射矿物油，整个过程持续4周。

(2)治疗分组：建模成功后，两个治疗组分别是2-D和3-D培养人胚胎干细胞外泌体治疗组，即通过小鼠尾静脉注射每两天给予50μL、浓度为1μg/mL的2-D和3-D培养人胚胎干细胞外泌体。阴性对照组(图中的PBS组)和正常对照组(图中的Con组)小鼠仅注射等量的PBS缓冲液。

(3)检测：在28天处死小鼠，取各组小鼠的血清进行生理生化指标的检测，取肝脏进行组织病理学染色以及Collagen I等关基因/蛋白表达量的检测。

实验结果如图5和图6所示。

如图5所示，2D和3D培养人胚胎干细胞外泌体能有效降低肝脏损伤指标如谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL)的水平，显著提高人体功能蛋白-血清白蛋白(ALB)的表达，这表明经外泌体治疗的肝脏损伤得到改善，肝脏功能在恢复，因此人胚胎干细胞来源的外泌体能显著增强CCL4诱导小鼠的肝功能，并且3D hESC来源的外泌体的治疗效果优于2D hESC外泌体治疗。

如图6所示，与对照组相比，结果显示2D和3D培养人胚胎干细胞外泌体治疗组小鼠肝脏组织内Collagen I和α-SMA的表达量也显著降低，与2D hESC外泌体处理组相比，3DhESC外泌体处理组中Collagen I和α-SMA的表达显著降低，显示肝脏纤维化程度得到更好地改善。

实施例6

人胚胎干细胞外泌体在ICR小鼠肝脏中积累能力增强

(1)染料工作液制备：PKH26染料试剂盒，用Diluent C稀释储存液，配制浓度为100μM的染料工作液(避光操作)。

(2)外泌体染色：按照说明书剂量，在外泌体中加入染料工作液，将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀1min，再静置孵育10min。

(3)中和染色：向孵育后的外泌体-染料复合物中加入10mL的1xPBS混匀；

(4)收集PKH26染料-外泌体：按照外泌体提取方法再次提取外泌体以去除多余染料；取100μL 1x PBS重悬沉淀物，沉淀即为染色后的外泌体。

(5)肝纤维化模型小鼠的建立：模型的建立同实施例5步骤(1)。

(4)治疗分组：分别通过小鼠尾静脉注射给予50ul、浓度为lμg/mL的PKH26染料标记的2D和3D培养人胚胎干细胞外泌体。

注射后的第1天和第7天检测外泌体在各脏器中的富集情况，结果如图7-图9所示。注射后的第1天，肝脏(Liver)是人胚胎干细胞(hESCs)外泌体富集的主要场所(图7)。注射后的第7天，肝脏中仍含有人胚胎干细胞(hESCs)外泌体(图8)。

通过不同器官的荧光信号，发现第1天和第7天，PKH26信号最强的是肝脏，其次是脾脏、肺、肾脏和心脏。综上所述，这些结果表明来自2D-hESC和3D-hESC的外泌体均能特异性靶向肝损伤部位。此外，3D-hESC-exosome比2D-hESC-Exosome积累量更多，说明更多的3D-hESC-exosome从血管中穿透，进入肝脏组织，因此具有更强的渗出和渗透入到急性肝衰竭(ALF)小鼠肝脏的能力(图9)。

重点关注注射后外泌体在肝脏中的累积，情况如图10和图11所示。

在2D-hESC-exosome和3D-hESC-Exosome处理的小鼠肝脏中，PKH26的荧光强度在第1天达到峰值，注射后第7天仍可检测到明显的PKH26信号。此外，从第1天到第7天，肝脏中PKH26标记的3D-hESC-exosome比2D-hESC-Exosome积累更多。

3D-hESC-exosome比2D-hESC-Exosome具有更强的渗出和渗透入到急性肝衰竭(ALF)小鼠肝脏的能力，这同时也间接证明本发明的3D生长细胞球的外泌体比MSC的外泌体治疗效果好，目前MSC全部都是2D生长的，本发明的人胚胎干细胞的3D生长的外泌体证明比人胚胎干细胞2D生长的外泌体治疗效果好，这也是个间接证据。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.胚胎干细胞的三维培养方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)用普兰尼克-F68预铺细胞培养孔板至少2小时；

(2)选取传代培养中的人胚胎干细胞，吸弃培养基后加入无钙镁PBS缓冲液清洗细胞，吸弃后加入细胞解离试剂GCDR，孵育5-10分钟后，吸弃GCDR，加入mTeSR^TM1培养基，将细胞吹打成单细胞悬液；

(3)取步骤(1)的孔板，吸弃Pluronic-F68，加入mTeSR^TM1培养基，然后接种步骤(2)的单细胞悬液；培养48h后每孔每天半量换液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的Pluronic-F68，先用DMEM/F12培养基对半稀释，用于预铺细胞培养孔板，置于CO₂培养箱中孵育。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述选取传代培养中的人胚胎干细胞，是选取覆盖率70％-80％、克隆边缘规整且无分化细胞的培养孔。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述加入mTeSRTM1培养基，还同时加入10μM的Y-27632。

5.一种胚胎干细胞，其特征在于：由权利要求1-4任一项所述的方法制得。

6.一种胚胎干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

在权1步骤(3)中，mTeSR^TM1培养基接种单细胞悬液，培养3-6天，从第3天开始每天收集换弃的培养基，从培养基中分离纯化外泌体，得到胚胎干细胞来源的外泌体。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

所述的分离纯化外泌体，包括以下步骤：

收集培养基，过滤，4℃、1000g离心10min，收集上清；再于4℃、2000g离心20min，收集上清；再于4℃、10000g离心30min，收集上清；再于110000g离心70min，弃上清，使用磷酸盐缓冲液重悬沉淀；再于110000g离心70min，弃上清，少量磷酸盐缓冲液重悬沉淀，0.22μm滤膜过滤除菌，得到胚胎干细胞来源的外泌体。

8.一种胚胎干细胞来源的外泌体，其特征在于：是由权利要求6或7所述的方法制得。

9.权利要求8所述胚胎干细胞来源的外泌体在制备治疗肝纤维化疾病药物中的应用。

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