CN110499279B - 一种诱导人尿源性干细胞向肝细胞分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人尿源性干细胞(human urine‑derived stem cells，hUSCs)向肝细胞诱导分化的一种方法。通过在含有细胞生长因子的特定培养基中培养和扩增，实现从人的尿液中分离干细胞，并通过与人肝实质细胞L02共培养的方法实现人尿源性干细胞向肝细胞诱导分化。本发明通过研究人尿源性干细胞向肝细胞诱导分化的机制并建立鉴定指标，为hUSCs的功能应用及建立向肝细胞分化平台提供基础研究数据。

Description

一种诱导人尿源性干细胞向肝细胞分化的方法

技术领域

本发明涉及一种诱导人尿源性干细胞向肝细胞分化的方法。

背景技术

干细胞(stem cell)是一类具有自我更新能力和多向分化潜能特性的细胞，在再生医学、细胞替代治疗及药物筛选等领域有着广泛的研究及应用前景，其主要可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)两大类。胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类高度未分化细胞，它具有发育的全能性，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的试验材料，然而其伦理学争议一直存在；成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，主要包括各组织器官来源的间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)、造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSCs)等，目前研究发现，成体干细胞具有诱导分化为所在组织起源的全部细胞的潜能，并可跨胚层分化，对于干细胞的研究与应用，成体干细胞可避开使用人类生殖细胞及早期胚胎无伦理学争议而受到青睐。人尿源性干细胞(human urine-derived stem cells，hUSCs)是近年来从人尿液中分离培养出的具有良好增殖活性的人成体干细胞^[1]，研究表明其具有间充质干细胞的各种生物学特性：细胞贴壁生长；高表达CD44、CD73、CD90、CD105和CD146等间充质干细胞表面标志物，不表达或微量表达CD34、CD45、CD133等造血干细胞和CD31等内皮细胞标志物；具有多向分化潜能；取材方便、无创，无伦理学问题，是一种理想的成体干细胞^[2-5]。

目前已有研究报道hUSCs对尿路、骨、皮肤等多种器官或组织的损伤具有修复重建作用，通过修复改善受损组织或器官的功能，理论上能够实现疾病治疗的可能^[6]。传统的药物研发及安全性评价对实验动物的需求量大，费用高，周期长，种属差异性问题难以克服，所以改良毒性筛选模型显得日益重要，发育毒性体外模型成为研究预测外源物质的发育毒性的良好工具^[7]，通过定向诱导干细胞培养成特定类型的细胞、组织、器官等体外模型来测定候选化合物的毒性探讨受试物可能作用的靶器官毒性和作用机制等，如肝毒性、神经毒性、致癌性等，结合各种组学技术快速高效地分析多条代谢通路，有助于定位靶器官及判定毒性程度，寻找潜在的毒性生物标志物^[8]。

肝脏是由肝细胞组成的，是生理和病理状态下药物代谢的重要器官，通过肝脏代谢后，许多内源性和外源性的物质对生物体的毒性作用被改变，部分药物的肝毒性是影响其进入临床试验的重要障碍。研究者常采用动物实验(体内)和细胞实验(体外)研究药物的代谢情况及代谢机制，然而由于种属问题的影响，不能完全用动物代谢情况来预测人的情况，而且动物实验周期长，耗费大量人力财力，结果仍然未知；在体外研究中原代肝细胞具有较好的体外实验重现性，基本维持了肝脏的代谢功能，保留了与体内一致的细胞色素P450酶的水平，然而限于技术和伦理的问题，人原代肝细胞较难获得；人肝实质细胞L02和其他肝癌细胞株虽然体外容易扩增，但是由于结构修饰改造使其生物学特性已发生显著变化，不能充分代表正常人肝细胞的功能特性，因此从其他途径获取大量成熟的肝细胞一直是备受关注的研究热点，干细胞由于具有分化为各种类型细胞的能力，有望成为肝细胞的理想细胞来源^[9]。

胚胎干细胞多通过外源细胞因子、细胞外基质、或化合物诱导成肝细胞或类肝细胞，但ESCs的获得需要毁损胚胎，存在伦理学争议，而且由ESCs分化来的肝细胞在临床应用中还会涉及免疫排斥问题，伦理学及免疫排斥问题的存在限制了其进一步的临床应用。成体干细胞无伦理学争议，且技术成熟，因此从人成体干细胞向肝细胞诱导分化的研究逐渐受到广泛关注^[10-13]。目前很多体内外实验都已表明成体干细胞最大类别的间充质干细胞具有向肝细胞或类肝细胞分化的能力，具体方法主要分为三种，培养液中加细胞生长因子，与肝源细胞共同培养和转基因法^[14]：生长因子诱导研究的较为透彻，作用机制也明晰，但是不同因子组合的分化效率不同，分化的细胞均一性也不高，且价格昂贵；转基因人为干预高，技术难度大；而共培养体系能够得到最接近于正常功能的细胞，将不同种类来源的细胞接种在同一个体系中，通过细胞间信息交流影响其增殖或分化。Mu et al^[11]将人多能成体祖细胞和人肝实质细胞L02共培养以及Zhong et al^[12]将肝祖细胞和间充质干细胞共培养均能获得功能良好的肝细胞，基于hUSCs自体的独特优势和共培养技术的可行性使其研究前景更加乐观。

发明内容

本发明旨在提供一种诱导人尿源性干细胞向肝细胞分化的方法。

收集健康成人无菌尿液200-300mL，常温离心分离培养hUSCs。

参考文献改良配制含特定组分的培养基实现hUSCs体外增殖培养，培养基在使用前半天配制。

hUSCs生物学特征鉴定，经倒置相差显微镜观察细胞形态、四甲基噻唑蓝(MTT)法检测增殖活性和流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)检测表面特异抗原并鉴定hUSCs纯度。

经鉴定得到的纯度较高的hUSCs通过与人肝实质细胞L02共培养的方法实现其向肝细胞诱导分化。

诱导分化细胞的鉴定，从细胞结构、分子生物学特征和生理功能三方面验证肝细胞是否分化成功，即倒置显微镜观察诱导后的细胞形态学变化，实时荧光定量PCR技术(Real time quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR)检测诱导前后白蛋白ALB、甲胎蛋白AFP和CYP酶亚型的mRNA表达变化情况，糖原染色试剂盒检测诱导后细胞甩片的糖原表达情况。

附图说明

图1是人尿源性干细胞hUSCs分离培养流程图；

图2显示了人尿源性干细胞hUSCs原代培养1d、5d、8d、14d细胞形态学观察图(100×)；

图3是人尿源性干细胞hUSCs生长曲线MTT图，结果显示其生长活性良好；

图4显示人尿源性干细胞hUSCs表达CD44和CD90，不表达CD31和CD34；

图5是人尿源性干细胞hUSCs与人肝实质细胞L02共培养流程图；

图6是人尿源性干细胞hUSCs与人肝实质细胞L02共培养1d、5d、10d、15d细胞形态学观察图(100×)；

图7是人尿源性干细胞hUSCs与人肝实质细胞L02共培养5d、10d、15d qRT-PCR检测相应肝系标志物表达变化情况(*p＜0.05，**p＜0.01)；

图8是与人肝实质细胞L02共培养10d的人尿源性干细胞hUSCs的糖原染色图；

图9是与人肝实质细胞L02共培养10d的人尿源性干细胞hUSCs与hUSCs和L02细胞比较CYP450酶亚型的mRNA表达变化情况(*p＜0.05，**p＜0.01)。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

实施例1：人尿源性干细胞hUSCs原代分离培养及生物学特征鉴定

实验步骤：

1.1无菌条件下收集健康成年人中段尿液至少200mL(无过夜)，立即转移至紫外无菌操作台，等量分装至50mL无菌尖底离心管中，1000r/min离心10min后，弃去上清液体，沉淀用PBS洗涤，再次1000r/min离心10min，再弃上清液体，用1mL hUSCs培养液重新悬浮细胞，种于24孔板培养，静置于37℃，5％CO2条件的培养箱中培养，记为原代(P0)，72h后每孔加入半倍体积新的hUSCs细胞培养液即0.5mL，然后于第5d和第6d分别完全更换培养液，以后每2d换液1次，换液过程不需用PBS清洗。在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，待细胞长成70-80％汇合度后，用含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化传代至24孔板培养，以此扩增。

1.2取P3代细胞，弃去上清液，用无菌PBS冲洗2遍，加入1mL含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶在常温下消化一定时间后，用含血清的hUSCs培养基中和胰酶消化制备成单细胞悬液，以每孔1000个的细胞密度接种于一次性96孔板(设8个复孔)连续观察8d，每天定时加入100μL MTT溶液，孵育4h，150μL DMSO溶解并微量振荡96孔板10min后用酶标仪检测570nm波长处吸光度值，记录结果，以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制生长曲线。

1.3取P3代细胞，弃去上清液，用无菌PBS冲洗2遍，加入1mL含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶在常温下消化一定时间后，用含血清的hUSCs培养基中和胰酶消化制备成单细胞悬液，1000rpm离心2min后，用PBS洗涤，重复三次1000rpm离心2min，重悬细胞调整浓度至1×106/mL，取200μL PBS细胞悬液并加入小鼠抗人抗体CD44-FITC，CD90-APC，CD31-PECY7和CD34-PE各1μg避光孵育30min，孵育完毕后300g离心5min用PBS洗去未标记的抗体，重复一次，弃上清后加200μL PBS重悬细胞过滤膜待上机检测。

实验结果：在倒置相差显微镜下观察，从人新鲜尿液中分离培养的人尿源性干细胞于接种后24-72h开始贴壁(图2A)，5d后细胞逐渐形成集落(图2B)，8-12d细胞呈克隆状生长(图2C)，14d细胞长成80％-90％的汇合度后开始第一次传代培养(图2D)；MTT法检测P3代hUSCs增殖能力结果显示，第1-3d hUSCs增殖缓慢，从第3d左右开始呈现指数增长，第7-8d以后细胞生长进入平台期，细胞增殖的速度明显变慢，生长曲线整体呈“S”形(图3)；流式细胞术检测P3代hUSCs中间充质干细胞标志物CD44和CD90阳性表达，内皮细胞标志物CD31和造血细胞标志物CD34不表达(图4)。

实验结论：成功实现人尿源性干细胞hUSCs的原代分离培养，并通过细胞形态学观察、MTT法检测增殖活性和流式细胞术检测表面特异抗原鉴定其纯度良好，可以开展下一步实验。

实施例2：人肝实质细胞L02共培养诱导人尿源性干细胞hUSCs向肝细胞分化及鉴定

实验步骤：

2.1取P3代细胞，弃去上清液，用无菌PBS冲洗2遍，加入1mL含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶在常温下消化一定时间后，用含血清的hUSCs培养基中和胰酶消化制备成单细胞悬液，按3×10⁴/孔分别接种于六孔板各十八个孔，其上悬挂孔径为0.4μm transwell六孔板细胞培养小室，接种2×10⁴/孔的人肝实质细胞L02，分三个诱导时间段总共诱导15d。细胞培养小室中培养基为含5％血清的高糖DMEM，孔板中的培养基为正常的hUSCs培养基，五天换液两次。

2.2倒置相差显微镜观察诱导前和诱导后5d、10d、15d的诱导细胞形态变化情况。

2.3分别取诱导前和诱导后5d、10d、15d的细胞做qRT-PCR检测，以高纯度离心柱试剂盒提取总RNA，然后以总RNA为模板，用PrimeScript^TM 1st strand cDNA Synthesis Kit试剂盒逆转录合成cDNA，进行荧光定量PCR扩增，诱导检测白蛋白ALP、甲胎蛋白AFP和细胞色素P450酶亚型的表达变化情况，引物序列见下表。

2.4分别取诱导前和诱导后5d、10d、15d的诱导细胞，制备细胞涂片，用PAS固定液固定10min，水洗晾干常温阴暗处保存即可。细胞涂片入过碘酸溶液，室温氧化20min(注意氧化时间)，自来水冲洗2次，蒸馏水浸洗2次；入schiff试剂并加盖，置于室温阴暗处浸润20min，亚硫酸钠溶液滴洗2次，每次2min，流水冲洗2min；入苏木素染色液复染2min，水洗晾干，正置显微镜观察拍照。

实验结果：人尿源性干细胞hUSCs与人肝实质细胞L02共培养阶段，诱导的hUSCs开始卷曲生长，在10d的时候形态发生明显的不规则变化，15d时大部分细胞分化为多边形细胞，即类肝细胞(图6)。qRT-PCR结果显示随着诱导时间的延长，与同期阴性对照对比，诱导后hUSCs总体上白蛋白ALB和细胞色素CYP450酶亚型表达升高，甲胎蛋白AFP表达下降(图7，*p＜0.05，**p＜0.01)。根据细胞状态和基因mRNA表达情况，选取CYP450酶亚型表达显著性升高的与人肝实质细胞L02共培养10d的hUSCs：其糖原染色结果显示与同期阴性对照相比，人尿源性干细胞hUSCs与人肝实质细胞L02共培养条件下，糖原表达水平有所升高(图8)；与L02细胞比较CYP450酶亚型的mRNA表达变化情况，结果显示部分CYP450酶亚型的mRNA表达高于L02细胞(图9)。

实验结论：人尿源性干细胞与人肝源细胞共培养的方法可以实现向肝细胞诱导分化，从细胞结构、分子生物学特征和生理功能三方面验证肝细胞分化成功。

参考文献

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Claims (4)

1.一种诱导人尿源性干细胞向肝细胞分化的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)从人无菌尿液中分离获得人尿源性干细胞hUSCs；

(2)人尿源性干细胞hUSCs通过与人肝实质细胞L02共培养诱导其向肝细胞分化。

2.根据权利要求1所述的诱导人尿源性干细胞向肝细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤(1)为：收集200-300mL健康成人无菌尿液常温1000r/min离心10min并用专用培养基分离培养获得hUSCs。

3.根据权利要求1所述的诱导人尿源性干细胞向肝细胞分化的方法，其特征在于，所述的共培养诱导为0.4μm transwell六孔板细胞共培养小室。

4.根据权利要求3所述的诱导人尿源性干细胞向肝细胞分化的方法，其特征在于，所述的共培养诱导方法为3×10⁴个人尿源性干细胞hUSCs接种于0.4μm transwell六孔板细胞培养小室中，2×10⁴个人肝实质细胞L02接种于相应悬挂0.4μm transwell六孔板细胞培养小室之下的六孔板细胞孔中，共培养15天。

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