CN104195102A - 诱导人胚胎干细胞向神经外胚层分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导人胚胎干细胞向神经外胚层分化的方法。保持H9细胞以细胞团状态传代，而且细胞团大小均一，能保持其细胞团高密度培养；在此基础上引入SB431542和NOGGIN两种诱导因子，利用化学成分确定的knock out serum replacer(KSR)培养基和N2培养基，在培养不同时间按不同比例配合使用上述培养基；在诱导分化后期的在N2培养基内添加抗坏血酸(维生素C)，在较短的时间内即可诱导HESC定向分化形成表达PAX6蛋白的NE细胞。

Description

诱导人胚胎干细胞向神经外胚层分化的方法

技术领域

本发明涉及一种诱导人胚胎干细胞向神经外胚层分化的方法，主要应用在干细胞定向分化的技术领域之中。

背景技术

神经外胚层(Neuroectoderm,NE)的形成是神经系统的起源,也是早期哺乳动物胚胎发育中的重要阶段。人胚胎干细胞(Humanembryonic stem cell,HESC)体外经诱导分化可形成NE，因此成为研究人早期胚胎发育中NE形成的重要平台。HESC具有自我更新(Self-renewal)和多能性(Pluripotent)的特点，体外可分化为三胚层(内胚层、中胚层和外胚层)进而分化成人体任意细胞。HESC定向神经分化更成为人神经发育研究的重要手段，也是目前干细胞研究领域的热点，对发育神经生物学研究、神经疾病的细胞替代治疗、疾病模型建立和相关药物筛选均有重要意义。

由于伦理限制，以人胚胎为对象的神经发育研究难以开展。其次，以动物胚胎为对象研究早期胚胎神经发育虽已被广泛运用，但是因种属差异仍有一定局限，难以完全替代人相关研究。再者，人类的神经发育研究，神经疾病的替代治疗，神经疾病模型建立和相关药物筛选都亟需合适的HESC衍生的神经细胞或神经组织来源。HESC向神经系统特定区域的神经细胞，例如多巴胺能神经元，脊髓运动神经元等的分化研究开展较多，而HESC的NE形成研究将为上述定向分化研究提供基础，具有较好的理论意义和实际效益。而如何寻找有效方法诱导HESC体外定向NE的形成是目前面临的难题。包括细胞密度，细胞团的大小等内源性因素和诱导因子在内的外源性因素共同在HESC体外定向分化中起到非常重要的作用。细胞团大小均一和细胞团的高密度有利于NE的分化。目前，国际上重视采用多种诱导因子的外源性因素诱导HESC形成NE的技术，但缺乏综合考虑细胞密度、细胞团大小和外源性因素结合的诱导HESC形成NE的技术。国内更是缺乏同类研究技术，也没有类似专利发布。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种诱导人胚胎干细胞向神经外胚层分化的方法，

本发明是通过以下技术方案来实现的。

一种诱导人胚胎干细胞向神经外胚层分化的方法，步骤包括：

制备KSR培养基，上述KSR培养基包括：以DMEM/F12作为溶剂、体积比在15-25％的knockout serum replacer、浓度在8-12ng/ml的FGF-2、0.08-0.12mM的beta-mercaptoethanol、体积比在0.8-1.2％的Non-essential amino acid；

制备N2培养基，上述N2培养基包括：以DMEM/F12作为溶剂、体积比在0.8-1.2％的N2supplement、8-12ng/ml的FGF2、0.08-0.12mM的beta-mercaptoethanol、体积比在0.8-1.2％的Non-essentialamino acid；

人胚胎干细胞H9细胞系接种于细胞培养板，用mTeSR^TM1培养基培养，每天换液一次；

待胞培养板中人胚胎干细胞H9细胞达到80％融合时，按照1：4比例传代；

上述80％融合的人胚胎干细胞H9细胞，使用Accutase消化20分钟，消化进行中在mTeSR^TM1培养基中加入ROCK-inhibitor，然后用含ROCK-inhibitor的mTeSR^TM1终止消化，制备成人胚胎干细胞悬液，在显微镜下用细胞计数板计数；

然后经150rpm离心15分钟,弃去上清，以10ml移液管吸取含ROCK-inhibitor的mTeSR^TM1培养基重悬细胞，缓慢轻柔吹打细胞数次，确保细胞悬液中形成小的细胞团，不形成单个细胞悬液；

然后分别按照04X10⁴cells/cm²、0.8X10⁴cells/cm²和2X10⁴cells/cm²传代在细胞培养板内；

隔天用新的不含ROCK-inhibitor的mTeSR^TM1培养基替换旧培养基，继续培养人胚胎干细胞至95％融合；

将上述KSR培养基和上述N2培养基的按照4：0、3：1、2：2、1：3、0：4的比例分别孵育上述95％融合的人胚胎干细胞，在诱导分化前5天在上述KSR培养基和上述N2培养基内均添8-12μM的SB431542和450-550ng/ml的NOGGIN；

诱导分化的第6天开始在N2培养基中添加0.18-0.22mM的Ascorbic acid，用含0.18-0.22mM的N2培养基诱导培养基继续培养至11天，每2天换液一次。

DMEM/F12(购自Hyclone公司)、knockout serum replacer(KSR)(Invitrogen产品)、FGF-2(10ng/ml)(购自Peprotech公司)、beta-mercaptoethanol(购自Invitrogen公司)、Non-essential aminoacid(NEAA)(购自Invitrogen公司)、N2supplement(购自Invitrogen公司)、SB431542(购自TOCRIS公司)、NOGGIN(购自Sigma公司)、Accutase(购自Millipore)、mTeSR^TM1(购自STEM CELL公司,货号#05850)、ROCK-inhibitor(Y-27632)(购自TOCRIS公司)、Ascorbicacid(购自Sigma公司)

其中，DMEM/F12

成分和作用原理：

DMEM/F12主要成分和浓度(浓度均为mg/ml)：无水氯化钙116.6 L-亮氨酸59.05 亚油酸0.042 五水硫酸铜0.0013 L-赖氨酸盐酸盐91.25 硫辛酸0.105 九水硝酸铁0.05 L-蛋氨酸17.24 酚红8.1 七水硫酸亚铁0.417 L-苯丙氨酸35.48 1,4-丁二胺二盐酸盐0.081 氯化钾311.8 L-丝氨酸26.25 丙酮酸钠55氯化镁28.64 L-苏氨酸53.45 维生素H0.0035 无水硫酸镁48.84 L-丙氨酸4.45 D-泛酸钙2.24 氯化钠6999.5 L-天门冬酰胺7.5 氯化胆碱8.98 无水磷酸二氢钠54.35 L-天门冬氨酸6.65 叶酸2.65 磷酸氢二钠71.02 L-半胱氨酸盐酸盐17.56 i-肌醇12.6 七水硫酸锌0.432 L-谷氨酸7.35 烟酰胺2.02 L-精氨酸盐酸盐147.5 L-脯氨酸17.25 盐酸吡哆醛2 L-胱氨酸盐酸盐31.29 L-色氨酸9.02 盐酸吡哆醇0.031 L-谷氨酰胺365L-酪氨酸38.4 核黄素0.219 甘氨酸18.75 L-缬氨酸52.85 盐酸硫胺2.17 L-组氨酸盐酸盐31.48 D-葡萄糖3151 胸苷0.365 L-异亮氨酸54.47 次黄嘌呤2 维生素B120.68)。

DMEM/F12包括十三种必须氨基酸之外的非必须氨基酸,维生素种类更多,是一种广泛使用的支持多种类型哺乳动物细胞生长的基础培养基,如神经胶质细胞,成纤维细胞,内皮细胞,大鼠成纤维细胞均可培养,这种细胞培养基非常适用于高密度克隆培养,并已经被广泛用于靶向组织中各种激素和生长因子影响的研究。

SB431542是一种强效的小分子抑制剂，选择性抑制转化生长因子β(TGF-β)I型受体活化素受体样激酶ALK5，ALK4和ALK7，通过特异性阻断ALK/Smad信号通路，SB431542抑制胚胎的自我更新，同时诱导干细胞向神经细胞分化。

NOGGIN作为一种重要的胚胎蛋白,通过拮抗骨形成蛋白(BMPs)参与胚胎及成体干细胞的增殖与分化。在胚胎神经发育及神经诱导方面有重要功能。有利于干细胞定向神经分化。

N2supplement(浓度均为1mM)：Human Transferrin(Holo):转铁蛋白，Insulin(Bovine)：胰岛素，Progesterone：黄体酮，Putrescine：腐胺，Selenite：亚硒酸钠。N2的作用主要促进干细胞定向神经分化。

抗坏血酸(维生素C)(Ascorbic acid)一方面可以促进干细胞神经分化，一方面对神经细胞还有保护作用。

本发明的有益效果：

既能保持H9细胞以细胞团状态传代，而且细胞团大小均一，能保持其细胞团高密度培养的特殊方法，同时在培养不同时间按不同比例配合使用化学成分确定的knock out serum replacer(KSR)培养基和N2培养基，并引入SB431542和NOGGIN两种诱导因子，在较短的时间内即可诱导HESC定向分化形成NE细胞。

附图说明

图1是人胚胎干细胞H9细胞单细胞传代(A)和高密度细胞团传代(B)培养24小时的生长情况图；(细胞接种后贴壁生长良好)

图2是诱导人胚胎干细胞形成神经外胚层细胞示意图；

在诱导分化的第1、2、3、4和5天(d1,d2,d3,d4和d5)，分别给予所示比例(4:0、3:1、2:2、1:3和0:4)的KSR培养基(黑色长方形)和N2培养基(白色长方形)，同时添加SB431542(SB)和NOGGIN(N)。第6天(d6)开始用添加了Ascorbic acid的N2培养基继续培养至第11天(d11)。

图3是免疫细胞化学检测结果图；

显示对照培养基培养的人胚胎干细胞表达多能性特征蛋白OCT4(A)但几乎不表达神经外胚层特征蛋白PAX6(B)。用添加了SB431542和NOGGIN的KSR培养基和N2培养基引起OCT4蛋白表达明显下降(D)，而多数细胞出现PAX6表达(E)。DAPI染色指示细胞核的形态特点和总细胞数。

图4是不同接种密度(0.4x10⁴cells/cm²，0.8X10⁴cells/cm²和2X10⁴cells/cm²)条件下PAX6的相对表达率有显著差异的示意图；

高接种密度(0.8X10⁴cells/cm2和2X10⁴cells/cm2)培养显著增加神经外胚层细胞特征蛋白PAX6的表达。

图5是RT-PCR检测结果示意图；

显示诱导分化第6天，添加SB431542和NOGGIN使神经外胚层特征基因PAX6表达明显增加的示意图；

OCT4基因的表达明显降低。内参基因GAPDH表达无明显变化。

图6是western blot检测结果示意图；

显示诱导的不同时间(第1、5、10天)，OCT4蛋白表达逐渐减少。神经细胞特征蛋白beta-III-tubulin表达明显增加。GAPDH的表达作为内参对照无明显变化。

图7是免疫细胞化学检测结果示意图；

显示诱导的第11天，神经细胞特征蛋白Nestin(A)和beta-III-tubulin(B)表达。DAPI染色(C)指示细胞核的形态特点和总细胞数。Nestin和beta-III-tubulin有共定位特点(D)。

具体实施方式

下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1人胚胎干细胞H9高密度细胞团传代培养。

1.方法

1.1H9细胞的复苏

细胞复苏前1个小时，6孔板的每孔用1mL Matrigel溶液(160μLMatrigel溶于冰上预冷的12mL的DMEM/F12培养基中)铺板，室温中放置。同时将DMEM/F12培养基，mTeSR^TM1培养基从冰箱中取出室温中放置。

1小时后将液氮中冻存的H9细胞取出，立即放入37℃水浴中。待完全融化后，将细胞混入5mL的室温的DMEM/F12培养基中，用离心机离心300g X5分钟后去除上清液。用2mL mTesR^TM1培养基轻轻重悬细胞，将悬浮细胞后转入Matrigel处理过的培养板。37℃，5％CO2培养箱培养。

1.2H9细胞的传代

细胞达到80％融合时，进行传代。

传代之前1个小时，6孔板的每孔用1mL Matrigel溶液(160μLMatrigel溶于12mL的DMEM/F12培养基中)铺板，室温中放置。

1小时后，将待传代的细胞从培养箱中拿出，用移液枪吸掉培养板中的培养液。6孔板的每孔加入1mg/mL Dispase(购自Stem cell公司)消化液约覆盖培养板底部约1mm深，消化约7分钟。吸掉消化液，加入DMEM/F12培养基轻轻冲洗一遍，注意不要将细胞冲下。

每孔加入1mL DMEM/F12培养基，用一次性无菌移液枪头将细胞克隆从培养板上刮下，边刮边轻轻吹打，注意吹打要轻，尽量让细胞保持团块状。吸取细胞悬液到15mL离心管，加入5mL DMEM/F12培养基，300g离心5分钟，弃上清。

用2mL mTesR^TM1培养基重悬细胞，按照1：4比例，接种于Matrigel处理过的培养板上，放入37℃5％CO2培养箱培养。每天换液一次。细胞达到80％融合时，继续传代。

1.3采用双标免疫荧光方法检测多能性特征蛋白OCT4和神经外胚层特征蛋白PAX6表达

将培养的人胚胎干细胞用1xPBS(购自武汉博士德公司)清洗1遍,用4％多聚甲醛固定15分钟，1xPBS清洗3遍。后用0.1％TritonX-100()孵育20分钟，1xPBST(含0.1％Tween-20的1xPBS)洗3遍。再用0.1％FBS(购自普飞生物)封闭1h,然后以anti-OCT4(购自Santa cruz公司)和anti-PAX6(购自Millipore公司)抗体在4℃孵育过夜。第二天用1XPBST洗3遍，再以荧光二抗Alexa Fluor(购自Invitrogen公司)在室温孵育2h,后用1XPBST洗3遍。然后用DAPI染料室温孵育1分钟,1xPBS清洗3遍后，封片。置于荧光显微镜下观察拍照。

1.4H9细胞高密度细胞团培养

上述80％融合的H9细胞，每孔用Accutase(Millipore)500μl消化20分钟。消化进行中，在mTeSR^TM1培养基中加入ROCK-inhibitor，然后用含ROCK-inhibitor的mTeSR^TM1终止消化，制备成单细胞悬液，在显微镜下用细胞计数板计数。经150rpm离心15分钟,弃去上清，以10ml移液管吸取含ROCK-inhibitor的mTeSR^TM1培养基重悬细胞，缓慢轻柔吹打细胞2次，确保细胞悬液中形成小的细胞团，不形成单个细胞。分别按照0.4X10⁴/cm²、0.8X10⁴/cm²和2.0X10⁴/cm²传代在Matrigel包被的6孔细胞培养板内。第二天用新的不含ROCK-inhibitor的mTeSR^TM1培养基替换旧培养基，继续培养H9细胞至95％融合。

2.结果

24小时后显微镜下可以观察到培养的细胞团贴壁生长良好，与单细胞传代方法(图1A)相比，能较好的保持细胞团大小均一和细胞团的高密度生长(图1B)。未分化的人胚胎干细胞H9细胞表达多能性特征蛋白OCT4，不表达神经外胚层标记蛋白PAX6(图3A-C)。

实施例2免疫荧光方法检测KSR培养基和N2培养基联合应用SB431542和NOGGIN诱导高密度人胚胎干细胞团分化的效果。

1.方法

实施例1中95％融合的H9细胞，弃去原培养基，分别给予不同比例(4:0、3:1、2:2、1:3和0:4)的KSR培养基和N2培养基，时间分表标记为分化的第1、2、3、4和5天(d1,d2,d3,d4和d5)(图2)。

本发明所述KSR培养基含：DMEM/F12(Hyclone),20％knockout serum replacer(KSR),10ng/ml FGF-2,0.1mMbeta-mercaptoethanol，1％Non-essential a分钟o acid(NEAA)。

本发明中所述N2培养基含：DMEM/F12(Hyclone),1％N2supplement,10ng/ml FGF2,0.1mM beta-mercaptoethanol，1％Non-essential a分钟o acid(NEAA)。

前5天同时添加SB431542和NOGGIN。SB431542配制成10mg/ml母液，-20℃保存，临用时按1：1000添加，经0.2μm滤器过滤除菌备用。NOGGIN配制成1000mg/ml母液，-20℃保存，临用时按1：500添加，经0.2μm滤器过滤除菌备用。

第6天，实施例1中所述不同细胞团密度的人胚胎干细胞衍生细胞用1xPBS清洗1遍,用4％多聚甲醛固定15分钟，1xPBS清洗3遍。后用0.1％Triton X-100孵育20分钟，1XPBST洗3遍。再用0.1％FBS封闭1h,然后以anti-OCT4和anti-PAX6抗体在4℃孵育过夜。第二天用1XPBST洗3遍，再以荧光二抗在室温孵育2h,后用1XPBST洗3遍。然后用DAPI染料室温孵育1分钟,1xPBS清洗3遍后，封片。置于荧光显微镜下观察拍照观察记录DAPI阳性的总细胞数，OCT4阳性细胞数和PAX6阳性细胞数。收集各密度组(0.4X10⁴/cm²、0.8X10⁴/cm²和2.0X10⁴/cm²)照片，用Image J软件统计DAPI阳性的总细胞数和PAX6阳性细胞数，然后计算PAX6的相对表达比率(PAX6相对表达率＝PAX6阳性细胞数/总细胞数X100％)。

2.结果

PAX6表达明显增加，OCT4表达明显减少(图3D-F)。用SPSS11.0软件进行显著性统计处理，发现高密度细胞团培养显著提高PAX6-阳性细胞数量(图4)。

实施例3PCR方法检测SB431542和NOGGIN促进人胚胎干细胞神经外胚层分化的效果

1.方法

按照实施例1进行人胚胎干细胞H9高密度细胞团方式传代培养，除按照2X10⁴/cm²传代在Matrigel包被的6孔细胞培养板内之外，其它方法均相同。培养至95％融合的H9细胞，弃去原培养基，分别给予不同比例(4:0、3:1、2:2、1:3和0:4)的KSR培养基和N2培养基，时间分别标记为分化的第1、2、3、4和5天(d1,d2,d3,d4和d5)。一组细胞用KSR和N2培养基培养，另一组细胞用KSR和N2培养基联合SB431542和NOGGIN培养。第6天收集细胞，用RNA提取试剂盒(购自Axygen公司)抽提RNA，再以cDNA合成试剂盒(购自Invitrogen公司)合成cDNA。后以上述cDNA为模版，在PCR仪上扩增相关基因。步骤如下：

1.1第一链cDNA的合成：整个操作在冰上完成

RNA模板1μl加oligo(DT)1μl加ddH₂O补齐总体积到12μl混匀，离心，放于65℃，置冰上加入下列反应物

混匀、离心，42℃水浴60分钟

70℃水浴5分钟终止反应。

1.2PCR反应体系(20μl)如下：

第一链cDNA模板1μl

正向引物0.5μl

反向引物0.5μl

PCR Master(2×)10μl

ddH₂O8μl

1.3所用引物如下：

OCT4:正向引物5’-AGTGAGAGGCAACCTGGAGA-3’反向引5’-GTGAAGTGAGGGCTCCCATA-3’；

PAX6:正向引物5’-AACAGACACAGCCCTCACAAACA-3’反向引物5’-CGGGAACTTGAACTGGAACTGAC-3’；

GAPDH:正向引物5’-GTACTCAGCGCCAGCATCG-3’反向引物5’-AGCCACATCGCTCAGACACC-3’。

1.4PCR程序设置：

95℃预变性5分钟

95℃变性30秒

55℃退火30秒

72℃延伸1分钟

72℃8分钟终止反应。

上述PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下观察记录电泳结果。

2.结果

SB431542和NOGGIN联合使用，明显增加PAX6的表达，减少OCT4的表达(图5)。

实施例4诱导神经外胚层细胞进一步分化形成神经细胞。

1.方法

实施例2中诱导分化5天得到的H9衍生神经外胚层细胞，分别收集第1天、第5天的细胞，-80℃冻存备用。自第6天(d6)开始用添加了0.2mM AA(Sigma)的N2培养基继续培养至第11天(d11)。每天换液一次。收集第10天的细胞，用RIPA裂解液裂解第1、5、10天的细胞获取蛋白。各组取等量的蛋白加6x上样缓冲液，100℃水浴5分钟，经SDS-PAGE分离蛋白成分，再通过western blot检测相关蛋白OCT4、beta-III-tubulin和GAPDH的表达。另取第十一天的神经细胞，用1xPBS清洗1遍,用4％多聚甲醛固定15分钟，1xPBS清洗3遍。后用0.1％Triton X-100孵育20分钟，1XPBST洗3遍。再用0.1％FBS封闭1h,然后以anti-NESTIN和anti-beta-III-tubulin(购自Millipore公司)抗体在4℃孵育过夜。第二天用1XPBST洗3遍，再以荧光二抗Alexa Fluor在室温孵育2h,后用1XPBST洗3遍。然后用DAPI染料室温孵育1分钟,1xPBS清洗3遍后，封片。置于荧光显微镜下观察拍照观察记录DAPI阳性的细胞数，NESTIN阳性细胞数和和anti-beta-III-tubulin阳性细胞数。

2.结果

进一步神经分化显示，OCT4的表达随神经分化明显降低，第10天完全消失。神经元特征蛋白beta-III-tubulin在分化后期明显增加(图6)。免疫染色显示获得的神经细胞同时表达NESTIN和beta-III-tubulin(图7)

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种诱导人胚胎干细胞向神经外胚层分化的方法，其特征在于，步骤包括：

制备KSR培养基，上述KSR培养基包括：以DMEM/F12作为溶剂、体积比在15-25％的knockout serum replacer、浓度在8-12ng/ml的FGF-2、0.08-0.12mM的beta-mercaptoethanol、体积比在0.8-1.2％的Non-essential amino acid；

制备N2培养基，上述N2培养基包括：以DMEM/F12作为溶剂、体积比在0.8-1.2％的N2supplement、8-12ng/ml的FGF2、0.08-0.12mM的beta-mercaptoethanol、体积比在0.8-1.2％的Non-essentialamino acid；

人胚胎干细胞H9细胞系接种于细胞培养板，用mTeSR^TM1培养基培养，每天换液一次；

待胞培养板中人胚胎干细胞H9细胞达到80％融合时，按照1：4比例传代；

上述80％融合的人胚胎干细胞H9细胞，使用Accutase消化20分钟，消化进行中在mTeSR^TM1培养基中加入ROCK-inhibitor，然后用含ROCK-inhibitor的mTeSR^TM1终止消化，制备成人胚胎干细胞悬液，在显微镜下用细胞计数板计数；

然后经150rpm离心15分钟,弃去上清，以10ml移液管吸取含ROCK-inhibitor的mTeSR^TM1培养基重悬细胞，缓慢轻柔吹打细胞数次，确保细胞悬液中形成小的细胞团，不形成单个细胞悬液；

然后分别按照04X10⁴cells/cm²、0.8X10⁴cells/cm²和2X10⁴cells/cm²传代在细胞培养板内；

隔天用新的不含ROCK-inhibitor的mTeSR^TM1培养基替换旧培养基，继续培养人胚胎干细胞至95％融合；

将上述KSR培养基和上述N2培养基的按照4：0、3：1、2：2、1：3、0：4的比例分别孵育上述95％融合的人胚胎干细胞，在诱导分化前5天在上述KSR培养基和上述N2培养基内均添8-12μM的SB431542和450-550ng/ml的NOGGIN；

诱导分化的第6天开始在N2培养基中添加0.18-0.22mM的Ascorbic acid，用含0.18-0.22mM的N2培养基诱导培养基继续培养至11天，每2天换液一次。