CN110343668B

CN110343668B - 一种敲除gs基因的cho细胞株及其制备方法与应用

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Publication number: CN110343668B
Application number: CN201910668173.3A
Authority: CN
Inventors: 李靖; 贺华; 曹春来; 韦苏珍; 陈康月
Original assignee: Zhuhai United Laboratories Co Ltd
Current assignee: Zhuhai United Laboratories Co Ltd
Priority date: 2019-07-23
Filing date: 2019-07-23
Publication date: 2021-11-19
Anticipated expiration: 2039-07-23
Also published as: CN110343668A

Abstract

本发明公开了一种敲除GS基因的CHO细胞株及其制备方法与应用。该CHO细胞株无GS蛋白表达且无嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及sgRNA序列整合入细胞基因组中。本发明利用CRISPR/Cas9方法敲除GS基因，通过优化筛选方法，得到该CHO细胞株。本发明提供的制备方法能快速实现CHO细胞GS‑/‑编辑，筛选出GS基因敲除且无嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及sgRNA序列整合的CHO GS‑/‑细胞株。该细胞株应用于重组蛋白表达，无需MSX介导的基因扩增过程，大大加快了高产细胞株筛选效率。

Description

一种敲除GS基因的CHO细胞株及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，特别涉及一种敲除GS基因的CHO细胞株及其制备方法与应用。

背景技术

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)是目前广泛使用的哺乳动物表达宿主细胞，它属于成纤维细胞，既可以贴壁生长，也可以驯化成悬浮生长，悬浮生长的CHO细胞可以进行高密度发酵培养，适合大规模生产重组蛋白药物。与其他重组蛋白表达宿主相比，CHO细胞有着其无可代替的优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达产物与其天然蛋白分子在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近，尤其适用于复杂大分子蛋白药物表达；(2)可以进行高密度发酵培养，有较高的剪切力和渗透压抵抗能力；(3)外源基因分子可以实现高拷贝表达，外源表达蛋白产量较高及相对稳定；(4)外源产物一般属于分泌表达，且较少存在内源性蛋白的干扰，利于后续分离纯化；(5)细胞背景清楚，应用较成熟，很容易实现大规模生产。以CHO细胞为宿主的药物表达系统中，二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase,DHFR)和谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)为最广泛使用的两个筛选表达系统，而GS系统因为其筛选出的细胞株产量高和靶基因整合更稳定，工业上应用越来越普及。

GS是合成L-谷氨酰胺的关键酶，缺失GS的细胞自身无法合成L-谷氨酰胺，从而必须依赖外界环境提供L-谷氨酰胺才能生存。传统的GS系统是通过在无L-谷氨酰胺的培养基中同时加入GS抑制剂MSX进行高产细胞株筛选，只有表达足够多GS的细胞才能在高浓度的MSX条件下存活下来。然而，按照传统的方式进行细胞株筛选，细胞筛选周期较长，效率较低，得到的细胞株产量也相对较低。因为CHO细胞内源性GS基因对细胞筛选过程存在较大的干扰，目的蛋白基因和GS基因整合拷贝数低的细胞也能在加压条件下存活下来，增加了筛选出目的蛋白高表达细胞株的难度，同时较高浓度的MSX压力也不利于CHO细胞正常生长及分泌表达外源蛋白。因此，降低CHO细胞内源性的GS表达是改善GS筛选表达系统的一种重要途径，其中获得GS基因缺陷的CHO细胞就是较为理想的一种方式。

GS基因缺陷的细胞(GS-/-)自身无L-无谷氨酰胺合成酶功能，必须严格依赖于外源提供的L-谷氨酰胺才能存活。GS-/-细胞转染后置于无L-谷氨酰胺培养基中即可完成筛选过程。只有整合入外源GS基因且整合位点在基因组内转录活跃区域的细胞才能存活下来，未整合外源GS基因或整合的GS外源基因表达量低的GS-/-细胞无法在无L-谷氨酰胺培养基中存活。一般而言，目的蛋白基因在GS基因上游或下游，因此可以通过这个系统，在不添加MSX的情况下，快速筛选到GS和目的蛋白表达量较高的细胞株。

CRISPR/Cas9基因编辑是目前操作最简便高效的基因编辑方式，只需要通过特异性的sgRNA序列碱基互补定位结合到基因组上相应的靶序列，sgRNA引导的Cas9酶就可切割DNA双链导致双链断裂(Double strand break,DSB)，断裂后的DNA通常会通过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)的方式进行修复。NHEJ修复的准确性和频率都较低，修复后很可能会造成DSB处小片段发生碱基突变、碱基插入或者碱基缺失，导致基因发生突变或移码，表达的蛋白因结构改变或者序列不完整而失去正常功能，从而实现靶基因修饰。

CRISPR/Cas9表达载体转染入细胞中进行基因编辑的同时，表达载体的序列可能会整合入细胞基因组中，破坏基因组的完整性。目前，未见有关于CRISPR载体整合入宿主细胞基因组序列的鉴定的相关报道，这些含有整合载体序列的细胞株可能会表达嘌呤霉素抗性基因，可能会持续表达Cas9蛋白和sgRNA序列，造成细胞基因组的切割损伤，同时消耗细胞资源，增加细胞株代谢负担。载体序列随机整合入宿主细胞基因组后，有增加激活癌基因的可能性，造成细胞株癌变，癌变细胞不适宜生物制品的表达。因此，在制备敲除GS基因的CHO细胞株须鉴定并去除含有整合载体序列如嘌呤霉素抗性基因、Cas9基因、sgRNA等的细胞株。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种敲除GS基因的CHO细胞株。这是一种无嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及sgRNA序列整合的CHO GS-/-细胞株。

本发明的另一目的在于提供上述的敲除GS基因的CHO细胞株的制备方法。这是一种基于CRISPR/Cas9技术实现CHO细胞GS基因敲除，尤其是一种无嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及sgRNA序列整合的CHO GS-/-细胞株分离、鉴定的方法。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑系统可以敲除CHO细胞的GS基因，筛选出三株两个GS等位基因均有碱基突变、插入或缺失，GS基因敲除且无嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及sgRNA序列整合的CHO GS-/-细胞。

本发明的再一目的在于提供上述的敲除GS基因的CHO细胞株的应用。应用CHOGS-/-细胞构建筛选目的蛋白表达量高的单克隆细胞株。

为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

一种敲除GS基因的CHO细胞株(CHO GS-/-)，其无GS蛋白表达且无嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及sgRNA序列整合入细胞基因组中。

所述的敲除GS基因的CHO细胞株，优选为细胞株A、细胞株B或细胞株C；更优选为细胞株B；其中：

细胞株A的GS基因编码区外显子6的核苷酸序列如下所示：一个等位基因的序列如SEQ ID NO.22所示，另一个等位基因的序列如SEQ ID NO.23所示；

细胞株B的GS基因编码区外显子6的核苷酸序列如下所示：两个等位基因的序列如SEQ ID NO.24所示；

细胞株C的GS基因编码区外显子2的核苷酸序列如下所示：一个等位基因的序列如SEQ ID NO.25所示，另一个等位基因的序列如SEQ ID NO.26所示。

一种敲除GS基因的CHO细胞株(CHO GS-/-)的制备方法，包括如下步骤：

(1)针对CHO细胞GS基因的编码序列(CDS)，设计合成得到内切酶Cas9引导序列sgRNA；

(2)将步骤(1)得到的sgRNA克隆至基因编辑载体(该载体表达内切酶Cas9)中，得到同时表达sgRNA和内切酶Cas9的基因编辑载体；

(3)将同时表达sgRNA和内切酶Cas9的基因编辑载体转染CHO细胞，加入嘌呤霉素进行筛选；

(4)将存活的细胞进行分离，获得单克隆细胞，静置培养，得到单克隆细胞株；

(5)将扩大培养的单克隆细胞株进行GS缺陷功能鉴定：将同一株单克隆细胞株中的一部分置于含有L-谷氨酰胺的培养基中培养，将一部分置于不含有L-谷氨酰胺的培养基中培养；在含有L-谷氨酰胺的培养基中能存活，但在不含L-谷氨酰胺的培养基中不能存活的细胞株，即为GS功能缺陷的CHO细胞株，简称为CHO GS-/-细胞株；

(6)将得到的CHO GS-/-细胞株进一步筛选获得无嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及sgRNA序列整合的CHO GS-/-细胞株。

步骤(6)的具体操作优选为：

(A)将同一株CHO GS-/-单克隆细胞株分别置于含有嘌呤霉素和不含嘌呤霉素的培养基中培养；在含有嘌呤霉素的培养基中不能存活的细胞株，即为不含嘌呤霉素抗性的CHO GS-/-单克隆细胞株；

(B)提取CHO GS-/-单克隆细胞株基因组DNA，PCR扩增Cas9基因序列和sgRNA序列，分析扩增产物；无法扩增出理论长度片段的细胞株，即为无Cas9基因及sgRNA序列整合的CHO GS-/-细胞株；

将步骤(A)和(B)的结果结合起来，筛选到不含嘌呤霉素抗性，无Cas9基因及sgRNA序列整合的CHO GS-/-细胞株。

步骤(1)中所述的sgRNA为特异性靶向GS基因第二外显子的sgRNA和特异性靶向GS基因第六外显子的sgRNA中的一种或两种。

所述的特异性靶向GS基因第二外显子的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

所述的特异性靶向GS基因第六外显子的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

步骤(2)中所述的基因编辑载体包括但不限于lentiCRISPRv2、PX459和LentiCrispr-E。

步骤(3)中所述的CHO细胞包括但不限于CHO-K1细胞株和CHO-S细胞株。

步骤(3)中所述的转染方法包括但不限于电击转染法、脂质体转染法、PEI转染法和磷酸钙转染法。

步骤(3)中所述的CHO细胞在转染前先进行活化，调整到对数生长期再进行转染。

所述的活化的培养基优选为含谷氨酰胺的CD培养基。

所述的谷氨酰胺在所述的活化的培养基中的浓度为8mM。

所述的CD培养基优选为CD FortiCHO(Thermo Scientific)培养基、CD OptiCHO培养基(Thermo Scientific)或CD M4CHO培养基(Hyclone)。

步骤(3)中所述的加入嘌呤霉素的时间优选为转染后24～72小时；更优选为48小时。

步骤(3)中所述的筛选的条件优选为：嘌呤霉素的用量按其在细胞培养体系中的终浓度为2～7.5μg/ml计，筛选时间为3～5天。

步骤(4)中所述的分离的方法包括但不限于有限稀释法、流式分选法和半固体培养基分离法。

所述的有限稀释法中的铺板细胞密度优选为0.3～0.5个细胞/孔。

步骤(4)中所述的静置培养的时间优选为12～14天。

步骤(5)中所述的培养基优选为CD培养基。

步骤(5)中所述的L-谷氨酰胺的用量按其在培养基中的浓度为8mM。

步骤(6)(A)中所述的培养基优选为CD培养基。

步骤(6)(A)中所述的嘌呤霉素的用量按其在细胞培养体系中的终浓度为2μg/ml计。

步骤(6)(A)中所述的培养的时间为7天。

步骤(6)(B)中所述的Cas9的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.14所示序列。

步骤(6)(B)中所述的sgRNA的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.17所示序列。

上述的敲除GS基因的CHO细胞株在重组蛋白表达中的应用。

所述的应用包括如下步骤：

①目的蛋白表达载体的构建，得到的目的蛋白表达载体含有目的蛋白编码基因和GS编码基因；

②将目的蛋白表达载体转染所述的敲除GS基因的CHO细胞株；

③转染后将细胞转入不含L-谷氨酰胺的培养基中培养，存活下来的细胞即为含有外源GS基因和目的蛋白编码基因的细胞。

所述的目的蛋白表达载体优选通过如下步骤制备得到：将pcDNA3.0载体上SV40-Neomycin更换为SV40-GS，得到pcGS；将pcGS载体上hCMV片段更换为mCMV-GLP-1-Fc，获得pcGS-mCMV-GLP-1-Fc。GLP-1-Fc为胰高血糖素样肽-1/IgG-Fc融合蛋白(glucagon likepeptide-1/IgG-Fc fusion protein)。

所述的SV40-GS中的SV40的序列如SEQ ID NO.27所示。

所述的GS的序列如SEQ ID NO.28所示。

所述的mCMV-GLP-1-Fc中的mCMV的序列如SEQ ID NO.29所示。

所述的GLP-1-Fc的序列如SEQ ID NO.30所示。

步骤③的具体步骤优选如下：转染24～72小时后，离心去上清收集细胞，将细胞重悬于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，再次离心去上清，将残存的L-谷氨酰胺去除；然后将细胞转入无L-谷氨酰胺培养基中培养7-10天，存活下来的细胞即为整合外源GS基因和目的蛋白基因的细胞。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明利用CRISPR/Cas9技术建立的GS基因编辑方法，可以快速实现CHO细胞GS-/-编辑，操作简单高效。筛选得到的无嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及sgRNA序列整合的GS-/-单克隆细胞株应用于重组蛋白表达，无需MSX介导的基因扩增过程，大大加快了高产细胞株筛选效率。

附图说明

图1为CHO细胞的GS基因结构图。

图2为基因编辑载体lentiCRISPRv2-GS02(sgRNA靶向外显子2)和lentiCRISPRv2-GS06(sgRNA靶向外显子6)的构建流程图。

图3为pcGS-mCMV-GLP-1-Fc表达载体构建流程图。

图4为通过ELISA方法检测得到的CHO GS-/-单克隆细胞株GLP-1-Fc产量结果图。

图5为通过分子排阻法检测得到的CHO GS-/-单克隆细胞株GLP-1-Fc摇瓶发酵产量结果图。

具体实施方式

为说明本发明所采取的技术手段及其效果，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：基因编辑载体构建

CHO细胞的GS基因由7个外显子组成，其中编码表达GS蛋白的编码序列(CDS)位于外显子2～7中(见图1)，其正常功能的发挥对细胞生长存活起着至关重要的作用。GS基因的2～7外显子部分序列如下所示(CDS序列使用下划线“_____”标记)：

SEQ ID NO.1：外显子2

CCCCTTCAGAGTAGATGTTAATGAAATGACTTTTGTCTCTCCAGAGCACCTTCCACCATGGCCACCTC AGCAAGTTCCCACTTGAACAAAAACATCAAGCAAATGTACTTGTGCCTGCCCCAGGGTGAGAAAGTCCAAGCCATG TATATCTGGGTTGATGGTACTGGAGAAGGACTGCGCTGCAAAACCCGCACCCTGGACTGTGAGCCCAAGTGTGTAG AAGGTGAGCATGGGCAGGAGCAGGACATGTGCCTGGAAGTGGGCAAGCAGCCTGAGATTTGACCTTCCTTCTGTTTTG；

SEQ ID NO.2：外显子3

GATATACATGCAAGTAAAACACCCCTACACACATAAAAATAAATACGTCTTCTTAAAAGTTAATTTTCCATCTTTATTTGGCCCAGAGTTACCTGAGTGGAATTTTGATGGCTCTAGTACCTTTCAGTCTGAGGGCTCCAACAG TGACATGTATCTCAGCCCTGTTGCCATGTTTCGGGACCCCTTCCGCAGAGATCCCAACAAGCTGGTGTTCTGTGAA GTTTTCAAGTACAACCGGAAGCCTGCAGGTGTGTATGGGGTGGGCGTGAATGTCTTAAGAATCTAGGGATGGATGATC；

SEQ ID NO.3：外显子4

GTACTATCATTGCTTCTTCACAGTGGTTGGGCCTGAGTAGGTCCAGCCTATGATGACTTCAGCTGTGTAAGAGTTGAGGACACTACTCCTTACAGCATGTTGATGCTTTATTCCTAGAGACCAATTTAAGGCACTCGTGTAAAC GGATAATGGACATGGTGAGCAACCAGCACCCCTGGTTTGGAATGGAACAGGAGTATACTCTGATGGGAACAGATGG GCACCCTTTTGGTTGGCCTTCCAATGGCTTTCCTGGGCCCCAAGGTAAGTTCCCCAGGTGAAATAAAAG；

SEQ ID NO.4：外显子5

TATGGACTCTGATTCTTCACTGATTGCTCTTGATTCTCCTTCAGGTCCGTATTACTGTGGTGTGGGCG CAGACAAAGCCTATGGCAGGGATATCGTGGAGGCTCACTACCGCGCCTGCTTGTATGCTGGGGTCAAGATTACAGG AACAAATGCTGAGGTCATGCCTGCCCAGGTAAATGGCACTATTCT；

SEQ ID NO.5：外显子6

GTTCCTTTTCCTCCCCTCTGAAGACTTGGCACATGGGGACTTTGGTTAACAAGGGTGATGACTTAAAAGTGGTTCAGGGTAGAGGTAAGTAGAACAAGCTAGGAGCTTGAGTTGGCCTGAACAGTTAGTTGGCCTTATTCTAAAGGTCAACATGTTCTTTCTAGTGGGAATTCCAAATAGGACCCTGTGAAGGAATCCGCATGGGAGATCATCTCTGGGT GGCCCGTTTCATCTTGCATCGAGTATGTGAAGACTTTGGGGTAATAGCAACCTTTGACCCCAAGCCCATTCCTGGG AACTGGAATGGTGCAGGCTGCCATACCAACTTTAGCACCAAGGCCATGCGGGAGGAGAATGGTCTGAAGTAAGTAGCTTCCTCTGGAGCCATCTTTATTCTCAT；

SEQ ID NO.6：外显子7

GCCTGCATCAAGTATTTATTGGTTTCTTATGGAACTCATGCCTGCTCCTGCCCTTGAAGGACAGGTTTCTAGTGACAAGGTCAGACCCTCACCTTTACTGCTTCCACCAGGCACATCGAGGAGGCCATCGAGAAACTAAGCAAG CGGCACCGGTACCACATTCGAGCCTACGATCCCAAGGGGGGCCTGGACAATGCCCGTCGTCTGACTGGGTTCCACG AAACGTCCAACATCAACGACTTTTCTGCTGGTGTCGCCAATCGCAGTGCCAGCATCCGCATTCCCCGGACTGTCGG CCAGGAGAAGAAAGGTTACTTTGAAGACCGCCGCCCCTCTGCCAATTGTGACCCCTTTGCAGTGACAGAAGCCATC GTCCGCACATGCCTTCTCAATGAGACTGGCGACGAGCCCTTCCAATACAAAAACTAATTAGACTTTGAGTGATCTTGAGCCTTTCCTAGTTCATCCCACCCCGCCCCAGCTGTCTCATTGTAACTCAAAGGATGGAATATCAAGGTCTTTTTATTCCTCGTGCCCAGTTAATCTTGCTTTTATTGGTCAGAATAGAGGAGTCAAGTTCTTAATCCCTATAC。

(1)针对GS基因外显子2和外显子6上的CDS序列，综合使用在线软件CRISPRdirect和E-CRISP设计了sgRNA引导序列，序列如下：

靶向外显子2的sgRNA：5’-GGCTTGGACTTTCTCACCCT-3’(SEQ ID NO.7)；

靶向外显子6的sgRNA：5’-GTAGCACCAAGGCCATGCGGG-3’(SEQ ID NO.8)。

(2)合成sgRNA序列引物对(南京金斯瑞公司)，将成对引物磷酸化退火，得到sgRNA插入片段。磷酸化退火体系如下：1μl Oligo F(100μM)、1μl Oligo R(100μM)、1μl 10×T4PNK buffer(NEB M0201S)、1μl ATP(NEB P0756S)、0.5μl T4PNK(NEB M0201S)、5.5μl灭菌蒸馏水。程序如下：37℃30分钟，95℃5分钟，以5℃/分钟逐步降至25℃。

靶向外显子2的正向寡核苷酸链和反向寡核苷酸链的序列分别如下所示：

正向寡核苷酸链(OligoF)：5’-CACCGGCTTGGACTTTCTCACCCT-3’；

反向寡核苷酸链(OligoR)：5’-AAACAGGGTGAGAAAGTCCAAGCC-3’。

靶向外显子6的正向寡核苷酸链和反向寡核苷酸链的序列分别如下所示：

正向寡核苷酸链(OligoF)：5’-CACCGTAGCACCAAGGCCATGCGGG-3’；

反向寡核苷酸链(OligoR)：5’-AAACCCCGCATGGCCTTGGTGCTAC-3’。

(3)使用核酸内切酶BsmBI酶切lentiCRISPRv2载体(购自Addgene)并切胶回收。

(4)将步骤(2)得到的磷酸化双链sgRNA亚克隆入lentiCRISPRv2载体。连接体系如下：1μl LentiCRISPRv2-BsmB I酶切胶回收产物(50ng)、1μl 1：200稀释的磷酸化双链sgRNA、1μl 10×T4连接缓冲液(Takara)、1μl T4连接酶(Takara)、6μl灭菌蒸馏水，16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取单菌落质粒送去测序获得基因编辑载体lentiCRISPRv2-GS02(sgRNA靶向外显子2)和lentiCRISPRv2-GS06(sgRNA靶向外显子6)，构建流程见图2。

实施例2：CHO-S细胞的GS基因编辑及单克隆细胞分离鉴定

(1)质粒提取：使用质粒纯化试剂盒(PureLink^TMHiPure Plasmid FilterMidiprep Kit，Thermo Fisher Scientifi)，参照说明书中方法，提取lentiCRISPRv2-GS02和lentiCRISPRv2-GS06质粒，获得纯度高、无内毒素的高浓度质粒。

(2)细胞培养：复苏CHO-S(cGMP Banked,

)悬浮细胞，以常规传代培养方法在CD FortiCHO完全培养基(含8mM L-谷氨酰胺)中进行传代培养，传代培养3代以后分别进行LentiCRISPRv2-GS02和LentiCRISPRv2-GS06转染实验。

(3)细胞转染：

(A)转染前22-24小时，将CHO-S细胞以(5～6)×10⁵细胞/mL，30ml CD FortiCHO完全培养基传代；转染当天，细胞密度应为(1.2～1.5)×10⁶细胞/ml，成活率在95％以上，将待转染CHO-S细胞稀释至1×10⁶细胞/ml，并以5ml/管分装至50ml摇管中备用。

(B)准备DNA-脂质体转染复合物，具体包括：

a.使用OptiPRO^TMSFM(GIBCO)分别稀释6.25μg LentiCRISPRv2-GS02和6.25μgLentiCRISPRv2-GS06，总体积分别为0.1ml，混合均匀；得到稀释好的DNA；

b.使用OptiPRO^TMSFM稀释6.25μl FreeStyle^TMMAX Reagent(Thermo FisherScientific)，总体积为0.1ml，制备2管，轻轻混匀，室温静置孵育5分钟；得到稀释的转染试剂；

c.将稀释好的DNA加入到稀释的转染试剂中，轻轻混匀，室温静置20-30分钟待转染复合物形成。

(C)将DNA-脂质体转染复合物逐滴加入到备用待转染的CHO-S细胞中，然后将细胞置于细胞培养摇床培养，条件如下：37℃、110rpm、8％CO₂。

(4)转染48小时后，加入终浓度为2μg/ml的嘌呤霉素进行筛选。

(5)嘌呤霉素加压培养4天后，进行有限稀释分离单克隆细胞。

有限稀释分离单克隆细胞具体包括如下步骤：

(A)含6mM L-谷氨酰胺的克隆培养基配制(100ml)：CD FortiCHO基础培养基97ml，浓度为200mM的L-谷氨酰胺3ml，混匀后放37℃预热备用。

(B)将存活细胞用不含嘌呤霉素克隆培养基梯度稀释至0.3个细胞/40μl，排枪接种至96孔板，40μl/孔，即0.3个细胞/孔。

(C)接种的96孔板放置于CO₂培养箱，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下绝对静置培养4小时后，显微镜下逐孔观察，确认并标记只含有一个细胞的孔，并补加克隆培养基至200μl，置于CO₂培养箱继续静置培养。

(D)绝对静置培养12-14天，镜下观察单克隆细胞生长状况，找到有明显细胞增殖的孔并作标记，将细胞增殖较多状态较好的单克隆细胞放大至24孔板。

(E)将24孔板生长较好的单克隆细胞再放大至6孔板，继续培养。

(6)GS功能缺陷细胞株鉴定：将扩大培养的单克隆细胞使用CD FortiCHO培养基均分2管，0.5×10⁶个/ml，5ml体积，其中1管加入终浓度为8mM的L-谷氨酰胺，另1管不添加L-谷氨酰胺，传代培养7-10天后，在含有L-谷氨酰胺的培养基中能存活，但在不含L-谷氨酰胺的培养基中不能存活的细胞株即为GS功能缺陷细胞株(GS-/-)。

(7)不含嘌呤霉素抗性的GS-/-单克隆细胞株鉴定：将筛选出来的GS-/-单克隆细胞株使用CD FortiCHO培养基再均分2管，0.5×10⁶个/ml，5ml体积，其中1管加入终浓度为2μg/ml的嘌呤霉素，另1管不加，传代培养7天后，在含有嘌呤霉素的培养基中不能存活的，即为不含嘌呤霉素抗性的GS功能缺陷细胞株(GS-/-)。

(8)鉴定GS-/-单克隆细胞株基因组中是否含有整合的Cas9基因：

(A)使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA KitDP304，天根生物)，参照说明书中方法，提取GS-/-单克隆细胞株基因组。

(B)以GS-/-单克隆细胞株基因组为模板，根据Cas9 CDS序列设计3对引物，分别覆盖Cas9 CDS序列不同区域，PCR扩增Cas9序列，琼脂糖电泳分析扩增产物，所用引物分别如下所示：

Cas1正向引物(Cas1F)：5’-AGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTG-3’(SEQ ID NO.9)；

Cas1反向引物(Cas1R)：5’-GTAGTACAGGTACAGCTTCTCGTTCTG-3’(SEQ ID NO.10)；

Cas2正向引物(Cas2F)：5’-GTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTG-3’(SEQ ID NO.11)；

Cas2反向引物(Cas2R)：5’-CTTGTCATTCTCGTCGTACTTAGTGT-3’(SEQ ID NO.12)；

Cas3正向引物(Cas3F)：5’-GTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTG-3’(SEQ ID NO.13)；

Cas3反向引物(Cas3R)：5’-GTTCATGATGTTGCTGTAGAAGAAG-3’(SEQ ID NO.14)。

PCR反应体系如下所示：

50μl反应体系：模板基因组DNA 3μl(100ng)、浓度为5μM的引物Cas1F 2μl、浓度为5μM的引物Cas1R 2μl、PrimerSTAR Max mix 25μl(Takara)、补足双蒸水至50μl。整合Cas9序列的细胞株基因组可以扩增出751bp大小的片段。扩增出单一751bp片段(CHO-S对照细胞未扩增出相应大小条带)，可以认为是含有整合的Cas9基因。

50μl反应体系：模板基因组DNA 3μl(100ng)、浓度为5μM的引物Cas2F 2μl、浓度为5μM的引物Cas2R 2μl、PrimerSTAR Max mix25μl、补足双蒸水至50μl。整合Cas9序列的细胞株基因组可以扩增出222bp大小的片段。扩增出单一222bp片段(CHO-S对照细胞未扩增出相应大小条带)，可以认为是含有整合的Cas9基因。

50μl反应体系：模板基因组DNA 3μl(100ng)、浓度为5μM的引物Cas3F 2μl、浓度为5μM的引物Cas3R 2μl、PrimerSTAR Max mix 25μl、补足双蒸水至50μl。整合Cas9序列的细胞株基因组可以扩增出512bp大小的片段。扩增出单一512bp片段(CHO-S对照细胞未扩增出相应大小条带)，可以认为是含有整合的Cas9基因。

PCR程序统一为：94℃3分钟；98℃10秒、52℃5秒、72℃1分钟，34个循环；72℃5分钟；4℃∞。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，无Cas9基因扩增产物的单克隆细胞株即为不含Cas9整合基因的GS-/-单克隆细胞株。

(9)鉴定GS-/-单克隆细胞株是否含有整合的sgRNA序列。以步骤(8)中提取的GS-/-单克隆细胞株基因组为模板，PCR扩增包含sgRNA碱基序列片段，琼脂糖电泳分析扩增产物，所用引物如下所示：

U6-F：5’-TGGACTATCATATGCTTACCGT-3’(SEQ ID NO.15)；

R02：5’-AAACAGGGTGAGAAAGTCCAAGCC-3’(SEQ ID NO.16)；

R06：5’-AAACCCCGCATGGCCTTGGTGCTAC-3’(SEQ ID NO.17)。

其中，R02为SEQ ID NO.7互补序列，R06为SEQ ID NO.8互补序列。体系如下所示：

50μl反应体系：模板基因组DNA 3μl(100ng)、浓度为5μM的引物U6-F 2μl、浓度为5μM的引物R02 2μl、PrimerSTAR Max mix 25μl、补足双蒸水至50μl。整合sgRNA序列(SEQ IDNO.7)的细胞株基因组可以扩增出100bp大小的片段。

50μl反应体系：模板基因组DNA 3μl(100ng)、浓度为5μM的引物U6-F 2μl、浓度为5μM的引物R06 2μl、PrimerSTAR Max mix 25μl、补足双蒸水至50μl。整合sgRNA序列(SEQ IDNO.8)的细胞株基因组可以扩增出101bp大小的片段。

PCR程序统一为：94℃3分钟；98℃10秒、53℃5秒、72℃20秒，34个循环；72℃5分钟；4℃∞。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，挑选出无sgRNA基因扩增产物的单克隆细胞株，即为鉴定不含sgRNA整合基因的GS-/-单克隆细胞株。

综合步骤(7)、(8)和(9)的结果，得到不含嘌呤霉素抗性、Cas9整合基因及sgRNA序列整合的GS-/-单克隆细胞株。

(10)实验结果：有限稀释法得到的17株单克隆细胞中有7株细胞在不含L-谷氨酰胺的CDFortiCHO培养基中随着培养时间的延长，细胞逐步死亡，而在CD FortiCHO完全培养基(含8mM L-谷氨酰胺)中正常生长，说明该7株细胞必须依赖外源L-谷氨酰胺才能存活，其GS基因没有合成谷氨酰胺合成酶的功能。将这7株GS无功能的单克隆细胞分别编号：1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号。其中1号、2号、5号、6号和7号单克隆细胞株为使用靶向外显子6的sgRNA获得，3号和4号单克隆细胞株为使用靶向外显子2的sgRNA获得。1号、2号、3号在含嘌呤霉素的CD FortiCHO培养基中不能存活，4号、5号、6号、7号在含嘌呤霉素的CDFortiCHO培养基中能正常生长；琼脂糖凝胶电泳分析Cas9和sgRNA扩增产物：1号、2号、3号、6号均未扩增出理论大小片段，4号、5号、7号电泳结果存在sgRNA扩增产物和Cas9扩增产物。

实施例3：CRISPR/Cas9编辑的GS基因碱基序列确定

(1)以实施例2中提取的1号、2号、3号(3株不含sgRNA整合基因、Cas9整合基因、嘌呤霉素抗性的GS-/-单克隆细胞株)单克隆细胞株基因组为模板，PCR扩增GS基因外显子2和外显子6 CDS序列，引物序列和PCR反应体系分别如下所示：

GS02正向引物(GS02F)：5’-CCCCTTCAGAGTAGATGTTAATGAA-3’(SEQ ID NO.18)；

GS02反向引物(GS02R)：5’-CAAAACAGAAGGAAGGTCAAATCTC-3’(SEQ ID NO.19)；

GS06正向引物(GS06F)：5’-TATGGACTCTGATTCTTCACTG-3’(SEQ ID NO.20)；

GS06反向引物(GS06R)：5’-ATGAGAATAAAGATGGCTCCAG-3’(SEQ ID NO.21)。

50μl反应体系：模板基因组DNA 3μl(100ng)、浓度为5μM的引物GS02F 2μl、浓度为5μM的引物GS02R 2μl、PrimerSTAR Max mix 25μl、补足双蒸水至50μl。

50μl反应体系：模板基因组DNA 3μl(100ng)、浓度为5μM的引物G06F 2μl、浓度为5μM的引物GS06R 2μl、PrimerSTAR Max mix 25μl、补足双蒸水至50μl。

PCR程序统一为：94℃3分钟；98℃10秒、53℃5秒、72℃1分钟，34个循环；72℃5分钟；4℃∞。

(2)琼脂糖凝胶回收外显子2和外显子6的PCR扩增产物，分别使用引物GS02F/GS02R、GS06F/GS06R，送公司(Invitrogen)进行DNA测序。

(3)测序结果显示2号克隆在sgRNA识别结合位点附近多一个碱基C插入(外显子6，插入后翻译提前终止，编辑后CDS序列如SEQ ID NO.24)，测序图谱峰型清晰，未观察到碱基C插入位置有双峰，使用TaKaRa Taq将PCR产物添加A尾后亚克隆入pMD-18T载体后测序，20个克隆均为sgRNA识别结合位点附近多一个碱基C插入；结合其在无L-谷氨酰胺培养基中不能生长的表型，即其GS基因功能缺失。我们认为两个等位基因发生了相同的碱基修饰。1号和3号克隆有双峰，将1号和3号克隆的PCR产物亚克隆入T载体(pMD18T，Takara)，转化大肠杆菌后分别随机挑选20个单克隆菌落送Invitrogen进行测序。TA克隆具体步骤包括：

(A)步骤(2)中胶回收产物添加碱基A尾：反应体系如下：TaKaRa Taq(5U/μl)0.25μl，10×PCR Buffer(Mg²⁺)5μl，dNTP混合物(dNTP Mixtμre，2.5mM)4μl，胶回收产物25μl(1μg)，补足双蒸水至50μl，72℃反应30分钟，冰上冷却15分钟，产物纯化回收。

(B)回收产物与pMD18T载体进行连接，转化大肠杆菌。

(4)含有步骤(3)中PCR扩增产物片段的T载体送Invitrogen进行测序后发现，1号克隆的一个GS等位基因在外显子6上sgRNA识别结合片段有碱基C插入导致的移码突变(编辑后CDS序列如SEQ ID NO.22)；另一个GS等位基因在sgRNA识别结合片段附近的CDS区有182bp的碱基缺失(外显子6 CDS序列sgRNA识别序列上游基本丢失，编辑后CDS序列如SEQID NO.23)。3号克隆的一个GS等位基因在外显子2上sgRNA识别结合片段有9个碱基缺失以及有21个碱基额外插入(编辑后CDS序列如SEQ ID NO.25)；另一个GS等位基因在sgRNA识别结合片段附近4个碱基缺失(外显子2，缺失后翻译提前终止，编辑后CDS序列如SEQ IDNO.26)。

SEQ ID NO.22：(1号克隆GS等位基因外显子6经编辑后的序列，方框中为基因编辑后插入的碱基C；亦为细胞株A的GS基因编码区外显子6的一个等位基因的序列)

SEQ ID NO.23：(1号克隆GS等位基因外显子6经编辑后的序列，方框中带删除线的序列为基因编辑后缺失的碱基序列，方框中ATG序列为额外插入序列；亦为细胞株A的GS基因编码区外显子6的一个等位基因的序列)

SEQ ID NO.24：(2号克隆两个GS等位基因外显子6经编辑后的序列，方框中为基因编辑后插入的碱基C；亦为细胞株B的GS基因编码区外显子6的两个等位基因的序列)

SEQ ID NO.25：(3号克隆GS等位基因外显子2经编辑后的序列，方框中带删除线序列为基因编辑后缺失的序列，其余序列为额外插入序列；亦为细胞株C的GS基因编码区外显子2的一个等位基因的序列)

SEQ ID NO.26：(3号克隆GS等位基因外显子2经编辑后的序列，方框中带删除线序列为基因编辑后缺失的序列；亦为细胞株C的GS基因编码区外显子2的一个等位基因的序列)

实施例4：无嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及sgRNA序列整合的GS-/-单克隆细胞株表达GLP-1-Fc融合蛋白

(1)选择2号GS-/-单克隆细胞作为GLP-1-Fc表达宿主细胞，使用CD FortiCHO完全培养基(含8mM L-谷氨酰胺)进行传代培养待用。

(2)构建表达GLP-1-Fc表达载体pcGS-mCMV-GLP-1-Fc，并使用质粒纯化试剂盒(PureLinkHiPure Plasmid Filter Midiprep Kit，Thermo Fisher Scientifi)，参照说明书中方法，提取高纯度质粒待转染。

pcGS-mCMV-GLP-1-Fc载体构建具体包括以下步骤：

A.合成SV40-GS核酸片段(南京金斯瑞公司)，SV40-GS中的SV40的序列如SEQ IDNO.27所示(含DraIII酶切位点)，GS的序列如SEQ ID NO.28所示(含BstBI酶切位点)，分别使用DraIII和BstBI酶切SV40-GS和pcDNA3.0，经胶回收纯化获得带开放性粘性末端的DraIII-SV40-GS-BstBI基因片段和pcDNA3.0线性化载体(不含有SV40-NeoR)，用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(DraIII和BstBI酶切出1359bp、4020bp大小片段为阳性克隆，测序)，最终获得pcDNA3.0-SV40-GS重组质粒(简记为pcGS，如图3所示)，该载体可以表达GS。

B.合成MluI-mCMV-GLP-1-Fc-NotI基因片段(南京金斯瑞公司)，mCMV启动子序列如SEQ IDNO.29所示(含MluI酶切位点)，GLP-1-Fc序列如SEQ ID NO.30所示(含NotI酶切位点)，用MluI和NotI分别双酶切MluI-mCMV-GLP-1-Fc-NotI基因片段和pcGS载体，将酶切后的片段和载体用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(MluI和NotI酶切出1625bp、5000bp大小片段为阳性克隆，测序)，最终获得pcGS-mCMV-GLP-1-Fc重组质粒，构建流程见图3。

SEQ ID NO.27：SV40启动子序列

CACGTAGTGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTATCCCGGGGCCACCGCTCAGAGCACCGTTAACC；

SEQ ID NO.28：GS基因序列

ATGGCCACCTCAGCAAGTTCCCACTTGAACAAAAACATCAAGCAAATGTACTTGTGCCTGCCCCAGGGTGAGAAAGTCCAAGCCATGTATATCTGGGTTGATGGTACTGGAGAAGGACTGCGCTGCAAAACCCGCACCCTGGACTGTGAGCCCAAGTGTGTAGAAGAGTTACCTGAGTGGAATTTTGATGGCTCTAGTACCTTTCAGTCTGAGGGCTCCAACAGTGACATGTATCTCAGCCCTGTTGCCATGTTTCGGGACCCCTTCCGCAGAGATCCCAACAAGCTGGTGTTCTGTGAAGTTTTCAAGTACAACCGGAAGCCTGCAGAGACCAATTTAAGGCACTCGTGTAAACGGATAATGGACATGGTGAGCAACCAGCACCCCTGGTTTGGAATGGAACAGGAGTATACTCTGATGGGAACAGATGGGCACCCTTTTGGTTGGCCTTCCAATGGCTTTCCTGGGCCCCAAGGTCCGTATTACTGTGGTGTGGGCGCAGACAAAGCCTATGGCAGGGATATCGTGGAGGCTCACTACCGCGCCTGCTTGTATGCTGGGGTCAAGATTACAGGAACAAATGCTGAGGTCATGCCTGCCCAGTGGGAGTTCCAAATAGGACCCTGTGAAGGAATCCGCATGGGAGATCATCTCTGGGTGGCCCGTTTCATCTTGCATCGAGTATGTGAAGACTTTGGGGTAATAGCAACCTTTGACCCCAAGCCCATTCCTGGGAACTGGAATGGTGCAGGCTGCCATACCAACTTTAGCACCAAGGCCATGCGGGAGGAGAATGGTCTGAAGCACATCGAGGAGGCCATCGAGAAACTAAGCAAGCGGCACCGGTACCACATTCGAGCCTACGATCCCAAGGGGGGCCTGGACAATGCCCGTCGTCTGACTGGGTTCCACGAAACGTCCAACATCAACGACTTTTCTGCTGGTGTCGCCAATCGCAGTGCCAGCATCCGCATTCCCCGGACTGTCGGCCAGGAGAAGAAAGGTTACTTTGAAGACCGCCGCCCCTCTGCCAATTGTGACCCCTTTGCAGTGACAGAAGCCATCGTCCGCACATGCCTTCTCAATGAGACTGGCGACGAGCCCTTCCAATACAAAAACTAACGAGACTCTGTAGTTCGAA；

SEQ ID NO.29：mCMV启动子序列

ACGCGTCTACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCTCGAGCCAATACACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCCCTGGAAATTCCATATTGGCACGCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGGGTATAAGAGGCGCGACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGAACGCAGCCTCAGG；

SEQ ID NO.30：GLP-1-Fc核苷酸序列

AGATCTGCTGACTAGCGTTTAAACTTAAGCTTAGCGCAGAGGCTTGGGGCAGCCGAGCGGCAGCCAGGCCCCGGCCCGGGCCTCGGTTCCAGAAGGGAGAGGAGCCCGCCAAGGCGCGCAAGAGAGCGGGCTGCCTCGCAGTCCGAGCCGGAGAGGGAGCGCGAGCCGCGCCGGCCCCGGACGGCCTCCGAAACCATGGGCGTGAAGGTCCTGTTCGCCCTGATTTGCATCGCCGTCGCAGAGGCACACGGCGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTCGAAGAGCAGGCCGCCAAGGAATTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGCGGCGGTGGTGGTGGCTCCGGAGGCGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCGCTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTTGATAAGCGGCCGC。

(3)pcGS-mCMV-GLP-1-Fc转染2号单克隆细胞，方法同实施例2。

(4)转染48h后，更换不含L-谷氨酰胺的CD FortiCHO培养基筛选培养，同时设立未转染pcGS-mCMV-GLP-1-Fc的阴性对照组细胞。

(5)无L-谷氨酰胺筛选培养7天后(阴性对照组细胞全部死亡)，将获得的稳定转染细胞进行有限稀释分离单克隆，方法同实施例2。

(6)绝对静置培养14天后，镜下观察并吸取单细胞集落的培养上清，进行SDS-PAGE检测。根据SDS-PAGE检测结果，挑选目的条带(约62kDa)较明显的单克隆转移至15ml-摇管扩大培养。

(7)15ml-摇管体系正常培养5天，挑选生长状态较好的单克隆细胞培养上清进行ELISA检测，结果见图4所示。三明治夹心ELISA法方法简述如下：96孔板经羊抗人IgG Fc抗体(货号109-005-098，Johnson Immune Research)4℃包被过夜，杜拉鲁肽标准品(EliLilly)和CHO-S细胞上清经倍比稀释后分别加入96孔板中结合一抗。然后加入HRP标记的小鼠抗GLP-1单克隆抗体(货号AP84512-HRP，上海安源生物)以结合一抗俘获的GLP-1-Fc。

(8)根据ELISA检测结果，挑选产量较高的单克隆细胞转移至50ml-摇管扩大培养，培养4-6天后进行细胞株冷冻保藏。

实施例5：摇瓶发酵产量评估

(1)根据15ml-摇管ELISA检测结果挑选4株产量较高单克隆细胞从50ml-摇管接种至125ml-摇瓶培养，接种后终密度为0.5M/ml，30ml培养体积(作为一级种子)，待细胞密度达到4-6M/ml后再同样方法接种二级种子。

(2)待二级种子细胞密度达到4-6M/ml后，将细胞接种至250ml-摇瓶中，接种后终密度为0.5×10⁶个细胞/ml，总体积为50ml CD11V完全培养基(含8mM L-谷氨酰胺，上海奥普迈)，130rpm、8％CO₂、37℃进行培养，开始发酵，接种当天记为第0天。

(3)从培养的第3天开始，每天取样2ml进行以下参数检测：活细胞密度，细胞活率，细胞直径，pH值，渗透压，乳酸浓度，谷氨酰胺浓度及葡萄糖浓度，同时镜下观察细胞状态。

(4)发酵液中葡萄糖含量低于2g/L时，补加葡萄糖溶液至4g/L。

(5)发酵培养的第3、5、7、9、11、13天分别添加3％、4％、5％、5％、5％、5％的补料培养基PFF06(上海奥普迈)(V/V)。

(6)当细胞密度达到1.5×10⁷细胞/ml时，降低培养温度至33℃。

(7)发酵第9、11、14天离心取发酵上清，分子排阻SEC法检测GLP-1-Fc融合蛋白的产量及纯度。

(8)发酵过程中出现细胞存活率低于80％时，结束发酵并取样检测产量及进一步分析。

(9)实验结果：本实施例中单克隆细胞摇瓶发酵产量结果如图5所示，从产量结果看出GS-/-单克隆细胞表达外源蛋白(GLP-1-Fc)在无MSX添加剂情况下得到的单克隆产量(4、13、15、18克隆)达到1.4-2.2g/L，说明鉴定分离的GS-/-单克隆细胞株可以应用于外源蛋白重组表达，且操作过程中无需添加MSX进行基因扩增，缩短了细胞株构建周期。

实施例6：GS基因编辑无效实施例

(1)针对GS基因外显子5上的CDS序列设计的sgRNA序列如下：

外显子5sgRNA序列：5’-GCGCCCACACCACAGTAATA-3’(SEQ ID NO.31)。

(2)lentiCRISPRv2-GS05(sgRNA靶向外显子5)载体的构建同实施例1中lentiCRISPRv2-GS02(sgRNA靶向外显子2)和lentiCRISPRv2-GS06(sgRNA靶向外显子6)，载体构建所用靶向外显子5的正向寡核苷酸链和反向寡核苷酸链的序列分别如下所示：

正向寡核苷酸链(OligoF)：5’-CACCGCGCCCACACCACAGTAATA-3’；

反向寡核苷酸链(OligoR)：5’-AAACTATTACTGTGGTGTGGGCGC-3’。

(3)细胞培养：复苏CHO-S(cGMP Banked,

)悬浮细胞，以常规传代培养方法在CD FortiCHO完全培养基(含8mM L-谷氨酰胺)中进行传代培养，传代培养3代以后进行lentiCRISPRv2-GS05转染实验。

具体包括如下步骤：

(A)转染前22-24小时，将CHO-S细胞以(5～6)×10⁵细胞/mL，30ml CD FortiCHO完全培养基传代；转染当天，细胞密度应为(1.2～1.5)×10⁶细胞/mL，活率在95％以上，将待转染CHO-S细胞稀释至1×10⁶细胞/ml，并以5ml/管分装至50ml摇管中备用。

(B)准备DNA-脂质体转染复合物，具体包括：

a.使用OptiPRO^TMSFM稀释6.25μg lentiCRISPRv2-GS05，总体积为0.1ml，混合均匀；

b.使用OptiPRO^TMSFM稀释6.25μl FreeStyle^TMMAX Reagent，总体积为0.1ml，轻轻混匀，室温静置孵育5分钟；

(4)将DNA-脂质体转染复合物逐滴加入到备用待转染的CHO-S细胞中，然后将细胞置于细胞培养摇床培养，条件为：37℃、110rpm、8％CO₂。

(5)转染48小时后，加入终浓度为2μg/ml嘌呤霉素进行筛选。

(6)嘌呤霉素加压培养4天后进行有限稀释分离单克隆细胞。

有限稀释分离单克隆细胞具体包括如下步骤：

(A)6mM L-谷氨酰胺克隆培养基配制(100ml)：CD FortiCHO基础培养基97ml，200mM L-谷氨酰胺3ml，混匀后放37℃预热备用。

(B)将存活细胞用克隆培养基梯度稀释至0.3个细胞/40μl，排枪接种至96孔板，40μl/孔，即0.3个细胞/孔。

(C)接种的96孔板放置于CO₂培养箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下绝对静置培养4小时后，显微镜下逐孔观察，确认并标记只含有一个细胞的孔并将培养基补加至200μl，置于CO₂培养箱继续静置培养。

(7)GS功能缺陷细胞株鉴定：将扩大培养的单克隆细胞均分2管，0.5M/ml，5ml体积，其中1管加入终浓度为8mM的L-谷氨酰胺，另1管不添加L-谷氨酰胺，正常进行传代培养。

(8)实验结果：分离得到多株单克隆细胞在含有L-谷氨酰胺的培养基中生长良好，在不含有L-谷氨酰胺的培养基中传代培养7天并未明显见到细胞大量死亡，与正常野生型CHO-S细胞生长情况基本一致。说明其谷氨酰胺合成酶(GS)功能未受损，sgRNA介导的GS编辑失效，导致此结果的原因应是靶向外显子5的sgRNA(SEQ ID NO.31)靶向性较差，不能有效引导Cas9切割GS基因。

实施例7：适宜的嘌呤霉素筛选浓度和时间确定

为了得到GS基因敲除且CHO-S细胞中无整合的载体序列，我们进行了嘌呤霉素加压时间和加压浓度的摸索，以转染和加压筛选后的细胞是否具有嘌呤霉素抗性作为是否有载体基因整合的一个标志，具体包括以下步骤：

(1)细胞培养：复苏CHO-S(cGMP Banked,

)悬浮细胞，以常规传代培养方法在CDFortiCHO完全培养基(含8mM L-谷氨酰胺)中进行传代培养，传代培养3代以后进行GS敲除表达载体转染实验，下面以lentiCRISPRv2-GS06为例进行说明。

具体包括如下步骤：

(A)转染前22-24小时，将CHO-S细胞以(5～6)×10⁵细胞/mL，30ml CD FortiCHO完全培养基传代；转染当天，细胞密度应为(1.2～1.5)×10⁶细胞/mL，活率在95％以上，将待转染CHOS细胞稀释至1×10⁶细胞/ml，并以5ml/管分装至50ml摇管中备用。

(B)准备DNA-脂质体转染复合物，具体包括：

a.使用OptiPRO^TMSFM稀释6.25μg lentiCRISPRv2-GS06，总体积为0.1ml，混合均匀；

(2)将DNA-脂质体转染复合物逐滴加入到备用待转染的CHO-S细胞中，然后将细胞置于细胞培养摇床培养，条件为：37℃、110rpm、8％CO₂。

(3)转染48小时后，分别加入终浓度为1、2、5、7.5、10、12.5μg/ml嘌呤霉素进行筛选。

(4)嘌呤霉素筛选时间为2、3、4、5、7、8天，然后分别进行有限稀释分离单克隆细胞。

有限稀释分离单克隆细胞具体包括如下步骤：

(5)GS功能缺陷细胞株鉴定：将扩大培养的单克隆细胞均分2管，0.5M/ml，5ml体积，其中1管加入终浓度为8mM的L-谷氨酰胺，另1管不添加L-谷氨酰胺，正常进行传代培养。

(6)GS-/-单克隆细胞株嘌呤霉素抗性鉴定：将筛选出来的GS-/-单克隆细胞株再均分2管，0.5M/ml，5ml体积，其中1管加入终浓度为2μg/ml的嘌呤霉素，另1管不加，传代培养7天后(预实验中终浓度为2μg/ml的嘌呤霉素培养7天，不含嘌呤霉素抗性的GS功能缺陷细胞株不能存活)，在含有嘌呤霉素培养基中不能存活的为不含嘌呤霉素抗性的GS功能缺陷细胞株(GS-/-)，反之为含有嘌呤霉素抗性的GS功能缺陷细胞株(GS-/-)。

(7)实验结果：

1μg/ml嘌呤霉素筛选2、3、4、5、7、8天未能筛选出GS-/-细胞株，应该是嘌呤霉素浓度过低，不能有效杀死载体未转染的细胞，导致背景高，干扰后续筛选过程，无法有效实现筛选出GS-/-细胞株。

2、5、7.5μg/ml嘌呤霉素筛选2天未能筛选到GS-/-细胞株，原因为筛选时间较短，未转染的细胞不能被大量杀死，干扰后续筛选过程；筛选3、4、5、7、8天能筛选出GS-/-细胞株，但筛选7天和8天组得到的GS-/-单克隆细胞株基本含有嘌呤霉素抗性。

10、12.5μg/ml嘌呤霉素筛选2天后有细胞存活，但细胞状态较差未能筛选出GS-/-细胞株；细胞不能耐受3、4、5、7、8天筛选，存活细胞极少。

综合上述结果，2-7.5μg/ml嘌呤霉素，筛选3-5天最有利于得到无嘌呤霉素抗性基因整合的GS-/-细胞株。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 珠海联邦制药股份有限公司

<120> 一种敲除GS基因的CHO细胞株及其制备方法与应用

<160> 37

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 298

<212> DNA

<213> 中国仓鼠(Cricetulus griseus)

<220>

<223> CHO细胞GS基因外显子2部分序列

<400> 1

ccccttcaga gtagatgtta atgaaatgac ttttgtctct ccagagcacc ttccaccatg 60

gccacctcag caagttccca cttgaacaaa aacatcaagc aaatgtactt gtgcctgccc 120

cagggtgaga aagtccaagc catgtatatc tgggttgatg gtactggaga aggactgcgc 180

tgcaaaaccc gcaccctgga ctgtgagccc aagtgtgtag aaggtgagca tgggcaggag 240

caggacatgt gcctggaagt gggcaagcag cctgagattt gaccttcctt ctgttttg 298

<210> 2

<211> 298

<212> DNA

<213> 中国仓鼠(Cricetulus griseus)

<220>

<223> CHO细胞GS基因外显子3部分序列

<400> 2

gatatacatg caagtaaaac acccctacac acataaaaat aaatacgtct tcttaaaagt 60

taattttcca tctttatttg gcccagagtt acctgagtgg aattttgatg gctctagtac 120

ctttcagtct gagggctcca acagtgacat gtatctcagc cctgttgcca tgtttcggga 180

ccccttccgc agagatccca acaagctggt gttctgtgaa gttttcaagt acaaccggaa 240

gcctgcaggt gtgtatgggg tgggcgtgaa tgtcttaaga atctagggat ggatgatc 298

<210> 3

<211> 289

<212> DNA

<213> 中国仓鼠(Cricetulus griseus)

<220>

<223> CHO细胞GS基因外显子4部分序列

<400> 3

gtactatcat tgcttcttca cagtggttgg gcctgagtag gtccagccta tgatgacttc 60

agctgtgtaa gagttgagga cactactcct tacagcatgt tgatgcttta ttcctagaga 120

ccaatttaag gcactcgtgt aaacggataa tggacatggt gagcaaccag cacccctggt 180

ttggaatgga acaggagtat actctgatgg gaacagatgg gcaccctttt ggttggcctt 240

ccaatggctt tcctgggccc caaggtaagt tccccaggtg aaataaaag 289

<210> 4

<211> 189

<212> DNA

<213> 中国仓鼠(Cricetulus griseus)

<220>

<223> CHO细胞GS基因外显子5部分序列

<400> 4

tatggactct gattcttcac tgattgctct tgattctcct tcaggtccgt attactgtgg 60

tgtgggcgca gacaaagcct atggcaggga tatcgtggag gctcactacc gcgcctgctt 120

gtatgctggg gtcaagatta caggaacaaa tgctgaggtc atgcctgccc aggtaaatgg 180

cactattct 189

<210> 5

<211> 400

<212> DNA

<213> 中国仓鼠(Cricetulus griseus)

<220>

<223> CHO细胞GS基因外显子6部分序列

<400> 5

gttccttttc ctcccctctg aagacttggc acatggggac tttggttaac aagggtgatg 60

acttaaaagt ggttcagggt agaggtaagt agaacaagct aggagcttga gttggcctga 120

acagttagtt ggccttattc taaaggtcaa catgttcttt ctagtgggaa ttccaaatag 180

gaccctgtga aggaatccgc atgggagatc atctctgggt ggcccgtttc atcttgcatc 240

gagtatgtga agactttggg gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaact 300

ggaatggtgc aggctgccat accaacttta gcaccaaggc catgcgggag gagaatggtc 360

tgaagtaagt agcttcctct ggagccatct ttattctcat 400

<210> 6

<211> 593

<212> DNA

<213> 中国仓鼠(Cricetulus griseus)

<220>

<223> CHO细胞GS基因外显子7部分序列

<400> 6

gcctgcatca agtatttatt ggtttcttat ggaactcatg cctgctcctg cccttgaagg 60

acaggtttct agtgacaagg tcagaccctc acctttactg cttccaccag gcacatcgag 120

gaggccatcg agaaactaag caagcggcac cggtaccaca ttcgagccta cgatcccaag 180

gggggcctgg acaatgcccg tcgtctgact gggttccacg aaacgtccaa catcaacgac 240

ttttctgctg gtgtcgccaa tcgcagtgcc agcatccgca ttccccggac tgtcggccag 300

gagaagaaag gttactttga agaccgccgc ccctctgcca attgtgaccc ctttgcagtg 360

acagaagcca tcgtccgcac atgccttctc aatgagactg gcgacgagcc cttccaatac 420

aaaaactaat tagactttga gtgatcttga gcctttccta gttcatccca ccccgcccca 480

gctgtctcat tgtaactcaa aggatggaat atcaaggtct ttttattcct cgtgcccagt 540

taatcttgct tttattggtc agaatagagg agtcaagttc ttaatcccta tac 593

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶向外显子2的sgRNA序列

<400> 7

ggcttggact ttctcaccct 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶向外显子6的sgRNA序列

<400> 8

gtagcaccaa ggccatgcgg g 21

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cas1正向引物（Cas1F）序列

<400> 9

agaggactac ttcaagaaaa tcgagtg 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cas1反向引物（Cas1R）序列

<400> 10

gtagtacagg tacagcttct cgttctg 27

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cas2正向引物（Cas2F）序列

<400> 11

gtcgtgaaga agatgaagaa ctactg 26

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cas2反向引物（Cas2R）序列

<400> 12

cttgtcattc tcgtcgtact tagtgt 26

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cas3正向引物（Cas3F）序列

<400> 13

gtcgtgaaga agatgaagaa ctactg 26

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cas3反向引物（Cas3R）序列

<400> 14

gttcatgatg ttgctgtaga agaag 25

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> U6-F序列

<400> 15

tggactatca tatgcttacc gt 22

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R02序列

<400> 16

aaacagggtg agaaagtcca agcc 24

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R06序列

<400> 17

aaaccccgca tggccttggt gctac 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GS02正向引物（GS02F）序列

<400> 18

ccccttcaga gtagatgtta atgaa 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GS02反向引物（GS02R）序列

<400> 19

caaaacagaa ggaaggtcaa atctc 25

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GS06正向引物（GS06F）序列

<400> 20

tatggactct gattcttcac tg 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GS06反向引物（GS06R）序列

<400> 21

atgagaataa agatggctcc ag 22

<210> 22

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 细胞株A GS基因编码区外显子6的等位基因序列

<400> 22

tgggaattcc aaataggacc ctgtgaagga atccgcatgg gagatcatct ctgggtggcc 60

cgtttcatct tgcatcgagt atgtgaagac tttggggtaa tagcaacctt tgaccccaag 120

cccattcctg ggaactggaa tggtgcaggc tgccatacca actttagcac caaggccatg 180

ccgggaggag aatggtctga a 201

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 细胞株A GS基因编码区外显子6的等位基因序列

<400> 23

atgggaggag aatggtctga a 21

<210> 24

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 细胞株B GS基因编码区外显子6的等位基因序列

<400> 24

tgggaattcc aaataggacc ctgtgaagga atccgcatgg gagatcatct ctgggtggcc 60

cgtttcatct tgcatcgagt atgtgaagac tttggggtaa tagcaacctt tgaccccaag 120

cccattcctg ggaactggaa tggtgcaggc tgccatacca actttagcac caaggccatg 180

ccgggaggag aatggtctga a 201

<210> 25

<211> 178

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 细胞株C GS基因编码区外显子2的等位基因序列

<400> 25

atggccacct cagcaagttc ccacttgaac aaaaacatca agcaaatgta cttgtgcctg 60

ccccaacttt cccaacccga tgccacagtc caagccatgt atatctgggt tgatggtact 120

ggagaaggac tgcgctgcaa aacccgcacc ctggactgtg agcccaagtg tgtagaag 178

<210> 26

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 细胞株C GS基因编码区外显子2的等位基因序列

<400> 26

atggccacct cagcaagttc ccacttgaac aaaaacatca agcaaatgta cttgtgcctg 60

ccccagggaa agtccaagcc atgtatatct gggttgatgg tactggagaa ggactgcgct 120

gcaaaacccg caccctggac tgtgagccca agtgtgtaga ag 162

<210> 27

<211> 218

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SV40启动子序列（含DraIII酶切位点）

<400> 27

cacgtagtgc tgtggaatgt gtgtcagtta gtcccgcccc taactccgcc cagttccgcc 60

cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg 120

gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa 180

aagctatccc ggggccaccg ctcagagcac cgttaacc 218

<210> 28

<211> 1141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GS基因序列（含BstBI酶切位点）

<400> 28

atggccacct cagcaagttc ccacttgaac aaaaacatca agcaaatgta cttgtgcctg 60

ccccagggtg agaaagtcca agccatgtat atctgggttg atggtactgg agaaggactg 120

cgctgcaaaa cccgcaccct ggactgtgag cccaagtgtg tagaagagtt acctgagtgg 180

aattttgatg gctctagtac ctttcagtct gagggctcca acagtgacat gtatctcagc 240

cctgttgcca tgtttcggga ccccttccgc agagatccca acaagctggt gttctgtgaa 300

gttttcaagt acaaccggaa gcctgcagag accaatttaa ggcactcgtg taaacggata 360

atggacatgg tgagcaacca gcacccctgg tttggaatgg aacaggagta tactctgatg 420

ggaacagatg ggcacccttt tggttggcct tccaatggct ttcctgggcc ccaaggtccg 480

tattactgtg gtgtgggcgc agacaaagcc tatggcaggg atatcgtgga ggctcactac 540

cgcgcctgct tgtatgctgg ggtcaagatt acaggaacaa atgctgaggt catgcctgcc 600

cagtgggagt tccaaatagg accctgtgaa ggaatccgca tgggagatca tctctgggtg 660

gcccgtttca tcttgcatcg agtatgtgaa gactttgggg taatagcaac ctttgacccc 720

aagcccattc ctgggaactg gaatggtgca ggctgccata ccaactttag caccaaggcc 780

atgcgggagg agaatggtct gaagcacatc gaggaggcca tcgagaaact aagcaagcgg 840

caccggtacc acattcgagc ctacgatccc aaggggggcc tggacaatgc ccgtcgtctg 900

actgggttcc acgaaacgtc caacatcaac gacttttctg ctggtgtcgc caatcgcagt 960

gccagcatcc gcattccccg gactgtcggc caggagaaga aaggttactt tgaagaccgc 1020

cgcccctctg ccaattgtga cccctttgca gtgacagaag ccatcgtccg cacatgcctt 1080

ctcaatgaga ctggcgacga gcccttccaa tacaaaaact aacgagactc tgtagttcga 1140

a 1141

<210> 29

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mCMV启动子序列（含MluI酶切位点）

<400> 29

acgcgtctac tgagtcatta gggactttcc aatgggtttt gcccagtaca taaggtcaat 60

aggggtgaat caacaggaaa gtcccattgg agccaagtac actgagtcaa tagggacttt 120

ccattgggtt ttgcccagta caaaaggtca atagggggtg agtcaatggg tttttcccat 180

tattggcacg tacataaggt caataggggt gagtcattgg gtttttccag ccaatttaat 240

taaaacgcca tgtactttcc caccattgac gtcaatgggc tattgaaact aatgcaacgt 300

gacctttaaa cggtactttc ccatagctga ttaatgggaa agtaccgttc tcgagccaat 360

acacgtcaat gggaagtgaa agggcagcca aaacgtaaca ccgccccggt tttcccctgg 420

aaattccata ttggcacgca ttctattggc tgagctgcgt tctacgtggg tataagaggc 480

gcgaccagcg tcggtaccgt cgcagtcttc ggtctgacca ccgtagaacg cagcctcagg 540

<210> 30

<211> 1085

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GLP-1-Fc序列（含NotI酶切位点）

<400> 30

agatctgctg actagcgttt aaacttaagc ttagcgcaga ggcttggggc agccgagcgg 60

cagccaggcc ccggcccggg cctcggttcc agaagggaga ggagcccgcc aaggcgcgca 120

agagagcggg ctgcctcgca gtccgagccg gagagggagc gcgagccgcg ccggccccgg 180

acggcctccg aaaccatggg cgtgaaggtc ctgttcgccc tgatttgcat cgccgtcgca 240

gaggcacacg gcgagggcac cttcacctcc gacgtgtcct cctatctcga agagcaggcc 300

gccaaggaat tcatcgcctg gctggtgaag ggcggcggcg gtggtggtgg ctccggaggc 360

ggcggctctg gtggcggtgg cagcgctgag tccaaatatg gtcccccatg cccaccctgc 420

ccagcacctg aggccgccgg gggaccatca gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac 480

actctcatga tctcccggac ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa 540

gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 600

aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 660

caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg 720

tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac 780

accctgcccc catcccagga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 840

aaaggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaaa gcaatgggca gccggagaac 900

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg 960

ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1020

gaggctctgc acaaccacta cacacagaag agcctctccc tgtctctggg ttgataagcg 1080

gccgc 1085

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶向外显子5的sgRNA序列

<400> 31

gcgcccacac cacagtaata 20

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶向外显子2的正向寡核苷酸链

<400> 32

caccggcttg gactttctca ccct 24

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶向外显子2的反向寡核苷酸链

<400> 33

aaacagggtg agaaagtcca agcc 24

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶向外显子6的正向寡核苷酸链

<400> 34

caccgtagca ccaaggccat gcggg 25

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶向外显子6的反向寡核苷酸链

<400> 35

aaaccccgca tggccttggt gctac 25

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶向外显子5的正向寡核苷酸链

<400> 36

caccgcgccc acaccacagt aata 24

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶向外显子5的反向寡核苷酸链

<400> 37

aaactattac tgtggtgtgg gcgc 24

Claims

1.一种利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除GS基因的CHO细胞株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）针对CHO细胞GS基因的编码序列，设计合成得到内切酶Cas9引导序列sgRNA；

（2）将步骤（1）得到的sgRNA克隆至基因编辑载体中，得到同时表达sgRNA和内切酶Cas9的基因编辑载体；

（3）将同时表达sgRNA和内切酶Cas9的基因编辑载体转染CHO细胞，加入嘌呤霉素进行筛选；嘌呤霉素的用量按其在细胞培养体系中的终浓度为2～7.5 µg /ml计，筛选时间为3～5天；

（4）将存活的细胞进行分离，获得单克隆细胞，静置培养，得到单克隆细胞株；

（5）将扩大培养的单克隆细胞株进行GS缺陷功能鉴定：将同一株单克隆细胞株中的一部分置于含有L-谷氨酰胺的培养基中培养，将一部分置于不含有L-谷氨酰胺的培养基中培养；在含有L-谷氨酰胺的培养基中能存活，但在不含L-谷氨酰胺的培养基中不能存活的细胞株，即为GS功能缺陷的CHO细胞株，简称为CHO GS-/-细胞株；

（6）将得到的CHO GS-/-细胞株进一步筛选获得不含嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及sgRNA序列整合的CHO GS-/-细胞株，具体操作为：

（A）将同一株CHO GS-/-单克隆细胞株分别置于含有嘌呤霉素和不含有嘌呤霉素的培养基中培养；在含有嘌呤霉素的培养基中不能存活的细胞株，即为不含嘌呤霉素抗性的CHOGS-/-单克隆细胞株；

（B）提取CHO GS-/-单克隆细胞株基因组DNA，PCR扩增Cas9基因序列和sgRNA序列，分析扩增产物；无法扩增出理论长度片段的细胞株，即为无Cas9基因及sgRNA序列整合的CHOGS-/-细胞株；

将步骤（A）和（B）的结果结合起来，筛选到不含嘌呤霉素抗性，无Cas9基因及sgRNA序列整合的CHO GS-/-细胞株。

2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除GS基因的CHO细胞株的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的sgRNA为特异性靶向GS基因第二外显子的sgRNA和特异性靶向GS基因第六外显子的sgRNA中的一种或两种。

3.根据权利要求2所述的利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除GS基因的CHO细胞株的制备方法，其特征在于：

所述的特异性靶向GS基因第二外显子的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

4.根据权利要求1～3任一项所述的利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除GS基因的CHO细胞株的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的基因编辑载体为lentiCRISPRv2、PX459或LentiCrispr-E；

步骤（3）中所述的CHO细胞为CHO-K1细胞株或CHO-S细胞株；

步骤（3）中所述的转染的方法为电击转染法、脂质体转染法、PEI转染法或磷酸钙转染法；

步骤（3）中所述的加入嘌呤霉素的时间为转染后24～72小时；

步骤（4）中所述的分离获得单克隆细胞株的方法包括但不限于有限稀释法、流式分选法以及半固体培养基分离法；

步骤（4）中所述的有限稀释法中的铺板细胞密度为0.3～0.5个细胞/孔；

步骤（4）中所述的静置培养的时间为12～14天；

步骤（6）（A）中所述的嘌呤霉素的用量按其在细胞培养体系中的浓度为2 µg /ml计；

步骤（6）（A）中所述的培养的时间为7天；

步骤（6）（B）中所述的Cas9的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.14所示序列；

步骤（6）（B）中所述的sgRNA的PCR扩增引物序列为SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.17所示序列；

步骤（3）、步骤（5）和步骤（6）中所用到的细胞培养基为CD培养基。

5.根据权利要求4所述的利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除GS基因的CHO细胞株的制备方法，其特征在于：

所述的CD培养基为CD FortiCHO培养基、CD OptiCHO培养基或CDM4CHO培养基。

6.权利要求1～5任一项所述的利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除GS基因的CHO细胞株的制备方法在制备敲除GS基因的CHO细胞株中的应用。