CN107760650A - 一种改造的cho细胞及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种经改造的中国仓鼠卵巢癌细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)及其用途。所述经改造的CHO细胞能够在无血清、悬浮培养的条件下稳定且高密度地生长，并且优选地，不表达功能性的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)和岩藻糖基转移酶8(Fucosyl trans ferase 8，FUT8)。此类经改造的CHO细胞特别适合用于重组蛋白(特别是抗体)的高水平真核表达，从而在基因工程领域和蛋白工程领域具有广阔的应用前景。

Description

一种改造的CHO细胞及其用途

技术领域

本申请涉及基因工程领域、蛋白工程领域以及细胞工程领域。具体而言，本申请涉及一种经改造的中国仓鼠卵巢癌细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)及其用途。所述经改造的CHO细胞能够在无血清、悬浮培养的条件下稳定且高密度地生长，并且优选地，不表达功能性的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)和岩藻糖基转移酶8(Fucosyltransferase 8，FUT8)。此类经改造的CHO细胞特别适合用于重组蛋白(特别是抗体)的高水平真核表达，从而在基因工程领域和蛋白工程领域具有广阔的应用前景。

背景技术

自1982年美国FDA批准Genetech的重组胰岛素上市以来，重组蛋白已经成功用于科学研究、多种疾病的诊断、治疗及预防等。目前，重组蛋白主要使用外源蛋白表达系统来进行生产和表达。

基因工程领域和蛋白工程领域的外源蛋白表达系统主要分为：原核表达系统和真核表达系统。原核表达系统主要使用大肠杆菌细胞；真核表达系统主要使用酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞等真核细胞。与用于表达蛋白的其他细胞相比，哺乳动物细胞在用于表达外源蛋白时，能够对外源蛋白进行翻译后修饰；而且还能实现多亚基蛋白的多个亚基的共表达，并在胞内对多个亚基进行正确组装，表达出结构正确的多亚基蛋白。哺乳动物细胞的规模化生产技术也日渐成熟。因此，用哺乳动物细胞生产重组蛋白已经成为生物技术药物的主流技术。目前已上市、正在进行临床实验及临床前研究的蛋白药物，大部分都由哺乳动物细胞进行表达，而其中，中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)是在重组蛋白生产中最广泛使用的宿主细胞。

CHO细胞及其衍生细胞系，具有与人体最为接近的蛋白翻译修饰系统，其对蛋白的修饰方式与人细胞接近。因此，在使用CHO细胞来生产外源蛋白时，因蛋白翻译后修饰导致的免疫原性问题较低，所表达的蛋白产物活性较高。因此，CHO细胞是目前大部分重组蛋白尤其是抗体的主流表达宿主细胞。

CHO细胞具有多个品系。目前用于工业生产的CHO细胞主要系包括DG44，CHO-DUBX，CHOs及CHO-K1等。前三者为基因缺陷型CHO细胞，主要用于构建含有DHFR系统的细胞株；CHO-K1细胞系为进化上较为原始的CHO细胞，其基因组相对较为完整，可以作为多种表达系统的宿主细胞。CHO-K1细胞系又可分为两个品系，CHO-K1-CCL-61和CHO-K1-CRL-9618；前者运用较多，对其研究也较为充分；后者为新一代的CHO细胞，但关于该细胞的研究和运用少有报道。

动物细胞培养主要以贴壁培养和悬浮培养两种方式进行。贴壁培养的细胞贴附生长于二维的基质表面。贴壁生长的细胞具有接触抑制性，即，一旦细胞铺满生长基质表面以后，就开始启动细胞凋亡程序。因此，这类细胞的生产放大依赖于培养面积的扩大，培养空间和培养基的利用率较低。此外，贴壁培养通常需要使用动物来源的血清，这增加了蛋白产物污染动物源病原体的风险。同时，血清的批次差异较大，这会增加生产过程的不确定性；并且，血清的价格昂贵，显著增加了蛋白生产的成本。因此，对CHO细胞进行悬浮驯化，实现以无血清、悬浮方式进行培养是重组蛋白生产的最佳选择。

根据表达的时效性和稳定性，蛋白表达分为瞬时表达和稳定表达。在瞬时表达过程中，大量外源基因被导入细胞，但不整合到细胞的基因组(例如染色体)上，由此在短期内实现外源蛋白的高效表达。然而，随着细胞的分裂，外源基因的拷贝逐渐丢失，外源蛋白的表达水平也逐步降低。因此，瞬时表达可实现蛋白的短期、快速生产，但蛋白的异质性和批次间差异较大，只能用于蛋白药物研发早期对候选蛋白进行高通量筛选和评价。在稳定表达过程中，编码外源蛋白的基因被稳定插入宿主细胞的基因组(例如染色体)中，因此，宿主细胞能够长期稳定地表达外源蛋白。蛋白的工业化生产主要基于稳定表达，因为通过稳定表达生产的蛋白同质性较好，批次间差异也较小。

因此，在目前的工业化生产中，通常会使用以无血清、悬浮方式进行培养的经驯化的CHO细胞系来稳定表达目的外源蛋白。然而，驯化后的CHO细胞系普遍存在下述问题：细胞无法实现稳定且高密度地生长；细胞在整合外源基因以稳定表达外源蛋白时生产能力相对有限(通常低于10pg/细胞/天)。因此，需要开发新的CHO细胞株，以进一步提高细胞的生长密度以及细胞生产外源蛋白的能力。

发明内容

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞等，真菌细胞例如酵母细胞或曲霉菌细胞等，昆虫细胞例如S2果蝇细胞或SF9细胞，和动物细胞例如纤维源细胞，CHO细胞，COS细胞，NS0细胞，Hela细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等。

如本文中所使用的，某一细胞的“后代细胞”是指直接或间接起源于该细胞的细胞，其不仅包括该细胞通过细胞分裂或细胞繁殖而直接产生的后代细胞，而且包括由该细胞的后代细胞产生的后代细胞。例如，CHO-9618s的后代细胞包括，任何直接或间接源于CHO-9618s的细胞；CHO-NIDVD的后代细胞包括，任何直接或间接源于CHO-NIDVD的细胞。

如本文中所使用的，术语“贴壁培养”是指，细胞贴附于固体基质表面进行生长的培养方式。在贴壁培养的条件下，细胞通常进行单层生长。贴壁培养可使用含血清或不含血清的培养基。

如本文中所使用的，术语“悬浮培养”是指，细胞悬浮培养于液体培养基中的培养方式。在悬浮培养的条件下，细胞可在液体空间中进行多层培养。

如本文中所使用的，术语“无血清培养”是指，使用不含血清的培养基来培养细胞的培养方式。如本文中所使用的，术语“无血清悬浮培养”是指，细胞悬浮培养于不含血清的液体培养基中的培养方式。

如本文中所使用的，术语“无血清悬浮适应”是指，将依赖于血清的、贴壁培养的细胞转化为能够在无血清培养基中悬浮培养的细胞的过程。

如本文中所使用的，术语“谷氨酰胺合成酶(GS)”是指，能够催化谷氨酸和铵合成谷氨酰胺的酶。GS的国际系统分类编号为EC6.3.1.2。CHO细胞的基因组中，编码谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列是已知的，其示例性核苷酸序列可参见例如，NCBI登录号NW_003613921.1；第1430036-1435423位。

如本文中所使用的，术语“岩藻糖基转移酶8(FUT8)”亦称为α-(1,6)-岩藻糖基转移酶，其能够催化岩藻糖基以α-(1,6)的连接方式转移至蛋白的糖基化位点。FUT8的国际系统分类编号为EC2.4.1.68。CHO细胞的基因组中，编码岩藻糖基转移酶8(FUT8)的核苷酸序列是已知的，其示例性核苷酸序列可参见例如，NCBI登录号NW_003613860.1；第608848-730818位。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“瞬时表达”是指，宿主细胞将游离于宿主细胞基因组之外(即，未整合到宿主细胞的基因组中)的编码外源蛋白的基因表达为外源蛋白。瞬时表达可在短期内实现外源蛋白的高效表达。然而，随着细胞的分裂，外源基因的拷贝逐渐丢失，外源蛋白的表达水平也逐步降低。

如本文中所使用的，术语“稳定表达”是指，宿主细胞将整合到宿主细胞基因组中的编码外源蛋白的基因表达为外源蛋白。在稳定表达过程中，编码外源蛋白的基因被稳定插入宿主细胞的基因组(例如染色体)中，因此，宿主细胞能够长期稳定地表达外源蛋白。

如本文中所使用的，术语“基因敲除”是指，对细胞基因组中的基因进行编辑(例如，对该基因进行插入、替换、和/或删除等改造)，使得该基因丧失其原有功能(例如，不能表达功能性的蛋白)。可使用各种已知的分子生物学技术(例如，使用ZFN、TALEN、CRISPR/cas9、或NgAgo的基因编辑技术)来编辑细胞基因组中的基因。基因敲除并不局限于将整个基因完整缺失或去除，而只要使基因丧失其原有功能即可。例如，可通过在基因中插入外源DNA片段，使得该基因无法表达功能性蛋白，或可通过在基因中插入或缺失一个或数个碱基，使得该基因发生移码突变，来实现对该基因的敲除。

如本文中所使用的，术语“FCGR”是指免疫球蛋白的Fcγ受体，其介导多种效应，例如ADCC和ADCP等。

如本文中所使用的，术语“ADCC”即抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，其是指，具有杀伤活性的细胞(例如NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)，通过其表面表达的Fc受体(FcR)识别特异性结合于靶细胞(例如病毒感染的细胞和肿瘤细胞)表面抗原的抗体的Fc片段，直接杀伤靶细胞(例如病毒感染的细胞和肿瘤细胞)。

如本文中所使用的，术语“ADCP”即抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis)，其是指，吞噬细胞(例如单核-巨噬细胞、中性粒细胞)，通过其表面表达的Fc受体(FcR)识别特异性结合于靶细胞(例如病毒感染的细胞和肿瘤细胞)表面抗原的抗体的Fc片段，直接吞噬靶细胞(例如病毒感染的细胞和肿瘤细胞)。

如本文中所使用的，术语“翻译后修饰”是指，蛋白质在翻译后发生的化学修饰。“翻译后修饰”通常在宿主细胞中发生，但也可通过人工修饰进行；其包括但不限于：乙酰化、烷基化、甲基化、生物素化、谷氨酸化、甘氨酸化、糖基化、异戊二烯化、硫辛酸化、磷酸泛酰巯基乙胺基化、磷酸化、硫酸化等。

如本文中所使用的，术语“糖基化”是指，将糖基转移至蛋白质，并与蛋白质上的氨基酸残基(例如天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸；此类氨基酸残基亦被称为糖基化位点)形成糖苷键的过程。糖基化通常在糖基转移酶的催化下进行，其是一种重要的蛋白质翻译后修饰，使蛋白转变为糖蛋白，并影响/改变蛋白的功能。

如本文中所使用的，术语“批次培养”又叫“分批培养”，其指将细胞接种至有限数量的培养基中进行培养，直至完成一个培养周期(即，培养基中的营养物质耗尽或细胞死亡)的培养方式。

如本文中所使用的，术语“补料-批次培养”又叫“流加培养”，其是指，将细胞接种至一定量的培养基中进行培养，随后随着营养物质的不断消耗，不断地向系统中补充新的培养基以继续培养细胞(即，延长细胞的培养时间)，直到整个培养过程结束的培养方式。

本申请的发明人通过大量的研究，获得了一株CHO细胞系(命名为CHO-9618s，且保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO.C2016142)，其能够在无血清、悬浮培养的条件下稳定且高密度地生长(最高活细胞密度可达2.5*10⁷个细胞/ml)。本申请的发明人还对该CHO细胞系进行了进一步的改造，使其不表达功能性的谷氨酰胺合成酶(GS)和岩藻糖基转移酶8(FUT8)。在此基础上，本申请的发明人获得了另一株特别有利的CHO细胞系(命名为CHO-NIDVD，且保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNO.C2016143)，其不仅能够在无血清、悬浮培养的条件下稳定且高密度地生长，而且能够用于快速、高效地构建以高水平稳定表达目的蛋白的工程细胞系(即，当使用CHO-NIDVD作为宿主细胞来构建稳定表达目的蛋白的工程细胞系时，不仅构建工程细胞系的效率得到提高，而且所构建的工程细胞系的目的蛋白表达水平也得到提高)。

因此，在一个方面，本发明提供了一种CHO细胞系，其为保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，并且保藏号为CCTCC NO.C2016142的CHO-9618s细胞或其后代细胞。

在某些优选的实施方案中，所述CHO细胞系经改造而不表达功能性的谷氨酰胺合成酶(GS)和岩藻糖基转移酶8(FUT8)。在某些优选的实施方案中，在所述CHO细胞系的基因组中，编码谷氨酰胺合成酶(GS)和岩藻糖基转移酶8(FUT8)的基因已被基因敲除。

本申请的细胞系CHO-9618s及其后代细胞能够在无血清、悬浮培养的条件下稳定且高密度地生长(最高活细胞密度可达2.5*10⁷个细胞/ml)。因此，本申请的细胞系CHO-9618s及其后代细胞特别适合用于表达目的蛋白(例如抗体)。因此，在某些优选的实施方案中，所述CHO细胞系还包含编码目的蛋白的核酸分子。在某些优选的实施方案中，所述目的蛋白为抗体。

在某些优选的实施方案中，所述核酸分子游离于所述CHO细胞系的基因组之外(即，未整合到所述CHO细胞系的基因组中)。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含于游离的表达载体(例如质粒)中。在某些优选的实施方案中，所述CHO细胞系能够瞬时表达所述目的蛋白。

在另外一些优选的实施方案中，所述核酸分子被整合到所述CHO细胞系的基因组中。在某些优选的实施方案中，所述CHO细胞系能够稳定表达所述目的蛋白。

在另一方面，本发明提供了一种表达目的蛋白的方法，其包括，(1)将编码所述目的蛋白的核酸分子导入本发明的CHO细胞系中，以及，(2)在适合表达目的蛋白的条件下培养所述CHO细胞系，以在所述CHO细胞系中表达所述目的蛋白。在某些优选的实施方案中，所述目的蛋白为抗体。

在某些优选的实施方案中，所述CHO细胞系为保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)且保藏号为CCTCC NO.C2016142的CHO-9618s细胞或其后代细胞。在某些优选的实施方案中，在步骤(1)之前，对所述CHO细胞系进行改造，以使其不表达功能性的谷氨酰胺合成酶(GS)和岩藻糖基转移酶8(FUT8)。在某些优选的实施方案中，在步骤(1)之前，从所述CHO细胞系的基因组中基因敲除编码谷氨酰胺合成酶(GS)和岩藻糖基转移酶8(FUT8)的基因。

可使用各种方式来将编码所述目的蛋白的核酸分子导入CHO细胞系中。例如，可通过使用转染试剂(例如脂质转染试剂)，或者可通过使用电转染的方式，将编码所述目的蛋白的核酸分子导入CHO细胞系中。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含于表达载体(例如质粒)中。

在某些优选的实施方案中，所述核酸分子在导入所述CHO细胞系后，游离于所述CHO细胞系的基因组之外(即，未整合到所述CHO细胞系的基因组中)。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子在导入所述CHO细胞系后，被整合到所述CHO细胞系的基因组中。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，所述CHO细胞系以瞬时表达的方式表达所述目的蛋白。在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，所述CHO细胞系以稳定表达的方式表达所述目的蛋白。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，以分批培养或流加培养的方式培养所述CHO细胞系。

在另一方面，本发明提供了如上所述的CHO细胞系用于表达目的蛋白的用途。在另一方面，本发明提供了如上所述的CHO细胞系用于制备工程化细胞的用途，所述工程化细胞用于表达目的蛋白。在某些优选的实施方案中，所述目的蛋白为抗体。在某些优选的实施方案中，所述CHO细胞系为保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)且保藏号为CCTCCNO.C2016142的CHO-9618s细胞或其后代细胞。在某些优选的实施方案中，所述CHO细胞系不表达功能性的谷氨酰胺合成酶(GS)和岩藻糖基转移酶8(FUT8)。在某些优选的实施方案中，在所述CHO细胞系的基因组中，编码谷氨酰胺合成酶(GS)和岩藻糖基转移酶8(FUT8)的基因已被基因敲除。

在另一个方面，本发明提供了一种经改造的CHO细胞系，其为保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，并且保藏号为CCTCC NO.C2016143的CHO-NIDVD细胞或其后代细胞。

本申请的细胞系CHO-NIDVD及其后代细胞不仅能够在无血清、悬浮培养的条件下稳定且高密度地生长，而且能够用于快速、高效地构建以高水平稳定表达目的蛋白(例如抗体)的工程化细胞系。例如，当使用CHO-NIDVD作为宿主细胞来构建稳定表达目的蛋白的工程细胞系时，不仅构建工程细胞系的效率得到显著提高，而且所构建的工程细胞系的目的蛋白表达水平也得到显著提高。因此，在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系还包含编码目的蛋白的核酸分子。在某些优选的实施方案中，所述目的蛋白为抗体。

在某些优选的实施方案中，所述核酸分子游离于所述经改造的CHO细胞系的基因组之外(即，未整合到所述经改造的CHO细胞系的基因组中)。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含于游离的表达载体(例如质粒)中。在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系能够瞬时表达所述目的蛋白。在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系用于瞬时表达目的蛋白。

在另外一些优选的实施方案中，所述核酸分子被整合到所述经改造的CHO细胞系的基因组中。在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系能够稳定表达所述目的蛋白。在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系能够稳定表达所述目的蛋白至少10代，至少20代，至少30代，至少40代，至少50代，至少60代，至少80代，或至少100代。在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系用于稳定表达目的蛋白。

本申请的细胞系CHO-NIDVD及其后代细胞不能表达功能性的谷氨酰胺合成酶(GS)，具有谷氨酰胺依赖性。因此，在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系在含有谷氨酰胺的培养基中进行培养。然而，在另外一些优选的实施方案中，将所述经改造的CHO细胞系培养在不含有谷氨酰胺的培养基中，以建立稳定表达目的蛋白的工程化细胞。

此外，本申请的细胞系CHO-NIDVD及其后代细胞不能表达功能性的岩藻糖基转移酶8，其细胞表面实质上不存在岩藻糖基。因此，在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系的细胞表面实质上不存在岩藻糖基。在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系用于表达目的蛋白(例如抗体)，并且所述目的蛋白(例如抗体)实质上不具有岩藻糖基修饰。

在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系用于分批培养或流加培养。在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系能够以至少10pg/cell/day，至少20pg/cell/day，至少30pg/cell/day，至少40pg/cell/day，至少50pg/cell/day，至少60pg/cell/day，至少70pg/cell/day，或约75pg/cell/day的比生成速率生产目的蛋白(例如抗体)。在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系能够以至少100mg/L，至少200mg/L，至少300mg/L，至少400mg/L，至少500mg/L，至少600mg/L，至少800mg/L，至少1000mg/L，至少1500mg/L或约2000mg/L的产量生产目的蛋白(例如抗体)。

在另一方面，本发明提供了一种表达目的蛋白的方法，其包括，(1)将编码所述目的蛋白的核酸分子导入本发明的经改造的CHO细胞系中，以及，(2)在适合表达目的蛋白的条件下培养所述经改造的CHO细胞系，以在所述经改造的CHO细胞系中表达所述目的蛋白。在某些优选的实施方案中，所述目的蛋白为抗体。

在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系为保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，并且保藏号为CCTCC NO.C2016143的CHO-NIDVD细胞或其后代细胞。

可使用各种方式来将编码所述目的蛋白的核酸分子导入所述经改造的CHO细胞系中。例如，可通过使用转染试剂(例如脂质转染试剂)，或者可通过使用电转染的方式，将编码所述目的蛋白的核酸导入所述经改造的CHO细胞系中。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子包含于表达载体(例如质粒)中。

在某些优选的实施方案中，所述核酸分子在导入所述经改造的CHO细胞系后，游离于所述经改造的CHO细胞系的基因组之外(即，未整合到所述经改造的CHO细胞系的基因组中)。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子在导入所述经改造的CHO细胞系后，被整合到所述经改造的CHO细胞系的基因组中。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，所述经改造的CHO细胞系以瞬时表达的方式表达所述目的蛋白。在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，所述经改造的CHO细胞系以稳定表达的方式表达所述目的蛋白。在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系稳定表达所述目的蛋白至少10代，至少20代，至少30代，至少40代，至少50代，至少60代，至少80代，或至少100代。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，在含有谷氨酰胺的培养基中培养所述经改造的CHO细胞系。在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，在不含有谷氨酰胺的培养基中培养所述经改造的CHO细胞系。在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，以分批培养的方式来培养所述经改造的CHO细胞系。在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，以流加培养的方式来培养所述经改造的CHO细胞系。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，所述经改造的CHO细胞系以至少10pg/cell/day，至少20pg/cell/day，至少30pg/cell/day，至少40pg/cell/day，至少50pg/cell/day，至少60pg/cell/day，至少70pg/cell/day，或约75pg/cell/day的比生成速率生产目的蛋白(例如抗体)。在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，所述经改造的CHO细胞系以至少100mg/L，至少200mg/L，至少300mg/L，至少400mg/L，至少500mg/L，至少600mg/L，至少800mg/L，至少1000mg/L，至少1500mg/L或约2000mg/L的产量生产目的蛋白(例如抗体)。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，所述经改造的CHO细胞系表达的目的蛋白(例如抗体)实质上不具有岩藻糖基修饰。

在另一方面，本发明提供了如上所述的经改造的CHO细胞系用于表达目的蛋白的用途。在另一方面，本发明提供了如上所述的经改造的CHO细胞系用于制备工程化细胞的用途，所述工程化细胞用于表达目的蛋白。在某些优选的实施方案中，所述目的蛋白为抗体。在某些优选的实施方案中，所述经改造的CHO细胞系为保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，并且保藏号为CCTCC NO.C2016143的CHO-NIDVD细胞或其后代细胞。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的CHO-9618s和CHO-NIDVD细胞具有以下有益效果：

(1)CHO-9618s细胞具有高密度生长的特性(其最高活细胞密度可达到2.5×10⁷个细胞/ml)。

(2)当CHO-NIDVD细胞用作宿主细胞表达抗体时，能够显著提高抗体的ADCC和ADCP效应，从而可以提高抗体的功效。

(3)当使用CHO-NIDVD细胞来构建工程化细胞时，可以显著提高构建以高水平稳定表达目的蛋白(例如抗体)的细胞群/细胞株(例如，产量大于10mg/L或大于20mg/L的细胞群)的效率，且更易于获得具有高目的蛋白产量的工程化细胞。

(4)当使用CHO-NIDVD细胞来构建工程化细胞时，所获得的阳性细胞群的目的蛋白产量(中位数和平均值)显著更高。例如，在流加培养的条件下，所获得的阳性细胞群/细胞株的抗体比生成速率基本上都大于20pg/cell/day，甚至高达75pg/cell/day；且抗体产量基本上都大于200mg/L，甚至高达2.0g/L。这可显著降低细胞株构建过程中的筛选通量，且易于实现目的蛋白的高水平表达。

(5)CHO-NIDVD细胞能够对复杂的多亚基蛋白(例如抗体)的多个亚基进行准确的组装，所表达的蛋白产物均一、完整。

因此，本发明的CHO-NIDVD以及基于其构建的工程化细胞特别适合用于目的蛋白的大规模工业化生产。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了不同培养条件下的CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618)的形态；其中，图1A，在补充有10％FBS的DMEM/F12培养基中贴壁生长的CHO-K1细胞；图1B，在SFM IV培养基中悬浮生长的初步驯化的CHO-K1细胞；图1C，在补充有25ug/ml的硫酸葡聚糖和1g/L的PF68的SFMIV培养基中悬浮生长的经驯化的CHO-K1细胞。

图2显示了所选择的15个细胞株在21天的培养期间的生长情况(活细胞密度，图2A和图2B)，以及这些细胞株各自的倍增时间(图2C)。

图3显示了所选择的12个细胞株在批次培养的前7天的生长情况(活细胞密度)。

图4显示了所选择的12个细胞株在流加培养过程中的生长情况(活细胞密度)。

图5显示了CHO K1-S-2在流加培养过程中达到的最高活细胞密度(高于2.5×10⁷个细胞/ml)。

图6显示了CHO-9618s瞬时表达外源蛋白的能力的评估结果；其中，图6A显示了表达绿色荧光蛋白(GFP)的CHO-9618s的荧光显微镜观察结果；图6B显示了表达人源化抗体Hu-E6F6的CHO-9618s的抗体产量(mg/L)。

图7显示了在搅拌式生物反应器(Sartorius)中培养的CHO-9618s在整个培养过程中的生长情况和代谢情况；其中，图7A，CHO-9618s的活细胞密度；图7B，CHO-9618s的细胞活率；图7C-7F，细胞培养上清中的葡萄糖(图7C)、铵离子(图7D)、谷氨酰胺(图7E)和乳酸(图7F)的浓度。

图8显示了CHO-NIDVD和CHO-9618s在不同培养条件下第0天和第7天的细胞密度。

图9显示了用FITC-Lectin染色的CHO-9618s和CHO-NIDVD的流式细胞术分析结果(图9A)和荧光显微镜观察结果(图9B)。

图10显示了，使用不同抗体对CHO-NIDVD细胞和CHO-9618s细胞的总蛋白进行Western Blot检测的结果。

图11显示了，CHO-NIDVD在补料批次培养过程中的生长情况(活细胞密度)。

图12显示了，分批培养的CHO-NIDVD细胞在整个培养过程中的生长情况和代谢情况；其中，图12A，CHO-NIDVD的活细胞密度；图12B-12F，细胞培养上清中的谷氨酸(图12B)、谷氨酰胺(图12C)、NH₄ ⁺(图12D)、葡萄糖(图12E)和乳酸(图12F)的浓度。

图13显示了表达绿色荧光蛋白(GFP)的CHO-NIDVD的荧光显微镜观察结果。

图14显示了，用于评估由CHO-9618s或CHO-NIDVD表达的抗体与CD16a(图14A)或CD16b(图14B)的结合能力的ELISA测定的实验结果。

图15显示了在CHO-NIDVD和CHO-9618表达的抗体Herceptin存在下，PBMC对SKOV3的杀伤活性。

图16显示了在CHO-NIDVD和CHO-9618表达的162抗体存在下，外周血细胞对HBsAg的吞噬活性。

图17A显示了，基于CHO-NIDVD和CHO-9618s细胞构建的工程化细胞的抗体表达水平(mg/L)。

图17B显示了，基于多种细胞系构建的工程化细胞的抗体表达水平(mg/L)。

图18显示了，稳定表达抗体的细胞群在批次培养条件下的总体抗体产量(mg/L；图18A)和抗体比生成速率(pg/cell/day；图18B)，其中，抗体比生成速率是根据总体抗体产量和整个培养周期内活细胞密度的积分来计算的。

图19显示了，稳定表达抗体的细胞群在流加培养条件下的总体抗体产量(mg/L；图19A)和抗体比生成速率(pg/cell/day；图19B)，其中，抗体比生成速率是根据总体抗体产量和整个培养周期内活细胞密度的积分来计算的。

图20显示了，不同培养代次的稳定表达抗体160F1，37G1或145C2的细胞群在流加培养条件下的总体抗体产量(mg/L；图20A)和抗体比生成速率(pg/cell/day；图20B)，其中，抗体比生成速率是根据总体抗体产量和整个培养周期内活细胞密度的积分来计算的。

图21显示了，经纯化的抗体样品在经历还原型(图21A)和非还原型(图21B)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后的考马斯亮蓝染色结果，其中，各个泳道从左到右分别为：蛋白分子量标记、抗体58、134D3、145C2、37G1、133A8和160F1。

图22显示了，经纯化的样品58(图22A)、134D3(图22B)、145C2(图22C)、37G1(图22D)、133A8(图22E)和160F1(图22F)的SEC-HPLC分析结果。

序列信息

本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。

SEQ ID NO:	序列描述
		1	GS基因第5个外显子的核苷酸序列
2	FUT8基因第7个外显子的核苷酸序列
		3	SV40启动子+抗生素基因Zeocin的核苷酸序列
4	引物
		5	引物
6	引物
		7	引物
8	CHO-NIDVD细胞的GS-Exon5处的核苷酸序列
		9	CHO-NIDVD细胞的Fut8-Exon7处的核苷酸序列

SEQ ID NO:1

TGGGAATTCCAAATAGGACCCTGTGAAGGAATCCGCATGGGAGATCATCTCTGGGTGGCCCGTTTCATCTTGCATCGAGTATGTGAAGACTTTGGGGTAATAGCAACCTTTGACCCCAAGCCCATTCCTGGGAACTGGAATGGTGCAGGCTGCCATACCAACTTTAGCACCAAGGCCATGCGGGAGGAGAATGGTCTGAAG

SEQ ID NO:2

AGTCCATGTCAGACGCACTGACAAAGTGGGAACAGAAGCAGCCTTCCATCCCATTGAGGAATACATGGTACACGTTGAAGAACATTTTCAGCTTCTCGAACGCAGAATGAAAGTGGATAAAAAAAGAGTGTATCTGGCCACTGATGACCCTTCTTTGTTAAAGGAGGCAAAGACAAAGTA

SEQ ID NO:3

TAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGGAGCTAGCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGAGCGGCCGCCCCGACCTCGACCTCAGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGG

SEQ ID NO:4

AGTCCATGTCAGACGCACTG

SEQ ID NO:5

TGTTACTTAAGCCCCAGGC

SEQ ID NO:6

GATTGCTCTTGATTCTCCTTCAG

SEQ ID NO:7

GTGACAACTTTCCCATATCAC

SEQ ID NO:8

GATTGCTCTTGATTCTCCTTCAGGTCCGTATTACTGTGGTGTGGGCGCAGACAAAGCCTATGGCAGGGATATCGTGGAGGCTCACTACCGCGCCTGCTTGTATGCTGGGGTCAAGATTACAGGAACAAATGCTGAGGTCATGCCTGCCCAGGTAAATGGCACTATTCTGTTCCTTTTCCTCCCCTCTGAAGACTTGGCACATGGGGACTTTGGTTAACAAGGGTGATGACTTAAAAGTGGTTCAGGGTAGAGGTAAGTAGAACAAGCTAGGAGCTTGAGTTGGCCTGAACAGTTAGTTGGCCTTATTCTAAAGGTCAACATGTTCTTTCTAGTGAGCGAATGTGTGTCAGTTAGTAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGGAGCTAGCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGAGCGGCCGCCCCGACCTCGACCTCAGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGAGATCATCTTTATTCTCATGGGGTGGAAGGGCTTTGTGTTAGGGTTGGGAAAGTTGGACTTCTCACAAACTACATGCCATGCTCTTCGTGTTTGTCATAAGCCTATCGTTTTGTACCCGTTGGAGAAGTGACAGTACTCTAGGAATAGAATTACAGCTGTGATATGGGAAAGTTGTCAC

SEQ ID NO:9

AGTCCATGTCAGACGCACTGACAAAGTGGGAACAGAAGCAGCCTTCCATCCCATTGAGGAATACATGGTACACGTTGAAGAACATTTTCAGCTTCTCGAACGCAGAATGAAAGTGGATAAAAAAAGAGTGTATCTGGCCACTGATGACCCTTCTTTGTTAAAAGGAGGCAAAGACAAAGTAAGTTAGACCAACAAGTGGTTCTGTATGGGATTATCTCTTAGTTGAAGAAAATCCTTAATTCTGGGAACTTGTGGTTCTTGTTGCTAACTAATAGGTTCCAAAATCAAAGACTACATGTGCAAATATTAATCTAATCAAGTCATACCTTACTAGCTGTATCTGATGCAAATTAAGAAGTCTAAAATGAATTAGACTGCTGATTTGTGTAGCATCACTAGCAGTCATCATTCAACACAGTACCACACTTCTTAGTACCAAAATCTGTTTAACATACTAGAGTTTCCATAAATCAAATTTTGTAGCCTGGGGCTTAAGTAACAG

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及下列已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)进行保藏的生物材料：

中国仓鼠卵巢癌细胞CHO-9618s(在本文中简称为CHO-9618s)，其保藏号为CCTCCNO:C2016142，保藏时间为2016年08月08日；和

中国仓鼠卵巢癌细胞CHO-NIDVD(在本文中简称为CHO-NIDVD)，其保藏号为CCTCCNO:C2016143，保藏时间为2016年08月08日。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例1：CHO-9618s细胞株的筛选和表征

1.1.能够在无血清、悬浮条件下高密度生长的CHO-K1细胞株(CHO-9618s)的筛选

将从ATCC购得的CHO-K1细胞系(ATCC CRL-9618)贴壁培养于补充有10％FBS的DMEM/F12培养基(简称为DF12培养基)中，并选择处于对数生长期的CHO-K1细胞。通过显微镜来观察培养的细胞。结果显示，CHO-K1细胞呈柳叶状，贴壁生长良好(图1A)。

将培养基更换为1:1的DF12培养基和SFM IV培养基的混合物(FBS的终浓度为5％)，并继续静置培养细胞至少1周。随后，将培养基更换为1:4的DF12培养基和SFM IV培养基的混合物(FBS的终浓度为2％)，并继续静置培养细胞，直至细胞能够以24h左右的倍增时间稳定扩增至少1周。随后，通过类似的方案，继续降低培养基中的血清浓度，直至细胞能够稳定培养于血清浓度低于1％的培养基中。将贴壁生长于血清浓度低于1％的培养基中的细胞用Accutase Solution进行处理，并悬浮于0.5:9.5的DF12培养基和SFM IV培养基的混合物(FBS的终浓度为0.5％)中，制为单细胞悬液。将单细胞悬液接种至三角形摇瓶，并置于100rpm的CO₂培养摇床上进行悬浮培养。在细胞密度增加一倍以上后，对细胞进行传代，并继续悬浮培养。通过显微镜来观察培养的细胞。结果显示，经初步驯化的CHO-K1细胞呈球形，但出现了多细胞聚团现象(图1B)。向培养基中加入25ug/ml的硫酸葡聚糖和1g/L的PF68，继续悬浮培养细胞。经反复传代后，获得了能够稳定悬浮培养于无血清培养基SFMIV中的细胞库，其中，细胞的平均直径为15μm；对数生长期的倍增时间为24h±3h。该细胞库的显微镜检查结果示于图1C。结果显示，经驯化的CHO-K1细胞呈球形，且能够适应无血清悬浮培养，不再出现多细胞聚团现象。

采用有限稀释法将细胞库中的悬浮细胞梯度稀释至2.5个细胞/ml，然后以200μl/孔接种至96孔板中。运用常光显微拍照设备对微孔板进行全板拍照，记录下接种当天每个孔中接种的细胞数目。将接种细胞的96孔板置于37℃的CO₂培养箱中进行培养。培养3周后，选择接种当天接种细胞数目为1个细胞、且3周培养后只含有单个细胞团的孔，以确保孔中的细胞来源于同一个细胞。

将所选择的孔中的细胞以0.5×10⁶个细胞/ml接种于无血清培养基SFMIV中，进行连续培养(21天)。在此期间，每天检测细胞的密度，并且每隔3天，将细胞密度重新调整至0.5×10⁶个细胞/ml。图2显示了，所选择的15个孔中的细胞在21天的培养期间的细胞密度的变化情况(图2A和图2B)，以及这些细胞各自的倍增时间(图2C)。结果显示，所选择的细胞基本上都能稳定连续的生长，且其倍增时间基本上都在24h左右。

选择在连续培养中生长良好的12株亚克隆细胞株用于在SFMIV中进行批次培养(接种密度为0.5×10⁶个细胞/ml)。图3显示了，所选择的12个细胞株在批次培养的前7天的生长情况(活细胞密度)。结果显示，CHO K1-S-1，CHO K1-S-2和CHO K1-S-14这3个细胞株的最高活细胞密度可以达到7×10⁶个细胞/ml。

还将这12株亚克隆细胞株用于在SFMIV中进行流加培养，其中，接种密度为0.5×10⁶个细胞/ml，并且在培养的第3天、第6天和第9天给培养物添加补料，补料为Gibco公司的Feed C+3g/L葡萄糖，添加量分别为3％、6％和6％。图4显示了，所选择的12个细胞株在流加培养过程中的生长情况(活细胞密度)。结果显示，CHO K1-S-1，CHO K1-S-2，CHO K1-S-13和CHO K1-S-14这4个细胞株的最高活细胞密度可以达到1×10⁷个细胞/ml。

使用CD-forti培养基作为基础培养基，对上面鉴定到的生长表现最佳的4个细胞株进行流加培养，并分别跟踪培养过程的活细胞密度变化以及细胞直径的变化。结果显示，CHO K1-S-2在流加培养的第8天活细胞密度达到峰值，其最高活细胞密度可达到高于2.5×10⁷个细胞/ml(图5)，显著优于其他细胞株。另外，在培养过程中，还使用Countstar对细胞的直径进行测量。结果显示，CHO K1-S-2细胞株在培养过程中细胞直径一直保持低于15um。这一结果表明，该细胞株直径均匀且稳定，具有良好的开发潜能。将CHO K1-S-2细胞株命名为CHO-9618s，并用于后续实验。

1.2.CHO-9618s表达外源蛋白的能力的评估

使用PEI转染试剂，将编码绿色荧光蛋白的PTT5-GFP质粒转染入CHO-9618s中。24h后，运用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)在CHO-9618s中的表达情况。结果显示，CHO-9618s能够高效地表达绿色荧光蛋白(GFP)，显示出绿色荧光(图6A)。

另外，还将编码人源化抗体Hu-E6F6的质粒PTT5-huE6F6-K和PTT5-huE6F6-H共转染入CHO-9618s中，以观察抗体蛋白在细胞株CHO-9618s中的表达情况。在本实验中，使用购自Gibco公司的CHOs作为对照细胞。转染7天后，用生化分析仪对表达上清中的抗体进行定量，结果如图6B所示。结果显示，CHO-9618s的瞬时表达水平基本与对照CHOs的表达水平相当。这表明CHO-9618s可以用于外源蛋白的表达。

1.3.CHO-9618s的生产放大潜能

将CHO-9618s以5×10⁵个细胞/ml的密度接种至搅拌式生物反应器(Sartorius)中，其中，搅拌速度设置为100rpm，前5天的培养温度设定为36.5℃，第6天后的培养温度设定为32℃。分别在培养的第3天、第6天、第8天和第10天添加补料，补料为Feed C+FM012(10g/L)，补料的体积分别为6％，10％，8％和6％。监测CHO-9618s细胞在培养过程中的生长情况，并使用生化分析仪对培养过程中的细胞培养上清中的谷氨酰胺、葡萄糖、铵离子和乳酸进行测定。结果示于图7中。图7显示了，在整个培养过程中，CHO-9618s在生物反应器中的活细胞密度(图7A)和细胞活率(图7B)，以及细胞培养上清中的葡萄糖(图7C)、铵离子(图7D)、谷氨酰胺(图7E)和乳酸(图7F)的浓度。结果显示，CHO-9618s在生物反应器中最高细胞密度可达1.3×10⁷个细胞/ml，并且在整个培养过程中，细胞活率可以维持在80％以上，且细胞具有正常的代谢情况。这些结果表明，CHO-9618s有潜力用于工业级搅拌式生物反应器中。

实施例2.CHO-NIDVD的构建和表征

在本实施例中，对细胞系CHO-9618s进行了改造，构建了新的细胞系CHO-NIDVD，其中，GS基因和FUT8基因已被敲除。

2.1.CHO-NIDVD细胞系的构建

简言之，根据Ran,F.A.et al.Genome engineering using the CRISPR-Cas9system.Nature protocols 8(143):2281-2308(2013)描述的基因编辑方法对细胞系CHO-9618s进行改造；其中，用抗生素基因Zeocin(Zeo)替换GS基因的第5个外显子，以实现对GS基因的敲除；并且，在FUT8基因的第7个外显子中引入移码突变(即，插入一个碱基)，以实现对FUT8基因的敲除。GS基因(NCBI登录号：NW_003613921.1；第1430036-1435423位)的第5个外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。FUT8基因(NCBI登录号：NW_003613860.1；第6088480-730818位)的第7个外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。处于SV40启动子控制下的抗生素基因Zeocin的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。通过上述改造，获得了一株新的细胞系，命名为CHO-NIDVD。

2.2.CHO-NIDVD细胞系的GS和Fut8功能的评估

分别在含有谷氨酰胺(LG+)、不含有谷氨酰胺(LG-)、以及含有不同浓度的MSX(甲硫氨酸砜亚胺，一种GS抑制剂)且不含有谷氨酰胺(LG-)的培养基中培养CHO-NIDVD和CHO-9618s(作为对照)。以1×10⁵个细胞/ml接种细胞，培养7天。在第0天和第7天检测细胞密度。结果示于图8中。图8显示了CHO-NIDVD和CHO-9618s在不同培养条件下第0天和第7天的细胞密度。结果显示，CHO-9618s在含有谷氨酰胺(LG+)或不含有谷氨酰胺(LG-)的培养基中均能正常生长，并且在不存在谷氨酰胺(LG-)的条件下，随着MSX浓度的升高，CHO-9618s细胞的生长受到了抑制。这表明，CHO-9618s细胞表达功能性的GS基因。相比之下，CHO-NIDVD仅能在含有谷氨酰胺(LG+)的培养基中正常生长(第7天的细胞密度可达3.5×10⁶个细胞/ml)；而在不存在谷氨酰胺(LG-)的条件下，CHO-9618s细胞的生长几乎完全停滞。这表明，CHO-NIDVD细胞为LG依赖性细胞，其内源GS基因已被敲除。

另外，用标记了FITC的凝集素(FITC-Lectin)对CHO-9618s细胞以及CHO-NIDVD细胞进行细胞表面染色。随后，运用流式细胞术和荧光显微镜对细胞进行分析，结果如图9所示。图9显示了用FITC-Lectin染色的CHO-9618s和CHO-NIDVD的流式细胞术分析结果(图9A)和荧光显微镜观察结果(图9B)。结果显示，CHO-9618s能够与FITC-Lectin结合，并因此显示出荧光；而CHO-NIDVD则基本上不与FITC-Lectin结合，并因此基本上检测不到荧光。这表明，CHO-9618s能够正常表达功能性的Fut8基因，其细胞表面存在岩藻糖基修饰的蛋白；而CHO-NIDVD的内源Fut8基因被敲除，其细胞表面基本上不存在岩藻糖基修饰的蛋白。

2.3.CHO-NIDVD的分子生物学鉴定

在GS基因的Exon5和Fut8基因的Exon7附近分别设计鉴定引物，如表2所示。

表2：用于鉴定GS-Exon5和Fut8-Exon7处的核苷酸序列的引物

使用上述两对引物分别对CHO-NIDVD细胞的基因组进行PCR扩增，并对所获得的PCR产物进行测序。测序结果显示，GS-Exon5处的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，Fut8-Exon7处的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

通过将测序结果与已知的序列进行比对可知，CHO-NIDVD基因组GS-Exon5处的核苷酸序列已被替换为抗生素基因Zeocin的序列，并且Fut8基因的第7个外显子中被插入了一个碱基“A”，发生了移码突变。

另外，还使用抗GS抗体、抗-Fut8抗体和抗β-actin抗体对提取自CHO-NIDVD细胞和CHO-9618s细胞的总蛋白进行检测。图10显示了，使用不同抗体对CHO-NIDVD细胞和CHO-9618s细胞的总蛋白进行Western Blot检测的结果。结果显示，CHO-9618s能够表达GS蛋白和FUT蛋白，而CHO-NIDVD细胞内已经无GS蛋白和Fut8蛋白的表达。

2.4.CHO-NIDVD的生长潜能的评估

将CHO-NIDVD细胞以5×10⁵个细胞/ml的密度接种至补充有8mM LG的基础培养基中，并在37℃、悬浮条件下进行补料批次培养。分别于接种后第2天，第4天，第6天，第8天，第10天和第12天添加3mM LG；于接种后的第3天，第5天，第7天，第9天和第11天添加5％的补料(Feed C+15g/L FM012)。在接种后的第6天，将培养温度降低为32℃。图11显示了CHO-NIDVD在补料批次培养过程中的生长情况(活细胞密度)。结果显示，CHO-NIDVD细胞在培养的第6天-第9天达到1×10⁷个细胞/ml以上，这表明CHO-NIDVD具有高密度生长的潜能。

2.5.CHO-NIDVD细胞的代谢特征

将处于对数生长期的CHO-NIDVD细胞以5×10⁵个细胞/ml的密度接种至培养基(SFM IV+8mM LG+1g/L PF68+25mg/L硫酸葡聚糖)中，并于37℃培养6天。为降低实验误差，本实验设置三个平行对照。每天运用细胞计数仪测量培养物的活细胞浓度(图12A)，且运用Cedex生化分析仪测定培养上清中的谷氨酸(图12B)、谷氨酰胺(图12C)、NH₄ ⁺(图12D)、葡萄糖(图12E)和乳酸(图12F)的浓度。结果显示，CHO-NIDVD能够在分批培养过程中快速增殖，并且在培养期间，谷氨酸持续累积；谷氨酰胺于培养的第4天基本耗尽；铵离子持续累积至培养第4天(由于谷氨酰胺耗尽，第4天后培养基中的铵离子浓度不再增加)；葡萄糖持续消耗；乳酸持续累积。但整个培养周期中，铵离子的水平低于10mM，乳酸的水平低于40mM。这些结果表明，CHO-NIDVD细胞的代谢特征足以支持其在工业水平中的运用。

实施例3.外源蛋白在CHO-NIDVD中的瞬时表达

将编码绿色荧光蛋白的表达质粒PTT5-GFP转染入对数生长期的CHO-NIDVD细胞中。48小时后，在荧光显微镜下进行观察和拍照。观察结果如图13所示。结果显示，CHO-NIDVD能够用于表达外源蛋白(例如绿色荧光蛋白)。

实施例4.抗体在CHO-NIDVD中的瞬时表达

将分别编码抗Her2人源化抗体Herceptin的重链和轻链的表达质粒PTT5-Herceptin H和PTT5-herceptin K，按照1:1的质量比共转染入对数生长期的CHO-NIDVD细胞中，并于32℃条件下，培养细胞7天。培养结束后，收集细胞培养物的培养上清，并用Protein A亲和层析法纯化培养上清中的抗体。还使用类似的方法，在CHO-NIDVD细胞中表达乙肝抗体162(实验室自制)，并从培养上清中回收和纯化CHO-NIDVD表达的抗体。

另外，还使用类似的方法，在CHO-9618s细胞中表达人源化抗体Herceptin和乙肝抗体162，用作对照。

实施例5.由CHO-NIDVD表达的抗体的评估

5.1.抗体与FCGR的结合能力的评估

CD16a是NK细胞表面的Fc受体。抗体可通过与CD16a结合来激活NK细胞，并促使NK细胞攻击靶细胞。CD16b是吞噬细胞(例如中性粒细胞)表面的Fc受体。抗体可通过与CD16b结合来激活吞噬细胞的吞噬作用。因此，使用CD16a和CD16b蛋白来评估抗体与FCGR的结合能力。

简言之，用100ng/孔的CD16a或CD16b蛋白包被化学发光微孔板。将一抗(待测抗体)连续倍比稀释11个梯度(以0.1μg/μl为起始浓度)。然后，将经稀释的抗体添加到微孔板中并温育1小时。温育结束后，洗涤各个孔，并添加二抗(标记HRP的抗-人IgG羊多抗)，温育30分钟。温育结束后，再次洗涤各个孔，并添加HRP发光底物和发光液，进行发光反应。随后，使用板式化学发光检测仪(Berthold DS，Orion II)对各个孔的化学发光进行检测。在本实验中，针对待测抗体的每个稀释度，设置三个平行重复实验，以降低系统误差。实验结果(三个平行重复实验的平均值)示于图14中。

图14显示了用于评估由CHO-9618s或CHO-NIDVD表达的抗体与CD16a(图14A)或CD16b(图14B)的结合能力的ELISA测定的实验结果。结果显示，由CHO-NIDVD细胞表达的两种抗体(Herceptin和162抗体)与两种Fc受体(CD16a和CD16b)的结合活性均显著高于由CHO-9618s表达的抗体。与CHO-9618s表达的抗体相比，由CHO-NIDVD表达的抗体与CD16a的结合能力增强了约4倍(图14A)，并且与CD16b的结合能力增强了约6倍(图14B)。CHO-NIDVD增强了抗体与FCGR的结合能力。

5.2.Herceptin的ADCC效应的评估

采集健康人的外周血，并用密度梯度离心法分离人外周血单核细胞(PBMC)。使用补充有1％FBS的无酚红的MEM培养基，将获得的PBMC细胞的密度调整为5×10⁶个细胞/ml。在本实验中，使用SKOV3(其为Her2阳性的卵巢癌细胞)作为ADCC效应的靶细胞。

将对数生长期的SKOV3细胞消化为单细胞悬液，然后离心并收集细胞。随后，用补充有1％FBS的无酚红的MEM培养基将收集的SKOV3细胞的密度调整为1×10⁵个细胞/ml，并按照50μL/孔的体积铺入96孔板中。将CHO-NIDVD和CHO-9618来源的Herceptin分别用补充有1％FBS的无酚红的MEM培养基稀释至40μg/ml，并按1:10的比例进行连续稀释。将经稀释的抗体按照50μL/孔的体积加入接种了SKOV3的96孔板中；并于37℃，5％CO₂的培养箱中孵育1h。随后，向各个孔中添加PBMC细胞(50μL/孔)，混匀，并于37℃，5％CO₂的培养箱中继续孵育6h。

孵育后，将各个孔中的50μl上清转移至新的96孔微孔板中。然后，根据乳酸脱氢酶检测试剂盒(BEYOTIME，C0016)的说明书，对所述上清进行处理。随后，使用酶标仪检测各个孔中的上清样品的OD值(参比波长为630nm，检测波长为492nm)

在本实验中，共设置以下组别：最大释放组(使用细胞裂解液和靶细胞SKOV3)，最小释放组(仅使用靶细胞SKOV3)，背景对照组(使用靶细胞SKOV3和效应细胞PBMC)；实验组(使用靶细胞SKOV3、效应细胞PBMC和待测抗体)。

由待测抗体的ADCC活性所诱发的对靶细胞的杀伤作用通过下式进行计算：

细胞杀伤率％＝(OD实验组-OD背景对照组)/(OD最大释放组-OD最小释放组)×100。

另外，为了降低系统误差，每个实验条件设置三个平行重复。实验结果(三个平行重复实验的平均值)示于图15中。图15显示了在CHO-NIDVD和CHO-9618表达的抗体Herceptin存在下，PBMC对SKOV3的杀伤活性。结果显示，与CHO-9618s表达的Herceptin相比，由CHO-NIDVD表达的Herceptin具有更强的ADCC活性，其能够诱发更强的PBMC对SKOV3的杀伤作用。在达到相同的细胞毒性的情况下，由CHO-NIDVD表达的Herceptin的剂量仅为CHO-9618s表达的抗体的1/100。这些结果表明，CHO-NIDVD增强了抗体的ADCC活性。以CHO-NIDVD作为宿主表达的抗体(如Herceptin)的治疗效果更强；在达到相同的治疗效果时，抗体的使用剂量更低，毒副作用也更低。

5.3.乙肝抗体162的ADCP效应

将2000IU的乙肝表面抗原(HBsAg)分别与20mg/L的由CHO-9618s和CHO-NIDVD表达的162抗体混匀，并于37℃孵育1h。随后，加入健康人的外周血作为效应细胞；并于37℃再孵育6h。反应结束后，离心收集血清，并使用乙肝表面抗原检测试剂盒(万泰制药，YZB/国0346-2014)对血清中的HBsAg进行检测。

在本实验中，共设置3个组，即，对照组A：外周血+HBsAg；对照组B：外周血+待测抗体；测试组：外周血+HBsAg+待测抗体。同时，为了减少误差，本实验使用了三个健康人的外周血，并且，每个实验条件设置3个平行重复。

通过下式来计算待测抗体的ADCP活性：

ADCP％＝(对照组A-测试组-对照组B)/对照组A×100。

实验结果(三个平行重复实验的平均值)示于图16中。图16显示了在CHO-NIDVD和CHO-9618表达的162抗体存在下，外周血细胞对HBsAg的吞噬活性。结果显示，与CHO-9618s表达的162抗体相比，在CHO-NIDVD表达的162抗体存在下，来自三个供血者的全血(外周血细胞)对HBsAg的ADCP效应均显著更高(提高了约75％；P＝0.035；图16A)。虽然外周血细胞的ADCP活性可能因个体的免疫状态不同而发生变化，但是，在相同条件下，CHO-NIDVD表达的162抗体所介导的ADCP活性均显著强于CHO-9618s表达的162抗体(图16B)。这些结果表明，由CHO-NIDVD表达的162抗体具有更强的ADCP活性，其能够诱发更强的外周血细胞对HBsAg的吞噬活性。CHO-NIDVD增强了抗体的ADCP活性。

实施例6：外源蛋白在CHO-NIDVD中的稳定表达

在本实施例中，以多种抗体为例，构建了能够稳定表达外源蛋白的CHO-NIDVD细胞系。

6.1.一般方案

为了在CHO-NIDVD细胞系中稳定表达抗体，构建了表达质粒PGS-2ORF-Ab，其含有处于PGK启动子控制下的编码GS蛋白的序列，以及各自处于CMV启动子控制下的编码抗体的重链和轻链的核苷酸序列。随后，以CHO-NIDVD作为宿主细胞，以PGS-2ORF-Ab作为表达质粒，构建用于稳定表达抗体的细胞株。

简言之，运用BTX电转仪，将线性化的PGS-2ORF-Ab质粒电转染入CHO-NIDVD细胞中。48h后，将细胞转移至添加有25μM MSX、且不含有LG的培养基中，并按照5000个细胞/孔的密度铺到96孔板中。培养21天后，用Elisa法对各个孔中的上清进行检测，以确定孔中的细胞是否表达目的抗体。对检测结果为阳性的孔中的细胞(每个孔的细胞即为一个细胞群)进行扩增培养，从96孔板扩大至24孔板，6孔板，乃至摇瓶。随后，对各个细胞群的目的抗体的产量进行评价，从中筛选能够稳定表达抗体的细胞群。

6.2.构建稳定表达抗体的细胞株的效率的评估

利用6.1中描述的方法，以CHO-NIDVD细胞和CHO-9618s细胞为宿主细胞，构建稳定表达抗体(以乙肝抗体162为例)的细胞株。简言之，将等量的编码抗体的质粒分别转染入5×10⁶个CHO-NIDVD和CHO-9618s细胞；转染48h后，将细胞转移至添加有25μM MSX、且不含有LG的培养基中，并按照3000个细胞/孔的密度铺到5块96孔板中，进行培养。培养21天后，用Elisa法对各个孔中的上清进行定量检测，以确定孔中的细胞是否表达目的抗体，以及目的抗体的表达水平。实验结果如图17A所示。图17A显示了，基于CHO-NIDVD和CHO-9618s细胞构建的工程化细胞的抗体表达水平(mg/L)。结果显示，当使用CHO-NIDVD作为宿主细胞时，在5块96孔板(480个细胞群)中，共鉴定到了62个阳性细胞群。这些阳性细胞群的平均抗体表达水平为约21.0mg/L，中位抗体表达水平为约9.13mg/L；并且，其中，超过50％的细胞群的抗体产量大于10mg/L，约25％的细胞群的抗体产量大于20mg/L，最高的抗体产量可达95mg/L。相比之下，当使用CHO-9618s作为宿主细胞时，在5块96孔板(480个细胞群)中，共鉴定到了20个阳性细胞群。这些阳性细胞群的平均抗体表达水平为约1.08mg/L，中位抗体表达水平为约0.352mg/L；并且，其中，绝大多数细胞群的抗体产量极低(低于1mg/L)，最高的抗体产量只有3mg/L。这些结果表明，当使用CHO-NIDVD来构建稳定表达外源蛋白(例如抗体)的细胞群/细胞株时，获得阳性细胞群(特别是具有高外源蛋白产量的阳性细胞群)的效率大大提高，并且所获得的阳性细胞群的外源蛋白(例如抗体)产量也显著得到提高。

为了验证CHO-NIDVD的上述优点是否是独特的，还使用了多个不同的细胞系来重复上述实验。简言之，使用CHO-9618s作为基础细胞，构建了另外10株GS基因和FUT8基因被敲除的细胞系，包括：CHO-gs-/fut--1、CHO-gs-/fut--12、CHO-gs-/fut--X、CHO-gs-/fut--8C4、CHO-gs-/fut--VI、CHO-gs-/fut--9C1、CHO-gs-/fut--32C1、CHO-gs-/fut--71C1、CHO-gs-/fut--1E1、CHO-gs-/fut--8a。这些细胞系均在GS基因和FUT8基因中包含突变，从而不能表达功能性GS蛋白和FUT8蛋白；但是它们所包含的GS基因和FUT8基因的突变各不相同。同时，还选择了另外2株GS基因和FUT8基因未被敲除的CHO细胞系：CHOs和CHO-K1-61，用作对照。使用这12株细胞系重复上述实验。实验结果概述于图17B和表3中。图17B显示了，基于多种细胞系构建的工程化细胞的抗体表达水平(mg/L)。表3概述了CHO-NIDVD与其他细胞系用于构建稳定表达外源蛋白的工程化细胞的效率的比较。

表3.

*：与CHO-NIDVD相比较的产量分布p值

结果显示，当使用CHO-NIDVD作为宿主细胞来构建稳定表达外源蛋白的工程化细胞时，获得具有高外源蛋白产量的阳性细胞群(例如，产量大于10mg/L或大于20mg/L的细胞群)的效率显著高于其他宿主细胞；并且所获得的阳性细胞群的外源蛋白产量(中位数和平均值)也显著高于基于其他宿主细胞构建的阳性细胞群。

这些结果表明，CHO-NIDVD能够显著提高构建稳定表达外源蛋白(例如抗体)的细胞群/细胞株的效率，且特别适合用于构建具有高外源蛋白产量的阳性细胞群。这一有利效果是CHO-NIDVD独有的。

6.3.稳定表达外源蛋白的细胞群的产量评估

利用6.1中描述的方法，以CHO-NIDVD细胞为宿主细胞，构建稳定表达抗体7C11、23H3、26E5、37G1、111C11、130B3、131G11、133A8、134D3、138C6、139G2、144C8、145C2、147F6、150F3、155F3、160F1、161C7、175C3或259F10(这些抗体均为本实验室自制)的细胞群。

将所获得的稳定表达抗体的细胞群分别进行批次培养。简言之，以5×10⁵个细胞/ml的密度，将各个细胞群分别接种至不含LG的培养基中，并在37℃下培养7天。培养期间，每天记录细胞密度。培养结束后，用生化分析仪Cedex对培养上清中的抗体水平进行测定。实验结果如图18所示。图18显示了，稳定表达抗体的细胞群在批次培养条件下的总体抗体产量(mg/L；图18A)和抗体比生成速率(pg/cell/day；图18B)，其中，抗体比生成速率是根据总体抗体产量和整个培养周期内活细胞密度的积分来计算的。结果显示，在批次培养过程中，各个细胞群的抗体比生成速率都大于20pg/cell/day，且最高可达75pg/cell/day；总体抗体产量均大于100mg/L，且最高可达780mg/L。这些结果表明，所获得的各个细胞群的产能极高，适合于工业化应用。另外，需要指出的是，通过工艺流程的优化，这些细胞群的抗体产量还能进一步提高。

另外，还将所获得的稳定表达抗体的细胞群分别进行流加培养。简言之，以5×10⁵个细胞/ml的密度，将各个细胞群分别接种至不含LG的培养基中，并培养14天，其中，第1-6天在37℃下培养，且第7-14天在32℃下培养；并且，分别在培养的第3天，第5天，第7天，第9天以及第11天添加补料。培养期间，每天记录细胞密度。培养结束后，用生化分析仪Cedex对培养上清中的抗体水平进行测定。实验结果如图19所示。图19显示了，稳定表达抗体的细胞群在流加培养条件下的总体抗体产量(mg/L；图19A)和抗体比生成速率(pg/cell/day；图19B)，其中，抗体比生成速率是根据总体抗体产量和整个培养周期内活细胞密度的积分来计算的。结果显示，在批次培养过程中，各个细胞群的抗体比生成速率都大于20pg/cell/day，且最高可达75pg/cell/day；总体抗体产量均大于200mg/L，且部分细胞群的抗体产量可达1.0g/L-2.0g/L。这些结果表明，所获得的各个细胞群的产能极高，适合于工业化应用。另外，需要指出的是，通过工艺流程的优化，这些细胞群的抗体产量还能进一步提高。

6.3.稳定表达外源蛋白的细胞群的表达稳定性

随机挑选3个细胞群(分别表达抗体160F1，37G1和145C2)进行长期培养，并且在不同的培养代次冻存3个细胞群的部分细胞。针对这3个细胞群，分别取第0代，第14代，第28代，第42代，第56代以及第63代的细胞进行复苏。培养5天后，以5×10⁵个细胞/ml的密度，将复苏的细胞分别接种至不含LG的培养基中进行流加培养(共培养14天)，其中，第1-6天在37℃下培养，且第7-14天在32℃下培养；并且，分别在培养的第3天，第5天，第7天，第9天以及第11天添加补料。培养期间，每天记录细胞密度。培养结束后，用生化分析仪Cedex对培养上清中的抗体水平进行测定。实验结果如图20所示。图20显示了，不同培养代次的稳定表达抗体160F1，37G1或145C2的细胞群在流加培养条件下的总体抗体产量(mg/L；图20A)和抗体比生成速率(pg/cell/day；图20B)，其中，抗体比生成速率是根据总体抗体产量和整个培养周期内活细胞密度的积分来计算的。结果显示，对于所选择的这三个细胞群而言，在长达63个代次的培养过程中，细胞的抗体产量和抗体比生产速率基本保持稳定。这些结果表明，基于CHO-NIDVD构建的工程细胞系具有长期的表达稳定性，能够支持至少2000L发酵规模的种子细胞扩增和蛋白生产表达。

6.4.由细胞群稳定表达的外源蛋白的纯化与质量分析

利用protein A来纯化表达抗体58、134D3、145C2、37G1、133A8和160F1的细胞群的培养上清中的抗体。

对纯化后的样品进行还原型和非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，其中，还原型SDS-PAGE使用12％的聚丙烯酰胺凝胶，非还原型SDS-PAGE使用10％的聚丙烯酰胺凝胶，且每个样品的上样量均为10μg。对于还原型SDS-PAGE，在上样之前，向待测样品中加入含有β-巯基乙醇的上样缓冲液，并将样品置于沸水浴中孵育10分钟，以样品中的抗体充分还原。对于非还原型SDS-PAGE，在上样之前，向待测样品中加入不含还原剂的上样缓冲液。电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝染色2小时，随后用KCl水溶液脱色过夜。实验结果如图21所示。图21显示了，经纯化的抗体样品在经历还原型(图21A)和非还原型(图21B)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后的考马斯亮蓝染色结果，其中，各个泳道从左到右分别为：蛋白分子量标记、抗体58、134D3、145C2、37G1、133A8和160F1。结果显示，各个经纯化的抗体在非还原型凝胶中均显现出150KD左右的单条完整抗体条带，而在还原型凝胶中均显现出50KD左右的重链条带和25KD左右的轻链条带，并且无其他杂质条带。这些结果表明，经纯化的抗体样品中均包含均一、完整的抗体，而不包含其他杂质，且不包含抗体的聚合形式、降解形式及其他不正常的组装形式。

另外，还对纯化后的抗体样品进行SEC-HPLC分析。实验结果如图22所示。图22显示了，经纯化的抗体样品58(图22A)、134D3(图22B)、145C2(图22C)、37G1(图22D)、133A8(图22E)和160F1(图22F)样品的SEC-HPLC分析结果。结果显示，对于各个经纯化的抗体样品，均只能检测到单个峰，且出峰时间一致。该结果与还原型SDS-PAGE后的考马斯亮蓝染色结果一致，这进一步说明经纯化的抗体样品中均包含均一、完整的抗体，而不包含其他杂质。

此外，对protein A纯化前后的样品中的抗体含量进行测定，并计算得率。实验结果如表4所示。表4的结果显示，对于这6种抗体蛋白，其纯化得率均在90％以上。

表4.纯化前后的样品中的抗体含量

综上，CHO-9618s细胞具有高密度生长的特性；CHO-NIDVD细胞用作宿主表达抗体时，能够显著提高抗体的ADCC和ADCP效应，从而可以提高抗体的功效；并且，当使用CHO-NIDVD细胞来构建工程化细胞时，可以显著提高构建稳定表达外源蛋白(例如抗体)的细胞群/细胞株的效率，且更易于获得具有高外源蛋白产量的工程化细胞(例如，在流加培养的条件下，所获得的阳性细胞群/细胞株的抗体比生成速率基本上都大于20pg/cell/day，甚至高达75pg/cell/day；且抗体产量基本上都大于200mg/L，甚至高达2.0g/L；这可显著降低细胞株构建过程中的筛选通量，且易于实现外源蛋白的高水平表达)。此外，CHO-NIDVD细胞能够对复杂的多亚基蛋白(例如抗体)的多个亚基进行准确的组装，所表达的蛋白产物均一、完整。因此，CHO-NIDVD以及基于其构建的工程化细胞特别适合用于外源蛋白的大规模工业化生产。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 厦门大学

养生堂有限公司

<120> 一种改造的CHO细胞及其用途

<130> IDC160147

<150> CN 201610697549.X

<151> 2016-08-22

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GS基因第5个外显子的核苷酸序列

<400> 1

atggaatgga cctgggtttt tctcttcctg atggcactgg tcacaggggt caattcagag 60

gttcagctgc aacagtctgg ggcagagctt gtgaagccag gggcctcagt caagatgtcc 120

tgctgggaat tccaaatagg accctgtgaa ggaatccgca tgggagatca tctctgggtg 180

gcccgtttca tcttgcatcg agtatgtgaa gactttgggg taatagcaac ctttgacccc 240

aagcccattc ctgggaactg gaatggtgca ggctgccata ccaactttag caccaaggcc 300

atgcgggagg agaatggtct gaag 324

<210> 2

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FUT8基因第7个外显子的核苷酸序列

<400> 2

agtccatgtc agacgcactg acaaagtggg aacagaagca gccttccatc ccattgagga 60

atacatggta cacgttgaag aacattttca gcttctcgaa cgcagaatga aagtggataa 120

aaaaagagtg tatctggcca ctgatgaccc ttctttgtta aaggaggcaa agacaaagta 180

<210> 3

<211> 699

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SV40启动子+抗生素基因Zeocin的核苷酸序列

<400> 3

tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 60

cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg 120

agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc 180

cggggagcta gcatggccaa gttgaccagt gccgttccgg tgctcaccgc gcgcgacgtc 240

gccggagcgg tcgagttctg gaccgaccgg ctcgggttct cccgggactt cgtggaggac 300

gacttcgccg gtgtggtccg ggacgacgtg accctgttca tcagcgcggt ccaggaccag 360

gtggtgccgg acaacaccct ggcctgggtg tgggtgcgcg gcctggacga gctgtacgcc 420

gagtggtcgg aggtcgtgtc cacgaacttc cgggacgcct ccgggccggc catgaccgag 480

atcggcgagc agccgtgggg gcgggagttc gccctgcgcg acccggccgg caactgcgtg 540

cacttcgtgg ccgaggagca ggactgagcg gccgccccga cctcgacctc aggctaataa 600

aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg 660

acatatggga gggcaaatca tttggtcgag atccctcgg 699

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

agtccatgtc agacgcactg 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

tgttacttaa gccccaggc 19

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

gattgctctt gattctcctt cag 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

gtgacaactt tcccatatca c 21

<210> 8

<211> 1286

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHO-NIDVD细胞的GS-Exon5处的核苷酸序列

<400> 8

gattgctctt gattctcctt caggtccgta ttactgtggt gtgggcgcag acaaagccta 60

tggcagggat atcgtggagg ctcactaccg cgcctgcttg tatgctgggg tcaagattac 120

aggaacaaat gctgaggtca tgcctgccca ggtaaatggc actattctgt tccttttcct 180

cccctctgaa gacttggcac atggggactt tggttaacaa gggtgatgac ttaaaagtgg 240

ttcagggtag aggtaagtag aacaagctag gagcttgagt tggcctgaac agttagttgg 300

ccttattcta aaggtcaaca tgttctttct agtgagcgaa tgtgtgtcag ttagtagtcc 360

cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc 420

atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat 480

tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggga 540

gctagcatgg ccaagttgac cagtgccgtt ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga 600

gcggtcgagt tctggaccga ccggctcggg ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc 660

gccggtgtgg tccgggacga cgtgaccctg ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg 720

ccggacaaca ccctggcctg ggtgtgggtg cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg 780

tcggaggtcg tgtccacgaa cttccgggac gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc 840

gagcagccgt gggggcggga gttcgccctg cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc 900

gtggccgagg agcaggactg agcggccgcc ccgacctcga cctcaggcta ataaaggaaa 960

tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat 1020

gggagggcaa atcatttggt cgagatccct cgggagtcag tgagcgagga agcgtacatt 1080

tatattggct catgtccaat atgaccgaga tcatctttat tctcatgggg tggaagggct 1140

ttgtgttagg gttgggaaag ttggacttct cacaaactac atgccatgct cttcgtgttt 1200

gtcataagcc tatcgttttg tacccgttgg agaagtgaca gtactctagg aatagaatta 1260

cagctgtgat atgggaaagt tgtcac 1286

<210> 9

<211> 502

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHO-NIDVD细胞的Fut8-Exon7处的核苷酸序列

<400> 9

agtccatgtc agacgcactg acaaagtggg aacagaagca gccttccatc ccattgagga 60

atacatggta cacgttgaag aacattttca gcttctcgaa cgcagaatga aagtggataa 120

aaaaagagtg tatctggcca ctgatgaccc ttctttgtta aaaggaggca aagacaaagt 180

aagttagacc aacaagtggt tctgtatggg attatctctt agttgaagaa aatccttaat 240

tctgggaact tgtggttctt gttgctaact aataggttcc aaaatcaaag actacatgtg 300

caaatattaa tctaatcaag tcatacctta ctagctgtat ctgatgcaaa ttaagaagtc 360

taaaatgaat tagactgctg atttgtgtag catcactagc agtcatcatt caacacagta 420

ccacacttct tagtaccaaa atctgtttaa catactagag tttccataaa tcaaattttg 480

tagcctgggg cttaagtaac ag 502

Claims (9)

1.一种CHO细胞系，其为保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，并且保藏号为CCTCCNO.C2016142的CHO-9618s细胞或其后代细胞。

2.权利要求1的CHO细胞系，其经改造而不表达功能性的谷氨酰胺合成酶(GS)和岩藻糖基转移酶8(FUT8)；例如，在所述CHO细胞系的基因组中，编码谷氨酰胺合成酶(GS)和岩藻糖基转移酶8(FUT8)的基因已被基因敲除。

3.权利要求1或2的CHO细胞系，其还包含编码目的蛋白的核酸分子；

优选地，所述目的蛋白为抗体；

优选地，所述核酸分子游离于所述CHO细胞系的基因组之外；或者，优选地，所述核酸分子被整合到所述CHO细胞系的基因组中；

优选地，所述CHO细胞系能够瞬时表达所述目的蛋白；或者，优选地，所述CHO细胞系能够稳定表达所述目的蛋白。

4.一种表达目的蛋白的方法，其包括，

(1)将编码所述目的蛋白的核酸分子导入权利要求1或2的CHO细胞系中，以及，

(2)在适合表达目的蛋白的条件下培养所述CHO细胞系，以在所述CHO细胞系中表达所述目的蛋白；

优选地，所述目的蛋白为抗体；

优选地，在步骤(1)之前，对所述CHO细胞系进行改造，以使其不表达功能性的谷氨酰胺合成酶(GS)和岩藻糖基转移酶8(FUT8)；

优选地，在步骤(1)之前，从所述CHO细胞系的基因组中基因敲除编码谷氨酰胺合成酶(GS)和岩藻糖基转移酶8(FUT8)的基因；

优选地，在步骤(1)中，通过使用转染试剂(例如脂质转染试剂)，或者通过使用电转染的方式，将编码所述目的蛋白的核酸分子导入CHO细胞系中；

优选地，所述核酸分子包含于表达载体(例如质粒)中；

优选地，所述核酸分子在导入所述CHO细胞系后，游离于所述CHO细胞系的基因组之外；或者，优选地，所述核酸分子在导入所述CHO细胞系后，被整合到所述CHO细胞系的基因组中；

优选地，在步骤(2)中，所述CHO细胞系以瞬时表达的方式表达所述目的蛋白；或者，优选地，在步骤(2)中，所述CHO细胞系以稳定表达的方式表达所述目的蛋白；

优选地，在步骤(2)中，以分批培养或流加培养的方式培养所述CHO细胞系。

5.权利要求1-3任一项的CHO细胞系的用途，其用于表达目的蛋白(例如抗体)，或者用于制备表达目的蛋白(例如抗体)的工程化细胞。

6.一种经改造的CHO细胞系，其为保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，并且保藏号为CCTCC NO.C2016143的CHO-NIDVD细胞或其后代细胞。

7.权利要求6的经改造的CHO细胞系，其还包含编码目的蛋白的核酸分子；

优选地，所述目的蛋白为抗体；

优选地，所述核酸分子游离于所述经改造的CHO细胞系的基因组之外；或者，优选地，所述核酸分子被整合到所述经改造的CHO细胞系的基因组中；

优选地，所述经改造的CHO细胞系能够瞬时表达所述目的蛋白；或者，优选地，所述经改造的CHO细胞系能够稳定表达所述目的蛋白；更优选地，所述经改造的CHO细胞系能够稳定表达所述目的蛋白至少10代，至少20代，至少30代，至少40代，至少50代，至少60代，至少80代，或至少100代；

优选地，所述经改造的CHO细胞系用于分批培养或流加培养；

优选地，所述经改造的CHO细胞系能够以至少10pg/cell/day，至少20pg/cell/day，至少30pg/cell/day，至少40pg/cell/day，至少50pg/cell/day，至少60pg/cell/day，至少70pg/cell/day，或约75pg/cell/day的比生成速率生产目的蛋白(例如抗体)；

优选地，所述经改造的CHO细胞系能够以至少100mg/L，至少200mg/L，至少300mg/L，至少400mg/L，至少500mg/L，至少600mg/L，至少800mg/L，至少1000mg/L，至少1500mg/L或约2000mg/L的产量生产目的蛋白(例如抗体)。

8.一种表达目的蛋白的方法，其包括，

(1)将编码所述目的蛋白的核酸分子导入权利要求6或7的经改造的CHO细胞系中，以及，(2)在适合表达目的蛋白的条件下培养所述经改造的CHO细胞系，以在所述经改造的CHO细胞系中表达所述目的蛋白；

优选地，所述目的蛋白为抗体；

优选地，在步骤(1)中，通过使用转染试剂(例如脂质转染试剂)，或者通过使用电转染的方式，将编码所述目的蛋白的核酸分子导入所述经改造的CHO细胞系中；

优选地，所述核酸分子包含于表达载体(例如质粒)中；

优选地，所述核酸分子在导入所述经改造的CHO细胞系后，游离于所述经改造的CHO细胞系的基因组之外；或者，优选地，所述核酸分子在导入所述经改造的CHO细胞系后，被整合到所述经改造的CHO细胞系的基因组中；

优选地，在步骤(2)中，所述经改造的CHO细胞系以瞬时表达的方式表达所述目的蛋白；或者，优选地，在步骤(2)中，所述经改造的CHO细胞系以稳定表达的方式表达所述目的蛋白；例如，在步骤(2)中，所述经改造的CHO细胞系稳定表达所述目的蛋白至少10代，至少20代，至少30代，至少40代，至少50代，至少60代，至少80代，或至少100代；

优选地，在步骤(2)中，以分批培养或流加培养的方式培养所述CHO细胞系；

优选地，在步骤(2)中，所述经改造的CHO细胞系以至少10pg/cell/day，至少20pg/cell/day，至少30pg/cell/day，至少40pg/cell/day，至少50pg/cell/day，至少60pg/cell/day，至少70pg/cell/day，或约75pg/cell/day的比生成速率生产目的蛋白(例如抗体)；

优选地，在步骤(2)中，所述经改造的CHO细胞系以至少100mg/L，至少200mg/L，至少300mg/L，至少400mg/L，至少500mg/L，至少600mg/L，至少800mg/L，至少1000mg/L，至少1500mg/L或约2000mg/L的产量生产目的蛋白(例如抗体)；

优选地，在步骤(2)中，所述经改造的CHO细胞系表达的目的蛋白(例如抗体)实质上不具有岩藻糖基修饰。

9.权利要求6或7的经改造的CHO细胞系的用途，其用于表达目的蛋白(例如抗体)，或者用于制备表达目的蛋白(例如抗体)的工程化细胞。