CN105624117A - 一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法，利用重编程因子将小鼠成纤维细胞直接重编程为高效分化的心肌细胞为切入点，研究低氧对直接重编程产生心肌细胞的效率及成纤维细胞重编程为心肌细胞过程中HIF-1表达水平的变化，系统阐述低氧对细胞直接重编程的作用。同时检测了多潜能转录因子和表观遗传调控因子这在低氧刺激下的表达情况。用体细胞直接重编程得到的个体化心肌细胞用于心肌梗死的修复，将为提高临床细胞移植的效率和安全性打下基础。探讨低氧微环境与重编程的关系，为低氧下重编程机制的研究提供新的思路。

Description

一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法。
背景技术
心血管疾病是威胁人类健康的主要疾病，尤其是心肌梗死已经成为人类死亡的主要病因之一。许多心肌再生策略都是为了解决移植器官短缺的问题。在心肌替代治疗中，成体细胞诱导产生的心肌细胞是治疗心肌缺血性疾病细胞替代治疗不失为一个很好的选择。如何安全、高效获得诱导心肌细胞是用个性化细胞疗法治疗心肌梗死和心力衰竭亟待解决的问题。成纤维细胞直接重编程为心肌细胞将为心肌细胞移植提供了新的细胞来源。基于之前的研究，说明体细胞存在的微环境对体细胞表观遗传修饰和重编程具有极其重要的作用。
现有技术中还没有一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法，利用重编程因子(Gata4、Mef2c和Tbx5)将小鼠成纤维细胞直接重编程为高效分化的心肌细胞为切入点，研究低氧对直接重编程产生心肌细胞的效率及成纤维细胞重编程为心肌细胞过程中HIF-1表达水平的变化，系统阐述低氧对细胞直接重编程的作用。同时检测了多潜能转录因子和表观遗传调控因子这在低氧刺激下的表达情况。用体细胞直接重编程得到的个体化心肌细胞用于心肌梗死的修复，将为提高临床细胞移植的效率和安全性打下基础。探讨低氧微环境与重编程的关系，为低氧下重编程机制的研究提供新的思路。其技术方案如下：
一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法，包括以下步骤：构建慢病毒载体，利用293T细胞包装生产病毒，将携带转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5的慢病毒感染小鼠背部皮肤成纤维细胞，将成纤维细胞直接重编程为心肌细胞；重编程过程中转染的细胞分别进行对照组常氧培养和低氧2％O2+5％CO2+93％N2预处理6h、12h，在培养过程中每天观察重编程细胞的形态改变；在转导后第1、2、3、4周，利用RT-PCR、免疫细胞化学和流式细胞技术检测低氧不同时间心肌特异标记Myh6阳性的细胞比率；收集低氧组重编程细胞，利用RT-PCR检测HIF-1在重编程细胞中的表达，在mRNA水平上对其进行分析；
体外低氧条件2％O2+5％CO2+93％N2下，培养小鼠背部皮肤成纤维细胞，实验组分低氧6h、12h、24h、48h组，常氧为对照组；用免疫细胞化学方法和RT-PCR检测小鼠皮肤成纤维细胞中HIF-1、Oct4和Uhrf1的表达，在蛋白和mRNA水平对其进行分析。
优选地，加入低氧条件后，RT-PCR检测直接重编程第1、2、3、4周Myh6mRNA的表达，第4周Myh6表达水平升高明显，低氧6h组高于0h和12h；免疫细胞化学方法检测低氧条件下成纤维细胞直接重编程为心肌细胞内Myh6阳性率高于常氧组；低氧6h组Myh6的表达倍数是对照组的4.59倍；流式细胞技术检测到直接重编程后低氧6h组Myh6的表达量是对照组的4.71倍P<0.05；低氧12h组与常氧组阳性细胞比率差异不大；RT-PCR结果显示HIF-1在细胞重编程的早期表达水平升高，低氧6h组高于低氧12h组，与Myh6的表达变化相同，证明HIF-1在细胞直接重编程过程中被激活，起到促进细胞重编程的作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明成功将成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞。低氧微环境明显提高了成纤维细胞直接重编程为心肌细胞的效率。HIF-1在低氧条件下被激活，参与促进成纤维细胞直接重编程的过程。多潜能转录因子Oct4和表观遗传调控因子Uhrf1在低氧微环境下在小鼠成纤维细胞中表达水平升高，提示低氧微环境刺激有可能启动了细胞表观遗传学的改变和细胞的多潜能性，从而影响细胞的功能、增殖和分化。HIF-1通路在其中发挥了重要作用。
附图说明
图1是原代细胞培养，图1(A)图为原代小鼠皮肤成纤维细胞(×40)，图1(B)图为小鼠原代心肌细胞(×100)；
图2是Gata4病毒液的生产及鉴定，图中所示为Gata4感染239T细胞荧光(A-D)与白光(a-d)对比图，计算Gata4感染效率，病毒液的体积(A)为0.1μL，(B)为0.5μL，(C)为2μL，(D)为10μL(×100)；
图3是Tbx5病毒液的生产及鉴定，图中所示为Tbx5感染239T细胞荧光(A-D)与白光(a-d)对比图，计算Tbx5感染效率，病毒液的体积(A)为0.1μL，(B)为0.5μL，(C)为2μL，(D)为10μL(×100)；
图4是Mef2c病毒液的生产及鉴定，图中所示为Mef2c感染239T细胞荧光(A-D)与白光(a-d)对比图，计算Mef2c感染效率，病毒液的体积(A)为0.1μL，(B)为0.5μL，(C)为2μL，(D)为10μL(×100)；
图5是Gata4病毒感染小鼠皮肤成纤维细胞，第4d观察荧光计算病毒感染效率，图中显示为细胞在荧光(ABC)和白光(abc)下的图片，病毒体积(A)为2μL，(B)为10μL，(C)为30μL(×200)；
图6是Tbx5病毒感染小鼠皮肤成纤维细胞，第4d观察荧光计算病毒感染效率，图中显示为细胞在荧光(ABC)和白光(abc)下的图片，病毒体积(A)为2μL，(B)为10μL，(C)为30μL(×200)；
图7是Mef2c病毒感染小鼠皮肤成纤维细胞，第4d观察荧光计算病毒感染效率，图中显示为细胞在荧光(ABC)和白光(abc)下的图片，病毒体积(A)为2μL，(B)为10μL，(C)为30μL(×200)；
图8是慢病毒感染小鼠皮肤成纤维细胞，三种转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5同时转入成纤维细胞后第4d，观察细胞荧光(A)和白光(a)下的细胞数，计算病毒感染效率(×200)；
图9是RT-PCR检测Gata4、Mef2c和Tbx5mRNA的表达，三种目的基因Gata4、Mef2c和Tbx5分别感染成纤维细胞，计算细胞内每个基因mRNA的表达水平(*P<0.05)；
图10是三种转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5共同感染小鼠皮肤成纤维细胞，转染后第1、2、3、4周细胞荧光的变化，图为细胞荧光(A-D)和白光(a-d)下的对比图，(A)为第1周，(B)为第2周，(C)为第3周，(D)为第4周(×100)；
图11是免疫荧光化学方法检测重编程细胞和心肌细胞内心肌特异蛋白cTnI和Myh6的表达，(A)为重编程细胞内cTnI的表达，(B)为重编程细胞内Myh6的表达，(C)为心肌细胞内cTnI的表达，(D)为心肌细胞内Myh6的表达(×100)；
图12是RT-PCR检测成纤维细胞直接重编程为心肌细胞后第1、2、3、4周心肌特异标记基因cTnI和Myh6的表达水平(*P<0.05)；
图13是三种转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5同时转入成纤维细胞，转染后第1周和第2周感染的细胞荧光(A-F)和白光(a-f)下的对比，ABC(abc)为病毒感染后第1周，DEF(def)为感染后第2周，(A)和(D)为0h组，(B)和(E)为低氧6h组，(C)和(F)为低氧12h组(×100)；
图14是三种转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5同时转入成纤维细胞，转染后第3周和第4周感染的细胞荧光(A-F)和白光(a-f)下的对比，ABC(abc)为病毒感染后第3周，DEF(def)为感染后第4周，(A)和(D)为0h组，(B)和(E)为低氧6h组，(C)和(F)为低氧12h组(×100)；
图15是RT-PCR检测低氧预处理不同时间(0h、6h和12h)组转染后第1、2、3、4周重编程细胞内Myh6表达量的变化；
图16是免疫荧光化学方法检测低氧预处理不同时间点直接重编程的细胞内特异蛋白Myh6的表达，Myh6表达为绿色荧光，细胞核为DAPI染色(×200)；
图17是流式细胞仪测定心肌特异性标记蛋白Myh6的表达，成纤维细胞直接重编程为心肌细胞第4周，流式细胞技术检测低氧预处理不同时间点(0、6、12h)心肌特异标记蛋白Myh6的表达，其中，A.对照组；B.低氧预处理0h组；C.低氧预处理6h组；D.低氧预处理12h组；
图18是RT-PCR检测成纤维细胞转染后第1、2、3、4周低氧预处理不同时间点(0、6、12h)HIF-1的表达，(**P<0.01，*P<0.05)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。
本发明利用重编程因子(Gata4、Mef2c和Tbx5)将小鼠皮肤成纤维细胞直接重编程为心肌细胞为切入点，研究低氧对重编程过程的影响及低氧诱导因子-1(hypoxia-induciblefactor-1,HIF-1)作为低氧的始动元件，在重编程过程中表达水平的变化，初步探究HIF-1在成纤维细胞重编程过程中的作用。为了进一步证明低氧与细胞重编程的关系，研究了低氧微环境下成纤维细胞内多潜能转录因子Oct4及表观遗传调控因子Uhrf1的表达变化。
方法：构建慢病毒载体，利用293T细胞包装生产病毒，将携带转录因子(Gata4、Mef2c和Tbx5)的慢病毒感染小鼠背部皮肤成纤维细胞，将成纤维细胞直接重编程为心肌细胞。重编程过程中转染的细胞分别进行常氧培养(对照组)和低氧预处理(2％O2+5％CO2+93％N2)6h、12h，在培养过程中每天观察重编程细胞的形态改变。在转导后第1、2、3、4周，利用RT-PCR、免疫细胞化学和流式细胞技术检测低氧不同时间心肌特异标记Myh6阳性的细胞比率。收集低氧组重编程细胞，利用RT-PCR检测HIF-1在重编程细胞中的表达，在mRNA水平上对其进行分析。
体外低氧条件下(2％O2+5％CO2+93％N2)培养小鼠背部皮肤成纤维细胞，实验组分低氧6h、12h、24h、48h组，常氧为对照组。用免疫细胞化学方法和RT-PCR检测小鼠皮肤成纤维细胞中HIF-1、Oct4和Uhrf1的表达，在蛋白和mRNA水平对其进行分析。
结果：293T细胞生产病毒液Gata4、Mef2c和Tbx5，测得病毒液的滴度为109/mL左右。原代培养小鼠背部皮肤组织块3d后可见大小均匀、菱形、成簇分布的成纤维细胞从组织块周围爬出。原代成纤维细胞经传代纯化后由慢病毒感染诱导，在转染后第4d，计算细胞荧光比率得到最佳感染效率所需的病毒体积，为每种病毒30μL。将三种转录因子同时转染到成纤维细胞内，用免疫细胞化学方法和RT-PCR检测到直接重编程第4周细胞内心肌特异标记cTnI和Myh6的表达，成纤维细胞直接重编程为心肌细胞模型建立成功。加入低氧条件后，RT-PCR检测直接重编程第1、2、3、4周Myh6mRNA的表达，结果显示第4周Myh6表达水平升高明显，低氧6h组高于0h和12h。免疫细胞化学方法检测低氧条件下成纤维细胞直接重编程为心肌细胞内Myh6阳性率高于常氧组。低氧6h组Myh6的表达倍数是对照组的4.59倍；流式细胞技术检测到直接重编程后低氧6h组Myh6的表达量是对照组的4.71倍(P<0.05)。低氧12h组与常氧组阳性细胞比率差异不大。RT-PCR结果显示HIF-1在细胞重编程的早期表达水平升高，低氧6h组高于低氧12h组，与Myh6的表达变化相同，证明HIF-1在细胞直接重编程过程中被激活，起到促进细胞重编程的作用。
低氧不同时间点(0、6、12、24、48h)培养成纤维细胞，免疫细胞化学方法显示低氧组成纤维细胞内HIF-1阳性细胞比率从8.07％±2.15增加到31.26％±1.48；Oct4阳性细胞比率从7.84％±1.15增加到24.19％±0.98；Uhrf1阳性细胞表达率从7.14％±1.78增加到26.32％±1.05，荧光表达量具有时间依赖性，常氧组均未见表达；RT-PCR结果显示低氧6、12、24h组HIF-1、Oct4、Uhrf1的mRNA表达差异不显著，而低氧48h组HIF-1表达倍数为12.41±0.7，Oct4表达倍数为13.29±0.91，Uhrf1表达倍数为8.20±2.07，差异显著(P<0.01)。
实施例1小鼠成纤维细胞和心肌细胞的分离、培养
取生后1～3dC57BL/6J小鼠和昆明白幼鼠，进行原代成纤维细胞的培养。观察到背部皮肤组织块贴壁后3d原代成纤维细胞开始游出贴壁，细胞形态为长梭型，呈条索状或漩涡状排列(图1A)，消化后的细胞呈悬浮状，光镜下其为圆型透亮的小球。选用第3～5代成纤维细胞进行诱导，此时的细胞纯度高，细胞生长状态最好。
心肌细胞经胰蛋白酶消化的方法接种于培养皿内，细胞单个球形漂浮于培养液中，培养12h后开始贴壁生长，呈圆形，后变为梭形，生长状态良好，有自发跳动(图1B)。
实施例2小鼠成纤维细胞直接重编程为心肌细胞模型的建立
分子克隆及慢病毒感染成纤维细胞
慢病毒载体的构建
根据Gata4、Mef2c和Tbx5序列设计引物，分别扩增Gata4、Mef2c和Tbx5基因；提取和纯化高质量的重组质粒，构建携带目的基因的慢病毒质粒表达载体。由GeneCopoeia公司协助。
病毒液生产
293T是慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10％FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。用状态良好且传代次数较少的293T细胞包装病毒。收集转染后48h的293T细胞上清液，离心、过滤后得到病毒液。
病毒生物学滴度测定
收集病毒液，Gata4、Mef2c和Tbx5按不同浓度梯度0.1μL、0.5μL、2μL、10μL分别感染293T细胞，48h后荧光显微镜下观察，随机挑选10个视野，数出荧光细胞的数目及视野下的总细胞数目，计算荧光细胞所占比例(图2-4)，将平皿的细胞消化下来并计数。计算病毒滴度＝荧光百分比×细胞总数/所加病毒体积(表1)，计算得到的病毒滴度可达109/mL。
表1.病毒滴度
慢病毒感染成纤维细胞
Gata4、Mef2c和Tbx5按不同浓度梯度2μL、10μL、30μL分别感染传至第3代的小鼠皮肤成纤维细胞，第4d在荧光显微镜下观察，随机挑选10个视野，计算荧光细胞所占比例(图5-7)，2μLGata4病毒液感染小鼠成纤维细胞感染效率为13.1％±2.3，10μL病毒液感染小鼠成纤维细胞感染效率为50.2％±10，30μL病毒液感染小鼠成纤维细胞感染效率为90％±5.4；2μLMef2c病毒液感染小鼠成纤维细胞感染效率为10.6％±4.6，10μL病毒液感染小鼠成纤维细胞感染效率为43.3％±9.5，30μL病毒液感染小鼠成纤维细胞感染效率为87.6％±6.7；2μLTbx5病毒液感染小鼠成纤维细胞感染效率为7.5％±5.2，10μL病毒液感染小鼠成纤维细胞感染效率为40.3％±12.9，30μL病毒液感染小鼠成纤维细胞感染效率为83.5％±6.1。从而得到了最佳感染效率所需的病毒体积，为每个病毒30μL。此时的转染效率可达90％以上。图8为3个病毒共转染成纤维细胞第4d，病毒感染效率为90.3％±3.7。
RT-PCR检测Gata4、Mef2c和Tbx5mRNA的表达
通过慢病毒转染，将三种转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5分别成功转入成纤维细胞，细胞内三种转录因子mRNA的表达情况如图9所示。图中显示，与对照组的正常细胞相比，三种目的基因Gata4、Mef2c和Tbx5在转染成功后的细胞内，表达水平显著升高，具有统计学意义(P<0.05)。
成纤维细胞直接重编程为心肌细胞
慢病毒感染皮肤成纤维细胞获得重编程心肌细胞
三种转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5共同感染小鼠皮肤成纤维细胞，在重编程过程中每24h观察细胞形态，细胞感染后第3d开始出现红色微弱的荧光，随着时间的增长，荧光强度和密度也逐渐增加，细胞形态由长梭形慢慢变成近似三角形，有小触角的细胞形态。转导后第1、2、3、4周细胞的荧光强度逐渐加强(图10)。
三种转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5共同感染小鼠皮肤成纤维细胞。转染后第1、2、3、4周细胞荧光的变化，图为细胞荧光(A-D)和白光(a-d)下的对比图，(A)为第1周，(B)为第2周，(C)为第3周，(D)为第4周。(×100)
Figure-10.ThreetranscriptionfactorsGata4,Mef2candTbx5infectmiceskinfibroblaststogether.Observethechangeofthefluorescenceafter1,2,3,4weeks,thegraphshowedthecontrastunderfluorescentlight(A-D)andwhitelight(a-d),(A)1w,(B)2w,(C)3w,(D)4w.(×100)
细胞免疫荧光化学检测重编程细胞内cTnI和Myh6的表达
用细胞免疫荧光化学技术检测成纤维细胞直接重编程为心肌细胞后第4周，诱导的心肌样细胞内心肌特异蛋白cTnI和Myh6的表达。可见绿色荧光，细胞形态为类三角形，触角较小，同时检测培养的正常心肌细胞内特异蛋白Myh6和cTnI的表达作为阳性对照(图11)，可见四组细胞形态相似，细胞绿色荧光强度相似，可初步证明成纤维细胞直接重编程为心肌细胞的模型建立成功。
RT-PCR检测重编程细胞内cTnI和Myh6mRNA的表达
利用RT-PCR检测成纤维细胞直接重编程为心肌细胞后第1、2、3、4周心肌特异标记cTnI和Myh6的表达，图12中可以看出与第1、2、3周相比，第4周心肌发育相关基因cTnI和Myh6表达倍数显著增加，cTnI表达倍数为5.94±0.013；Myh6表达倍数为5.21±0.19，证明成纤维细胞直接重编程为心肌细胞的模型建立成功。
实施例3低氧对成纤维细胞直接重编程为心肌细胞效率的影响
低氧微环境下成纤维细胞直接重编程为心肌细胞
重编程过程中细胞分别进行常氧培养(对照组)和低氧培养(实验组2％O2+5％CO2+93％N2)，选取6h和12h低氧预处理。慢病毒感染小鼠皮肤成纤维细胞，在重编程过程中每24h观察细胞形态，细胞荧光出现的时间为转染后第3d，此时的细胞荧光微弱，数量少，低氧预处理6h组荧光数量比低氧12h组荧光数量多，低氧预处理12h组荧光细胞数量比常氧组细胞多。转导后第1、2、3、4周细胞的荧光强度逐渐加强，荧光数量也逐渐增多(图13-14)。低氧6h组细胞荧光比率比低氧12h组高1.4±0.8倍，比常氧组高2.3±1.1倍。
低氧微环境下诱导的心肌细胞心肌特异性基因的表达
RT-PCR检测心肌特异标记Myh6mRNA的表达
用RT-PCR技术检测成纤维细胞转染后第1、2、3、4周低氧不同时间点(0h、6h、12h)心肌特异性基因Myh6的表达，通过所得数据计算每组2-ΔΔct值，由图中可以看出，细胞转染后前3wMyh6表达不显著，第4周常氧组Myh6表达倍数为4.26±0.21，低氧6h组Myh6表达倍数为6.21±0.38，低氧12h组Myh6表达倍数为3.97±0.30(图15)，低氧6h组Myh6表达量最高。
免疫细胞荧光化学检测心肌特异标记Myh6的表达
用免疫细胞荧光化学技术检测转染后第4周低氧预处理不同时间点心肌特异蛋白Myh6阳性的细胞比率，显微镜下随机观察10个视野，计算荧光细胞数与细胞核的比例从而得到阳性细胞率(图16)，常氧组荧光细胞比率为1.47±0.24，低氧6h组阳性细胞比率为6.74±1.31，低氧12h组阳性细胞比率为1.53±0.16。低氧6h组细胞阳性率是常氧组的4.59倍，低氧预处理12h组与常氧组荧光细胞数差异不大。
流式细胞技术检测检测心肌特异标记Myh6的表达
用流式细胞技术检测转染后第4周低氧预处理不同时间点(0、6、12h)心肌特异标记Myh6蛋白的表达。通过分析得到，常氧组Myh6表达量为1.7％±0.23，低氧6h组Myh6表达量为8％±1.20，低氧12h组Myh6表达量为1.8％±1.07(图17)，低氧6h组Myh6表达差异显著。
实施例4HIF-1在小鼠成纤维细胞直接重编程为心肌细胞过程中的表达
低氧处理组小鼠成纤维细胞直接重编程为心肌细胞过程中HIF-1在转染后不同时间(1、2、3、4w)的表达水平逐渐下降，第1周低氧预处理6h组HIF-1表达量为256.3±50.78，第2周HIF-1表达量为80.23±23.17，第3周和第4周表达量明显减少，几乎不表达。低氧预处理12h组第1周HIF-1表达量为187±20.81，第2周表达量为68.59±18.1，第3周和第4周表达量明显减少，几乎不表达(图18)。细胞在整个诱导过程中，未观察到自发跳动的细胞和异型细胞。
以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：构建慢病毒载体，利用293T细胞包装生产病毒，将携带转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5的慢病毒感染小鼠背部皮肤成纤维细胞，将成纤维细胞直接重编程为心肌细胞；重编程过程中转染的细胞分别进行对照组常氧培养和低氧2％O2+5％CO2+93％N2预处理6h、12h，在培养过程中每天观察重编程细胞的形态改变；在转导后第1、2、3、4周，利用RT-PCR、免疫细胞化学和流式细胞技术检测低氧不同时间心肌特异标记Myh6阳性的细胞比率；收集低氧组重编程细胞，利用RT-PCR检测HIF-1在重编程细胞中的表达，在mRNA水平上对其进行分析；
体外低氧条件2％O2+5％CO2+93％N2下，培养小鼠背部皮肤成纤维细胞，实验组分低氧6h、12h、24h、48h组，常氧为对照组；用免疫细胞化学方法和RT-PCR检测小鼠皮肤成纤维细胞中HIF-1、Oct4和Uhrf1的表达，在蛋白和mRNA水平对其进行分析。
2.根据权利要求1所述的低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法，其特征在于，加入低氧条件后，RT-PCR检测直接重编程第1、2、3、4周Myh6mRNA的表达，第4周Myh6表达水平升高明显，低氧6h组高于0h和12h；免疫细胞化学方法检测低氧条件下成纤维细胞直接重编程为心肌细胞内Myh6阳性率高于常氧组；低氧6h组Myh6的表达倍数是对照组的4.59倍；流式细胞技术检测到直接重编程后低氧6h组Myh6的表达量是对照组的4.71倍P<0.05；低氧12h组与常氧组阳性细胞比率差异不大；RT-PCR结果显示HIF-1在细胞重编程的早期表达水平升高，低氧6h组高于低氧12h组，与Myh6的表达变化相同，证明HIF-1在细胞直接重编程过程中被激活，起到促进细胞重编程的作用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109589337A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 南京艾尔普再生医学科技有限公司 心肌细胞制剂及其制备方法和应用
CN111630154A (zh) * 2017-12-20 2020-09-04 菲格内有限责任公司 加强成纤维细胞再生活性

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101074428A (zh) * 2006-05-16 2007-11-21 中国科学院上海生命科学研究院 一种促进胚胎干细胞向心肌细胞分化的方法
CN101932705A (zh) * 2007-04-07 2010-12-29 怀特黑德生物医学研究所 体细胞重编程
CN102947444A (zh) * 2010-06-23 2013-02-27 帷幄生物技术公司 用于治疗心血管疾病的非遗传修饰性重编程细胞的组合物和方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101074428A (zh) * 2006-05-16 2007-11-21 中国科学院上海生命科学研究院 一种促进胚胎干细胞向心肌细胞分化的方法
CN101932705A (zh) * 2007-04-07 2010-12-29 怀特黑德生物医学研究所 体细胞重编程
CN102947444A (zh) * 2010-06-23 2013-02-27 帷幄生物技术公司 用于治疗心血管疾病的非遗传修饰性重编程细胞的组合物和方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M LEDA 等: "Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors", 《CELL》 *
唐嘉茵 等: "HIF-1α对小鼠耳缘成纤维细胞组蛋白乙酰化的影响", 《中国解剖学会2011年年会论文文摘汇编》 *
师淑君 等: "低氧微环境对小鼠皮肤成纤维细胞HIF-1、Oct4、Uhrf1表达的影响", 《解剖科学进展》 *
王艳艳 等: "低氧促进小鼠皮肤成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞", 《中国解剖学会2015年年会论文文摘汇编》 *
王艳艳 等: "成纤维细胞直接重编程为心肌细胞的研究进展", 《中国细胞生物学学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111630154A (zh) * 2017-12-20 2020-09-04 菲格内有限责任公司 加强成纤维细胞再生活性
US11959102B2 (en) 2017-12-20 2024-04-16 Figene, Llc Augmentation of fibroblast regenerative activity
CN109589337A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 南京艾尔普再生医学科技有限公司 心肌细胞制剂及其制备方法和应用
CN109589337B (zh) * 2018-12-29 2022-04-26 南京艾尔普再生医学科技有限公司 心肌细胞制剂及其制备方法和应用

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