CN101074428B - 一种促进胚胎干细胞向心肌细胞分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进胚胎干细胞向心肌细胞分化的方法，包括将胚胎干细胞培养物置于低氧环境中，培养适当的时间。本发明首次将低氧处理技术用于胚胎干细胞向心肌细胞的定向诱导，从而可明显提高心肌细胞的获得率，并且，采用本发明的低氧处理技术，条件易于控制、操作简单、成本低廉。

Description

一种促进胚胎干细胞向心肌细胞分化的方法 

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，更具体地，本发明涉及一种促进胚胎干细胞向心肌细胞分化的方法。 

背景技术

胚胎干细胞(embryonic stem，ES)是一种全/多能干细胞，源自处于囊胚期胚胎的内细胞团，不仅能够在体内发育分化形成新生个体的各个组织器官，而且可以在体外培养条件下诱导分化形成各种特化细胞类型，如心室肌细胞，平滑肌细胞，内皮细胞，红细胞，胰岛细胞等等。人胚胎干细胞体外建系的成功和诱导分化技术的成熟，使胚胎干细胞成为临床上器官移植治疗和细胞移植治疗的重要细胞来源。 

由冠状动脉病变引起的心肌梗塞(myocardial infarction，MI)是现代社会中人们最常见的疾病和主要致死原因。虽然近年在其诊疗方面有众多进展，但心肌梗塞后受损的心肌逐渐被无收缩功能的纤维组织代替，从而导致的心力衰竭仍是主要的心脏病变。心脏移植或植入左室机械性的支撑系统，可挽救终末期心力衰竭病人的生命，但受限于供源的短缺(前者)和有限的使用寿命(后者)。由于心肌细胞是一种终末分化细胞，没有增殖能力，因此，如何修复丢失损伤的心肌细胞，改善病变心肌血供和MI后心功能不全成为国际国内心脏学领域研究热点。随着干细胞生物学的研究突破和其培养技术的改进，通过细胞移植(将健康的细胞移植入病变心脏)以重建受损心肌、恢复病变心脏功能的尝试为治疗心脏疾病展示了令人兴奋的前景。 

定向分化是胚胎干细胞走向临床的必要步骤。体外培养诱导胚胎干细胞的分化得到的类胚体中含有各种特化细胞类型，所以如何提高心肌细胞的丰度、如何分离出纯化的心肌细胞是将胚胎干细胞作为细胞移植供体所急需解决的关键问题。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进胚胎干细胞向心肌细胞分化的方法，所述方法可大大提高类胚体中心肌细胞的丰度，从而可为心肌梗塞的干细胞临床治疗提供更多的细胞来源。 

在本发明的第一方面，提供一种促进胚胎干细胞向心肌细胞分化的方法，包括步骤： 

(a)在低氧环境中，培养胚胎干细胞48±24小时，得到第一培养物； 

(b)在常氧环境中，继续培养第一培养物120±24小时，得到第二培养物，在第二培养物中心肌细胞占所有细胞的10-15％； 

并且，所述的低氧环境是气体环境，其中含有3±1体积百分比的氧气； 

所述的常氧环境条件是气体环境，其中含有21±1体积百分比的氧气。 

在本发明的另一优选例中，所述的胚胎干细胞在以下的培养基中进行培养：DMEM+15％FBS+L-Glu+P-S+MEM+β-ME。 

在本发明的另一优选例中，所述的胚胎干细胞选自：未分化的胚胎干细胞、或分化早期的胚胎干细胞。 

在本发明的另一优选例中，所述的分化早期为胚胎干细胞开始分化起的0-48小时。 

在本发明的另一优选例中，所述的低氧环境含有3±0.5体积百分比的氧气；或者，所述的常氧环境含有21±0.5体积百分比的氧气。 

在本发明的另一优选例中，所述的低氧环境含有3±0.2体积百分比的氧气；比如可以含有3体积百分比的氧气。 

在本发明的另一优选例中，所述的常氧环境含有21±0.2体积百分比的氧气；比如可以含有21体积百分比的氧气。 

在本发明的另一优选例中，所述的胚胎干细胞为哺乳动物的胚胎干细胞。 

在本发明的另一优选例中，所述的哺乳动物选自：人、鼠、或猴。 

在本发明的另一优选例中，在低氧环境中，培养胚胎干细胞48±12小时；或者，在常氧环境中，继续培养第一培养物120±12小时。 

在本发明的另一优选例中，在步骤(a)和步骤(b)中，培养条件是37±1℃，5±0.5％CO₂。 

在本发明的第二方面，提供一种制备心肌细胞的方法，包括步骤： 

(a)在低氧环境中，培养胚胎干细胞48±24小时，得到第一培养物， 

(b)在常氧环境中，继续培养第一培养物120±24小时，得到第二培养物，在第二培养物中心肌细胞占所有细胞的10-15％， 

(c)从第二培养物中分离出心肌细胞； 

并且，所述的低氧环境是气体环境，其中含有3±1体积百分比的氧气； 

所述的常氧环境条件是气体环境，其中含有21±1体积百分比的氧气。 

在本发明的第三方面，提供一种用于培养心肌细胞的装置，所述的装置包括：一个封闭的箱体，以及位于箱体上的箱门，所述的箱体中包括氮气供给装置，氧气排出装置，以及含氧量检测装置， 

其中，所述的氮气供给装置和氧气排出装置调节箱体内的氧气含量，使得氧气在气体中的含量为3±1体积百分比。 

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 

附图说明

图1显示了转入心肌特异性启动子NCX1心肌特异性钠钙交换蛋白一型驱动绿色荧光蛋白基因的ES细胞诱导向心肌细胞的分化。其中，图1A显示了在类胚体博动区域特异性表达绿色荧光蛋白；图1B显示了分离单个心肌细胞中有绿色荧光蛋白的表达；本图证明本发明人建立的心肌特异性钠钙交换蛋白一型驱动绿色荧光蛋白基因的ES细胞能够表达心肌细胞特异性的绿色荧光。 

图2显示了低氧处理提高类胚体向心肌的分化率。 

图3显示了低氧处理能够提高类胚体中心肌细胞的比例。低氧处理对类胚体的形态和大小无明显影响，却可以明显提高胚体中表达绿色荧光蛋白的心肌细胞的比例。

细胞的比例。 

图4显示了低氧处理能够上调类胚体中心肌特异性转录因子和结构基因的表达。 

本发明人经过广泛而深入的研究和试验，出乎意料地发现在体外培养分化的胚胎干细胞的分化早期给以低氧刺激，能够促进胚胎干细胞向心肌细胞的分化，大大提高类胚体中心肌细胞的丰度，从而可为心肌梗塞的干细胞临床治疗提供更多的细胞来源。基于此完成了本发明。 

胚胎干细胞 

如本发明所用，所述的胚胎干细胞为：未分化的胚胎干细胞、或为分化早期(为胚胎干细胞开始分化起的0-48小时)的胚胎干细胞。在本发明中，所述的胚胎干细胞为哺乳动物的胚胎干细胞。在本发明的优选方式中，所述的哺乳动物包括但不限于：鼠、牛、羊、猪、狗、猫、兔、马或猴；更优选的，所述的哺乳动物包括但不限于：鼠、或猴。 

在本发明中，所述的胚胎干细胞可获自细胞保藏机构，例如ATCC。 

细胞培养的条件 

在本发明中，可采用本领域技术人员已知的胚胎干细胞培养技术来培养胚胎干细胞。比如在合适的条件下，可将胚胎干细胞培养在滋养层细胞上。 

可用于本发明的培养基没有特别限制，可以采用本领域常规的适用于培养胚胎干细胞的培养基。代表性的例子比如DMEM+15％ FBS+L-Glu+P-S+MEM+β-ME；其中，DMEM为一种通用培养基，FBS指特级胎牛血清，L-Glu指L型谷氨酸，P-S指链霉素+青霉素，MEM为非必需氨基酸，β-ME为β-巯基乙醇。 

这些培养基可以用常规方法配制或购买获得，例如，DMEM培养基可购自GIBCO公司。 

在本发明的一个优选例中，胚胎干细胞如下培养：选用丝裂霉素C(购自SIGMA)处理的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层细胞，将胚胎干细胞培养在滋养层细胞上。培养基使用DMEM，添加15％胎牛血清，L-谷氨酸，链霉素-青霉素，非必需氨基酸，β-巯基乙醇(0.0007％)，平均36小时传代。传代采用0.05％Trypsin-EDTA。 

更佳地，胚胎干细胞的培养条件是37±1℃，5±0.5％CO₂。 

促进胚胎干细胞向心肌细胞分化的培养环境 

如本发明所用，所述的“低氧环境”与“低氧气氛”可互换使用，均是指一种气体环境，所述气体环境中除了对氧气、二氧化碳、氮气的含量进行调节外，其它气体及其配比基本上接近空气或与空气完全等同。所述低氧环境中含有3±1体积百分比的氧气；更优选的，所述的低氧环境含有3±0.5体积百分比的氧气；比如可以含有3体积百分比的氧气。 

在本发明的另一优选方式中，所述的低氧环境的气压等于常氧环境的气压，本发明人通过调节氮气的浓度来调节出低氧环境，因而在低氧环境中氮气的浓度相对于常氧环境有升高(即：与常氧相比，氧气体积的减少量基本等于或完全等于氮气体积的增加量)。 

如本发明所用，所述的“常氧环境”和“常氧气氛”可互换使用，均是指一种气体环境，其中氧气的含量接近于或等于空气中氧气的含量，其它气体及其配比接近空气或与空气完全等同。所述常氧环境中含有21±1体积百分比的氧气；更优选的，所述的常氧环境含有21±0.5体积百分比的氧气；比如可以含有21体积百分比的氧气。 

在本发明的一种优选方式中，所述的“常氧环境”为一般的空气环境，但是CO₂浓度为5％。 

在本发明的具体实施方式中，本发明人进行了心肌特异性荧光表达试验，心肌特异性基因表达水平试验等检测，均说明低氧刺激能够大大促进胚胎干细胞向心肌细胞的分化。 

本发明的主要优点在于： 

(1)通过本发明的方法，仅需要调节环境中的含氧量，即可实现胚胎干细胞向心肌细胞的定向分化。一般地，持续在常氧条件下培养分化的胚胎干细胞所得培养物中心肌细胞占所有细胞的5％，而本发明在对胚胎干细胞在分化早期的低氧处理明显增加了心肌细胞的比例。 

(1)本发明首次将低氧处理技术用于胚胎干细胞向心肌细胞定向诱导，从而可大大提高心肌细胞的获得率，可使用本发明制备的心肌细胞取代受损的心肌细胞，发挥重建受损心肌、恢复病变心脏功能。 

(2)现有的胚胎干细胞体外诱导向心肌细胞的分化方法往往复杂烦琐且效果不理想，而采用本发明的低氧处理技术，不仅心肌细胞的获得率高，条件易于控制、操作简单，而且无需加入诱导试剂，成本低廉。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 

实施例1胚胎干细胞的培养及体外诱导分化 

小鼠R1胚胎干细胞(ES)系(Roder JC，Canada购自美国ATCC)培养在滋养层细胞上，滋养层细胞选用丝裂霉素C(购自SIGMA)处理的原代小鼠胚胎成纤维细胞(来源自远交系昆明白鼠，13-15天龄胚胎)，培养使用DMEM，添加15％胎牛血清(购自Hyclone公司，ES cell qualified)，L-谷氨酸，P-S(青霉素+链霉素)，非必需氨基酸，(购自GIBCO，100X稀释)，β-巯基乙醇(0.0007％)，平均36小时传代。传代采用0.2％Trypsin-EDTA(购自GIBCO)。 

体外诱导分化采用悬滴培养方法，将适宜细胞密度(1.5-3.0×10⁶细胞/ 培养皿(直径60mm))的小鼠R1胚胎干细胞(用0.05％Trypsin-EDTA消化成单个细胞悬液，采用差速贴壁的方法除去其中的滋养层细胞，使滋养层细胞占细胞总数小于5％，用血球记数板记数；然后，用含有20％FBS的细胞培养液稀释细胞至终浓度为约600细胞/20μl，然后将细胞悬液接种为每滴20μl的悬滴，以悬滴状态培养两天；然后，将形成的类胚体收集到无Matrigel处理的培养皿中，悬浮培养3天；然后，将经培养的类胚体接种到0.1％明胶-包被的(gelatin-coated)培养板上。 

实施例2质粒构建和ES细胞的转染 

先利用载体质粒pEGFP-N1(BD，购自Clontech)，用内切酶AatII酶切然后大片段自连，将原有的CMVIE启动子失活，再用内切酶PstI酶切失活后的载体，然后将克隆的心肌特异性钠钙交换蛋白一型基因启动子(采用常规的方法从基因组DNA中克隆得到，或可购自NIH/NIA研究所)用内切酶PstI切出，用T4连接酶连接，得到的克隆分别用PstI，SalI，AseI酶切鉴定，挑出其中正确插入的阳性克隆，大量扩增质粒用于转染。用AseI酶切线性化质粒，得到的线性化质粒15μg，利用电转仪(BioRad，GenePulser)转染ES细胞，电转条件设置为250V，500μF，ES细胞悬液为5×10⁶/800μl，转染后接种到有Neo抗性的滋养层细胞(Neo处理的原代小鼠胚胎成纤维细胞)上，36小时后在培养液中加入300μg/ml的G418(购自GIBCO)，培养7-10天，挑取单个克隆，培养扩增鉴定，选出阳性克隆并诱导分化成为心肌细胞。 

结果，转染筛选得到7个独立克隆，挑选其中的两个(克隆19和克隆20)做体外诱导分化实验。NCX1-EGFP ES细胞系可以在分化得到的心肌细胞中表达绿色荧光蛋白，检测胚体中绿色荧光就可以检测胚体中心肌细胞的比率。 

如图1所示，诱导分化第6天，第9天荧光显微镜下观察，发现在类胚体的搏动区域有特异性的绿色荧光，分离培养的单个心肌细胞免疫组化染色发现绿色荧光和心肌特异性结构蛋白α-sarcomeric actin(肌浆网肌动蛋白α亚型)分布在共同的细胞中。 

因此，可见NCX1启动子驱动绿色荧光蛋白基因表达转染ES细胞，得到表达心肌特异性绿色荧光蛋白表达的ES细胞系。 

实施例3 ES细胞的低氧培养诱导分化 

将正常培养的ES细胞(转染钠钙交换蛋白启动子驱动绿色荧光蛋白(NCX1)基因后的ES细胞)做成悬滴以后，分成低氧处理组和正常对照组。 

将低氧处理组细胞放入低氧培养箱中培养(Thermo Forma)，培养条件为3％O₂，5％二氧化碳，，持续培养48小时(2天)，而正常对照组细胞在21％O₂，5％CO₂条件下培养，悬滴培养结束后，两组细胞都在正常氧浓度条件下培养。 

实施例4 ES细胞向心肌细胞分化率的统计 

a.测定阳性胚体数 

将分化的类胚体接种到24孔板中，然后开始观察类胚体中的跳动情况，有自主搏动心肌细胞的类胚体记为阳性胚体，每天观察得到阳性胚体占总胚体个数的百分率，得到ES细胞向心肌细胞分化的曲线(profile)。 

结果如图2，可见与正常条件培养组相比，低氧培养组有更大比例的类胚体中有搏动的心肌细胞。 

b.测定荧光面积 

含有NCX1-EGFP基因的ES细胞诱导分化后，有自主搏动出现的类胚体在荧光显微镜(Leica)下观察其绿色荧光的表达和分布并拍照，从照片上的绿色荧光面积的来鉴定单个类胚体中心肌细胞的比率。 

结果如图3所示，在单个类胚体中，相对于正常条件培养组，低氧处理组类胚体中有更多的绿色荧光，这就意味着低氧培养过的胚体中有更大比例的心肌细胞。 

实施例5心肌细胞的免疫细胞化学染色 

从类胚体中分离出来的单个心肌细胞用4％多聚甲醛固定后用，0.1％Triton破膜，用10％羊血清封闭，然后加入0.1％的抗α-sacromeric actin(购自SIGMA，鼠源)，4℃过夜，接着加入二抗5％TRITC标记山羊抗小鼠IgG二抗(anti-mouseTRITC-conjugated，购自Santa Cruz公司)，室温下放置1小时，荧光显微镜 下检测。 

实施例6心肌特异性转录因子和结构基因表达的RT-PCR检测 

分化不同天数的类胚体收集用于提取总RNA，然后利用Superscript II(购自Invitrogene)做逆转录，逆转录的产物当作模板做PCR，检测低氧处理对不同基因表达的影响。各种引物的序列以及PCR的扩增条件分别如下： 

NKX2.5 

正向引物(Sense)：gCC AAC AgC AAC TTC gTg A(SEQ ID NO：1)； 

反向引物(Antisense)：CCg gTC CTA gTg Tgg AAT C(SEQ ID NO：2)； 

94℃ 30s，58℃ 40s，72℃ 40s，35个循环。 

MEF2C 

正向引物(Sense)：AgA TAC CCA CAA CAC ACC A(SEQ ID NO：3)； 

反向引物(Antisense)：ATC CTT CAg AgA gTC gCA T(SEQID NO：4)； 

94℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 40s，35个循环。 

MLC-2v 

正向引物(Sense)：TGT GGG TCA CCT GAG GCT GTG GTT CAG(SEQ ID NO：5)； 

反向引物(Antisense)：GAA GGC TGA CTA TGT CCG GGA GAT GC(SEQ IDNO：6)； 

94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s，29个循环。 

aMHC 

正向引物(Sense)：GCA GAC CAT CAA GGA CCT，(SEQ ID NO：7)； 

反向引物(Antisense)：GTT GGC CTG TTC CTC CGC C；(SEQ ID NO：8)； 

94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s，33个循环。 

M28s 

正向引物(Sense)：AgC AgC CgA CTT AgA ACT gg (SEQ IDNO：9)； 

反向引物(Antisense)：TAg ggA CAg Tgg gAA TCT Cg(SEQ IDNO：10)； 

94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s，21个循环。 

RT-PCR实验检测心肌特异性基因表达的结果见图4，心肌特异性的转录因子NKX2.5，MEF2C，心肌特异性结构蛋白MLC-2v，RyR2，低氧培养组类胚体中上述基因的表达显著上调，说明相对于正常培养条件，低氧处理的类胚体中有更大比例的心肌细胞。 

实施例7分化得到心肌细胞的纯化 

利用转入NCX1-EGFP基因(即：前面实施例2中钠钙交换蛋白基因启动子驱动下的EGFP基因)的ES细胞诱导分化，用0.25％胰酶消化低氧处理过分化到第8天的类胚体，37℃ 6分钟，每隔2分钟敲打一次，消化结束后加入培养液，离心收集细胞，弃上清，用培养液重悬，得到单细胞悬液。 

利用BD公司FaCSAria流式细胞仪分选出有绿色荧光蛋白表达的细胞，即得到纯化的心肌细胞。 

实施例8培养心肌细胞的装置 

一种培养心肌细胞的培养箱，该培养箱包括一个箱体和一个箱门，所述的箱体中包括氮气供给装置，氧气排出装置，以及含氧量检测装置；其中，所述的氮气供给装置和氧气排出装置调节箱体内的氧气含量，使得氧气在气体中的含量为3±1体积百分比。 

培养小鼠R1 ES细胞时，打开箱门，将处于分化早期的胚胎干细胞培养物置于箱体内部，调节氮气供给装置和氧气排出装置，调节氧气含量，使氧气在气体中的含量为3±1体积百分比。 

总结 

综上所述，在本发明的实施例中，通过分化时程，心肌特异性荧光表达，心肌特异性基因表达水平等指标的检测，证实低氧能够有效的体外诱导胚胎干 细胞向心肌细胞的分化。低氧作为一种新的诱导胚胎干细胞体向心肌细胞的分化干预手段，有望为心肌梗塞的干细胞临床治疗提供更多的细胞来源。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

                          序列表 

<110>中国科学院上海生命科学研究院 

<120>一种促进胚胎干细胞向心肌细胞分化的方法 

<130>060605 

<160>10 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>19 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

<400>1 

gccaacagca acttcgtga                                         19 

<210>2 

<211>19 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

<400>2 

ccggtcctag_tgtggaatc                                         19 

<210>3 

<211>19 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

<400>3 

agatacccac aacacacca                                19 

<210>4 

<211>19 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

<400>4 

atccttcaga gagtcgcat                                19 

<210>5 

<211>27 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

<400>5 

tgtgggtcac ctgaggctgt ggttcag                       27 

<210>6 

<211>26 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>6 

gaaggctgac tatgtccggg agatgc                        26 

<210>7 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

<400>7 

gcagaccatc aaggacct                                    18 

<210>8 

<211>19 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

<400>8 

gttggcctgt tcctccgcc                                   19 

<210>9 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

<400>9 

agcagccgac ttagaactgg                                  20 

<210>10 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<221>misc_feature 

<223>引物 

<400>10 

tagggacagt gggaatctcg                                  20 

Claims (7)

1.一种促进鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在低氧环境中，培养鼠胚胎干细胞48±24小时，得到第一培养物；

(b)在常氧环境中，继续培养第一培养物120±24小时，得到第二培养物，在第二培养物中心肌细胞占所有细胞的10-15％；

并且，所述的低氧环境是气体环境，其中含有3±1体积百分比的氧气和5±0.5体积百分比的CO₂；

所述的常氧环境条件是气体环境，其中含有21±1体积百分比的氧气和5±0.5体积百分比的CO₂。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胚胎干细胞选自：未分化的胚胎干细胞、或分化早期的胚胎干细胞。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的分化早期为胚胎干细胞开始分化起的0-48小时。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述的低氧环境含有3±0.5体积百分比的氧气；或者，

所述的常氧环境含有21±0.5体积百分比的氧气。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

在低氧环境中，培养胚胎干细胞48±12小时；或者

在常氧环境中，继续培养第一培养物120±12小时。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)和步骤(b)中，培养条件是37±1℃。

7.一种制备鼠心肌细胞的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在低氧环境中，培养鼠胚胎干细胞48±24小时，得到第一培养物，

(b)在常氧环境中，继续培养第一培养物120±24小时，得到第二培养物，在第二培养物中心肌细胞占所有细胞的10-15％，

(c)从第二培养物中分离出心肌细胞；

并且，所述的低氧环境是气体环境，其中含有3±1体积百分比的氧气和5±0.5体积百分比的CO₂；

所述的常氧环境条件是气体环境，其中含有21±1体积百分比的氧气和5±0.5体积百分比的CO₂。

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