CN110628696A

CN110628696A - 定向诱导细胞分化的小分子组合物及视网膜色素上皮细胞的制备方法

Info

Publication number: CN110628696A
Application number: CN201910804580.2A
Authority: CN
Inventors: 彭广华; 朱涵
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2039-08-28
Also published as: CN110628696B

Abstract

本发明公开了一种定向诱导细胞分化的小分子组合物及视网膜色素上皮细胞的制备方法，旨在解决诱导分化效率低、分化周期长、成本费用高等技术问题。该小分子组合物含尼克酰胺5～50ng/ml、姜黄素0.5～10μM，余量成分为水。视网膜色素上皮细胞的制备方法：将hESCs集落融合至60%～70%时去除培养液内的bFGF；培养直至形成色素细胞，再色素细胞移至铺有基质胶的培养皿，换为视网膜色素上皮细胞培养基；诱导分化培养的第1～10天加尼克酰胺；诱导分化培养的第11天起，加小分子组合物继续培养至第30天，即得。本发明能够获得高纯度的视网膜色素上皮细胞，为治疗视网膜变性疾病提供质量可靠的治疗细胞。

Description

定向诱导细胞分化的小分子组合物及视网膜色素上皮细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种定向诱导细胞分化的小分子组合物及视网膜色素上皮细胞的制备方法。

背景技术

我国是盲人最多的国家之一，最常见的致盲性疾病包括视网膜变性、青光眼、白内障、角膜病变等，而视网膜变性的发生率超过致盲性眼病的三分之一。我国视网膜病变患者已超过5000万，每年因此类疾病失明的患者近20万，是目前国际上尚无有效治疗手段的严重致盲性眼病。视网膜变性疾病主要表现为视网膜色素上皮细胞（RPE）受损变性或萎缩。PRE是位于视网膜与脉络膜之间的一种单层细胞，对于维持视网膜及其光受体细胞的正常功能起着关键的作用。RPE功能失调、变性或缺失会引起视网膜功能的减退导致盲目，目前国内外尚无逆转这种退行性过程并恢复视力的有效方法。

前人曾尝试有多种替代受损RPE的方法，如直接注射自体RPE细胞到视网膜下腔，RPE组织移植，移植胚胎视网膜组织和RPE到视网膜下腔等。新近研究中，Schwartz等开展的把人胚胎干细胞（hESCs）分化而来的RPE注入失明患者的视网膜下腔的临床实验显示，病人未产生排斥反应，同时视力有所改善。细胞替代疗法是目前治疗视网膜变性疾病的可行性途径之一。

既往研究认为，胚胎干细胞具有体外无限增殖能力和多向分化潜能，将其诱导成为RPE细胞后，移植入损伤或萎缩的视网膜下腔，治疗视网膜变性疾病，受到广泛的关注。然而，诱导人胚胎干细胞定向分化为视网膜色素上皮细胞大多存在诱导分化效率低、分化周期长、成本费用高等问题，故而难以获得足量的治疗及细胞，成为限制细胞替代疗法临床应用的瓶颈之一。

因此，亟需研发一种稳定、安全、高效的将hESCs诱导分化为RPE的方法，以提高诱导分化RPE的效率，为RPE的临床应用打下基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种定向诱导细胞分化的小分子组合物及视网膜色素上皮细胞的制备方法。该小分子组合物可诱导人胚胎干细胞定向分化为视网膜色素上皮细胞，以期解决现有技术诱导分化效率低、分化周期长、成本费用高等技术问题，从而获得高纯度的视网膜色素上皮细胞，为治疗视网膜变性疾病提供质量可靠的治疗细胞。

为解决上述技术问题，本发明采用的具体技术方案如下：

筛选得到一种定向诱导细胞分化的小分子组合物，含尼克酰胺5～50ng/ml、姜黄素0.5～10μM（μmol/L），溶剂为去离子水或蒸馏水。

所述尼克酰胺的优选浓度为10ng/mL。

所述姜黄素的优选浓度为1μM。

提供一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）将人胚胎干细胞活化培养并传代，集落融合至60%～70%时去除培养液内的bFGF，且每隔1～3天换培养液一次，直至培养形成色素团/色素灶（由细胞自然分泌的色素成分形成）后，再将色素团/色素灶移至铺有基质胶的培养皿，添加视网膜色素上皮细胞培养基进行诱导分化培养；

（2）在诱导分化培养的第1～10天内向培养基中加入尼克酰胺，使其在培养基中的浓度为5～50ng/ml，且每隔1～3天换一次培养基；

（3）从诱导分化培养的第11天起，向培养基中加入上述定向诱导细胞分化的小分子组合物继续培养，每隔1～3天换一次培养基，继续培养至第30～40天，即获得成熟的视网膜色素上皮细胞。

优选的，在所述步骤（1）中，诱导分化培养于37℃、5% CO₂条件下的细胞培养箱内进行。

所述培养液为mTeSR1培养基。

所述视网膜色素上皮细胞培养基的制备方法为：

在Knock out DMEM培养基中增添新成分，使其含有10%的KSR、1%的L-Glu、1%的NEAA、1%的PS双抗、0.1mM的β-巯基乙醇。

在所述步骤（2）中，培养基中尼克酰胺的优选浓度为10ng/mL。

优选的，在所述步骤（3）中，加入所述定向诱导细胞分化的小分子组合物，使培养基含尼克酰胺10ng/mL、姜黄素1μM。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

1.本发明首次创造性的将生物活性小分子化合物尼克酰胺和姜黄素联合应用诱导人胚胎干细胞定向分化为视网膜色素上皮细胞。

2.本发明进一步优选了最适浓度的尼克酰胺和姜黄素联合应用，结合本发明所特定的培养方法、步骤，能够显著地提高人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化效率。

3.本发明为获得高纯度视网膜色素上皮细胞提供一种可靠的培养制备方法，能低成本的为视网膜变性疾病的治疗提供有效的治疗细胞。

附图说明

图1为不同浓度的尼克酰胺在hESC向RPE分化过程中各个时间点Pax6的mRNA表达水平图。

图2为不同浓度的尼克酰胺在hESC向RPE分化过程中各个时间点Mitf的mRNA表达水平图。

图3为不同浓度的姜黄素在hESC向RPE定向分化过程中各个时间点Pax6的mRNA表达水平图。

图4为不同浓度的姜黄素在hESC向RPE定向分化过程中各个时间点Mitf的mRNA表达水平图。

图5为姜黄素和尼克酰胺联合诱导hESC分化为RPE的RPE65免疫荧光染色图。

图6为姜黄素和尼克酰胺联合诱导hESC分化为RPE的Mitf免疫荧光染色图。

图7为姜黄素和尼克酰胺联合诱导hESC分化为RPE的ZO-1免疫荧光染色图。

图8为Western blot检测姜黄素和尼克酰胺联合诱导分化hESC定向诱导分化为成熟的视网膜色素上皮细胞的蛋白表达水平电泳图。

图9为不同诱导方式下RPE相关蛋白半定量分析的统计分析结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂或产品如无特别说明，均为市售常规试剂或产品；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例：诱导人胚胎干细胞定向分化为视网膜色素上皮细胞的培养方法

1. 检测尼克酰胺或姜黄素诱导视网膜色素上皮细胞的最佳浓度

（1）按照hESC（人类胚胎干细胞H1细胞株，市购）常规培养的方法进行hESC细胞培养和传代后，使细胞生长至融合状态达到60～70%，每个克隆与克隆之间的边界清楚尚未达到接触，去除hESC细胞培养所用常规培养液内的bFGF生长因子，隔2天换液1次，细胞达到完全融合，大约在3～4周，色素灶形成。色素灶在解剖显微镜下用玻璃电极挑出，移到铺有基质胶的培养皿，同时除去mTeSR1培养基，更换为视网膜色素上皮细胞培养基（Knock out DMEM培养基中加入10%的KSR、1%的L-Glu、1%的NEAA、1%的PS双抗、0.1mM的β-巯基乙醇）；所述培养均在5%CO₂、37℃条件下的细胞培养箱内进行。

（2）选择尼克酰胺或姜黄素诱导视网膜色素上皮细胞的最佳浓度：

在视网膜色素上皮细胞培养基内分别加入尼克酰胺，使其在培养基中的浓度分别为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml，或加入姜黄素且使其在培养基中的浓度分别为0.5μM、1μM、5μM、10μM的姜黄素，分别诱导hESCs定向诱导分化为视网膜色素上皮细胞。

（3）在诱导分化的第10天、20天、30天、40天时，取出长满细胞的盖玻片，相同时间点获取细胞做荧光定量RT-PCR 检测诱导分化中视网膜色素上皮细胞中特异性基因mRNA表达量的差异。

试验检测结果如图1～4所示：

在诱导分化过程中加入不同浓度的尼克酰胺均可导致分化进程中相关蛋白Pax6的表达水平逐渐降低，而视网膜色素上皮细胞的重要标记物Mitf的表达水平逐渐升高。

图1中显示10ng/mL的尼克酰胺浓度在hESCs定向诱导分化过程的不同时间点的Pax6的表达水平最高，与同一时间点的其他浓度组相比，差异均有统计学差异（P<0.05）；

图2显示10ng/mL的尼克酰胺浓度在hESCs定向诱导分化过程的不同时间点的Mitf的表达水平最高，与同一时间点的其他浓度组相比，差异均有统计学差异（P<0.05）。

在诱导分化过程中加入不同浓度的姜黄素均可导致分化进程中的Pax6的表达水平逐渐降低，而Mitf的表达水平逐渐升高。

图3显示1μM的姜黄素浓度在hESCs定向诱导分化过程的不同时间点的Pax6的表达水平最高，与同一时间点的其它浓度组每一个时间点相比，Pax6的表达水平的差异均有统计学差异（P<0.05）；

图4显示1μM的姜黄素浓度在hESCs定向诱导分化过程的不同时间点的Mitf的表达水平最高，与同一时间点的其他浓度组相比，Mitf的表达水平的差异均有统计学差异（P<0.05）。

由上可知，选择10ng/mL的尼克酰胺和1μM的姜黄素为最佳浓度组合。

2. 诱导人胚胎干细胞定向分化为视网膜色素上皮细胞的验证试验

（1）试验分组

试验分为四组：

a. 基础诱导组：视网膜色素上皮细胞基础诱导培养液连续培养；

b. 姜黄素诱导组：第1天加入姜黄素（在培养基中的浓度1μM）的作用，每3天换液一次，并维持相同浓度的姜黄素；

c. 尼克酰胺诱导组：第1天加入尼克酰胺（在培养基中浓度为10ng/mL），每3天换液一次，并维持相同浓度的尼克酰胺；

d. 姜黄素尼克酰胺联合诱导组：第1～10天加入尼克酰胺（在培养基中浓度为10ng/mL）；第11天开始，同时再加入尼克酰胺（在培养基中浓度10ng/mL）和姜黄素（在培养基中的浓度1μM）继续培养。

每3天换液观察，注意细胞形态和生长变化，观察黑色素出现的时间，同时拍照记录。

结果显示：联合诱导组的10ng/mL的尼克酰胺和1μM的姜黄素为最佳浓度组合组，与基础条件分化组、姜黄素组或尼克酰胺组相比，诱导出成熟的视网膜色素上皮细胞的时间从40天缩短至30天；从细胞形态观察，尼克酰胺和姜黄素联合诱导组比单独使用尼克酰胺或姜黄素诱导出成熟的六角形视网膜色素上皮细胞排列密度高，细胞数显著增加。

（2）在不同分组诱导分化的第10天、20天、30天、40天时，取出长满细胞的盖玻片，进行免疫荧光染色；Western-blot检测姜黄素联合尼克酰胺诱导视网膜色素上皮细胞中蛋白表达水平的差异。

免疫组织化学结果显示联合诱导组视网膜色素上皮细胞的重要标记物RPE65和Mitf的表达较高，视网膜色素上皮细胞之间的紧密连接蛋白ZO-1表达明显高于对照组。

试验结果如图5～7所示：

图5中，A为姜黄素单独诱导hESC向hRPE定向分化第40天RPE65免疫荧光染色；

B为尼克酰胺单独诱导hESC向hRPE定向分化第40天RPE65免疫荧光染色；

C为姜黄素联合尼克酰胺诱导hESC向hRPE定向分化第30天RPE65免疫荧光染色。联合诱导组第30天的RPE65表达明显强于尼克酰胺单独诱导组第40天和姜黄素单独诱导第40天的结果；且视网膜色素上皮细胞密度比单独的姜黄素或尼克酰胺诱导组的明显增加。

图6中，A为姜黄素单独诱导hESC向hRPE定向分化第40天的Mitf免疫荧光染色；

B为尼克酰胺单独诱导hESC向hRPE定向分化第40天的Mitf免疫荧光染色；

C为姜黄素联合尼克酰胺诱导hESC向hRPE定向分化第30天的Mitf免疫荧光染色。联合诱导组第30天的Mitf表达明显强于尼克酰胺单独诱导组40天和姜黄素单独诱导40天的结果；且视网膜色素上皮细胞密度比单独的姜黄素或尼克酰胺诱导组的明显增加。

图7中，A为姜黄素单独诱导hESC向hRPE定向分化第40天的ZO-1免疫荧光染色；

B为尼克酰胺单独诱导hESC向hRPE定向分化第40天的ZO-1免疫荧光染色；

C为姜黄素联合尼克酰胺诱导hESC向hRPE定向分化第30天的ZO-1免疫荧光染色。联合诱导组30天的ZO-1表达明显强于尼克酰胺单独诱导组40天和姜黄素单独诱导40天的结果；相比单独的姜黄素或尼克酰胺诱导组，联合诱导组的视网膜色素上皮细胞紧密连接明显增多，尼克酰胺和姜黄素联合应用诱导出成熟的视网膜色素上皮细胞的紧密连接蛋白的表达、细胞融合度、细胞数目和视网膜色素上皮细胞之间的紧密连接明显增高。

Western-blot检测结果如图8所示，姜黄素和尼克酰胺联合诱导分化组与正常诱导分化组、姜黄素组、尼克酰胺组相比，联合诱导分化组视网膜色素上皮细胞的RPE65、Mitf和ZO-1的蛋白水平明显增高。

不同诱导方式下RPE相关蛋白半定量分析的统计分析结果如图9所示，姜黄素和尼克酰胺联合诱导分化组（30天）与正常分化组（48天）、姜黄素组（40天）和尼克酰胺组（40天）相比，联合诱导组的RPE65、Mitf和ZO-1蛋白表达水平比其他三组均有明显提高，差异具有统计学意义（P<0.05）。

综上可得，本发明研究中适当浓度的尼克酰胺和姜黄素联合应用能够显著地提高人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化效率。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体步骤、参数进行变更、替代，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

Claims

1.一种定向诱导细胞分化的小分子组合物，含尼克酰胺5～50ng/ml、姜黄素0.5～10μM。

2.根据权利要求1所述的定向诱导细胞分化的小分子组合物，其特征在于，所述尼克酰胺的浓度为10ng/mL。

3.根据权利要求1或2所述的定向诱导细胞分化的小分子组合物，其特征在于，所述姜黄素的浓度为1μM。

4.一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将人胚胎干细胞活化培养并传代，集落融合至60%～70%时去除培养液内的bFGF，且每隔1～3天换培养液一次，直至培养形成色素团/色素灶后，再将色素团/色素灶移至铺有基质胶的培养皿，添加视网膜色素上皮细胞培养基进行诱导分化培养；

（2）在诱导分化培养的第1～10天内向培养基中加入尼克酰胺，且使其在培养基中的浓度达到5～50ng/ml，每隔1～3天换一次培养基；

（3）从诱导分化培养的第11天起，向培养基中加入权利要求1所述定向诱导细胞分化的小分子组合物继续培养，每隔1～3天换一次培养基，持续培养至第30～40天，即获得成熟的视网膜色素上皮细胞。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，所述培养液为mTeSR1培养基。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，视网膜色素上皮细胞培养基的制备方法如下：

在Knock out DMEM培养基中加入10%的KSR、1%的L-Glu、1%的NEAA、1%的PS双抗、0.1mM的β-巯基乙醇。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，诱导分化培养于37℃、5% CO₂条件下的细胞培养箱内进行。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，尼克酰胺在培养基中的浓度为10ng/mL。

9.根据权利要求4或8所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，加入所述定向诱导细胞分化的小分子组合物后，使培养基中含尼克酰胺10ng/mL、姜黄素1μM。