CN104928251B - 一种诱导多能性干细胞的培养体系 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于诱导多能性干细胞的培养基,所述培养基为LBX液体培养基,所述干细胞为猪干细胞、小鼠干细胞、猴干细胞或人干细胞;本发明还提供了使用本发明的培养基诱导多能干细胞的方法。本发明首次发明一种可以很好地提高多种诱导多能性的诱导效率的培养基。该培养基成本较低。本发明诱导的诱导多能性干细胞更倾向于小鼠样的状态,可以单个细胞传代,有利于大规模的扩增和后临床应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种诱导多能性干细胞的培养体系,具体地,本发明涉及一种诱导多能性干细胞的培养体系,其制备方法及其应用。
背景技术
小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)和人胚胎干细胞的建立开创了生物和医学的新领域,胚胎干细胞以自我更新和向各个胚层细胞分化的能力为研究个体发育和细胞分化提供了有力的工具,并在再生医学和组织工程领域具有广阔的应用前景,很快就应用于细胞治疗和疾病模型研究,它可以为人类无法自身修复的疾病(帕金森,糖尿病等)提供组织再生的替代细胞。
猪的胚胎干细胞的建立将对农业生产和生物医学起着至关重要的作用。但是目前为止还没有一株被承认的猪胚胎干细胞系被建立。在这近20年的猪胚胎干细胞研究过程中,大家在一直探索和追寻怎样才能建立出猪的胚胎干细胞并且解释猪胚胎干细胞无法容易建立的原因。最成功的猪胚胎干细胞系是在1990年被Evan等人建立,可以传10代左右,但之后会呈现上皮样细胞的生长。之后经过了一系列的努力,但没有一株胚胎干细胞系被认可,分化能力较差,更没有嵌合能力。虽然有报道猪的依赖于Activin/Nodal信号通路的上胚层干细胞系被建立,但是无论是分子标记的表达还是分化能力都不是很明确。
在没有成功的细胞系被建立时,大家都在猜测各种各样的原因,比如猪胚胎的发育时程问题,猪胚胎的着床问题,合子基因问题,多能性基因表达和饲养层等问题,但是这一切都没有好的解决手段或是针对性的分析方法,一切还是停留在描述的阶段。
自小鼠诱导多能性干细胞(induce pluripotent stem cells,iPS)细胞建立之后,人们在想是否可以通过外源基因导入的手段来建立猪的多能性干细胞系。2009第一株猪iPS细胞系被建立,之后得到多个实验室的重复,但是分子表达标记有些差异,尤其是针对SSEA1和SSEA4,但令人失望的是外源基因的表达是维持多能性状态所必须的,虽然有报道可以进行嵌合体实验,至今却没有得到其他实验室的重复。更令人奇怪的是猪iPS细胞的核移植胚胎发育率远远低于正常的体细胞,并且克隆胚胎的体内发育率更是极低,极少的胎儿能够正常出生。
虽然很多实验室进行了小分子的添加来诱导多能性干细胞。但是效果不甚理想,针对上述问题,本发明首先对诱导的培养体系的摸索和优化,能够较高效率的获得猪iPS,并且这些猪iPS更倾向于小鼠样的克隆,可以单个细胞传代,有较高的发育潜能和更好的转基因效率。由于小鼠,猴子和人的细胞也存在诱导效率较低的问题,因此,当前存在能诱导多能性干细胞并提高其诱导效率的培养基的需要。
发明内容
因此,本发明的一个目的是提供一种用于诱导多能性干细胞的培养基,本发明的另一个目的是提供该培养基的制备方法及其应用。
一方面,本发明提供了一种用于诱导多能性干细胞的培养基,所述培养基为LBX液体培养基,包括氨基酸、维生素、无机盐及其它组分;
其中,所述氨基酸包括50-150mg/L的L-精氨酸盐酸盐、10-20mg/L的L-组氨酸盐酸盐一水物、25-50mg/L的L-异亮氨酸、25-50mg/L的L-亮氨酸、40-80mg/L的L-赖氨酸盐酸盐、7-15mg/L的L-蛋氨酸、18-40mg/L的L-苯丙氨酸、17-40mg/L的L-丝氨酸、17-60mg/L的L-苏氨酸、2-8mg/L的L-色氨酸、15-50mg/L的L-酪氨酸二钠盐和10-60mg/L的L-缬氨酸;
所述维生素包括0.5-8mg/L的氯化胆碱、0.5-5mg/L的D-泛酸钙、0.5-4mg/L的叶酸、0.5-4mg/L的烟酰胺、0.5-4mg/L的盐酸吡哆醇、0.05-1mg/L的核黄素、0.5-4mg/L的盐酸硫胺素和1-10mg/L的肌醇;
所述无机盐包括30-100mg/L的无水氯化钙、2-30mg/L的无水硫酸镁、80-300mg/L的氯化钾、300-1000mg/L的碳酸氢钠、1000-5000mg/L的氯化钠和20-100mg/L的磷酸二氢钠;
所述其它组分包括500-2000mg/L的D-葡萄糖、500-2000mg/L的羟乙基哌嗪乙磺酸、0.005-0.1mg/L的辛硫酸、50-400mg/L的腐胺、100-600mg/L的丙酮酸钠、0.04-0.40mg/L的胸苷、4-50mg/L的L-肉碱、2000-20000mg/L的人转铁蛋白、0.2-3mg/L的孕酮、0.05-2mg/L的亚硒酸盐钠、2-80mg/L的乙醇胺、50-400mg/L的D-半乳糖、40-400mg/L的过氧化氢酶、2-40mg/L的谷胱甘肽、4-80mg/L的超氧化物歧化酶、30-400mg/L的视黄醇、30-400mg/L的视黄醇乙酸酯、300-4000mg/L的维生素E、300-4000mg/L的维生素E醋酸酯、0.05-0.5mg/ml的牛血清白蛋白、0.5-5μg/ml的胰岛素、500-4000U/ml的白血病抑制因子和4-100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子;
优选地,所述氨基酸还包括以下氨基酸中的一种或多种:10-50mg/L的甘氨酸、2-40mg/L的L-丙氨酸、0.83-50mg/L的L-天冬酰胺一水合物、6-50mg/L的L-天冬氨酸、1-20mg/L的L-半胱氨酸、4-100mg/L的L-半胱氨酸盐酸盐一水物、4-30mg/L的L-半胱氨酸二盐酸盐、5-70mg/L的L-谷氨酸、7-100mg/L的L-脯氨酸;
优选地,所述维生素还包括以下维生素中的一种或多种:0.5-4mg/L的维生素H、0-10mg/L的维生素b12;
优选地,所述无机盐还包括以下无机盐中的一种或多种:0-0.001mg/L的五水硫酸铜、0-0.01mg/L的九水硝酸铁、0-0.5mg/L的七水硝酸铁、0-50mg/L的无水氯化镁、4-50mg/L的无水磷酸氢二钠、0-5mg/L的七水硫酸锌;
优选地,所述其他组分包括以下的一种或多种:0.1-1mg/L的次黄嘌呤钠、400-2000mg/L的亚油酸、0-5mg/L的酚红、0.005-0.05mg/L的腐胺二盐酸、0-3000mg/L的亚麻酸、0.4-4mM的L-谷酰胺、20-200μg/ml的链霉素溶液、20-200U/mL的青霉素、0-0.1mM的β-硫基乙醇、0.5-5μM的转化生长因子抑制剂(SB431542)、0.5-3μM丝裂原活化蛋白激酶抑制剂(PD0325901)、1-10μM的肝糖原合成激酶3β(GSK3β)受体的选择性抑制剂(CHIR99021)、10-200ng/ml的维生素C;
进一步优选地,所述LBX液体培养基包括下表所述的组分:
优选地,所述干细胞为猪干细胞、小鼠干细胞、猴干细胞或人干细胞。
更优选地,所述干细胞为猪干细胞。
本发明的培养基配制方法如下:
1)根据配制的总体积,计算好所需各类组分的量;
2)将上述组分中的水溶性组分直接溶于灭菌的去离子水中,搅拌均匀;
3)其它不溶于水的组分溶于微量的DMSO中;其中,使用的DMSO的量不超过所述总体积的0.5%;
4)将步骤2)和步骤3)得到的溶液混合均匀后,定容到所述的总体积;使用滤器过滤即得。优选地,所述滤器为0.22微米的滤器。
另一方面,本发明提供一种诱导多能干细胞的方法,所述方法使用上述培养基。
优选地,所述方法包括以下步骤:将已导入多能性相关基因的供体细胞制备为单细胞悬液,并使用上述培养基诱导ips细胞。
更优选地,所述方法包括以下步骤:
1)将已导入多能性相关基因的供体细胞接种到饲养层细胞上;
优选地,所述供体细胞为成纤维细胞,更优选地,所述供体细胞为猪成纤维细胞、小鼠成纤维细胞、猴成纤维细胞或人成纤维细胞;
优选地,所述多能性相关基因为Klf4、Sox2、Nanoge和Oct4;
优选地,供体细胞与饲养层细胞的数量比优选为1:6-9,更优选为1:8;
优选地,使用胰酶将供体细胞消化成单细胞,优选地,所述胰酶的浓度为0.25g/100mL;
优选地,所述饲养层细胞为小鼠成纤维细胞;
2)将步骤1)中接种好的细胞使用10%DMEM的培养液培养1-2天;
3)弃去10%DMEM的培养液,使用如权利要求1-7中任一项所述的培养基培养细胞;
4)每隔一天更换一次培养基;
5)培养3-4天后,得到诱导多能干细胞克隆;
优选地,通过以下方法将多能性相关基因导入所述供体细胞:
1)将供体细胞接种到含有SP(青链霉素双抗溶液)的10%DMEM培养液中;优选地,所述细胞的接种密度为1.5-2*104/cm2;
其中,加入青链霉素双抗溶液后,10%DMEM培养液中链霉素的浓度为100μg/ml,青霉素的浓度为100U/mL;
2)一天后,将所述含有SP的10%DMEM培养液换成不含sp的10%DMEM,并使用含有多能性相关基因的病毒感染供体细胞;
优选地,所述多能性相关基因为Klf4、Sox2、Nanoge和Oct4;
优选地,在感染的同时,加入8μg/ml聚凝胺;
3)诱导24小时后,弃去含有病毒的培养液,换上含有sp的10%DMEM,隔天再换液一次;
其中,加入青链霉素双抗溶液后,10%DMEM培养液中链霉素的浓度为100μg/ml,青霉素的浓度为100U/mL;
4)感染后第六天得到感染好的供体细胞。
再一方面,本发明还提供了上述分化培养基在后临床中的应用。
相比较于传统的培养基,本发明培养基配方简单,成本较低,不涉及任何伦理问题,可以提高诱导效率,而且诱导的细胞具有更多的优势,而且该培养基应用的物种也非常广泛,所以不论是从基础研究还是市场推广,本发明都具有更广泛的前景。
本发明的培养基对小鼠,猴子和人的细胞进行诱导多能性干细胞也有着很好的效果。
本发明的主要前景和意义包括:
1)单细胞传代和增殖可以更好的进行基因修饰,为将来带有基因缺陷的多能性干细胞进行基因修饰并用于治疗。
2)成功获得的诱导多能性干细胞体系可以为多能性干细胞系的多能性干细胞的多能性维持提供很好的研究平台。
3)干细胞的临床应用首先必须确保是临床级别的干细胞才能将多能性干细胞应用于临床,并且能大规模扩增,无论是饲养层还是培养液中的动物源性成分都会限制干细胞的应用,但是目前关于小鼠胚胎干细胞的无饲养层培养已经非常成熟,所以小鼠样的状态人的多能性干细胞可以更快的促进将来的临床转化。
4)培养环境是多能性干细胞培养无法的避免因素,而通过目前的多能性状态的改变方法可看出相关科研人员大多用同一种培养液,尤因为目前所认为的状态都是和小鼠胚胎干细胞一样,所以将来用同一种培养液培养多物种的状态的多能性干细胞不无可能。这会为以后干细胞研究提供明确的行业标准,更易于以后的广泛交流
本发明涉及一种提高诱导多能性干细胞系的诱导效率的培养基。本发明培养基适合小鼠,猪,人,猴子等物种。本发明涉及促进诱导多能性干细胞倾向于小鼠样细胞生长,使诱导性多能干细胞具有更好的发育潜能。本发明涉及该培养基在促进诱导多能性干细胞产生中的应用。本发明首次发明一种可以很好地提高多种诱导多能性的诱导效率的培养基。该培养基只是改变了基础培养基的配方,成本较低。本发明诱导的诱导多能性干细胞更倾向于小鼠样的状态,可以单个细胞传代,有利于大规模的扩增和后临床应用。
本发明诱导的多能性干细胞符合多能性和发育潜能的各种鉴定。
本发明诱导的猪的多能性干细胞有更好的体内和体外发育效率以及转基因效率。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1为使用本发明的培养基和KOSE培养基诱导猪多能干细胞的对比;其中:
A图为猪iPS细胞在LBX和KOSR培养液中的诱导时程。0表示供体成纤维细胞刚被感染接种后的一天,第二天开始使用两种不同的培养液KOSR和本发明的培养液进行培养。10表示PEFs经过不同的培养体系诱导在第10天所呈现出的克隆状态。在LBX培养液中克隆呈现突起状,而在KOSR培养液中的克隆较为扁平。其中P3表示猪的iPS细胞系在KOSR和LBX培养液中分别被传代了三次;Bars=200μm;
B图为在不同的天数进行iPS克隆数的统计,可以发现LBX培养液中的诱导效率始终高于KOSR培养液(一种常规的iPS培养液)中;
C图为经过稳定传代的猪iPS细胞在LBX(pips_h)和KOSR(pips_m)所呈现的状态,及AP染色均为阳性,Bars=200μm;
D图为在KOSR溶液中猪iPS细胞的核型分析,超过75%的细胞呈现正常的包含38条染色体;
E图为在LBX溶液中猪iPS细胞的核型分析,超过75%的细胞呈现正常的包含38条染色体;
F图为不同培养液中的细胞活性分析,在LBX中猪iPS细胞的细胞活性明显高于在KOSR培养液中的;
G图为不同培养液中的猪iPS细胞的单克隆形成率分析。
图2示出使用本发明的培养基诱导多能干细胞,在高效得到猪iPS细胞之后PiPS_m细胞具有正常的多能性;其中:
A图为pips_m细胞多能性基因免疫荧光染色。OCT4,SSEA4和Tra1-60,均为阳性。小鼠ES细胞的特异标记SSEA1也为阳性,其中核定位用的是碘化丙啶(PI),bars=20μm;
B图为EB分化能力检测;pips_m和pips_h分别是使用本发明的培养基和KOSE培养基诱导的猪iPS细胞形成的EB,电泳图显示的为针对EB进行三胚层基因的检测,外胚层(Ncstn),中胚层(Osteonectin)和内胚层(Neurod)都有表达;
C图为神经分化能力检测;直接将EB分化成神经元细胞,TUJ1呈现阳性;其中EB是从pips-n-3细胞系形成ips_m细胞的畸胎瘤形成能力检测;
D图所选细胞系为pips-n-3,三胚层通过HE染色的方法都可以被检测到,第一幅图中能观察到上皮结构,则为内胚层;第二幅图能观察到肌肉组织,为中胚层;第三幅能观察到脑组织,为外胚层。
图3示出本发明得到了两种不同状态的猪iPS细胞的X染色体状态的分析;其中:
A图为pips_h细胞的H3K27me3的染色,上图用的是20倍的物镜,下图用的是40倍的物镜,可以明显看到斑点(spot),如箭头所示;
B图为pips_m细胞的H3K27me3的染色,上图用的是20倍的物镜,下图用的是40倍的物镜,没有斑点的显示。
图4示出本发明的pips_h和pips_m具有不同的基因表达模式,使用不同的培养基得到两种不同状态的猪iPS细胞,在细胞表型上和细胞活性上都表现出了差异;其中,
A图为pips_h和pips_m细胞外源基因(Oct4_v,Sox2_v,Klf4_v和c-Myc_v)表达水平检测,表达量相对于β-Actin;
B图为pips_h和pips_m细胞内源基因(Oct4_UTR,Sox2_UTR,Nanog_UTR和c-Myc_UTR)表达水平检测,表达量相对于β-Actin;
C图为pips_h和pips_m细胞的内源Oct4启动子甲基化测序,其中PEF为供体成纤维细胞,PA_Blastocyst为猪的孤雌囊胚,用来做阳性对照,黑色圈代表甲基化,白色圈代表未甲基化;
D图为信号通路相关基因(Fgfr1,Fgfr2,Lifr,Lif,Bmp4,bfgf和Smad4)的表达分析,表达量相对于β-Actin。
图5示出本发明的细胞系的电转效率;其中:
A图为电转质粒的图谱,RFP表示红色荧光蛋白的位点,neo表示新霉素的抗性位点;
B图为pips_m细胞的转基因细胞系,Phase是在自然光下的图片,RFP表示荧光下的图片;
C图为pips_h细胞的转基因细胞系,Phase是在自然光下的图片,RFP表示荧光下的图片。
图6示出本发明对人的体细胞诱导多能性干细胞;其中:
A图为人iPS细胞在感染后第10天分别在KOSR和LBX液体中所呈现的克隆形态,箭头所指为典型的在LBX液体中的克隆。
B图为iPS克隆效率的统计;对在不同培养体系的,在不同的天数对iPS克隆数进行统计发现LBX中的效率明显高于KOSR中的效率。
图7为使用本发明的培养基A-E诱导小鼠多能干细胞,其中实验组1、实验组2和实验组3分别为三组重复实验,其中纵坐标为第10天时出现克隆数的统计。
图8为使用本发明的培养基诱导猴的多能干细胞的结果图,能得到与诱导猪的多能干细胞相似的结果。
图9为使用不同的培养基诱导小鼠的多能干细胞的结果,跟诱导的猪多能干细胞的情况一样,产生的克隆数明显多于KOSR培养液,诱导效率明显高于KOSR培养液。
具体实施方式
除非特别指明,本文中所用到的细胞,购自中国科学院动物研究所。
除非特别指明,以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂,且可从正规渠道商购获得。
实施例1 LBX液体培养基的制备
根据表1-3中提供的组分和配比制备LBX液体培养基A-E,所述培养基的步骤如下:
1)根据配制的总体积,计算好所需各类组分的量;
2)将所述组分中的水溶性组分直接溶于灭菌的去离子水中,搅拌均匀;
3)将其它组分于微量的DMSO中进行溶解;其中,使用的DMSO的量不超过所述总体积的0.5%;
4)将步骤2)和步骤3)得到的二者混合均匀后;定容到所述的总体积;使用0.22微米滤器过滤即得。
表1培养基A和B的组成和比例,
除非特别说明,表1中各组分的浓度单位为mg/l
表2 培养基C和D的组成和比例
除非特别说明,表2中各组分的浓度单位为mg/l
组分 | 浓度范围 | 浓度范围 |
L-精氨酸盐酸盐 | 50 | 150 |
L-组氨酸盐酸盐一水物 | 10 | 20 |
L-异亮氨酸 | 25 | 50 |
L-亮氨酸 | 25 | 50 |
L-赖氨酸盐酸盐 | 40 | 80 |
L-蛋氨酸 | 7 | 15 |
L-苯丙氨酸 | 18 | 40 |
L-丝氨酸 | 17 | 40 |
L-苏氨酸 | 17 | 60 |
L-色氨酸 | 8 | 2 |
L-酪氨酸二钠盐 | 50 | 15 |
L-缬氨酸 | 60 | 10 |
氯化胆碱 | 8 | 0.5 |
D-泛酸钙 | 5 | 0.5 |
叶酸 | 4 | 0.5 |
烟酰胺 | 4 | 0.5 |
盐酸吡哆醇 | 4 | 0.5 |
核黄素 | 1 | 0.05 |
盐酸硫胺素 | 4 | 0.5 |
肌醇 | 10 | 1 |
无水氯化钙 | 30 | 100 |
无水硫酸镁 | 30 | 2 |
氯化钾 | 300 | 80 |
碳酸氢钠 | 1000 | 1000 |
氯化钠 | 5000 | 1000 |
一水磷酸二氢钠 | 100 | 20 |
D-葡萄糖 | 500 | 2000 |
羟乙基哌嗪乙磺酸 | 500 | 2000 |
硫辛酸 | 0.005 | 0.1 |
腐胺 | 50 | 400 |
丙酮酸钠 | 100 | 600 |
胸苷 | 0.40 | 0.04 |
L-肉碱 | 4 | 50 |
人转铁蛋白 | 2000 | 20000 |
孕酮 | 0.2 | 3 |
亚硒酸盐钠 | 0.05 | 2 |
乙醇胺 | 2 | 80 |
D-半乳糖 | 50 | 400 |
过氧化氢酶 | 40 | 400 |
谷胱甘肽 | 2 | 40 |
超氧化物歧化酶 | 4 | 80 |
视黄醇 | 30 | 400 |
视黄醇乙酸酯 | 30 | 400 |
生育酚/维生素E | 300 | 4000 |
维他命E醋酸酯 | 300 | 4000 |
牛血清白蛋白 | 0.05mg/ml | 0.5mg/ml |
胰岛素 | 0.5μg/ml | 5μg/ml |
白血病抑制因子 | 500U/ml | 4000U/ml |
碱性成纤维细胞生长因子 | 4ng/ml | 100ng/ml |
培养基C | 培养基D |
表3 培养基E的组成和比例
除非特别说明,表3中各组分的浓度单位为mg/l
实施例2 使用本发明的培养基诱导多能干细胞
具体实施步骤:
提前一天准备猪成纤维细胞(购自中科院动物研究所),按2*104/cm2接种于10%DMEM培养液上。
一天后先把培养基换成不含有sp的10%DMEM,再把包装了四个因子Klf4,Sox2,Nanoge,Oct4的病毒同时加到事先接种好的猪成纤维细胞里,同时加8μg/ml聚凝胺(增加感染效率)。
所述ips细胞的诱导步骤如下所述:
前期准备:需要诱导的细胞按2*104/cm2接种于含有SP的10%DMEM培养液上。
第0天:换液,换成不加sp的10%DMEM,再把包装了四个因子Klf4,Sox2,Nanoge,Oct4的病毒同时加到事先接种好的细胞里,同时加8μg/mlpolybrene(增加感染效率)。
第1天:诱导24小时后,弃去含有病毒的培养液,换上正常的含有sp的10%DMEM,之后隔天换液。
第6天:感染后第六天的细胞这个时候基本长满。此时可以用0.25%胰酶把细胞消化成单细胞接种到饲养层上,接种的比例为1:8,仍然用10%DMEM的培养液。
第7天:弃去10%DMEM的培养液,换成实施例1中的培养基E。
第8天:观察细胞。
第9天:更换实施例1中的培养基E,感染效率好的话可能会出现小的克隆。
第10天到第13天:继续换液并观察克隆的形成,这个时候克隆逐渐长大,液体颜色容易变黄,13d后细胞每天都必须进行换液,如果液体颜色在变黄的话,每个六孔板的孔加入3-4ml的液体。
实施例3 使用本发明的培养基和KOSR培养基诱导多能干细胞的比较
分别使用实施例1中的培养基E和KOSE培养基按照实施例2的方法诱导猪多能干细胞;并进行分析
其中,KOSR培养基为一种用于培养干细胞的常规培养基,本实施例中的KOSR培养基;
KOSR培养液是由以下几种成品配制而来78%KODMEM+20%KOSR+1%SP+1%L-glu+1%NEAA+0.1%β-ME,以上试剂均购自life technology公司:
其中,所述配比为体积百分数,各组分的货号或其它信息如表4所示:
表4
使用Wang,J.,et al.,Generation of Induced Pluripotent Stem Cells withHigh Efficiency from Human Umbilical Cord Blood Mononuclear Cells.GenomicsProteomics Bioinformatics.11(2013):304-311和Zhao,X.Y.,et al.,iPS cellsproduce viable mice through tetraploid complementation.Nature,2009.461(7260):p.86-90.所述的方法观察并鉴定诱导的干细胞,具体包括
3.1QRT-PCR法进行ips多能性基因的鉴定
QRT-PCR结果显示:LBX培养液诱导出的猪iPS,且相对于KOSR培养液诱导出的猪iPS来说,在多能性的表现方面能更加趋近小鼠ES细胞。
3.2多能性细胞的免疫荧光染色
多能性鉴定结果:使用本发明的培养基诱导多能干细胞,在高效得到猪iPS细胞之后PiPS_m细胞具有正常的多能性
3.3多能性细胞的体外拟胚体(EB)形成试验
鉴定结果:pips_m和pips_h分别是使用本发明的培养基和KOSE培养基诱导的猪iPS细胞形成的EB,电泳图显示的为针对EB进行三胚层基因的检测,外胚层(Ncstn),中胚层(Osteonectin)和内胚层(Neurod)都有表达;
3.4多能性细胞的神经分化试验
结果:直接将EB分化成神经元细胞,TUJ1呈现阳性;其中EB是从pips-n-3细胞系形成ips_m细胞的畸胎瘤形成能力检测
3.5小鼠胚胎干细胞多能性标志分子免疫细胞化学染色鉴定
3.6小鼠胚胎干细胞染色体核型分析结果:
本发明培养液诱导出的细胞,超过75%的细胞呈现正常的包含38条染色体;
3.7体外畸胎瘤形成试验
所述试验结果如下,其中
pips_m为使用本发明的培养基诱导的多能干细胞系;
pips_h为使用KOSR诱导的多能干细胞系;
结果见图1-5以及表5-表7;
图1为使用本发明的培养基和KOSE培养基诱导猪多能干细胞的对比。其中,A图为猪iPS细胞在LBX和KOSR培养液中的诱导时程。0表示供体成纤维细胞刚被感染接种后的一天,第二天开始使用两种不同的培养液KOSR和本发明的培养液进行培养。10表示PEFs经过不同的培养体系诱导在第10天所呈现出的克隆状态。在LBX培养液中克隆呈现突起状,而在KOSR培养液中的克隆较为扁平。其中P3表示猪的iPS细胞系在KOSR和LBX培养液中分别被传代了三次;Bars=200μm
B图为在不同的天数进行iPS克隆数的统计,可以发现LBX培养液中的诱导效率始终高于BH培养液中;
C图为经过稳定传代的猪iPS细胞在LBX(pips_h)和KOSR(pips_m)所呈现的状态,及AP染色均为阳性,Bars=200μm;
D图为在KOSR溶液中猪iPS细胞的核型分析,超过75%的细胞呈现正常的包含38条染色体;
E图为在LBX溶液中猪iPS细胞的核型分析,超过75%的细胞呈现正常的包含38条染色体;
F图为不同培养液中的细胞活性分析,在LBX中猪iPS细胞的细胞活性明显高于在KOSR培养液中的;
G图为不同培养液中的猪iPS细胞的单克隆形成率分析。
图2示出使用本发明的培养基诱导多能干细胞,在高效得到猪iPS细胞之后PiPS_m细胞具有正常的多能性;
其中,A图为pips_m细胞多能性基因免疫荧光染色。OCT4,SSEA4和Tra1-60,均为阳性。小鼠ES细胞的特异标记SSEA1也为阳性,其中核定位用的是PI,bars=20μm;
B图为EB分化能力检测;pips_m和pips_h分别是使用本发明的培养基和KOSE培养基诱导的猪iPS细胞形成的EB,电泳图显示的为针对EB进行三胚层基因的检测,外胚层(Ncstn),中胚层(Osteonectin)和内胚层(Neurod)都有表达;
C图为神经分化能力检测;直接将EB分化成神经元细胞,TUJ1呈现阳性;其中EB是从pips-n-3细胞系形成ips_m细胞的畸胎瘤形成能力检测;所选细胞系为pips-n-3。
D图:三胚层通过HE染色的方法都可以被检测到,其中第一幅图中能观察到腺体结构,则为内胚层;第二幅图能观察到脂肪组织,为中胚层;第三幅能观察到神经组织,为外胚层。
图3示出本发明得到了两种不同状态的猪iPS细胞的X染色体状态的分析;其中
A图为pips_h细胞的H3K27me3的染色,上图用的是20倍的物镜,下图用的是40倍的物镜,可以明显看到斑点(spot),如箭头所示;
B图为pips_m细胞的H3K27me3的染色,上图用的是20倍的物镜,下图用的是40倍的物镜,没有斑点的显示。
图4示出本发明的pips_h和pips_m具有不同的基因表达模式,使用不同的培养基得到两种不同状态的猪iPS细胞,在细胞表型上和细胞活性上都表现出了差异。
其中,A图为pips_h和pips_m细胞外源基因(Oct4_v,Sox2_v,Klf4_v和c-Myc_v)表达水平检测,表达量相对于β-Actin;
B图为pips_h和pips_m细胞内源基因(Oct4_UTR,Sox2_UTR,Nanog_UTR和c-Myc_UTR)表达水平检测,表达量相对于β-Actin;
C图为pips_h和pips_m细胞的内源Oct4启动子甲基化测序,其中PEF为供体成纤维细胞,PA_Blastocyst为猪的孤雌囊胚,用来做阳性对照,黑色圈代表甲基化,白色圈代表未甲基化;
D图为信号通路相关基因(Fgfr1,Fgfr2,Lifr,Lif,Bmp4,bfgf和Smad4)的表达分析,表达量相对于β-Actin。
图5示出本发明的细胞系的电转效率;
其中,A图为电转质粒的图谱,RFP表示红色荧光蛋白的位点,neo表示新霉素的抗性位点;
B图为pips_m细胞的转基因细胞系,Phase是在自然光下的图片,RFP表示荧光下的图片;
C图为pips_h细胞的转基因细胞系,Phase是在自然光下的图片,RFP表示荧光下的图片。
表5和表6示出本发明获得不同形态细胞猪iPS细胞的核移植胚胎体外发育率和体内发育率,通过对pips_h细胞和pips_m细胞的核移植实验结果进行对比发现,pips_m细胞作为供体细胞的核移植胚胎的体外发育效率高于pips_m细胞的,并且差异显著。
表5 猪iPS细胞核移植胚胎的体外发育率对比
表6 猪iPS细胞核移植胚胎的体内发育率对比
表7 猪iPS细胞核移植胚胎的体内发育率对比
结果讨论
在LBX培养液中可以高效的诱导猪iPS细胞,并且具有多能性
通过进行不同培养体系的猪iPS细胞的诱导,发现LBX诱导体系有着很高的诱导效率,并且在多能性的表现方面能更加趋近小鼠ES细胞。通过猪iPS的诱导发现,发现相对于KOSR培养液,在LBX培养液中,有很高的诱导效率,并且在单克隆形成率和细胞活性上有很大的提高。
PiPS_m细胞具有正常的多能性
在高效得到猪iPS细胞之后,首先需要确定的是这些细胞的多能性,于是对得到pips_m和pips_h细胞进行多能性的分析和分化能力的检测,通过多能性基因的染色可以看出pips_m的细胞的多能性并且还表达SSEA1,这是不同于pips_h细胞地方,和小鼠的ES细胞有些类似。pips_m细胞有很好的神经分化能力和三胚层的形成能力。这些结果表明猪的iPS细胞可以被很好的诱导出,并且在多能性方面经过各个阶段的验证。
猪iPS细胞的X染色体状态
得到了两种不同状态的猪iPS细胞,虽然它们在细胞活性水平上有着很大的差异,需要进一步摸索这种差异产生的原因,并且需要详细证明它们是处于不同的多能性状态。因此对着两种状态的iPS细胞进行X染色体状态的分析,选择同一雌性供体来源的两种状态的iPS细胞分别进行H3K27me3的染色,通过分析发现,pips_m的两条X染色体是都处于激活的状态,而对于pips_h细胞,有X染色体的失活,如图3-7所示,类似于人的ES细胞或者小鼠的EpiSC细胞。
相对于pips_h细胞,pips_m细胞具有不同的基因表达模式
得到了两种不同状态的猪iPS细胞,在细胞表型上和细胞活性上都表现出了差异。针对目前的猪iPS细胞来讲,还没有外源基因沉默的细胞系存在,并且对于内源的多能性及基因的启动也不得而知。既然这两种细胞具有不同的状态,不同的培养体系,所以还需对其进行信号通路的检测。通过外源基因和内源的基因的表达分析,发现pips_h细胞和pips_m细胞的Oct4和c-Myc外源基因的表达都没有被沉默,而在外源Sox2和Klf4的表达模式上差异很大,pips_h细胞的外源Sox2已沉默,Klf4依然表达,而pips_m细胞则反之。在内源基因启动方面,虽然内源Oct4和c-Myc的表达量都有所提高,但是针对外源基因的表达量来讲非常低,内源Sox2的表达有所启动,但是在内源Nanog的表达上有所不同,pips_h细胞的Nanog表达量更高。并且进一步对内源基因Oct4的启动子进行甲基化测序发现,这两种细胞的内源启动子基本上没有启动。通过信号通路相关基因的表达分析,pips_m细胞更倾向于Lif和Bmp4的信号通路维持,但是也有Fgf2的高表达,而pips_h更倾向bFGF的通路。
猪iPS细胞的核移植和转基因效率
建立猪iPS细胞的目的之一是进行农业生产应用。只有猪iPS细胞或其他类型细胞有较高的核移植胚胎发育率和较高的转基因效率将来才可能有所应用。尤其针对目前的猪iPS的细胞来讲,核移植胚胎的效率都很。也有相关报道给出什么样的猪iPS细胞更适宜于将来的核移植和转基因。于是进行了相关实验,通过对pips_h细胞和pips_m细胞的核移植实验结果进行对比发现,pips_m细胞作为供体细胞的核移植胚胎的体外发育效率高于pips_m细胞的,并且差异显著。pips_h细胞的核移植囊胚发育率在6%-9%之间,而pips_m细胞的核移植囊胚发育率在9%-15%之间。但是它们作为供体细胞的核移植囊胚发育率都低于正常的猪胚胎成纤维细胞(24.7±4.6%),体外核移植胚胎发育率如表4所示。之后又进行了体内发育的对比,PEFs实验组完全可以有动物的出生,而进行两株pips_h细胞来源的NT胚胎移植根本没有妊娠的发生,其他4株pips_m细胞只有一株没有妊娠,其他的都可以发育到50-60天,但是胚胎最后还是退化掉了。
进行胚胎发育率对比之后,又进行了电转效率的对比,为将来猪iPS细胞的转基因应用提供材料和理论数据。选择带有红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)转座子质粒,并且质粒带有新霉素抗性位点(neomycin-resistant(neor))。将将质粒电转到猪iPS细胞之后,通过3-4天的G418筛选,即可挑克隆建亚细胞系,两种不同状态的猪iPS细胞通过电转之后成功建立的有红色荧光的亚细胞系,同时电转之后也针对这两种状态的细胞进行了阳性克隆的统计,从而对它们的电转效率进行对比,如表5-7所示。pips_m的效率大概是pips_h的40倍,虽然Rock抑制剂Y27632可以提高pips_h的存活率,但pips_m的效率仍然远远高于pips_h的效率。
实施例4 使用本发明的LBX培养基诱导人多能性干细胞
使用本发明的实施例1中的培养基E诱导人多能干细胞,方法和步骤见实施例2.
其中,所述人多能干细胞为:诱导多能性干细胞。
结果见图6,示出本发明对人的体细胞诱导多能性干细胞;其中
A图为人iPS细胞在感染后第10天分别在BH和LBX液体中所呈现的克隆形态,箭头所指为典型的在LBX液体中的克隆。
B图为iPS克隆诱导效率的统计;在不同培养体系下,在不同的诱导天数时对iPS克隆数进行统计发现LBX中的诱导效率明显高于BH中的诱导效率。
人iPS细胞诱导结果可以看到,在LBX培养液中的诱导出的克隆更加突起饱满,并且通过效率统计发现,用LBX诱导iPS细胞效率明显高于传统的培养液。
实施例5 使用本发明的LBX培养基诱导
使用本发明的实施例1中的A-E五种培养基诱导猪多能干细胞,方法和步骤见实施例2,对供体细胞进行了三次重复实验。
结果见图7,示出A-E五种培养液对猪的体细胞的诱导效率要明显高于KOSR培养液的诱导效率;其中横坐标为A-E五种培养液,纵坐标为第10天时出现克隆数的统计。
实施例6 使用本发明的LBX培养基诱导产生其他类型的多能性干细胞
使用本发明的LBX培养液,方法和步骤见实施例2,分别对猴子和小鼠来源的供体细胞进行了多能性细胞的诱导实验。
结果见图8,9,利用本发明的LBX培养液诱导猴子和小鼠多能干细胞时,同猪的细胞一样也能产生很多形态典型的克隆,说明LBX培养液对猴子和小鼠成纤维细胞也有很好的诱导作用。
Claims (30)
1.一种用于诱导多能性干细胞的培养基,所述培养基为LBX液体培养基,包括氨基酸、维生素、无机盐及其它组分;
其中,所述氨基酸包括50-150mg/L的L-精氨酸盐酸盐、10-20mg/L的L-组氨酸盐酸盐一水物、25-50mg/L的L-异亮氨酸、25-50mg/L的L-亮氨酸、40-80mg/L的L-赖氨酸盐酸盐、7-15mg/L的L-蛋氨酸、18-40mg/L的L-苯丙氨酸、17-40mg/L的L-丝氨酸、17-60mg/L的L-苏氨酸、2-8mg/L的L-色氨酸、15-50mg/L的L-酪氨酸二钠盐和10-60mg/L的L-缬氨酸;
所述维生素包括0.5-8mg/L的氯化胆碱、0.5-5mg/L的D-泛酸钙、0.5-4mg/L的叶酸、0.5-4mg/L的烟酰胺、0.5-4mg/L的盐酸吡哆醇、0.05-1mg/L的核黄素、0.5-4mg/L的盐酸硫胺素和1-10mg/L的肌醇;
所述无机盐包括30-100mg/L的无水氯化钙、2-30mg/L的无水硫酸镁、80-300mg/L的氯化钾、300-1000mg/L的碳酸氢钠、1000-5000mg/L的氯化钠和20-100mg/L的磷酸二氢钠;
所述其它组分包括500-2000mg/L的D-葡萄糖、500-2000mg/L的羟乙基哌嗪乙磺酸、0.005-0.1mg/L的辛硫酸、50-400mg/L的腐胺、100-600mg/L的丙酮酸钠、0.04-0.40mg/L的胸苷、4-50mg/L的L-肉碱、2000-20000mg/L的人转铁蛋白、0.2-3mg/L的孕酮、0.05-2mg/L的亚硒酸盐钠、2-80mg/L的乙醇胺、50-400mg/L的D-半乳糖、40-400mg/L的过氧化氢酶、2-40mg/L的谷胱甘肽、4-80mg/L的超氧化物歧化酶、30-400mg/L的视黄醇、30-400mg/L的视黄醇乙酸酯、300-4000mg/L的维生素E、300-4000mg/L的维生素E醋酸酯、0.05-0.5mg/ml的牛血清白蛋白、0.5-5μg/ml的胰岛素、500-4000U/ml的白血病抑制因子和4-100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。
2.根据权利要求1所述的培养基,其中,所述氨基酸还包括以下氨基酸中的一种或多种:10-50mg/L的甘氨酸、2-40mg/L的L-丙氨酸、0.83-50mg/L的L-天冬酰胺一水合物、6-50mg/L的L-天冬氨酸、1-20mg/L的L-半胱氨酸、4-100mg/L的L-精氨酸盐酸盐一水物、4-30mg/L的L-半胱氨酸二盐酸盐、5-70mg/L的L-谷氨酸、7-100mg/L的L-脯氨酸。
3.根据权利要求1所述的培养基,其中,所述维生素还包括以下维生素中的一种或多种:0.5-4mg/L的维生素H、0-10mg/L的维生素b12。
4.根据权利要求1所述的培养基,其中,所述无机盐还包括以下无机盐中的一种或多种:0-0.001mg/L的五水硫酸铜、0-0.01mg/L的九水硝酸铁、0-0.5mg/L的七水硝酸铁、0-50mg/L的无水氯化镁、4-50mg/L的无水磷酸氢二钠、0-5mg/L的七水硫酸锌。
5.根据权利要求1所述的培养基,其中,所述其它组分包括以下的一种或多种:0.1-1mg/L的次黄嘌呤钠、400-2000mg/L的亚油酸、0-5mg/L的酚红、0.005-0.05mg/L的腐胺二盐酸、0-3000mg/L的亚麻酸、0.4-4mM的L-谷酰胺、20-200μg/ml的链霉素溶液、20-200U/mL的青霉素、0-0.1mM的β-硫基乙醇、0.5-5μM的转化生长因子抑制剂(SB431542)、0.5-3μM丝裂原活化蛋白激酶抑制剂(PD0325901)、1-10μM的肝糖原合成激酶3β(GSK3β)受体的选择性抑制剂(CHIR99021)、10-200ng/ml的维生素C。
6.根据权利要求1所述的培养基,所述培养基包括下表所述的组分:
7.根据权利要求1-6中任一项所述的培养基,其中,所述干细胞为猪干细胞、小鼠干细胞、猴干细胞或人干细胞。
8.根据权利要求7所述的培养基,其中,所述干细胞为猪干细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的培养基的制备方法,包括以下步骤:
1)根据配制的总体积,计算好所需各类组分的量;
2)将所需组分中的水溶性组分直接溶于灭菌的去离子水中,搅拌均匀;
3)其它不溶于水的组分溶于微量的DMSO中;其中,使用的DMSO的量不超过所述总体积的0.5%;
4)将步骤2)和步骤3)得到的溶液混合均匀后,定容到所述的总体积;使用滤器过滤即得。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其中,在步骤4)中,所述滤器为0.22微米的滤器。
11.一种诱导多能干细胞的方法,所述方法使用如权利要求1-8中任一项所述的培养基诱导多能干细胞。
12.根据权利要求11所述的方法,其中,所述方法包括以下步骤:将已导入多能性相关基因的供体细胞制备为单细胞悬液,并使用如权利要求1-8中任一项所述的培养基多能干细胞。
13.根据权利要求12所述的方法,其中,所述方法包括以下步骤:
1)将已导入多能性相关基因的供体细胞接种到饲养层细胞上;
2)将步骤1)中接种好的细胞使用10%DMEM的培养液培养1-2天;
3)弃去10%DMEM的培养液,使用如权利要求1-8中任一项所述的培养基培养细胞;
4)每隔一天更换一次培养基;
5)培养3-4天后,得到诱导多能干细胞克隆。
14.根据权利要求13所述的方法,其中,在步骤1)中,所述供体细胞为成纤维细胞。
15.根据权利要求14所述的方法,其中,在步骤1)中,所述供体细胞为猪成纤维细胞、小鼠成纤维细胞、猴成纤维细胞或人成纤维细胞。
16.根据权利要求13所述的方法,其中,在步骤1)中,所述多能性相关基因为Klf4、Sox2、Nanoge和Oct4。
17.根据权利要求13所述的方法,其中,在步骤1)中,供体细胞与饲养层细胞的数量比为1:6-9。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,在步骤1)中,供体细胞与饲养层细胞的数量比为1:8。
19.根据权利要求18所述的方法,其中,在步骤1)中,使用胰酶将供体细胞消化成单细胞。
20.根据权利要求19所述的方法,其中,在步骤1)中,所述胰酶的浓度为0.25g/100mL。
21.根据权利要求13所述的方法,其中,在步骤1)中,所述饲养层细胞为小鼠成纤维细胞。
22.根据权利要求13所述的方法,其中,在步骤1)中,通过以下方法将多能性相关基因导入所述供体细胞:
1)将供体细胞接种到含有SP的10%DMEM培养液中;2)一天后,将所述含有SP的10%DMEM培养液换成不含sp的10%DMEM,并使用含有多能性相关基因的病毒感染供体细胞;
3)诱导24小时后,弃去含有病毒的培养液,换上含有sp的10%DMEM,隔天再换液一次;
4)感染后第六天得到感染好的供体细胞。
23.根据权利要求22所述的方法,其中,在步骤1)中,所述细胞的接种密度为(1.5-2)×104/cm2。
24.根据权利要求22所述的方法,其中,在步骤1)中,加入青链霉素双抗溶液后,所述10%DMEM培养液中链霉素的浓度为100μg/ml,青霉素的浓度为100U/mL。
25.根据权利要求22所述的方法,其中,在步骤2)中,所述多能性相关基因为Klf4、Sox2、Nanoge和Oct4。
26.根据权利要求22所述的方法,其中,在步骤2)中,在感染的同时,加入8μg/ml聚凝胺。
27.根据权利要求22所述的方法,其中,在步骤3)中,加入青链霉素双抗溶液后,所述10%DMEM培养液中链霉素的浓度为100μg/ml,青霉素的浓度为100U/mL。
28.如权利要求1-8中任一项所述的培养基、权利要求11-27中任一项所述的方法在诱导多能干细胞中的应用。
29.根据权利要求28所述的应用,其中,所述干细胞为猪干细胞、小鼠干细胞、猴干细胞或人干细胞。
30.根据权利要求28所述的应用,其中,所述干细胞为猪干细胞。
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