CN102618488A - 一种制备视网膜色素上皮细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备视网膜色素上皮细胞的方法，利用LXR受体激活剂诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞；与现有技术相比，本发明利用LXR受体激活剂诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法不使用饲养层，从而避免动物源性饲养层带来的潜在风险，而且能提高分化效率、缩短分化时间。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及制备视网膜色素上皮细胞的方法。
背景技术
视网膜变性疾病是一类严重的致盲性疾病，主要包括视网膜色素变性(Retinal pigment degeneration，简称RP)和年龄相关性黄斑变性(Agerelatedmacular degeneration，简称AMD)等。此类疾病发病机理不明、有效防治手段有限，严重危害患者的生活质量，每年在全球范围内造成数千亿计的巨大损失。此类疾病的病理过程均是因视网膜色素上皮细胞(Retinal pigmentepithelium，简称RPE)的变性死亡所引致。故应用RPE细胞进行替代性移植治疗成为治疗此类疾病的重要手段，但RPE细胞来源有限，限制了移植治疗的临床应用。目前人胚胎干细胞(Embryonic stem cell，简称ES)诱导分化的RPE细胞成为了细胞移植治疗的研究热点，已有大量离体及在体实验证明该细胞具有类似甚至优于原代分离的人的RPE细胞。
目前诱导ES向RPE分化的方法为ES细胞在饲养层细胞上达到超级融合状态后，加入缺少成纤维细胞生长因子(bFGF)的ES完全培养基使ES的自发分化。该方法的缺点在于，第一，对胚胎干细胞本身具有较高的要求，仅部分细胞株能分化出足够量的RPE细胞；第二，分化时间较长，通常4-8周才能形成色素灶；第三，饲养层细胞本身具有抑制干细胞分化的作用，使分化效率低，通常为10-20％；第四，需要采用饲养层细胞，目前广泛使用小鼠来源的饲养层细胞，增加了动物源性污染的可能性，也有报道采用人源性的饲养层，但其技术难度较高，且来源有限，难以付诸实施。
因此，需要一种不用饲养层也能诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，从而提高分化效率、缩短分化时间，且能避免动物源性饲养层带来的潜在风险。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供一种诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞(RPE)的方法，利用核受体肝X受体(Liver X Receptor，简称LXR)激活剂诱导干细胞分化，该方法不使用饲养层，从而避免动物源性饲养层带来的潜在风险，而且能提高分化效率、缩短分化时间。
本发明提供了一种制备视网膜色素上皮细胞的方法，利用LXR受体激活剂诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞。LXR受体在视网膜多层表达，在RPE细胞的分化中起到重要作用，经试验5μM的LXR受体激动剂具有最佳的促进ES向RPE细胞分化的能力，且无明显细胞毒性作用。
优选的，所述干细胞为人胚胎干细胞；
优选的，所述诱导分化包括如下步骤：
a.接种干细胞于孔板中，加入干细胞完全培养基，放置培养并定期更换干细胞完全培养基至细胞达融合状态；
b.加入含LXR受体激动剂的诱导分化培养基，放置培养并定期更换诱导分化培养基至细胞分化形成色素灶；
c.将色素灶与周边细胞分离，并接种于孔板中，加入培养基，放置培养并定期更换培养基得视网膜色素上皮细胞。
优选的，步骤a中所述干细胞为第20-30代人胚胎干细胞；所述干细胞完全培养基为胚胎干细胞完全培养基，成分为20％血清替代物+1％非必需氨基酸+1mM谷氨酰胺+4ng成纤维细胞生长因子(bFGF)+0.1mM β-巯基乙醇；所述定期更换干细胞完全培养为每天更换一次；所述融合状态为超级融合状态。
优选的，步骤b中所述诱导分化培养基为20％血清替代物+1％非必需氨基酸+1mM谷氨酰胺+5μM LXR受体激动剂+0.1mM β-巯基乙醇；所述定期更换诱导分化培养基为隔天更换一次至2周。
优选的，步骤c中所述分离采用的器材为玻璃电极；所述接种采取的接种密度为每孔5-10个色素灶；所述孔板铺有基质胶；所述培养基为20％血清替代物+1％非必需氨基酸+1mM谷氨酰胺+0.1mM β-巯基乙醇；所述定期更换培养基为每天更换一次至4周。
优选的，步骤a或/和步骤b或/和步骤c中所述放置培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行。
与现有技术相比，本发明利用LXR受体激活剂诱导干细胞分化为视网膜上皮细胞的方法，不使用饲养层，避免了动物源性饲养层带来的潜在风险，而且能提高分化效率、缩短分化时间。
附图说明
图1为本发明人胚胎干细胞分化形成色素灶示意图；
图2为本发明色素灶边缘爬出视网膜上皮细胞示意图；
图3为本发明玻璃电极分离的色素灶示意图；
图4为本发明人胚胎干细胞分化的视网膜上皮细胞的免疫荧光鉴定示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。
本实施例制备视网膜色素上皮细胞的方法，利用肝X受体(LXR)激活剂诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞。
本实施例中，所述干细胞为人胚胎干细胞，当然也可以采用其他种类的人干细胞或者其他物种的干细胞，均能够实现发明目的，但采用人胚胎干细胞效果较佳。
本实施例中，所述诱导分化包括如下步骤：
a.接种干细胞于孔板中，加入干细胞完全培养基，放置培养并定期更换干细胞完全培养基至细胞达融合状态；
本步骤中，所述干细胞为第20代人胚胎干细胞；所述干细胞完全培养基为胚胎干细胞完全培养基，成分为20％血清替代物+1％非必需氨基酸+1mM谷氨酰胺+4ng成纤维细胞生长因子(bFGF)+0.1mM β-巯基乙醇；所述放置培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行；所述定期更换干细胞完全培养为每天更换一次；所述融合状态为超级融合状态。
b.加入含LXR受体激动剂的诱导分化培养基，放置培养并定期更换诱导分化培养基至细胞分化形成色素灶；
本步骤中，所述诱导分化培养基为20％血清替代物+1％非必需氨基酸+1mM谷氨酰胺+5μM LXR受体激动剂+0.1mM β-巯基乙醇；所述放置培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行；所述定期更换诱导分化培养基为隔天更换一次至2周。该诱导分化培养基是去除干细胞完全培养基中的bFGF且加入LXR受体激动剂构成，对细胞进行隔天换液，维持2周，部分ES细胞发生分化形成色素灶如图1。
c.将色素灶与周边细胞分离，并接种于孔板中，加入培养基，放置培养并定期更换培养基得视网膜色素上皮细胞。
本步骤中，所述分离采用的器材为玻璃电极；所述接种采取的接种密度为每孔5个色素灶；所述孔板铺有基质胶；所述培养基为20％血清替代物+1％非必需氨基酸+1mM谷氨酰胺+0.1mM β-巯基乙醇；所述放置培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行；所述定期更换培养基为每天更换一次至4周。
采用本实验室自制的玻璃电极小心分离色素灶与周边细胞，挑取色素灶细胞接种于铺有基质胶的6孔板中(5色素灶/孔)，采用20％血清替代物+1％非必需氨基酸+1mM谷氨酰胺+0.1mM β-巯基乙醇的培养基对细胞进行继续培养，每3天换液一次，维持4周，色素灶边缘爬出RPE细胞如图2。自制的玻璃电极，不遮挡视野，相较于采用塑料巴氏吸管和显微手术刀的传统方法具有更好的可操作性且不易损伤细胞，获得的色素灶完整如图3。
进一步对人ES细胞分化的RPE细胞做免疫组化鉴定，分化的RPE细胞具有与原代视网膜色素上皮细胞表达重要功能蛋白的能力，如图4所示胞内视黄醛结合蛋白(CRALBP)、RPE65蛋白、紧密连接蛋白(ZO-1)的免疫荧光鉴定图。
对于诱导分化步骤a中，人胚胎干细胞可在第20-30代中进行选择，经实验得知，均能够实现发明目的，但第20代具有更加的效果；步骤c中，接种密度在每孔5-10个色素灶均能够实现发明目的，但每孔5个色素灶效果更佳。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.一种制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：利用肝X受体(LXR)激活剂诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：所述干细胞为人胚胎干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：所述诱导分化包括如下步骤：
a.接种干细胞于孔板中，加入干细胞完全培养基，放置培养并定期更换干细胞完全培养基至细胞达融合状态；
b.加入含LXR受体激动剂的诱导分化培养基，放置培养并定期更换诱导分化培养基至细胞分化形成色素灶；
c.将色素灶与周边细胞分离，并接种于孔板中，加入培养基，放置培养并定期更换培养基得视网膜色素上皮细胞。
4.根据权利要求3所述的制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：步骤a中所述干细胞为第20-30代人胚胎干细胞；所述干细胞完全培养基为胚胎干细胞完全培养基，成分为20％血清替代物+1％非必需氨基酸+1mM谷氨酰胺+4ng成纤维细胞生长因子(bFGF)+0.1mM β-巯基乙醇；所述定期更换干细胞完全培养为每天更换一次；所述融合状态为超级融合状态。
5.根据权利要求4所述的制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：步骤b中所述诱导分化培养基为20％血清替代物+1％非必需氨基酸+1mM谷氨酰胺+5μM LXR受体激动剂+0.1mM β-巯基乙醇；所述定期更换诱导分化培养基为隔天更换一次至2周。
6.根据权利要求5所述的制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：步骤c中所述分离采用的器材为玻璃电极；所述接种采取的接种密度为每孔5-10个色素灶；所述孔板铺有基质胶；所述培养基为20％血清替代物+1％非必需氨基酸+1mM谷氨酰胺+0.1mM β-巯基乙醇；所述定期更换培养基为每天更换一次至4周。
7.根据权利要求6所述的制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：步骤a或/和步骤b或/和步骤c中所述放置培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行。
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