CN106282121A - 一种携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞及其制备方法，所述携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞分泌PEDF蛋白。本发明的技术方案采用高效的转基因技术使hUCMSCs细胞高表达PEDF蛋白，解决PEDF蛋白在眼内持续表达的技术难题，而且hUCMSCs细胞免疫原性低，以hUCMSCs细胞作为PEDF蛋白的载体注射体内，不引起免疫反应。

Description

一种携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间 充质干细胞及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞及其制备方法。
背景技术
视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa, RP）是一组以进行性感光细胞及色素上皮功能丧失为共同表现的遗传性视网膜变性疾病，以夜盲、进行性视野损害、眼底色素沉着和视网膜电图异常或无波为主要临床特征，大多数患者病变仅在眼部。研究认为RP发生的主要原因是视网膜色素上皮细胞（Retinal Pigment Epithelium, RPE）的变性、坏死和丢失。据估计全世界约有300多万患者。目前尚无有效治疗RPE变性的方法，相关治疗研究还处于探索阶段，如药物治疗、手术治疗、基因治疗、细胞移植治疗等。
色素上皮衍生因子（Pigment epithelial-derived factor, PEDF）在人体中广泛分布，在中枢和外周神经系统中的许多神经元和一些非神经组织如肝脏、心脏、骨骼肌等均有表达，PEDF在人眼组织中也广泛分布，角膜、晶状体、睫状体、视网膜和脉络膜中均检测到PEDF的表达。眼部PEDF主要由RPE细胞产生，分泌至光感受器间基质，包绕光感受器外节，发挥生理功能。PEDF在视网膜的生长发育及许多疾病中起着神经分化、神经营养、神经保护和抑制新生血管形成等作用，可对抗缺血、长期光照、H2O2和视网膜脱离等所致的视网膜变性损伤，并可对抗视网膜和脉络膜等新生血管的形成，给视网膜变性疾病和新生血管性疾病等的治疗带来希望。作为一种可溶性糖蛋白，PEDF一旦被分泌到细胞外之后，很快便代谢分解，难以持续发挥生理作用。给药途径是PEDF治疗的一个关键问题，单次眼内注射难以维持持久疗效，反复注射又存在眼内感染及其他并发症的风险，因此，寻找一种使PEDF在眼内持续表达的新方法已越来越获得广大科研工作者的关注。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞及其制备方法，采用高效的转基因技术使hUCMSCs（Humanumbilical cord mesenchymal stem cells，人脐带间充质干细胞）细胞高表达PEDF蛋白，解决了PEDF蛋白在眼内持续表达的技术难题，而且hUCMSCs细胞免疫原性低，以hUCMSCs细胞作为PEDF蛋白的载体注射体内，不引起免疫反应。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞，其分泌PEDF蛋白。
本发明还公开了一种如上所述的携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞的制备方法，其包括以下步骤：
步骤S1：取脐带剪成0.5-3mm3 大小的组织块后，加入胶原酶和胰酶消化后过滤，接种于含FBS的DMEM培养瓶内，放入培养箱中进行培养；原代培养12- 15天，胰酶常规消化后，接种传代扩增培养；当传代细胞生长接近单层汇合80%时，继续传代；
步骤S2：人工合成PEDF基因单链小片段，通过PCR 拼接成完整的双链DNA片段，其扩增产物与T-Vector pMD19(Simple)连接后转化至 E.coliCompetent Cell JM109，筛选阳性克隆，经PCR鉴定和DNA测序确定，得到PEDF 的DNA片段，即T-Vector pMD19(Simple)-PEDF；
步骤S3：PCR扩增PEDF片段和GFP（Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白）片段，将 PEDF片段、GFP片段融合获得In-Fusion，然后将In-Fusion克隆至 pLenti-CMV-hChR2-EYFP 载体中，得到pLenti-CMV-PEDF-EYFP 质粒；
步骤S4：pLenti-CMV-PEDF-EYFP质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，并涂布LB-Amp固体琼脂平板，于37℃恒温培养箱倒置培养过夜；从转化平板挑取单克隆至约LB-Amp液体培养基中，37℃振荡培养过夜；过夜菌小量提取质粒，测定浓度，酶切鉴定质粒无误后，接种至LB-Amp液体培养基中，37℃振荡培养过夜，扩大培养；第二天提取质粒，得到无内毒素质粒，并测定浓度，-20℃冻存备用；用脂质体感染慢病毒载体质粒pLenti-CMV-PEDF-EYFP和辅助质粒pDelta 8.74、pMD2.G 质粒至HEK293FT细胞，感染后48 h，超速离心收集病毒；
步骤S5：重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP感染hUCMSCs。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中，所述脐带为正常足月产健康新生儿脐带。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中，所述PCR扩增PEDF片段为以T-Vector pMD19(Simple)- PEDF质粒为模板，PCR扩增 PEDF 基因CDS区；所述PCR 扩增GFP片段为以pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒为模板，PCR扩增 GFP 序列；其中，所述PEDF 基因CDS区的序列如SEQ ID No.1所示。
作为本发明的进一步改进，所述PCR扩增的反应体系为：所述T-Vector pMD19(Simple)- PEDF质粒和pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒的50倍稀释液分别为1 μL，20 pmol/μL T-Vector pMD19(Simple)- PEDF质粒引物0.5 μL，20 pmol/μL pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒引物0.5 μL，PrimeSTAR HS（Premix）25 μL ，添加dH2O 至总体积为50 μL；反应条件为：98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 1min，30个循环；其中，所述T-Vector pMD19(Simple)- PEDF质粒引物的序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示；所述pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒引物的序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中，将 PEDF片段、GFP片段融合获得In-Fusion的反应体系为：PEDF片段、GFP片段的50倍稀释液分别为1 μL，20 pmol/μL 扩增引物0.5 μL，Tks Gflex DNA Polymerase 1 μL，2× Gflex PCR Buffer 25 μL，添加dH2O至总体积为50 μL；反应条件为：98℃ 10s，60℃ 15s，68℃ 1min，30个循环；其中，所述扩增引物的序列如SEQ ID No.6、SEQ ID No.7所示。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中，所述将In-Fusion克隆至 pLenti-CMV-hChR2-EYFP 载体中包括以下步骤：酶切pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒载体，使用TakaraMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0切胶回收载体片段，命名为 VectorDNA；将 In-Fusion 与 Vector DNA 连接，将连接产物热转化至 E.coli Competent CellJM109中，涂布平板，37℃过夜培养；挑取阳性克隆，使用如SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQID No.10所述序列的引物对质粒进行测序，克隆命名为 pLenti-CMV-PEDF-EYFP 质粒。
作为本发明的进一步改进，所述酶切pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒载体的反应体系和条件为：pLenti-CMV-hChR2-EYFP 10 μL，10× K Buffer 5 μL，10 U/μL BamH I 1.5μL，10 U/μL EcoR I 1.5 μL，添加dH2O至总体积为50 μL，37℃反应4h。
作为本发明的进一步改进，所述In-Fusion 与 Vector DNA 连接的体系及条件为：50ng/ μL Vector DNA 1 μL，80ng/ μL Insert DNA 1 μL，5×In-Fusion HD EnzymePremix 2 μL，添加dH2O至总体积为10 μL，50℃反应15min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明专利采用高效的转基因技术使hUCMSCs细胞高表达PEDF蛋白，解决PEDF蛋白在眼内持续表达的技术难题，而且hUCMSCs细胞免疫原性低，以hUCMSCs细胞作为PEDF蛋白的载体注射体内，不引起免疫反应。
附图说明
图1是本发明hUCMSCs的形态图；其中，A为原代培养10天放大40倍的hUCMSCs形态图；B为P1代培养3天放大40倍的hUCMSCs形态图。
图2是本发明hUCMSCs流式细胞仪检测结果图。
图3是本发明T-Vector pMD19(Simple)- PEDF质粒和pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒PCR产物即PEDF基因片段、GFP片段的鉴定图；其中，M1为DL2000 DNA Marker，1为PEDF基因片段，2为GFP片段。
图4是本发明PEDF和GFP融合产物In-Fusion的电泳图；其中，M1为DL2000 DNAMarker，1为In-Fusion。
图5是本发明pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒载体酶切鉴定图；其中，M1为DL2000DNA Marker，M2为λ-Hind III digest，1为pLenti-CMV-hChR2-EYFP-BamH I/EcoR I。
图6是本发明重组慢病毒感染hUCMSCs放大400倍的形态图。
图7是本发明重组慢病毒感染hUCMSCs对细胞活性的影响分析图。
图8是PEDF在重组慢病毒感染hUCMSCs的表达放大400倍的情况图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1
hUCMSCs的分离与培养、表型鉴定。
取正常足月产健康新生儿脐带，将华通氏胶剪成1mm×1mm×1mm大小，经0.1%胶原酶和0.125%胰酶消化30min，用100目和200目滤网过滤,接种于含10%FBS的DMEM培养瓶内，放入37℃、5%CO2培养箱中培养。倒置显微镜每天观察细胞生长情况。原代培养12- 15d可生长融合达到90%，胰酶常规消化后，按5000个/cm2接种传代扩增培养。当传代细胞生长接近单层汇合80%时 ，可继续传代。倒置显微镜下观察hUCMSCs的形态学特点。取第2代hUCMSCs检测细胞表型。
原代接种24 h后半量换液，可见细胞贴壁，圆形或短梭形，大小不一，第4天开始细胞逐渐伸展呈长梭形，第7天开始呈漩涡状生长，第13天可达到80%融合，0.25%胰酶消化并传代后3-5 d细胞可达80%融合， hUCMSCs的形态图如图1所示，由图1可见，细胞为长梭形，大小均一。
流式细胞仪检测第2代hUCMSCs的免疫表型CD 90、CD 73、CD 105 均呈阳性表达（>98%），而造血细胞系分子标记物CD 45呈阴性表达(0.08%)，如图2所示。
实施例2
人工合成PEDF基因。
从NCBI检索得到Homo sapiens pigment epithelium-derived factor (PEDF)mRNA (AB593013.1) 信息，其中PEDF基因CDS区1257 bp如下：
60 a
61 tgcaggccct ggtgctactc ctctgcattg gagccctcct cgggcacagc agctgccaga
121 accctgccag ccccccggag gagggctccc cagaccccga cagcacaggg gcgctggtgg
181 aggaggagga tcctttcttc aaagtccccg tgaacaagct ggcagcggct gtctccaact
241 tcggctatga cctgtaccgg gtgcgatcca gcacgagccc cacgaccaac gtgctcctgt
301 ctcctctcag tgtggccacg gccctctcgg ccctctcgct gggagcggag cagcgaacag
361 aatccatcat tcaccgggct ctctactatg acttgatcag cagcccagac atccatggta
421 cctataagga gctccttgac acggtcaccg ccccccagaa gaacctcaag agtgcctccc
481 ggatcgtctt tgagaagaag ctgcgcataa aatccagctt tgtggcacct ctggaaaagt
541 catatgggac caggcccaga gtcctgacgg gcaaccctcg cttggacctg caagagatca
601 acaactgggt gcaggcgcag atgaaaggga agctcgccag gtccacaaag gaaattcccg
661 atgagatcag cattctcctt ctcggtgtgg cgcacttcaa ggggcagtgg gtaacaaagt
721 ttgactccag aaagacttcc ctcgaggatt tctacttgga tgaagagagg accgtgaggg
781 tccccatgat gtcggaccct aaggctgttt tacgctatgg cttggattca gatctcagct
841 gcaagattgc ccagctgccc ttgaccggaa gcatgagtat catcttcttc ctgcccctga
901 aagtgaccca gaatttgacc ttgatagagg agagcctcac ctccgagttc attcatgaca
961 tagaccgaga actgaagacc gtgcaggcgg tcctcactgt ccccaagctg aagctgagtt
1021 acgaaggcga agtcaccaag tccctgcagg agatgaagct gcaatccttg tttgattcac
1081 cagactttag caagatcaca ggcaaaccca tcaagctgac tcaggtggaa caccgggctg
1141 gctttgagtg gaacgaggat ggggcgggaa ccacccccag cccagggctg cagcctgccc
1201 acctcacctt cccgctggac tatcacctta accagccttt catcttcgta ctgagggaca
1261 cagacacagg ggcccttctc ttcattggca agattctgga ccccaggggc ccctaa（如SEQID No.1所示）。
人工合成PEDF基因单链小片段，通过PCR 拼接成完整的双链DNA片段，扩增产物与T-Vector pMD19(Simple)连接后转化至 E.coli Competent Cell JM109，筛选阳性克隆，经PCR鉴定和DNA测序确定，得到预期的DNA片段，即T-Vector pMD19(Simple)- PEDF。
实施例3
PCR 扩增 PEDF 基因片段和GFP片段，融合后克隆至 pLenti-CMV-hChR2-EYFP 载体中。
以T-Vector pMD19(Simple)- PEDF质粒为模板，PCR扩增 PEDF 基因CDS区，以pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒为模板，PCR扩增 GFP 序列。反应体系为：T-Vector pMD19(Simple)- PEDF质粒和pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒（50倍稀释液）分别为1 μL，20 pmol/μL T-Vector pMD19(Simple)- PEDF质粒引物0.5 μL，20 pmol/μL pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒引物0.5 μL，PrimeSTAR HS（Premix）25 μL ，添加dH2O 至总体积为50 μL。反应条件：98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 1min，30个循环。获得PCR产物A、B，取 5 μL 进行 1%琼脂糖凝胶电泳。使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0切胶回收目的片段，分别命名为 PEDF片段、GFP片段。T-Vector pMD19(Simple)- PEDF质粒和pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒PCR产物（PEDF基因片段、GFP片段）鉴定图如图3所示，表明扩增产物正确。
上述过程中，所述T-Vector pMD19(Simple)- PEDF质粒引物的序列为：
引物F：5’-CGAAATTAATGGATCCCCGGGTACCGGTGC-3’，（如SEQ ID No.2所示）；
引物R：5’-TGGCGGCCGCGGGGCCCCTGGGGTCCAGAATCTT- 3’（如SEQ ID No.3所示）；
所述pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒引物序列为：
引物F：5’-CAGGGGCCCCGCGGCCGCCACCATGGTGAG- 3’，（如SEQ ID No.4所示）；
引物R：5’-GCTTGATATCGAATTCTTACTTGTACAGCT- 3’（如SEQ ID No.5所示）；
将 PEDF片段、GFP片段融合获得In-Fusion。反应体系：PEDF片段、GFP片段（50倍稀释液）分别为1 μL，20 pmol/μL 扩增引物0.5 μL，Tks Gflex DNA Polymerase 1 μL，2×Gflex PCR Buffer 25 μL，添加dH2O至总体积为50 μL。反应条件：98℃ 10s，60℃ 15s，68℃ 1min，30个循环。取 5 μL 进行 1%琼脂糖凝胶电泳。PEDF和GFP融合产物In-Fusion的电泳图如图4所示，可见，目的片段正确。使用 Takara MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0切胶回收目的片段，命名为In-Fusion。
其中，所述扩增引物的序列为：
F：5’-CGAAATTAATGGATCCCCGGGTACCGGTGC- 3’，（如SEQ ID No.6所示）；
R：5’-GCTTGATATCGAATTCTTACTTGTACAGCT- 3’ （如SEQ ID No.7所示）。
酶切pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒载体。反应体系和条件为：pLenti-CMV-hChR2-EYFP 10 μL，10× K Buffer 5 μL，10 U/μL BamH I 1.5 μL，10 U/μL EcoR I 1.5 μL，添加dH2O至总体积为50 μL，37℃反应4h。取 5 μL 进行 1%琼脂糖凝胶电泳。使用TakaraMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0切胶回收载体片段，命名为 VectorDNA。pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒载体酶切鉴定图如图5所示，由图5可见，酶切产物片段正确。
将 In-Fusion 与 Vector DNA 连接，连接体系及条件如下:50ng/ μL VectorDNA 1 μL，80ng/ μL Insert DNA 1 μL，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μL，添加dH2O至总体积为10 μL，50℃反应15min。将连接产物取 1 μL热转化至 E.coli Competent CellJM109中，涂布平板，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，使用测序引物对质粒进行测序。正确的克隆命名为 pLenti-CMV-PEDF-EYFP 质粒。其中，所述测序引物的序列为：
引物1：5’-TTGCAGGTCCAAGCGAGGGT- 3’（如SEQ ID No.8所示）；
引物2：5’-CCTCACTGTCCCCAAGCTGA- 3’（如SEQ ID No.9所示）；
引物3：5’-CCGTGCCCTGGCCCACCCTC- 3’（如SEQ ID No.10所示）。
实施例4
质粒提取、重组慢病毒制备及纯化。
质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，并涂布LB-Amp固体琼脂平板，于37℃恒温培养箱倒置培养过夜。从转化平板挑取单克隆至约5mL LB-Amp液体培养基中，37℃振荡培养过夜。过夜菌小量提取质粒，测定浓度，酶切鉴定质粒无误后，接种至500mL LB-Amp液体培养基中，37℃振荡培养过夜，扩大培养。第二天提取质粒，得到无内毒素质粒，并测定浓度，-20℃冻存备用。
用脂质体（Fugene HD）感染慢病毒载体质粒pLenti-CMV-PEDF-EYFP和辅助质粒pDelta 8.74、pMD2.G 质粒(VSVg,外壳蛋白)至HEK293FT细胞，感染后48 h，超速离心收集病毒。
实施例5
重组慢病毒感染人脐带来源间充质干细胞。
重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP感染hUCMSCs 72 h后，激光共聚焦显微镜观察感染后细胞荧光蛋白表达情况，倒置显微镜下观察感染后细胞形态变化，MTT法检测细胞活性，激光共聚焦显微镜下观察PEDF蛋白的表达。
重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP感染hUCMSCs 72 h后，激光共聚焦显微镜下观察，如图6所示，观察到hUCMSCs的细胞质中大量的绿色荧光，细胞形态未发生明显的变化。CCK8法检测重组病毒感染组，空载病毒感染组与未进行病毒感染的空白对照组的细胞活性，结果如图7所示，图7显示三组细胞活性无显著差异（P>0.05）。如图8所示，在激光共聚焦显微镜下观察到重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP感染的hUCMSCs的细胞质中有大量PEDF蛋白表达。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞，其特征在于：其分泌PEDF蛋白。
2.一种如权利要求1所述的携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：
步骤S1：取脐带剪成0.5-3mm3 大小的组织块后，加入胶原酶和胰酶消化后过滤，接种于含FBS的DMEM培养瓶内，放入培养箱中进行培养；原代培养12- 15天，胰酶常规消化后，接种传代扩增培养；当传代细胞生长接近单层汇合80%时，继续传代；
步骤S2：人工合成PEDF基因单链小片段，通过PCR 拼接成完整的双链DNA片段，其扩增产物与T-Vector pMD19(Simple)连接后转化至 E.coliCompetent Cell JM109，筛选阳性克隆，经PCR鉴定和DNA测序确定，得到PEDF 的DNA片段，即T-Vector pMD19(Simple)-PEDF；
步骤S3：PCR扩增PEDF片段和GFP片段，将 PEDF片段、GFP片段融合获得In-Fusion，然后将In-Fusion克隆至 pLenti-CMV-hChR2-EYFP 载体中，得到pLenti-CMV-PEDF-EYFP 质粒；
步骤S4：pLenti-CMV-PEDF-EYFP质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，并涂布LB-Amp固体琼脂平板，于37℃恒温培养箱倒置培养过夜；从转化平板挑取单克隆至约LB-Amp液体培养基中，37℃振荡培养过夜；过夜菌小量提取质粒，测定浓度，酶切鉴定质粒无误后，接种至LB-Amp液体培养基中，37℃振荡培养过夜，扩大培养；第二天提取质粒，得到无内毒素质粒，并测定浓度，-20℃冻存备用；用脂质体感染慢病毒载体质粒pLenti-CMV-PEDF-EYFP和辅助质粒pDelta 8.74、pMD2.G 质粒至HEK293FT细胞，感染后48 h，超速离心收集病毒；
步骤S5：重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP感染hUCMSCs。
3.根据权利要求2所述的携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述脐带为正常足月产健康新生儿脐带。
4.根据权利要求2所述的携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述PCR扩增PEDF片段为以T-Vector pMD19(Simple)- PEDF质粒为模板，PCR扩增 PEDF 基因CDS区；所述PCR 扩增GFP片段为以pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒为模板，PCR扩增 GFP 序列；其中，所述PEDF 基因CDS区的序列如SEQ ID No.1所示。
5.根据权利要求4所述的携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：所述T-Vector pMD19(Simple)- PEDF质粒和pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒的50倍稀释液分别为1 μL，20 pmol/μL T-Vector pMD19(Simple)- PEDF质粒引物0.5 μL，20 pmol/μL pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒引物0.5 μL，PrimeSTAR HS（Premix）25 μL ，添加dH2O 至总体积为50 μL；反应条件为：98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 1min，30个循环；其中，所述T-Vector pMD19(Simple)- PEDF质粒引物的序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示；所述pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒引物的序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示。
6.根据权利要求5所述的携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤S3中，将 PEDF片段、GFP片段融合获得In-Fusion的反应体系为：PEDF片段、GFP片段的50倍稀释液分别为1 μL，20 pmol/μL 扩增引物0.5 μL，TksGflex DNA Polymerase 1 μL，2× Gflex PCR Buffer 25 μL，添加dH2O至总体积为50 μL；反应条件为：98℃ 10s，60℃ 15s，68℃ 1min，30个循环；其中，所述扩增引物的序列如SEQID No.6、SEQ ID No.7所示。
7.根据权利要求6所述的携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述将In-Fusion克隆至 pLenti-CMV-hChR2-EYFP 载体中包括以下步骤：酶切pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒载体，使用Takara MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0切胶回收载体片段，命名为 Vector DNA；将In-Fusion 与 Vector DNA 连接，将连接产物热转化至 E.coli Competent Cell JM109中，涂布平板，37℃过夜培养；挑取阳性克隆，使用如SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10所述序列的引物对质粒进行测序，克隆命名为 pLenti-CMV-PEDF-EYFP 质粒。
8.根据权利要求7所述的携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述酶切pLenti-CMV-hChR2-EYFP质粒载体的反应体系和条件为：pLenti-CMV-hChR2-EYFP 10 μL，10× K Buffer 5 μL，10 U/μL BamH I 1.5 μL，10 U/μL EcoR I 1.5 μL，添加dH2O至总体积为50 μL，37℃反应4h。
9.根据权利要求7所述的携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述In-Fusion 与 Vector DNA 连接的体系及条件为：50ng/ μL Vector DNA 1 μL，80ng/ μL Insert DNA 1 μL，5×In-Fusion HD EnzymePremix 2 μL，添加dH2O至总体积为10 μL，50℃反应15min。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107345221A (zh) * 2017-06-12 2017-11-14 山东兴瑞生物科技有限公司 一种TGF‑β1修饰脐带间充质干细胞的制备方法及在类风湿疾病的应用
WO2018045914A1 (zh) * 2016-09-09 2018-03-15 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞及其制备方法
CN108588026A (zh) * 2018-04-03 2018-09-28 南京鼓楼医院 高表达il10的临床级间充质干细胞的制备方法及其用途
CN109706180A (zh) * 2019-01-11 2019-05-03 杭州荣泽生物科技有限公司 一种脐带间充质干细胞过表达ido增强免疫抑制的方法及应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102198942B1 (ko) * 2019-07-02 2021-01-05 의료법인 성광의료재단 Pedf를 발현하거나 모세포에 비하여 pedf를 과발현하도록 유전적으로 조작된 중간엽 줄기세포

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080118477A1 (en) * 2006-11-09 2008-05-22 Rush University Medical Center Umbilical cord mesenchymal stem cells support cord blood hematopoiesis

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101922048B (zh) * 2010-08-06 2014-12-31 青岛奥克生物开发有限公司 一种脐带间充质干细胞公共库的建库方法
CN106282121A (zh) * 2016-09-09 2017-01-04 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080118477A1 (en) * 2006-11-09 2008-05-22 Rush University Medical Center Umbilical cord mesenchymal stem cells support cord blood hematopoiesis

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NWANI，N.G等: "Melanoma Cells Block PEDF Production in Fibroblasts to Induce the Tumor-Promoting Phenotype of Cancer-Associated Fibroblasts", 《CANCER RESEARCH》 *
段红涛: "PEDF基因修饰人脐带间充质干细胞对早期糖尿病大鼠视网膜PEDF及VEGF表达的影响", 《中国优秀博士学位论文全文数据库，医药卫生科技辑，天津医科大学博士学位论文》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018045914A1 (zh) * 2016-09-09 2018-03-15 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种携带色素上皮衍生因子基因的重组慢病毒修饰人脐带间充质干细胞及其制备方法
CN107345221A (zh) * 2017-06-12 2017-11-14 山东兴瑞生物科技有限公司 一种TGF‑β1修饰脐带间充质干细胞的制备方法及在类风湿疾病的应用
CN108588026A (zh) * 2018-04-03 2018-09-28 南京鼓楼医院 高表达il10的临床级间充质干细胞的制备方法及其用途
CN109706180A (zh) * 2019-01-11 2019-05-03 杭州荣泽生物科技有限公司 一种脐带间充质干细胞过表达ido增强免疫抑制的方法及应用

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