CN102628029B - 地贫诱导多能干细胞及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及地贫诱导多能干细胞及其制备方法和用途。其中，地贫诱导多能干细胞衍生自地中海贫血症患者的体细胞，并且该诱导多能干细胞的基因组中包含正常β珠蛋白基因。本发明的地贫诱导多能干细胞在适当的条件下能够分化为造血干细胞，并且该造血干细胞能够表达正常β珠蛋白基因。

Description

地贫诱导多能干细胞及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物医学领域。具体地，本发明涉及地贫诱导多能干细胞及其制备方法和用途。

背景技术

地中海贫血(thalassemia，地贫)是一组全球最常见的单基因遗传病，是由于珠蛋白基因缺陷导致血红蛋白(hemoglobin，Hb)功能异常的疾病，表现为慢性进行性溶血性贫血。地贫在我国广东、广西等地的人群中发病率非常高，目前主要依赖定期输血进行维持治疗，给病人及社会带来了沉重的负担。其中，重型β地中海贫血的治疗难度更大。异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前根治重型β地中海贫血的惟一临床手段。但众所周知，造血干细胞的来源及移植后的排斥极大限制了其临床应用。

多能性干细胞(pluripotent stem cell)是一类能够维持自我更新并具有多潜能分化能力的干细胞，在再生医学方面具有广阔的应用前景。而通过诱导性多能干细胞(iPS细胞)技术，能够获得充足的、自体来源的iPS细胞，从而能够将获得的iPS细胞应用于疾病治疗例如β-地中海贫血的治疗，并且能够有效地避免免疫排斥问题。

然而，目前的诱导性多能干细胞技术，尤其是制备地贫诱导多能干细胞的方法，仍有待改进。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：目前的诱导性多能干细胞技术，具有外源基因整合等问题，可能会影响插入基因的表达调控。

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效制备地贫诱导多能干细胞的方法。

为此，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种地贫诱导多能干细胞。根据本发明的实施例，该地贫诱导多能干细胞衍生自地中海贫血症患者的体细胞，并且该诱导多能干细胞的基因组中包含正常β珠蛋白基因。根据本发明实施例的地贫诱导多功能干细胞或其衍生物能够在适当的条件下有效地分化为造血干细胞，并且该造血干细胞能够表达正常β珠蛋白基因，进一步造血干细胞能够被引入地中海贫血症患者体内，从而能够有效地治疗地中海贫血症。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备地贫诱导多能干细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将多能干细胞诱导因子引入地中海贫血症患者的体细胞中，其中，地中海贫血症患者体细胞基因组中的β珠蛋白基因与正常β珠蛋白基因相比，存在选自下列的至少一种突变：CD41/42(-4bp)、IVS-II-654(C→T)、CD71/72(+A)、-28(A→G)、CD17(A→T)、IVS1-1(G→T)、IVS1-5(G→C)、CD8/9(+G)、CD15(G→A)、CD26(G→A)和CD30(G→C)；将引入多能干细胞诱导因子的体细胞在适于重编程的培养基中进行培养，以便获得原始诱导多能干细胞；以及向原始诱导多能干细胞中引入编码正常β珠蛋白的核酸，以便获得地贫诱导多能干细胞，该地贫诱导多能干细胞的基因组中包含正常β珠蛋白基因。利用根据本发明实施例的制备地贫诱导多能干细胞的方法，能够有效地制备地贫诱导多能干细胞，并且获得的地贫诱导多能干细胞能够在适当的条件下有效地分化为造血干细胞，并且该造血干细胞能够表达正常β珠蛋白基因，进一步造血干细胞能够被引入地中海贫血症患者体内，从而能够有效地治疗地中海贫血症。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种载体。根据本发明的实施例，该载体包括：第一核酸分子，该第一核酸分子包含编码正常β珠蛋白的核酸序列；第二核酸分子，该第二核酸分子位于第一核酸分子的5’侧，并且第二核酸分子包含编码筛选基因的核酸序列；两个loxP位点，这两个loxp位点分别位于第二核酸分子的5’侧和3’侧，其中位于第二核酸分子5’侧的loxP位点位于第二核酸分子和第一核酸分子之间。由此，利用该载体转化地中海贫血症患者的体细胞，能够获得地贫诱导多能干细胞，并且其能够在适当的条件下有效地分化为能够表达正常β珠蛋白基因的造血干细胞，从而本发明的载体能够成功修复地中海贫血症患者体细胞中的突变。并且在修复成功后，能够通过cre重组酶将两个loxp位点之间的筛选基因从细胞基因组中删除，从而能够避免外源基因的干扰，维持原始细胞的基因组完整性。

根据本发明的再一方面，本发明提供了一组载体。根据本发明的实施例，该组载体包含：第一载体，该第一载体为前面所述的根据本发明实施例的载体；以及第二载体，该第二载体携带编码锌指核酸酶的核酸分子，其中锌指核酸酶特异性识别β珠蛋白基因的3’下游区域，包括任选3’UTR区域以及下游区域。利用本发明的一组载体，能够方便有效地将地中海贫血症患者的体细胞转化诱导为能够表达正常β珠蛋白基因的多能干细胞，并且转化过程中对原始细胞基因组剪切的影响最低，细胞基因组中无外源基因的插入。

根据本发明的另一方面，本发明提供了前面所述的根据本发明实施例的一种载体，或一组载体在制备地贫诱导多能干细胞中的用途。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种制备造血干细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括在适于造血分化的条件下，培养根据本发明实施例的地贫诱导多能干细胞，以便获得造血干细胞。利用根据本发明实施例的制备造血干细胞的方法，能够有效地制备造血干细胞，进一步获得的造血干细胞能够被引入地中海贫血症患者体内，从而能够有效地治疗地中海贫血症。

根据本发明的再一方面，本发明提供了一种造血干细胞。根据本发明的实施例，该造血干细胞是通过根据本发明实施例的制备造血干细胞的方法得到的。根据本发明实施例的造血干细胞能够有效地应用于地中海贫血症治疗，具体地，将本发明的造血干细胞引入地中海贫血症患者体内，即能够有效地治疗地中海贫血症。

根据本发明的另一方面，本发明提供了根据本发明实施例的地贫诱导多能干细胞在制备药物以及药物库筛选中的用途，所述药物用于治疗地中海贫血症。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种治疗地中海贫血症的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：分离患者的体细胞；根据本发明实施例的制备地贫诱导多能干细胞的方法，基于体细胞，制备地贫诱导多能干细胞；以及将地贫诱导多能干细胞或其衍生物引入患者体内。利用根据本发明实施例的治疗地中海贫血症的方法，能够有效地对地中海贫血症患者进行治疗。

根据本发明的再一方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：前面所述的根据本发明实施例的一种载体，或一组载体。根据本发明的实施例，利用该试剂盒能够有效地对地中海贫血症患者的体细胞进行转化，进而能够有效地获得包含正常β珠蛋白基因的地贫诱导多能干细胞，且细胞基因组中无外源基因的插入。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的第一载体的结构示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的原始诱导多能干细胞的非整合鉴定结果；

图3显示了根据本发明一个实施例的地贫诱导多能干细胞的PCR鉴定结果；

图4显示了根据本发明一个实施例的地贫诱导多能干细胞以及前述的原始诱导多能干细胞的目的片段测序图谱；以及

图5显示了根据本发明一个实施例的地贫诱导多能干细胞分化前后的表面标记免疫荧光流式细胞仪检测图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，其中通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种地贫诱导多能干细胞。根据本发明的实施例，该地贫诱导多能干细胞衍生自地中海贫血症患者的体细胞，并且该诱导多能干细胞的基因组中包含正常β珠蛋白基因。根据本发明实施例的地贫诱导多功能干细胞或其衍生物能够在适当的条件下有效地分化为造血干细胞，并且该造血干细胞能够表达正常β珠蛋白基因，进一步造血干细胞能够被引入地中海贫血症患者体内，从而能够有效地治疗地中海贫血症。

根据本发明的实施例，地中海贫血症患者体细胞基因组中的β珠蛋白基因与正常β珠蛋白基因相比，存在选自下列的至少一种突变：CD41/42(-4bp)、IVS-II-654(C→T)、CD71/72(+A)、-28(A→G)、CD17(A→T)、IVS1-1(G→T)、IVS1-5(G→C)、CD8/9(+G)、CD15(G→A)、CD26(G→A)和CD30(G→C)。其中，CD41/42(-4bp)、IVS-II-654(C→T)、CD71/72(+A)、-28(A→G)和CD17(A→T)等β珠蛋白基因突变为中国南方地中海贫血症发病率最高的类型。

根据本发明的实施例，地贫诱导多能干细胞的基因组中的β珠蛋白基因均为正常β珠蛋白基因。由此，本发明的地贫诱导多能干细胞能够在适当的条件下有效地分化为造血干细胞，并且该造血干细胞能够表达正常β珠蛋白基因。根据本发明的实施例，体细胞的类型并不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，体细胞可以为选自地中海贫血症患者的尿液细胞、血液细胞、皮肤细胞、羊水细胞、角质细胞和脐血细胞的至少一种，优选为选自羊水细胞和尿液细胞的至少一种。根据本发明的实施例，地贫诱导多能干细胞不含有外源基因。由此，本发明的地贫诱导多能干细胞能够保持地中海贫血症患者体细胞基因组的完整性，避免了外源基因可能导致的致癌性。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备地贫诱导多能干细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将多能干细胞诱导因子引入地中海贫血症患者的体细胞中，其中，地中海贫血症患者体细胞基因组中的β珠蛋白基因与正常β珠蛋白基因相比，存在选自下列的至少一种突变：CD41/42(-4bp)、IVS-II-654(C→T)、CD71/72(+A)、-28(A→G)、CD17(A→T)、IVS1-1(G→T)、IVS1-5(G→C)、CD8/9(+G)、CD15(G→A)、CD26(G→A)和CD30(G→C)；将引入多能干细胞诱导因子的体细胞在适于重编程的培养基中进行培养，以便获得原始诱导多能干细胞；以及向原始诱导多能干细胞中引入编码正常β珠蛋白的核酸，以便获得地贫诱导多能干细胞，该地贫诱导多能干细胞的基因组中包含正常β珠蛋白基因。利用根据本发明实施例的制备地贫诱导多能干细胞的方法，能够有效地制备地贫诱导多能干细胞，并且获得的地贫诱导多能干细胞能够在适当的条件下有效地分化为造血干细胞，并且该造血干细胞能够表达正常β珠蛋白基因，进一步造血干细胞能够被引入地中海贫血症患者体内，从而能够有效地治疗地中海贫血症。

根据本发明的实施例，在本发明的制备地贫诱导多能干细胞的方法中，体细胞的类型并不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，体细胞可以为选自地中海贫血症患者的尿液细胞、血液细胞、皮肤细胞、羊水细胞、角质细胞和脐血细胞的至少一种，优选为选自羊水细胞和尿液细胞的至少一种。根据本发明的实施例，多能干细胞诱导因子引入地中海贫血症患者的体细胞中的形式并不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，在本发明的制备地贫诱导多能干细胞的方法中，多能干细胞诱导因子是以cDNA或miRNA的形式引入的。根据本发明的实施例，将多能干细胞诱导因子引入地中海贫血症患者的体细胞中，是利用携带上述多能干细胞诱导因子的载体进行的，其中载体的类型并不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，可以利用选自外随体载体、病毒载体和质粒载体的至少一种作为载体引入多能干细胞诱导因子，优选采用外随体载体。这是因为，在人细胞中，外随体(EPISOME)能够有效地表达其所携带的基因，但是其在细胞传代过程中会逐渐丢失，不会整合到细胞的基因组中，从而能够保持细胞基因组的完整性，并且，利用外随体载体诱导的多能干细胞，能够得到非病毒整合的多能干细胞，无病毒插入到多能干细胞基因组，不会引发机体对多能干细胞的免疫反应，从而能够有效提高后续实验的安全性。根据本发明的实施例，多能干细胞诱导因子的种类不受特别限制，可以包括现有技术中常采用的以及发现的具有诱导多能干细胞作用的任何诱导因子，如Sox1、Klf5、l-Myc或n-Myc、Esrrb、LRH等，也可以是其他具有该功能的编码或非编码RNA(包括micro RNA、长非编码RNA)、蛋白质、肽、化合物、细胞因子以及任何可能的组织培养基或培养环境(如低氧)。根据本发明的一些具体示例，多能干细胞诱导因子可以为选自Oct4、Sox2、Sox1、Klf4、Klf5、l-Myc、n-Myc、Esrrb、LRH、Nanog、Lin28和miR-302-367的至少一种，优选采用Oct4、Sox2、Nanog、Lin28和miR-302-367的组合。其中，miR-302的加入，能够有效地提高制备非整合地贫诱导多能干细胞的效率。前面所述的多能干细胞诱导因子均是已公开的，本领域技术人员可以方便地获取其登录号等信息，例如：Oct4，NCBI登录号为NM_013663；Sox2，NCBI登录号为NM_011443。根据本发明的一些实施例，多能干细胞诱导因子还可以为前面所述的几种多能干细胞诱导因子的变体。根据本发明的实施例，将多能干细胞诱导因子引入地中海贫血症患者的体细胞中的方法不受特别限制，可以是本领域技术人员熟知的任何转化技术。根据本发明的一些具体示例，可以采用选自核转染、病毒感染、脂质体转染、电穿孔和基因枪的至少一种，将多能干细胞诱导因子引入地中海贫血症病人的体细胞中，优选采用核转染方法。由此，能够有效地将多能干细胞诱导因子引入地中海贫血症患者的体细胞中，进而利用适于重编程的培养基能够有效地获得原始诱导多能干细胞。

根据本发明的实施例，向原始诱导多能干细胞中引入编码正常β珠蛋白的核酸是通过第一载体进行的，其中，第一载体包括：第一核酸分子、第二核酸分子和两个loxP位点。其中，第一核酸分子包含编码正常β珠蛋白的核酸序列，第二核酸分子位于第一核酸分子的3’侧，并且第二核酸分子包含编码筛选基因的核酸序列，两个loxp位点分别位于第二核酸分子的5’侧和3’侧，其中位于第二核酸分子5’侧的loxP位点位于第二核酸分子和第一核酸分子之间。根据本发明的实施例，第一核酸分子的序列如SEQ ID NO：1所示。根据本发明的实施例，第二核酸分子可以进一步包括启动子。根据本发明的实施例，该启动子的类型并不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，启动子为真核细胞启动子，该真核细胞启动子优选为选自PGK启动子、CMV启动子启动子、CAG启动子和EF1α启动子的至少一种，由此，能够使诱导的地贫诱导多能干细胞有效表达筛选基因，进而能够依据筛选基因的表达情况，对地贫诱导多能干细胞进行筛选，从而能够有效地获得阳性的含有正常β珠蛋白基因的地贫诱导多能干细胞。根据本发明的实施例，筛选基因的种类并不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，筛选基因可以为选自药物抗性基因和编码发光蛋白的基因的至少一种，发光蛋白优选为选自GFP和EGFP的至少一种，药物抗性基因优选为选自新霉素磷酸转移酶、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和杀稻瘟菌素抗性基因的至少一种。由此，依据诱导的地贫诱导多能干细胞对相应药物的抗性或荧光发生情况，能够方便有效地筛选出阳性细胞，从而有效能够提高制备地贫诱导多能干细胞的效率。

根据本发明的实施例，第一载体可以进一步包括第三核酸分子，第三核酸分子位于第二核酸分子的3’侧，并且第三核酸分子为同源重组所需要的β珠蛋白基因下游的序列。根据本发明的实施例，第三核酸分子可以为β珠蛋白基因的3’下游区域。根据本发明的一些具体示例，第三核酸分子可以为β珠蛋白基因的3’UTR区域以及下游区域。由此，能够有效地避免剪切对β珠蛋白基因的影响。

根据本发明的一个实施例，在本发明的制备地贫诱导多能干细胞的方法中，第一载体具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，并且具有附图1所示的结构，其中，如图1所示，第一载体以第一核酸分子(5arm)、第二核酸分子(PGK-Puro-PA)和两个loxP位点作为左臂，以第三核酸分子作为右臂(3arm)。

根据本发明的实施例，在本发明的制备地贫诱导多能干细胞的方法中，可以进一步包括向原始诱导多能干细胞中引入编码锌指核酸酶的核酸分子，其中锌指核酸酶特异性识别β珠蛋白基因的3’下游区域。根据本发明的一些具体示例，锌指核酸酶特异性识别β珠蛋白基因的3’UTR区域以及下游区域。根据本发明的实施例，编码锌指核酸酶的核酸分子有两个，分别具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的所示的序列。由此，利用编码锌指核酸酶的核酸分子，能够将原始诱导多能干细胞在基因组的目的位点进行准确有效地剪切，从而能够进一步有效地提高第一载体及编码正常β珠蛋白的核酸序列对基因的修复效率，至少可以使修复效率提高100倍，从而能够有效地提高制备地贫诱导多能干细胞的效率。

根据本发明的实施例，在本发明的制备地贫诱导多能干细胞的方法中，第一载体可以包括两个载体，这两个载体中分别包含不同的筛选基因。根据本发明的一些具体示例，第一载体可以包括两个载体，这两个载体中分别包含新霉素磷酸转移酶和嘌呤霉素抗性基因。由此，能够显著提高筛选阳性地贫诱导多功能干细胞的效率。

此外，根据本发明的实施例，在本发明的制备地贫诱导多能干细胞的方法中，向所述原始诱导多能干细胞中引入编码正常β珠蛋白的核酸的步骤，在本文中有时也称为“对原始诱导多能干细胞进行原位基因修复或基因修复”。根据本发明的一些实施例，在本发明的制备地贫诱导多能干细胞的方法中，对于基因组中等位基因发生双突变的地中海贫血症患者体细胞，可以对其进行双修复，即同时对基因组中两条染色体上的等位基因均进行修复，从而能够有效地获得该地贫重症患者的地贫诱导多能干细胞，而利用分别包含不同药物抗性基因的两个第一载体，通过分步法双修复，能够显著提高制备所述地贫重症患者的地贫诱导多能干细胞的效率。

需要说明的是，在本文中所使用的术语“第一”、“第二”、“第三”仅为了描述方便，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。此外，在本发明的制备地贫诱导多能干细胞的方法中，均不使用来源于动物血清和小鼠饲养层的培养条件，这是因为，动物血清和小鼠饲养层的培养条件会使得干细胞在临床应用中受到限制。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种载体。根据本发明的实施例，该载体包括：第一核酸分子、第二核酸分子和两个loxP位点，其中，第一核酸分子包含编码正常β珠蛋白的核酸序列；第二核酸分子位于第一核酸分子的5’侧，并且第二核酸分子包含编码筛选基因的核酸序列；两个loxp位点分别位于第二核酸分子的5’侧和3’侧，其中位于第二核酸分子5’侧的loxP位点位于第二核酸分子和第一核酸分子之间。由此，利用本发明的载体转化地中海贫血症患者的体细胞，能够有效地获得包含正常β珠蛋白基因的地贫诱导多能干细胞，从而能够成功修复地中海贫血症患者体细胞中的突变。并且在修复成功后，能够通过cre重组酶将两个loxp位点之间的筛选基因从细胞基因组中删除，从而能够避免外源基因的干扰，维持原始细胞的基因组完整性。

根据本发明的实施例，在本发明的载体中，第一核酸分子的序列如SEQ ID NO：1所示。根据本发明的实施例，第二核酸分子可以进一步包括启动子。根据本发明的实施例，该启动子的类型并不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，启动子为真核细胞启动子，该真核细胞启动子优选为选自PGK启动子、CMV启动子启动子、CAG启动子和EF1α启动子的至少一种，由此，利用本发明的载体转化诱导地中海贫血症患者的体细胞，能够使诱导的地贫诱导多能干细胞有效表达筛选基因，进而能够依据筛选基因的表达情况，筛选出阳性的地贫诱导多能干细胞。根据本发明的实施例，筛选基因的种类并不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，筛选基因可以为选自药物抗性基因和编码发光蛋白的基因的至少一种，发光蛋白优选为选自GFP和EGFP的至少一种，药物抗性基因优选为选自新霉素磷酸转移酶、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和杀稻瘟菌素抗性基因的至少一种。由此，依据诱导的地贫诱导多能干细胞对相应药物的抗性或荧光发生情况，能够方便有效地对利用本发明的载体获得的地贫诱导多能干细胞进行筛选。

根据本发明的实施例，本发明的载体进一步包括第三核酸分子，第三核酸分子位于第二核酸分子的3’侧，并且第三核酸分子为同源重组所需要的β珠蛋白基因下游的序列。根据本发明的实施例，第三核酸分子可以为β珠蛋白基因的3’下游区域。根据本发明的一些具体示例，第三核酸分子可以为β珠蛋白基因的3’UTR区域以及下游区域。由此，在利用本发明的载体修复地贫诱导多能干细胞时，能够有效地避免对β珠蛋白基因的改变。

根据本发明的实施例，本发明的载体可以包括两个载体，这两个载体中分别包含不同的筛选基因。根据本发明的一些具体示例，本发明的载体可以包括两个载体，这两个载体中分别包含新霉素磷酸转移酶和嘌呤霉素抗性基因。

根据本发明的再一方面，本发明提供了一组载体。根据本发明的实施例，该组载体包含：第一载体，该第一载体为前面所述的根据本发明实施例的载体；以及第二载体，该第二载体携带编码锌指核酸酶的核酸分子，其中锌指核酸酶特异性识别β珠蛋白基因的3’下游区域，包括任选3’UTR区域以及下游区域。根据本发明的实施例，编码锌指核酸酶的核酸分子有两个，分别具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的所示的序列。利用本发明的一组载体，能够方便有效地将地中海贫血症患者的体细胞转化诱导为包含正常β珠蛋白基因的多能干细胞，并且转化过程中对原始细胞基因组剪切的影响最低，细胞基因组中无外源基因的插入。

根据本发明的另一方面，本发明提供了前面所述的根据本发明实施例的一种载体，或一组载体在制备地贫诱导多能干细胞中的用途。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种制备造血干细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括在适于造血分化的条件下，培养根据本发明实施例的地贫诱导多能干细胞，以便获得造血干细胞。利用根据本发明实施例的制备造血干细胞的方法，能够有效地制备造血干细胞，进一步获得的造血干细胞能够被引入地中海贫血症患者体内，从而能够有效地治疗地中海贫血症。

根据本发明的再一方面，本发明提供了一种造血干细胞。根据本发明的实施例，该造血干细胞是通过根据本发明实施例的制备造血干细胞的方法得到的。根据本发明实施例的造血干细胞能够有效地应用于地中海贫血症治疗，具体地，将本发明的造血干细胞引入地中海贫血症患者体内，即能够有效地治疗地中海贫血症。

根据本发明的另一方面，本发明提供了根据本发明实施例的地贫诱导多能干细胞在制备药物以及药物库筛选中的用途，所述药物用于治疗地中海贫血症。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种治疗地中海贫血症的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：分离患者的体细胞；根据本发明实施例的制备地贫诱导多能干细胞的方法，基于体细胞，制备地贫诱导多能干细胞；以及将地贫诱导多能干细胞或其衍生物引入患者体内。利用根据本发明实施例的治疗地中海贫血症的方法，能够有效地对地中海贫血症患者进行治疗。

根据本发明的再一方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：前面所述的根据本发明实施例的一种载体，或一组载体。根据本发明的实施例，利用该试剂盒能够有效地对地中海贫血症患者的体细胞进行转化，进而能够有效地获得包含正常β珠蛋白基因的地贫诱导多能干细胞，且细胞基因组中无外源基因的插入。

需要说明的是，本发明的地贫诱导多能干细胞及其制备方法和用途，是本申请的发明人通过艰苦的创造性劳动和优化的工作而完成的。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

1、原始诱导多能干细胞的获得以及鉴定

首先，通过核转染方法，将包含多能干细胞诱导因子的cDNA或miRNA簇的外随体导入地中海贫血症患者的羊水细胞中，其中，与正常β珠蛋白基因相比，该地中海贫血症患者羊水细胞基因组中的β珠蛋白基因的两条等位基因均发生了同样的突变，突变类型为IVS-II—654；所采用的多能干细胞诱导因子为Oct4、Sox2、Nanog、Lin28和miR-302-367的组合。

然后，将引入多能干细胞诱导因子的羊水细胞直接转入无血清、无细胞饲养层的人胚胎干细胞培养环境中，培养20天后获得大量生长典型的原始诱导多能干细胞克隆，将这些克隆挑取后继续培养。随机挑取两个获得的原始诱导多能干细胞，利用PCR方法扩增其外源的诱导因子，以便对其进行非整合鉴定，结果见图2。图2显示了原始诱导多能干细胞的非整合鉴定结果。如图2所示，-为阴性对照；+为阳性对照；UC为地贫患者的体细胞(羊水细胞)的泳道；iPS1和iPS2为两个原始诱导多能干细胞的泳道。由图2可知，两个原始诱导多能干细胞，以及地贫患者的体细胞，均无任何外源基因的整合。

2、地贫诱导多能干细胞的获得以及鉴定

首先，利用EDTA，将在无血清、无细胞饲养层培养至汇合度为80％，并且非整合鉴定为阳性的原始诱导多能干细胞消化至小团块；收集上述小团块并去除上清，然后利用电转液将其进行重悬后分至两个Eppendorf离心管中，分别记作第一组和第二组；接着，将两组反应体系分别添加相应的试剂后进行电转，其中，第一组加入锌指核酸酶和第一载体，第二组只加入第一载体和携带绿色荧光蛋白基因的质粒，其中，第一载体携带的筛选基因为嘌呤霉素(puromycin)；将两组反应体系的转化细胞，分别于铺被有matrigel的培养板中继续培养；培养第4天时，向培养板中添加相应的药物进行筛选；在利用药物筛选3-7天后，可以发现第一组中有大约30个药物抗性克隆，而第二组没有克隆生长，表明锌指核酸酶可以显著提高同源重组修复的效率。第一组中获得的克隆即为地贫诱导多能干细胞，将其挑取到单独的培养孔中培养，备用。其中，需要说明的是，第二组采用带绿色荧光蛋白基因的质粒是为了表征电转干细胞的效率，因为这个效率很低，约20％。是质量控制的一部分。

利用PCR反应和凝胶电泳对获得的地贫诱导多能干细胞进行鉴定，其中，PCR反应采用引物1和2，引物序列如下所示：

引物1 ATCTTAGAGGGAGGGCTGAGGGTTTG(SEQ ID NO：5)，

引物2 ACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTGGCG(SEQ ID NO：6)，

结果见图3。图3显示了地贫诱导多能干细胞的PCR鉴定结果。如图3所示，M为marker；水为阴性对照；6、7、9、10、16、19、24、26、30，分别为本实施例获得的各地贫诱导多能干细胞的泳道。其中，只有基因组中β珠蛋白基因修复后的地贫诱导多能干细胞，才能产生阳性条带。由图3可知，6、9、16、24、26、30地贫诱导多能干细胞为阳性克隆。

接着，采用引物3和4，分别将地贫诱导多能干细胞9和26以及前述的原始诱导多能干细胞的基因组进行PCR扩增，以便获得包含有β珠蛋白基因的目的片段，然后采用常规测序方法对目的片段进行测序，以便确定对原始诱导多能干细胞的修复是否成功，部分测序图谱见图4。其中，引物3和4的序列如下所示：

引物3 TTAGGCAGAATCCAGATGCTCAA(SEQ ID NO：7)，

引物4 ATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATG(SEQ ID NO：8)。

图4显示了地贫诱导多能干细胞以及前述的原始诱导多能干细胞的目的片段的测序图谱。其中，若修复成功，则原始诱导多能干细胞中β珠蛋白基因的突变区域的2个T碱基会变成C碱基。如图4所示，从左至右，第一个测序图谱为地贫患者的原始诱导多能干细胞的目的片段测序图；第二和第三个测序图谱分别为对原始诱导多能干细胞进行单修复、双修复获得的地贫诱导多能干细胞的目的片段测序图。由图4可知，原始诱导多能干细胞在如箭头所指的第3位和倒数第2为碱基T，而单修复的地贫诱导多能干细胞26的测序图上在该位置可见双峰，为C和T的叠加，双修复的地贫诱导多能干细胞9的测序图上在该位置为单一的碱基C。其中，双峰代表一个等位基因修复，单峰的C碱基代表双修复。图4的结果表明，双修复的方法可行。

3、地贫多能干细胞多能性鉴定

将上述获得并继续培养的地贫诱导多能干细胞，经过造血分化后，利用流式细胞仪免疫荧光法检测其分化能力。结果见图5，其中，CD34和CD43均为造血干细胞的表面标记分子。造血干细胞的标志是流式细胞仪检测为CD34阳性。图5显示了地贫诱导多能干细胞分化前后的免疫荧光流式细胞仪检测图。如图5所示，上图为未分化的地贫诱导多能干细胞的免疫荧光流式细胞仪检测图，作为对照；下图为地贫诱导多能干细胞经造血分化后的细胞的免疫荧光流式细胞仪检测图，其中横坐标为FITC，表征CD43表达量的高低，将10作为阳性的阈值；纵坐标为PE-cy5表征CD34表达量的高低，将10作为阳性的阈值。可以将图中的所有待测细胞分为四个区域。由图5可知，分化后左上区域细胞(为造血干细胞)明显增加。表明对原始诱导多能干细胞进行基因修复后获得的地贫诱导多能干细胞具有多能性，能够分化为造血干细胞，分化后细胞CD34阳性率约10％(下图左上区域，未分化的干细胞此区域0％)。

然后，利用定量PCR对地贫多能干细胞进行检测，结果表明获得的地贫多能干细胞表达Oct4、Sox2、Nanog等多能性因子。

此外，利用传统的造血分化技术，在适于造血分化的条件下，即将上述地贫诱导多能干细胞形成的拟胚体与OP9细胞共培养，添加培养基(成分：MEM alpha基础培养基+10％FBS+MTG+Vc)培养8天，结果约有10％的地贫诱导多能干细胞分化为CD34阳性的造血干细胞。需要说明的是，诱导多能干细胞要用于药物筛选及临床移植，必须分化为特定类型的细胞。而本实验证明了，根据本发明的方法得到的修复好的地贫诱导多能干细胞，可以在体外分化为造血干细胞。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种制备地贫诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括：

将多能干细胞诱导因子引入地中海贫血症患者的体细胞中，其中，所述地中海贫血症患者体细胞基因组中的β珠蛋白基因与正常β珠蛋白基因相比，存在选自下列的至少一种突变：CD41/42(-4bp)、IVS-II-654(C→T)、CD71/72(+A)、-28(A→G)、CD17(A→T)、IVS1-1(G→T)、IVS1-5(G→C)、CD8/9(+G)、CD15(G→A)、CD26(G→A)和CD30(G→C)；

将引入所述多能干细胞诱导因子的体细胞在适于重编程的培养基中进行培养，以便获得原始诱导多能干细胞；以及

向所述原始诱导多能干细胞中引入编码正常β珠蛋白的核酸，以便获得地贫诱导多能干细胞，所述地贫诱导多能干细胞的基因组中包含正常β珠蛋白基因，

其中，

向所述原始诱导多能干细胞中引入编码正常β珠蛋白的核酸是通过第一载体进行的，

其中，

所述第一载体包括：

第一核酸分子，所述第一核酸分子包含编码正常β珠蛋白的核酸序列；

第二核酸分子，所述第二核酸分子位于所述第一核酸分子的3’侧，并且所述第二核酸分子包含编码筛选基因的核酸序列；

两个loxP位点，所述两个loxp位点分别位于所述第二核酸分子的5’侧和3’侧，其中位于所述第二核酸分子5’侧的loxP位点位于所述第二核酸分子和所述第一核酸分子之间；

第三核酸分子，所述第三核酸分子位于所述第二核酸分子的3’侧，并且所述第三核酸分子为同源重组所需要的β珠蛋白基因的3’UTR区域以及下游区域，

进一步包括向所述原始诱导多能干细胞中引入编码锌指核酸酶的核酸分子，其中所述锌指核酸酶特异性识别所述β珠蛋白基因的3’UTR区域以及下游区域，

所述体细胞为选自所述地中海贫血症患者的尿液细胞、血液细胞、皮肤细胞、羊水细胞、角质细胞的至少一种，

所述多能干细胞诱导因子是以cDNA或miRNA的形式引入的，

利用选自外随体载体、病毒载体和质粒载体的至少一种作为载体引入所述多能干细胞诱导因子，

所述多能干细胞诱导因子为选自Oct4、Sox2、Sox1、Klf4、Klf5、l-Myc、n-Myc、Esrrb、LRH、Nanog、Lin28和miR-302-367的至少一种，

采用选自核转染、病毒感染、脂质体转染、电穿孔和基因枪的至少一种，将所述多能干细胞诱导因子引入所述地中海贫血症病人的体细胞中，

所述第一核酸分子的序列如SEQ ID NO：1所示，

所述第二核酸分子进一步包括启动子，

所述启动子为真核细胞启动子，

所述筛选基因为药物抗性基因，

所述编码锌指核酸酶的核酸分子有两个，序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体细胞为选自羊水细胞和尿液细胞的至少一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用外随体载体作为载体引入所述多能干细胞诱导因子。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞诱导因子为Oct4、Sox2、Nanog、Lin28和miR-302-367的组合。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用核转染方法将所述多能干细胞诱导因子引入所述地中海贫血症病人的体细胞中。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真核细胞启动子为选自PGK启动子、CMV启动子、CAG启动子和EF1α启动子的至少一种。

7.一组载体，其特征在于，包含：

第一载体，所述第一载体包括：

第一核酸分子，所述第一核酸分子包含编码正常β珠蛋白的核酸序列；

第二核酸分子，所述第二核酸分子位于所述第一核酸分子的3’侧，并且所述第二核酸分子包含编码筛选基因的核酸序列；

两个loxP位点，所述两个loxp位点分别位于所述第二核酸分子的5’侧和3’侧，其中位于所述第二核酸分子5’侧的loxP位点位于所述第二核酸分子和所述第一核酸分子之间；

第三核酸分子，所述第三核酸分子位于所述第二核酸分子的3’侧，并且所述第三核酸分子为同源重组所需要的β珠蛋白基因的3’UTR区域以及下游区域，

其中，

所述第一核酸分子的序列如SEQ ID NO：1所示，

所述第二核酸分子进一步包括启动子，

所述启动子为真核细胞启动子，

所述筛选基因为药物抗性基因；以及

第二载体，所述第二载体携带编码锌指核酸酶的核酸分子，其中所述锌指核酸酶特异性识别所述β珠蛋白基因的3’下游区域，包括任选3’UTR区域以及下游区域，

所述编码锌指核酸酶的核酸分子有两个，序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

8.根据权利要求7所述的一组载体，其特征在于，所述真核细胞启动子为选自PGK启动子、CMV启动子、CAG启动子和EF1α启动子的至少一种。

9.权利要求7或8所述的一组载体在制备地贫诱导多能干细胞中的用途。

10.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求7或8所述的一组载体。