KR20180103923A - 혈색소병증의 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

혈색소병증의 치료를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20180103923A
KR20180103923A KR1020187021444A KR20187021444A KR20180103923A KR 20180103923 A KR20180103923 A KR 20180103923A KR 1020187021444 A KR1020187021444 A KR 1020187021444A KR 20187021444 A KR20187021444 A KR 20187021444A KR 20180103923 A KR20180103923 A KR 20180103923A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
grna molecule
grna
cell
molecule
Prior art date
Application number
KR1020187021444A
Other languages
English (en)
Inventor
앤소니 에드워드 보이타노
마이클 쿠크
로이드 비. 클릭스타인
레이날드 레스카보
크레이그 스티븐 미카닌
카번고 물룸바
세시다르 레디 폴리스
제니퍼 스니드
수잔 씨. 스티븐슨
모라그 스튜어트
이 양
Original Assignee
노파르티스 아게
인텔리아 테라퓨틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노파르티스 아게, 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. filed Critical 노파르티스 아게
Publication of KR20180103923A publication Critical patent/KR20180103923A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 혈색소병증(hemoglobinopathies) 치료를 위한 게놈 편집 시스템, 시약 및 방법에 관한 것이다.

Description

혈색소병증의 치료를 위한 조성물 및 방법
관련 출원
본 출원은 2015년 12월 28일에 출원된 U.S. 가출원 번호 제62/271,968호, 및 2016년 6월 8일에 출원된 U.S. 가출원 번호 제62/347,484호의 우선권 이익을 주장한다. 이들 출원의 전 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, 주기적 간격으로 분포하고 짧은 회문 구조의 반복서열)은 바이러스 공격에 대하여 방어하기 위한 적응 면역 시스템으로서 박테리아에서 진화했다. 바이러스에 노출 시, 바이러스 DNA의 짧은 부분이 박테리아 게놈의 CRISPR 유전자좌 내로 통합된다. RNA는 바이러스 서열을 포함하는 CRISPR 유전자좌 일부분으로부터 전사된다. 바이러스 게놈에 상보적인 서열을 함유하는 RNA는 바이러스 게놈 내의 서열로의 Cas9 단백질의 표적화를 매개한다. Cas9 단백질은 바이러스 표적을 절단하여 침묵시킨다.
최근, CRISPR/Cas 시스템은 진핵 세포에서 게놈 편집을 위해 조정되었다. 부위-특이적 단일(SSB) 또는 이중 가닥 단절(DSB)의 도입은, 예를 들어 비상동 말단-접합(non-homologous end-joining, NHEJ) 또는 상동 지시된 수선(homology-directed repair, HDR)을 통한 표적 서열 변경을 가능하게 한다.
이론에 얽매이지 않고, 본 발명은 CRISPR 시스템, 예를 들어 본원에 기재된 Cas9 CRISPR 시스템과 같은 시스템이 세포(예를 들어 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC))를 태아 헤모글로빈(HbF) 발현 증가 및/또는 베타 글로빈(예를 들어 질병 야기 돌연변이를 갖는 베타 글로빈 유전자) 발현 감소하도록 변형시키는 데 사용될 수 있고, 이러한 세포가 예를 들어 겸상 적혈구 질병 및 베타 탈라세미아(thalassemia)의 혈색소병증을 치료하는 데 사용될 수 있다는 발견에 부분적으로 기반한다.
따라서, 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의, 예를 들어 하나의 gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 Cas CRISPR 시스템, 예를 들어 Cas9 CRISPR 시스템, 예를 들어 S. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 CRISPR 시스템)을 제공한다. 본원에 기재된 임의의 gRNA 분자는 이러한 시스템, 및 본원에 기재된 방법 및 세포에 사용될 수 있다.
양태에서, 본 발명은 tracr 및 crRNA를 포함하는 gRNA 분자를 제공하며, crRNA는 BCL11A 유전자, BCL11a 인핸서, 또는 HFPH 영역의 표적 서열과 상보적인 표적화 도메인을 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 BCL11A 유전자의 표적 서열과 상보적인, 예를 들어 BCL11a 코딩 영역 내(예를 들어 BCL11a 엑손 내, 예를 들어 BCL11a 엑손 2 내)의 표적 서열과 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 제공한다. 구현예에서, gRNA는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 85 또는 SEQ ID NO: 400 내지 SEQ ID NO: 1231 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 표적화 도메인을 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 BCL11A 인핸서의 표적 서열과 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 제공한다.
구현예에서, gRNA는 SEQ ID NO: 1232 내지 SEQ ID NO: 1499 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 표적화 도메인을 포함한다.
구현예에서, BCL11a 인핸서의 표적 서열에 대한 gRNA는 BCL11a 인핸서의 +58 영역 내의 표적 서열에 대한 것이고, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 182 내지 SEQ ID NO: 277 또는 SEQ ID NO: 334 내지 SEQ ID NO: 341 중 어느 하나를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 336 또는 SEQ ID NO: 337중 어느 하나를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 248을 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 247을 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 245를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 336을 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 337을 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 338을 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 335를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 252를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, gRNA는 예를 들어 5'에서 3'으로, SEQ ID NO: 248-SEQ ID NO: 6607을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 예를 들어 5'에서 3'으로, SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracrRNA를 포함하는 dgRNA이다. 구현예에서, gRNA는 예를 들어 5'에서 3'으로, SEQ ID NO: 247-SEQ ID NO: 6607을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 예를 들어 5'에서 3'으로, SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracrRNA를 포함하는 dgRNA이다. 구현예에서, gRNA 분자는 sgRNA 분자이고, 예를 들어 5'에서 3'으로, SEQ ID NO: 338-SEQ ID NO: 6604-UUUU를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, gRNA 분자는 sgRNA 분자이고, 예를 들어 5'에서 3'으로, SEQ ID NO: 335-SEQ ID NO: 6604-UUUU를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, gRNA 분자는 sgRNA 분자이고, 예를 들어 5'에서 3'으로, SEQ ID NO: 336-SEQ ID NO: 6604-UUUU를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, gRNA 분자는 sgRNA 분자이고, 예를 들어 5'에서 3'으로, SEQ ID NO: 245-SEQ ID NO: 6604-UUUU를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, gRNA 분자는 sgRNA 분자이고, 예를 들어 5'에서 3'으로, SEQ ID NO: 337-SEQ ID NO: 6604-UUUU를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, gRNA 분자는 sgRNA 분자이고, 예를 들어 5'에서 3'으로, SEQ ID NO: 252-SEQ ID NO: 6604-UUUU를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, BCL11a 인핸서의 표적 서열에 대한 gRNA는 BCL11a 인핸서의 +62 영역 내의 표적 서열에 대한 것이고, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 278 내지SEQ ID NO: 333 중 어느 하나를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 289 또는 SEQ ID NO: 281 중 어느 하나를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 318을 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, BCL11a 인핸서의 표적 서열에 대한 gRNA는 BCL11a 인핸서의 +55 영역 내의 표적 서열에 대한 것이고, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 1596 내지SEQ ID NO: 1691 중 어느 하나를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 1683, SEQ ID NO: 1638, SEQ ID NO: 1647, SEQ ID NO: 1609, SEQ ID NO: 1621, SEQ ID NO: 1617, SEQ ID NO: 1654, SEQ ID NO: 1631, SEQ ID NO: 1620, SEQ ID NO: 1637, SEQ ID NO: 1612, SEQ ID NO: 1656, SEQ ID NO: 1619, SEQ ID NO: 1675, SEQ ID NO: 1645, SEQ ID NO: 1598, SEQ ID NO: 1599, SEQ ID NO: 1663, SEQ ID NO: 1677 또는 SEQ ID NO: 1626 중 어느 하나를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다.
또다른 양태에서, 본 발명은 유전성 태아 헤모글로빈 지속(hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH) 영역의 표적 서열과 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 제공한다. 구현예에서, HPFH 영역은 프렌치(French) HPFH 영역이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 86 내지 SEQ ID NO: 181 또는 SEQ ID NO: 1500 내지 SEQ ID NO: 1595중 어느 하나를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 1580, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 1503, SEQ ID NO: 1589, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 1537, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 1536, SEQ ID NO: 1539, SEQ ID NO: 1585 중 어느 하나를 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 100을 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 165을 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 113을 포함하며, 예를 들어 이로 구성된다.
전술한 구현예 중 임의의 것에서, gRNA 분자는 본원에 기재된 영역 및/또는 특성을 추가로 가질 수 있다. 양태에서, gRNA 분자(예를 들어 전술한 양태 또는 구현예 중 임의의)는 열거된 표적화 도메인 서열 중 어느 하나의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속적 핵산을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 열거된 표적화 도메인 서열 중 어느 하나의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 3' 말단에 배치된17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속적 핵산이다. 구현예에서, 열거된 표적화 도메인 서열 중 어느 하나의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 5' 말단에 배치된 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속적 핵산이다. 구현예에서, 열거된 표적화 도메인 서열 중 어느 하나의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 5' 또는 3' 핵산 중 어느 것도 포함하지 않는다. 전술한 양태 또는 구현예 중 임의의 것에서, 표적화 도메인은 열거된 표적화 도메인 서열로 구성될 수 있다.
전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 gRNA 분자의 구현예에서, 표적화 도메인은 열거된 표적화 도메인 서열 중 어느 하나의 17, 18, 19, 20, 21(참조 서열에 존재한다면), 22(참조 서열에 존재한다면), 23(참조 서열에 존재한다면), 24(참조 서열에 존재한다면), 또는 25(참조 서열에 존재한다면) 개의 연속적 핵산을 포함한다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 gRNA 분자의 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 열거된 표적화 도메인 서열 중 어느 하나의 17, 18, 19, 20, 21(참조 서열에 존재한다면), 22(참조 서열에 존재한다면), 23(참조 서열에 존재한다면), 또는 24(참조 서열에 존재한다면), 또는 25(참조 서열에 존재한다면) 개의 연속적 핵산으로 구성된다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 gRNA 분자의 구현예에서, 열거된 표적화 도메인 서열 중 어느 하나의 17, 18, 19, 20, 21(참조 서열에 존재한다면), 22(참조 서열에 존재한다면), 23(참조 서열에 존재한다면), 또는 24(참조 서열에 존재한다면), 또는 25(참조 서열에 존재한다면) 개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 3' 말단에 배치된17, 18, 19, 20, 21(참조 서열에 존재한다면), 22(참조 서열에 존재한다면), 23(참조 서열에 존재한다면), 또는 24(참조 서열에 존재한다면), 또는 25(참조 서열에 존재한다면) 개의 연속적 핵산이다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 gRNA 분자의 다른 구현예에서, 열거된 표적화 도메인 서열 중 어느 하나의 17, 18, 19, 20, 21(참조 서열에 존재한다면), 22(참조 서열에 존재한다면), 23(참조 서열에 존재한다면), 또는 24(참조 서열에 존재한다면), 또는 25(참조 서열에 존재한다면) 개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 5' 말단에 배치된17, 18, 19, 20, 21(참조 서열에 존재한다면), 22(참조 서열에 존재한다면), 23(참조 서열에 존재한다면), 또는 24(참조 서열에 존재한다면), 또는 25(참조 서열에 존재한다면) 개의 연속적 핵산이다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 gRNA 분자의 다른 구현예에서, 열거된 표적화 도메인 서열 중 어느 하나의 17, 18, 19, 20, 21(참조 서열에 존재한다면), 22(참조 서열에 존재한다면), 23(참조 서열에 존재한다면), 또는 24(참조 서열에 존재한다면), 또는 25(참조 서열에 존재한다면) 개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 5' 또는 3' 핵산 중 어느 것도 포함하지 않는다.
전술한 양태 또는 구현예 중 임의의 것을 포함하는 양태에서, gRNA 분자는 플래그폴(flagpole)을 형성하도록 혼성화되는 crRNA의 일부분 및 tracr의 일부분을 포함하며, SEQ ID NO: 6584 또는 6585를 포함한다. 구현예에서, 플래그폴은 플래그폴의 crRNA 부분에 대해 3'에 위치하는 제1 플래그폴 연장을 추가로 포함하며, 상기 제1 플래그폴 연장은 SEQ ID NO: 6586을 포함한다. 구현예에서, 플래그폴은 플래그폴의 crRNA 부분에 대해 3'에 위치하는 제2 플래그폴 연장 및, 존재하는 경우, 제1 플래그폴 연장을 추가로 포함하며, 상기 제2 플래그폴 연장은 SEQ ID NO: 6587을 포함한다.
전술한 양태 또는 구현예 중 임의의 것을 포함하는 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 6660 또는 SEQ ID NO: 6661을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는 gRNA 분자를 제공한다. 구현예에서, 플래그폴의 crRNA 부분은 SEQ ID NO: 6607 또는 SEQ ID NO: 6608을 포함한다.
전술한 양태 또는 구현예 중 임의의 것을 포함하는 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 6589 또는 6590을 포함하는 tracr, 및 선택적으로, 제1 플래그폴 연장이 존재하는 경우, SEQ ID NO: 6589 또는 6590에 대해 5'에 배치되는 제1 tracr 연장을 포함하는 gRNA 분자를 제공하며, 제1 tracr 연장은 SEQ ID NO: 6591을 포함한다.
전술한 양태 또는 구현예 중 임의의 것을 포함하는 양태에서, 본 발명은 표적화 도메인 및 tracr이 별개의 핵산 분자(예를 들어 dgRNA 분자) 상에 배치되는 gRNA 분자를 제공한다.
전술한 양태 또는 구현예 중 임의의 것을 포함하는 양태에서, 본 발명은 표적화 도메인 및 tracr이 단일 핵산 분자(예를 들어 sgRNA 분자) 상에 배치되고, tracr이 표적화 도메인에 대해 3'에 배치되는 gRNA 분자를 제공한다. 구현예에서, sgRNA 분자는 표적화 도메인에 대해 3' 및 tracr에 대해 5'에 배치되는 루프, 예를 들어 SEQ ID NO: 6588을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 루프를 포함한다.
전술한 양태 또는 구현예 중 임의의 것을 포함하는 양태에서, 본 발명은 5'에서 3'으로, [표적화 도메인]-:
(a) SEQ ID NO: 6601;
(b) SEQ ID NO: 6602;
(c) SEQ ID NO: 6603;
(d) SEQ ID NO: 6604; 또는
(e) 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 우라실(U) 뉴클레오티드, 예를 들어 4 우라실 뉴클레오티드를 3' 말단에 추가로 포함하는, 상기 (a) 내지 (d) 중 임의의 것을 포함하는 gRNA 분자를 제공한다. 구현예에서, 표적화 도메인과 (a) 내지 (e) 중 임의의 서열 사이에 개재 뉴클레오티드가 존재하지 않는다.
또다른 양태에서, 본 발명은 전술한 양태 및 구현예 중 어느 하나 이상, 예를 들어 하나의 gRNA 분자를 포함하는, CRISPR 시스템, 예를 들어 Cas CRISPR 시스템, 예를 들어 Cas9 CRISPR 시스템, 예를 들어 S. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 CRISPR 시스템을 제공한다. 양태에서, 본 발명은 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 제1 gRNA 분자를 포함하고, Cas9 분자를 추가로 포함하는 조성물을 제공한다. 구현예에서, Cas9 분자는 활성 또는 불활성 s. 피오게네스 Cas9이다. 구현예에서, 제1 gRNA 분자 및 Cas9 분자는 리보핵산 단백질 복합체(RNP)로 존재한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 하나를 초과하는 gRNA, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자, 예를 들어 전술한 gRNA 분자 양태 또는 구현예 중 어느 하나를 초과하는 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 제2 gRNA 분자; 제2 gRNA 분자 및 제3 gRNA 분자; 또는 제2 gRNA 분자, 제3 gRNA 분자, 및 제4 gRNA 분자를 추가로 포함하는, 전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 조성물을 제공하며, 제2 gRNA 분자, 제3 gRNA 분자(존재하는 경우), 및 제4 gRNA 분자(존재하는 경우)는 본원에 기재된 gRNA 분자, 예를 들어 전술한 gRNA 분자 양태 또는 구현예 중 임의의 gRNA 분자이다. 구현예에서, 조성물의 각각의 gRNA 분자는 상이한 표적 서열에 상보적이다. 구현예에서, 각각의 gRNA 분자는 동일한 유전자 또는 영역 내의 표적 서열에 상보적이다. 양태에서, 제1 gRNA 분자, 제2 gRNA 분자, 제3 gRNA 분자(존재하는 경우) 및 제4 gRNA 분자(존재하는 경우)는 20000 뉴클레오티드 이하, 10000 뉴클레오티드 이하, 6000뉴클레오티드 이하, 5000 뉴클레오티드 이하, 4000 뉴클레오티드 이하, 1000 뉴클레오티드 이하, 500 뉴클레오티드 이하, 400 뉴클레오티드 이하, 300 뉴클레오티드 이하, 200 뉴클레오티드 이하, 100 뉴클레오티드 이하, 90 뉴클레오티드 이하, 80 뉴클레오티드 이하, 70 뉴클레오티드 이하 60 뉴클레오티드 이하, 50 뉴클레오티드 이하, 40 뉴클레오티드 이하, 30 뉴클레오티드 이하, 20 뉴클레오티드 이하, 10 뉴클레오티드 이하로 떨어진 표적 서열에 상보적이다. 또다른 양태에서, 조성물의 각각의 gRNA 분자는 상이한 유전자 또는 영역 내의 표적 서열에 상보적이다.
본 발명의 하나를 초과하는 gRNA 분자의 구체적이고 바람직한 조합이 본원에 기재되어 있다. 양태에서, 조성물은 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하며, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 상이한 표적 서열에 상보적이고:
(a) BCL11a 유전자에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되거나;
(b) +58 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되거나;
(c) +62 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되거나;
(d) +55 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되거나;
(e) HPFH 영역에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택된다.
양태에서, 조성물은 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하며, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 상이한 표적 서열에 상보적이고:
(a) 제1 gRNA 분자는 BCL11a 유전자에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고, 제2 gRNA 분자는 +58 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고;
(b) 제1 gRNA 분자는 BCL11a 유전자에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고, 제2 gRNA 분자는 +62 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고;
(c) 제1 gRNA 분자는 BCL11a 유전자에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고, 제2 gRNA 분자는 +55 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고;
(d) 제1 gRNA 분자는 BCL11a 유전자에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고, 제2 gRNA 분자는 HPFH 영역에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고;
(e) 제1 gRNA 분자는 +58 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고, 제2 gRNA 분자는 +62 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고;
(f) 제1 gRNA 분자는 +58 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고, 제2 gRNA 분자는 +55 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고;
(g) 제1 gRNA 분자는 +58 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고, 제2 gRNA 분자는 HPFH 영역에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고;
(h) 제1 gRNA 분자는 +62 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고, 제2 gRNA 분자는 +55 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고;
(i) 제1 gRNA 분자는 +62 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고, 제2 gRNA 분자는 HPFH 영역에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고;
(j) 제1 gRNA 분자는 +55 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되고, 제2 gRNA 분자는 HPFH 영역에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택된다.
또다른 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하는 조성물은:
(a) HPFH 영역에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되는 제1 gRNA 분자를 포함하며, 제2 gRNA 분자는 베타 글로빈 유전자의 표적 서열에 상보적인 표적화 도메인을 포함하거나;
(b) BCL11a 인핸서, 예를 들어 +58 BCL11a 인핸서, +55 BCL11a 인핸서 또는 +62 BCL11a 인핸서에 대한 본원에 기재된(예를 들어 상기) gRNA 분자들로부터 선택되는 제1 gRNA 분자를 포함하며, 제2 gRNA 분자는 베타 글로빈 유전자의 표적 서열에 상보적인 표적화 도메인을 포함한다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, 조성물은 조성물의 gRNA 성분에 대하여, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자로 구성될 수 있다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, 조성물은 전기천공에 적합한 매질 중에 제형화될 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 CRISPR 시스템의 gRNA 분자(들) 및/또는 Cas 분자들을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 핵산을 세포에 전달하는 것이 세포 내에서의 CRISPR 시스템의 발현을 유도할 것으로 생각된다. 양태에서, 본 발명은 이전의 gRNA 양태 및 구현예 중 어느 하나 이상의 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 gRNA 분자를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 구현예에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 II 또는 RNA 폴리머라제 III에 의해 인식되는 프로모터이다. 구현예에서, 프로모터는 U6 프로모터 또는 HI 프로모터이다.
추가의 양태에서, 핵산은 Cas9 분자를 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 구현예에서, 핵산은 Cas9 분자를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 구현예에서, 프로모터는 EF-1 프로모터, CMV IE 유전자 프로모터, EF-1α프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터 또는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터이다.
양태에서 본 발명은 이전의 핵산 양태 및 구현예 중 임의의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 구현예에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터, 플라스미드, 미니 서클, 나노플라스미드, 및 RNA 벡터로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 양태에서, 본 발명은, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전의 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의 것에서의, 하나 이상의 gRNA 분자, 및 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 gRNA 분자(예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의) 및 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 주형 핵산을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 조성물을 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 주형 핵산을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 조성물을 제공한다. 구현예에서, 주형 핵산은 gRNA 분자의 표적 서열의 뉴클레오티드에 상응하는 뉴클레오티드를 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 인간 베타 글로빈, 예를 들어 돌연변이 G16D, E22A 및 T87Q 중 하나 이상을 포함하는 인간 베타 글로빈을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 인간 감마 글로빈을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 gRNA 분자, CRISPR 시스템, 조성물 또는 핵산(예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것에서의)을 포함하는(또는 임의의 시간에 포함된) 세포를 제공한다. 이러한 양태에서, 본 발명은 이러한 포함에 의해 변형된 세포를 제공한다.
따라서, 양태에서, 본 발명은 상기 세포를:
1) 전술한 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 어느 하나 이상의 gRNA 분자, 및 Cas9 분자(예를 들어 본원에 기재된);
2) 전술한 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 어느 하나 이상의 gRNA 분자, 및 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산(예를 들어 본원에 기재된);
3) 전술한 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 어느 하나 이상의 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자(예를 들어 본원에 기재된);
4) 전술한 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 하나 이상의 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산(예를 들어 본원에 기재된); 또는
5) 상기 1) 내지 4) 중 임의의 것, 및 주형 핵산(예를 들어 본원에 기재된);
6) 상기 1) 내지 4) 중 임의의 것, 및 주형 핵산을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산(예를 들어 본원에 기재된);
7) 본원에 기재된 조성물(예를 들어 전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의); 또는
8) 전술한 벡터 양태 및 구현예 중 임의의 벡터; 와 접촉시키는 단계를 포함하는, 변경하는 방법, 예를 들어 세포의 핵산 내의 표적 서열의 구조, 예를 들어 서열을 변경하는 방법을 제공한다.
구현예에서, gRNA 분자 또는 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자 또는 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산은 단일 조성물로 제형화된다. 다른 구현예에서, gRNA 분자 또는 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자 또는 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산은 하나를 초과하는 조성물로 제형화된다. 구현예에서, 하나를 초과하는 조성물은 동시에 또는 순차적으로 전달된다.
구현예에서, 세포는 동물 세포이다. 구현예에서, 세포는 포유류, 영장류, 또는 인간 세포이다. 구현예에서, 세포는 조혈 줄기 또는 전구 세포(HSPC)(예를 들어 HSPC의 집단)이다. 구현예에서, 세포는 CD34+ 세포이다. 구현예에서, 세포는 CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA- 세포이다. 구현예에서, 세포는 CD34+/CD90+/CD49f+ 세포이다. 구현예에서, 세포는 CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA-/CD49f+ 세포이다. 구현예에서, 방법은HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포에 대해 부화(enrich)된 세포 집단을 포함한다.
구현예에서, 세포(예를 들어 세포 집단)는 골수로부터 단리되었다. 구현예에서, 세포(예를 들어 세포 집단)는 동원된 말초 혈액으로부터 단리되었다. 구현예에서, 세포(예를 들어 세포 집단)는 제대혈로부터 단리되었다.
구현예에서, 세포(예를 들어 세포 집단)는 상기 세포(예를 들어 세포 집단)를 투여할 환자에 대해 자가 유래이다. 구현예에서, 세포(예를 들어 세포 집단)는 상기 세포(예를 들어 세포 집단)를 투여할 환자에 대해 동종이계이다.
본원에 기재된 방법의 구현예에서, 변경은 세포에서 태아 헤모글로빈 발현의 증가를 야기한다. 본원에 기재된 방법의 구현예에서, 변경은 세포에서 태아 헤모글로빈 발현의 감소를 야기한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 방법에 의해 변경된 세포를 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 이전의 양태 및 구현예 중 임의의 제1 gRNA 분자(예를 들어 본원에 기재된) 또는 조성물(예를 들어 본원에 기재된) 또는 제1 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산(예를 들어 본원에 기재된)을 포함하는 세포를 제공한다. 구현예에서, 세포는 동물 세포이다. 구현예에서, 세포는 포유류, 영장류, 또는 인간 세포이다. 구현예에서, 세포는 조혈 줄기 또는 전구 세포(HSPC)(예를 들어 HSPC의 집단)이다. 구현예에서, 세포는 CD34+ 세포이다. 구현예에서, 세포는 CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA- 세포이다. 구현예에서, 세포는 CD34+/CD90+/CD49f+ 세포이다. 구현예에서, 방법은HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포에 대해 부화(enrich)된 세포 집단을 포함한다.
구현예에서, 세포(예를 들어 세포 집단)는 골수로부터 단리되었다. 구현예에서, 세포(예를 들어 세포 집단)는 동원된 말초 혈액으로부터 단리되었다. 구현예에서, 세포(예를 들어 세포 집단)는 제대혈로부터 단리되었다.
구현예에서, 세포(예를 들어 세포 집단)는 상기 세포(예를 들어 세포 집단)를 투여할 환자에 대해 자가 유래이다. 구현예에서, 세포(예를 들어 세포 집단)는 상기 세포(예를 들어 세포 집단)를 투여할 환자에 대해 동종이계이다.
구현예에서, 세포는, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전의 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의, 제2 gRNA 분자, 또는 제2 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 포함했거나, 포함할 것이며, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 동일하지 않은 표적화 도메인을 포함한다.
구현예에서, 태아 헤모글로빈의 발현은 세포에서, 예를 들어 gRNA 분자(예를 들어 본원에 기재된)를 포함하도록 변형되지 않은 동일한 세포 유형의 세포에 비하여 증가된다. 구현예에서, 베타 글로빈의 발현은 세포에서, 예를 들어 gRNA 분자(예를 들어 본원에 기재된)를 포함하도록 변형되지 않은 동일한 세포 유형의 세포에 비하여 감소된다. 구현예에서, 세포에서, 예를 들어 gRNA 분자(예를 들어 본원에 기재된)를 포함하도록 변형되지 않은 동일한 세포 유형의 세포에 비해 태아 헤모글로빈의 발현은 증가되고 베타 글로빈의 발현은 감소된다.
양태에서, 본 발명의 세포(또는 세포를 포함하는 방법)는 예를 들어 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 4와 같은, 본원에 기재된 줄기 세포 확장제와 접촉되었다. 양태에서, 본 발명의 세포(또는 세포를 포함하는 방법)는 예를 들어 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 이의 조합(예를 들어 화합물 1 및 화합물 4)과 같은, 본원에 기재된 줄기 세포 확장제와 접촉되었다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 화합물 4이다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 화합물 1과 화합물 4의 조합이다. 구현예에서, 접촉은 생체외이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 치료 방법, 예를 들어 혈색소병증의 치료 방법을 제공한다. 양태에서, 본 발명은 이전의 세포 또는 방법 양태 및 구현예 중 임의의 세포(예를 들어 세포 집단)를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 혈색소병증을 치료하는 방법을 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 이전의 세포 또는 방법 양태 및 구현예 중 임의의 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 구현예에서, 혈색소병증은 베타-탈라세미아 또는 겸상 적혈구 질병이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 예를 들어 질병의 치료에 사용하기 위한, 약제로서 사용하기 위한, 예를 들어 본원에 기재된 가이드 RNA 분자를 제공한다. 구현예에서, 질병은 혈색소병증, 예를 들어 베타-탈라세미아 또는 겸상 적혈구 질병이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 전술한 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의 것에 기재된 gRNA분자를 제공하며, gRNA분자를 포함하는 CRISPR 시스템이 세포(예를 들어 CD34+ 세포, 예를 들어 HSC)에 도입될 때, 생산된 삽입결실의 적어도 약 15%는 변형되지 않은 표적 DNA에 비해, NGS에 의해 측정된 (a) 프레임쉬프트 돌연변이; 또는 (b) 큰 결실을 포함한다. 구현예에서, 생산된 삽입결실의 적어도 약 25%는 변형되지 않은 표적 DNA에 비해, NGS에 의해 측정된 (a) 프레임쉬프트 돌연변이; 또는 (b) 큰 결실을 포함한다. 구현예에서, 생산된 삽입결실의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%는 변형되지 않은 표적 DNA에 비해, NGS에 의해 측정된 (a) 프레임쉬프트 돌연변이; 또는 (b) 큰 결실을 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 HSPC(예를 들어 CD34+ 세포)의 생체외 확장 및 변형 방법을 제공한다. 양태에서, 본 발명은:
(a) 세포 집단을 제공하는 단계;
(b) 줄기 세포 확장제의 존재 하에 상기 세포를 생체외 확장시키는 단계; 및
(c) 제1 gRNA 분자(예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 전술한 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의), 제1 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산 분자 또는 조성물(예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 전술한 조성물 분자 양태 및 구현예 중 임의의)을 상기 세포 내로 도입시키는 단계를 포함하며,
단계 (c)를 거치지 않은 동일 세포 유형에 비해 상기 세포에서 헤모글로빈, 예를 들어 태아 헤모글로빈 발현이 증가되도록 하는, 세포(예를 들어 세포 집단)를 변형하는 방법을 제공한다.
구현예에서, 세포는 그것을 필요로 하는 대상체, 예를 들어 혈색소병증, 예를 들어 겸상 적혈구 질병 또는 베타 탈라세미아를 갖는 대상체로 도입된다.
구현예에서, 세포는 CD34+ 세포이거나 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 세포는 HSPC이거나 HSPC를 포함한다. 구현예에서, 세포는 골수, 동원된 말초 혈액 또는 제대혈로부터 단리된다. 바람직한 구현예에서, 세포는 골수로부터 단리된다. 다른 구현예에서, 세포는 동원된 말초 혈액으로부터 단리된다. 양태에서, 동원된 말초 혈액은 G-CSF를 투여한 대상체로부터 단리된다. 양태에서, 동원된 말초 혈액은 G-CSF 외의 동원 제제, 예를 들어 Plerixafor®(AMD3100)를 투여한 대상체로부터 단리된다. 구현예에서, 세포는 부화된 세포 집단이다.
구현예에서, 줄기 세포 확장제는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 4, 예를 들어 화합물 4이다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 이의 조합이다(예를 들어 화합물 1과 화합물 4의 조합). 구현예에서, 세포는 약 1 내지 약 200 마이크로 몰(μM)의 농도로 화합물 4와 접촉된다. 구현예에서, 화합물 4의 농도는 약 75 마이크로 몰(μM)이다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제의 존재 하에 상기 세포를 생체외 확장하는 것은 약 1 내지 10 일, 예를 들어 약 1 내지 5 일, 예를 들어 약 2 내지 5 일, 예를 들어 약 4 일의 기간 동안 일어난다.
구현예에서, 세포는 상기 세포를 투여할 것으로 의도된 환자에게 자가 유래이다. 구현예에서, 세포는 상기 세포를 투여할 것으로 의도된 환자에게 동종이계이다.
구현예에서, 단계 (b)의 확장은 추가로 트롬보포이에틴(Tpo), Flt3 리간드(Flt-3L), 인간 줄기 세포 인자(SCF) 및 인간 인터루킨-6(IL-6)의 존재 하에 있다. 구현예에서, 트롬보포이에틴(Tpo), Flt3 리간드(Flt-3L), 인간 줄기 세포 인자(SCF) 및 인간 인터루킨-6(IL-6)은 각각 약 50 ng/mL의 농도이다. 구현예에서, 트롬보포이에틴(Tpo), Flt3 리간드(Flt-3L), 인간 줄기 세포 인자(SCF) 및 인간 인터루킨-6(IL-6)은 각각 50 ng/mL의 농도이다.
추가의 양태 및 구현예가 아래에 기재된다.
양태에서, 본 발명은 tracr 및 crRNA를 포함하는 gRNA 분자를 제공하며, crRNA는 BCL11A 유전자(예를 들어 인간 BCL11a 유전자), BCL11a 인핸서(예를 들어 인간 BCL11a 인핸서), 또는 HFPH 영역(예를 들어 인간 HPFH 영역)의 표적 서열과 상보적인 표적화 도메인을 포함한다.
구현예에서, 표적 서열은 BCL11A 유전자의 것이고, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 85 또는 SEQ ID NO: 400 내지 SEQ ID NO: 1231 중 어느 하나를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다. 이들 구현예는 gRNA 분자 구현예 2로 본원에서 지칭된다.
다른 구현예에서, 표적 서열은 BCL11a 인핸서의 것이고, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 1232 내지 SEQ ID NO: 1499 중 어느 하나를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다. 이들 구현예는 gRNA 분자 구현예 3으로 본원에서 지칭된다. 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 BCL11a 인핸서의 것이고, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 182 내지 SEQ ID NO: 277 또는 SEQ ID NO: 334 내지 SEQ ID NO: 341 중 어느 하나를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다. 이들 구현예는 gRNA 분자 구현예 4로 본원에서 지칭된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 336 또는 SEQ ID NO: 337중 어느 하나를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다. 이들 구현예는 본원에서 gRNA 분자 구현예 5로 지칭된다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 337 또는 SEQ ID NO: 338 중 어느 하나를 포함하고, 예를 들어 이로 구성되며(본원에서 gRNA 분자 구현예 6으로 지칭됨), 예를 들어 SEQ ID NO: 248 또는 SEQ ID NO: 338중 어느 하나를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다(본원에서 gRNA 분자 구현예 7로 지칭됨). 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 248을 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다(본원에서 gRNA 분자 구현예 8로 지칭됨). 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 338을 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다(본원에서 gRNA 분자 구현예 9로 지칭됨).
다른 구현예에서, 표적 서열은 BCL11a 인핸서의 것이고, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 278 내지 SEQ ID NO: 333중 어느 하나를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다(본원에서 gRNA 분자 구현예 10으로 지칭됨). 바람직한 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 289, 또는 SEQ ID NO: 281중 어느 하나를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다(본원에서 gRNA 분자 구현예 11로 지칭됨). 일 바람직한 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 318을 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다(본원에서 gRNA 분자 구현예 12로 지칭됨).
다른 구현예에서, 표적 서열은 BCL11a 인핸서의 것이고, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 1596 내지 SEQ ID NO: 1691중 어느 하나를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다(본원에서 gRNA 분자 구현예 13으로 지칭됨). 바람직한 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 1683, SEQ ID NO: 1638, SEQ ID NO: 1647, SEQ ID NO: 1609, SEQ ID NO: 1621, SEQ ID NO: 1617, SEQ ID NO: 1654, SEQ ID NO: 1631, SEQ ID NO: 1620, SEQ ID NO: 1637, SEQ ID NO: 1612, SEQ ID NO: 1656, SEQ ID NO: 1619, SEQ ID NO: 1675, SEQ ID NO: 1645, SEQ ID NO: 1598, SEQ ID NO: 1599, SEQ ID NO: 1663, SEQ ID NO: 1677 또는 SEQ ID NO: 1626중 어느 하나를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다(본원에서 gRNA 분자 구현예 14로 지칭됨).
다른 구현예에서, 표적 서열은 HFPH 영역(예를 들어 프렌치 HPFH 영역)의 것이고, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 86 내지 SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 1500 내지 SEQ ID NO: 1595 또는 SEQ ID NO: 1692 내지 SEQ ID NO: 1761중 어느 하나를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다(본원에서 gRNA 분자 구현예 15로 지칭됨). 바람직한 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 1580, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 1503, SEQ ID NO: 1589, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 1537, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 1536, SEQ ID NO: 1539, SEQ ID NO: 1585중 어느 하나를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다(본원에서 gRNA 분자 구현예 16으로 지칭됨). 더욱 더 바람직한 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 1505, SEQ ID NO: 1589, SEQ ID NO: 1700, 또는 SEQ ID NO: 1750 중 어느 하나를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다(본원에서 gRNA 분자 구현예 17로 지칭됨). 다른 바람직한 구현예에서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 165 또는 SEQ ID NO: 113중 어느 하나를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다(본원에서 gRNA 분자 구현예 18로 지칭됨).
구현예에서, gRNA 분자는 본원에 기재된 임의의 표적화 도메인 서열, 예를 들어 표 1 또는 표 2의 표적화 도메인 서열의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24, 바람직하게는 20개의 연속적 핵산을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 본원에 기재된 어느 하나의 표적화 도메인 서열, 예를 들어 표 1 또는 표 2의 표적화 도메인 서열의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24, 바람직하게는 20개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 3' 말단에 배치된17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24, 바람직하게는 20개의 연속적 핵산이다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 어느 하나의 표적화 도메인 서열, 예를 들어 표 1 또는 표 2의 표적화 도메인 서열의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24, 바람직하게는 20개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 5' 말단에 배치된 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24, 바람직하게는 20개의 연속적 핵산이다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 어느 하나의 표적화 도메인 서열, 예를 들어 표 1 또는 표 2의 표적화 도메인 서열의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24, 바람직하게는 20개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 5' 또는 3'핵산 중 어느 것도 포함하지 않는다.
구현예에서, gRNA 분자는 본원에 기재된 임의의 표적화 도메인 서열, 예를 들어 표 5, 표 6, 표 7, 표 8 또는 표 9의 표적화 도메인 서열의 17, 18, 19, 20, 바람직하게는 20개의 연속적 핵산을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 본원에 기재된 어느 하나의 표적화 도메인 서열, 예를 들어 표 5, 표 6, 표 7, 표 8 또는 표 9의 표적화 도메인 서열의17, 18, 19, 20, 바람직하게는 20개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 3' 말단에 배치된 17, 18, 19, 20, 바람직하게는 20개의 연속적 핵산이다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 어느 하나의 표적화 도메인 서열, 예를 들어 표 5, 표 6, 표 7, 표 8 또는 표 9의 표적화 도메인 서열의 17, 18, 19, 20, 바람직하게는 20개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 5' 말단에 배치된 17, 18, 19, 20, 바람직하게는 20개의 연속적 핵산이다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 어느 하나의 표적화 도메인 서열, 예를 들어 표 5, 표 6, 표 7, 표 8 또는 표 9의 표적화 도메인 서열의 17, 18, 19, 20, 바람직하게는 20개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 5' 또는 3' 핵산 중 어느 것도 포함하지 않는다.
다음의 양태는 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것과 조합될 수 있는 gRNA 분자의 특징을 기재한다. 구현예에서, 전술한 양태 및 구현예 중 임의의gRNA 분자를 포함하는 gRNA 분자는 SEQ ID NO: 6584 또는 6585를 포함하는 플래그폴을 형성하도록 혼성화되는 crRNA의 일부분 및 tracr 의 일부분을 포함한다. 구현예에서, 플래그폴은 플래그폴의 crRNA 부분에 대해 3'에 위치하는 제1 플래그폴 연장을 추가로 포함하며, 상기 제1 플래그폴 연장은 SEQ ID NO: 6586을 포함한다. 구현예에서, 플래그폴은 (제1플래그폴 연장에 추가적으로 또는 대체하여) 플래그폴의 crRNA 부분에 대해 3'에 위치하는 제2 플래그폴 연장 및, 존재하는 경우, 제1 플래그폴 연장을 추가로 포함하며, 상기 제2 플래그폴 연장은 SEQ ID NO: 6587을 포함한다.
전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, tracr은 SEQ ID NO: 6660 또는 SEQ ID NO: 6661을 포함한다. 구현예에서, tracr은 SEQ ID NO: 7812를 포함하며, 선택적으로 3' 말단에, 추가적인 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 우라실(U) 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 구현예에서, crRNA는 5'에서 3'으로, [표적화 도메인]-: a) SEQ ID NO: 6584; b) SEQ ID NO: 6585; c) SEQ ID NO: 6605; d) SEQ ID NO: 6606; e) SEQ ID NO: 6607; f) SEQ ID NO: 6608; 또는 g) SEQ ID NO: 7806을 포함한다.
전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, tracr은 5'에서 3'으로: a) SEQ ID NO: 6589; b) SEQ ID NO: 6590; c) SEQ ID NO: 6609; d) SEQ ID NO: 6610; e) SEQ ID NO: 6660; f) SEQ ID NO: 6661; g) SEQ ID NO: 7812; h) SEQ ID NO: 7807; i) SEQ ID NO: 7808; j) SEQ ID NO: 7809; k) 3' 말단에, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 우라실(U) 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 우라실(U) 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 상기 a) 내지 j) 중 임의의 것; l) 3' 말단에, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 상기 a) 내지 k) 중 임의의 것; 또는 m) 5' 말단에(예를 들어 5'말단(terminus)에), 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 상기 a) 내지 l) 중 임의의 것을 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인 및 tracr은 별개의 핵산 분자 상에 배치된다. 이러한 gRNA 분자의 구현예에서, 표적화 도메인을 포함하는 핵산 분자는SEQ ID NO: 6607을 포함하며, 선택적으로 표적화 도메인에 대해 3' 바로 옆에 배치되고, tracr을 포함하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 6660을 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, 플래그폴의 crRNA 부분은 SEQ ID NO: 6607 또는 SEQ ID NO: 6608을 포함한다.
구현예에서, tracr은 SEQ ID NO: 6589 또는 6590을 포함하고, 선택적으로 제1 플래그폴 연장이 존재하는 경우, SEQ ID NO: 6589 또는 6590에 대해 5'에 배치되는 제1 tracr 연장을 포함하며, 상기 제1 tracr 연장은 SEQ ID NO: 6591을 포함한다.
전술한 양태 및 구현예 중 임의의 구현예를 포함하는 구현예에서, 표적화 도메인 및 tracr은 별개의 핵산 분자 상에 배치된다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 구현예를 포함하는 다른 구현예에서, 표적화 도메인 및 tracr은 단일 핵산 분자 상에 배치되고, 예를 들어 tracr은 표적화 도메인에 대해 3'에 배치된다.
구현예에서, 표적화 도메인 및 tracr이 단일 핵산 분자 상에 배치되는 경우, gRNA 분자는 표적화 도메인에 대해 3' 및 tracr에 대해 5'에 배치된 루프를 추가로 포함한다. 구현예에서, 루프는, SEQ ID NO: 6588을 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, 표적화 도메인 및 tracr이 단일 핵산 분자 상에 배치되는 경우, gRNA 분자는 5'에서 3'으로, [표적화 도메인]-: (a) SEQ ID NO: 6601; (b) SEQ ID NO: 6602; (c) SEQ ID NO: 6603; (d) SEQ ID NO: 6604; (e) SEQ ID NO: 7811; 또는 (f) 3' 말단에, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 우라실(U) 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 상기 a) 내지 e) 중 임의의 것을 포함한다. 구현예에서, gRNA 분자는 상기 표적화 도메인 및, 선택적으로, 상기 표적화 도메인에 대해 3' 바로 옆에 배치된, SEQ ID NO: 7811을 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, gRNA 분자의 핵산 잔기 각각은 변형되지 않은 A, U, G 또는 C 핵산 잔기이고, 핵산 분자(들)의 각각의 잔기 사이의 변형되지 않은 포스페이트 결합이다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 다른 구현예에서, gRNA 분자를 구성하는 하나의, 또는 선택적으로 하나를 초과하는 핵산 분자는 a) 상기 핵산 분자 또는 분자들의 3' 말단에 하나 이상의, 예를 들어 3개의 포스포로티오에이트 변형; b) 상기 핵산 분자 또는 분자들의 5' 말단에 하나 이상의, 예를 들어 3개의 포스포로티오에이트 변형; c) 상기 핵산 분자 또는 분자들의 3' 말단에 하나 이상의, 예를 들어 3개의2'-O-메틸 변형; d) 상기 핵산 분자 또는 분자들의 5' 말단에 하나 이상의, 예를 들어 3개의2'-O-메틸 변형; e) 상기 핵산 분자 또는 분자들의 말단 방향으로 4 번째, 말단 방향으로 3 번째, 및 말단 방향으로 2 번째 3' 잔기 각각에 2' O-메틸 변형; f) 상기 핵산 분자 또는 분자들의 말단 방향으로 4 번째, 말단 방향으로 3 번째, 및 말단 방향으로 2 번째 5' 잔기 각각에 2' O-메틸 변형; 또는 f) 이의 임의의 조합을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 342; (b) SEQ ID NO: 343; 또는 (c) SEQ ID NO: 1762 의 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 sgRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 41로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 344를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (b) SEQ ID NO: 344를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (c) SEQ ID NO: 345를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (d) SEQ ID NO: 345를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 이중 gRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 42로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 347; (b) SEQ ID NO: 348; 또는 (c) SEQ ID NO: 1763 의 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 sgRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 43으로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 349를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (b) SEQ ID NO: 349를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (c) SEQ ID NO: 350를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (d) SEQ ID NO: 350을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 이중 gRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 44로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 351; (b) SEQ ID NO: 352; 또는 (c) SEQ ID NO: 1764 의 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 sgRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 45로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 353을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (b) SEQ ID NO: 353을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (c) SEQ ID NO: 354를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (d) SEQ ID NO: 354를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 이중 gRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 46으로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 355; (b) SEQ ID NO: 356; 또는 (c) SEQ ID NO: 1765 의 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 sgRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 47로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 357을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (b) SEQ ID NO: 357을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (c) SEQ ID NO: 358을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (d) SEQ ID NO: 358을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 이중 gRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 48으로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 359; (b) SEQ ID NO: 360; 또는 (c) SEQ ID NO: 1766 의 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 sgRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 49로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 361을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (b) SEQ ID NO: 361을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (c) SEQ ID NO: 362를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (d) SEQ ID NO: 362를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 이중 gRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 50으로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 363; (b) SEQ ID NO: 364; 또는 (c) SEQ ID NO: 1767 의 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 sgRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 51로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 365를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (b) SEQ ID NO: 365를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (c) SEQ ID NO: 366을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (d) SEQ ID NO: 366을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 이중 gRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 52로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 367; (b) SEQ ID NO: 368; 또는 (c) SEQ ID NO: 1768 의 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 sgRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 53으로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 369를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (b) SEQ ID NO: 369를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (c) SEQ ID NO: 370을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (d) SEQ ID NO: 370을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 이중 gRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 54로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 371; (b) SEQ ID NO: 372; 또는 (c) SEQ ID NO: 1769 의 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 sgRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 55로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 373을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (b) SEQ ID NO: 373을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (c) SEQ ID NO: 374를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (d) SEQ ID NO: 374를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 이중 gRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 56으로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 375; (b) SEQ ID NO: 376; 또는 (c) SEQ ID NO: 1770 의 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 sgRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 57로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 377을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (b) SEQ ID NO: 377을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (c) SEQ ID NO: 378을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (d) SEQ ID NO: 378을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 이중 gRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 58로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 379; (b) SEQ ID NO: 380; 또는 (c) SEQ ID NO: 1771 의 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 sgRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 59로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 381을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (b) SEQ ID NO: 381을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (c) SEQ ID NO: 382를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (d) SEQ ID NO: 382를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 이중 gRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 60으로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 383; (b) SEQ ID NO: 384; 또는 (c) SEQ ID NO: 1772 의 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 sgRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 61로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 385를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (b) SEQ ID NO: 385를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (c) SEQ ID NO: 386을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (d) SEQ ID NO: 386을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 이중 gRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 62로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 387; (b) SEQ ID NO: 388; 또는 (c) SEQ ID NO: 1773 의 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 sgRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 63으로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 389를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (b) SEQ ID NO: 389를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (c) SEQ ID NO: 390을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (d) SEQ ID NO: 390을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 이중 gRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 64로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 391; (b) SEQ ID NO: 392; 또는 (c) SEQ ID NO: 1774 의 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 sgRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 65로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 393을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (b) SEQ ID NO: 393을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (c) SEQ ID NO: 394를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (d) SEQ ID NO: 394를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 이중 gRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 66으로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 395; (b) SEQ ID NO: 396; 또는 (c) SEQ ID NO: 1775 의 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 sgRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 67로 지칭됨).
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 397을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (b) SEQ ID NO: 397을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (c) SEQ ID NO: 398을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; (d) SEQ ID NO: 398을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 gRNA 분자(예를 들어 이중 gRNA 분자)를 제공한다(본 발명의 개요에서 gRNA 분자 구현예 68로 지칭됨).
전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 gRNA 분자를 제공하며, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된 RNP)이 세포 내로 도입될 때, gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열에 또는 그 근처에 삽입결실이 형성된다. +58 인핸서 영역의 표적 서열에 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 구현예를 포함하는 구현예에서, 삽입결실은 GATA-1 및/또는 TAL-1 결합 부위의 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 구현예에서, 삽입결실은 GATA-1 및/또는 TAL-1의 그의 결합 부위에의 결합을 간섭하지 않는다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 gRNA 분자를 제공하며, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된RNP)이 세포 집단 내로 도입될 때, 집단 내 적어도 약 40%, 예를 들어 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 60%, 예를 들어 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 80%, 예를 들어 적어도 약 90%, 예를 들어 적어도 약 95%, 예를 들어 적어도 약 96%, 예를 들어 적어도 약 97%, 예를 들어 적어도 약 98%, 예를 들어 적어도 약 99%의 세포에서 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열에 또는 그 근처에 삽입결실이 형성된다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 gRNA 분자를 제공하며, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된RNP)이 세포 집단 내로 도입될 때, GATA-1 및/또는 TAL-1 결합 부위의 뉴클레오티드를 포함하지 않는 삽입결실은 집단 내 적어도 약 20%, 예를 들어 적어도 약 30%, 예를 들어 적어도 약 35%, 예를 들어 적어도 약 40%, 예를 들어 적어도 약 45%, 예를 들어 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 55%, 예를 들어 적어도 약 60%, 예를 들어 적어도 약 65%, 예를 들어 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 75%, 예를 들어 적어도 약 80%, 예를 들어 적어도 약 85%, 예를 들어 적어도 약 90%, 예를 들어 적어도 약 95%, 예를 들어 적어도 약 99%의 세포에서 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열에 또는 그 근처에 형성된다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 삽입결실은 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37 중 임의의 것에 나열된 삽입결실이다. 구현예에서, 집단 내 적어도 약 30%, 예를 들어 적어도 약 40%, 예를 들어 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 60%, 예를 들어 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 80%, 예를 들어 적어도 약 90%, 예를 들어 적어도 약 95%, 예를 들어 적어도 약 96%, 예를 들어 적어도 약 97%, 예를 들어 적어도 약 98%, 예를 들어 적어도 약 99%의 세포에서, 삽입결실은 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37중 임의의 것에 나열된 삽입결실이다. 구현예에서, 상기 세포 집단에서 3개의 가장 빈번하게 검출되는 삽입결실은 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37 중 임의의 것에 나열된 임의의 gRNA 분자와 관련된 삽입결실들이다. 구현예에서, 삽입결실(또는 상위 삽입결실의 패턴)은 예를 들어 당분야에 기재된 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 측정된 것이다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은gRNA 분자를 제공하며, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된 RNP)이 세포 내로 도입될 때, 예를 들어 차세대 시퀀싱 및/또는, 예를 들어 CD34+ 세포와 같은 HPCS 세포에서 검정되는, 뉴클레오티드 삽입 검정에 의해 검출 가능한 바와 같이, 표적-외 삽입결실은 상기 세포에서 형성되지 않는다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 gRNA 분자를 제공하며, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된 RNP)이 세포 집단에 도입될 때, 예를 들어 차세대 시퀀싱 및/또는, 예를 들어 CD34+ 세포와 같은 HPCS 세포에서 검정되는, 뉴클레오티드 삽입 검정에 의해 검출 가능한 바와 같이, 세포 집단 내 약 5% 초과, 예를 들어 약 1% 초과, 예를 들어 약 0.1% 초과, 예를 들어 약 0.01% 초과의 세포에서, 표적-외 삽입결실은 검출되지 않는다.
전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 gRNA 분자를 제공하며, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된 RNP)이 세포 내로 도입될 때, 태아 헤모글로빈의 발현은 상기 세포 또는 그의 자손, 예를 들어 그의 적혈구계 자손, 예를 들어 그의 적혈구 자손에서 증가된다. 구현예에서, 태아 헤모글로빈의 발현은 상기 세포 또는 그의 자손, 예를 들어 그의 적혈구계 자손, 예를 들어 그의 적혈구 자손에서, 적어도 약 20%, 예를 들어 적어도 약 30%, 예를 들어 약 40%, 예를 들어 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 60%, 예를 들어 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 80%, 예를 들어 적어도 약 90%, 예를 들어 적어도 약 95%, 예를 들어 적어도 약 96%, 예를 들어 적어도 약 97%, 예를 들어 적어도 약 98%, 예를 들어 적어도 약 99% 만큼 증가된다. 구현예에서, 상기 세포 또는 그의 자손, 예를 들어 그의 적혈구계 자손, 예를 들어 그의 적혈구 자손은 세포 당 적어도 약 6 피코그램(예를 들어 적어도 약 7 피코그램, 적어도 약 8 피코그램, 적어도 약 9 피코그램, 적어도 약 10 피코그램, 또는 약 8 내지 약 9 피코그램, 또는 약 9 내지 약 10 피코그램)의 태아 헤모글로빈을 생산한다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은gRNA 분자를 제공하며, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된 RNP)이 세포 내로 도입될 때, 태아 헤모글로빈(예를 들어 감마 글로빈) mRNA의 수준은 상기 세포 또는 그의 자손, 예를 들어 그의 적혈구계 자손, 예를 들어 그의 적혈구 자손에서 증가된다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은gRNA 분자를 제공하며, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된 RNP)이 세포 내로 도입될 때, BCL11a mRNA의 발현이 상기 세포 또는 그의 자손, 예를 들어 그의 적혈구계 자손, 예를 들어 그의 적혈구 자손에서 감소된다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은gRNA 분자를 제공하며, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된 RNP)이 세포 내로 도입될 때, BCL11a mRNA의 수준이 상기 세포 또는 그의 자손, 예를 들어 그의 적혈구계 자손, 예를 들어 그의 적혈구 자손에서 감소된다.
세포를 언급하는 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것에서, 세포는(또는 세포 집단은) 포유류, 영장류 또는 인간 세포, 예를 들어 인간 세포 또는 인간 세포 집단이다(를 포함한다). 구현예에서, 세포는(또는 세포 집단은) HSPC, 예를 들어 CD34+이고, 예를 들어 CD34+CD90+이다(를 포함한다). 구현예에서, 세포(또는 세포 집단)는 상기 세포를 투여할 환자에 대해 자가 유래이다. 다른 구현예에서, 세포(또는 세포 집단)는 상기 세포를 투여할 환자에 대해 동종이계이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 1) 본원에 기재된 하나 이상의 gRNA 분자(제1 gRNA 분자를 포함), 예를 들어 이전 양태 및 구현예 중 어느 하나 이상의 gRNA 분자, 및,예를 들어 본원에 기재된, Cas9 분자; 2) 본원에 기재된 하나 이상의 gRNA 분자(제1 gRNA 분자를 포함), 예를 들어 이전 양태 및 구현예 중 어느 하나 이상의 gRNA 분자, 및 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산(본원에 기재된); 3) 본원에 기재된 하나 이상의 gRNA 분자(제1 gRNA 분자를 포함), 예를 들어 이전 양태 및 구현예 중 어느 하나 이상의 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자(본원에 기재된); 4) 본원에 기재된 하나 이상의 gRNA 분자(제1 gRNA 분자를 포함), 예를 들어 이전 양태 및 구현예 중 어느 하나 이상의 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산(본원에 기재된); 또는 5) 상기 1) 내지 4) 중 임의의 것, 및 주형 핵산; 또는 6) 상기 1) 내지 4) 중 임의의 것, 및 주형 핵산을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 Cas9 분자(본원에 기재된)를 추가로 포함하는, 제1 gRNA 분자(예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의 제1 gRNA 분자)를 포함하는 조성물을 제공한다.
구현예에서, Cas9 분자는 활성 또는 불활성 s. 피오게네스 Cas9이다. 구현예에서, Cas9 분자는 SEQ ID NO: 6611을 포함한다. 구현예에서, Cas9 분자는 예를 들어 (a) SEQ ID NO: 7821; (b) SEQ ID NO: 7822; (c) SEQ ID NO: 7823; (d) SEQ ID NO: 7824; (e) SEQ ID NO: 7825; (f) SEQ ID NO: 7826; (g) SEQ ID NO: 7827; (h) SEQ ID NO: 7828; (i) SEQ ID NO: 7829; (j) SEQ ID NO: 7830; 또는 (k) SEQ ID NO: 7831을 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
바람직한 구현예에서, 제1 gRNA 분자 및 Cas9 분자는 리보핵산 단백질 복합체(RNP)로 존재한다.
구현예에서, 본 발명은 제2 gRNA 분자; 제2 gRNA 분자 및 제3 gRNA 분자; 또는 제2 gRNA 분자, 선택적으로, 제3 gRNA 분자, 및, 선택적으로, 제4 gRNA 분자를 추가로 포함하는 조성물, 예를 들어 이전의 양태 및 구현예 중 임의의 조성물을 제공하며, 제2 gRNA 분자, 선택적인 제3 gRNA 분자, 및 선택적인 제4 gRNA 분자는 본원에 기재된 gRNA 분자, 예를 들어 이전의 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의 gRNA 분자의 gRNA 분자이고, 조성물의 각각의 gRNA 분자는 상이한 표적 서열에 상보적이다.
구현예에서, 제1 gRNA 분자, 제2 gRNA 분자, 선택적인 제3 gRNA 분자 및 선택적인 제4 gRNA 분자 중 둘 이상은 동일한 유전자 또는 영역 내의 표적 서열에 상보적이다. 구현예에서, 제1 gRNA 분자, 제2 gRNA 분자, 선택적인 제3 gRNA 분자, 및 선택적인 제4 gRNA 분자는 20000 뉴클레오티드 이하, 10000 뉴클레오티드 이하, 6000 이하, 5000 뉴클레오티드 이하, 4000 이하, 1000 뉴클레오티드 이하, 500 뉴클레오티드 이하, 400 뉴클레오티드 이하, 300 뉴클레오티드 이하, 200 뉴클레오티드 이하, 100 뉴클레오티드 이하, 90 뉴클레오티드 이하, 80 뉴클레오티드 이하, 70 뉴클레오티드 이하, 60 뉴클레오티드 이하, 50 뉴클레오티드 이하, 40 뉴클레오티드 이하, 30 뉴클레오티드 이하, 20 뉴클레오티드 이하 또는 10 뉴클레오티드 이하로 떨어진 표적 서열에 상보적이다.
다른 구현예에서, 제1 gRNA 분자, 제2 gRNA 분자, 선택적인 제3 gRNA 분자, 및 선택적인 제4 gRNA 분자 중 둘 이상은 상이한 유전자 또는 영역 내의 표적 서열에 상보적이다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 제공하며, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는:
(a) gRNA 분자 구현예 4의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
(b) gRNA 분자 구현예 5의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
c) gRNA 분자 구현예 6의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
(d) gRNA 분자 구현예 7의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
(e) gRNA 분자 구현예 41 내지 56 중 임의의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 제공하며, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는:
(a) gRNA 분자 구현예 10의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
(b) gRNA 분자 구현예 11의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 제공하며, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는:
(a) gRNA 분자 구현예 13의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
(b) gRNA 분자 구현예 14의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 제공하며, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는:
(a) gRNA 분자 구현예 16의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
(b) gRNA 분자 구현예 17의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
(c) gRNA 분자 구현예 18의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
(d) gRNA 분자 구현예 57 내지 68 중 임의의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 제공하며:
(1) 제1 gRNA 분자는: (a) gRNA 분자 구현예 4의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) gRNA 분자 구현예 5의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) gRNA 분자 구현예 6의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) gRNA 분자 구현예 7의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (e) gRNA 분자 구현예 41 내지 56 중 임의의 gRNA 분자들로부터 선택되고;
(2) 제2 gRNA 분자는: (a) gRNA 분자 구현예 10의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) gRNA 분자 구현예 11의 gRNA 분자들로부터 선택된다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 제공하며:
(1) 제1 gRNA 분자는: (a) gRNA 분자 구현예 4의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) gRNA 분자 구현예 5의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) gRNA 분자 구현예 6의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) gRNA 분자 구현예 7의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (e) gRNA 분자 구현예 41 내지 56 중 임의의 gRNA 분자들로부터 선택되고;
(2) 제2 gRNA 분자는: (a) gRNA 분자 구현예 13의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) gRNA 분자 구현예 14의 gRNA 분자들로부터 선택된다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 제공하며:
(1) 제1 gRNA 분자는: (a) gRNA 분자 구현예 4의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) gRNA 분자 구현예 5의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) gRNA 분자 구현예 6의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) gRNA 분자 구현예 7의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (e) gRNA 분자 구현예 41 내지 56 중 임의의 gRNA 분자들로부터 선택되고;
(2) 제2 gRNA 분자는: (a) gRNA 분자 구현예 16의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) gRNA 분자 구현예 17의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) gRNA 분자 구현예 18의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) gRNA 분자 구현예 57 내지 68 중 임의의 gRNA 분자들로부터 선택된다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 제공하며:
(1) 제1 gRNA 분자는: (a) gRNA 분자 구현예 10의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) gRNA 분자 구현예 11의 gRNA 분자들로부터 선택되고;
(2) 제2 gRNA 분자는: (a) gRNA 분자 구현예 13의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) gRNA 분자 구현예 14의 gRNA 분자들로부터 선택된다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 제공하며:
(1) 제1 gRNA 분자는: (a) gRNA 분자 구현예 10의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) gRNA 분자 구현예 11의 gRNA 분자들로부터 선택되고;
(2) 제2 gRNA 분자는: (a) gRNA 분자 구현예 16의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) gRNA 분자 구현예 17의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) gRNA 분자 구현예 18의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) gRNA 분자 구현예 57 내지 68 중 임의의 gRNA 분자들로부터 선택된다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 제공하며:
(1) 제1 gRNA 분자는: (a) gRNA 분자 구현예 13의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) gRNA 분자 구현예 14의 gRNA 분자들로부터 선택되고;
(2) 제2 gRNA 분자는: (a) gRNA 분자 구현예 16의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) gRNA 분자 구현예 17의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) gRNA 분자 구현예 18의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) gRNA 분자 구현예 57 내지 68 중 임의의 gRNA 분자들로부터 선택된다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 제공하며:
(1) 제1 gRNA 분자는: (a) gRNA 분자 구현예 16의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) gRNA 분자 구현예 17의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) gRNA 분자 구현예 18의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) gRNA 분자 구현예 57 내지 68 중 임의의 gRNA 분자들로부터 선택되고; (2) 제2 gRNA 분자는 베타 글로빈 유전자의 표적 서열에 상보적인 표적화 도메인을 포함하거나;
(1) 제1 gRNA 분자는: (a) gRNA 분자 구현예 4의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) gRNA 분자 구현예 5의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) gRNA 분자 구현예 6의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) gRNA 분자 구현예 7의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (e) gRNA 분자 구현예 41 내지 56 중 임의의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (f) gRNA 분자 구현예 10의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (g) gRNA 분자 구현예 11의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (h) gRNA 분자 구현예 13의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (i) gRNA 분자 구현예 14의 gRNA 분자들로부터 선택되고; (2) 제2 gRNA 분자는 베타 글로빈 유전자의 표적 서열에 상보적인 표적화 도메인을 포함한다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 조성물을 제공하며, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 gRNA 분자 구현예 41 내지 68 중 임의의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택된다.
조성물의 구현예에서, 조성물의 gRNA 분자 성분에 관하여, 조성물은 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자로 구성된다.
조성물의 구현예에서, 상기 gRNA 분자 각각은 본원에 기재된 Cas9 분자와의 리보핵산 단백질 복합체(RNP)로 존재한다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 주형 핵산을 추가로 포함하는 조성물을 제공하며, 주형 핵산은 제1 gRNA분자의 표적 서열의 또는 그 근처의 뉴클레오티드에 상응하는 뉴클레오티드를 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 (a) 인간 베타 글로빈, 예를 들어 돌연변이 G16D, E22A 및 T87Q 중 하나 이상을 포함하는 인간 베타 글로빈, 또는 그의 단편; 또는 (b) 인간 감마 글로빈, 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
전술한 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 조성물은 전기천공에 적합한, 예를 들어 HSPC 세포로의 전기천공에 적합한 매질 중에 제형화된다. 하나 이상의 gRNA 분자를 포함하는 조성물의 구현예에서, 상기 gRNA 분자 각각은 본원에 기재된 Cas9 분자와의 RNP 로 존재하며, 상기 RNP 각각은 약 10 uM 미만, 예를 들어 약 3 uM 미만, 예를 들어 약 1 uM 미만, 예를 들어 약 0.5 uM 미만, 예를 들어 약 0.3 uM 미만, 예를 들어 약 0.1 uM 미만의 농도로 존재한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 gRNA 분자, 예를 들어 이전의 양태 및 구현예 중 임의의gRNA 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 gRNA 분자를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 예를 들어 RNA 폴리머라제 II 또는 RNA 폴리머라제 III에 의해 인식되는 프로모터, 예를 들어 U6 프로모터 또는 HI 프로모터를 포함한다. 구현예에서, 핵산은 Cas9 분자, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 SEQ ID NO: 6611, SEQ ID NO: 7821, SEQ ID NO: 7822, SEQ ID NO: 7823, SEQ ID NO: 7824, SEQ ID NO: 7825, SEQ ID NO: 7826, SEQ ID NO: 7827, SEQ ID NO: 7828, SEQ ID NO: 7829, SEQ ID NO: 7830, 또는 SEQ ID NO: 7831 중 임의의 것을 포함하는(예를 들어 이로 구성되는) Cas9 분자를 추가로 인코딩한다. 구현예에서, 핵산은 Cas9 분자를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 예를 들어 EF-1 프로모터, CMV IE 유전자 프로모터, EF-1α 프로모터, 유비퀴틴 C프로모터, 또는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터를 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 이전의 핵산 양태 및 구현예 중 임의의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 구현예에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터, 플라스미드, 미니 서클, 나노플라스미드, 및 RNA 벡터로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 양태에서, 본 발명은 1) 이전의 gRNA 양태 및 구현예 중 어느 하나 이상의 gRNA 분자, 및 Cas9 분자(예를 들어 본원에 기재된); 2) 이전의 gRNA 양태 및 구현예 중 어느 하나 이상의 gRNA 분자, 및 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산(예를 들어 본원에 기재된); 3) 이전의 gRNA 양태 및 구현예 중 어느 하나 이상의 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자(예를 들어 본원에 기재된); 4) 이전의 gRNA 양태 및 구현예 중 어느 하나 이상의 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산(예를 들어 본원에 기재된); 5) 상기 1) 내지 4) 중 임의의 것, 및 주형 핵산; 6) 상기(1) 내지(4) 중 임의의 것, 및 주형 핵산을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산; 7) 이전의 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 조성물; 또는 8) 이전의 벡터 양태 및 구현예 중 임의의 벡터와 상기 세포(예를 들어 세포 집단)를 접촉시키는(예를 들어 도입하는) 것을 포함하는, 세포(예를 들어 세포 집단)를 상기 세포 내 표적 서열에서 또는 그 근처에서 변경하는(예를 들어 핵산의 구조(예를 들어 서열)를 변경하는) 방법을 제공한다. 구현예에서, gRNA 분자 또는 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자 또는 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산은 단일 조성물로 제형화된다. 다른 구현예에서, gRNA 분자 또는 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자 또는 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산은 하나를 초과하는 조성물로 제형화된다. 하나를 초과하는 조성물을 포함하는 구현예에서, 하나를 초과하는 조성물은 동시에 또는 순차적으로 전달된다. 구현예에서, 세포는 동물 세포, 예를 들어 포유류, 영장류 또는 인간 세포이다. 구현예에서, 세포는 조혈 줄기 또는 전구 세포(HSPC)(예를 들어 HSPC의 집단)이고, 예를 들어 세포는 CD34+ 세포이고, 예를 들어 세포는 CD34+CD90+ 세포이다. 구현예에서, 세포는 CD34+ 세포에 대해 부화된 세포 집단을 포함하는 조성물 내에 배치된다. 구현예에서, 세포(예를 들어 세포 집단)는 골수, 동원된 말초 혈액 또는 제대혈로부터 단리되었다. 구현예에서, 세포는 상기 세포를 투여할 환자에 대해 자가 유래이다. 다른 구현예에서, 세포는 상기 세포를 투여할 환자에 대해 동종이계이다. 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 게놈 DNA 서열에 또는 그 근처에 삽입결실을 야기하며, 예를 들어도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37에 나타난 삽입결실, 예를 들어도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37에 나타난 gRNA 분자의 표적화 도메인과 관련된 삽입결실을 야기한다. 구현예에서, 삽입결실은 약 40 뉴클레오티드 미만, 예를 들어 30 뉴클레오티드 미만, 예를 들어 20 뉴클레오티드 미만, 예를 들어 10 뉴클레오티드 미만의 삽입 또는 결실이고, 예를 들어 단일 뉴클레오티드 결실이다. 구현예에서, 방법은 집단 내 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 60%, 예를 들어 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 80%, 예를 들어 적어도 약 90%(예를 들어 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%)의 세포가 변경되는, 예를 들어 삽입결실을 포함하는, 세포 집단을 야기한다. 구현예에서, 방법(예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 세포 집단 상에 수행된 방법)은 적혈구계 계통의 분화된 세포(예를 들어 적혈구)로 분화할 수 있는 세포(예를 들어 세포 집단)를 야기하며, 상기 분화된 세포는, 예를 들어 변경되지 않은 세포(예를 들어 세포 집단)에 비해, 증가된 태아 헤모글로빈 수준을 나타낸다. 구현예에서, 방법은 분화된 세포 집단, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포 집단(예를 들어 적혈구 집단)으로 분화할 수 있는 세포 집단을 야기하며, 상기 분화된 세포 집단은, 예를 들어 변형되지 않은 세포 집단에 비해, 증가된 비율의 F 세포(예를 들어 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40% 더 큼)를 갖는다. 구현예에서, 방법은 분화된 세포, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포(예를 들어 적혈구)로 분화할 수 있는 세포를 야기하며, 상기 분화된 세포는 세포 당 적어도 약 6 피코그램(예를 들어 적어도 약 7 피코그램, 적어도 약 8 피코그램, 적어도 약 9 피코그램, 적어도 약 10 피코그램, 또는 약 8 내지 약 9 피코그램, 또는 약 9 내지 약 10 피코그램)의 태아 헤모글로빈을 생산한다. 구현예에서, 방법은 생체외에서 수행된다. 다른 구현예에서, 방법은 생체내에서 수행된다.
또다른 양태에서, 본 발명은 이전의 방법 양태 및 구현예 중 임의의 세포를 변경하는 방법에 의해 변경된 세포를 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 이전의 방법 양태 및 구현예 중 임의의 세포를 변경하는 방법에 의해 수득 가능한 세포를 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전의 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의, 제1 gRNA 분자, 또는, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전의 조성물 양태 및 구현예 중 임의의, 조성물, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전의 핵산 양태 및 구현예 중 임의의, 핵산, 또는, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전의 벡터 양태 및 구현예 중 임의의, 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 구현예에서, 세포는 예를 들어 본원에 기재된, Cas9 분자, 예를 들어 SEQ ID NO: 6611, SEQ ID NO: 7821, SEQ ID NO: 7822, SEQ ID NO: 7823, SEQ ID NO: 7824, SEQ ID NO: 7825, SEQ ID NO: 7826, SEQ ID NO: 7827, SEQ ID NO: 7828, SEQ ID NO: 7829, SEQ ID NO: 7830 또는 SEQ ID NO: 7831 중 임의의 것을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 Cas9 분자를 추가로 포함한다. 구현예에서, 세포는 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전의 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의, 제2 gRNA 분자, 또는, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전의 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의, 제2 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 포함했거나, 또는 포함할 것이며, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 동일하지 않은 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 태아 헤모글로빈의 발현은 상기 세포 또는 그의 자손(예를 들어 그의 적혈구계 자손, 예를 들어 그의 적혈구 자손)에서, gRNA 분자를 포함하도록 변형되지 않은 동일한 세포 유형의 세포 또는 그의 자손에 비해 증가된다. 구현예에서, 세포는 분화된 세포, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포(예를 들어 적혈구)로 분화할 수 있으며, 상기 분화된 세포는, 예를 들어 gRNA 분자를 포함하도록 변형되지 않은 동일한 세포 유형의 세포에 비해, 증가된 수준의 태아 헤모글로빈을 나타낸다. 구현예에서, 분화된 세포(예를 들어 적혈구계 계통의 세포, 예를 들어 적혈구)는, 예를 들어 gRNA 분자를 포함하도록 변형되지 않은 동일한 세포 유형의 세포에 비해, 세포 당 적어도 약 6 피코그램(예를 들어 적어도 약 7 피코그램, 적어도 약 8 피코그램, 적어도 약 9 피코그램, 적어도 약 10 피코그램, 또는 약 8 내지 약 9 피코그램, 또는 약 9 내지 약 10 피코그램)의 태아 헤모글로빈을 생산한다. 구현예에서, 세포는 예를 들어 본원에 기재된, 줄기 세포 확장제, 예를 들어 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 이의 조합(예를 들어 화합물 1 및 화합물 4)인 줄기 세포 확장제, 예를 들어 화합물 4인 줄기 세포 확장제와, 예를 들어 생체외로 접촉되었다. 전술한 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 세포는, 도입된 gRNA 분자(본원에 기재된, 예를 들어 전술한 핵산 양태 및 구현예 중 임의의 gRNA 분자)의 표적화 도메인에 상보적인 게놈 DNA 서열에 또는 그 근처에 삽입결실, 예를 들어 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37 상에 나타난 삽입결실, 예를 들어 도입된 gRNA 분자(본원에 기재된, 예를 들어 전술한 핵산 양태 및 구현예 중 임의의 gRNA 분자)와 관련된, 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37 상에 나타난 삽입결실을 포함한다. 구현예에서, 삽입결실은 약 40 뉴클레오티드 미만, 예를 들어 30 뉴클레오티드 미만, 예를 들어 20 뉴클레오티드 미만, 예를 들어 10 뉴클레오티드 미만의 삽입 또는 결실이고, 예를 들어 삽입결실은 단일 뉴클레오티드 결실이다. 전술한 세포 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 세포는 동물 세포이고, 예를 들어 세포는 포유류, 영장류 또는 인간 세포이다. 전술한 세포 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 세포는 조혈 줄기 또는 전구 세포(HSPC)(예를 들어 HSPC의 집단)이고, 예를 들어 세포는 CD34+ 세포이고, 예를 들어 세포는 CD34+CD90+ 세포이다. 전술한 세포 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 세포(예를 들어 세포 집단)는 골수, 동원된 말초 혈액 또는 제대혈로부터 단리되었다. 전술한 세포 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 세포는 상기 세포를 투여할 환자에 대해 자가 유래이다. 구현예에서, 세포는 상기 세포를 투여할 환자에 대해 동종이계이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 이전의 세포 양태 및 구현예 중 임의의 세포를 포함하는 세포 집단을 제공한다. 구현예에서, 집단 내 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 60%, 예를 들어 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 80%, 예를 들어 적어도 약 90%(예를 들어 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%)의 세포가 이전의 세포 양태 및 구현예 중 임의의 것에 따른 세포이다. 구현예에서, 세포 집단은 분화된 세포 집단, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포 집단(예를 들어 적혈구 집단)으로 분화할 수 있으며, 상기 분화된 세포 집단은, 예를 들어 동일한 유형의 변형되지 않은 세포 집단에 비해, 증가된 비율의 F 세포(예를 들어 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40% 더 큼)를 갖는다. 구현예에서, 분화된 세포 집단 중 F 세포는 세포 당 평균 적어도 약 6 피코그램(예를 들어 적어도 약 7 피코그램, 적어도 약 8 피코그램, 적어도 약 9 피코그램, 적어도 약 10 피코그램, 또는 약 8 내지 약 9 피코그램, 또는 약 9 내지 약 10 피코그램)의 태아 헤모글로빈을 생산한다. 구현예에서, 집단은 1) 세포가 투여될 환자의 체중 kg 당 적어도 1e6 CD34+ 세포; 2) 세포가 투여될 환자의 체중 kg 당 적어도 2e6 CD34+ 세포; 3) 세포가 투여될 환자의 체중 kg 당 적어도 3e6 CD34+ 세포; 4) 세포가 투여될 환자의 체중 kg 당 적어도 4e6 CD34+ 세포; 또는 5) 세포가 투여될 환자의 체중 kg 당 2e6 내지 10e6 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 집단 내 적어도 약 40%, 예를 들어 적어도 약 50%(예를 들어 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%)의 세포는 CD34+ 세포이다. 구현예에서, 집단 내 적어도 약 10%, 예를 들어 적어도 약 15%, 예를 들어 적어도 약 20%, 예를 들어 적어도 약 30%의 세포는 CD34+CD90+ 세포이다. 구현예에서, 세포 집단은 골수, 말초 혈액(예를 들어 동원된 말초 혈액), 제대혈, 또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유래된다. 바람직한 구현예에서, 세포 집단은 골수에서 유래된다. 구현예에서, 세포 집단은 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, 세포 집단은 그것이 투여될 환자에 대해 자가 유래이다. 다른 구현예에서, 세포 집단은 그것이 투여될 환자에 대해 동종이계이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 이전의 세포 양태 및 구현예 중 임의의 세포, 또는 이전의 세포 집단 양태 및 구현예 중 임의의 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 매질, 예를 들어 동결 보존에 적합한 약학적으로 허용 가능한 매질을 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 이전의 세포 양태 및 구현예 중 임의의 세포, 이전의 세포 집단 양태 및 구현예 중 임의의 세포 집단, 또는 이전의 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 혈색소병증의 치료 방법을 제공한다. 구현예에서, 혈색소병증은 탈라세미아, 예를 들어 베타-탈라세미아, 또는 겸상 적혈구 질병이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 이전의 세포 양태 및 구현예 중 임의의 세포, 이전의 세포 집단 양태 및 구현예 중 임의의 세포 집단, 또는 이전의 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 (a) 세포(예를 들어 세포 집단)(예를 들어 HSPC(예를 들어 HSPC의 집단))를 제공하는 단계; (b) 줄기 세포 확장제를 포함하는 세포 배양 배지에서 생체외로 상기 세포(예를 들어 상기 세포 집단)를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 세포 내로 제1 gRNA 분자(예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전의 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의 gRNA 분자), 제1 gRNA 분자(예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전의 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의 gRNA 분자)를 인코딩하는 핵산, 조성물(예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 조성물), 핵산(예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전의 핵산 양태 및 구현예 중 임의의 핵산), 또는 벡터(예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 이전의 벡터 양태 및 구현예 중 임의의 벡터)를 도입시키는 단계를 포함하는, 세포(예를 들어 세포 집단)를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 구현예에서, 상기 단계 (c)의 도입 후에, 상기 세포(예를 들어 세포 집단)는 분화된 세포(예를 들어 분화된 세포 집단), 예를 들어 적혈구계 계통의 세포(예를 들어 적혈구계 계통의 세포 집단), 예를 들어 적혈구(예를 들어 적혈구 집단)로 분화할 수 있으며, 상기 분화된 세포(예를 들어 분화된 세포 집단)는, 예를 들어 단계 (c)를 거치지 않은 동일 세포에 비해, 증가된 태아 헤모글로빈을 생산한다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 이의 조합(예를 들어 화합물 1 및 화합물 4)이고, 예를 들어 화합물 4이다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 세포 배양 배지는 트롬보포이에틴(Tpo), Flt3 리간드(Flt-3L) 및 인간 줄기 세포 인자(SCF)를 포함한다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 세포 배양 배지는 인간 인터루킨-6(IL-6)을 추가로 포함한다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 세포 배양 배지는 각각 약 10 ng/mL내지 1000 ng/mL 범위의 농도, 예를 들어 각각 약 50 ng/mL의 농도, 예를 들어 50 ng/mL의 농도의 트롬보포이에틴(Tpo), Flt3 리간드(Flt-3L) 및 인간 줄기 세포 인자(SCF)를 포함한다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 10 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL 범위의 농도, 예를 들어 약 50 ng/mL의 농도, 예를 들어 50 ng/mL의 농도의 인간 인터루킨-6(IL-6)을 포함한다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 1 nM 내지 약 1 mM 범위의 농도, 예를 들어 약 1 uM 내지 약 100 uM 범위의 농도, 예를 들어 약 50 uM 내지 약 75 uM의 농도, 예를 들어 약 50 uM의 농도, 예를 들어 50 uM의 농도, 또는, 약 75 uM의 농도, 예를 들어 75 uM의 농도의 줄기 세포 확장제를 포함한다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 단계 (b)의 배양은 단계 (c)의 도입 전 배양 기간을 포함하며, 예를 들어 단계 (c)의 도입 전 배양 기간은, 적어도 12시간, 예를 들어 약 1 일 내지 약 3 일의 기간 동안, 예를 들어 약 1일 내지 약 2일의 기간 동안, 예를 들어 약 2일의 기간 동안이다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 단계 (b)의 배양은 단계 (c)의 도입 후 배양 기간을 포함하며, 예를 들어 단계 (c)의 도입 후 배양 기간은, 적어도 12시간, 예를 들어 약 1 일 내지 약 10 일의 기간 동안, 예를 들어 약 1일 내지 약 5일의 기간 동안, 예를 들어 약 2 일 내지 약 4 일의 기간 동안, 예를 들어 약 2일의 기간 동안 또는 약 3일의 기간 동안 또는 약 4일의 기간 동안이다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 세포 집단은, 예를 들어 단계 (b)에 따라서 배양되지 않은 세포들에 비해, 적어도 4배, 예를 들어 적어도 5 배, 예를 들어 적어도 10 배 확장된다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 단계 (c)의 도입은 전기천공, 예를 들어 1 내지 5 펄스, 예를 들어 1 펄스를 포함하는 전기천공을 포함하며, 각 펄스는 700 볼트 내지 2000 볼트 범위의 펄스 전압을 가지며, 10 ms 내지 100 ms 범위의 펄스 지속 기간을 갖는다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 전기천공은 1 펄스를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 펄스 전압은 1500 내지 1900 볼트의 범위, 예를 들어 1700 볼트이다. 전술한 방법 양상들 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 펄스 지속 기간은 10 ms 내지 40 ms 범위, 예를 들어 20 ms이다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 단계 (a)에서 제공된 세포(예를 들어 세포 집단)는 인간 세포(예를 들어 인간 세포 집단)이다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 단계 (a)에서 제공된 세포(예를 들어 세포 집단)는 골수, 말초 혈액(예를 들어 동원된 말초 혈액), 제대혈 또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 바람직하게는 골수로부터 단리된다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 단계 (a)에서 제공된 세포(예를 들어 세포 집단)는 골수에서 단리되고, 예를 들어 혈색소병증을 앓고 있는 환자의 골수로부터 단리된다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 단계 (a)에서 제공된 세포 집단은 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포에 대해 부화된다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 단계 (c)의 도입 후에, 세포(예를 들어 세포 집단)는 동결 보존된다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 단계 (c)의 도입 후에, 세포(예를 들어 세포 집단)는 제1 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 게놈 DNA 서열에 또는 그 근처에 삽입결실, 예를 들어 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37 상에 나타난 삽입결실, 예를 들어 제1 gRNA와 관련된 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37에 나타난 삽입결실을 포함한다. 전술한 방법 양태 및 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 단계 (c)의 도입 후, 세포 집단 내 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 세포가 제1 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 게놈 DNA 서열에 또는 그 근처에 삽입결실, 예를 들어 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37 상에 나타난 삽입결실, 예를 들어 제1 gRNA와 관련된 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37에 나타난 삽입결실을 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 이전 양태 및 구현예 중 임의의 세포를 제조하는 방법에 의해 수득 가능한 세포(예를 들어 세포 집단)를 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 상기 세포(예를 들어 세포 집단)를 포함하는 조성물을 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는 혈색소병증(예를 들어 탈라세미아(예를 들어 베타-탈라세미아) 또는 겸상 적혈구 질병)을 치료하는 방법을 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 상기 세포(예를 들어 세포 집단)를 포함하는 조성물을 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 태아 헤모글로빈 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 구현예에서, 인간 환자에게 인간 환자의 체중 kg 당 적어도 약 1e6 세포(예를 들어 CD34+ 세포, 예를 들어 이전의 양태 및 구현예 중 임의의 세포 제조하는 방법에 의해 수득 가능한 세포), 예를 들어 인간 환자의 체중 kg 당 적어도 약 1e6의 이전의 양태 및 구현예 중 임의의 세포 제조하는 방법에 의해 수득 가능한 CD34+ 세포를 포함하는 조성물을 투여한다. 구현예에서, 인간 환자에게 인간 환자의 체중 kg 당 적어도 약 2e6 세포(예를 들어 CD34+ 세포, 예를 들어 이전의 양태 및 구현예 중 임의의 세포 제조하는 방법에 의해 수득 가능한 세포), 예를 들어 인간 환자의 체중 kg 당 적어도 약 2e6의 이전의 양태 및 구현예 중 임의의 세포 제조하는 방법에 의해 수득 가능한 CD34+ 세포를 포함하는 조성물을 투여한다. 구현예에서, 인간 환자에게 인간 환자의 체중 kg 당 약 2e6 내지 약 10e6세포(예를 들어 CD34+ 세포, 예를 들어 이전의 양태 및 구현예 중 임의의 세포 제조하는 방법에 의해 수득 가능한 세포), 예를 들어 인간 환자의 체중 kg 당 적어도 약 2e6 내지 약 10e6의 이전의 양태 및 구현예 중 임의의 세포 제조하는 방법에 의해 수득 가능한 CD34+ 세포를 포함하는 조성물을 투여한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 gRNA 분자, 예를 들어 이전의 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의 gRNA 분자, 본원에 기재된 조성물, 예를 들어 이전의 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 조성물, 본원에 기재된 핵산, 예를 들어 이전의 핵산 양태 및 구현예 중 임의의 핵산, 본원에 기재된 벡터, 예를 들어 이전의 벡터 양태 및 구현예 중 임의의 벡터, 본원에 기재된 세포, 예를 들어 이전의 세포 양태 및 구현예 중 임의의 세포, 또는 본원에 기재된 세포 집단, 예를 들어 이전의 세포 집단 양태 및 구현예 중 임의의 세포 집단을, 약제로서 사용하기 위하여 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 gRNA 분자, 예를 들어 이전의 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의 gRNA 분자, 본원에 기재된 조성물, 예를 들어 이전의 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 조성물, 본원에 기재된 핵산, 예를 들어 이전의 핵산 양태 및 구현예 중 임의의 핵산, 본원에 기재된 벡터, 예를 들어 이전의 벡터 양태 및 구현예 중 임의의 벡터, 본원에 기재된 세포, 예를 들어 이전의 세포 양태 및 구현예 중 임의의 세포, 또는 본원에 기재된 세포 집단, 예를 들어 이전의 세포 집단 양태 및 구현예 중 임의의 세포 집단을, 약제의 제조에 사용하기 위하여 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 gRNA 분자, 예를 들어 이전의 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의 gRNA 분자, 본원에 기재된 조성물, 예를 들어 이전의 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 조성물, 본원에 기재된 핵산, 예를 들어 이전의 핵산 양태 및 구현예 중 임의의 핵산, 본원에 기재된 벡터, 예를 들어 이전의 벡터 양태 및 구현예 중 임의의 벡터, 본원에 기재된 세포, 예를 들어 이전의 세포 양태 및 구현예 중 임의의 세포, 또는 본원에 기재된 세포 집단, 예를 들어 이전의 세포 집단 양태 및 구현예 중 임의의 세포 집단을, 질병의 치료에 사용하기 위하여 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 gRNA 분자, 예를 들어 이전의 gRNA 분자 양태 및 구현예 중 임의의 gRNA 분자, 본원에 기재된 조성물, 예를 들어 이전의 조성물 양태 및 구현예 중 임의의 조성물, 본원에 기재된 핵산, 예를 들어 이전의 핵산 양태 및 구현예 중 임의의 핵산, 본원에 기재된 벡터, 예를 들어 이전의 벡터 양태 및 구현예 중 임의의 벡터, 본원에 기재된 세포, 예를 들어 이전의 세포 양태 및 구현예 중 임의의 세포, 또는 본원에 기재된 세포 집단, 예를 들어 이전의 세포 집단 양태 및 구현예 중 임의의 세포 집단을, 질병의 치료에 사용하기 위하여 제공하며, 질병은 혈색소병증, 예를 들어 탈라세미아(예를 들어 베타-탈라세미아) 또는 겸상 적혈구 질병이다.
도 1: Bcl11a +58 적혈구계 인핸서 영역의 Cas9 편집. 리포펙션에 의한 +58 인핸서 영역 표적화 crRNA 및 trRNA 전달 후 24 시간에 HEK-293 Cas9GFP에서 NGS로 검출된 편집 비율. 각 점은 상이한 crRNA를 나타내며, trRNA는 일정하게 유지된다. 게놈 좌표는 예를 들어 hg38과 관련하여 염색체 2상의 위치를 나타낸다.(n=1)
도 2: Bcl11a +62 적혈구계 인핸서 영역의 Cas9 편집. 리포펙션에 의한 +62 인핸서 영역 표적화 crRNA 및 trRNA 전달 후 24 시간에 HEK-293 Cas9GFP에서 NGS로 검출된 편집 비율. 각 점은 상이한 crRNA를 나타내며, trRNA는 일정하게 유지된다. 게놈 좌표는 예를 들어 hg38과 관련하여 염색체 2상의 위치를 나타낸다.(n=1)
도 3. Cas9 편집 시스템 도입 후 세포 선택을 위한 게이팅 전략.
도 4. Cas9 편집 시스템-처리된 CD34+ 세포(참조 정렬되지 않은 세포와 함께 CD34+CD90+ 및 CD34+CD90- 세포 집단 모두 나타남)로부터의 유전자 단편의 아가로스 겔 전기 영동. 상부 밴드는 절단되지 않은 호모듀플렉스 DNA에 해당하고 하부 밴드는 헤테로듀플렉스 DNA로부터 기인한 절단 산물을 나타낸다. 맨 왼쪽 레인은 DNA 사다리이다. 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어에 의한 미처리 이미지의 피크 통합에 의해 계산되었다. % 유전자 변형(삽입결실)은 다음과 같이 계산되었다: % 유전자 변형 = 100 x (1 - (1 - 절단된 비율)1/2), 그리고 겔의 각 대응하는 레인 아래에 표시하였다.
도 5. 밑줄 표시된 뉴클레오티드에 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 sgRNA 분자에 의해 표적화된 게놈 DNA의 부위를 나타내는 적혈구계 인핸서 영역.
도 6a/6b. CD34+ HSC 세포에서 sgEH1(CR00276) (a) 또는 sgEH2(CR00275) (b)에 의한 삽입결실 형성에 대한 NGS 결과. 삽입은 대문자로 되어 있다. 결실은 점선으로 표시된다. 절단 부위 근처의 미세상동 영역은 굵은 밑줄로 강조되어 있다.
도 6c/6d. CD34+ HSC 세포에서 sgEH8(CR00273) (c) 또는 sgEH9(CR00277) (d)에 의한 삽입결실 형성에 대한 NGS 결과. 삽입은 대문자로 되어 있다. 결실은 점선으로 표시된다. 절단 부위 근처의 미세상동 영역은 굵은 밑줄로 강조되어 있다.
도 7. g7, g8 및 g2에 대한 다수 공여자에 걸친 NGS 결과 및 삽입결실 패턴 형성. g7 및 g8을 사용하는 2개의 생물학적 반복실험으로부터의 상위 3의 삽입결실의 서열은 동일했고, g2를 사용하는 상위 3의 삽입결실의 서열은 이전 실험으로부터의 것과 동일했다.
도 8. 변형된 gRNA 스캐폴드(BC)를 이용한 NGS 결과 및 삽입결실 패턴 형성. 이들 실험으로부터의 상위 3의 삽입결실의 서열은 표준 gRNA 스캐폴드를 사용할 때 형성된 것과 동일하다.
도 9. 상이한 전달 방법에 걸친 삽입결실 패턴 비교. AVG%는 표시된 삽입결실을 나타내는 NGS 리드의 %를 지칭한다(2 실험의 평균).
도 10. 연장되지 않은 플래그폴 영역을 갖는("reg") 또는 제1 플래그폴 연장 및 제1 tracr 연장을 갖는("BC") g7 gRNA 및 g8 gRNA의 공동 도입에 의한 삽입결실 형성. 두 gRNA에 대한 PAM 서열은 박스 표시된다.
도 11: NGS에 의해 측정된, CD34+ 세포에서 BCL11a 유전자의 +58 인핸서 영역으로 향하는 상위 gRNA 서열(n=3).
도 12: NGS에 의해 측정된, CD34+ 세포에서 BCL11a 유전자의 +62 인핸서 영역으로 향하는 상위 gRNA 서열(n=3).
도 13: BCL11a +62 인핸서 유전자좌를 표적화하는 2 gRNA 분자가 HEK293_Cas9 세포에 도입될 때, CR00187(밝은 회색 막대) 또는 CR00202(진한 회색 막대) 중 어느 하나가 일정하게 유지되고 표시된 gRNA의 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA 분자와 세포로 공동 삽입될 때의 예측 절제 크기.
도 14: CR00187의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자 및 그래프에 표시된 제2 gRNA 분자의 첨가에 의한 BCL11a의 +62 인핸서 내의 게놈 DNA 절제. 별(*)은 30%보다 큰 빈도로 관찰된 절제를 나타내고; 캐럿(＾)은 더 낮은 빈도(30% 미만)로 관찰된 절제를 나타낸다. 50 nt 미만의 단편을 야기하는 예측 절제 산물은 구별될 수 없었다.
도 15: CR00202의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자 및 그래프에 표시된 제2 gRNA 분자의 첨가에 의한 BCL11a의 +62 인핸서 내의 게놈 DNA 절제. 별(*)은 30%보다 큰 빈도로 관찰된 절제를 나타내고; 캐럿(＾)은 더 낮은 빈도(30% 미만)로 관찰된 절제를 나타낸다.
도 16: 프렌치 HPFH 영역으로 표적화되는 192 gRNA 분자에 의한 % 삽입결실 형성(문헌[Sankaran VG et al. A functional element necessary for fetal hemoglobin silencing. NEJM(2011) 365:807-814.])
도 17. 게놈 편집, 뒤따르는 유전적 및 표현형 특징 확인을 위한, Cas9:gRNA 리보핵산 단백질(Cas9-RNP)의 일차 인간 CD34+ HSPC로의 전달에 대한 실험 계획.
도 18. CD34+ HSPC로의 모의 전기천공 또는 Cas9-RNP 복합체의 전기천공 후의 세포 생존능. HSPC는 RNP 복합체의 전기천공 후 48 시간 동안 시험관내 확장되었고 세포 생존능을 모니터하고 생존 퍼센트를 결정하였다. RNP 복합체를 제조하는 데 사용된 gRNA의 명칭은 x 축 상에 나타나고 대응하는 세포 생존능은 y 축 상에 나타난다. CRxxxx 식별자는 gRNA 분자의 표적화 도메인을 나타낸다.
도 19. T7 엔도뉴클레아제 검정을 이용한 미스매치 검출. NHEJ에 의해 BCL11A 적혈구계 인핸서의 +58 DHS 영역에 삽입결실을 도입하기 위한 RNP 복합체를 전달하기 위해 인간 HSC를 전기천공하였다. 표적 영역에 걸친 PCR 앰플리콘을 T7E1 검정하고 생성된 단편을 2% 아가로스 겔 전기 영동으로 분석하였다. BCL11A +58 적혈구계 인핸서 영역은 두 가이드 RNA 형식 모두(이중 가이드 RNA-검은색, 단일 가이드 RNA-회색(하단 그래프 및 상단 그래프의 g7BCL11a-BC(1) 및 g7BCL11A-BC(2))에 의해 파괴되었다. DNA 밴드의 강도는 편집된 대립유전자의 퍼센트를 결정하기 위해 ImageJ 소프트웨어(http://rsb.info.nih.gov/ij/)에 의해 추정되었다. 사용된 gRNA의 명칭 및 미스매치 검출 검정으로부터 결정된 상응하는 유전자 편집 효율 또한 겔 이미지 아래의 표에 나타난다.
도 20: 차세대 시퀀싱에 의한 대립유전자 편집 퍼센트. 라벨은 도 18 및 19에서 기재된 것과 같다.
도 21. 5개의 선택된 gRNA에 대해 관찰된 콜로니 수 및 콜로니 유형을 나타내는 콜로니 형성 세포(CFC) 단위 검정. +58 적혈구계 인핸서에서 게놈 편집된 HSPC을 메틸 셀룰로오스에서 평판 배양하고 STEMvision을 사용하는 형태학적 및 표현형 기준을 사용하여 성숙한 세포의 수 및 유형에 기반하여 클론성 콜로니를 분류하고 계수하였다. 콜로니들은 콜로니 형성 단위-적혈구계(CFU-E), 대집락 형성 단위-적혈구계(BFU-E), 콜로니 형성 단위-과립구/대식세포(CFU-GM) 및 콜로니 형성 단위-과립구/적혈구/대식세포/거핵구(CFU-GEMM)로 분류되었다.
도 22. 적혈구계 분화 동안 세포 분열의 동역학. 적혈구계 분화 및 배수 세포 확장 동안 0, 7, 14 및 21 일차에 결정된 총 세포 수.
도 23. 게놈 편집되고 적혈구계 분화된 HSC에서의 BCL11A, 감마 및 베타-글로빈 mRNA 수준. 단계통 적혈구계 배양물에서의 BCL11A, 감마- 및 베타-글로빈 사슬의 상대적 mRNA 발현을 실시간 PCR로 정량화 하였다. 전사체 수준은 인간 GAPDH 전사체 수준에 대비해 정규화되었다.
도 24a. BCL11a 인핸서(+58)의 파괴를 위해 이중 gRNA/cas9 시스템으로 수득된 HSC의 효율적인 편집은 높은 수준의 HbF 유도를 야기하였다. 전기천공 48 시간 후 HSC를 시험관내 적혈구계 분화하고 HbF 발현을 측정하였다. HbF 양성 세포(F-세포)의 퍼센트를 7, 14 및 21 일차에 FACS 분석법으로 모니터링하였다. 이 도면에 나타난 데이터는 dgRNA가 표시된 표적화 도메인을 포함하는 dgRNA 시스템으로 생성되었다.
도 24b. BCL11a 인핸서(+58)의 파괴를 위해 sgRNA/cas9 시스템으로 수득된 HSC의 효율적인 편집은 높은 수준의 HbF 유도를 야기하였다. 전기천공 48 시간 후 HSC를 시험관내 적혈구계 분화하고 HbF 발현을 측정하였다. HbF 양성 세포(F-세포)의 퍼센트를 7, 14 및 21 일차에 FACS 분석법으로 모니터링하였다. 이 도면에 나타난 데이터는 sgRNA가 표시된 표적화 도메인을 포함하는 sgRNA 시스템으로 생성되었다.
도 25: 표시된 표적화 도메인을 포함하는 gRNA에 의해 HSPC에서 생산된 삽입결실 패턴.
도 26a: CD34+ 세포 확장 배지에서의 편집된 및 편집되지 않은 배양물의 세포 표면 마커 염색에 의한 표현형 분석. 모든 gRNA 분자를 dgRNA 형식으로 테스트하였다. 사용된 Tracr은 SEQ ID NO: 7808이고, crRNA는 표시된 2'O-메틸 (m) 및 포스포로티오에이트 결합(*) 변형을 갖는 다음의 형식 및 서열을 가는다: mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArU*mG*mC*mU, 여기서 N은 표시된 표적화 도메인의 잔기이다. 재료 및 방법에 기술된 각각의 항체 패널 또는 상응하는 아이소타입 대조군으로 염색된 세포의 형광을 나타내는 대표적인 도트 플롯이 나타난다. 나타난 세포는 전면 및 측면 산란 특성 및 DAPI(4', 6-디아미디노-2-페닐인돌) 식별에 의해 살아있는 세포 집단에 대해 사전 게이팅되었다. 플롯의 상단에 명명된 각 세포 집단의 백분율은 굵은 선 박스에 의해 표시된 게이트에 의해 결정되었다.
도 26b: CD34+ 세포 확장 배지에서의 편집된 및 편집되지 않은 배양물의 세포 표면 마커 염색에 의한 표현형 분석. 모든 gRNA 분자를 dgRNA 형식으로 테스트하였다. 사용된 Tracr은 SEQ ID NO: 7808이고, crRNA는 표시된 2'O-메틸 (m) 및 포스포로티오에이트 결합(*) 변형을 갖는 다음의 형식 및 서열을 가는다: mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArU*mG*mC*mU, 여기서 N은 표시된 표적화 도메인의 잔기이다. 편집된 및 편집되지 않은 배양물에서의 각 명명된 세포 집단의 백분율이 나타난다. 편집된 배양물의 표적화 도메인은 표시된 바와 같다.
도 27. HPFH 영역 내의 2개의 부위를 표적화하는 dgRNA를 포함하는 RNP로 편집된 CD34+ 세포 집단으로부터 분화된 적혈구에서의 % F 세포. "g2"는 양성 대조군(BCL11a 유전자의 코딩 영역에 대한 표적화 도메인); "대조군"은 음성 대조군(Cas9 단독 도입)이다.
도 28a. 표시된 dgRNA(표시된 바와 같이 unmod 또는 변형된)를 포함하는 RNP의 전기천공 후 2 일차에 CD34+ HSPC에서 NGS에 의해 결정된 % 편집. 대조군은 변형되지 않은 CR00317(CR00317-m)의 표적화 도메인을 포함하는 dgRNA, 또는 완충제 단독으로 전기천공(Cas9 또는 gRNA 없음, "모의")을 포함한다.
도 28b. 표시된 dgRNA(표시된 바와 같이 unmod 또는 변형된)를 포함하는 RNP의 전기천공 후 2 일차에 CD34+ HSPC에서 NGS에 의해 결정된 % 편집. 대조군은 완충제 단독으로 전기천공(Cas9 또는 gRNA 없음, "모의")을 포함한다.
도 29. 표시된 sgRNA(표시된 바와 같이 unmod 또는 변형된. 각 경우에 숫자는 표적화 도메인의 CRxxxxxx 식별자에 해당한다. 예를 들어 Unmod sg312는 CR00312의 표적화 도메인을 포함하는 변형되지 않은 sgRNA를 지칭한다)를 포함하는 RNP의 전기천공 후 2 일차에 CD34+ HSPC에서 NGS에 의해 결정된 % 편집. 대조군에는Cas9 단백질 단독 전기천공("Cas9"), 완충제 단독으로 전기천공("모의") 또는 전기천공이 없는 것("WT")이 포함된다.
도 30a. 표시된 dgRNA(표시된 바와 같이 unmod 또는 변형된)를 포함하는 RNP로 CD34+ HSPC의 전기천공 및 그 다음에 적혈구계 분화 배지에서의 배양으로 분화 유도된 후의, 정규화된 HbF+인 적혈구 백분율("모의"를 공제한 % F 세포). 대조군은 완충제 단독 전기천공("모의")을 포함한다.
도 30b. 표시된 dgRNA(표시된 바와 같이 unmod 또는 변형된)를 포함하는 RNP로 CD34+ HSPC의 전기천공 및 그 다음에 적혈구계 분화 배지에서의 배양으로 분화 유도된 후의, 정규화된 HbF+인 적혈구 백분율("모의"를 공제한 % F 세포). 대조군은 완충제 단독 전기천공("모의")을 포함한다.
도 31. 표시된 dgRNA(표시된 바와 같이 unmod 또는 변형된. 각 경우에 숫자는 표적화 도메인의 CRxxxxxx 식별자에 해당한다. 예를 들어 Unmod sg312는 CR00312의 표적화 도메인을 포함하는 변형되지 않은 sgRNA를 지칭한다)를 포함하는 RNP로 CD34+ HSPC의 전기천공 및 그 다음에 적혈구계 분화 배지에서의 배양으로 분화 유도된 후의, 정규화된 HbF+인 적혈구 백분율("모의"를 공제한 % F 세포). 대조군에는Cas9 단백질 및 tracr 단독 전기천공("CAS9+TracRNA 단독"), 완충제 단독으로 전기천공("세포 단독+펄스"), 또는 전기천공이 없는 것("펄스 없이 세포 단독")이 포함된다.
도 32. 표시된 sgRNA(각 경우에 숫자는 표적화 도메인의 CRxxxxxx 식별자에 해당한다. 예를 들어 Unmod sg312는 CR00312의 표적화 도메인을 포함하는 변형되지 않은 sgRNA를 지칭한다)를 포함하는 RNP의 CD34+ 세포로의 전기천공 후에 적혈구계 분화 후 14 일차에 배양물에서의 총 세포 확장 배수. 대조군에는Cas9 단백질 및 tracr 단독 전기천공("CAS9+TracRNA 단독"), 완충제 단독으로 전기천공("세포 단독+펄스"), 또는 전기천공이 없는 것("펄스 없이 세포 단독")이 포함된다.
도 33. BCL11a 인핸서 영역을 표적화하는 dgRNA 분자에 의해 지시되는 Cas9에 의해 절단된 잠재적 표적-외 부위의 평가. 삼각형은 표적-적중 부위에 해당하는 반면 열린 원은 테스트된 각 가이드 RNA에 대한 잠재적 표적-외 부위에 해당한다.
도 34. NGS 및 유세포 분석에 의해 평가된, 상이한 Cas9 변이체에 의한 CD34+ 조혈 줄기 세포에서의 표적화된 B2M 유전자좌의 편집 효율. NLS=SV40 NLS; His6 또는 His8은 각각 6개 또는 8개의 히스티딘 잔기를 지칭하고; TEV=담배 식각 바이러스 절단 부위; Cas9=야생형 S.피오게네스 Cas9-돌연변이 또는 변이체는 표시된 바와 같다).
도 35. 데이터는 확장 배지에서 총 10 일의 배양(전기천공 전 3일의 배양 및 전기천공 후 7일의 배양) 후 세포 수에 있어서의 배수 증가를 나타낸다. 단일 및 이중 가이드 RNA 형식 둘 다를 포함하는 테스트된 모든 가이드 RNA에서, 세포 확장은 2 내지 7 배의 범위였다. 화살표로 표시된 CR00312 및 CR001128은 10 일의 세포 확장 후에 3 내지 6 배 증가를 입증하였다. 라벨 "Crxxxx"는 표시된 표적화 도메인을 갖는 dgRNA를 지칭한다; "sgxxxx"는 동일한 숫자의 CRxxxxx 식별자의 표적화 도메인을 갖는 sgRNA를 지칭한다(예를 들어 sg312는 CR00312의 표적화 도메인을 갖는다); "변형되지 않은(Unmod)"은 RNA에 변형이 없음을 나타닌다; "O'MePS"는 dgRNA와 관련하여 사용될 때에는 3개의 3' 및 3개의 5' 2'-OMe 변형 및 포스포로티오에이트 결합을 가지며 변형되지 않은 tracr과 쌍을 이루는 crRNA를 지칭한다; "O'MePS"는 sgRNA와 관련하여 사용될 때에는 3개의 5'-말단 2'-OMe 변형 및 포스포로티오에이트 결합, 3개의 3'-말단 포스포로티오에이트 결합, 및 끝에서 4 번째, 끝에서 3 번째 및 끝에서 2 번째 3'뉴클레오티드의 3개의 2'OMe 변형을 갖는 gRNA를 지칭한다.
도 36. 상이한 HSPC 하위 집단을 구별하기 위한 게이팅 전략.
도 37. 표시된 배지(IL6, 화합물 4, 또는 IL6 및 화합물 4 모두로 개질된 STF)에서 48 시간 생체외 배양 후, 그러나 CRISPR 시스템의 전기천공 전에 각각의 조혈 서브세트의 빈도. STF=StemSpan SFEM.
도 38. 표시된 배지(IL6, 화합물 4, 또는 IL6 및 화합물 4 모두로 개질된 STF)에서 배양된, BCL11a의 +58 인핸서를 표적화하는 CRISPR 시스템을 도입하는 전기천공 7 일 후의 각 조혈 서브세트의 빈도. STF=StemSpan SFEM.
도 39a. +58 영역을 표적화하는 dgRNA를 함유하는 RNP로, 상이한 RNP 농도를 사용하는 유전자 편집시 세포 생존능.
도 39b. +58 영역을 표적화하는 sgRNA를 함유하는 RNP로, 상이한 RNP 농도를 사용하는 유전자 편집시 세포 생존능.
도 40a. +58 영역을 표적화하는 dgRNA를 함유하는 RNP로, 상이한 RNP 농도를 사용하는 유전자 편집시 NGS로 측정된 유전자 편집 효율.
도 40b. +58 영역을 표적화하는 sgRNA를 함유하는 RNP로, 상이한 RNP 농도를 사용하는 유전자 편집시 NGS로 측정된 유전자 편집 효율.
도 41a. +58 영역을 표적화하는 dgRNA를 함유하는 RNP로, 상이한 RNP 농도를 사용하는 유전자 편집시 유세포 분석으로 측정된 HbF 유도 백분율.
도 41b. +58 영역을 표적화하는 sgRNA를 함유하는 RNP로, 상이한 RNP 농도를 사용하는 유전자 편집시 유세포 분석으로 측정된 HbF 유도 백분율.
도 42a. 상이한 Cas9 단백질을 갖는 RNP의 유전자 편집 효율. 유전자 편집은 변형되지 않은 형태의 sgRNA CR00312 및 sgRNA CR001128, 또는 변형된 형태의 sgRNA CR00312 및 sgRNA CR001128 중 어느 하나와 결합된 상이한 Cas9 변이체(X-축 상에 나열됨)를 사용하여 수행되었다. 편집된 세포를 NGS하여 % 편집(Y-축)을 결정하였다.
도 42b. 상이한 Cas9 단백질을 이용한 유전자 편집시 HbF+ 세포의 유도. 유전자 편집은 변형되지 않은 형태의 sgRNA CR00312 및 sgRNA CR001128, 또는 변형된 형태의 sgRNA CR00312 및 sgRNA CR001128 중 어느 하나와 결합된 상이한 Cas9 변이체(X-축 상에 나열됨)를 사용하여 수행되었다. 편집된 세포를 적혈구계 계통으로 분화시키고 형광단과 접합된 항-HbF 항체를 사용하여 유세포 분석으로 HbF 생산을 평가하였다.
도 43. 표시된 dgRNA 또는 sgRNA(표시된 바와 같이 unmod 또는 변형된)를 포함하는 RNP의 전기천공에 의한 CD34+ HSPC에서의 NGS에 의해 결정된 % 편집(라벨은 표 36에 표시된 바와 같은 gRNA 서열을 나타냄). 편집은 전기천공 후 2 일(검은 색 막대) 또는 6 일(회색 막대)에 결정되었다. Cas9 단백질 및 Tracr만의 대조군 전기천공("없음", 데이터는 나타나지 않음) 이후에 각 부위에서 1.5% 미만의 편집이 검출되었다. 두 전기천공 반복실험의 평균+표준 편차가 나타난다.
도 44. 표시된 dgRNA 또는 sgRNA(표시된 바와 같이 unmod 또는 변형된)를 포함하는 RNP의 CD34+ HSPC으로의 전기천공(라벨은 표 36에 표시된 바와 같은 gRNA 서열을 나타냄) 및 적혈구계 분화 조건에서 7 일 동안의 배양 후의 CD71+인 살아있는 세포의 퍼센트. 전기천공 후, 세포는 실시예 4.7에 기재된 바와 같이, 프로토콜 1(검은색 막대) 또는 프로토콜 2(회색 막대)에 의해 유지되었다. 대조군은 Cas9 단백질 및 Tracr 단독의 전기천공("없음")을 포함한다. 두 전기천공 반복실험의 평균+표준 편차가 나타난다.
도 45. 표시된 dgRNA 또는 sgRNA(표시된 바와 같이 unmod 또는 변형된)를 포함하는 RNP의 CD34+ HSPC으로의 전기천공(라벨은 표 36에 표시된 바와 같은 gRNA 서열을 나타냄) 및 적혈구계 분화 조건에서 7 일 동안의 배양 후의 HbF+인 적혈구계 세포의 퍼센트. 전기천공 후, 세포는 실시예 4.7에 기재된 바와 같이, 프로토콜 1(검은색 막대) 또는 프로토콜 2(회색 막대)에 의해 유지되었다. 대조군은 Cas9 단백질 및 Tracr 단독의 전기천공("없음")을 포함한다. 두 전기천공 반복실험의 평균+표준 편차가 나타난다.
도 46. 표시된 dgRNA 또는 sgRNA(표시된 바와 같이 unmod 또는 변형된)를 포함하는 RNP의 CD34+ HSPC으로의 전기천공(라벨은 표 36에 표시된 바와 같은 gRNA 서열을 나타냄) 및 적혈구계 분화 조건에서 14 일 동안의 배양 후의 HbF+인 세포의 퍼센트. 전기천공 후, 세포는 실시예 4.7에 기재된 바와 같이, 프로토콜 1(검은색 막대) 또는 프로토콜 2(회색 막대)에 의해 유지되었다. 대조군은 Cas9 단백질 및 Tracr 단독의 전기천공("없음")을 포함한다. 두 전기천공 반복실험의 평균+표준 편차가 나타난다.
도 47. 표시된 dgRNA 또는 sgRNA(표시된 바와 같이 unmod 또는 변형된)를 포함하는 RNP의 CD34+ HSPC으로의 전기천공(라벨은 표 36에 표시된 바와 같은 gRNA 서열을 나타냄) 및 적혈구계 분화 조건에서 21 일 동안의 배양 후의 HbF+인 세포의 퍼센트. 전기천공 후, 세포는 실시예 4.7에 기재된 바와 같이, 프로토콜 1(검은색 막대) 또는 프로토콜 2(회색 막대)에 의해 유지되었다. 대조군은 Cas9 단백질 및 Tracr 단독의 전기천공("없음")을 포함한다. 두 전기천공 반복실험의 평균+표준 편차가 나타난다.
도 48. 표시된 dgRNA 또는 sgRNA(표시된 바와 같이 unmod 또는 변형된)를 포함하는 RNP의 CD34+ HSPC으로의 전기천공(라벨은 표 36에 표시된 바와 같은 gRNA 서열을 나타냄) 후에 7(검은색 막대) 또는 21 일(검은색 막대) 동안의 적혈구계 분화 배양에서의 총 세포 확장 배수. 전기천공 후, 세포는 실시예 4.7에 기재된 바와 같이, 프로토콜 2에 의해 유지되었다. 대조군은 Cas9 단백질 및 Tracr 단독의 전기천공("없음")을 포함한다. 두 전기천공 반복실험의 평균+표준 편차가 나타난다.
도 49. HPFH 영역을 표적화하는 dgRNA 분자에 의해 지시되는 Cas9에 의해 절단된 잠재적 표적-외 부위의 평가. 삼각형은 표적-적중 부위에 해당하는 반면 열린 원은 테스트된 각 가이드 RNA에 대한 잠재적 표적-외 부위에 해당한다.
정의
용어 "CRISPR 시스템", "Cas 시스템" 또는 "CRISPR/Cas 시스템"은 RNA-가이드된 뉴클레아제 또는 다른 이펙터 분자 및 gRNA 분자를 포함하여, 함께RNA-가이드된 뉴클레아제 또는 다른 이펙터 분자에 의해 표적 서열에서 핵산의 변형을 안내 및 달성하기에 필요 충분한 분자 세트를 지칭한다. 일 구현예에서, CRISPR 시스템은 gRNA 및 Cas 단백질, 예를 들어 Cas9 단백질을 포함한다. Cas9 또는 변형된 Cas9 분자를 포함하는 이러한 시스템은 본원에서 "Cas9 시스템" 또는 "CRISPR/Cas9 시스템"으로 지칭된다. 일 실시예에서, gRNA 분자 및 Cas 분자는 복합체화 되어 리보핵산 단백질(RNP) 복합체를 형성할 수 있다.
용어 "가이드 RNA", "가이드 RNA 분자", "gRNA 분자" 또는 "gRNA"는 상호 교환적으로 사용되고, RNA-가이드된 뉴클레아제 또는 다른 이펙터 분자(전형적으로gRNA 분자와 복합체로)의 표적 서열로의 특이적 안내를 촉진하는 핵산 분자 세트를 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 안내는 gRNA의 일부분이 DNA에 혼성화되는 것(예를 들어 gRNA 표적화 도메인을 통해)을 통해, 및 gRNA 분자의 일부분이 RNA-가이드된 뉴클레아제 또는 다른 이펙터 분자에 결합하는 것(예를 들어 적어도 gRNA tracr을 통해)에 의해 달성된다. 구현예에서, gRNA 분자는 본원에서 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA" 등으로 지칭되는 단일 인접 폴리뉴클레오티드 분자로 구성된다. 다른 구현예에서, gRNA 분자는 본원에서 "이중 가이드 RNA" 또는 "dgRNA" 등으로 지칭되는, 통상적으로 혼성화를 통해, 스스로 관련될 수 있는, 복수의, 통상적으로 2개의 폴리뉴클레오티드 분자로 구성된다. gRNA 분자는 하기에 더욱 상세하게 기재되지만, 일반적으로 표적화 도메인 및 tracr을 포함한다. 구현예에서, 표적화 도메인 및 tracr은 단일 폴리뉴클레오티드 상에 배치된다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인 및 tracr은 별개의 폴리뉴클레오티드 상에 배치된다.
용어가 gRNA와 관련되어 사용되는 바와 같이는 용어 "표적화 도메인"은, 표적 서열, 예를 들어 세포의 핵산 내, 예를 들어 유전자 내, 표적 서열을 인식하는, 예를 들어 표적 서열에 상보적인 gRNA 분자의 부분이다.
용어가 gRNA와 관련되어 사용되는 바와 같이는 용어 "crRNA"는 표적화 도메인 및, 플래그폴 영역을 형성하기 위해 tracr과 상호 작용하는 영역을 포함하는 gRNA 분자의 일부분이다.
용어 "표적 서열"은 gRNA 표적화 도메인에 상보적인, 예를 들어 완전히 상보적인 핵산 서열을 지칭한다. 구현예에서, 표적 서열은 게놈 DNA 상에 배치된다. 구현예에서, 표적 서열은 뉴클레아제 또는 다른 이펙터 활성을 갖는 단백질에 의해 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열, 예를 들어 Cas9에 의해 인식되는 PAM 서열에 인접해 있다(DNA의 동일 가닥 상 또는 상보적 가닥 상에). 구현예에서, 표적 서열은 글로빈 유전자의 발현에 영향을 미치는, 예를 들어 베타 글로빈 또는 태아 헤모글로빈(HbF)의 발현에 영향을 미치는 유전자 또는 유전자좌 내의 표적 서열이다. 구현예에서, 표적 서열은 글로빈 유전자좌 내의 표적 서열이다. 구현예에서, 표적 서열은 BCL11a 유전자 내의 표적 서열이다. 구현예에서, 표적 서열은 BCL11a 인핸서 영역 내의 표적 서열이다. 구현예에서, 표적 서열은 HPFH 영역 내의 표적 서열이다.
gRNA분자와 관련되어 본원에 사용된 용어 "플래그폴(flagpole)"은 crRNA 및 tracr이 서로 결합하거나 또는 서로 혼성화되는 gRNA의 부분을 지칭한다.
gRNA분자와 관련되어 본원에 사용된 용어 "tracr"은 뉴클레아제 또는 다른 이펙터 분자에 결합하는 gRNA의 부분을 지칭한다. 구현예에서, tracr은 Cas9에 특이적으로 결합하는 핵산 서열을 포함한다. 구현예에서, tracr은 플래그폴의 일부를 형성하는 핵산 서열을 포함한다.
용어 "Cas9" 또는 "Cas9 분자"는 DNA 절단을 담당하는 박테리아 II형 CRISPR/Cas 시스템 유래의 효소를 지칭한다. Cas9는 또한 야생형 단백질뿐만 아니라 이의 기능적 및 비기능적 돌연변이를 포함한다. 구현예에서, Cas9는 S.피오게네스의 Cas9이다.
핵산과 관련되어 사용된 용어 "상보적"은 염기들, A의 T 또는 U와의, 및 G의 C와의 쌍을 지칭한다. 용어 상보적은 완전히 상보적인, 즉, 전체 참조 서열에 걸쳐 A 대 T 또는 U 쌍 및 G 대 C 쌍을 형성하는 핵산 분자뿐만 아니라 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 상보적인 분자도 지칭한다.
상동 지시된 수선(homology-directed repair) 또는 상동 재조합과 관련되어 사용된 "주형 핵산"은 절단 부위에서의 유전자 수선(삽입)을 위해 CRISPR 시스템 공여자 서열에 의해 변형 부위에 삽입되는 핵산을 지칭한다.
용어가 본원에 사용되는 바와 같이는 "삽입결실"은 gRNA 분자를 포함하는 조성물, 예를 들어 CRISPR 시스템에 노출된 후 발생한, 참조 핵산에 비해 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 또는 뉴클레오티드의 삽입 및 결실의 조합을 포함하는 핵산을 지칭한다. 삽입결실은 gRNA 분자를 포함하는 조성물에 노출된 후 핵산을 시퀀싱하는 것, 예를 들어 NGS에 의해 결정될 수 있다. 삽입결실 부위에 대해, 참조 서열의 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1뉴클레오티드 내에 적어도 하나의 삽입 또는 결실을 포함하는 경우, 또는 상기 참조 부위의 일부 또는 전부와 중첩되는(예를 들어 gRNA 분자, 예를 들어 본원에 기재된 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 부위의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 뉴클레오티드와 중첩되는 또는 내에 적어도 하나의 삽입 또는 결실을 포함하는) 경우, 삽입결실은 참조 부위(예를 들어 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 부위) "에 또는 그 근처에" 존재한다고 한다.
용어가 본원에 사용되는 바와 같이는 "삽입결실 패턴(indel pattern)"은 gRNA 분자를 포함하는 조성물에의 노출 후 발생한 삽입결실 세트를 지칭한다. 구현예에서, 삽입결실 패턴은 출현 빈도에 의해 상위 3개의 삽입결실들로 구성된다. 구현예에서, 삽입결실 패턴은 출현 빈도에 의해 상위 5개의 삽입결실들로 구성된이다. 구현예에서, 삽입결실 패턴은 모든 시퀀싱 리드(read)에 비해 약 5% 초과의 빈도로 존재하는 삽입결실로 구성된다. 구현예에서, 삽입결실 패턴은 삽입결실 시퀀싱 리드(즉, 변형되지 않은 참조 핵산 서열로 구성되지 않은 리드)의 총 개수에 비해 약 10% 초과의 빈도로 존재하는 삽입결실로 구성된다. 구현예에서, 삽입결실 패턴은 상위 5개의 가장 빈번하게 관찰된 삽입결실 중 임의의 3개를 포함한다. 삽입결실 패턴은 예를 들어 gRNA 분자에 노출된 세포 집단의 세포를 시퀀싱함에 의해 결정될 수 있다.
용어가 본원에 사용되는 바와 같이는 "표적-외 삽입결실"은 gRNA 분자의 표적화 도메인의 표적 서열 외의 부위의 또는 그 근처의 삽입결실을 지칭한다. 이러한 부위는 예를 들어 gRNA의 표적화 도메인의 서열에 비해 1,2,3,4,5 또는 그 이상의 미스매치 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 그러한 부위는 인 실리코(in silico) 예측된 표적-외 부위의 표적화된 시퀀싱을 이용하여, 또는 당분야에 공지된 삽입 방법에 의해 검출된다.
용어 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 목적어의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭한다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나를 초과하는 요소를 의미한다.
양, 시간의 지속 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 때 용어 "약"은 이러한 변동이 개시된 방법을 수행하기에 적절한 동안, 특정 값으로부터 ± 20% 또는 일부 경우 ± 10%, 또는 일부 경우 ± 5%, 또는 일부 경우 ± 1%, 또는 일부 경우 ± 0.1%의 변동을 포괄하는 의미이다.
용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 항체 생산, 또는 특정 면역학적으로-적격한 세포의 활성화, 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대 분자가 항원으로서 역할할 수 있음을 이해할 것이다. 추가적으로, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자는 면역 반응을 유도하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 따라서, 그 용어가 본원에 사용되는 바와 같이, "항원"을 인코딩하는 것을 이해할 것이다. 추가적으로, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 인코딩될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 본 발명이 하나를 초과하는 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는다는 것 및 이들 뉴클레오티드 서열이 원하는 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드를 인코딩하기 위해 다양한 조합으로 배열된다는 것은 쉽게 명백하다. 더욱이, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 인코딩될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원은 합성되거나 생물학적 샘플에서 유래될 수 있고, 또는 폴리펩티드 외의 거대 분자일 수 있다는 것은 쉽게 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분을 갖는 유체를 포함 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "자가 유래(autologous)"는 물질이 이후 재-도입될 동일한 개체에서 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
용더 "동종이계(allogeneic)"은 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물에서 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 하나 이상의 유전자좌의 유전자가 동일하지 않은 경우 둘 이상의 개체는 서로 동종이계라고 한다. 일부 양태에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종이계 물질은 항원적으로 상호 작용하기에 충분히 유전적으로 같지 않을 수 있다.
용어 "이종(xenogenic)"은 상이한 종의 동물에서 유래된 이식을 지칭한다.
용어가 본원에 사용되는 바와 같이 "에서 유래된"은 제1 과 제2 분자 사이의 관계를 표시한다. 이는 일반적으로 제1 분자와 제2 분자 사이의 구조적 유사성을 지칭하며, 제2 분자에서 유래된 제1 분자에 대해 공정 또는 공급원 제한을 함축 또는 포함하지 않는다.
용어 "인코딩"은 정의된 서열의 뉴클레오티드(예를 들어 rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 서열의 아미노산 서열 및 그로부터 발생하는 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서의 다른 중합체 및 거대 분자의 합성을 위한 주형으로서 역할하는, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내 특정 뉴클레오티드 서열의 내재적 특성을 지칭한다. 따라서 유전자, cDNA 또는 RNA는 그 유전자에 해당하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산하는 경우 단백질을 인코딩한다. 그 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하며 통상적으로 서열 목록에 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥 둘다 단백질 또는 그 유전자 또는 cDNA의 다른 산물을 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
달리 특정되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴성 형태이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 구(phrase) 핵산 서열은 또한 일부 형태에서 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 인트론을 함유할 수 있는 정도까지 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 특정 생물학적 결과를 달성하기에 효과적인 본원에 기재된 화합물, 제형, 물질 또는 조성물의 양을 지칭한다.
용어 "내인성(endogenous)"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 내부에서 유래된 또는 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "외인성(exogenous)"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 외부로부터 도입된 또는 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "발현"은 프로모터에 의해 추진된 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
용어 "전달 벡터"는 분리된 핵산을 포함하고 세포의 내부로 분리된 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질 조성을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친성 화합물 관련된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하는 다수의 벡터가 당분야에 공지되어 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 용어 "전달 벡터"는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 용어는 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포좀 등과 같은 핵산의 세포로의 전달을 촉진하는 비플라스미드 및 비바이러스 화합물을 추가로 포함하는 것으로 또한 해석되어야 한다. 바이러스 전달 벡터의 예로는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하며; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템 내에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 혼입시키는 코스미드, 플라스미드(예를 들어 네이키드(naked) 또는 리포좀 내 함유된) 및 바이러스(예를 들어 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하는 당분야에 공지된 모든 것을 포함한다.
용어 "상동의" 또는 "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 예를 들어 2개의 핵산 분자, 예를 들어 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자 사이, 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 분자 둘 다에서의 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때; 예를 들어 2개의 DNA 분자의 각각에서의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 그들은 그 위치에서 상동 또는 동일하다. 2개의 서열 사이의 상동성은 매치되거나 상동의 위치의 개수의 직접 함수이며; 예를 들어 2개의 서열에서 위치의 절반(예를 들어 10개 서브유닛 길이의 중합체에서 5개 위치)이 상동이면, 2개의 서열은 50% 상동이고; 위치의 90%(예를 들어 10개 중 9개)가 매치되거나 상동이면, 2개의 서열은 90% 상동이다.
용어 "단리된"은 자연 상태로부터 변경되거나 제거되는 것을 의미한다. 예를 들어 살아있는 동물 내 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된"이 아니지만, 그 자연적인 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된"이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은, 본래가 아닌(non-native) 환경에서 존재할 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된" 또는 "전사 제어"는 이종 핵산 서열을 발현을 야기하는, 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 배치될 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 주는 경우 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 서로와 인접할 수 있으며, 예를 들어 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하기 위해 필요한 경우, 동일한 리딩 프레임 내에 있다.
용어 면역원성 조성물의 "비경구" 투여는 예를 들어 피하(s.c.), 정맥 내(i.v.), 근육 내(i.m.) 또는 흉골 내 주사, 종양 내, 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일 또는 이중 가닥 형태의 데 옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이의 중합체를 지칭한다. 명확히 제한되지 않는 한, 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연적 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 표시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명시적으로 표시된 서열뿐만 아니라 보존적으로 변형된 그의 변이체(예를 들어 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 이종상동체(ortholog), SNP 및 상보적 서열을 암시적으로 포괄한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함에 의해 달성 할 수 있다(문헌[Batzer et al., Nucleic Acid Res.19 : 5081 (1991)]; 문헌[Ohtsuka et al., J.Biol.Chem.260 : 2605-2608(1985)] 및 문헌[Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8 : 91-98(1994)]).
용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩티드 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 개수에 대해 제한은 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어는, 예를 들어 펩티드, 올리고 펩티드 및 올리고머로 당분야에서 통상적으로 지칭되는, 단쇄 및, 많은 유형이 있는, 단백질로 당분야에서 일반적으로 지칭되는 장쇄 둘 다 지칭한다. "폴리펩티드"에는 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이합체, 이종이합체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 등이 포함된다. 폴리펩티드에는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 또는 이의 조합이 포함된다.
용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적인 전사를 개시하기 위해 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다.
용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 산물의 발현을 위해 필요한 핵산 서열을 지칭한다. 일부 경우, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우에, 이 서열은 또한 인핸서 서열 및 유전자 산물의 발현을 위해 필요한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은, 예를 들어 조직 특이적 방법으로 유전자 산물을 발현하는 것일 수 있다.
용어 "구성적" 프로모터는 유전자 산물을 인코딩 또는 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우, 세포의 대부분 또는 모든 생리적 조건 하에서 유전자 산물이 세포에서 생산되도록 야기하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "유도성(inducible)" 프로모터는 유전자 산물을 인코딩 또는 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우, 실질적으로 프로모터에 대응하는 유도제가 세포 내에 존재할 때에만 유전자 산물이 세포에서 생산되도록 야기하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "조직 특이적" 프로모터는 유전자에 의해 인코딩 또는 특정된 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우, 실질적으로 세포가 프로모터에 대응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 세포에서 유전자 산물이 생산되도록 야기하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
메신저 RNA(mRNA)와 관련되어 본원에 사용된, 5'캡(RNA 캡, RNA 7- 메틸구아노신 캡 또는 RNA m7G 캡으로 또한 불림)은 "프론트" 또는 전사 시작 직후 진핵 세포 메신저 RNA의 5' 말단에 부가된 변형된 구아닌 뉴클레오티드이다. 5'캡은 첫 번째 전사되는 뉴클레오티드에 연결된 말단 군으로 구성된다. 그 존재는 리보솜에 의한 인식 및 RNase로부터의 보호에 대단히 중요하다. 캡 부가는 전사에 연결되며, 각자가 서로에게 영향을 미치도록, 동시-전사적으로(co-transcriptionally) 발생한다. 전사 시작 직후, 합성되는 mRNA의 5' 말단은 RNA 폴리머라제와 관련된 캡 합성 복합체에 의해 결합된다. 이 효소 복합체는 mRNA 캡핑에 필요한 화학 반응을 촉매한다. 합성은 다단계 생화학 반응으로 진행한다. 캡핑 모이어티는 안정성 또는 번역 효율과 같은 mRNA의 기능성을 조절하도록 변형될 수 있다.
본원에 사용된 "시험관내 전사된 RNA"는 시험관내에서 합성된 RNA, 바람직하게는 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 시험관내 전사된 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 생성된다. 시험관내 전사 벡터는 시험관내 전사된 RNA를 생성하기 위해 사용되는 주형을 포함한다.
본원에 사용된 "폴리(A)"는 폴리아데닐화에 의해 mRNA에 붙은 일련의 아데노신이다. 일시적 발현을 위한 작제물의 바람직한 구현예에서, 폴리A는 50과 5000 사이(SEQ ID NO: 6596), 바람직하게는 64 초과, 더욱 바람직하게는 100 초과, 가장 바람직하게는 300 또는 400 초과이다. 폴리(A) 서열은, 배치, 안정성 또는 번역 효율과 같은 mRNA 기능성을 조절하기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다.
본원에 사용된 "폴리아데닐화"는 폴리아데닐일 모이어티 또는 이의 변형된 변이체의 메신저 RNA 분자로의 공유 결합을 지칭한다. 진핵 생물에서 대부분의 메신저 RNA(mRNA) 분자는 3' 말단에서 폴리아데닐화된다. 3'폴리(A) 꼬리는 효소인 폴리아데닐레이트 폴리머라제의 작용을 통해 pre-mRNA에 부가된 아데닌 뉴클레오티드(종종 수백 개)의 긴 서열이다. 고등 진핵 생물에서 폴리(A) 꼬리는 특정 서열인 폴리아데닐화 신호를 함유하는 전사체에 부가된다. 폴리(A) 꼬리 및 그에 결합된 단백질은 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 mRNA를 보호하는데 도움을 준다. 폴리아데닐화는 또한 전사 종결, 핵으로부터의 mRNA의 외수송, 및 번역을 위해 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA가 RNA로 전사 된 직후에 핵에서 발생하지만, 추가적으로, 이후에 세포질에서도 발생할 수 있다. 전사가 종결된 후, mRNA 사슬은 RNA 폴리머라제와 관련된 엔도뉴클레아제 복합체의 작용을 통해 절단된다. 절단 부위는 통상적으로 절단 부위 근처의 염기 서열 AAUAAA의 존재를 특징으로 한다. mRNA가 절단된 후, 아데노신 잔기가 절단 부위에서 유리 3' 말단에 부가된다.
본원에 사용된, "일시적(transient)"은 수 시간, 수 일 또는 수 주의 기간 동안 통합되지 않은 전이 유전자의 발현을 지칭하며, 발현 기간은 게놈에 통합되는 경우 또는 숙주 세포에서 안정한 플라스미드 복제 단물 내에 함유되는 경우의 유전자 발현을 위한 기간보다 적다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은, 하나 이상의 치료법(예를 들어 gRNA 분자, CRISPR 시스템, 또는 본 발명의 변형된 세포와 같은 하나 이상의 치료제)의 투여로부터 발생하는, 장애, 예를 들어 혈색소병증의 진행, 중증도 및/또는 지속기간의 감소 또는 개선, 또는 장애, 예를 들어 혈색소병증의 하나 이상의 증상(바람직하게는, 하나 이상의 식별 가능한 증상)의 개선을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 환자에 의해 식별되지 않는, 혈색소병증 장애의 적어도 하나의 측정 가능한 신체적 파라미터의 개선을 지칭한다. 다른 구현예에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 신체적으로, 예를 들어 식별 가능한 증상의 안정화에 의해, 생리적으로, 예를 들어 신체적 파라미터의 안정화에 의해, 또는 둘 다에 의해 장애의 진행을 저해하는 것을 지칭한다. 다른 구현예에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 혈색소병증, 예를 들어 겸상 적혈구 질병 또는 베타-탈라세미아의 증상의 감소 또는 안정화를 지칭한다.
용어 "신호 전달 경로"는 세포의 한 부분에서 세포의 또다른 부분으로의 신호 전달에 중요한 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 문구 "세포 표면 수용체"는 신호를 받고 세포막 건너 신호를 전달할 수 있는 분자 및 분자의 복합체를 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 유도될 수있는 살아있는 유기체(예를 들어 포유동물, 인간)를 포함하는 것을 의미한다.
용어 "실질적으로 정제된" 세포는 본질적으로 다른 세포 유형이 없는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 자연적으로 발생하는 상태에서 정상적으로 관련되어 있는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 경우, 실질적으로 정제된 세포 집단은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 다른 경우, 이 용어는 단순히 자연 상태에서 자연적으로 관련되어 있는 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 양태에서, 세포는 시험관내 배양된다. 다른 양태에서, 세포는 시험관내 배양되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "치료적"은 치료를 의미한다. 치료적 효과는 질병 상태의 감소, 억제, 완화 또는 박멸에 의해 수득된다.
본원에 사용된 용어 "예방"은 질병 또는 질병 상태의 예방 또는 보호적 처치를 의미한다.
용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산 및/또는 단백질이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산 및/또는 단백질로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 것이다. 세포는 일차 대상체 세포 및 그의 자손을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합한다"는 샘플 내에 존재하는 결합 파트너(예를 들어 단백질 또는 핵산)를 인식하고 결합하지만, 샘플 내의 다른 분자를 실질적으로 인식 또는 결합하지 않는 분자를 지칭한다.
용어 "생물학적 동등성의"는 참조 화합물의 참조 용량 또는 참조량에 의해 생산된 효과와 동등한 효과를 생산하기 위해 필요한, 참조 화합물 외의 제제의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 "불응성"은 치료에 반응하지 않는 질병, 예를 들어 혈색소병증을 지칭한다. 구현예에서, 불응성 혈색소병증은 치료 시작 전 또는 치료 초기에 내성을 나타낼 수 있다. 다른 구현예에서, 불응성 혈색소병증은 치료 동안 내성이 생길 수 있다. 불응성 혈색소병증은 내성 헤모글로빈 병증으로도 불린다.
본원에 사용된 "재발된"은 개선 기간 후, 예를 들어 치료법, 예를 들어 혈색소병증 치료법의 이전 처치 후 질병(예를 들어 혈색소병증) 또는 혈색소병증과 같은 질병의 징후 및 증상의 복귀를 지칭한다.
범위: 본 개시 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 양태가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 융통성없는 제한으로 해석되어서는 안된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위 범위뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위 범위뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 또다른 예로서, 95 내지 99% 동일성과 같은 범위에는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 어떤 것이 포함되고, 96 내지 99%, 96 내지 98%, 96 내지 97%, 97 내지 99%, 97 내지 98% 및 98 내지 99% 동일성과 같은 하위 범위가 포함된다. 이것은 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
용어 "BCL11a"는 B-세포 림프종/백혈병 11A, RNA 폴리머라제 II 코어 프로모터 근위 영역 서열-특이적 DNA 결합 단백질, 및 모든 인트론 및 엑손과 함께 상기 단백질을 인코딩하는 유전자를 지칭한다. 이 유전자는 C2H2 형 징크 핑거 단백질을 인코딩한다. BCL11A는 태아 헤모글로빈 생산 억제에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. BCL11a는 B-세포 CLL/림프종 11A(징크 핑거 단백질), CTIP1, EVI9, 동종지향성 바이러스 통합 부위 9 단백질 동족체, COUP-TF-상호 작용 단백질 1, 징크 핑거 단백질 856, KIAA1809, BCL-11A, ZNF856, EVI-9 및 B-세포 CLL/림프종 11A로 또한 알려져 있다. 용어는 BLC11a의 모든 아이소폼(isoform) 및 스플라이스 변이체를 포괄한다. BCL11a를 인코딩하는 인간 유전자는 염색체 위치2p16.1(Ensembl에 의한)로 맵핑된다. 인간 및 쥐의 아미노산 및 핵산 서열은 GenBank, UniProt 및 Swiss-Prot.와 같은 공개 데이터베이스에서 찾을 수 있으며, 인간 BCL11a의 게놈 서열은 GenBank에서 NC_000002.12에서 찾을 수 있다. BCL11a 유전자는 모든 인트론 및 엑손을 포함하여 이 게놈 위치를 지칭한다. 다수의 알려진 BCL11a의 아이소타입(isotype)이 있다.
인간 BCL11a의 아이소폼1을 인코딩하는 mRNA의 서열은 NM_022893에서 찾을 수있다.
인간 BCL11a의 아이소폼1의 펩티드 서열은 아래이다:
Figure pct00001
Figure pct00002
SEQ ID NO: 21-1(식별자 Q9H165-1; 및 NM_022893.3; 및 accession ADL14508.1).
다른 BCL11a 단백질 아이소폼의 서열은 아래에서 제공된다.
아이소폼2: Q9H165-2
아이소폼3: Q9H165-3
아이소폼4: Q9H165-4
아이소폼5: Q9H165-5
아이소폼6: Q9H165-6
본원에 사용된, 인간 BCL11a 단백질은 또한 그의 전장에 걸쳐 BCL11a 이소형 1 내지 6과 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 포괄하며, 이러한 단백질은 여전히 BCL11a의 기능 중 적어도 하나를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "글로빈 유전자좌"는 배아(ε), 태아(G(γ) 및 A(γ)), 성인 글로빈 유전자(γ 및 β), 유전자좌 제어 영역 및 DNase I 과민성 부위를 포함하는 인간 염색체 11의 영역을 지칭한다.
핵산과 관련되어 사용된 용어 "상보적"은 염기들, A의 T 또는 U와의, 및 G의 C와의 쌍을 지칭한다. 용어 상보적은 완전히 상보적인, 즉, 전체 참조 서열에 걸쳐 A 대 T 또는 U 쌍 및 G 대 C 쌍을 형성하는 핵산 분자뿐만 아니라 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 상보적인 분자도 지칭한다.
용어 "HPFH"는 유전성 태아 헤모글로빈지속을 지칭하며, 성인 적혈구에서의 증가된 태아 헤모글로빈을 특징으로 한다. 용어 "HPFH 영역"은 변형(예를 들어 돌연변이 또는 결실)되는 경우 성인 적혈구에서 증가된 HbF 생산을 야기하는 게놈 부위를 지칭하며, 문헌에서 확인된 HPFH 부위를 포함한다(예를 들어 the Online Mendelian Inheritance in Man: http://www.omim.org/entry/141749 참조). 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 염색체 11p15상의 베타 글로빈 유전자 클러스터 내에 있거나 또는 포괄하는 영역이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 델타 글로빈 유전자의 적어도 부분 내에 있거나 포괄한다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 HBG1의 프로모터의 영역이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 HBG1의 프로모터의 영역이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 문헌[Sankaran VG et al. NEJM(2011) 365: 807-814]에 기재된 영역이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 문헌[Sankaran VG et al. NEJM(2011) 365: 807-814]에 기재된 프렌치 브레이크포인트 결실 HPFH 이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 문헌[Sankaran VG et al. NEJM(2011) 365: 807-814]에 기재된 알제리안 HPFH이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 문헌[Sankaran VG et al. NEJM(2011) 365: 807-814]에 기재된 스리랑칸 HPFH이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 문헌[Sankaran VG et al. NEJM(2011) 365: 807-814]에 기재된 HPFH-3이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 문헌[Sankaran VG et al. NEJM(2011) 365: 807-814]에 기재된 HPFH-2이다. 구현예에서, HPFH-1 영역은 문헌[Sankaran VG et al. NEJM(2011) 365: 807-814]에 기재된 HPFH-3이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 문헌[Sankaran VG et al. NEJM(2011) 365: 807-814]에 기재된 스리랑칸(δβ)0-탈라세미아HPFH이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 문헌[Sankaran VG et al. NEJM(2011) 365: 807-814]에 기재된 시칠리안(δβ)0-탈라세미아HPFH이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 문헌[Sankaran VG et al. NEJM(2011) 365: 807-814]에 기재된 마케도니안(δβ)0-탈라세미아HPFH이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 문헌[Sankaran VG et al. NEJM(2011) 365: 807-814]에 기재된 쿠르디쉬 β0-탈라세미아HPFH이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 Chr11: 5213874-5214400(hg18)에 위치하는 영역이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 Chr11: 5215943-5215046(hg18)에 위치하는 영역이다. 예시적인 구현예에서, HPFH 영역은 Chr11: 5234390-5238486(hg38)에 위치하는 영역이다.
용어가 본원에 사용되는 바와 같이 "BCL11a 인핸서"는 BCL11a의 발현 또는 기능에 영향을 미치는, 예를 들어 증강시키는 핵산 서열을 지칭한다. 예를 들어 문헌[Bauer et al., Science, vol. 342, 2013, pp. 253-257]을 참조하라. BCL11a 인핸서는 예를 들어 어떤 세포 유형, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포에서만 작동될 수 있다. BCL11a 인핸서의 한 예는 BCL11a 유전자 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열이다(예를 들어 hg38에 기록된 +55: Chr2 : 60497676-60498941, +58: Chr2: 60494251-60495546; +62 : Chr2: 60490409-60491734 위치에 있는 또는 위치에 해당하는 핵산). 구현예에서, BCL11a 인핸서는 BCL11a 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +62 영역이다. 구현예에서, BCL11a 인핸서는 BCL11a 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +58 영역이다. 구현예에서, BCL11a 인핸서는 BCL11a 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +55 영역이다.
용어 "조혈 줄기 및 전구 세포" 또는 "HSPC"는 상호교환적으로 사용되며, 조혈 줄기 세포("HSC") 및 조혈 전구 세포("HPC")를 둘 다 포함하는 세포 집단을 지칭한다. 이러한 세포는, 예를 들어 CD34+ 인 것을 특징으로 한다. 예시적인 구현예에서, HSPC는 골수로부터 단리된다. 다른 예시적 구현예에서, HSPC는 말초 혈액으로부터 단리된다. 다른 예시적 구현예에서, HSPC는 제대혈로부터 단리된다.
본원에 사용된 "줄기 세포 확장제"는 세포, 예를 들어 HSPC, HSC 및/또는 HPC가 상기 제제가 없는 동일한 세포 유형에 비해 더 빠른 속도로 증식, 예를 들어 수가 증가하도록 야기하는 화합물을 지칭한다. 하나의 예시적인 양태에서, 줄기 세포 확장제는 아릴 탄화수소 수용체 경로의 저해제이다. 줄기 세포 확장제의 추가적인 예는 아래에서 제공된다. 구현예에서, 증식, 예를 들어 수의 증가는 생체외에서 달성된다.
용어 "생착" 또는 "생착하다"는 수용자 예를 들어 포유동물 또는 인간 대상체의 신체 내로의 세포 또는 조직, 예를 들어 HSPC의 집단의 혼입을 지칭한다. 일 실시예에서, 생착은 수용자 내에서 생착된 세포의 성장, 확장 및/또는 분화를 포함한다. 실시예에서, HSPC의 생착은 수용자 신체 내에서의 상기 HSPC의 적혈구계 세포로의 분화 및 성장을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "조혈 전구 세포"(HPC)"는 자가 재생을 위한 제한된 능력 및, 조혈 계층 내 배치에 따라(문헌[Doulatov et al., Cell Stem Cell 2012]), 다-계통 분화(예를 들어 골수성, 림프성), 단일 계통 분화(예를 들어 골수성 또는 림프성) 또는 세포 유형 한정된 분화(예를 들어 적혈구계 전구 세포)를 위한 잠재력을 갖는 원시 조혈 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 "조혈 줄기 세포(HSC)"는 자가 재생 능력, 및 과립구(예를 들어 전골수구, 호중구, 호산구, 호염기구), 적혈구(예를 들어 망상 적혈구, 적혈구), 혈전구(예를 들어 거핵모구, 혈소판 생산 거핵구, 혈소판) 및 단핵구(예를 들어 단핵구, 대식세포)를 포함하는 더 성숙한 혈액 세포로의 분화 능력을 갖는 미성숙 혈액 세포를 지칭한다. HSC는 명세서 전반에 걸쳐 줄기 세포로 상호 교환적으로 기재된다. 이러한 세포는 CD34+ 세포를 포함하거나 포함하지 않을 수 있음이 당분야에 공지되어 있다. CD34+ 세포는 CD34 세포 표면 마커를 발현하는 미성숙 세포이다. CD34+ 세포는 상기 정의된 줄기 세포 특성을 갖는 세포의 하위 집단을 포함하는 것으로 생각된다. HSC는 원시 전구 세포(예를 들어 다능성 전구 세포) 및/또는 특정 조혈 계통(예를 들어 림프 전구 세포)에 헌신된 전구 세포를 생기게 하는 다능성 세포인 것이 당분야에 잘 알려져 있다. 특정 조혈 계통에 헌신된 줄기 세포는 T 세포 계통, B 세포 계통, 수지상 세포 계통, 랑게르한스 세포 계통 및/또는 림프계 조직 특이적 대식 세포 계통일 수있다. 추가적으로, HSC는 또한 장기 HSC(LT-HSC) 및 단기 HSC(ST-HSC)를 지칭한다. ST-HSC는 LT-HSC보다 더 활성있고 더 증식한다. 그러나, ST-HSC는 제한된 자가 재생을 갖는(즉, 오직 제한된 기간 동안 생존한다) 반면, LT-HSC는 무제한의 자가 재생을 갖는다(즉, 성인기 전반에 걸쳐 생존한다). 이들 HSC 중 임의의 것은 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 사용될 수 있다. 선택적으로, ST-HSC는 매우 증식하기고, 따라서, HSC 및 그의 자손의 수를 빠르게 증가시키기 때문에 유용하다. 조혈 줄기 세포는 선택적으로 혈액 산물로부터 수득된다. 혈액 산물은 조혈 기원 세포를 함유하는 신체 또는 신체 기관으로부터 수득된 산물을 포함한다. 이러한 공급원은 분획되지 않은 골수, 제대, 말초 혈액(예를 들어 동원된 말초 혈액, 예를 들어 G-CSF 또는 Plerixafor®(AMD3100)과 같은 동원 제제로 동원된 말초 혈액), 간, 흉선, 림프 및 비장을 포함한다. 전술한 원래 그대로의 또는 분획되지 않은 혈액 산물 모두는 당업자에게 공지된 방법으로 조혈 줄기 세포 특징을 갖는 세포에 대해 부화될 수 있다. 구현예에서, HSC는 CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA-인 것을 특징으로 한다. 구현예에서, HSC는 CD34+/CD90+/CD49f+ 세포인 것을 특징으로 한다.
세포의 맥락에서 "확장" 또는 "확장하다"는 세포의 초기 세포 집단으로부터, 동일하거나 동일하지 않을 수 있는, 특징적인 세포 유형 또는 세포 유형들의 수의 증가를 지칭한다. 확장을 위해 사용된 초기 세포는 확장으로부터 생성된 세포와 동일하지 않을 수 있다.
"세포 집단"은 생물학적 공급원, 예를 들어 혈액 산물 또는 조직으로부터 단리되고, 하나를 초과하는 세포에서 유래된 진핵 포유동물, 바람직하게는 인간 세포를 지칭한다.
세포 집단의 맥락에 사용될 때 "부화된"은 하나 이상의 마커(예를 들어 CD34+)의 존재에 기반하여 선택된 세포 집단을 지칭한다.
용어 "CD34+ 세포"는 표면에 CD34 마커를 발현하는 세포를 지칭한다. CD34+ 세포는 예를 들어 유세포 분석 및 형광 표지된 항-CD34 항체를 이용하여 검출되고 계수될 수 있다.
"CD34+ 세포로 부화된"은 세포 집단이 CD34 마커의 존재에 기반하여 선택되었다는 것을 의미한다. 따라서, 선택 방법 후의 세포 집단 내 CD34+ 세포의 백분율은 CD34 마커에 기반한 선택 단계 전의 초기 세포 집단 내 CD34+ 세포의 백분율보다 높다. 예를 들어 CD34+ 세포는 CD34+ 세포로 부화된 세포 집단 내 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 적어도 90%에 해당할 수 있다.
용어 "F 세포" 및 "F-세포"는 태아 헤모글로빈을 함유 및/또는 생산(예를 들어 발현)하는 일반적으로 적혈구(예를 들어 적혈구)인 세포를 지칭한다. 예를 들어 F 세포는 검출 가능한 수준의 태아 헤모글로빈을 함유하거나 생산하는 세포이다. 예를 들어 F-세포는 적어도 5 피코그램의 태아 헤모글로빈을 함유하거나 생산하는 세포이다. 또다른 실시예에서, F-세포는 적어도 6 피코그램의 태아 헤모글로빈을 함유하거나 생산하는 세포이다. 또다른 실시예에서, F-세포는 적어도 7 피코그램의 태아 헤모글로빈을 함유하거나 생산하는 세포이다. 또다른 실시예에서, F-세포는 적어도 8 피코그램의 태아 헤모글로빈을 함유하거나 생산하는 세포이다. 또다른 실시예에서, F-세포는 적어도 9 피코그램의 태아 헤모글로빈을 함유하거나 생산하는 세포이다. 또다른 실시예에서, F-세포는 적어도 10 피코그램의 태아 헤모글로빈을 함유하거나 생산하는 세포이다. 태아 헤모글로빈의 수준은 본원에 기재된 검정 또는 당분야에 공지된 다른 방법, 예를 들어 항-태반 헤모글로빈 검출 시약을 이용하는 유세포 분석, 고성능 액체 크로마토그라피, 질량 분광분석, 또는효소-관련 면역흡착 측정을 사용하여 측정될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 모든 게놈 또는 염색체 좌표는 hg38에 따른다.
상세한 설명
본원에 기재된 gRNA 분자, 조성물 및 방법은 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 진핵 세포에서의 게놈 편집에 관한 것이다. 특히, 본원에 기재된 gRNA 분자, 조성물 및 방법은 글로빈 수준의 조절에 관한 것이며, 예를 들어 글로빈 유전자 및 단백질의 발현 및 생산 조절에 유용하다. gRNA 분자, 조성물 및 방법은 혈색소병증의 치료에 유용할 수 있다.
I. gRNA 분자
gRNA 분자는 아래에서 더 충분히 기재된 바와 같이, 다수의 도메인을 가질 수 있으나, gRNA 분자는 전형적으로 적어도 하나의 crRNA 도메인(표적화 도메인을 포함하는) 및 tracr을 포함한다. CRISPR 시스템의 성분으로서 사용되는, 본 발명의 gRNA 분자는 표적 부위에서 또는 그 근처에서 DNA를 변형(예를 들어 서열을 변형)하는데 유용하다. 이러한 변형은 예를 들어 표적 부위를 포함하는 유전자의 기능적 산물의 감소된 또는 제거된 발현을 야기하는 결실 및/또는 삽입을 포함한다. 이들 용도, 및 추가적 용도는 아래에서 더 충분히 기재된다.
구현예에서, 단분자, 또는 sgRNA는 바람직하게는 5'에서 3'으로:(표적 서열에 상보적인 표적화 도메인 및 플래그폴의 부분을 형성하는 영역(즉, crRNA 플래그폴 영역)을 함유하는) crRNA; 루프; 및 (crRNA 플래그폴 영역에 상보적인 도메인, 및 뉴클레아제 또는 다른 이펙터 분자, 예를 들어 Cas 분자, 예를 들어 Cas9 분자에 추가적으로 결합하는 도메인을 함유하는) tracr을 포함하고, 다음의 형식을 취할 수 있다(5'에서 3'으로):
[표적화 도메인]-[crRNA 플래그폴 영역]-[선택적인 제1플래그폴 연장]-[루프]-[선택적인 제1 tracr 연장]-[tracr 플래그폴 영역]-[tracr 뉴클레아제 결합 도메인].
구현예에서, tracr 뉴클레아제 결합 도메인은 Cas 단백질, 예를 들어 Cas9 단백질에 결합한다.
구현예에서, 이분자, 또는 dgRNA는 2개의 폴리뉴클레오티드를 포함한다; 제1, 바람직하게는 5'에서 3'으로:(표적 서열에 상보적인 표적화 도메인 및 플래그폴의 부분을 형성하는 영역을 함유하는) crRNA; 및 제2, 바람직하게는 5'에서 3'으로:(crRNA 플래그폴 영역에 상보적인 도메인, 및 뉴클레아제 또는 다른 이펙터 분자, 예를 들어 Cas 분자, 예를 들어 Cas9 분자에 추가적으로 결합하는 도메인을 함유하는) tracr, 그리고 다음의 형식을 취할 수 있다(5'에서 3'으로):
폴리뉴클레오티드1(crRNA): [표적화 도메인]-[crRNA 플래그폴 영역]-[선택적인 제1 플래그폴 연장]-[선택적인 제2플래그폴 연장]
폴리뉴클레오티드2(tracr): [선택적인 제1 tracr 연장]-[tracr 플래그폴 영역] - [tracr 뉴클레아제 결합 도메인]
구현예에서, tracr 뉴클레아제 결합 도메인은 Cas 단백질, 예를 들어 Cas9 단백질에 결합한다.
일부 양태에서, 표적화 도메인은 본원에 기재된 표적화 도메인 서열, 예를 들어 표 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 기재된 표적화 도메인, 또는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5 또는 표 6에 기재된 표적화 도메인 서열의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25(바람직하게는 20) 개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 표적화 도메인을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일부 양태에서, 플래그폴, 예를 들어 crRNA 플래그폴 영역은 5'에서 3'으로: GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO: 6584)를 포함한다.
일부 양태에서, 플래그폴, 예를 들어 crRNA 플래그폴 영역은 5'에서 3'으로: GUUUAAGAGCUA(SEQ ID NO: 6585)를 포함한다.
일부 양태에서, 루프는 5'에서 3'으로: GAAA(SEQ ID NO: 6588)를 포함한다.
일부 양태에서, tracr은 5'에서 3'으로: UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 6589) 를 포함하며, 바람직하게는 SEQ ID NO 6584를 포함하는 gRNA 분자에 사용된다.
일부 양태에서, tracr은 5'에서 3'으로: UAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 6590) 를 포함하며, 바람직하게는 SEQ ID NO 6585를 포함하는 gRNA 분자에 사용된다.
일부 양태에서, gRNA는 또한 3' 말단에 추가적인 U 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어 gRNA는 3' 말단에 추가적인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 U 핵산을 포함할 수 있다. 구현예에서, gRNA는 3' 말단에 추가적인 4개의 U 핵산을 포함한다. dgRNA의 경우, dgRNA의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어 표적화 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 tracr을 포함하는 폴리뉴클레오티드)는 3' 말단에 추가적인 U 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어 dgRNA의 경우, dgRNA의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어 표적화 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 tracr을 포함하는 폴리뉴클레오티드)는 추가적인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 U 핵산을 3' 말단에 포함할 수 있다. 구현예에서, dgRNA의 경우, dgRNA의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어 표적화 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 tracr을 포함하는 폴리뉴클레오티드)은 3' 말단에 추가적인 4개의 U 핵산을 포함한다. dgRNA의 구현예에서, 오직 tracr을 포함하는 폴리뉴클레오티드만 추가적인 U 핵산(들), 예를 들어 4개의 U 핵산을 포함한다. dgRNA의 구현예에서, 오직 표적화 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드만 추가적인 U 핵산(들)을 포함한다. dgRNA의 구현예에서, 표적화 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 tracr을 포함하는 폴리뉴클레오티드 둘 다 추가적인 U 핵산, 예를 들어 4개의 U 핵산을 포함한다.
일부 양태에서, gRNA는 또한 3' 말단에 추가적인 A 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어 gRNA는 3' 말단에 추가적인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의A 핵산을 포함할 수 있다. 구현예에서, gRNA는 3' 말단에 추가적인 4개의A 핵산을 포함한다. dgRNA의 경우, dgRNA의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어 표적화 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 tracr을 포함하는 폴리뉴클레오티드)는 3' 말단에 추가적인A 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어 dgRNA의 경우, dgRNA의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어 표적화 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 tracr을 포함하는 폴리뉴클레오티드)는 추가적인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의A 핵산을 3' 말단에 포함할 수 있다. 구현예에서, dgRNA의 경우, dgRNA의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어 표적화 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 tracr을 포함하는 폴리뉴클레오티드)은 3' 말단에 추가적인 4개의A 핵산을 포함한다. dgRNA의 구현예에서, 오직 tracr을 포함하는 폴리뉴클레오티드만 추가적인 A 핵산(들), 예를 들어 4개의 A 핵산을 포함한다. dgRNA의 구현예에서, 오직 표적화 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드만 추가적인 A 핵산(들)을 포함한다. dgRNA의 구현예에서, 표적화 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 tracr을 포함하는 폴리뉴클레오티드 둘 다 추가적인 U 핵산, 예를 들어 4개의A 핵산을 포함한다.
구현예에서, gRNA 분자의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 5' 말단에 캡을 포함할 수 있다.
구현예에서, 단분자, 또는 sgRNA는, 바람직하게는 5'에서 3'으로: crRNA(표적 서열에 상보적인 표적화 도메인을 함유하는); crRNA 플래그폴 영역; 제1 플래그폴 연장; 루프; 제1 tracr 연장(제1 플래그폴 연장의 적어도 일부분에 상보적인 도메인을 함유하는); 및 tracr(crRNA 플래그폴 영역에 상보적인 도메인, 및 Cas9 분자에 추가적으로 결합하는 도메인을 함유하는)를 포함한다. 일부 양태에서, 표적화 도메인은, 본원에 기재된 표적화 도메인 서열, 예를 들어 표 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 기재된 표적화 도메인, 또는 표 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 기재된 표적화 도메인 서열의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25(바람직하게는 20) 개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 표적화 도메인, 예를 들어 표 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 기재된 표적화 도메인 서열의 3' 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25(바람직하게는 20) 개의 연속적 뉴클레오티드를 포함한다.
제1 플래그폴 연장 및/또는 제1 tracr 연장을 포함하는 양태에서, 플래그폴, 루프 및 tracr 서열은 상기 기재된 바와 같을 수 있다. 일반적으로 임의의 제1플래그폴 연장 및 제1 tracr 연장은 그들이 상보적이라면 이용될 수 있다. 구현예에서, 제1 플래그폴 연장 및 제1 tracr 연장은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 상보적 뉴클레오티드로 구성된다.
일부 양태에서, 제1 플래그폴 연장은 5'에서 3'으로: UGCUG(SEQ ID NO: 6586)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 플래그폴 연장은 SEQ ID NO: 6586으로 구성된다.
일부 양태에서, 제1 tracr 연장은 5'에서 3'으로: CAGCA(SEQ ID NO: 6591)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 tracr 연장은 SEQ ID NO: 6591로 구성된다.
구현예에서, dgRNA는 2개의 핵산 분자를 포함한다. 일부 양태에서, dgRNA는 바람직하게는 5'에서 3'으로: 표적 서열에 상보적인 표적화 도메인; crRNA 플래그폴 영역; 선택적으로 제1 플래그폴 연장; 및 선택적으로, 제2 플래그폴 연장을 함유하는 제1핵산; 및 바람직하게는 5'에서 3'으로: 선택적으로 제1 tracr 연장; 및 tracr(crRNA 플래그폴 영역에 상보적인 도메인, 및 Cas, 예를 들어 Cas9, 분자에 추가로 결합하는 도메인을 함유하는)을 포함하는 제2핵산(본원에서 tracr로 지칭될 수 있고, Cas 분자, 예를 들어 Cas9 분자에 결합하는 적어도 하나의 도메인을 포함하는)을 포함한다. 제2 핵산은 추가적으로 3' 말단(예를 들어 tracr의 3')에 추가적인 U 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어 tracr은 3' 말단(예를 들어 tracr의 3')에 추가적인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 U 핵산을 포함할 수 있다. 제2 핵산은 추가적으로 또는 교대로 3' 말단(예를 들어 tracr의 3')에 추가적인 A 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어 tracr은 3' 말단(예를 들어 tracr에 대해 3')에 추가적인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 A핵산을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 표적화 도메인은 본원에 기재된 표적화 도메인 서열, 예를 들어 표 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 기재된 표적화 도메인, 또는 표 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 기재된 표적화 도메인 서열의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25(바람직하게는 20) 개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다.
dgRNA를 수반하는 양태에서, crRNA 플래그폴 영역, 선택적인 제1 플래그폴 연장, 선택적인 제1 tracr 연장 및 tracr 서열은 상기 기재된 바와 같을 수 있다.
일부 양태에서, 선택적인 제2 플래그폴 연장은 5'에서 3'으로: UUUUG(SEQ ID NO: 6587)를 포함한다.
구현예에서, gRNA 분자의 3' 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오티드, 5' 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오티드, 또는 3' 및 5' 둘 다의 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오티드(및 dgRNA 분자의 경우, 표적화 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 tracr을 포함하는 폴리뉴클레오티드)는 아래 섹션 XIII에서 더 충분히 기재된 바와 같이, 변형된 핵산이다.
도메인이 아래에 간략히 논의된다:
1) 표적화 도메인:
표적화 도메인의 선택에 대한 안내는 예를 들어 문헌[Fu Y el al. NAT BIOTECHNOL 2014(doi: 10.1038/nbt.2808)] 및 문헌[Sternberg SH el al. Nature 2014(doi: 10.1038/naturel3011)]에서 찾을 수 있다.
표적화 도메인은 표적 핵산 상의 표적 서열에 상보적인, 예를 들어 적어도 80, 85, 90, 95 또는 99% 상보적인, 예를 들어 완전히 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 표적화 도메인은 RNA 분자의 부분이며, 따라서 염기 우라실(U)을 포함할 것인 반면, gRNA 분자를 인코딩하는 임의의 DNA는 염기 티민(T)을 포함할 것이다. 이론에 얽매이기를 원하지 않지만, 표적 서열과 표적화 도메인의 상보성이 표적 핵산과 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체의 상호 작용의 특이성에 기여한다고 여겨진다. 표적화 도메인과 표적 서열 쌍에서, 표적화 도메인에서의 우라실 염기는 표적 서열에서의 아데닌 염기와 쌍을 이룰 것으로 이해된다.
구현예에서, 표적화 도메인은 5 내지 50, 예를 들어 10 내지 40, 예를 들어 10 내지 30, 예를 들어 15 내지 30, 예를 들어 15 내지 25 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 16 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 17 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 18 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 19 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 20 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 21 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 22 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 23 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 24 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 25 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 전술한 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오티드는 표 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 기재된 표적화 도메인으로부터 5'- 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오티드를 포함한다. 전술한 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오티드는 표 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 기재된 표적화 도메인으로부터 3'- 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오티드를 포함한다.
이론에 얽매이지 않고, 표적화 도메인의 3' 말단에 배치된 표적화 도메인의 8, 9, 10, 11 또는 12개의 핵산은 표적 서열을 표적화하는데 중요하며, 따라서 표적화 도메인의 '코어' 영역으로 지칭될 수 있다고 여겨진다. 구현예에서, 코어 도메인은 표적 서열과 완전히 상보적이다.
표적화 도메인이 상보적인 표적 핵산의 가닥은 본원에서 표적 서열로 지칭된다. 일부 양태에서, 표적 서열은 염색체 상에 배치되고, 예를 들어 유전자 내의 표적이다. 일부 양태에서, 표적 서열은 유전자의 엑손 내에 배치된다. 일부 양태에서, 표적 서열은 유전자의 인트론 내에 배치된다. 일부 양태에서, 표적 서열은 조절 요소의 결합 부위, 예를 들어 관심 유전자의 프로모터 또는 전사 인자 결합 부위를 포함하거나 인접한다(예를 들어 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 또는 1000 핵산 내). 도메인의 뉴클레오티드의 일부 또는 전부는 변형, 예를 들어 본원 섹션 XIII에서 확인되는 변형을 가질 수 있다.
2) crRNA 플래그폴 영역:
플래그폴은 crRNA 및 tracr둘 다로부터의 부분을 함유한다. crRNA 플래그폴 영역은 tracr의 일부분과 상보적이고, 구현예에서, 적어도 일부 생리적 조건, 예를 들어 정상적인 생리적 조건 하에서 이중 영역을 형성하기에 충분한 tracr의 일부분에 대한 상보성을 갖는다. 구현예에서, crRNA 플래그폴 영역은 5 내지 30뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, crRNA 플래그폴 영역은 5 내지 25 뉴클레오티드 길이이다. crRNA 플래그폴 영역은 박테리아 CRISPR 배열로부터의 반복 서열의 자연적 발생 부분과 상동성을 공유할 수 있거나, 이로부터 유래될 수 있다. 구현예에서, 본원에 개시된 crRNA 플래그폴 영역, 예를 들어 S. 피오게네스 또는 S. 써모필루스, crRNA 플래그폴 영역과 적어도 50%의 상동성을 갖는다.
구현예에서, 플래그폴, 예를 들어 crRNA 플래그폴 영역은 SEQ ID NO: 6584를 포함한다. 구현예에서, 플래그폴, 예를 들어 crRNA플래그폴 영역은 SEQ ID NO: 6584와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 플래그폴, 예를 들어 crRNA 플래그폴 영역은 SEQ ID NO: 6584의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 뉴클레오티드를 포함한다. 구현예에서, 플래그폴, 예를 들어 crRNA 플래그폴 영역은 SEQ ID NO: 6585를 포함한다. 구현예에서, 플래그폴은 SEQ ID NO: 6585와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 플래그폴, 예를 들어 crRNA 플래그폴 영역은 SEQ ID NO: 6585의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 뉴클레오티드를 포함한다.
도메인의 뉴클레오티드의 일부 또는 전부는 변형, 예를 들어 본원 섹션 XIII에 기재된 변형을 가질 수 있다.
3) 제1 플래그폴 연장
제1 tracr 연장을 포함하는 tracr이 사용되는 경우, crRNA는 제1 플래그폴 연장을 포함할 수 있다. 일반적으로 임의의 제1플래그폴 연장 및 제1 tracr 연장은 그들이 상보적이라면 이용될 수 있다. 구현예에서, 제1 플래그폴 연장 및 제1 tracr 연장은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 상보적 뉴클레오티드로 구성된다.
제1 플래그폴 연장은 제1 tracr 연장의 뉴클레오티드와 상보적인, 예를 들어 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%, 예를 들어 완전히 상보적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 제1 tracr 연장의 상보적인 뉴클레오티드와 혼성화되는 제1 플래그폴 연장 뉴클레오티드는 연속적이다. 일부 양태에서, 제1 tracr 연장의 상보적인 뉴클레오티드와 혼성화되는 제1 플래그폴 연장 뉴클레오티드는 불연속적이고, 예를 들어 제1 tracr 연장의 뉴클레오티드와 염기쌍 형성하지 않는 뉴클레오티드에 의해 분리된 2개 이상의 혼성화 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 플래그폴 연장은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 플래그폴 연장은 5'에서 3'으로: UGCUG(SEQ ID NO: 6586)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 플래그폴 연장은 SEQ ID NO: 6586으로 구성된다. 일부 양태에서, 제1 플래그폴 연장은 SEQ ID NO: 6586과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 핵산을 포함한다.
제1 tracr 연장의 뉴클레오티드의 일부 또는 전부는 변형, 예를 들어 본원 섹션 XIII에서 확인되는 변형을 가질 수 있다.
3) 루프
루프는 sgRNA의 crRNA 플래그폴 영역(또는 존재하는 경우, 선택적으로 제1플래그폴 연장)을tracr(또는 존재하는 경우, 선택적으로 제1 tracr 연장)와 연결하는 역할을 한다. 루프는 crRNA 플래그폴 영역과 tracr을 공유 또는 비공유 결합으로 연결할 수 있다. 구현예에서, 연결은 공유결합이다. 구현예에서, 루프는 crRNA 플래그폴 영역과 tracr을 공유결합으로 결합시킨다. 구현예에서, 루프는 제1 플래그폴 연장과 제1 tracr 연장을 공유결합으로 결합시킨다. 구현예에서, 루프는 crRNA 플래그폴 영역과 crRNA 플래그폴 영역에 혼성화되는 tracr의 도메인 사이에 삽입된 공유 결합이거나 이를 포함한다. 전형적으로, 루프는 하나 이상의, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드를 포함한다.
dgRNA 분자에서 2개의 분자는crRNA의 적어도 일부분(예를 들어 crRNA 플래그폴 영역)과 tracr의 적어도 일부분(예를 들어 crRNA 플래그폴 영역에 상보적인 tracr의 도메인) 사이의 혼성화에 의해 관련될 수 있다.
매우 다양한 루프가 sgRNA에서의 사용에 적합하다. 루프는 공유 결합으로 구성될 수 있거나, 1 또는 수 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오티드 길이만큼 짧을 수 있다. 구현예에서, 루프는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 루프는 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 20, 2 내지 10 또는 2 내지 5 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 루프는 자연적 발생 서열과 상동성을 공유하거나 또는 이로부터 유래된다. 구현예에서, 루프는 본원에 개시된 루프와 적어도 50%의 상동성을 갖는다. 구현예에서, 루프는 SEQ ID NO: 6588을 포함한다.
도메인의 뉴클레오티드의 일부 또는 전부는 변형, 예를 들어 본원 섹션 XIII에 기재된 변형을 가질 수 있다.
4) 제2 플래그폴 연장
구현예에서, dgRNA는 추가적인 서열, crRNA 플래그폴 영역에 대해 3', 또는 존재하는 경우, 본원에서 제2 플래그폴 연장으로 지칭되는 제1플래그폴 연장을 포함할 수 있다. 구현예에서, 제2 플래그폴 연장은 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5 또는 2 내지 4 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 제2 플래그폴 연장은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이상 뉴클레오티드 길이이다. 구현예에서, 제2 플래그폴 연장은 SEQ ID NO: 6587을 포함한다.
5) Tracr:
tracr은 뉴클레아제(예를 들어 Cas9) 결합에 필요한 핵산 서열이다. 이론에 얽매이지 않고, 각각의 Cas9 종은 특정 tracr 서열과 관련되어 있다고 여겨진다. Tracr 서열은 sgRNA 및 dgRNA 시스템 둘 다에 이용된다. 구현예에서, tracr은 S. 피오게네스 tracr으로부터의 서열, 또는 이로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 양태에서, tracr은 crRNA의 플래그폴 부분에 혼성화되는 일부분을 가지며, 예를 들어 적어도 일부 생리적 조건 하에서 이중 영역을 형성하기에 충분한 crRNA 플래그폴 영역에 대한 상보성을 갖는다(때때로 본원에서 tracr 플래그폴 영역 또는 crRNA 플래그폴 영역에 상보적인 tracr 도메인으로 지칭됨). 구현예에서, crRNA 플래그폴 영역과 혼성화되는 tracr 도메인은crRNA 플래그폴 영역의 상보적인 뉴클레오티드와 혼성화되는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, crRNA 플래그폴 영역의 상보적인 뉴클레오티드와 혼성화되는 tracr 뉴클레오티드는 연속적이다. 일부 양태에서, crRNA 플래그폴 영역의 상보적인 뉴클레오티드와 혼성화되는tracr뉴클레오티드는 불연속적이고, 예를 들어 crRNA 플래그폴 영역의 뉴클레오티드와 염기쌍 형성하지 않는 뉴클레오티드에 의해 분리된 2개 이상의 혼성화 영역을 포함한다. 일부 양태에서, crRNA 플래그폴 영역에 혼성화되는 tracr의 부분은 5'에서 3'으로 UAGCAAGUUAAAA(SEQ ID NO: 6597)를 포함한다. 일부 양태에서, crRNA 플래그폴 영역에 혼성화되는 tracr 부분은 5'에서 3'으로 UAGCAAGUUUAA(SEQ ID NO: 6598)를 포함한다. 구현예에서, crRNA 플래그폴 영역과 혼성화되는 서열은tracr 상에서 뉴클레아제, 예를 들어Cas 분자, 예를 들어 Cas9 분자와 추가적으로 결합하는 tracr의 서열의 5'에 배치된다.
tracr은 뉴클레아제, 예를 들어 Cas 분자, 예를 들어 Cas9 분자에 추가적으로 결합하는 도메인을 추가로 포함한다. 이론에 얽매이지 않고, 상이한 종으로부터의 Cas9는 상이한 tracr 서열에 결합한다고 여겨진다. 일부 양태에서, tracr은 S. 피오게네스 Cas9 분자에 결합하는 서열을 포함한다. 일부 양태에서, tracr은 본원에 개시된 Cas9 분자에 결합하는 서열을 포함한다. 일부 양태에서, Cas9 분자에 추가적으로 결합하는 도메인은 5'에서 3'으로: UAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 6599)를 포함한다. 일부 양태에서, Cas9 분자에 추가적으로 결합하는 도메인은 5'에서 3'으로:UAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 6600) 를 포함한다.
일부 구현예에서, tracr은 SEQ ID NO: 6589를 포함한다. 일부 구현예에서, tracr은 SEQ ID NO: 6590을 포함한다.
tracr의 뉴클레오티드의 일부 또는 전부는 변형, 예를 들어 본원 섹션 XIII에서 확인되는 변형을 가질 수 있다. 구현예에서, gRNA(예를 들어 sgRNA 또는 dgRNA의 tracr 및/또는 crRNA), 예를 들어 상기 기재된 gRNA 또는 gRNA 성분 중 임의의 것은 gRNA의 5' 말단, 3' 말단 또는 5' 및 3' 말단 둘 다에 역위된 무염기성(abasic) 잔기를 포함한다. 구현예에서, gRNA(예를 들어 sgRNA 또는dgRNA의tracr 및/또는 crRNA), 예를 들어 상기 기재된 gRNA 또는 gRNA 성분 중 임의의 것은 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 있는 잔기들 사이에 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합, 예를 들어 처음 2개의 5' 잔기들 사이, 처음 3개의 5' 잔기들 각각의 사이, 처음 4개의 5' 잔기들 각각의 사이, 또는 처음 5개의 5' 잔기들 각각의 사이의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 구현예에서, gRNA 또는 gRNA 성분은 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 있는 잔기들 사이에 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합, 예를 들어 처음 2개의 3' 잔기들 사이, 처음 3개의 3' 잔기들 각각의 사이, 처음 4개의 3' 잔기들 각각의 사이, 또는 처음 5개의 3' 잔기들 각각의 사이의 포스포로티오에이트 결합을 대안적으로 또는 추가로 포함할 수 있다. 구현예에서, gRNA(예를 들어 sgRNA 또는 dgRNA의 tracr 및/또는 crRNA), 예를 들어 상기 기재된 gRNA 또는 gRNA 성분 중 임의의 것은 처음 4개의 5' 잔기들 각각의 사이의 포스포로티오에이트 결합(예를 들어 5' 말단(들)에 3개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 예를 들어 이로 구성됨), 및 처음 4개의 3' 잔기들 각각의 사이의 포스포로티오에이트 결합(예를 들어 3' 말단(들)에 3개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 예를 들어 이로 구성됨)을 포함한다. 구현예에서, 상기 기재된 포스포로티오에이트 변형 중 임의의 것은 폴리뉴클레오티드의 5' 말단, 3' 말단 또는 5' 및 3' 말단 둘 다에서의 역위된 무염기성 잔기와 조합된다. 이러한 구현예에서, 역위된 무염기성 뉴클레오티드는 포스페이트 결합 또는 포스포로티오에이트 결합에 의해 5' 및/또는 3'뉴클레오티드에 연결될 수있다. 구현예에서, gRNA(예를 들어 sgRNA 또는 dgRNA의 tracr 및/또는 crRNA), 예를 들어 상기 기재된 gRNA 또는 gRNA 성분 중 임의의 것은 2'O-메틸 변형을 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 구현예에서, 처음 1, 2, 3 이상의 5' 잔기들 각각은 2'O-메틸 변형을 포함한다. 구현예에서, 처음 1, 2, 3 이상의 3' 잔기들 각각은 2'O-메틸 변형을 포함한다. 구현예에서, 말단 방향으로 4 번째, 말단 방향으로 3 번째, 및 말단 방향으로 2 번째 3' 잔기들은 2'O-메틸 변형을 포함한다. 구현예에서, 처음 1, 2, 3 이상의 5' 잔기들 각각은 2'O-메틸 변형을 포함하고, 처음 1, 2, 3 이상의 3' 잔기들 각각은 2'O-메틸 변형을 포함한다. 구현예에서, 처음 3개의 5' 잔기들 각각은 2'O-메틸 변형을 포함하고, 처음 3개의 3' 잔기들 각각은 2'O-메틸 변형을 포함한다. 구현예에서, 처음 3개의 5' 잔기들 각각은 2'O-메틸 변형을 포함하고, 말단 방향으로 4 번째, 말단 방향으로 3 번째, 및 말단 방향으로 2 번째 3' 잔기들은 2'O-메틸 변형을 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 상기 기재된 2'O-메틸 변형 중 임의의 것은, 예를 들어 상기 기재된 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 및/또는 예를 들어 상기 기재된 하나 이상의 역위된 무염기성의 변형과 조합될 수 있다. 구현예에서, gRNA(예를 들어 sgRNA 또는 dgRNA의 tracr 및/또는 crRNA), 예를 들어 상기 기재된 gRNA 또는 gRNA 성분 중 임의의 것은 처음 4개의 5' 잔기들 각각의 사이의 포스포로티오에이트 결합(예를 들어 폴리뉴클레오티드(들)의 5' 말단에 3개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 예를 들어 이로 구성됨), 처음 4개의 3' 잔기들 각각의 사이의 포스포로티오에이트 결합(예를 들어 폴리뉴클레오티드(들)의 5' 말단에 3개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 예를 들어 이로 구성됨), 처음 3개의 5' 잔기들 각각에 2'O-메틸 변형, 및 처음 3개의 3' 잔기들 각각에 2'O-메틸 변형을 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다. 구현예에서, gRNA(예를 들어 sgRNA 또는 dgRNA의 tracr 및/또는 crRNA), 예를 들어 상기 기재된 gRNA 또는 gRNA 성분 중 임의의 것은 처음 4개의 5' 잔기들 각각의 사이의 포스포로티오에이트 결합(예를 들어 폴리뉴클레오티드(들)의 5' 말단에 3개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 예를 들어 이로 구성됨), 처음 4개의 3' 잔기들 각각의 사이의 포스포로티오에이트 결합(예를 들어 폴리뉴클레오티드(들)의 5' 말단에 3개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 예를 들어 이로 구성됨), 처음 3개의 5' 잔기들 각각에 2'O-메틸 변형, 및 말단 방향으로 4 번째, 말단 방향으로 3 번째, 및 말단 방향으로 2 번째 3' 잔기 각각에 2'O-메틸 변형을 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, gRNA(예를 들어 sgRNA 또는 dgRNA의 tracr 및/또는 crRNA), 예를 들어 상기 기재된 gRNA 또는 gRNA 성분 중 임의의 것은 처음 4개의 5' 잔기들 각각의 사이의 포스포로티오에이트 결합(예를 들어 폴리뉴클레오티드(들)의 5' 말단에 3개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 예를 들어 이로 구성됨), 처음 4개의 3' 잔기들 각각의 사이의 포스포로티오에이트 결합(예를 들어 폴리뉴클레오티드(들)의 5' 말단에 3개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 예를 들어 이로 구성됨), 처음 3개의 5' 잔기들 각각에 2'O-메틸 변형, 처음 3개의 3' 잔기들 각각에 2'O-메틸 변형 및 5' 및 3' 말단 각각에 추가적인 역위된 무염기성 잔기를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, gRNA(예를 들어 sgRNA 또는 dgRNA의 tracr 및/또는 crRNA), 예를 들어 상기 기재된 gRNA 또는 gRNA 성분 중 임의의 것은 처음 4개의 5' 잔기들 각각의 사이의 포스포로티오에이트 결합(예를 들어 폴리뉴클레오티드(들)의 5' 말단에 3개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 예를 들어 이로 구성됨), 처음 4개의 3' 잔기들 각각의 사이의 포스포로티오에이트 결합(예를 들어 폴리뉴클레오티드(들)의 5' 말단에 3개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 예를 들어 이로 구성됨), 처음 3개의 5' 잔기들 각각에 2'O-메틸 변형, 및 말단 방향으로 4 번째, 말단 방향으로 3 번째, 및 말단 방향으로 2 번째 3' 잔기 각각에 2'O-메틸 변형, 및 5' 및 3' 말단 각각에 추가적인 역위된 무염기성 잔기를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, gRNA는 dgRNA이고:
crRNA:
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAU*mG*mC*mU, 여기서 m은 2'O-메틸 변형을 갖는 염기를 나타내고, *은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, N은 예를 들어 본원에 기재된 표적화 도메인의 잔기(선택적으로, 5' 및/또는 3' 말단에 역위된 무염기성 잔기를 갖는)를 나타낸다.; 및
tracr:
AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)(선택적으로 5' 및/또는 3' 말단에 역위된 무염기성 잔기를 갖는);를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, gRNA는 dgRNA이고:
crRNA:
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAU*mG*mC*mU, 여기서 m은 2'O-메틸 변형을 갖는 염기를 나타내고, *은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, N은 예를 들어 본원에 기재된 표적화 도메인의 잔기(선택적으로, 5' 및/또는 3' 말단에 역위된 무염기성 잔기를 갖는)를 나타낸다.; 및
tracr:
mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346), 여기서 m은 2'O-메틸 변형을 갖는 염기를 나타내고, *은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, N은 예를 들어 본원에 기재된 표적화 도메인의 잔기(선택적으로, 5' 및/또는 3' 말단에 역위된 무염기성 잔기를 갖는)를 나타낸다; 를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, gRNA는 dgRNA이고:
crRNA:
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG, 여기서 m은 2'O-메틸 변형을 갖는 염기를 나타내고, *은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, N은 예를 들어 본원에 기재된 표적화 도메인의 잔기(선택적으로, 5' 및/또는 3' 말단에 역위된 무염기성 잔기를 갖는)를 나타낸다; 및
tracr:
AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)(선택적으로 5' 및/또는 3' 말단에 역위된 무염기성 잔기를 갖는);를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, gRNA는 dgRNA이고:
crRNA:
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG, 여기서 m은 2'O-메틸 변형을 갖는 염기를 나타내고, *은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, N은 예를 들어 본원에 기재된 표적화 도메인의 잔기(선택적으로, 5' 및/또는 3' 말단에 역위된 무염기성 잔기를 갖는)를 나타낸다; 및
tracr:
mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346), 여기서 m은 2'O-메틸 변형을 갖는 염기를 나타내고, *은 포스포로티오에이트 결합(선택적으로, 5' 및/또는 3' 말단에 역위된 무염기성 잔기를 갖는)을 나타낸다; 를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, gRNA는 dgRNA이고:
crRNA:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG, 여기서 N은 예를 들어 본원에 기재된 표적화 도메인의 잔기(선택적으로, 5' 및/또는 3' 말단에 역위된 무염기성 잔기를 갖는)를 나타낸다; 및
tracr:
mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346), 여기서 m은 2'O-메틸 변형을 갖는 염기를 나타내고, *은 포스포로티오에이트 결합(선택적으로, 5' 및/또는 3' 말단에 역위된 무염기성 잔기를 갖는)을 나타낸다; 를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, gRNA는 sgRNA이고:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU, 여기서 m은 2'O-메틸 변형을 갖는 염기를 나타내고, *은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, N은 예를 들어 본원에 기재된 표적화 도메인의 잔기(선택적으로, 5' 및/또는 3' 말단에 역위된 무염기성 잔기를 갖는)를 나타낸다; 를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, gRNA는 sgRNA이고:
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU, 여기서 m은 2'O-메틸 변형을 갖는 염기를 나타내고, *은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, N은 예를 들어 본원에 기재된 표적화 도메인의 잔기(선택적으로, 5' 및/또는 3' 말단에 역위된 무염기성 잔기를 갖는)를 나타낸다; 를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, gRNA는 sgRNA이고:
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U, 여기서 m은 2'O-메틸 변형을 갖는 염기를 나타내고, *은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, N은 예를 들어 본원에 기재된 표적화 도메인의 잔기(선택적으로, 5' 및/또는 3' 말단에 역위된 무염기성 잔기를 갖는)를 나타낸다; 를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
6) 제1 Tracr 연장
gRNA가 제1 플래그폴 연장을 포함하는 경우, tracr은 제1 tracr 연장을 포함할 수 있다. 제1 tracr 연장은 제1 플래그폴 연장의 뉴클레오티드와 상보적인, 예를 들어 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%, 예를 들어 완전히 상보적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 제1 플래그폴 연장의 상보적인 뉴클레오티드와 혼성화되는 제1 tracr 연장 뉴클레오티드는 연속적이다. 일부 양태에서, 제1 플래그폴 연장의 상보적인 뉴클레오티드와 혼성화되는 제1 tracr 연장 뉴클레오티드는 불연속적이고, 예를 들어 제1 플래그폴 연장의 뉴클레오티드와 염기쌍 형성하지 않는 뉴클레오티드에 의해 분리된 2개 이상의 혼성화 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 tracr 연장은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 tracr 연장은 SEQ ID NO: 6591을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 tracr 연장은 SEQ ID NO: 6591과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동인 핵산을 포함한다.
제1 tracr 연장의 뉴클레오티드의 일부 또는 전부는 변형, 예를 들어 본원 섹션 XIII에서 확인되는 변형을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, sgRNA는 5'에서 3'으로 표적화 도메인에 대해 3'에 배치되는:
a) GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 6601);
b)
GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 6602);
c)
GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 6603);
d)
GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 6604);
e) 3' 말단에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 우라실(U) 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 우라실(U) 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 상기 a) 내지 d) 중 임의의 것;
f) 3' 말단에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 상기 a) 내지 d) 중 임의의 것; 또는
g) 5' 말단(예를 들어 5' 말단, 예를 들어 표적화 도메인에 대해 5')에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 상기 a) 내지 f) 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 구현예에서, 상기 a) 내지 g) 중 임의의 것은 표적화 도메인에 대해 3'에 직접 배치된다.
구현예에서, 본 발명의 sgRNA는 5'에서 3'으로: [표적화 도메인]- GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 7811)을 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, 본 발명의 sgRNA는 5'에서 3'으로: [표적화 도메인]-GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 7807) 을 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
일부 구현예에서, dgRNA는:
5'에서 3'으로, 바람직하게는 표적화 도메인에 대해 3'에 직접 배치된:
a) GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO: 6584);
b) GUUUAAGAGCUA(SEQ ID NO: 6585);
c) GUUUUAGAGCUAUGCUG(SEQ ID NO: 6605);
d) GUUUAAGAGCUAUGCUG(SEQ ID NO: 6606);
e) GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 6607);
f) GUUUAAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 6608); 또는
g) GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO: 7806): 를 포함하는 crRNA; 및
5'에서 3'으로:
a) UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 6589);
b) UAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 6590);
c) CAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 6609);
d) CAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 6610);
e) AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660);
f) AACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6661);
g) AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 7812)
h) GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 7807);
i) AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO: 7808);
j) GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO: 7809);
k) 3' 말단에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 우라실(U) 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 우라실(U) 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 상기 a) 내지 j) 중 임의의 것;
l) 3' 말단에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 상기 a) 내지 j) 중 임의의 것; 또는
m) 5' 말단(예를 들어 5'말단)에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 상기 a) 내지 l) 중 임의의 것;을 포함하는 tracr을 포함할 수 있다.
구현예에서, 상기 k)의 서열은, 예를 들어 U6 프로모터가 전사에 사용되는 경우 3'서열 UUUUUU를 포함한다. 구현예에서, 상기 k)의 서열은, 예를 들어 HI 프로모터가 전사에 사용되는 경우 3'서열 UUUU를 포함한다. 구현예에서, 상기 k)의 서열은, 예를 들어 사용된 pol-III 프로모터의 종결 신호에 따라, 가변 적인 개수의 3'U를 포함한다. 구현예에서, 상기 k)의 서열은 T7 프로모터가 사용되는 경우 DNA 주형으로부터 유래된 가변적인 3'서열을 포함한다. 구현예에서, 상기 k)의 서열은, 예를 들어 시험관내 전사가 RNA 분자를 생성하기 위해 사용되는 경우, DNA 주형으로부터 유래된 가변적인 3'서열을 포함한다. 구현예에서, 상기 k)의 서열은 예를 들어 pol-II 프로모터가 전사를 추진하는데 사용되는 경우, DNA 주형으로부터 유래된 가변적인 3'서열을 포함한다.
구현예에서, crRNA는 표적화 도메인 및, 표적화 도메인에 대해 3'에 배치된(예를 들어 표적화 도메인에 대해 3'에 직접 배치된) SEQ ID NO: 6607을 포함하고, 예를 들어 이로 구성되는 서열을 포함하고, 예를 들어 이로 구성되고, tracr은 AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, crRNA는 표적화 도메인 및, 표적화 도메인에 대해 3'에 배치된(예를 들어 표적화 도메인의 3'에 직접 배치된) SEQ ID NO: 6608을 포함하고, 예를 들어 이로 구성되는 서열을 포함하고, 예를 들어 이로 구성되고, tracr은 AACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6661) 를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, crRNA는 표적화 도메인 및, 표적화 도메인에 대해 3'에 배치된(예를 들어 표적화 도메인에 대해 3'에 직접 배치된) GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO: 7806)을 포함하고, 예를 들어 이로 구성되는 서열을 포함하고, tracr은GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 7807)를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, crRNA는 표적화 도메인 및, 표적화 도메인에 대해 3'에 배치된(예를 들어 표적화 도메인에 대해 3'에 직접 배치된) GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO: 7806) 을 포함하고, 예를 들어 이로 구성되는 서열을 포함하고, tracr은 AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO: 7808)를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
구현예에서, crRNA는 표적화 도메인 및, 표적화 도메인에 대해 3'에 배치된(예를 들어 표적화 도메인에 대해 3'에 직접 배치된) GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 6607)을 포함하고, 예를 들어 이로 구성되는 서열을 포함하고, tracr은 GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO: 7809)를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
II. 글로빈 유전자의 발현을 변경하는 것에 유용한 표적화 도메인
본 발명의 다양한 양태에서, 예를 들어 글로빈 유전자, 예를 들어 태아 헤모글로빈 유전자 또는 헤모글로빈 베타 유전자의 발현을 변경하는 것에서, 사용하기 위한 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인이 아래 표에 제공된다.
[표 1]
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
[표 2]
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
구현예에서, gRNA 표적화 도메인은 상기 표의 서열 중 임의의 하나의 20 3' nt로 구성된다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 예시적인 바람직한 gRNA 표적화 도메인은 아래 표에 기재된다.
[표 5]
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
[표 6]
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
본 발명의 일부 양태에서, HPFH 영역에 대한 gRNA 분자는, 예를 들어 실시예 4에 기재된 검정에서, 대조군에 비해 F 세포 적어도 약 20% 증가를 생산할 수 있는 gRNA의 표적화 도메인을 포함하는 것이, 예를 들어 이로 구성되는 것이 바람직하다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1503을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다.
예를 들어 본원에 표시된 바와 같이, 본 발명의 일부 양태에서, 하나 초과, 예를 들어 2개의 표적 부위를 표적화하는 gRNA 분자(예를 들어 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자)를 포함하는 것이 유익할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 표적 부위는 둘 다 HPFH 영역에 위치한다. 이러한 양태에서, 표 6에 나열된 표적화 도메인을 포함하는 하나 초과, 예를 들어 2개의 gRNA 분자(예를 들어 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자)의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 1503을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 100 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 1503을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 165 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 165을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 1503을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 1503을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 99 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 1503을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 112 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 1503을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 98 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 1503을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1580 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 1503을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 106 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1503 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 1503를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1589 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 1503를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 160 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 1503를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1537 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 1503를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 159 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 1503를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 104를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 101 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 162 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 162 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 162 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 162 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 162 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 162 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 162 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 162 및 SEQ ID NO: 1503를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 162 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 162 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 162 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 162 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 162 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 1503를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 104 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 1503를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 104을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 138 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 1503를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 104을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1536 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 1503를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 104을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1539 및 SEQ ID NO: 1585를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 165를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 113을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 99를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 112를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 98을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 1580을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 106을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 1503를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 1589를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 160을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 1537을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 159를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 101을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 162를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 104을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 138을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 1536을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1585 및 SEQ ID NO: 1539를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다.
[표 7]
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
본 발명의 일부 양태에서, BCL11a의 +58 인핸서 영역에 대한 gRNA 분자는 도 11에 나열된 gRNA의 표적화 도메인을 포함하는 것이 바람직하다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 341을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다.
예를 들어 본원에 표시된 바와 같이, 본 발명의 일부 양태에서, 하나 초과, 예를 들어 2개의 표적 부위를 표적화하는 gRNA 분자(예를 들어 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자)를 포함하는 것이 유익할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 표적 부위는 둘 다 +58 BCL11a인핸서 영역에 위치한다. 이러한 양태에서, 표 7에 나열된 표적화 도메인을 포함하는 하나 초과, 예를 들어 2개의 gRNA 분자(예를 들어 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자)의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 341 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 246 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 248 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 247 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 245 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 249 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 244 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 199 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 251 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 250 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 334 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 185 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 336 및 SEQ ID NO: 337을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 246을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 247을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 245를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 249를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 244를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 199를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 251을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 250을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 334를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 185를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 186을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 337 및 SEQ ID NO: 336을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다.
구현예에서, 본 발명의 양태는 GATA-1 결합 부위에 대해 3', 예를 들어 GATA1 결합 부위 및 TAL-1 결합 부위에 대해 3'에 배치된 BCL11a 유전자의 +58 인핸서 영역 내의 표적 서열에 상보적인 gRNA 분자에 관한 것이거나 또는 이를 포함한다. 구현예에서, 본원에 기재된 gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템은 표적 부위에서 또는 그 근처에서 하나 이상의 삽입결실을 유도한다. 구현예에서, 삽입결실은 GATA-1 결합 부위의 뉴클레오티드를 포함하지 않으며 및/또는 TAL-1 결합 부위의 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 구현예에서, CRISPR 시스템은 예를 들어 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%의, 예를 들어 NGS에 의해 측정된, 전체적인 프레임쉬프트 삽입결실 비율로, 표적 부위에서 또는 그 근처에서 하나 이상의 프레임쉬프트 삽입결실을 유도한다. 구현예에서, 전체적인 삽입결실 비율은 예를 들어 NGS에 의해 측정된, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%이다.
[표 8]
Figure pct00099
Figure pct00100
본 발명의 일부 양태에서, BCL11a의 +62 인핸서 영역에 대한 gRNA 분자는 도 12에 나열된 gRNA의 표적화 도메인을 포함하는 것이 바람직하다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 318을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다.
예를 들어 본원에 표시된 바와 같이, 본 발명의 일부 양태에서, 하나 초과, 예를 들어 2개의 표적 부위를 표적화하는 gRNA 분자(예를 들어 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자)를 포함하는 것이 유익할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 표적 부위는 둘 다 +62 BCL11a인핸서 영역에 위치한다. 이러한 양태에서, 표 8에 나열된 표적화 도메인을 포함하는 하나 초과, 예를 들어 2개의 gRNA 분자(예를 들어 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자)의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 318 및 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 318 및 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 318 및 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 318 및 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 318 및 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 318 및 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 318 및 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 318 및 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 318 및 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 318 및 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 318 및 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 318 및 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 318 및 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 318 및 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 312 및 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 312 및 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 312 및 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 312 및 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 312 및 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 312 및 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 312 및 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 312 및 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 312 및 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 312 및 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 312 및 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 312 및 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 312 및 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 313 및 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 313 및 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 313 및 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 313 및 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 313 및 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 313 및 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 313 및 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 313 및 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 313 및 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 313 및 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 313 및 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 313 및 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 313 및 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 294 및 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 294 및 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 294 및 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 294 및 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 294 및 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 294 및 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 294 및 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 294 및 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 294 및 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 294 및 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 294 및 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 294 및 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 294 및 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 310 및 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 310 및 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 310 및 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 310 및 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 310 및 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 310 및 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 310 및 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 310 및 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 310 및 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 310 및 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 310 및 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 310 및 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 310 및 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 319 및 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 319 및 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 319 및 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 319 및 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 319 및 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 319 및 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 319 및 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 319 및 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 319 및 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 319 및 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 319 및 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 319 및 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 319 및 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 298 및 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 298 및 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 298 및 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 298 및 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 298 및 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 298 및 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 298 및 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 298 및 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 298 및 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 298 및 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 298 및 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 298 및 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 298 및 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 322 및 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 322 및 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 322 및 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 322 및 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 322 및 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 322 및 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 322 및 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 322 및 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 322 및 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 322 및 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 322 및 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 322 및 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 322 및 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 311 및 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 311 및 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 311 및 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 311 및 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 311 및 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 311 및 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 311 및 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 311 및 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 311 및 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 311 및 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 311 및 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 311 및 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 311 및 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 315 및 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 315 및 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 315 및 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 315 및 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 315 및 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 315 및 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 315 및 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 315 및 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 315 및 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 315 및 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 315 및 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 315 및 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 315 및 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 290 및 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 290 및 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 290 및 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 290 및 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 290 및 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 290 및 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 290 및 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 290 및 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 290 및 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 290 및 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 290 및 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 290 및 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 290 및 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 317 및 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 317 및 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 317 및 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 317 및 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 317 및 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 317 및 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 317 및 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 317 및 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 317 및 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 317 및 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 317 및 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 317 및 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 317 및 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 309 및 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 309 및 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 309 및 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 309 및 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 309 및 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 309 및 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 309 및 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 309 및 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 309 및 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 309 및 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 309 및 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 309 및 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 309 및 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 289 및 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 289 및 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 289 및 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 289 및 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 289 및 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 289 및 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 289 및 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 289 및 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 289 및 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 289 및 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 289 및 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 289 및 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 289 및 SEQ ID NO: 281을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 281 및 SEQ ID NO: 312를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 281 및 SEQ ID NO: 313을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 281 및 SEQ ID NO: 294를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 281 및 SEQ ID NO: 310을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 281 및 SEQ ID NO: 319를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 281 및 SEQ ID NO: 298을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 281 및 SEQ ID NO: 322를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 281 및 SEQ ID NO: 311을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 281 및 SEQ ID NO: 315를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 281 및 SEQ ID NO: 290을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 281 및 SEQ ID NO: 317을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 281 및 SEQ ID NO: 309를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 281 및 SEQ ID NO: 289를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다.
[표 9]
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
Figure pct00104
본 발명의 일부 양태에서, BCL11a의 +55 인핸서 영역에 대한 gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1683, SEQ ID NO: 1638, SEQ ID NO: 1647, SEQ ID NO: 1609, SEQ ID NO: 1621, SEQ ID NO: 1617, SEQ ID NO: 1654, SEQ ID NO: 1631, SEQ ID NO: 1620, SEQ ID NO: 1637, SEQ ID NO: 1612, SEQ ID NO: 1656, SEQ ID NO: 1619, SEQ ID NO: 1675, SEQ ID NO: 1645, SEQ ID NO: 1598, SEQ ID NO: 1599, SEQ ID NO: 1663, SEQ ID NO: 1677, 및 SEQ ID NO: 1626으로부터 선택된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함하는 것이 바람직하다.
예를 들어 본원에 표시된 바와 같이, 본 발명의 일부 양태에서, 하나 초과, 예를 들어 2개의 표적 부위를 표적화하는 gRNA 분자(예를 들어 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자)를 포함하는 것이 유익할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 표적 부위는 둘 다 +55 BCL11a인핸서 영역에 위치한다. 이러한 양태에서, 표 9에 나열된 표적화 도메인을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 하나 초과, 예를 들어 2개의 gRNA 분자(예를 들어 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자)의 임의의 조합이 사용될 수 있으며, +55 BCL11a인핸서 영역의 상이한 표적 부위를 표적화한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1683 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1638 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1647 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1609 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1621 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1617 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1654 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1631 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1620 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1637 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1612 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1656 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1619 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1675 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1645 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1645 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1645 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1645 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1645 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1645 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1645 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1645 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1645 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1645 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1645 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1645 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1645 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1598 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1599 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1663 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1677 및 SEQ ID NO: 1626을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1638을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1647을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1609를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1621을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1617을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1654를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1631을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1620을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1637을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1612를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1656을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1619를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1675를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1645를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1598을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1599를 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1663을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 각각 SEQ ID NO: 1626 및 SEQ ID NO: 1677을 포함하는, 예를 들어 이로 구성된 표적화 도메인을 포함한다.
III. gRNA 설계 방법
표적 서열을 선택, 설계 및 검증하기 위한 방법을 포함하여, gRNA를 설계하기 위한 방법이 본원에 기재된다. 예시적인 표적화 도메인이 또한 본원에 제공된다. 본원에서 논의된 표적화 도메인은 본원에 기재된 gRNA에 포함될 수 있다.
표적-외 분석뿐만 아니라 표적 서열의 선택 및 검증 방법은 예를 들어 문헌[Mali el al., 2013 SCIENCE 339(6121): 823-826]; 문헌[Hsu et al, 2013 NAT BIOTECHNOL, 31(9): 827-32]; 문헌[Fu et al, 2014 NAT BIOTECHNOL, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PM ID: 24463574]; 문헌[Heigwer et al, 2014 NAT METHODS ll(2): 122-3. doi: 10.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216]; 문헌[Bae el al, 2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID: 24463181]; 문헌[Xiao A el al, 2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID: 24389662]에 기재되어 있다.
예를 들어 소프트웨어 툴은 사용자의 표적 서열 내에서 gRNA의 선택을 최적화하기 위하여, 예를 들어 게놈 전체에 걸쳐 총 표적-외 활성을 최소화하기 위하여 사용될 수 있다. 표적-외 활성은 절단 외의 것일 수 있다. 예를 들어 S. 피오게네스 Cas9를 사용하는, 각각의 가능한 gRNA 선택을 위하여, 툴은 일정 개수(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)까지의 미스매치된 염기쌍을 함유하는 게놈 전체에 걸친 모든 표적-외 서열(예를 들어 NAG 또는 NGG PAM 이전의)을 확인할 수 있다. 각 표적-외 서열에서의 절단 효율은, 예를 들어 실험적으로 유도된 가중치 구조를 사용하여 예측될 수 있다. 그 후 각각의 가능한 gRNA는 총 예상 표적-외 절단에 따라 순위가 매겨진다; 최상위 순위의 gRNA는 가장 많은 적중(on-target) 절단 및 가장 적은 표적-외(off-target) 절단을 가질 가능성이 있는 것에 해당한다. 다른 기능, 예를 들어 CRISPR 구축을 위한 자동화된 시약 설계, 적중(on-target) Surveyor 검정을 위한 프라이머 설계, 및 차세대 시퀀싱을 통한 표적-외 절단의 대용량고효율(high-throughput) 검출 및 정량화를 위한 프라이머 설계가 툴에 또한 포함될 수 있다. 후보 gRNA 분자는 당분야에 공지된 방법 또는 본원에 기재된 바에 의해 평가될 수 있다.
잠재적인 gRNA 분자의 초기 목록을 생성하기 위해 소프트웨어 알고리즘이 사용될 수 있음에도 불구하고, 절단 효율 및 특이성이 반드시 예측된 값을 반영하지 않을 것이며, gRNA 분자는 전형적으로, 예를 들어 절단 효율, 삽입결실 형성, 절단 특이성 및 원하는 표현형의 변화를 결정하기 위해, 특정 세포주, 예를 들어 일차 인간 세포주, 예를 들어 인간 HSPC, 예를 들어 인간CD34+ 세포에서의 스크리닝을 필요로 한다. 이들 특성은 본원에 기재된 방법에 의해 검정될 수 있다.
본 발명의 양태에서, CR00312(SEQ ID NO: 248, 아래 밑줄 표시된)의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 아래 기재된 gRNA 분자 중 하나는, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자를 수반하는 양태를 포함하는, 본 발명의 CRISPR 시스템, 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에 유용하다:
sgRNA CR00312 #1:
GUUUGGCCUCUGAUUAGGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 342)
sgRNA CR00312 #2:
mG*mU*mU*UGGCCUCUGAUUAGGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 343)
sgRNA CR00312 #3:
mG*mU*mU*UGGCCUCUGAUUAGGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO: 1762))
dgRNA CR00312 #1:
crRNA: GUUUGGCCUCUGAUUAGGGUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 344)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)
dgRNA CR00312 #2:
crRNA: mG*mU*mU*UGGCCUCUGAUUAGGGUGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 345)
tracr: mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346)
dgRNA CR00312 #3:
crRNA: mG*mU*mU*UGGCCUCUGAUUAGGGUGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 345)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660).
본 발명의 양태에서, CR001128(SEQ ID NO: 338, 아래 밑줄 표시된)의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 아래 기재된 gRNA 분자 중 하나는, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자를 수반하는 양태를 포함하는, 본 발명의 CRISPR 시스템, 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에 유용하다:
sgRNA CR001128 #1:
AUCAGAGGCCAAACCCUUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 347)
sgRNA CR001128 #2:
mA*mU*mC*AGAGGCCAAACCCUUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 348)
sgRNA CR001128 #3:
mA*mU*mC*AGAGGCCAAACCCUUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO: 1763)
dgRNA CR001128 #1:
crRNA: AUCAGAGGCCAAACCCUUCCGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 349)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)
dgRNA CR001128 #2:
crRNA: mA*mU*mC*AGAGGCCAAACCCUUCCGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 350)
tracr: mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346)
dgRNA CR001128 #3:
crRNA: mA*mU*mC*AGAGGCCAAACCCUUCCGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 350)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660).
본 발명의 양태에서, CR001126(SEQ ID NO: 336, 아래 밑줄 표시된)의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 아래 기재된 gRNA 분자 중 하나는, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자를 수반하는 양태를 포함하는, 본 발명의 CRISPR 시스템, 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에 유용하다:
sgRNA CR001126 #1:
UUUAUCACAGGCUCCAGGAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 351)
sgRNA CR001126 #2:
mU*mU*mU*AUCACAGGCUCCAGGAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 352)
sgRNA CR001126 #3:
mU*mU*mU*AUCACAGGCUCCAGGAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO: 1764)
dgRNA CR001126 #1:
crRNA: UUUAUCACAGGCUCCAGGAAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 353)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)
dgRNA CR001126 #2:
crRNA: mU*mU*mU*AUCACAGGCUCCAGGAAGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 354)
tracr: mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346)
dgRNA CR001126 #3:
crRNA: mU*mU*mU*AUCACAGGCUCCAGGAAGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 354)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660).
본 발명의 양태에서, CR00311(SEQ ID NO: 247, 아래 밑줄 표시된)의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 아래 기재된 gRNA 분자 중 하나는, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자를 수반하는 양태를 포함하는, 본 발명의 CRISPR 시스템, 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에 유용하다:
sgRNA CR00311 #1:
UUUGGCCUCUGAUUAGGGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 355)
sgRNA CR00311 #2:
mU*mU*mU*GGCCUCUGAUUAGGGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 356)
sgRNA CR00311 #3:
mU*mU*mU*GGCCUCUGAUUAGGGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO: 1765)
dgRNA CR00311 #1:
crRNA: UUUGGCCUCUGAUUAGGGUGGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 357)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)
dgRNA CR00311 #2:
crRNA: mU*mU*mU*GGCCUCUGAUUAGGGUGGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 358)
tracr: mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346)
dgRNA CR00311 #3:
crRNA: mU*mU*mU*GGCCUCUGAUUAGGGUGGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 358)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660).
본 발명의 양태에서, CR00309(SEQ ID NO: 245, 아래 밑줄 표시된)의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 아래 기재된 gRNA 분자 중 하나는, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자를 수반하는 양태를 포함하는, 본 발명의 CRISPR 시스템, 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에 유용하다:
sgRNA CR00309 #1:
CACGCCCCCACCCUAAUCAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 359)
sgRNA CR00309 #2:
mC*mA*mC*GCCCCCACCCUAAUCAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 360)
sgRNA CR00309 #3:
mC*mA*mC*GCCCCCACCCUAAUCAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO: 1766)
dgRNA CR00309 #1:
crRNA: CACGCCCCCACCCUAAUCAGGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 361)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)
dgRNA CR00309 #2:
crRNA: mC*mA*mC*GCCCCCACCCUAAUCAGGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 362)
tracr: mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346)
dgRNA CR00309 #3:
crRNA: mC*mA*mC*GCCCCCACCCUAAUCAGGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 362)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660).
본 발명의 양태에서, CR001127(SEQ ID NO: 337, 아래 밑줄 표시된)의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 아래 기재된 gRNA 분자 중 하나는, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자를 수반하는 양태를 포함하는, 본 발명의 CRISPR 시스템, 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에 유용하다:
sgRNA CR001127 #1:
CACAGGCUCCAGGAAGGGUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 363)
sgRNA CR001127 #2:
mC*mA*mC*AGGCUCCAGGAAGGGUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 364)
sgRNA CR001127 #3:
mC*mA*mC*AGGCUCCAGGAAGGGUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO: 1767)
dgRNA CR001127 #1:
crRNA: CACAGGCUCCAGGAAGGGUUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 365)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)
dgRNA CR001127 #2:
crRNA: mC*mA*mC*AGGCUCCAGGAAGGGUUGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 366)
tracr: mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346)
dgRNA CR001127 #3:
crRNA: mC*mA*mC*AGGCUCCAGGAAGGGUUGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 366)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660).
본 발명의 양태에서, CR00316(SEQ ID NO: 252, 아래 밑줄 표시된)의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 아래 기재된 gRNA 분자 중 하나는, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자를 수반하는 양태를 포함하는, 본 발명의 CRISPR 시스템, 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에 유용하다:
sgRNA CR00316 #1:
UUGCUUUUAUCACAGGCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 367)
sgRNA CR00316 #2:
mU*mU*mG*CUUUUAUCACAGGCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 368)
sgRNA CR00316 #3:
mU*mU*mG*CUUUUAUCACAGGCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO: 1768)
dgRNA CR00316 #1:
crRNA: UUGCUUUUAUCACAGGCUCCGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 369)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)
dgRNA CR00316 #2:
crRNA: mU*mU*mG*CUUUUAUCACAGGCUCCGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 370)
tracr: mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346)
dgRNA CR00316 #3:
crRNA: mU*mU*mG*CUUUUAUCACAGGCUCCGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 370)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660).
본 발명의 양태에서, CR001125(SEQ ID NO: 335, 아래 밑줄 표시된)의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 아래 기재된 gRNA 분자 중 하나는, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자를 수반하는 양태를 포함하는, 본 발명의 CRISPR 시스템, 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에 유용하다:
sgRNA CR001125 #1:
UUUUAUCACAGGCUCCAGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 371)
sgRNA CR001125 #2:
mU*mU*mU*UAUCACAGGCUCCAGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 372)
sgRNA CR001125 #3:
mU*mU*mU*UAUCACAGGCUCCAGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO: 1769)
dgRNA CR001125 #1:
crRNA: UUUUAUCACAGGCUCCAGGAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 373)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)
dgRNA CR001125 #2:
crRNA: mU*mU*mU*UAUCACAGGCUCCAGGAGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 374)
tracr: mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346)
dgRNA CR001125 #3:
crRNA: mU*mU*mU*UAUCACAGGCUCCAGGAGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 374)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660).
본 발명의 양태에서, CR001030(SEQ ID NO: 100, 아래 밑줄 표시된)의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 아래 기재된 gRNA 분자 중 하나는, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자를 수반하는 양태를 포함하는, 본 발명의 CRISPR 시스템, 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에 유용하다:
sgRNA CR001030 #1:
ACUGCUGAAAGAGAUGCGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 375)
sgRNA CR001030 #2:
mA*mC*mU*GCUGAAAGAGAUGCGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 376)
sgRNA CR001030 #3:
mA*mC*mU*GCUGAAAGAGAUGCGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO: 1770)
dgRNA CR001030 #1:
crRNA: ACUGCUGAAAGAGAUGCGGUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 377)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)
dgRNA CR001030 #2:
crRNA: mA*mC*mU*GCUGAAAGAGAUGCGGUGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 378)
tracr: mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346)
dgRNA CR001030 #3:
crRNA: mA*mC*mU*GCUGAAAGAGAUGCGGUGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 378)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660).
본 발명의 양태에서, CR001028(SEQ ID NO: 98, 아래 밑줄 표시된)의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 아래 기재된 gRNA 분자 중 하나는, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자를 수반하는 양태를 포함하는, 본 발명의 CRISPR 시스템, 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에 유용하다:
sgRNA CR001028 #1:
UGCGGUGGGGAGAUAUGUAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 379)
sgRNA CR001028 #2:
mU*mG*mC*GGUGGGGAGAUAUGUAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 380)
sgRNA CR001028 #3:
mU*mG*mC*GGUGGGGAGAUAUGUAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO: 1771)
dgRNA CR001028 #1:
crRNA: UGCGGUGGGGAGAUAUGUAGGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 381)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)
dgRNA CR001028 #2:
crRNA: mU*mG*mC*GGUGGGGAGAUAUGUAGGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 382)
tracr: mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346)
dgRNA CR001028 #3:
crRNA: mU*mG*mC*GGUGGGGAGAUAUGUAGGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 382)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660).
본 발명의 양태에서, CR001221(SEQ ID NO: 1589, 아래 밑줄 표시된)의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 아래 기재된 gRNA 분자 중 하나는, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자를 수반하는 양태를 포함하는, 본 발명의 CRISPR 시스템, 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에 유용하다:
sgRNA CR001221 #1:
GAAACAAUGAGGACCUGACUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 383)
sgRNA CR001221 #2:
mG*mA*mA*ACAAUGAGGACCUGACUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 384)
sgRNA CR001221 #3:
mG*mA*mA*ACAAUGAGGACCUGACUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO: 1772)
dgRNA CR001221 #1:
crRNA: GAAACAAUGAGGACCUGACUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 385)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)
dgRNA CR001221 #2:
crRNA: mG*mA*mA*ACAAUGAGGACCUGACUGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 386)
tracr: mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346)
dgRNA CR001221 #3:
crRNA: mG*mA*mA*ACAAUGAGGACCUGACUGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 386)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660).
본 발명의 양태에서, CR001137(SEQ ID NO: 1505, 아래 밑줄 표시된)의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 아래 기재된 gRNA 분자 중 하나는, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자를 수반하는 양태를 포함하는, 본 발명의 CRISPR 시스템, 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에 유용하다:
sgRNA CR001137 #1:
GUAAGCAUUUAAGUGGCUACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 387)
sgRNA CR001137 #2:
mG*mU*mA*AGCAUUUAAGUGGCUACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 388)
sgRNA CR001137 #3:
mG*mU*mA*AGCAUUUAAGUGGCUACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO: 1773)
dgRNA CR001137 #1:
crRNA: GUAAGCAUUUAAGUGGCUACGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 389)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)
dgRNA CR001137 #2:
crRNA: mG*mU*mA*AGCAUUUAAGUGGCUACGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 390)
tracr: mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346)
dgRNA CR001137 #3:
crRNA: mG*mU*mA*AGCAUUUAAGUGGCUACGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 390)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660).
본 발명의 양태에서, CR003035(SEQ ID NO: 1505, 아래 밑줄 표시된)의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 아래 기재된 gRNA 분자 중 하나는, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자를 수반하는 양태를 포함하는, 본 발명의 CRISPR 시스템, 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에 유용하다:
sgRNA CR003035 #1:
AGGCACCUCAGACUCAGCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 391)
sgRNA CR003035 #2:
mA*mG*mG*CACCUCAGACUCAGCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 392)
sgRNA CR003035 #3:
mA*mG*mG*CACCUCAGACUCAGCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO: 1774)
dgRNA CR003035 #1:
crRNA: AGGCACCUCAGACUCAGCAUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 393)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)
dgRNA CR003035 #2:
crRNA: mA*mG*mG*CACCUCAGACUCAGCAUGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 394)
tracr: mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346)
dgRNA CR003035 #3:
crRNA: mA*mG*mG*CACCUCAGACUCAGCAUGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 394)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660).
본 발명의 양태에서, CR003085(SEQ ID NO: 1750, 아래 밑줄 표시된)의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어 아래 기재된 gRNA 분자 중 하나는, 예를 들어 본원에 기재된 하나를 초과하는 gRNA 분자를 수반하는 양태를 포함하는, 본 발명의 CRISPR 시스템, 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에 유용하다:
sgRNA CR003085 #1:
AUGGUAUGGGAGGUAUACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 395)
sgRNA CR003085 #2:
mA*mU*mG*GUAUGGGAGGUAUACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 396)
sgRNA CR003085 #3:
mA*mU*mG*GUAUGGGAGGUAUACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO: 1775)
dgRNA CR003085 #1:
crRNA: AUGGUAUGGGAGGUAUACUAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 397)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660)
dgRNA CR003085 #2:
crRNA: mA*mU*mG*GUAUGGGAGGUAUACUAGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 398)
tracr: mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 346)
dgRNA CR003085 #3:
crRNA: mA*mU*mG*GUAUGGGAGGUAUACUAGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO: 398)
tracr: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO: 6660).
위에 기재된 gRNA 분자 각각에서, "*"는 인접한 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 결합을 의미하고, "mN"(N=A, G, C 또는 U)은 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드를 의미한다. 구현예에서, 본원에 기재된, 예를 들어 상기 기재된, gRNA 분자 중 임의의 것은, 예를 들어 본원에 기재된 Cas9 분자와 복합체 형성되어 리보핵산 단백질 복합체(RNP)를 형성한다. 이러한 RNP는 예를 들어 본원에 기재된 본 발명의 방법, 세포 및 다른 양태 및 구현예에서 특히 유용하다.
IV. Cas 분자
Cas9 분자
바람직한 구현예에서, Cas 분자는 Cas9 분자이다. 다양한 종의 Cas9 분자가 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. S. 피오게네스 Cas9 분자가 본원에 개시의 많은 것의 대상체이지만, 본원에 나열된 다른 종의 Cas9 단백질의, 이로부터 유래된, 또는 이에 기반한 Cas9 분자가 사용될 수도 있다. 즉, 다른 Cas9 분자, 예를 들어 S. 써모필루스(S. thermophilus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및/또는 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitides) Cas9 분자가 본원에 기재된 시스템, 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 추가적인 Cas9 종에는: 에시도보락스 아베나에(Acidovorax avenae), 악티노바실러스 플레우로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 악티노바실러스 수이스(Actinobacillus suis), 악티노마이세스 종(Actinomyces sp.) 사이클리필루스 데니트리피칸스(cycliphilus denitrificans), 아미노모나스 파우시보란스(Aminomonas paucivorans), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 스미티(Bacillus smithii), 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테로이데스 종(Bacteroides sp.), 블라스토피렐룰라 마리나(Blastopirellula marina), 브라디리조비움 종(Bradyrhizobium sp.), 브레비바실러스 라템스포루스(Brevibacillus latemsporus), 캄필로박터 콜리(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 라드(Campylobacter lad), 칸디다투스 푸니세이스피릴룸(Candidatus Puniceispirillum), 클로스트리디움 셀룰롤리티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 코리네박테리움 악콜렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 마트루초티(Corynebacterium matruchotii), 디노로세오박터 슬리바에(Dinoroseobacter sliibae), 유박테리움 돌리춤(Eubacterium dolichum), 감마 프로테오박테리움(Gamma proteobacterium), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus), 해모필루스 파라인플루엔자에(Haemophilus parainfluenzae), 해모필루스 스푸토룸(Haemophilus sputorum), 헬리코박터 카나덴시스(Helicobacter canadensis), 헬리코박터 시나에디(Helicobacter cinaedi), 헬리코박터 무스텔라에(Helicobacter mustelae), 일리오박터 폴리트로푸스(Ilyobacter polytropus), 킨겔라 킨가에(Kingella kingae), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아세아에 박테리움(Listeriaceae bacterium), 메틸로시스티스 종(Methylocystis sp.), 메틸로시누스 트리초스포리움(Methylosinus trichosporium), 모빌룬쿠스 물리에리스(Mobiluncus mulieris), 네이세리아 바실리포르미스(Neisseria bacilliformis), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 네이세리아 플라베센스(Neisseria flavescens), 네이세리아 락타미카, 네이세리아 종(Neisseria sp.), 네이세리아 와드스워르티(Neisseria wadsworthii), 니트로소모나스 종(Nitrosomonas sp.), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스콜락토박테리움 숙시나투텐스(Phascolarctobacterium succinatutens), 랄스토니아 시지기(Ralstonia syzygii), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로도불룸 종(Rhodovulum sp.), 시몬시엘라 무엘레리(Simonsiella muelleri), 스핀고모나스 종(Sphingomonas sp.), 스포로락토바실러스 비네아에(Sporolactobacillus vineae), 스타필로코커스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp), 서브돌리그라눌룸 종(Subdoligranulum sp.), 티스트렐라 모빌리스(Tistrella mobilis), 트레포네마 종(Treponema sp.) 또는 베르미네프로박터 에이세니아에(Verminephrobacter eiseniae)가 포함된다.
그 용어가 본원에 사용되는 바와 같이, Cas9 분자는 gRNA 분자(예를 들어 tracr 도메인의 서열)와 상호 작용할 수 있으며, gRNA 분자와 협력하여, 표적 서열 및 PAM 서열을 포함하는 부위로 배치(예를 들어 표적화 또는 유도화) 할 수 있는 분자를 지칭한다.
구현예에서, Cas9 분자는 표적 핵산 분자를 절단할 수 있으며, 본원에서 활성 Cas9 분자로 지칭될 수 있다. 구현예에서, 활성 Cas9 분자는 다음 활성 중 하나 이상을 포함한다: 니카제 활성, 즉 핵산 분자의 단일 가닥, 예를 들어 비상보성 가닥 또는 상보성 가닥을 절단하는 능력; 이중 가닥 뉴클레아제 활성, 즉 이중 가닥 핵산의 두 가닥을 모두 절단하고 이중 가닥 단절을 생성하는 능력, 구현예에서 이는 2개의 니카제 활성의 존재임; 엔도뉴클레아제 활성; 엑소 뉴클레아제 활성; 및 헬리카제 활성, 즉 이중 가닥 핵산의 나선형 구조를 푸는 능력.
구현예에서, 효소적으로 활성인 Cas9분자는 DNA 가닥을 둘 다 절단하며 이중 가닥 단절을 야기한다. 구현예에서, Cas9 분자는 오직 하나의 가닥, 예를 들어 gRNA가 혼성화하는 가닥, 또는 gRNA와 혼성화하는 가닥에 상보적인 가닥을 절단한다. 구현예에서, 활성 Cas9 분자는 HNH-유사 도메인과 관련된 절단 활성을 포함한다. 구현예에서, 활성 Cas9 분자는 N-말단의 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성을 포함한다. 구현예에서, 활성 Cas9 분자는 HNH-유사 도메인과 관련된 절단 활성 및 N-말단의 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성을 포함한다. 구현예에서, 활성 Cas9 분자는 활성의, 또는 절단적격의, HNH-유사 도메인 및 비활성의, 또는 절단 부적격의, N-말단의 RuvC-유사 도메인을 포함한다. 구현예에서, 활성 Cas9 분자는 비활성의, 또는 절단 부적격의, HNH-유사 도메인 및 활성의, 또는 절단적격의, N-말단의 RuvC-유사 도메인을 포함한다.
구현예에서, 표적 핵산과 상호작용하고 표적 핵산을 절단하는 활성 Cas9 분자의 능력은 PAM 서열 의존적이다. PAM 서열은 표적 핵산 내 서열이다. 구현예에서, 표적 핵산의 절단은 PAM 서열의 상류에서 발생한다. 상이한 박테리아 종으로부터의 활성 Cas9 분자는 상이한 서열 모티프(예를 들어 PAM 서열)를 인식할 수 있다. 구현예에서, S.피오게네스의 활성 Cas9 분자는 서열 모티프 NGG를 인식하고, 그 서열로부터 상류의 표적 핵산 서열 1 내지 10, 예를 들어 3 내지 5 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어 문헌[Mali et al., Science 2013; 339(6121): 823-826]을 참조하라. 구현예에서, S. 써모필루스의 활성 Cas9 분자는 서열 모티프 NGGNG 및 NNAGAAW(W= A 또는 T)를 인식하고, 이들 서열로부터 상류의 코어 표적 핵산 서열 1 내지 10, 예를 들어 3 내지 5 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어 문헌[Horvath et al., Science 2010; 327(5962):167-170], 및 문헌[Deveau et al., J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400]을 참조하라. 구현예에서, S. 뮤탄스의 활성 Cas9 분자는 서열 모티프 NGG 또는 NAAR(R- A 또는 G)을 인식하고, 이 서열로부터 상류의 코어 표적 핵산 서열 1 내지 10, 예를 들어 3 내지 5 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어 문헌[Deveau et al., J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400]을 참조하라.
구현예에서, S. 아우레우스의 활성 Cas9 분자는 서열 모티프 NNGRR(R= A 또는 G)을 인식하고, 그 서열로부터 상류의 표적 핵산 서열 1 내지 10, 예를 들어 3 내지 5 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어 문헌[Ran F. et al., NATURE, vol. 520, 2015, pp. 186-191]을 참조하라. 구현예에서, N. 메닌기티디스의 활성 Cas9 분자는 서열 모티프 NNNNGATT를 인식하고, 그 서열로부터 상류의 표적 핵산 서열 1 내지 10, 예를 들어 3 내지 5 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어 문헌[Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6]을 참조하라. PAM 서열을 인식하는 Cas9 분자의 능력은, 예를 들어 문헌[Jinek et al., Science 2012, 337:816]에 기재된 형질전환 분석을 이용하여 결정될 수 있다.
일부 Cas9 분자는 gRNA 분자와 상호작용하는 능력을 갖고, gRNA 분자와 함께 코어 표적 도메인으로 유도(예를 들어 표적화 또는 배치)되지만, 표적 핵산을 절단할 수 없거나 또는 효율적인 속도로 절단할 수 없다. 절단 활성을 갖지 않거나 또는 실질적인 절단 활성을 갖지 않는 Cas9 분자는 본원에서 비활성 Cas9(효소적으로 비활성인 Cas9), 비작동Cas9, 또는 dCas9분자로 지칭된다. 예를 들어 비활성Cas9 분자는 절단 활성이 없거나 또는 실질적으로 적은, 예를 들어 본원에 기재된 분석에 의해 측정하여, 참조 Cas9분자의 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만의 절단 활성을 가질 수 있다.
예시적인 자연적 발생 Cas9 분자는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013; 10:5, 727-737]에 기재되어 있다. 이러한 Cas9 분자는 클러스터 1 박테리아과, 클러스터 2 박테리아과, 클러스터 3 박테리아과, 클러스터 4 박테리아과, 클러스터 5 박테리아과, 클러스터 6 박테리아과, 클러스터 7 박테리아과, 클러스터 8 박테리아과, 클러스터 9 박테리아과, 클러스터 10 박테리아과, 클러스터 11 박테리아과, 클러스터 12 박테리아과, 클러스터 13 박테리아과, 클러스터 14 박테리아과, 클러스터 15 박테리아과, 클러스터 16 박테리아과, 클러스터 17 박테리아과, 클러스터 18 박테리아과, 클러스터 19 박테리아과, 클러스터 20 박테리아과, 클러스터 21 박테리아과, 클러스터 22 박테리아과, 클러스터 23 박테리아과, 클러스터 24 박테리아과, 클러스터 25 박테리아과, 클러스터 26 박테리아과, 클러스터 27 박테리아과, 클러스터 28 박테리아과, 클러스터 29 박테리아과, 클러스터 30 박테리아과, 클러스터 31 박테리아과, 클러스터 32 박테리아과, 클러스터 33 박테리아과, 클러스터 34 박테리아과, 클러스터 35 박테리아과, 클러스터 36 박테리아과, 클러스터 37 박테리아과, 클러스터 38 박테리아과, 클러스터 39 박테리아과, 클러스터 40 박테리아과, 클러스터 41 박테리아과, 클러스터 42 박테리아과, 클러스터 43 박테리아과, 클러스터 44 박테리아과, 클러스터 45 박테리아과, 클러스터 46 박테리아과, 클러스터 47 박테리아과, 클러스터 48 박테리아과, 클러스터 49 박테리아과, 클러스터 50 박테리아과, 클러스터 51 박테리아과, 클러스터 52 박테리아과, 클러스터 53 박테리아과, 클러스터 54 박테리아과, 클러스터 55 박테리아과, 클러스터 56 박테리아과, 클러스터 57 박테리아과, 클러스터 58 박테리아과, 클러스터 59 박테리아과, 클러스터 60 박테리아과, 클러스터 61 박테리아과, 클러스터 62 박테리아과, 클러스터 63 박테리아과, 클러스터 64 박테리아과, 클러스터 65 박테리아과, 클러스터 66 박테리아과, 클러스터 67 박테리아과, 클러스터 68 박테리아과, 클러스터 69 박테리아과, 클러스터 70 박테리아과, 클러스터 71 박테리아과, 클러스터 72 박테리아과, 클러스터 73 박테리아과, 클러스터 74 박테리아과, 클러스터 75 박테리아과, 클러스터 76 박테리아과, 클러스터 77 박테리아과, 또는 클러스터 78 박테리아과의 Cas9 분자를 포함한다.
예시적인 자연적 발생 Cas9 분자는 클러스터 1 박테리아과의 Cas9 분자를 포함한다. 예로는 S. 피오게네스(예를 들어 균주 SF370, MGAS10270, MGAS10750, MGAS2096, MGAS315, MGAS5005, MGAS6180, MGAS9429, NZ131 및 SSI-1), S. 써모필루스(예를 들어 균주 LMD-9), S. 슈도포르시누스(S. pseudoporcinus)(예를 들어 균주 SPIN 20026), S.뮤탄스(예를 들어 균주 UA 159, NN2025), S.마카카에(S. macacae)(예를 들어 균주 NCTC11558), S. 갈롤리리쿠스(S. gallolylicus)(예를 들어 균주 UCN34, ATCC BAA-2069), S. 에쿠이네스(S. equines)(예를 들어 균주 ATCC 9812, MGCS 124), S. 디스달락티아에(S. dysdalactiae)(예를 들어 균주 GGS 124), S. 보비스(S. bovis)(예를 들어 균주 ATCC 700338), S. 안기노수스(S. anginosus)(예를 들어 균주 F0211), S. 아갈락티아에(S. agalactiae)(예를 들어 균주 NEM316, A909), 리스테리아 모노사이토게네스(예를 들어 균주 F6854), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)(L. 이노쿠아, 예를 들어 균주 Clip11262), 엔테로코커스 이탈리쿠스(Enterococcus italicus)(예를 들어 균주 DSM 15952) 또는 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)(예를 들어 균주 1,231,408)의 Cas9 분자가 포함된다. 추가적인 예시적인 Cas9 분자는 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9 분자(문헌[Hou et al. PNAS Early Edition 2013, 1-6]) 및 S. 아우레우스 Cas9 분자이다.
구현예에서, Cas9 분자, 예를 들어 활성 Cas9 분자 또는 비활성 Cas9 분자는, 본원에 기재된 임의의 Cas9 분자 서열 또는 자연적 발생 Cas9 분자 서열, 예를 들어 본원에 나열되거나 또는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013, 10:5, 'I2'I-Τ,1; Hou et al. PNAS Early Edition 2013, 1-6]에 기재된 종으로부터의 Cas9 분자와 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖거나; 이와 비교할 때 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40% 이하의 아미노산 잔기에서 상이하거나; 이와 적어도 1, 2, 5, 10 또는 20개의 아미노산만큼이지만, 100, 80, 70, 60, 50, 40 또는 30개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는 이와 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
구현예에서, Cas9 분자는, S. 피오게네스 Cas9 분자와 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖거나; 이와 비교할 때 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40% 이하의 아미노산 잔기에서 상이하거나; 이와 적어도 1, 2, 5, 10 또는 20개의 아미노산만큼이지만, 100, 80, 70, 60, 50, 40 또는 30개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는 이와 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
Figure pct00108
Figure pct00109
Figure pct00110
Figure pct00111
(SEQ ID NO: 6611)
구현예에서, Cas9 분자는 비하전 또는 비극성 아미노산, 예를 들어 알라닌을 상기 위치에 도입하는 양전하 아미노산(예를 들어 리신, 아르기닌 또는 히스티딘)에 대한 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 SEQ ID NO: 6611의 S. 피오게네스 Cas9 변이체이다. 구현예에서, 돌연변이는 Cas9의 nt-그루브 내의 하나 이상의 양전하 아미노산에 대한 것이다. 구현예에서, Cas9 분자는 SEQ ID NO: 6611의 위치 855에서의 돌연변이, 예를 들어SEQ ID NO: 6611의 위치 855 위치에 비하전 아미노산, 예를 들어 알라닌으로의 돌연변이를 포함하는 SEQ ID NO: 6611의 S. 피오게네스 Cas9 변이체이다. 구현예에서, Cas9 분자는 SEQ ID NO: 6611에 비해 오직 SEQ ID NO: 6611의 위치 855에서만, 예를 들어 비하전 아미노산, 예를 들어 알라닌으로의 돌연변이를 갖는다. 구현예에서, Cas9 분자는 SEQ ID NO: 6611의 위치 810에서의 돌연변이, 위치 1003에서의 돌연변이 및/또는 위치 1060에서의 돌연변이, 예를 들어 SEQ ID NO: 6611의 위치 810, 위치 1003 및/또는 위치 1060에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함하는, SEQ ID NO: 6611의 S. 피오게네스 Cas9 변이체이다. 구현예에서, Cas9 분자는 SEQ ID NO: 6611에 비해 오직 SEQ ID NO: 6611의 위치 810, 위치 1003 및 위치 1060에서만 돌연변이를 가지며, 예를 들어 각 돌연변이는 비하전 아미노산, 예를 들어 알라닌으로이다. 구현예에서, Cas9 분자는 SEQ ID NO: 6611의 위치 848에서의 돌연변이, 위치 1003에서의 돌연변이 및/또는 위치 1060에서의 돌연변이, 예를 들어 SEQ ID NO: 6611의 위치 848, 위치 1003 및/또는 위치 1060에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함하는, SEQ ID NO: 6611의 S. 피오게네스 Cas9 변이체이다. 구현예에서, Cas9 분자는 SEQ ID NO: 6611에 비해 오직 SEQ ID NO: 6611의 위치 848, 위치 1003 및 위치 1060에서만 돌연변이를 가지며, 예를 들어 각 돌연변이는 비하전 아미노산, 예를 들어 알라닌으로이다. 구현예에서, Cas9 분자는 Science DOI: 10.1126/science.aad5227에서 2015 년 12 월 1 일 온라인 이용 가능한 문헌[Slaymaker et al., Science Express]에 기재된 Cas9 분자이다.
구현예에서, Cas9 분자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 SEQ ID NO: 6611의 S. 피오게네스 Cas9 변이체이다. 구현예에서, Cas9 변이체는 SEQ ID NO: 6611의 위치80 에 돌연변이를 포함하며, 예를 들어 SEQ ID NO: 6611의 위치 80에 류신을 포함한다(즉, C80L 돌연변이를 갖는SEQ ID NO: 6611를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다). 구현예에서, Cas9 변이체는 SEQ ID NO: 6611의 위치574 에 돌연변이를 포함하며, 예를 들어 SEQ ID NO: 6611의 위치 574에 글루탐산을 포함한다(즉, C574E 돌연변이를 갖는SEQ ID NO: 6611를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다). 구현예에서, Cas9 변이체는 SEQ ID NO: 6611의 위치80 에 돌연변이 및 위치 574에 돌연변이를 포함하며, 예를 들어 SEQ ID NO: 6611의 위치 80에 류신, 및 SEQ ID NO: 6611의 위치 574에 글루탐산을 포함한다(즉, C80L 돌연변이 및 C574E 돌연변이를 갖는SEQ ID NO: 6611를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다). 이론에 얽매이지 않고, 이러한 돌연변이는 Cas9 분자의 용해 특성을 개선시키는 것으로 여겨진다.
구현예에서, Cas9 분자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 SEQ ID NO: 6611의 S. 피오게네스 Cas9 변이체이다. 구현예에서, Cas9 변이체는 SEQ ID NO: 6611의 위치147 에 돌연변이를 포함하며, 예를 들어 SEQ ID NO: 6611의 위치 147에 티로신을 포함한다(즉, D147Y 돌연변이를 갖는SEQ ID NO: 6611를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다). 구현예에서, Cas9 변이체는 SEQ ID NO: 6611의 위치411 에 돌연변이를 포함하며, 예를 들어 SEQ ID NO: 6611의 위치 411에 트레오닌을 포함한다(즉, P411T 돌연변이를 갖는SEQ ID NO: 6611를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다). 구현예에서, Cas9 변이체는 SEQ ID NO: 6611의 위치147에 돌연변이 및 위치411 에 돌연변이를 포함하며, 예를 들어 SEQ ID NO: 6611의 위치 147에 티로신, 및 SEQ ID NO: 6611의 위치 411에 트레오닌을 포함한다(즉, D147Y 돌연변이 및 P411T 돌연변이를 갖는SEQ ID NO: 6611를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다). 이론에 얽매이지 않고, 이러한 돌연변이는 예를 들어 효모에서 Cas9 분자의 표적화 효율을 개선시키는 것으로 여겨진다.
구현예에서, Cas9 분자는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 SEQ ID NO: 6611의 S. 피오게네스 Cas9 변이체이다. 구현예에서, Cas9 변이체는 SEQ ID NO: 6611의 위치1135 에 돌연변이를 포함하며, 예를 들어 SEQ ID NO: 6611의 위치 1135에 글루탐산을 포함한다(즉, D1135E 돌연변이를 갖는SEQ ID NO: 6611를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다). 이론에 얽매이지 않고, 이러한 돌연변이는 NGG PAM 서열 대 NAG PAM 서열에 대한 Cas9 분자의 선택성을 개선시키는 것으로 여겨진다.
구현예에서, Cas9 분자는 비하전 또는 비극성 아미노산, 예를 들어 알라닌을 일정 위치에 도입하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 SEQ ID NO: 6611의 S. 피오게네스 Cas9 변이체이다. 구현예에서, Cas9 분자는 SEQ ID NO: 6611의 위치 497에서의 돌연변이, 위치 661에서의 돌연변이, 위치 695에서의 돌연변이 및/또는 위치 926에서의 돌연변이, 예를 들어 SEQ ID NO: 6611의 위치 497, 위치 661, 위치 695 및/또는 위치 926에서 알라닌으로의 돌연변이를 포함하는, SEQ ID NO: 6611의 S. 피오게네스 Cas9 변이체이다. 구현예에서, Cas9 분자는 SEQ ID NO: 6611에 비해 오직 SEQ ID NO: 6611의 위치 497, 위치 661, 위치 695 및 위치 926에서만 돌연변이를 가지며, 예를 들어 각 돌연변이는 비하전 아미노산, 예를 들어 알라닌으로이다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 돌연변이는 표적-외 부위에서의 Cas9 분자에 의한 절단을 감소하는 것으로 여겨진다.
본원에 기재된 Cas9 분자에 대한 돌연변이는 조합될 수 있고, 본원에 기재된 임의의 융합 또는 다른 변형 및 본원에 기재된 검정에서 시험된 Cas9 분자 중 임의의 것과 조합될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
다양한 유형의 Cas 분자가 본원에 개시된 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, II형 Cas 시스템의 Cas 분자가 사용된다. 다른 구현예에서, 다른 Cas 시스템의 Cas 분자가 사용된다. 예를 들어 I형 또는 III형 Cas 분자가 사용될 수 있다. 예시적인 Cas 분자(및 Cas 시스템)는 예를 들어 문헌[Haft et al, PLoS COMPUTATIONAL BIOLOGY 2005, 1(6): e60] 및 문헌[Makarova et al, NATURE REVIEW MICROBIOLOGY 201 1, 9:467-477]에 기재되어 있으며, 두 참조 문헌 모두의 내용은 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
구현예에서, Cas9 분자는 다음 활성 중 하나 이상을 포함한다: 니카제 활성; 이중 가닥 손상 활성(예를 들어 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소 뉴클레아제 활성); 헬리카제 활성; 또는 gRNA 분자와 함께 표적 핵산에 배치하는 능력.
변경된 Cas9 분자
자연적 발생 Cas9 분자는 니카제 활성, 뉴클레아제 활성(예를 들어 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 헬리카제 활성; gRNA 분자와 기능적으로 관련되는 능력; 및 핵산 상의 부위를 표적화하는(또는 부위에 배치하는) 능력(예를 들어 PAM 인식 및 특이성)을 포함하는 다수의 특성을 갖는다. 구현예에서, Cas9 분자는 이들 특성의 모두 또는 서브세트를 포함할 수 있다. 전형적인 구현예에서, Cas9 분자는 gRNA 분자와 상호작용하고, gRNA 분자와 협력하여 핵산 내 부위에 배치하는 능력을 갖는다. 다른 활성, 예를 들어 PAM 특이성, 절단 활성 또는 헬리카제 활성은 Cas9 분자에서 더욱 광범위하게 다를 수 있다.
원하는 특성을 갖는 Cas9 분자는 다수의 방법으로, 예를 들어 원하는 특성을 갖는 변경된 Cas9 분자를 제공하기 위하여 모 Cas9 분자, 예를 들어 자연적 발생 Cas9 분자의 변경에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 모 Cas9 분자에 비해 하나 이상의 돌연변이 또는 차이가 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이 및 차이는 치환(예를 들어 보존적 치환 또는 비필수 아미노산의 치환); 삽입; 또는 결실을 포함한다. 구현예에서, Cas9 분자는 하나 이상의 돌연변이 또는 차이, 예를 들어 참조 Cas9 분자에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50개의 돌연변이지만 200, 100 또는 80개 미만의 돌연변이를 포함할 수 있다.
구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 Cas9 활성, 예를 들어 본원에 기재된 Cas9 활성에 대해 실질적인 효과를 갖지 않는다. 구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 Cas9 활성, 예를 들어 본원에 기재된 Cas9 활성에 대해 실질적인 효과를 갖는다. 구현예에서, 예시적인 활성은 PAM 특이성, 절단 활성 및 헬리카제 활성 중 하나 이상을 포함한다. 돌연변이(들)는 예를 들어 하나 이상의 RuvC-유사 도메인, 예를 들어 N-말단의 RuvC-유사 도메인; HNH-유사 도메인; RuvC-유사 도메인 및 HNH-유사 도메인 외부의 영역에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이(들)는 N-말단의 RuvC-유사 도메인에 존재한다. 일부 구현예에서, 돌연변이(들)는 HNH-유사 도메인에 존재한다. 일부 구현예에서, 돌연변이들은 N-말단의 RuvC-유사 도메인 및 HNH-유사 도메인 둘 다에 존재한다.
특정 서열, 예를 들어 치환이 하나 이상의 활성, 예를 들어 표적화 활성, 절단 활성 등에 영향을 미칠 수 있는지 여부는, 예를 들어 돌연변이가 보존적인지 여부를 평가함에 의해 또는 섹션 III에 기재된 방법에 의해 평가 또는 예측될 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자의 맥락에 사용된 "비필수" 아미노산 잔기는 Cas9 활성(예를 들어 절단 활성)을 파괴하지 않고 또는 더욱 바람직하게는 실질적으로 변경하지 않고, Cas9 분자, 예를 들어 자연적 발생 Cas9 분자, 예를 들어 활성 Cas9 분자의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기를 변화시키는 것은 활성(예를 들어 절단 활성)의 실질적인 손실을 야기한다.
변경된 PAM 인식을 갖는 또는 PAM 인식을 갖지 않는 Cas9 분자
자연적 발생 Cas9 분자는 특정 PAM 서열, 예를 들어 S. 피오게네스, S.써모필루스, S.뮤탄스, S.아우레우스 및 N. 메닌기티디스에 대해 상기 기재된 PAM 인식 서열을 인식할 수 있다.
구현예에서, Cas9 분자는 자연적 발생 Cas9 분자와 동일한 PAM 특이성을 갖는다. 다른 구현예에서, Cas9 분자는 자연적 발생 Cas9 분자와 관련되지 않은 PAM 특이성, 또는 가장 가까운 서열 상동성을 갖는 자연적 발생 Cas9 분자와 관련되지 않은 PAM 특이성을 갖는다. 예를 들어 자연적 발생 Cas9 분자는, 예를 들어 PAM 인식을 변경하도록, 예를 들어 표적-외 부위를 감소시키고/시키거나 특이성을 개선하기 위해 Cas9 분자가 인식하는 PMA 서열을 변경하도록; 또는 PAM 인식 필요를 제거하도록, 변경될 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자는, 예를 들어 표적-외 부위를 감소시키고 특이성을 증가시키기 위해, 예를 들어 PAM 인식 서열의 길이를 증가시키고/시키거나 고수준의 동일성으로 Cas9 특이성을 개선하도록 변경될 수 있다. 구현예에서, PAM 인식 서열의 길이는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15개의 아미노산 길이이다. 상이한 PAM 서열을 인식하고/하거나 감소된 표적-외 활성을 갖는 Cas9 분자는 유도 진화(directed evolution)를 이용하여 생성될 수 있다. Cas9 분자의 유도 진화를 위해 사용될 수 있는 예시적인 방법 및 시스템은, 예를 들어 문헌[Esvelt el al, Nature 2011, 472(7344): 499-503]에 기재되어 있다. 후보 Cas9 분자는, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 평가될 수 있다.
절단하지 않는 및 변형된 절단 Cas9 분자
구현예에서, Cas9 분자는 자연적 발생 Cas9 분자와 상이한, 예를 들어 가장 가까운 상동성을 갖는 자연적 발생 Cas9 분자와 상이한 절단 특성을 포함한다. 예를 들어 Cas9 분자는 자연적 발생 Cas9 분자, 예를 들어 S. 피오게네스의 Cas9 분자와 다음과 같이 상이할 수 있다: 예를 들어 자연적 발생 Cas9 분자(예를 들어 S. 피오게네스의 Cas9 분자)에 비해 예를 들어 감소 또는 증가된, 이중 가닥 단절의 절단(엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성)을 조절하는 능력; 예를 들어 자연적 발생 Cas9 분자(예를 들어 S. 피오게네스의 Cas9 분자)에 비해, 예를 들어 감소 또는 증가된, 핵산의 단일 가닥, 예를 들어 핵산 분자의 비상보적 가닥 또는 핵산 분자의 상보적 가닥의 절단을 조절하는 능력(니카제 활성); 또는 핵산 분자, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자를 절단하는 능력이 제거될 수 있다.
변형된 절단 활성 Cas9 분자
구현예에서, 활성Cas9 분자는 다음의 활성 중 하나 이상을 포함한다: N-말단의 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성; HNH-유사 도메인과 관련된 절단 활성; HNH 도메인과 관련된 절단 활성 및 N-말단의 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성.
구현예에서, Cas9 분자는 Cas9 니카제고, 예를 들어 오직 DNA의 단일 가닥만 절단한다. 구현예에서, Cas9 니카제는SEQ ID NO: 6611의 위치 10에서의 돌연변이 및/또는 위치 840에서의 돌연변이를 포함하고, 예를 들어 SEQ ID NO: 6611에 대해 D10A 및/또는 H840A 돌연변이를 포함한다.
절단하지 않는 불활성 Cas9 분자
구현예에서, 변경된 Cas9 분자는 핵산 분자(이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자 어느 것도)를 절단하지 않거나, 또는 예를 들어 본원에 기재된 검정에 의해 측정하여, 상당히 더 적은 효율로, 예를 들어 참조 Cas9 분자의 절단 활성의 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만으로 핵산 분자를 절단하는 불활성 Cas9 분자이다. 참조Cas9 분자는 자연적으로 발생한 변형되지 않은 Cas9 분자, 예를 들어 S. 피오게네스, S.써모필루스, S.아우레우스 또는 N. 메닌기티디스의 Cas9 분자와 같은 자연적 발생 Cas9 분자일 수 있다. 구현예에서, 참조Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 자연적 발생 Cas9 분자이다. 구현예에서, 불활성 Cas9 분자는 실질적인 N-말단의 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성 및 HNH-유사 도메인과 관련된 절단 활성이 없다.
구현예에서, Cas9분자는 dCas9이다. 문헌[Tsai et al.(2014), Nat. Biotech. 32:569-577].
촉매적 불활성 Cas9 분자는 전사 억제제와 융합될 수 있다. 불활성 Cas9 융합 단백질은 gRNA와 복합체 형성하고, gRNA의 표적화 도메인에 의해 특정된 DNA 서열로 배치하지만, 활성 Cas9와 달리, 이는 표적 DNA를 절단하지 않을 것이다. 이펙터 도메인, 예를 들어 전사 억제 도메인의 불활성 Cas9로의 융합은 gRNA에 의해 특정된 임의의 DNA 부위로의 이펙터 모집을 가능하게 한다. 유전자의 프로모터 영역으로의 Cas9 융합 단백질의 부위 특이적 표적화는 프로모터 영역에 폴리머라제가 결합하는 것, 예를 들어 전사 활성화를 증가 또는 저해하는 핵산에 전사 인자(예를 들어 전사 활성화제) 및/또는 전사 인핸서와 융합된 Cas9가 결합하는 것을 차단하거나 영향을 미칠 수 있다. 대안적으로, 유전자의 전사 억제제 또는 프로모터 영역으로의 Cas9-융합의 부위 특이적 표적화는 전사 활성화를 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
불활성 Cas9 분자에 융합될 수 있는 전사 억제제 또는 전사 억제제 도메인에는 크루펠(kruppel) 관련 박스(KRAB 또는 SKD), Mad mSIN3 상호작용 도메인(SID) 또는 ERF 억제제 도메인(ERD)이 포함될 수 있다.
또다른 구현예에서, 불활성 Cas9 분자는 염색질을 변형하는 단백질과 융합될 수 있다. 예를 들어 불활성 Cas9 분자는 이질염색질 단백질 1(HP1), 히스톤 리신 메틸트랜스퍼라제(예를 들어 SUV39H1, SUV39H2, G9A, ESET/SETDB1, Pr-SET7/8, SUV4-20H1, RIZ1), 히스톤 리신 데메틸레이트(예를 들어 LSD1/BHC1 10, SpLsd1/Sw, 1/Saf1 10, Su(var)3-3, JMJD2A/JHDM3A, JMJD2B, JMJD2C/GASC1, JMJD2D, Rph1, JARID1A/RBP2, JAR1D1B/PLU-1, JAR1D1C/SMCX, JARID1D/SMCY, Lid, Jhn2, Jmj2), 히스톤 리신 데아세틸라제(예를 들어 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8, Rpd3, Hos1, Cir6, HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9, Hda1, Cir3, SIRT1, SIRT2, Sir2, Hst1, Hst2, Hst3, Hst4, HDAC11) 및 DNA 메틸라제(DNMT1, DNMT2a/DMNT3b, MET1)에 융합될 수 있다. 불활성 Cas9-염색질 변형 분자 융합 단백질은 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해 염색질 상태를 변경하는 데 사용될 수 있다.
이종 서열(예를 들어 전사 억제제 도메인)은 불활성 Cas9 단백질의 N- 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 이종 서열(예를 들어 전사 억제제 도메인)은 불활성 Cas9 단백질의 내부 부분(즉, N-말단 또는 C-말단 외의 일부분)에 융합될 수 있다.
Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 표적 핵산에 결합하고 표적 핵산을 절단하는 능력은, 예를 들어 섹션 III에서 본원에 기재된 방법에 의해 평가될 수 있다. 활성 Cas9 또는 불활성 Cas9와 같은 Cas9 분자의 활성은 단독으로 또는 gRNA 분자와의 복합체에서, 유전자 발현 검정 및 염색질-기반 검정, 예를 들어 염색질 면역침전(ChiP) 및 염색질 생체내 검정(CiA)을 포함하는 당분야에 잘 알려진 방법에 의해 또한 평가될 수 있다.
다른 Cas9 분자 융합
구현예에서, Cas9 분자, 예를 들어 S. 피오게네스의 Cas9는 추가적인 활성을 부여하는 하나 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, Cas9 분자는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 NLS와 같은 하나 이상의 핵 국재화 서열(NLS)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자는 아미노 말단에 또는 그 근처에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 NLS, 카르복시 말단에 또는 그 근처에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 NLS, 또는 이들의 조합(예를 들어 아미노 말단에 하나 이상의 NLS 및 카르복시 말단에 하나 이상의 NLS)를 포함한다. 하나를 초과하는 NLS가 존재할 때, 각각은 다른 것들과 독립적으로 선택될 수 있어, 단일 NLS는 하나를 초과하는 카피로 및/또는 하나 이상의 카피로 존재하는 하나 이상의 다른 NLS와 조합하여 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, NLS는 NLS의 가장 가까운 아미노산이 N 말단 또는 C 말단으로부터 폴리펩티드 사슬을 따라 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 이상의 아미노산 이내일 때, N- 또는 C-말단 근처라고 여겨진다. 전형적으로, NLS는 단백질 표면상에 노출된 하나 이상의 양전하 리신 또는 아르기닌의 짧은 서열로 구성되지만, 다른 유형의 NLS가 알려져 있다. NLS의 비제한적인 예로는 아미노산 서열 PKKKRKV(SEQ ID NO: 6612)를 갖는 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS; 서열 KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO: 6613)의 뉴클레오플라스민으로부터의 NLS(예를 들어 뉴클레오플라스민 2부분으로 된 NLS; 아미노산 서열 PAAKRVKLD(SEQ ID NO: 6614) 또는 RQRRNELKRSP(SEQ ID NO: 6615)를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO: 6616)를 갖는 hRNPA1 M9 NLS, 임포틴-알파로부터의 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO: 6617); 근종 T단백질의 서열 VSRKRPRP(SEQ ID NO: 6618) 및 PPKKARED(SEQ ID NO: 6619); 인간 p53의 서열 PQPKKKPL(SEQ ID NO: 6620); 마우스 c-ab1 IV의 서열 SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO: 6621); 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR(SEQ ID NO: 6622) 및 PKQKKRK(SEQ ID NO: 6623); 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL(SEQ ID NO: 6624); 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR(SEQ ID NO: 6625); 인간 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO: 6626); 및 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO: 6627)를 포함하거나 이로부터 유래된 NLS 서열이 포함된다. 다른 적합한 NLS 서열은 당분야에 공지되어있다(예를 들어 Sorokin, Biochemistry(Moscow)(2007) 72:13, 1439-1457; Lange J Biol Chem.(2007) 282:8, 5101-5).
구현예에서, Cas9 분자, 예를 들어 S. 피오게네스 Cas9 분자는, 예를 들어 Cas9 분자에 대해 N 말단 배치되는, SV40의 NLS 서열을 포함한다. 구현예에서, Cas9 분자, 예를 들어 S. 피오게네스Cas9 분자는Cas9 분자에 대해 N 말단 배치되는 SV40의 NLS 서열 및 Cas9 분자에 대해 C 말단 배치되는 SV40의 NLS 서열을 포함한다. 구현예에서, Cas9 분자, 예를 들어 S. 피오게네스 Cas9 분자는Cas9 분자에 대해 N 말단 배치되는 SV40의 NLS 서열 및 Cas9 분자에 대해 C 말단 배치되는 뉴클레오플라스민의 NLS 서열을 포함한다. 전술한 구현예 중 임의의 것에서, 분자는 예를 들어 N 말단 또는 C 말단에 태그, 예를 들어 His 태그, 예를 들어 His(6) 태그 또는 His(8) 태그를 추가로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, Cas9 분자는 Cas9 분자가 특이적으로 인식되도록 하는 하나 이상의 아미노산 서열, 예를 들어 태그를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 태그는 히스티딘 태그, 예를 들어 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 히스티딘 아미노산을 포함하는 히스티딘 태그이다. 구현예에서, 히스티딘 태그는 His6 태그(6개의 히스티딘)이다. 다른 구현예에서, 히스티딘 태그는 His8 태그(8개의 히스티딘)이다. 구현예에서, 히스티딘 태그는 링커에 의해 Cas9 분자의 하나 이상의 다른 부분으로부터 분리될 수있다. 구현예에서, 링커는 GGS이다. 그러한 융합의 예는 Cas9 분자 iProt106520이다.
일부 양태에서, Cas9 분자는 프로테아제에 의해 인식되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함(예를 들어 프로테아제 절단 부위를 포함)할 수 있다. 구현예에서, 절단 부위는 담배 식각 바이러스(TEV) 절단 부위, 예를 들어 서열 ENLYFQG(SEQ ID NO: 7810)를 포함한다. 일부 양태에서, 프로테아제 절단 부위, 예를 들어 TEV 절단 부위는 태그, 예를 들어 His6 또는 His8 태그와 같은 His 태그와 Cas9 분자의 나머지 사이에 배치된다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 도입은, 예를 들어 Cas9 분자의 정제를 위한 태그의 사용, 및 태그가 Cas9 분자 기능을 방해하지 않도록 후속적 절단을 감안할 것으로 여겨진다.
구현예에서, Cas9 분자(예를 들어 본원에 기재된 Cas9 분자)는 N-말단 NLS 및 C-말단 NLS를 포함(예를 들어 N-말단에서 C-말단으로 NLS-Cas9-NLS를 포함)하며, 예를 들어 각각의 NLS는 SV40 NLS(PKKKRKV(SEQ ID NO: 6612))이다. 구현예에서, Cas9 분자(예를 들어 본원에 기재된 Cas9 분자)는 N-말단 NLS, C-말단 NLS 및 C-말단 His6 태그를 포함(예를 들어 N-말단에서 C-말단으로NLS- Cas9-NLS-His 태그를 포함)하며, 예를 들어 각 NLS는 SV40 NLS(PKKKRKV(SEQ ID NO: 6612))이다. 구현예에서, Cas9 분자(예를 들어 본원에 기재된 Cas9 분자)는 N-말단 His 태그(예를 들어 His6 태그), N-말단 NLS 및 C-말단 NLS를 포함(예를 들어 N-말단에서 C-말단으로His 태그-NLS-Cas9-NLS를 포함)하며, 예를 들어 각 NLS는 SV40 NLS(PKKKRKV(SEQ ID NO: 6612))이다. 구현예에서, Cas9 분자(예를 들어 본원에 기재된 Cas9 분자)는 N-말단 NLS 및 C-말단 His 태그(예를 들어 His6 태그)를 포함(예를 들어 N-말단에서 C-말단으로His 태그-Cas9-NLS를 포함)하며, NLS는 SV40 NLS(PKKKRKV(SEQ ID NO: 6612))이다. 구현예에서, Cas9 분자(예를 들어 본원에 기재된 Cas9 분자)는 N-말단 NLS 및 C-말단 His 태그(예를 들어 His6 태그)를 포함(예를 들어 N-말단에서 C-말단으로NLS-Cas9-His 태그를 포함)하며, 예를 들어 NLS는 SV40 NLS(PKKKRKV(SEQ ID NO: 6612))이다. 구현예에서, Cas9 분자(예를 들어 본원에 기재된 Cas9 분자)는 N-말단 His 태그(예를 들어 His8 태그), N-말단 절단 도메인(예를 들어 담배 식각 바이러스(TEV) 절단 도메인(예를 들어 서열 ENLYFQG(SEQ ID NO: 7810)를 포함)), N-말단 NLS(예를 들어 SV40 NLS; SEQ ID NO: 6612), 및 C-말단 NLS(예를 들어 SV40 NLS; SEQ ID NO: 6612)를 포함(예를 들어 N-말단에서 C-말단으로 His 태그-TEV-NLS-Cas9-NLS를 포함)한다. 전술한 구현예 중 임의의 것에서, Cas9는 SEQ ID NO: 6611의 서열을 갖는다. 대안적으로, 전술한 구현예 중 임의의 것에서, Cas9는, 예를 들어 본원에 기재된, SEQ ID NO: 6611의 Cas9 변이체의 서열을 갖는다. 전술한 구현예 중 임의의 것에서, Cas9 분자는 His 태그와 분자의 또다른 부분 사이에 링커, 예를 들어 GGS 링커를 포함한다. 상기 기재된 예시적인 Cas9 분자의 아미노산 서열이 아래에 제공된다. "iProt" 식별자는 도 60에서의 것과 매치된다.
iProt105026(단백질의 조제물에 따라, iProt106154, iProt106331, iProt106545, 및 PID426303으로도 지칭됨)(SEQ ID NO: 7821):
Figure pct00112
iProt106518(SEQ ID NO: 7822):
Figure pct00113
iProt106519(SEQ ID NO: 7823):
Figure pct00114
iProt106520(SEQ ID NO: 7824):
Figure pct00115
iProt106521(SEQ ID NO: 7825):
Figure pct00116
iProt106522(SEQ ID NO: 7826):
Figure pct00117
iProt106658(SEQ ID NO: 7827):
Figure pct00118
iProt106745(SEQ ID NO: 7828):
Figure pct00119
iProt106746(SEQ ID NO: 7829):
Figure pct00120
iProt106747(SEQ ID NO: 7830):
Figure pct00121
iProt106884(SEQ ID NO: 7831):
Figure pct00122
Cas9 분자를 인코딩하는 핵산
Cas9 분자, 예를 들어 활성 Cas9 분자 또는 불활성 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산이 본원에 제공된다.
Cas9 분자를 인코딩하는 예시적인 핵산은 문헌[Cong et al, SCIENCE 2013, 399(6121):819-823]; 문헌[Wang et al, CELL 2013, 153(4):910-918]; 문헌[Mali et al., SCIENCE 2013, 399(6121):823-826]; 문헌[Jinek et al, SCIENCE 2012, 337(6096):816-821]에 기재되어 있다.
구현예에서, Cas9 분자를 인코딩하는 핵산은 합성 핵산 서열일 수 있다. 예를 들어 합성 핵산 분자는, 예를 들어 섹션 XIII에 기재된 바와 같이, 화학적으로 변형될 수 있다. 구현예에서, Cas9 mRNA는 다음의 특성 중 하나 이상, 예를 들어 모두를 갖는다: 캡핑되고, 폴리아데닐화되고, 5-메틸시티딘 및/또는 슈도우리딘으로 치환된다.
추가적으로 또는 대안적으로, 합성 핵산 서열은 코돈 최적화될 수 있으며, 예를 들어 적어도 하나의 흔하지 않은(non-common) 코돈 또는 덜 흔한 코돈이 흔한 코돈으로 대체되었다. 예를 들어 합성 핵산은 최적화된, 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 포유동물 발현 시스템에서의 발현에 최적화된, 메신저 mRNA의 합성을 지시할 수 있다.
S. 피오게네스의 Cas9 분자를 인코딩하는 예시적인 코돈 최적화된 핵산 서열이 아래에서 제공된다.
Figure pct00123
Figure pct00124
(SEQ ID NO: 6628)
상기 Cas9 서열이 C-말단에서 펩티드 또는 폴리펩티드와 융합되는 경우(예를 들어 C-말단에서 전사 억제제와 융합된 불활성 Cas9), 정지 코돈이 제거될 것으로 이해된다.
VI. 후보 분자의 기능적 분석
후보 Cas9 분자, 후보 gRNA 분자, 후보 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 당분야에 공지된 방법에 의해 또는 본원에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 예를 들어 Cas9 분자의 엔도뉴클레아제 활성을 평가하기 위한 예시적인 방법은 예를 들어 문헌[Jinek el al., SCIENCE 2012; 337(6096):816-821]에 기재되어 있다.
VII. 주형 핵산(핵산 도입용)
본원에 사용된 용어 "주형 핵산" 또는 "공여자 주형"은 본 발명의 CRISPR 시스템에 의해 변형된, 예를 들어 절단된 표적 서열에 또는 그 근처에 삽입되는 핵산을 지칭한다. 구현예에서, 표적 서열의 또는 그 근처의 핵산 서열은 전형적으로 절단 부위(들)에 또는 그 근처에, 주형 핵산의 서열의 일부 또는 전부를 갖도록 변형된다. 구현예에서, 주형 핵산은 단일 가닥이다. 대안적인 구현예에서, 주형 핵산은 이중 가닥이다. 구현예에서, 주형 핵산은 DNA, 예를 들어 이중 가닥 DNA이다. 대안적인 구현예에서, 주형 핵산은 단일 가닥 DNA이다.
구현예에서, 주형 핵산은 글로빈 단백질, 예를 들어 베타 글로빈을 인코딩하는 서열을 포함하며, 예를 들어 베타 글로빈 유전자를 포함한다. 구현예에서, 핵산에 의해 인코딩되는 베타 글로빈은 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 항-겸상적혈구화 돌연변이를 포함한다. 구현예에서, 핵산에 의해 인코딩되는 베타 글로빈은 돌연변이 T87Q를 포함한다. 구현예에서, 핵산에 의해 인코딩되는 베타 글로빈은 돌연변이 G16D를 포함한다. 구현예에서, 핵산에 의해 인코딩되는 베타 글로빈은 돌연변이 E22A를 포함한다. 구현예에서, 베타 글로빈 유전자는 돌연변이 G16D, E22A 및 T87Q를 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 하나 이상의 조절 요소, 예를 들어 프로모터(예를 들어 인간 베타 글로빈 프로모터), 3' 인핸서, 및/또는 글로빈 유전자좌 제어 영역(예를 들어 하나 이상의 DNAseI 과민성 부위(예를 들어 인간 글로빈 유전자좌의 HS2, HS3 및/또는 HS4))의 적어도 일부분을 추가로 포함한다.
다른 구현예에서, 주형 핵산은 감마 글로빈을 인코딩하는 서열을 포함하며, 예를 들어 감마 글로빈 유전자를 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 감마 글로빈 단백질의 하나를 초과하는 카피를 인코딩하는 서열을 포함하며, 예를 들어 2개 이상, 예를 들어 2개의 감마 글로빈 유전자 서열을 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 하나 이상의 조절 요소, 예를 들어 프로모터 및/또는 인핸서를 추가로 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은 상동성 지시된 수선 이벤트에 참여함으로써 표적 위치의 구조를 변경한다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치의 서열을 변경한다. 구현예에서, 주형 핵산은 변형된 또는 자연적 발생이 아닌 염기의 표적 핵산으로의 도입을 야기한다.
본원에 기재된 유전자 또는 경로의 돌연변이는 본원에서 논의된 접근법 중 하나를 이용하여 교정될 수 있다. 구현예에서, 본원에 기재된 유전자 또는 경로의 돌연변이는 주형 핵산을 이용하는 상동성 지시된 수선(HDR)에 의해 교정된다. 구현예에서, 본원에 기재된 유전자 또는 경로의 돌연변이는 주형 핵산을 이용하는 상동 재조합(HR)에 의해 교정된다. 구현예에서, 본원에 기재된 유전자 또는 경로의 돌연변이는 주형 핵산을 이용하는 비상동 말단 접합(NHEJ) 수선에 의해 교정된다. 다른 구현예에서, 관심 분자를 인코딩하는 핵산은 본 발명의 CRISPR 시스템에 의해 변형되는 부위에 또는 그 근처에 삽입될 수 있다. 구현예에서, 주형 핵산은 예를 들어 본원에 기재된, 관심 분자를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소, 예를 들어 하나 이상의 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다.
HDR 또는 HR 수선 및 주형 핵산
본원에 기재된 바와 같이, 뉴클레아제-유도된 상동성 지시된 수선(HDR) 또는 상동 재조합(HR)은 표적 서열을 변경하고 게놈 내의 돌연변이를 교정(예를 들어 수선 또는 편집)하는 데 사용될 수 있다. 이론에 얽매이기를 원하지 않지만, 표적 서열의 변경은 공여자 주형 또는 주형 핵산에 기반한 수선에 의해 발생하는 것으로 여겨진다. 예를 들어 공여자 주형 또는 주형 핵산은 표적 서열의 변경을 대비한다. 플라스미드 공여자 또는 선형 이중 가닥 주형이 상동 재조합을 위한 주형으로서 사용될 수 있음이 고려된다. 단일 가닥 공여자 주형이 표적 서열과 공여자 주형 사이에서의 상동성 지시 수선(예를 들어 단일 가닥 어닐링)이라는 대안적 방법에 의해 표적 서열을 변경하기 위한 주형으로서 사용될 수 있음이 추가로 고려된다. 표적 서열의 공여자 주형-영향 변경은 Cas9 분자에 의한 절단에 의존할 수 있다. Cas9에 의한 절단은 이중 가닥 단절, 하나의 단일 가닥 단절, 또는 2개의 단일 가닥 단절을 포함할 수 있다.
구현예에서, 돌연변이는 하나의 이중 가닥 단절 또는 두 개의 단일 가닥 단절에 의해 교정될 수 있다. 구현예에서, 돌연변이는(1)하나의 이중 가닥 단절, (2)두 개의 단일 가닥 단절, (3)단절이 표적 서열의 각 편 상에서 발생하는 두 개의 이중 가닥 단절, (4)이중 가닥 단절 및 두 개의 단일 가닥 단절이 표적 서열의 각 편 상에서 발생하는 하나의 이중 가닥 단절 및 두 개의 단일 가닥 단절, (5)한 쌍의 단일 가닥 단절이 표적 서열의 각 편 상에서 발생하는 네 개의 단일 가닥 단절, 또는(6)하나의 단일 가닥 단절을 형성하는 CRISPR/Cas9 시스템 및 주형을 제공함으로써 교정될 수 있다.
이중 가닥 단절 매개 교정
구현예에서, 이중 가닥 절단은 HNH-유사 도메인과 관련된 절단 활성 및 RuvC-유사 도메인, 예를 들어 N-말단 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성을 갖는 Cas9분자, 예를 들어 야생형 Cas9에 의해 영향을 받는다. 이러한 구현예는 오직 단일 gRNA만을 필요로 한다.
단일 가닥 단절 매개 교정
다른 구현예에서, 2개의 단일 가닥 단절 또는 닉(nick)은 니카제 활성, 예를 들어 HNH-유사 도메인과 관련된 절단 활성 또는 N-말단 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성을 갖는 Cas9 분자에 의해 영향을 받는다. 이러한 구현예는 2개의 gRNA를 필요로 하며, 각각의 단일 가닥 단절의 배치를 위한 것이다. 구현예에서, 니카제 활성을 갖는 Cas9 분자는 gRNA가 혼성화되는 가닥을 절단 하지만, gRNA가 혼성화되는 가닥에 상보적인 가닥은 절단하지 않는다. 구현예에서, 니카제 활성을 갖는 Cas9 분자는 gRNA가 혼성화되는 가닥을 절단하지 않지만, 오히려 gRNA가 혼성화되는 가닥에 상보적인 가닥을 절단한다.
구현예에서, 니카제는 HNH 활성을 갖는다, 예를 들어 불활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9분자, 예를 들어 D10A 돌연변이와 같은 D10에서의 돌연변이를 갖는 Cas9 분자. D10A는 RuvC를 불활성화시키며; 따라서, Cas9 니카제는(오직) HNH 활성을 가지며, gRNA가 혼성화되는 가닥(예를 들어 NGG PAM을 갖지 않는, 상보적 가닥)을 절단할 것이다. 다른 구현예에서, H840, 예를 들어 H840A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자는 니카제로서 사용될 수있다. H840A는 HNH를 불활성화시키며; 따라서, Cas9 니카제는(오직) RuvC 활성을 가지며 비 상보적 가닥(예를 들어 NGG PAM을 갖고 그 서열이 gRNA와 동일한 가닥)을 절단한다.
니카제 및 2개의 gRNA가 2개의 단일 가닥 닉을 위치시키는 데 사용되는 구현예에서, 하나의 닉은 표적 핵산의 + 가닥 상에 있고 하나의 닉은 - 가닥 상에 있다. PAM은 바깥 쪽을 향하고 있다. gRNA가 약 0 내지 50부터, 0 내지 100 또는 0 내지 200 뉴클레오티드에 의해 분리되도록 gRNA는 선택될 수 있다. 구현예에서, 2개의 gRNA의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열 간에 중첩이 없다. 구현예에서, gRNA는 중첩되지 않으며 50, 100 또는 200 뉴클레오티드만큼에 의해 분리된다. 구현예에서, 2개의 gRNA의 사용은 예를 들어 표적-외 결합을 감소시킴으로써 특이성을 증가시킬 수있다(Ran el cil., CELL 2013).
구현예에서, 단일 닉은 HDR을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 단일 닉은 주어진 절단 부위에서 HDR, HR 또는 NHEJ의 비율을 증가시키는 데 사용될 수 있음이 본원에서 고려된다.
표적 위치에 관련하여 이중 가닥 단절 또는 단일 가닥 단절의 배치
가닥 중 하나에서 이중 가닥 단절 또는 단일 가닥 단절은 그러한 교정이 발생하도록 표적 위치에 충분히 가까워야 한다. 구현예에서, 거리는 50, 100, 200, 300, 350 또는 400 뉴클레오티드 이하이다. 이론에 얽매이기를 원하지 않지만, 단절은 말단 절제 동안의 엑소뉴클레아제-매개된 제거의 대상체가 되는 영역 내에 있도록 표적 위치에 충분히 가까워야 한다고 여겨진다. 표적 위치와 단절 사이의 거리가 너무 큰 경우, 돌연변이는 말단 절제에 포함되지 못할 수 있으며, 따라서, 공여자 서열이 말단 절제 영역 내의 서열을 교정하는 데에만 사용될 수 있기 때문에, 돌연변이는 교정되지 않을 수 있다.
gRNA(단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA) 및 Cas9 뉴클레아제가 HDR- 또는 HR-매개 교정을 유도할 목적으로 이중 가닥 단절을 유도하는 구현예에서, 절단 부위는 표적 위치로부터 0 내지 200 bp 사이(예를 들어 0 내지 175, 0 내지 150, 0 내지 125, 0 내지 100, 0 내지 75, 0 내지 50, 0 내지 25, 25 내지 200, 25 내지 175, 25 내지 150, 25 내지 125, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 200, 50 내지 175, 50 내지 150, 50 내지 125, 50 내지 100, 50 내지 75, 75 내지 200, 75 내지 175, 75 내지 150, 75 내지 125, 75 내지 100 bp) 떨어져 있다. 구현예에서, 절단 부위는 표적 위치로부터 0 내지 100 bp 사이(예를 들어 0 내지 75, 0 내지 50, 0 내지 25, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 100, 50 내지 75 또는 75 내지 100 bp) 떨어져 있다.
Cas9 니카제와 복합체를 형성하는 2개의 gRNA(독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA)가 HDR-매개 교정을 유도할 목적으로 2개의 단일 가닥 단절을 유도하는 구현예에서, 더 가까운 닉은 표적 위치로부터 0 내지 200 bp 사이(예를 들어 0 내지 175, 0 내지 150, 0 내지 125, 0 내지 100, 0 내지 75, 0 내지 50, 0 내지 25, 25 내지 200, 25 내지 175, 25 내지 150, 25 내지 125, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 200, 50 내지 175, 50 내지 150, 50 내지 125, 50 내지 100, 50 내지 75, 75 내지 200, 75 내지 175, 75 내지 150, 75 내지 125, 75 내지 100 bp) 떨어져 있고, 2개의 닉은 이상적으로 서로의 25 내지 55 bp 내(예를 들어 25 내지 50, 25 내지 45, 25 내지 40, 25 내지 35, 25 내지 30, 30 내지 55, 30 내지 50, 30 내지 45, 30 내지 40, 30 내지 35, 35 내지 55, 35 내지 50, 35 내지 45, 35 내지 40, 40 내지 55, 40 내지 50, 40 내지 45bp)에 있을 것이며, 서로로부터 100 bp 이하 떨어져 있을(예를 들어 서로로부터 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 또는 5 bp 이하로 떨어져 있을) 것이다. 구현예에서, 절단 부위는 표적 위치로부터 0 내지 100 bp 사이(예를 들어 0 내지 75, 0 내지 50, 0 내지 25, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 100, 50 내지 75 또는 75 내지 100 bp) 떨어져 있다.
일 구현예에서, 2개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA는 표적 위치의 양 편 상에 이중 가닥 단절을 위치시키도록 배열된다. 대안적인 구현예에서, 3개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA는 이중 가닥 단절(즉, Cas9 뉴클레아제와 복합체 형성하는 하나의 gRNA) 및 2개의 단일 가닥 단절 또는 쌍을 이루는 단일 가닥 단절(즉, Cas9 니카제와 복합체 형성하는 2개의 gRNA)을 표적 위치의 각 편 상에 위치시키도록 배열된다(예를 들어 제1 gRNA는 표적 위치의 업스트림(즉, 5')을 표적화하는 데 사용되며 제2 gRNA는 표적 위치의 다운스트림(즉, 3')을 표적화하는 데 사용된다). 또다른 구현예에서, 4개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA는 표적 위치의 각 편 상에 2 쌍의 단일 가닥 단절(즉, Cas9 니카제와 복합체 형성하는 2개의 gRNA의 2 쌍)을 생성하도록 배열된다(예를 들어 제1 gRNA는 표적 위치의 업스트림(즉, 5')을 표적화하는 데 사용되며 제2 gRNA는 표적 위치의 다운스트림(즉, 3')을 표적화하는 데 사용된다). 이중 가닥 단절(들) 또는 쌍에서 2개의 단일 가닥 닉 중 더 가까운 것은 이상적으로 표적 위치의 0 내지 500 bp 이내(예를 들어 표적 위치로부터 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, l00, 50 또는 25 bp이하)에 있을 것이다. 니카제가 사용될 때, 쌍에서 2개의 닉은 서로의 25 내지 55 bp 이내(예를 들어 25 내지 50, 25 내지 45, 25 내지 40, 25 내지 35, 25 내지 30, 50 내지 55, 45 내지 55, 40 내지 55, 35 내지 55, 30 내지 55, 30 내지 50, 35 내지 50, 40 내지 50, 45 내지 50, 35 내지 45, 또는 40 내지 45 bp 사이)에 있으며, 서로로부터 100 bp 이하(예를 들어 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 bp 이하) 떨어져 있다.
일 구현예에서, 2개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA는 표적 위치의 양 편 상에 이중 가닥 단절을 위치시키도록 배열된다. 대안적인 구현예에서, 3개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA는 이중 가닥 단절(즉, Cas9 뉴클레아제와 복합체 형성하는 하나의 gRNA) 및 2개의 단일 가닥 단절 또는 쌍을 이루는 단일 가닥 단절(즉, Cas9 니카제와 복합체 형성하는 2개의 gRNA)을 2개의 표적 서열 상에 위치시키도록 배열된다(예를 들어 제1 gRNA는 표적 서열의 업스트림(즉, 5')을 표적화하는 데 사용되며 제2 gRNA는 삽입 부위의 표적 서열의 다운스트림(즉, 3')을 표적화하는 데 사용된다). 또다른 구현예에서, 4개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA는 삽입 부위의 각 편 상에 2 쌍의 단일 가닥 단절(즉, Cas9 니카제와 복합체 형성하는 2개의 gRNA의 2 쌍)을 생성하도록 배열된다(예를 들어 제1 gRNA는 본원에 기재된 표적 서열의 업스트림(즉, 5')을 표적화하는 데 사용되며 제2 gRNA는 본원에 기재된 표적 서열의 다운스트림(즉, 3')을 표적화하는 데 사용된다). 이중 가닥 단절(들) 또는 쌍에서 2개의 단일 가닥 닉 중 더 가까운 것은 이상적으로 표적 위치의 0 내지 500 bp 이내(예를 들어 표적 위치로부터 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 또는 25 bp이하)에 있을 것이다. 니카제가 사용될 때, 쌍에서 2개의 닉은 서로의 25 내지 55 bp 이내(예를 들어 25 내지 50, 25 내지 45, 25 내지 40, 25 내지 35, 25 내지 30, 50 내지 55, 45 내지 55, 40 내지 55, 35 내지 55, 30 내지 55, 30 내지 50, 35 내지 50, 40 내지 50, 45 내지 50, 35 내지 45, 또는 40 내지 45 bp 사이)에 있으며, 서로로부터 100 bp 이하(예를 들어 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 bp 이하) 떨어져 있다.
상동성 암(arm)의 길이
상동성 암은 예를 들어 절제된 단일 가닥 돌출부가 공여자 주형 내에서 상보적 영역을 찾을 수 있도록 하기 위해서, 적어도 말단 절제가 발생할 수 있는 영역까지 연장되어야 한다. 전체 길이는 플라스미드 크기 또는 바이러스 패키징 한계와 같은 파라미터에 의해 제한될 수 있다. 구현예에서, 상동성 암은 반복 요소, 예를 들어 ALU 반복, LINE 반복 내로 연장되지 않는다. 주형은 동일하거나 상이한 길이의 2개의 상동성 암을 가질 수 있다.
예시적인 상동성 암 길이는 적어도 25, 50, 100, 250, 500, 750 또는 1000 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 사용된 표적 위치는 Cas9 분자-의존적 과정에 의해 변형되는 표적 핵산(예를 들어 염색체)상의 부위를 지칭한다. 예를 들어 표적 위치는 표적 핵산의 변형된 Cas9 분자 절단 및 표적 위치의 주형 핵산 지시된 변형, 예를 들어 교정일 수 있다. 구현예에서, 표적 위치는 하나 이상의 뉴클레오티드가 첨가되는 표적 핵산 상의 2개의 뉴클레오티드, 예를 들어 인접한 뉴클레오티드 사이의 부위일 수 있다. 표적 위치는 주형 핵산에 의해 변경(예를 들어 교정) 되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 구현예에서, 표적 위치는 표적 서열(예를 들어 gRNA가 결합하는 서열) 내에 있다. 구현예에서, 표적 위치는 표적 서열(예를 들어 gRNA가 결합하는 서열)의 업스트림 또는 다운스트림이다.
전형적으로, 주형 서열은 표적 서열과 단절 매개된 또는 촉매된 재조합을 겪는다. 구현예에서, 주형 핵산은 Cas9 매개된 절단 이벤트에 의해 절단되는 표적 서열상의 부위에 상응하는 서열을 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 제1 Cas9 매개 이벤트에서 절단되는 표적 서열 상의 제1 부위 및 제2 Cas9 매개 이벤트에서 절단되는 표적 서열 상의 제2 부위 둘 다에 상응하는 서열을 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은 번역된 서열의 코딩 서열에서의 변경을 야기하는 서열, 예를 들어 돌연변이 대립유전자를 야생형 대립유전자로 형질전환하는, 야생형 대립유전자를 돌연변이 대립유전자로 형질전환하는, 및/또는 정지 코돈을 도입하는 것과 같은, 단백질 산물에서 하나의 아미노산의 또다른 것으로의 치환, 아미노산 잔기의 삽입, 아미노산 잔기의 결실, 또는 넌센스 돌연변이를 야기하는 것을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 주형 핵산은 비-코딩 서열에서의 변경, 예를 들어 엑손에서의 또는 5'또는 3' 비-번역 또는 비-전사 영역에서의 변경을 야기하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 제어 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서에서의 변경, 및 시스-작용 또는 트랜스-작용 제어 요소에서의 변경을 포함한다.
주형 핵산은 통합될 때:
양성 제어 요소의 활성 감소;
양성 제어 요소의 활성 증가;
음성 제어 요소의 활성 감소;
음성 제어 요소의 활성 증가;
유전자의 발현 감소;
유전자의 발현 증가;
장애 또는 질병에 대한 내성 증가;
바이러스 진입에 대한 내성 증가;
돌연변이 교정 또는 원하지 않는 아미노산 잔기 변경;
유전자 산물의 생물학적 특성 부여, 증가, 파괴 또는 감소, 예를 들어 효소의 효소 활성 증가, 또는 유전자 산물의 또다른 분자와 상호작용하는 능력 증가; 를 야기하는 서열을 포함할 수 있다.
주형 핵산은:
표적 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 이상 뉴클레오티드의 서열에서의 변화를 야기하는 서열을 포함할 수 있다.
구현예에서, 주형 핵산은 20+/- 10, 30+/- 10, 40+/- 10, 50+/- 10, 60+/- 10, 70+/- 10, 80+/- 10, 90+/- 10, 100+/- 10, 1 10+/- 10, 120+/- 10, 130+/- 10, 140+/- 10, 150+/- 10, 160+/- 10, 170+/- 10, 1 80+/- 10, 190+/- 10, 200+/- 10, 210+/-10, 220+/- 10, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 1000 내지 2000, 2000 내지 3000 또는 3000을 초과하는 뉴클레오티드 길이이다.
주형 핵산은 다음의 성분을 포함한다:
[5' 상동성 암]-[삽입 서열]-[3' 상동성 암].
상동성 암은 염색체 내로의 재조합을 대비하며, 이는 원하지 않는 요소, 예를 들어 돌연변이 또는 특징을 대체 서열로 대체할 수 있다. 구현예에서, 상동성 암은 가장 먼 절단 부위의 옆에 배치된다.
구현예에서, 5' 상동성 암의 3' 말단은 대체 서열의 5' 말단의 바로 옆 위치이다. 구현예에서, 5' 상동성 암은 대체 서열의 5' 말단으로부터 5'로 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 180, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 또는 2000 뉴클레오티드 연장될 수 있다.
구현예에서, 3' 상동성 암의 5' 말단은 대체 서열의 3' 말단의 바로 옆 위치이다. 구현예에서, 3' 상동성 암은 대체 서열의 3' 말단으로부터 3'로 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 180, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 또는 2000 뉴클레오티드 연장될 수 있다.
본원에서는 일정 서열 반복 요소, 예를 들어 Alu 반복, LINE 요소를 포함하는 것을 피하기 위하여 하나 또는 두 개의 상동성 암이 단축될 수 있음이 고려된다. 예를 들어 5' 상동성 암은 서열 반복 요소를 피하기 위하여 단축될 수 있다. 다른 구현예에서, 3' 상동성 암은 서열 반복 요소를 피하기 위하여 단축될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' 상동성 암 둘 다는 일정 서열 반복 요소를 포함하는 것을 피하기 위하여 단축될 수 있다.
본원에서는 돌연변이를 교정하기 위한 주형 핵산은 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드(ssODN)로서의 사용을 위해 설계될 수 있음이 고려된다. ssODN을 사용할 때, 5' 및 3' 상동성 암은 약 200 염기쌍(bp) 길이까지의, 예를 들어 적어도 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 또는 200 bp 길이의 범위일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 합성에서의 개선이 계속됨에 따라 ssODN을 위해 더 긴 상동성 암 또한 고려된다.
유전자 표적화를 위한 NHEJ 접근법
본원에 기재된 바와 같이, 뉴클레아제-유도된 비-상동 말단-접합(NHEJ)은 유전자 특이적 녹아웃을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 뉴클레아제-유도된 NHEJ는 관심 유전자에서 서열을 제거(예를 들어 결실)하는 데 또한 사용될 수 있다.
이론에 얽매이기를 원하지 않지만, 구현예에서, 본원에 기재된 방법과 관련된 게놈 변경은 뉴클레아제-유도된 NHEJ 및 NHEJ 수선 경로의 오류-빈발 성질에 의존한다. NHEJ는 2개의 말단을 함께 접합함으로써 DNA의 이중 가닥 단절을 수선한다; 그러나, 일반적으로, 원래의 서열은 2개의 맞는 말단이, 이중 가닥 단절에 의해 형성되었던 것과 정확히 같이, 완벽하게 결찰되는 경우에만 복구된다. 이중 가닥 단절의 DNA 말단은 빈번하게, 말단이 재접합하기 전에, 하나 또는 양 가닥에서, 뉴클레오티드의 첨가 또는 제거를 야기하는 효소적 가공의 대상체가 된다. 이는 NHEJ 수선 부위의 DNA 서열에 삽입 및/또는 결실(삽입결실) 돌연변이의 존재를 야기한다. 이들 돌연변이의 3분의 2는 리딩 프레임을 변경하여, 비-기능성 단백질을 생산할 수 있다. 추가적으로, 리딩 프레임을 유지하지만, 상당량의 서열을 삽입 또는 결실하는 돌연변이는 단백질의 기능성을 파괴할 수 있다. 중대한 기능성 도메인에서의 돌연변이는 단백질의 중대하지 않은 영역에서의 돌연변이보다 덜 견딜 수 있을 가능성이 있기 때문에, 이는 유전자좌 의존적이다.
NHEJ에 의해 생성된 삽입결실 돌연변이는 사실상 예측할 수 없다; 그러나 주어진 단절 부위에서 일정 삽입결실 서열이 유리하여 집단 내에서 과도하게 나타난다. 결실 길이는 폭넓게 달라질 수 있으며; 가장 통상적으로 1 내지 50 bp 범위이지만, 쉽게 100 내지 200 bp 초과에 도달할 수 있다. 삽입은 더 짧은 경향이 있고 종종 단절 부위 바로 옆을 둘러싸는 서열의 짧은 중복을 포함한다. 그러나, 대형 삽입을 수득하는 것이 가능하며, 이들 경우에, 삽입된 서열은 종종 세포 내에 존재하는 게놈의 다른 영역 또는 플라스미드 DNA임이 밝혀졌다.
NHEJ는 돌연변이 유발 과정이기 때문에, 특정 최종 서열의 생성이 필요하지 않는 한 작은 서열 모티프를 결실하는 데 또한 사용될 수 있다. 이중 가닥 단절이 짧은 표적 서열 근처로 표적화되는 경우, NHEJ 수선에 의해 야기된 결실 돌연변이는 종종 원하지 않는 뉴클레오티드를 포괄하고, 따라서 제거한다. 더 큰 DNA 부분을 결실하기 위해, 서열의 각 편 상에 하나씩 2개의 이중 가닥 단절을 도입하는 것은, 말단들 사이에 중간 서열 전체가 제거되는 NHEJ를 야기할 수 있다. 이들 접근법은 둘 다 특정 DNA 서열을 결실하는 데 사용될 수 있다; 그러나, NHEJ의 오류-빈발 성질은 여전히 수선 부위에 삽입결실 돌연변이를 생산할 수 있다.
이중 가닥 절단하는 Cas9 분자 및 단일 가닥, 또는 니카제, Cas9 분자 둘 다는 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 NHEJ-매개 삽입결실을 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 유전자, 예를 들어 코딩 영역, 예를 들어 관심 유전자의 초기 코딩 영역으로 표적화된 NHEJ-매개 삽입결실은 관심 유전자를 녹아웃(즉, 발현 제거)하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어 관심 유전자의 초기 코딩 영역은, 전사 개시 부위를 바로 뒤따르는, 코딩 서열의 제1 엑손 내의, 또는 전사 개시 부위의 500 bp 내(예를 들어 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만)의 서열을 포함한다.
표적 위치에 관련하여 이중 가닥 또는 단일 가닥 단절의 배치
gRNA 및 Cas9 뉴클레아제가 NHEJ-매개 삽입결실을 유도할 목적으로 이중 가닥 단절을 생성하는 구현예에서, gRNA, 예를 들어 단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA 분자는 하나의 이중 가닥 단절을 표적 위치의 뉴클레오티드에 근접하게 위치시키도록 배열된다. 구현예에서, 절단 부위는 표적 위치로부터 0 내지 500 bp 사이(예를 들어 표적 위치로부터 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 bp 미만) 떨어져있다.
Cas9 니카제와 복합체 형성하는 2개의 gRNA가 NHEJ-매개 삽입결실을 유도할 목적으로 2개의 단일 가닥 단절을 유도하는 구현예에서, 2개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA는, 표적 위치의 뉴클레오티드의 NHEJ 수선을 대비하기 위해 2개의 단일 가닥 단절을 위치시키도록 배열된다. 구현예에서, gRNA들은 본질적으로 이중 가닥 단절을 모방 하여, 상이한 가닥 상의 동일한 위치 또는 서로의 수 뉴클레오티드 내에 절단을 위치시키도록 배열된다. 구현예에서, 더 가까운 닉은 표적 위치로부터 0 내지 30 bp 사이(예를 들어 표적 위치로부터 30, 25, 20, 1, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 bp 미만) 떨어져있고, 두 개의 닉은 서로의 25 내지 55 bp 내(예를 들어 25 내지 50, 25 내지 45, 25 내지 40, 25 내지 35, 25 내지 30, 50 내지 55, 45 내지 55, 40 내지 55, 35 내지 55, 30 내지 55, 30 내지 50, 35 내지 50, 40 내지 50, 45 내지 50, 35 내지 45, 또는 40 내지 45 bp 사이)에 있으며, 서로로부터 100 bp 이하(예를 들어 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 bp 이하) 떨어져 있다. 구현예에서, gRNA들은 표적 위치의 뉴클레오티드의 각 편 상에 단일 가닥 단절을 배치하도록 배열된다.
이중 가닥 절단하는 Cas9 분자 및 단일 가닥, 또는 니카제, Cas9 분자 둘 다는 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 표적 위치의 양 편에 단절을 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 2개의 절단 사이의 핵산 서열을 제거하기 위하여 이중 가닥 또는 쌍을 이루는 단일 가닥 단절은 표적 위치의 양 편 상에 생성될 수있다(예를 들어 2개의 단절 사이의 영역이 결실됨). 일 구현예에서, 2개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA는 표적 위치의 양 편 상에 이중 가닥 단절을 위치시키도록 배열된다(예를 들어 제1 gRNA는 본원에 기재된 유전자 또는 경로의 돌연변이의 업스트림(즉, 5')을 표적화하는 데 사용되며 제2 gRNA는 본원에 기재된 유전자 또는 경로의 돌연변이의 다운스트림(즉, 3')을 표적화하는 데 사용된다). 대안적인 구현예에서, 3개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA는 이중 가닥 단절(즉, Cas9 뉴클레아제와 복합체 형성하는 하나의 gRNA) 및 2개의 단일 가닥 단절 또는 쌍을 이루는 단일 가닥 단절(즉, Cas9 니카제와 복합체 형성하는 2개의 gRNA)을 표적 위치의 각 편 상에 위치시키도록 배열된다(예를 들어 제1 gRNA는 본원에 기재된 유전자 또는 경로의 돌연변이의 업스트림(즉, 5')을 표적화하는 데 사용되며 제2 gRNA는 본원에 기재된 유전자 또는 경로의 돌연변이의 다운스트림(즉, 3')을 표적화하는 데 사용된다). 또다른 구현예에서, 4개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA는 표적 위치의 각 편 상에 2 쌍의 단일 가닥 단절(즉, Cas9 니카제와 복합체 형성하는 2개의 gRNA의 2 쌍)을 생성하도록 배열된다(예를 들어 제1 gRNA는 본원에 기재된 유전자 또는 경로의 돌연변이의 업스트림(즉, 5')을 표적화하는 데 사용되며 제2 gRNA는 본원에 기재된 유전자 또는 경로의 돌연변이의 다운스트림(즉, 3')을 표적화하는 데 사용된다). 이중 가닥 단절(들) 또는 쌍에서 2개의 단일 가닥 닉 중 더 가까운 것은 이상적으로 표적 위치의 0 내지 500 bp 이내(예를 들어 표적 위치로부터 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 또는 25 bp이하)에 있을 것이다. 니카제가 사용될 때, 쌍에서 2개의 닉은 서로의 25 내지 55 bp 이내(예를 들어 25 내지 50, 25 내지 45, 25 내지 40, 25 내지 35, 25 내지 30, 50 내지 55, 45 내지 55, 40 내지 55, 35 내지 55, 30 내지 55, 30 내지 50, 35 내지 50, 40 내지 50, 45 내지 50, 35 내지 45, 또는 40 내지 45 bp 사이)에 있으며, 서로로부터 100 bp 이하(예를 들어 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 bp 이하) 떨어져 있다.
다른 구현예에서, 주형 핵산의 삽입은 미세상동 말단 접합(MMEJ)에 의해 매개될 수 있다. 예를 들어 2015년 12월 17일 온라인으로 발행되고, 그 내용의 전문이 참조로 포함되는 문헌[Saksuma et al., "MMEJ-assisted gene knock-in using TALENs and CRISPR-Cas9 with the PITCh systems." Nature Protocols 11, 118-133(2016) doi:10.1038/nprot.2015.140]을 참조하라.
VIII. 하나를 초과하는 gRNA 분자를 포함하는 시스템
이론에 얽매이기를 의도하지 않지만, 놀랍게도 연속적 핵산 상에 근접하게 위치된 2개의 표적 서열의 표적화(예를 들어 각각의 표적 서열에 또는 그 근처에 단일- 또는 이중-가닥 단절을 각각 유도하는 2개의 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체에 의하여)는 2개의 표적 서열 사이에 위치된 핵산 서열(또는 핵산 서열의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 절제(예를 들어 결실)를 유도한다는 것이 본원에 나타났다. 일부 양태에서, 본 개시는 연속적 핵산, 예를 들어 염색체, 예를 들어 그의 인트론, 엑손 및 조절 요소를 포함하는 유전자 또는 유전자좌 상에 근접한 표적 서열들을 표적화하는 표적화 도메인들을 포함하는 2개 이상의 gRNA 분자의 사용을 대비한다. 사용은 예를 들어 하나 이상의 Cas9 분자(또는 2개 이상의 gRNA 분자 및/또는 하나 이상의 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산)와 함께 2개 이상의 gRNA 분자를 세포 내로 도입하는 것에 의할 수 있다.
일부 양태에서, 2개 이상의 gRNA 분자의 표적 서열은 연속적 핵산 상에서 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 또는 15,000 뉴클레오티드 떨어지지만, 연속적 핵산 상에서 25,000 뉴클레오티드 이하 떨어져 위치된다. 구현예에서, 표적 서열은 약 4000 뉴클레오티드 떨어져 위치된다. 구현예에서, 표적 서열은 약 6000 뉴클레오티드 떨어져 위치된다.
일부 양태에서, 복수의 gRNA 분자는 각각 동일한 유전자 또는 유전자좌 내의 서열들을 표적화한다. 또다른 양태에서, 복수의 gRNA 분자는 각각 2개 이상의 상이한 유전자 내의 서열들을 표적화한다.
일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 복수, 예를 들어 2개 이상, 예를 들어 2개의 gRNA 분자를 포함하는 조성물 및 세포를 제공하며, 복수의 gRNA 분자는 15,000 미만, 14,000 미만, 13,000 미만, 12,000 미만, 11,000 미만, 10,000 미만, 9,000 미만, 8,000 미만, 7,000 미만, 6,000 미만, 5,000 미만, 4,000 미만, 3,000 미만, 2,000 미만, 1,000 미만, 900 미만, 800 미만, 700 미만, 600 미만, 500 미만, 400 미만, 300 미만, 200 미만, 100 미만, 90 미만, 80 미만, 70 미만, 60 미만, 50 미만, 40 미만 또는 30 미만의 뉴클레오티드 떨어진 서열들을 표적화한다. 구현예에서, 표적 서열들은 이중 핵산의 동일한 가닥 상에 있다. 구현예에서, 표적 서열들은 이중 핵산의 상이한 가닥 상에 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 이중 핵산의 동일한 또는 상이한 가닥 상에서 25,000 미만, 20,000 미만, 15,000 미만, 14,000 미만, 13,000 미만, 12,000 미만, 11,000 미만, 10,000 미만, 9,000 미만, 8,000 미만, 7,000 미만, 6,000 미만, 5,000 미만, 4,000 미만, 3,000 미만, 2,000 미만, 1,000 미만, 900 미만, 800 미만, 700 미만, 600 미만, 500 미만, 400 미만, 300 미만, 200 미만, 100 미만, 90 미만, 80 미만, 70 미만, 60 미만, 50 미만, 40 미만, 또는 30 미만 뉴클레오티드 떨어져 배치된 2개의 gRNA 결합 부위 사이에 배치된 핵산을 절제(예를 들어 결실)하기 위한 방법을 제공한다. 구현예에서, 방법은 각각의 gRNA 결합 부위와 관련된 PAM 부위 사이에 배치된 뉴클레오티드의 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 86% 초과, 87% 초과, 88% 초과, 89% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과, 또는 100%의 결실을 대비한다. 구현예에서, 결실은 각각의 gRNA 결합 부위와 관련된 하나 이상의 PAM 부위 내의 하나 이상의 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 구현예에서, 결실은 각각의 gRNA 결합 부위와 관련된 PAM 부위 사이의 영역 외부의 하나 이상의 뉴클레오티드를 또한 포함한다.
일 양태에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 유전자 조절 요소, 예를 들어 프로모터 결합 부위, 인핸서 영역 또는 억제제 영역의 옆에 배치되는 표적 서열을 표적화하는 표적화 도메인을 포함하여, 중간 서열(또는 중간 서열의 일부분)의 절제가 관심 유전자의 상향 또는 하향 조절을 야기한다.
구현예에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 표 1 또는 표 5의 표적화 도메인 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 동일한 유전자 내의 서열과 상보적인 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 상이한 유전자 내의 서열과 상보적인 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 표 6의 표적화 도메인 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 표 2, 표 7, 표 8 및/또는 표 9의 표적화 도메인 서열을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 동일한 유전자 내의 서열과 상보적인 표적화 도메인을 포함한다. 양태에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 상이한 유전자 내의 서열과 상보적인 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 표 7, 표 8 및/또는 표 9의 gRNA 분자로부터 선택된다. 구현예에서, 제1 및 제2 gRNA 분자는 표 1 내지 표9로부터 선택된 표적화 도메인 서열을 포함하며, 상이한 표로부터 선택되고, 예를 들어 상이한 유전자의 서열과 상보적인 표적화 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 유전자 조절 요소, 예를 들어 프로모터 결합 부위, 인핸서 영역 또는 억제제 영역의 옆에 배치되는 표적 서열을 표적화하는 표적화 도메인을 포함하여, 중간 서열(또는 중간 서열의 일부분)의 절제가 관심 유전자의 상향 또는 하향 조절을 야기한다. 예로서, 2개 이상의 gRNA 분자는 BCL11a 유전자의 적혈구계 인핸서 영역(예를 들어 +55, +58 또는 +62 영역 내)의 GATA1 결합 부위(또는 그의 부분) 또는 TAL1 결합 부위(또는 그의 부분)의 옆에 배치되는 표적 서열을 표적화하는 표적화 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, gRNA 분자 또는 분자들은 BCL11a 인핸서 내에서 GATA1 결합 부위 또는 TAL1 결합 부위의 파괴를 야기하지 않는다.
구현예에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 표 1로부터 선택된 표적화 도메인을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 표 2로부터 선택된 표적화 도메인을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 표 3으로부터 선택된 표적화 도메인을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 표 4로부터 선택된 표적화 도메인을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 표 5로부터 선택된 표적화 도메인을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 표 6으로부터 선택된 표적화 도메인을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 표 7로부터 선택된 표적화 도메인을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 표 8로부터 선택된 표적화 도메인을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 표 9로부터 선택된 표적화 도메인을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다.
양태에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 상기 섹션 II에 나열된 표적화 도메인 서열 쌍을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함한다.
이론에 얽매이지 않고, 동시에 베타 글로빈(예를 들어 겸상적혈구화 돌연변이를 포함하는 베타 글로빈)의 발현을 감소시키거나 제거하는 반면, 태아 헤모글로빈(예를 들어 감마 글로빈)의 발현을 증가시키는 것은 혈색소병증, 예를 들어 겸상 적혈구 질병을 치료하는 것에 증가된 효능을 야기할 것이다. 따라서, 일 양태에서, 2개 이상의 gRNA 분자는 감마 글로빈 발현의 증가를 야기하는 제1 gRNA 분자 및 베타 글로빈, 예를 들어 겸상 적혈구 돌연변이를 갖는 베타 글로빈의 발현을 감소시키거나 제거하는 제2 gRNA 분자를 포함한다. 구현예에서, 2개 이상의 gRNA 분자는, 예를 들어 본원에 기재된, BCL11a 인핸서 영역 내의 서열을 표적화하는 제1 gRNA 분자, 예를 들어 표 7, 표 8 또는 표 9의 표적화 도메인을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자, 및 겸상 적혈구 글로빈 유전자(겸상적혈구화 돌연변이를 포함하는 베타 글로빈 유전자)의 서열을 표적화하는 제2 gRNA 분자를 포함한다.
IX. gRNA의 특성
gRNA 분자 및 상기 gRNA 분자를 포함하는CRISPR 시스템이 동일한 세포 유형, 전달 방법 및 crRNA/tracr 성분을 사용하여 다수의 실험에 걸쳐 유사하거나 동일한 삽입결실 패턴을 생산한다는 것이 놀랍게도 본원에서 추가로 나타났다. 이론에 얽매이지 않고, 일부 삽입결실 패턴이 다른 것보다 더 유리하다고 여겨진다. 예를 들어 "프레임쉬프트 돌연변이"(예를 들어 1 또는 2 염기쌍 삽입 또는 결실, 또는 n/3이 정수가 아닌 임의의 삽입 또는 결실(n=삽입 또는 결실에서의 뉴클레오티드 수))를 야기하는 삽입 및/또는 결실을 대부분 포함하는 삽입결실은 기능성 단백질의 발현을 감소시키거나 제거하는 데 유익할 수 있다. 유사하게, "큰 결실"(10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 또는 30을 초과하는 뉴클레오티드 결실)이 대부분 포함하는 삽입결실은 또한 예를 들어 유사하게 기능성 단백질의 발현에 대해 개선된 효과를 나타낼 수 있는, 프로모터 결합 부위와 같은 중대한 조절 서열을 제거하는 데 유익할 수 있다. 주어진 gRNA/CRISPR 시스템에 의해 유도된 삽입결실 패턴은 놀랍게도 본원에 기재된 바와 같이 세포 유형에 걸쳐 일관되게 재현되는 것으로 밝혀진 반면, 단일 삽입결실 구조가 gRNA/CRISPR 시스템의 도입시 주어진 세포에서 필연적으로 생산되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 유익한 삽입결실 패턴 또는 구조를 생성하는, 예를 들어 프레임쉬프트 돌연변이 및/또는 큰 결실로 대부분 구성되는 삽입결실 패턴 또는 구조를 갖는 gRNA 분자를 대비한다. 이러한 gRNA 분자는 테스트 세포(예를 들어 HEK293 세포) 또는 관심 세포, 예를 들어 HSPC 세포에서 후보 gRNA 분자에 의해 생성되는 삽입결실 패턴 또는 구조를, 본원에 기재된 바와 같이 NGS에 의해 평가함으로써 선택될 수 있다. 실시예에서 나타난 바와 같이, gRNA 분자는, 원하는 세포 집단으로 도입될 때, 표적 유전자에서 프레임쉬프트 돌연변이를 갖는 상당한 분획의 세포를 포함하는 세포 집단을 야기하는 것으로 밝혀졌다. 일부 경우에서, 프레임쉬프트 돌연변이의 비율은 75%, 80%, 85%, 90% 이상만큼 높다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 gRNA 분자의 표적 부위에서 또는 그 근처에서, 예를 들어 본원에 기재된, 프레임쉬프트 돌연변이를 갖는 적어도 약 40%의 세포(예를 들어 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%)를 포함하는 세포 집단을 대비한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 gRNA 분자의 표적 부위에서 또는 그 근처에서, 예를 들어 본원에 기재된, 프레임쉬프트 돌연변이를 갖는 적어도 약 50%의 세포(예를 들어 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%)를 포함하는 세포 집단을 대비한다.
따라서, 본 발명은 1)관심 표적에 대한 복수의 gRNA 분자를 제공하는 단계, 2)상기 gRNA 분자의 사용에 의해 생성된 삽입결실 패턴 또는 구조를 평가하는 단계, 3)대부분 프레임쉬프트 돌연변이, 큰 결실 또는 이의 조합으로 구성된 삽입결실 패턴 또는 구조를 형성하는 gRNA 분자를 선택하는 단계; 및 4)본 발명의 방법에서 상기 선택된 gRNA를 사용하는 단계를 포함하는 본 발명의 치료 방법에서의 사용을 위해 gRNA 분자를 선택하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 세포를 변경하는 방법, 및 변경된 세포를 제공하며, 그 세포 유형에서 주어진 gRNA/CRISPR 시스템으로 특정 삽입결실 패턴이 일관되게 생산된다. 본원에 기재된 gRNA/CRISPR 시스템으로 관찰되는 상위 5개의 가장 빈번하게 발생하는 삽입결실을 포함하는 삽입결실 패턴은, 예를 들어 실시예에 개시된다. 실시예에 나타난 바와 같이, 세포 집단이 생성되며, 세포의 상당한 분획이 상위 5의 삽입결실 중 하나를 포함한다(예를 들어 상위 5의 삽입결실 중 하나가 집단 내의 세포의 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 이상 초과에 존재하는 세포 집단. 따라서, 본 발명은 주어진 gRNA/CRISPR 시스템으로 관찰되는 상위 5의 삽입결실 중 어느 하나의 삽입결실을 포함하는 세포, 예를 들어 HSPC(본원에 기재된)를 제공한다. 추가적으로, 본 발명은, 예를 들어 NGS에 의해 평가될 때, 주어진 gRNA/CRISPR 시스템에 대해 본원에 기재된 상위 5의 삽입결실 중 하나를 포함하는 높은 백분율의 세포를 포함하는 세포, 예를 들어 HSPC(본원에 기재된) 집단을 제공한다. 삽입결실 패턴 분석법과 관련되어 사용될 때, "높은 백분율"은 주어진 gRNA/CRISPR 시스템에 대해 본원에 기재된 상위 5 삽입결실 중 하나를 포함하는, 집단 내 세포의 적어도 약 50%(예를 들어 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%)를 지칭한다. 다른 구현예에서, 세포 집단은 주어진 gRNA/CRISPR 시스템에 대해 본원에 기재된 상위 5의 삽입결실 중 하나를 갖는, 적어도 약 25%(예를 들어 약 25% 내지 약 60%, 예를 들어 약 25% 내지 약 50%, 예를 들어 약 25% 내지 약 40%, 예를 들어 약 25% 내지 약 35%)의 세포를 포함한다. 구현예에서, BCL11a 인핸서의 +58 영역을 표적화하는, 주어진 gRNA/CRISPR 시스템에 대한 상위 삽입결실, 예를 들어 상위 5의 삽입결실은 표 15, 도 25 및 표 37에서 제공된다. 구현예에서, HPFH 영역을 표적화하는, 주어진 gRNA/CRISPR 시스템에 대한 상위 삽입결실, 예를 들어 상위 5의 삽입결실은 표 26, 표 27 및 표 37에서 제공된다.
일정 gRNA 분자는, 표적 부위에서의 삽입결실 생성 빈도에 비하여, 표적 세포 유형의 게놈 내에서 표적-외 서열에서의 삽입결실을 생성하지 않거나 매우 낮은 빈도(예를 들어 집단 내 세포의 5% 미만)로 표적-외 부위에서의 삽입결실을 생산한다는 것이 또한 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 표적 세포 유형에서 표적-외 삽입결실 형성을 나타내지 않는, 또는 5% 미만의 표적-외 삽입결실 형성 빈도를 생산하는 gRNA 분자 및 CRISPR 시스템을 대비한다. 구현예에서, 본 발명은 표적 세포 유형에서 표적-외 삽입결실 형성을 전혀 나타내지 않는 gRNA 분자 및 CRISPR 시스템을 제공한다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 gRNA 분자의 표적 부위에 또는 그 근처에 삽입결실(예를 들어 프레임쉬프트 삽입결실, 또는, 예를 들어 본원에 기재된, 주어진 gRNA/CRISPR 시스템에 의해 생산된 상위 5의 삽입결실 중 어느 하나)을 포함하는, 그러나 gRNA 분자의 어떤 표적-외 부위에서도 삽입결실을 포함하지 않는, 예를 들어 본원에 기재된 세포, 예를 들어 세포 집단, 예를 들어 HSPC를 추가로 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 gRNA 분자의 표적 부위에 또는 그 근처에 삽입결실(예를 들어 프레임쉬프트 삽입결실, 또는, 예를 들어 본원에 기재된, 주어진 gRNA/CRISPR 시스템에 의해 생산된 상위 5의 삽입결실 중 어느 하나)을 갖는 50% 초과의 세포를 포함하는, 그러나 gRNA 분자의 임의의 표적-외 부위에서 삽입결실을 포함하는 5% 미만, 예를 들어 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 세포를 포함하는, 예를 들어 본원에 기재된 세포, 예를 들어 HSPC의 집단을 추가로 제공한다.
구현예에서, 본원에 기재된 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된 gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템)에 의해 생산된 삽입결실은 GATA-1 결합 부위의 뉴클레오티드를 포함하지 않으며 및/또는 TAL-1 결합 부위의 뉴클레오티드를 포함하지 않는다(예를 들어도 25에 기재된 GATA-1 결합 부위 및/또는 TAL-1 결합 부위의 뉴클레오티드를 포함하지 않는다).
X. 전달/작제물
성분, 예를 들어 Cas9 분자 또는 gRNA 분자, 또는 둘 다는 다양한 형태로 전달, 제형화 또는 투여될 수 있다. 비제한적 예로서, gRNA 분자 및 Cas9 분자는(하나 이상의 조성물에) 제형화되고, 게놈 편집 이벤트가 필요한 세포로 직접 전달되거나 투여될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 성분, 예를 들어 Cas9 분자 또는 gRNA 분자 또는 둘 다를 인코딩하는 핵산은(하나 이상의 조성물에) 제형화되거나, 전달되거나 또는 투여될 수 있다. 일 양태에서, gRNA 분자는 gRNA 분자를 인코딩하는 DNA로서 제공되고, Cas9 분자는 Cas9 분자를 인코딩하는 DNA로서 제공된다. 일 구현예에서, gRNA 분자 및 Cas9 분자는 별개의 핵산 분자 상에서 인코딩된다. 일 구현예에서, gRNA 분자 및 Cas9 분자는 동일한 핵산 분자 상에서 인코딩된다. 일 양태에서, gRNA 분자는 RNA로서 제공되고, Cas9 분자는 Cas9 분자를 인코딩하는 DNA로서 제공된다. 일 구현예에서, gRNA 분자는 예를 들어 본원에 기재된 하나 이상의 변형과 함께 제공된다. 일 양태에서, gRNA 분자는 RNA로서 제공되고, Cas9 분자는 Cas9 분자를 인코딩하는 mRNA로서 제공된다. 일 양태에서, gRNA 분자는 RNA로서 제공되고, Cas9 분자는 단백질로서 제공된다. 일 구현예에서, gRNA 및 Cas9 분자는 리보핵산 단백질 복합체(RNP)로서 제공된다. 일 양태에서, gRNA 분자는 gRNA 분자를 인코딩하는 DNA로서 제공되고, Cas9 분자는 단백질로서 제공된다.
전달, 예를 들어 RNP의 전달(예를 들어 본원에 기재된 HSPC 세포로의)은 예를 들어 전기천공(예를 들어 당분야에 공지된) 또는 핵산 및/또는 폴리펩티드 분자에 대해 세포막을 투과성으로 만드는 다른 방법에 의해 달성될 수 있다. 구현예에서, CRISPR 시스템, 예를 들어 본원에 기재된 RNP는 4D-뉴클레오펙터(Lonza), 예를 들어 4D-뉴클레오펙터(Lonza) 상의 프로그램 CM-137을 사용한 전기천공에 의해 전달된다. 구현예에서, CRISPR 시스템, 예를 들어 본원에 기재된 RNP는 약 800 볼트 내지 약 2000 볼트의 전압, 예를 들어 약 1000 볼트 내지 약 1800 볼트, 예를 들어 약 1200 볼트 내지 약 1800 볼트, 예를 들어 약 1400 볼트 내지 약 1800 볼트, 예를 들어 약 1600 볼트 내지 약 1800 볼트, 예를 들어 약 1700 볼트, 예를 들어 1700 볼트의 전압을 사용하는 전기천공에 의해 전달된다. 구현예에서, 펄스 폭/길이 는 약 10 ms 내지 약 50 ms, 예를 들어 약 10 ms 내지 약 40 ms, 예를 들어 약 10 ms 내지 약 30 ms, 예를 들어 약 15 ms 내지 약 25 ms, 예를 들어 약 20 ms, 예를 들어 20 ms이다. 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5 이상, 예를 들어 2, 예를 들어 1 펄스가 사용된다. 구현예에서, CRISPR 시스템, 예를 들어 본원에 기재된 RNP는 약 1700 볼트(예를 들어 1700 볼트)의 전압, 약 20 ms(예를 들어 20 ms)의 펄스 폭을 사용하는 전기천공에 의해, 단일(1) 펄스를 사용하여 전달된다. 구현예에서, 전기천공은 네온 전기천공기를 사용하여 달성된다. 막을 투과성으로 만들기 위한 추가적인 기술은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 세포 압착(예를 들어 그 내용의 전문이 참조로 본원에 포함된, WO2015/023982 및 WO2013/059343에 기재됨), 나노 니들(nanoneedle)(예를 들어 그 내용의 전문이 참조로 본원에 포함된, 문헌[Chiappini et al., Nat. Mat., 14; 532-39], 또는 US2014/0295558에 기재됨) 및 나노 스트로(nanostraw)(예를 들어 그 내용의 전문이 참조로 본원에 포함된, 문헌[Xie, ACS Nano, 7(5); 4351-58]에 기재됨)를 포함한다.
성분이 DNA에 인코딩되어 전달될 때, DNA는 전형적으로 발현을 초래하기 위하여 예를 들어 프로모터를 포함하는 제어 영역을 포함할 것이다. Cas9 분자 서열에 유용한 프로모터로는 CMV, EF-1알파, MSCV, PGK, CAG 제어 프로모터가 포함된다. gRNA에 유용한 프로모터로는 H1, EF-1a 및 U6 프로모터가 포함된다. 성분의 발현을 조정하기 위하여 유사하거나 다른 강도를 갖는 프로모터가 선택될 수 있다. Cas9 분자를 인코딩하는 서열은 핵 국재화 신호(NLS), 예를 들어 SV40 NLS를 포함할 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자 또는 gRNA 분자를 위한 프로모터는 독립적으로 유도성, 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있다.
Cas9 분자 및 또는 gRNA 분자의 DNA-기반 전달
Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 인코딩하는 DNA는 당분야에 공지된 방법에 의해 또는 본원에 기재된 바와 같이 대상체에게 투여되거나 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어 Cas9-인코딩 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 예를 들어 벡터(예를 들어 바이러스 또는 비-바이러스 벡터), 비-벡터 기반 방법(예를 들어 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체를 이용하여) 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 벡터(예를 들어 바이러스 벡터/바이러스, 플라스미드, 미니 서클 또는 나노 플라스미드)에 의해 전달된다.
벡터는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한, 예를 들어 Cas9 분자 서열에 융합된 신호 펩티드(예를 들어 핵 국재화, 핵소체 국재화, 미토콘드리아 국재화를 위한)를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 벡터는 Cas9 분자를 인코딩하는 서열에 융합된 하나 이상의 핵 국재화 서열(예를 들어 SV40로부터의)을 포함할 수 있다.
하나 이상의 조절/제어 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작(Kozak) 공통 서열, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 2A 서열 및 스플라이스 수용체 또는 공여자는 벡터 내에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 II에 의해 인식된다(예를 들어 CMV 프로모터). 다른 구현예에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 III에 의해 인식된다(예를 들어 U6 프로모터). 일부 구현예에서, 프로모터는 조절되는 프로모터(예를 들어 유도성 프로모터)이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터이다.
일부 구현예에서, 벡터 또는 전달 비히클은 미니 서클이다. 일부 구현예에서, 벡터 또는 전달 비히클은 나노 플라스미드이다.
일부 구현예에서, 벡터 또는 전달 비히클은(예를 들어 재조합 바이러스의 생성을 위한) 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어 dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 다른 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어 ssRNA 바이러스)이다.
예시적인 바이러스 벡터/바이러스에는 예를 들어 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 우두 바이러스, 폭스바이러스 및 단순 헤르페스 바이러스가 포함된다. 바이러스 벡터 기술은 당분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY)] 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 바이러스는 분열성 세포를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 비-분열성 세포를 감염시킨다. 일부 구현예에서, 바이러스는 분열성 및 비-분열성 세포를 둘 다 감염시킨다. 일부 구현예에서, 바이러스는 숙주 게놈으로 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 예를 들어 인간에서 감소된 면역을 갖도록 조작된다. 일부 구현예에서, 바이러스는 복제-적격이다. 다른 구현예에서, 바이러스는 예를 들어 비리온 복제 및/또는 패키징의 추가적인 라운드에 필요한 유전자에 대한 하나 이상의 코딩 영역이 다른 유전자로 대체되거나 결실된, 복제-결함이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 일시적 발현을 야기한다. 다른 구현예에서, 바이러스는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의, 오래 지속되는, 예를 들어 적어도 1 주, 2 주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 1 년, 2 년 또는 영구적 발현을 야기한다. 바이러스의 패키징 용량은, 예를 들어 적어도 약 4 kb 내지 적어도 약 30 kb, 예를 들어 적어도 5 kb, 10 kb, 15 kb, 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35 kb, 40 kb, 45 kb 또는 50 kb로 다를 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 재조합 레트로바이러스에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스(예를 들어 몰로니(Moloney) 마우스 백혈병 바이러스)는, 예를 들어 숙주 게놈으로의 통합을 가능하게 하는, 역전사 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 복제-적격이다. 다른 구현예에서, 레트로바이러스는 예를 들어 비리온 복제 및 패키징의 추가적인 라운드에 필요한 유전자에 대한 하나 이상의 코딩 영역이 다른 유전자로 대체되거나 결실된, 복제-결함이다.
일부 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 재조합 렌티바이러스에 의해 전달된다. 예를 들어 렌티바이러스는, 예를 들어 바이러스 복제를 위해 요구되는 하나 이상의 유전자를 포함하지 않는, 복제-결함이다.
일부 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 재조합 아데노바이러스에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스는 인간에서 감소된 면역을 갖도록 조작된다.
일부 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 재조합 AAV에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, AAV는 그 게놈을 숙주 세포, 예를 들어 본원에 기재된 표적 세포의 게놈 내로 통합할 수 있다. 일부 구현예에서, AAV는 자가-상보적인 아데노-관련 바이러스(scAAV), 예를 들어 함께 어닐링하여 이중 가닥 DNA를 형성하는 양 가닥을 패키징하는 scAAV이다. 개시된 방법에 사용될 수 있는 AAV 혈청형에는, 예를 들어 AAV1, AAV2, 변형 AAV2(예를 들어 Y444F, Y500F, Y730F 및/또는 S662V에서의 변형), AAV3, 변형 AAV3(예를 들어 Y705F, Y73 1F 및/또는 T492V에서의 변형), AAV4, AAV5, AAV6, 변형 AAV6(예를 들어 S663V 및/또는 T492V에서의 변형), AAV8. AAV8.2, AAV9, AAVrh10이 포함되고, AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6과 같은 위형 AAV 또한 개시된 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 혼종 바이러스, 예를 들어 본원에 기재된 하나 이상의 바이러스의 혼종에 의해 전달된다.
패키징 세포는 숙주 또는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하기 위해 사용된다. 이러한 세포에는, 아데노바이러스를 패키징할 수 있는 293 세포, 및, 레트로바이러스를 패키징할 수 있는 ψ2 세포 또는 PA317 세포가 포함된다. 유전자 치료에 사용되는 바이러스 벡터는 통상적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자로 패키징하는 생산체 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 또는 표적 세포로의 후속적 통합(적용 가능한 경우)에 요구되는 최소한의 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 인코딩하는 발현 카세트에 의해 대체된다. 예를 들어 유전자 치료에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 숙주 또는 표적 세포에서의 패키징 및 유전자 발현에 요구되는 AAV 게놈으로부터의 역위 말단 반복(ITR) 서열만을 보유한다. 누락된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 트란스(trans)로 공급된다. 이후, 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap을 인코딩하지만 ITR 서열이 결여된 헬퍼 플라스미드를 함유하는 세포주에서 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터의 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 상당한 양에서 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다.
구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 및/또는 조직 유형 인식 능력을 갖는다. 예를 들어 바이러스 벡터는 상이한/대안적 바이러스 외피 당단백질로 위형화될 수 있고; 세포 유형-특이적 수용체로 조작될 수 있고(예를 들어 펩티드 리간드, 단일 사슬 항체, 성장 인자와 같은 표적화 리간드를 혼입시키기 위한 바이러스 외피 당단백질의 유전적 변형); 및/또는 바이러스 당단백질을 인식하는 하나의 말단 및 표적 세포 표면의 모이어티를 인식하는 다른 말단으로 이중 특이성을 갖는 분자 가교(예를 들어 리간드-수용체, 단일클론 항체, 아비딘-비오틴 및 화학적 접합)를 갖도록 조작될 수 있다.
구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 특이적 발현을 달성한다. 예를 들어 조직 특이적 프로모터는 표적 세포에서만 전이유전자(Cas9 및 gRNA)의 발현을 한정하도록 작제될 수 있다. 벡터의 특이성은 또한 전이유전자 발현의 마이크로RNA-의존적 제어에 의해 매개될 수 있다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터와 표적 세포막의 융합 효율을 증가시켰다. 예를 들어 세포 내로의 바이러스 흡수를 증가시키기 위해 융합-적격 헤마글루틴(HA)과 같은 융합 단백질이 혼입될 수 있다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 핵 국재화 능력을 갖는다. 예를 들어(세포 분열 동안의) 세포벽의 분해를 요구하며 따라서 비-분열성 세포를 감염시키지 않을 바이러스 는 바이러스의 매트릭스 단백질 내에 핵 국재화 펩티드를 혼입시켜 비-증식성 세포의 형질도입이 가능하도록 변경될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 비-벡터 기반 방법(예를 들어 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체를 사용하는)에 의해 전달된다. 예를 들어, DNA는 이를테면 유기적으로 변형된 실리카 또는 실리케이트(Ormosil), 전기천공, 유전자 총, 초음파 천공, 자기 주입, 지질-매개 형질 감염, 덴드리머, 무기 나노 입자, 포스페이트 칼슘 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-인코딩 DNA는 벡터 및 비-벡터 기반 방법의 조합에 의해 전달된다. 예를 들어 비로좀(virosome)은 불활성화된 바이러스(예를 들어 HIV 또는 인플루엔자 바이러스)와 조합된 리포좀을 포함하며, 바이러스 또는 리포좀 방법 단독보다, 예를 들어 호흡 상피 세포에서, 더 효율적인 유전자 전달을 야기할 수 있다.
구현예에서, 전달 비히클은 비-바이러스 벡터이다. 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 무기 나노 입자(예를 들어 나노 입자의 표면으로 페이로드(payload)에 부착된)이다. 예시적인 무기 나노 입자에는, 예를 들어 자성 나노 입자(예를 들어 Fe lvln02), 또는 실리카가 포함된다. 나노 입자의 외부 표면은 페이로드의 부착(예를 들어 접합 또는 포착)을 가능하게 하는 양전하 폴리머(예를 들어 폴리에틸렌이민, 폴리라이신, 폴리세린)와 접합될 수 있다. 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 유기 나노 입자(예를 들어 나노 입자 내부에 페이로드의 포착)이다. 예시적인 유기 나노 입자에는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 코팅된 중성 헬퍼 지질과 함께 양이온성 지질을 함유하는SNALP 리포좀 및 지질 코팅으로 코팅된 프로타민과 핵산 복합체가 포함된다.
CRISPR 시스템, 또는CRISPR 시스템 또는 이의 성분을 인코딩하는 핵산(예를 들어 벡터)의 전달을 위한 예시적인 지질 및/또는 폴리머에는, 예를 들어 그 각각의 내용의 전문이 참조로 본원에 포함된, WO2011/076807, WO2014/136086, WO2005/060697, WO2014/140211, WO2012/031046, WO2013/103467, WO2013/006825, WO2012/006378, WO2015/095340, 및 WO2015/095346에 기재된 것들이 포함된다. 구현예에서, 비히클은 나노 입자 및 리포좀의 표적 세포 갱신을 증가시키는 표적화 변형, 예를 들어 세포 특이적 항원, 단일클론 항체, 단일 사슬 항체, 압타머, 폴리머, 당 및 세포 침투 펩티드를 갖는다. 구현예에서, 비히클은 융합 생성 및 엔도좀-불안정화 펩티드/폴리머를 사용한다. 구현예에서, 비히클은 산-촉발된 입체 형태 변화를 겪는다(예를 들어 화물의 엔도좀 탈출을 가속화하기 위해). 구현예에서, 예를 들어 세포 구획에서의 방출을 위해 자극-절단 가능한 폴리머가 사용된다. 예를 들어 환원성 세포 환경에서 절단되는 디설파이드 기반 양이온성 폴리머가 사용될 수 있다.
구현예에서, 전달 비히클은 생물학적 비-바이러스 전달 비히클이다. 구현예에서, 비히클은 약화된 박테리아(예를 들어 침입성이지만 발병을 방지하기 위해 약화되도록 자연적으로 또는 인공적으로 조작되고 전이유전자를 발현하는(예를 들어 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 일정 살모넬라 균주, 비피도박테리움 론굼(Bifidobacterium longum) 및 변형된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)), 특정 조직을 표적화하기 위한 영양 및 조직-특이적 향성(tropism)을 갖는 박테리아, 표적 조직 특이성을 변경하기 위해 변형된 표면 단백질을 갖는 박테리아)이다. 구현예에서, 비히클은 유전적으로 변형된 박테리오파지(예를 들어 큰 패키징 용량, 더 적은 면역원성을 갖고, 포유류 플라스미드 유지 서열을 함유하며, 혼입된 표적화 리간드를 갖는, 조작된 파지)이다. 구현예에서, 비히클은 포유류 바이러스 유사 입자이다. 예를 들어 변형된 바이러스 입자가 생성될 수 있다(예를 들어 "비어있는" 입자의 정제 후 원하는 화물과 바이러스의 생체외 조립에 의해). 비히클은 또한 표적 조직 특이성을 변경하기 위해 표적화 리간드를 혼입하도록 조작될 수 있다. 구현예에서, 비히클은 생물학적 리포좀이다. 예를 들어 생물학적 리포좀은 인간 세포에서 유래된 인지질 기반 입자(예를 들어 구형 구조로 분해된 적혈구인, 대상체에서 유래된 적혈구 고스트(예를 들어 조직 표적화는 다양한 조직 또는 세포-특이적 리간드의 부착에 의해 달성될 수 있다), 또는 분비성 엑소좀 - 대상체(즉, 환자) 유래된 식균 작용 기원의 막-결합 나노베지클(30 내지 100 nm)(예를 들어 다양한 세포 유형으로부터 생산될 수 있으며 따라서 표적화 리간드의 필요 없이 세포들에 의해 잡힐 수 있다) 이다.
구현예에서, Cas 시스템의 성분, 예를 들어 본원에 기재된 Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분 외의 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어 DNA 분자)가 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 하나 이상의 성분이 전달되는 것과 동시에 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는 Cas9 시스템의 하나 이상의 성분이 전달되기 전 또는 후(예를 들어 약 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 6 시간, 9 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 1 주, 2 주 또는 4 주 미만)에 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는Cas9 시스템의 하나 이상의 성분, 예를 들어 Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분이 전달되는 것과 상이한 수단에 의해 전달된다. 핵산 분자는 본원에 기재된 전달 방법 중 임의의 것에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예를 들어 통합-결핍 렌티바이러스에 의해 전달될 수 있고, Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분은 전기천공에 의해 전달될 수 있어, 예를 들어 핵산(예를 들어 DNA)에 의해 야기되는 독성이 감소될 수 있다. 구현예에서, 핵산 분자는 치료 단백질, 예를 들어 본원에 기재된 단백질을 인코딩한다. 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 분자, 예를 들어 본원에 기재된 RNA 분자를 인코딩한다.
Cas9 분자를 인코딩하는 RNA의 전달
Cas9 분자(예를 들어 활성 Cas9 분자, 불활성 Cas9 분자 또는 불활성 Cas9 융합 단백질) 및/또는 gRNA 분자를 인코딩하는 RNA는 당분야에 공지된 방법에 의해 또는 본원에 기재된 바와 같이, 세포, 예를 들어 본원에 기재된 표적 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어 Cas9- 인코딩 및/또는 gRNA-인코딩 RNA는, 예를 들어 미세주사, 전기천공, 지질-매개 형질 감염, 펩티드-매개 전달, 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다.
Cas9 분자의 단백질로서 전달
Cas9 분자(예를 들어 활성 Cas9 분자, 불활성 Cas9 분자 또는 불활성 Cas9 융합 단백질)는 당분야에 공지된 방법에 의해 또는 본원에 기재된 바와 같이, 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어 Cas9 단백질 분자는, 예를 들어 미세주사, 전기천공, 지질-매개 형질 감염, 펩티드-매개 전달, 세포 압착 또는 마모(예를 들어 나노 니들에 의해), 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다. 전달은 gRNA를 인코딩하는 DNA, 또는 gRNA, 예를 들어 리보핵산 단백질 복합체(RNP)로 gRNA 및 Cas9 단백질을 미리 복합체 형성하는 것과 동반할 수 있다.
양태에서, 예를 들어 본원에 기재된 Cas9 분자는 단백질로서 전달되고, gRNA 분자는 하나 이상의 RNA로서(예를 들어 본원에 기재된 dgRNA 또는 sgRNA로서) 전달된다. 구현예에서, Cas9 단백질은 세포로의 전달 전에, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 리보핵산 단백질 복합체("RNP")로서 gRNA 분자와 복합체 형성된다. 구현예에서, RNP는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 전기천공에 의해 예를 들어 본원에 기재된, 세포 내로 전달될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 그리고 이론에 얽매이지 않고, 세포로 전달되는 RNP의 농도가 감소되는 때에도, 예를 들어 본원에 기재된 표적 세포에서 표적 서열에서의 높은 편집 %(예를 들어 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과)을 야기하는 gRNA 분자 및 Cas9분자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 이론에 얽매이지 않고, 표적 세포에서(낮은 RNP 농도에서를 포함하여) 표적 서열에서의 높은 편집 %을 생산하는 gRNA분자를 포함하는 감소된 또는 낮은 농도의RNP를 전달하는 것은, 표적-외 편집 이벤트의 빈도 및 수를 감소시킬 수 있기 때문에 유익할 수 있다. 일 양태에서, 낮은 또는 감소된 농도의 RNP가 사용되는 경우, dgRNA 분자를 갖는 RNP를 생성하기 위하여 다음의 예시적인 절차가 사용될 수 있다:
1. Cas9 분자 및 tracr을 고농도 용액(예를 들어 세포로 전달되는 최종 RNP 농도보다 높은 농도)으로 제공하고, 두 성분이 평형을 이룰 수 있게 한다;
2. crRNA 분자를 제공하고, 성분들이 평형을 이룰 수 있게 한다(이로써 RNP의 고농도 용액을 형성한다);
3. RNP 용액을 원하는 농도로 희석한다;
4. 상기 원하는 농도의 상기 RNP를 예를 들어 전기천공에 의해 표적 세포로 전달한다.
상기 절차는 상기 단계 2를 생략하고, 단계 1에서Cas9 분자 및 sgRNA 분자를 고농도 용액으로 제공하고 성분이 평형을 이룰 수 있게 함으로써, sgRNA 분자를 갖는 사용을 위하여 변형될 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자 및 각 gRNA 성분은 용액 내 1:2 비율(Cas9:gRNA), 예를 들어 Cas9:gRNA 분자의 1:2 몰 비율로 제공된다. dgRNA 분자가 사용되는 경우, 비율, 예를 들어 몰 비율은 1:2:2이다(Cas9:tracr:crRNA). 구현예에서, RNP는 20 uM 이상의 농도, 예를 들어 약 20 uM 내지 약 50 uM의 농도로 형성된다. 구현예에서, RNP는 10 uM 이상의 농도, 예를 들어 약 10 uM 내지 약 30 uM의 농도로 형성된다. 구현예에서, RNP는 표적 세포로의 전달을 위하여 상기 표적 세포(예를 들어 본원에 기재된)를 포함하는 용액에서 10 uM 이하의 최종 농도(예를 들어 약 0.01 uM 내지 약 10 uM의 농도)로 희석된다. 구현예에서, RNP는 표적 세포로의 전달을 위하여 상기 표적 세포(예를 들어 본원에 기재된)를 포함하는 용액에서 3 uM 이하의 최종 농도(예를 들어 약 0.01 uM 내지 약 3 uM의 농도)로 희석된다. 구현예에서, RNP는 표적 세포로의 전달을 위하여 상기 표적 세포(예를 들어 본원에 기재된)를 포함하는 용액에서 1 uM 이하의 최종 농도(예를 들어 약 0.01 uM 내지 약 1 uM의 농도)로 희석된다. 구현예에서, RNP는 표적 세포로의 전달을 위하여 상기 표적 세포(예를 들어 본원에 기재된)를 포함하는 용액에서 0.3 uM 이하의 최종 농도(예를 들어 약 0.01 uM 내지 약 0.3 uM의 농도)로 희석된다. 구현예에서, 표적 세포로의 전달을 위하여 상기 표적 세포(예를 들어 본원에 기재된)를 포함하는 용액에서 약 3 uM의 최종 농도로 제공된다. 구현예에서, 표적 세포로의 전달을 위하여 상기 표적 세포(예를 들어 본원에 기재된)를 포함하는 용액에서 약 1 uM의 최종 농도로 제공된다. 구현예에서, 표적 세포로의 전달을 위하여 상기 표적 세포(예를 들어 본원에 기재된)를 포함하는 용액에서 약 0.3 uM의 최종 농도로 제공된다. 구현예에서, 표적 세포로의 전달을 위하여 상기 표적 세포(예를 들어 본원에 기재된)를 포함하는 용액에서 약 0.1 uM의 최종 농도로 제공된다. 구현예에서, 표적 세포로의 전달을 위하여 상기 표적 세포(예를 들어 본원에 기재된)를 포함하는 용액에서 약 0.05 uM의 최종 농도로 제공된다. 구현예에서, 표적 세포로의 전달을 위하여 상기 표적 세포(예를 들어 본원에 기재된)를 포함하는 용액에서 약 0.03 uM의 최종 농도로 제공된다. 구현예에서, 표적 세포로의 전달을 위하여 상기 표적 세포(예를 들어 본원에 기재된)를 포함하는 용액에서 약 0.01 uM의 최종 농도로 제공된다. 구현예에서, RNP는 전기천공을 위해 적합한 매질 내에 제형화된다. 구현예에서, RNP는 예를 들어 본원에 기재된 세포, 예를 들어 HSPC 세포로, 예를 들어 본원에 기재된 전기천공 조건을 이용한, 전기천공에 의해 전달된다.
성분들의 두 가지 방식 또는 차등적 전달
Cas 시스템의 성분, 예를 들어 Cas9 분자 성분 및 gRNA 분자 성분의 별도의 전달, 더욱 구체적으로, 상이한 방식에 의한 성분들의 전달은, 예를 들어 조직 특이성 및 안전성을 개선함으로써 성능을 향상시킬 수 있다.
구현예에서, Cas9 분자 및 gRNA 분자는 상이한 방식(또는 때때로 본원에서 차등적 방식으로 지칭됨)에 의해 전달된다. 본원에 사용되는 상이한 또는 차등적 방식은 대상체 성분 분자, 예를 들어 Cas9 분자, gRNA 분자 또는 주형 핵산에 대해 상이한 약력학적 또는 약동학적 특성을 부여하는 전달 방식을 지칭한다. 예를 들어 전달 방식은 상이한 조직 분포, 상이한 반감기, 또는 예를 들어 선택된 구획, 조직 또는 기관에서의 상이한 시간 분포를 야기할 수 있다.
일부 전달 방식, 예를 들어 자율적 복제 또는 세포 핵산 내로의 삽입에 의한, 세포 또는 세포의 자손에서 지속되는 핵산 벡터에 의한 전달은 성분의 더 지속적인 발현 및 존재를 야기한다.
XI. 치료 방법
본원에 기재된 Cas9 시스템, 예를 들어 하나 이상의 gRNA 분자 및 하나 이상의 Cas9 분자는 포유동물, 예를 들어 인간에서 질병의 치료에 유용하다. 용어 "치료하다", "치료된", "치료하는", 및 "치료"는 질병의 증상, 합병증 또는 생화학적 징후의 개시를 방지 또는 지연하며, 증상을 경감 또는 질병, 질환, 또는 장애의 추가적인 발달을 정지 또는 저해하기 위해 cas9 시스템, 예를 들어 하나 이상의 gRNA 분자 및 하나 이상의 cas9 분자의 세포로의 투여를 포함한다. 치료는 또한 질병의 증상, 합병증 또는 생화학적 징후의 개시를 방지 또는 지연하며, 증상을 경감 또는 질병, 질환, 또는 장애의 추가적인 발달을 정지 또는 저해하기 위해, 본 발명의 gRNA 분자(또는 하나를 초과하는 gRNA 분자)의 도입 또는 본원에 기재된 CRISPR 시스템의 도입, 또는 본원에 기재된 상기 세포를 제조하는 방법 중 임의의 것에 의해 변형된 하나 이상의(예를 들어 집단의) 세포, 예를 들어 HSPC의 투여를 포함할 수 있다. 치료는 예방적(질병의 발병을 방지 또는 지연시키는 것, 또는 이의 임상적 또는 준임상적 증상의 표현을 방지하는 것) 또는 질병의 표현 후 증상의 치료적 억제 또는 경감일 수 있다. 치료는 본원에 기재된 치료적 기준에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 "치료"의 방법은 또한 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상을 치료, 중증도를 감소, 또는 개선하기 위하여, 이러한 치료의 부재 시에 기대되는 것 이상으로 대상체의 건강 또는 생존을 연장시키기 위하여, 상기 세포 내로의 cas9 시스템(예를 들어 하나 이상의 gRNA 분자 및 하나 이상의 Cas9 분자)의 도입에 의해 변경된 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어 "치료"는 환자에서 질병 증상의 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상 만큼의 경감을 포함한다.
본원에, 예를 들어 표 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및/또는 9에 기재된 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 포함하는 Cas9 시스템은 혈색소병증의 치료에 유용하다.
혈색소병증
혈색소병증은 적혈구(RBC)의 생산 감소 및/또는 파괴(용혈) 증가가 있는 유전적 기원의 다수의 빈혈을 포괄한다. 이들은 또한 산소 농도를 유지하는 능력 손상을 수반하는 비정상적 헤모글로빈 생산을 야기하는 유전적 결함을 포함한다. 일부 이러한 장애는 정상적인 β-글로빈을 충분한 양으로 생산하지 못하는 것을 수반하지만 다른 것은 정상적인 β-글로빈을 완전히 생산하지 못하는 것을 수반한다. β-글로빈 단백질과 관련된 이들 장애는 일반적으로 β-혈색소병증으로 지칭된다. 예를 들어 β-탈라세미아는 HbA 부족 또는 부재를 초래하는, β-글로빈 유전자의 발현에서의 부분적 또는 완전한 결함에 기인한다. 겸상 적혈구 빈혈은 비정상적(겸상) 헤모글로빈(HbS)의 생산을 초래하는, β-글로빈 구조 유전자에서의 점 돌연변이에 기인한다. HbS는 특히 탈산분해된 조건에서 중합되기 쉽다. HbS 적혈구는 정상적 적혈구보다 더 손상되기 쉽고 더 쉽게 용혈을 겪어, 결국 빈혈을 초래한다.
구현예에서, 알파 글로빈 또는 베타 글로빈에서의 유전적 결함은 본원에 기재된 Cas9 분자 및 gRNA 분자, 예를 들어 CRISPR 시스템을 사용하는 예를 들어 상동 재조합에 의해 교정된다.
구현예에서, 알파 글로빈 또는 베타 글로빈의 야생형(예를 들어 돌연변이되지 않은) 카피를 인코딩하는 유전자는 세포의 게놈 내로, 예를 들어 세이프 하버(safe harbor) 부위에, 예를 들어 AAVS1 세이프 하버 부위에, 본원에 기재된 CRISPR 시스템 및 방법을 이용하는 상동 재조합에 의해 삽입된다.
구현예에서, 혈색소병증-관련 유전자는 본원에 기재된 Cas9 분자 및 gRNA 분자를 사용하여 표적화된다. 예시적인 표적에는, 예를 들어 감마-글로빈 유전자의 제어와 관련된 유전자가 포함된다. 구현예에서, 표적은 BCL11A이다. 구현예에서, 표적은 BCL11a 인핸서이다. 구현예에서, 표적은 HPFH 영역이다.
태아 헤모글로빈(또한 헤모글로빈 F 또는 HbF 또는 α2γ2)은 2개의 성체 알파-글로빈 폴리펩티드 및 2개의 태아 베타-유사 감마-글로빈 폴리펩티드의 사합체이다. HbF는 자궁에서의 최종 7개월의 발달 동안의 인간 태아에서 및 대략적으로 6개월령까지의 신생아에서 주요 산소 수송 단백질이다. 기능적으로, 태아 헤모글로빈은, 성체 형태보다 더 높은 친화성으로 산소를 결합할 수 있어, 발달하고 있는 태아에게 모체 혈류로부터의 산소에 대한 더 좋은 접근을 제공한다는 점에서 성체 헤모글로빈과 가장 많이 상이하다.
신생아에서, 태아 헤모글로빈은 생후 약 6개월까지 성체 헤모글로빈에 의해 거의 완전히 대체된다. 성체에서, 태아 헤모글로빈 생산은 약리학적으로 재활성화될 수 있으며, 혈색소병증과 같은 질병의 치료에 유용하다. 예를 들어 혈색소병증을 갖는 일정 환자에서, 더 높은 수준의 감마-글로빈 발현은 결함있거나 손상된 베타-글로빈 유전자 생산을 부분적으로 보상할 수 있어, 이들 질병에서 임상적 중증도를 개선할 수 있다. 증가된 HbF 수준 또는 F-세포(HbF 함유 적혈구) 수는 혈색소병증, 예를 들어 베타-탈라세미아 메이저 및 겸상 적혈구 빈혈의 질병 중증도를 개선할 수 있다.
증가된 HbF 수준 또는 F-세포는 세포에서 감소된 BCL11A 발현과 관련될 수 있다. BCL11A 유전자는 다중 징크 핑거 전사 인자를 인코딩한다. 구현예에서, BCL11A의 발현은 조절, 예를 들어 하향 조절된다. 구현예에서, BCL11A 유전자는 편집된다. 구현예에서, 예를 들어 적혈구계 계통 세포에서, BCL11a의 기능은 손상되거나 하향 조절된다. 구현예에서, 세포는 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포이다.
겸상 적혈구 질병
겸상 적혈구 질병은 헤모글로빈에 영향을 미치는 장애 군이다. 이 장애를 갖는 인간들은 적혈구를 낫 또는 초승달 모양으로 일그러뜨릴 수 있는, 비정형 헤모글로빈 분자(헤모글로빈 S)를 갖는다. 이 장애의 특징은 적은 수의 적혈구(빈혈), 반복 감염, 및 주기적 통증 사건을 포함한다.
HBB 유전자에서의 돌연변이가 겸상 적혈구 질병을 야기한다. HBB 유전자는 베타-글로빈을 만들기 위한 지시를 제공한다. 다양한 형태의 베타-글로빈은 HBB 유전자에서의 상이한 돌연변이에 기인한다. 하나의 특정 HBB 유전자 돌연변이는 헤모글로빈 S(HbS)로 알려진 베타-글로빈의 비정상적 형태를 생산한다. HBB 유전자에서의 다른 돌연변이는 헤모글로빈 C(HbC) 및 헤모글로빈 E(HbE)와 같은 추가적인 베타-글로빈의 비정상적 형태를 초래한다. HBB 유전자 돌연변이는 또한 매우 낮은 수준의 베타-글로빈, 즉 베타 탈라세미아를 야기할 수 있다.
겸상 적혈구 질병을 갖는 인간들에서, 헤모글로빈 내의 베타-글로빈 서브유닛 중 적어도 하나는 헤모글로빈 S로 대체된다. 겸상 적혈구 질병의 통상적인 형태인, 겸상 적혈구 빈혈에서, 헤모글로빈 S는 헤모글로빈 내의 베타-글로빈 서브유닛 둘 다를 대체한다. 다른 유형의 겸상 적혈구 질병에서, 헤모글로빈 내의 오직 하나의 베타-글로빈 서브유닛이 헤모글로빈 S로 대체된다. 다른 베타-글로빈 서브유닛은 헤모글로빈 C와 같은 상이한 비정상적 변이체로 대체된다. 예를 들어 겸상 헤모글로빈 C(HbSC) 질병을 갖는 인간들은 베타-글로빈 대신 헤모글로빈 S 및 헤모글로빈 C를 갖는 헤모글로빈 분자를 갖는다. 헤모글로빈 S 및 베타 탈라세미아를 생산하는 돌연변이들이 함께 발생하는 경우, 개체는 헤모글로빈 S-베타 탈라세미아(HbSBetaThal) 질병을 갖는다.
베타 탈라세미아
베타 탈라세미아는 헤모글로빈 생산을 감소시키는 혈액 장애이다. 베타 탈라세미아를 갖는 인간들에서, 낮은 수준의 헤모글로빈이 신체의 많은 부분에서 산소의 부족을 초래한다. 병에 걸린 개체는 또한 적혈구의 부족(빈혈)을 가져, 창백한 피부, 허약, 피로 및 더 심각한 합병증을 야기할 수 있다. 베타 탈라세미아를 갖는 인간들은 비정상적 혈전을 발생시킬 위험이 증가한다.
베타 탈라세미아는 증상의 중증도에 따라 두 가지 유형으로 분류된다: 탈라세미아 메이저(쿨리(Cooley's) 빈혈로도 알려진) 및 탈라세미아 인터메디아(intermedia). 두 가지 유형 중에서, 탈라세미아 메이저가 더 중증이다.
HBB 유전자에서의 돌연변이는 베타 탈라세미아를 야기한다. HBB 유전자는 베타-글로빈을 만들기 위한 지시를 제공한다. HBB 유전자에서의 일부 돌연변이는 임의의 베타-글로빈의 생산을 방해한다. 베타-글로빈의 부재는 베타-제로(Bo) 탈라세미아로 지칭된다. 다른 HBB 유전자 돌연변이는 일부 베타-글로빈이 생산되지만 감소된 양으로 생산되도록 한다, 즉 베타-플러스(B+) 탈라세미아. 두 가지 유형을 갖는 인간들은 탈라세미아 메이저 및 탈라셈아 인터메디아로 진단되어 왔다.
구현예에서, 제1 유전자를 표적화하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 제2 유전자, 예를 들어 제2 유전자에서의 돌연변이를 특징으로 하는 장애를 치료하는 데 사용된다. 예로서, 예를 들어 편집 또는 페이로드 전달에 의한 제1 유전자의 표적화는 제2 유전자, 예를 들어 돌연변이 제2 유전자의 영향을 보상하거나 이로부터의 추가적인 손상을 저해할 수 있다. 구현예에서, 대상체가 갖는 제1 유전자의 대립유전자는 장애의 원인이 되지 않는다.
일 양태에서, 본 발명은 증가된 태아 헤모글로빈(HbF)을 필요로 하는 포유동물, 예를 들어 인간의 치료에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 혈색소병증으로 진단되거나 또는 혈색소병증을 발병할 위험이 있는 포유동물, 예를 들어 인간의 치료에 관한 것이다.
일 양태에서 혈색소병증은 β-혈색소병증이다. 일 양태에서 혈색소병증은 겸상 적혈구 질병이다. 일 양태에서 혈색소병증은 베타 탈라세미아이다.
혈색소병증의 치료 방법
또다른 양태에서, 본 발명은 치료 방법을 제공한다. 양태에서, 본 발명의 gRNA 분자, CRISPR 시스템 및/또는 세포는 이를 필요로 하는 환자를 치료하기 위해 사용된다. 양태에서, 환자는 포유동물, 예를 들어 인간이다. 양태에서 환자는 혈색소병증을 갖는다. 구현예에서, 환자는 겸상 적혈구 질병을 갖는다. 구현예에서, 환자는 베타 탈라세미아를 갖는다.
일 양태에서, 치료 방법은 포유동물, 예를 들어 인간에게 하나 이상의 gRNA 분자, 예를 들어 표 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9에 기재된 표적화 도메인을 포함하는 하나 이상의 gRNA 분자, 및 본원에 기재된 하나 이상의 cas9 분자를 투여하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 치료 방법은 포유동물에게 세포 집단을 투여하는 것을 포함하며, 세포 집단은, 하나 이상의 gRNA 분자, 예를 들어 표 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9에 기재된 표적화 도메인을 포함하는 하나 이상의 gRNA 분자, 및 본원에 기재된 하나 이상의 cas9 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CRISPR 시스템이 투여된 포유동물, 예를 들어 인간으로부터의 세포 집단이다. 일 구현예에서, 세포로의 하나 이상의 gRNA 분자 또는 CRISPR 시스템의 투여는 생체내에서 달성된다. 일 구현예에서, 세포로의 하나 이상의 gRNA 분자 또는 CRISPR 시스템의 투여는 생체외에서 달성된다.
일 양태에서, 치료 방법은 포유동물, 예를 들어 인간에게, 하나 이상의 gRNA 분자, 예를 들어 표 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9에 기재된 표적화 도메인을 포함하는 하나 이상의 gRNA 분자, 및 본원에 기재된 하나 이상의 cas9 분자를 포함하거나 한때 포함하였던 세포, 또는 상기 세포의 자손을 포함하는 세포 집단을 유효량 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서 세포는 포유동물에 대하여 동종이계이다. 일 구현예에서, 세포는 포유동물에 대하여 자가 유래이다. 일 구현예에서, 세포는 포유동물로부터 수확되고, 생체외에서 조작되고, 포유동물로 복귀된다.
양태에서, 하나 이상의 gRNA 분자, 예를 들어 표 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9에 기재된 표적화 도메인을 포함하는 하나 이상의 gRNA 분자, 및 본원에 기재된 하나 이상의 cas9 분자를 포함하거나 한때 포함하였던 세포, 또는 상기 세포의 자손은 줄기 세포 또는 전구 세포를 포함한다. 일 양태에서, 줄기 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일 양태에서, 전구 세포는 조혈 전구 세포이다. 일 양태에서, 세포는 조혈 줄기 세포 및 조혈 전구 세포 둘 다를 포함하며, 예를 들어 HSPC이다. 일 양태에서, 세포는 CD34+ 세포를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다. 일 양태에서, 세포는 실질적으로 CD34- 세포가 없다. 일 양태에서, 세포는 CD34+/CD90+ 줄기 세포를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다. 일 양태에서, 세포는 CD34+/CD90- 세포를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다. 양태에서, 세포는 상기 기재되거나 본원에 기재된 세포 유형 중 하나 이상을 포함하는 집단이다.
일 구현예에서, 본 개시는 혈색소병증, 예를 들어 겸상 적혈구 질병 또는 베타-탈라세미아를 치료하는 방법, 또는 이를 필요로 하는 포유동물, 예를 들어 인간의 태아 헤모글로빈 발현을 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은:
a) 포유동물로부터의 HSPC(예를 들어 CD34+ 세포)의 집단을 제공, 예를 들어 수확 또는 단리하는 것;
b) 선택적으로, 상기 HSPC(예를 들어 CD34+ 세포) 집단이 처리되지 않은 집단보다 더 큰 정도로 확장하는, 적어도 하나의 줄기 세포 확장제를 포함하는 조성물의 유효량의 존재하에, 상기 세포를 생체외, 예를 들어 세포 배양 배지 내로 제공하는 것;
c) HSPC(예를 들어 CD34+ 세포) 집단을, 본원에 기재된 표적화 도메인, 예를 들어 표 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9에 기재된 표적화 도메인을 포함하는 적어도 하나의 gRNA 분자, 또는 상기 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 예를 들어 본원에 기재된 적어도 하나의 cas9 분자, 또는 상기 cas9 분자를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 본원에 기재된 CRISPR 시스템을 갖는, 예를 들어 본원에 기재된 하나 이상의 RNP를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉하는 것;
d) 적어도 하나의 변형을 집단의 세포의 적어도 일부분(예를 들어 집단의 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포의 적어도 일부분)에서 야기함으로써, 예를 들어 상기 HSPC가 적혈구계 계통의 세포, 예를 들어 적혈구로 분화될 때, 예를 들어 단계 c)에 따라 접촉되지 않은 세포에 비해, 태아 헤모글로빈 발현이 증가되는 것; 및
f) 상기 변형된 HSPC(예를 들어 CD34+ 세포)를 포함하는 세포 집단을 포유동물로 복귀시키는 것;을 포함한다.
양태에서, HSPC는 그들이 복귀되는 포유동물에 대하여 동종이계이다. 양태에서, HSPC는 그들이 복귀되는 포유동물에 대하여 자가 유래이다. 양태에서, HSPC는 골수로부터 단리된다. 양태에서, HSPC는 말초 혈액, 예를 들어 동원된 말초 혈액으로부터 단리된다. 양태에서, 동원된 말초 혈액은 G-CSF를 투여한 대상체로부터 단리된다. 양태에서, 동원된 말초 혈액은 G-CSF 외의 동원 제제, 예를 들어 Plerixafor®(AMD3100)를 투여한 대상체로부터 단리된다. 양태에서, HSPC는 제대혈로부터 단리된다.
방법의 추가의 구현예에서, 방법은, 예를 들어 상기 공급원으로부터 HSPC(예를 들어 CD34+ 세포)의 집단을 제공한 후에, HSPC(예를 들어 CD34+ 세포)에 대하여 세포 집단을 부화하는 단계를 추가로 포함한다. 방법의 구현예에서, 상기 부화 후, 세포, 예를 들어 HSPC의 집단은 실질적으로 CD34- 세포가 없다.
구현예에서, 포유동물로 복귀되는 세포 집단은 적어도 70%의 살아있는 세포를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 세포 집단은 적어도 75%의 살아있는 세포를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 세포 집단은 적어도 80%의 살아있는 세포를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 세포 집단은 적어도 85%의 살아있는 세포를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 세포 집단은 적어도 90%의 살아있는 세포를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 세포 집단은 적어도 95%의 살아있는 세포를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 세포 집단은 적어도 99%의 살아있는 세포를 포함한다. 생존능은 예를 들어 당분야에 공지된 바와 같이 세포 생존능 마커에 대해 세포 집단의 대표적인 부분을 염색함으로써 결정될 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 개시는 혈색소병증, 예를 들어 겸상 적혈구 질병 또는 베타-탈라세미아를 치료하는 방법, 또는 이를 필요로 하는 포유동물, 예를 들어 인간의 태아 헤모글로빈 발현을 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은:
a) 예를 들어 포유동물의 골수로부터 포유동물의 HSP(예를 들어 CD34+ 세포) 집단을 제공, 예를 들어 수확 또는 단리하는 것;
b) 단계 a)의 세포 집단으로부터 CD34+ 세포를 단리하는 것;
c) 생체외에서 상기 CD34+ 세포를 제공하고, 상기CD34+ 세포 집단이 처리되지 않은 집단보다 더 큰 정도로 확장하는, 적어도 하나의 줄기 세포 확장제, 예를 들어 화합물 4, 예를 들어 화합물 4를 약 0.5 내지 약 0.75 마이크로몰의 농도로 포함하는 조성물의 유효량의 존재 하에, 상기 세포를 예를 들어 세포 배양 배지에서 배양하는 것;
d) 예를 들어 본원에 기재된 Cas9 분자 및 예를 들어 본원에 기재된 gRNA를 포함하며, 예를 들어 선택적으로 Cas9 분자 및 gRNA 분자는 예를 들어 본원에 기재된 RNP의 형태인 조성물의 유효량을 CD34+ 세포 집단의 세포로 도입하며, 선택적으로 상기 도입은 상기 세포 내로 상기 RNP의 예를 들어 본원에 기재된 전기천공에 의한 것인 것;
e) 세포 집단의 적어도 일부분(예를 들어 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포 집단의 적어도 일부분)에서 적어도 하나의 유전자 변형을 야기함으로써, 단계 d)에서 도입된 gRNA의 표적화 도메인에 상보적인 게놈 부위에 또는 그 근처에 예를 들어 본원에 기재된 삽입결실이 생성되는 것;
f) 선택적으로, 상기 도입 후에, 적어도 하나의 줄기 세포 확장제, 예를 들어 화합물 4, 예를 들어 화합물 4를 약 0.5 내지 약 0.75 마이크로몰의 농도로 포함하는 조성물의 유효량의 존재 하에, 상기 세포를 예를 들어 세포 배양 배지에서 추가적으로 배양하여, 세포가 적어도 2 배, 예를 들어 적어도 4 배, 예를 들어 적어도 5 배 확장하도록 하는 것;
g) 상기 세포를 동결보존하는 것; 및
h) 포유동물로 세포를 복귀시키며,
포유동물로 복귀된 세포는, 1) 적혈구계 계통의 세포, 예를 들어 적혈구로 분화하는 능력을 유지하고; 2) 적혈구로 분화될 때, 예를 들어 단계 e)의 gRNA에 의해 변형되지 않은 세포에 비해, 증가된 수준의 태아 헤모글로빈을 생산하며, 예를 들어 세포 당 적어도 6 피코그램의 태아 헤모글로빈을 생산하는 세포를 포함하는 것; 을 포함한다.
양태에서, HSPC는 그들이 복귀되는 포유동물에 대하여 동종이계이다. 양태에서, HSPC는 그들이 복귀되는 포유동물에 대하여 자가 유래이다. 양태에서, HSPC는 골수로부터 단리된다. 양태에서, HSPC는 말초 혈액, 예를 들어 동원된 말초 혈액으로부터 단리된다. 양태에서, 동원된 말초 혈액은 G-CSF를 투여한 대상체로부터 단리된다. 양태에서, 동원된 말초 혈액은 G-CSF 외의 동원 제제, 예를 들어 Plerixafor®(AMD3100)를 투여한 대상체로부터 단리된다. 양태에서, HSPC는 제대혈로부터 단리된다.
상기 방법의 구현예에서, 열거된 단계b)는 실질적으로 CD34- 세포가 없는 세포 집단을 야기한다.
방법의 추가의 구현예에서, 방법은, 예를 들어 상기 공급원으로부터 HSPC(예를 들어 CD34+ 세포)의 집단을 제공한 후에, HSPC(예를 들어 CD34+ 세포)에 대하여 세포 집단을 부화하는 단계를 추가로 포함한다.
이들 방법의 추가의 구현예에서, 분화하는 능력을 갖고, 증가된 태아 헤모글로빈 발현을 갖는 변형된 HSPC(예를 들어 CD34+ 줄기 세포)의 집단은 포유동물 내로 재도입되기 전에 동결보존 및 저장된다. 구현예에서, 적혈구계 계통의 세포, 예를 들어 적혈구로 분화하는 능력을 갖고/갖거나 적혈구계 계통의 세포, 예를 들어 적혈구로 분화될 때, 증가된 수준의 태아 헤모글로빈을 생산하는 동결보존된 HSPC의 집단은 해동되어 포유동물로 재도입된다. 이들 방법의 추가의 구현예에서, 방법은 포유동물의 내인성 조혈 전구 또는 줄기 세포를 제거 또는 감소시키기 위하여 화학 요법 및/또는 방사선 요법을 포함한다. 이들 방법의 추가의 구현예에서, 방법은 포유동물의 내인성 조혈 전구 또는 줄기 세포를 제거 또는 감소시키기 위하여 화학 요법 및/또는 방사선 요법의 것을 포함하지 않는다. 이들 방법의 추가의 구현예에서, 방법은 포유동물의 내인성 조혈 전구 또는 줄기 세포를 부분적으로 감소시키기 위하여(예를 들어 부분적 림프구 감소) 화학 요법 및/또는 방사선 요법을 포함한다. 구현예에서, 환자는 포유동물로의 변형된 HSPC의 재도입 전에, 완전히 림프구 감소시키는 투여량의 부술판(busulfan)으로 처리된다. 구현예에서, 환자는 포유동물로의 변형된 HSPC의 재도입 전에, 부분적으로 림프구 감소시키는 투여량의 부술판(busulfan)으로 처리된다.
구현예에서, 세포는 +58 BCL11a 인핸서 영역에 대한 gRNA와 복합체 형성된, 예를 들어 본원에 기재된 Cas9 분자를 포함하는 RNP와 접촉된다. 구현예에서, gRNA는 CR000312의 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, gRNA는 CR000311의 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, gRNA는 CR001128의 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, gRNA는 CR001125의 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, gRNA는 CR001126의 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, gRNA는 CR001127의 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 248]-[SEQ ID NO: 6607]을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 [SEQ ID NO: 7812]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 SEQ ID NO: 6660인 tracr을 포함하는 이중 가이드 RNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 248]-[SEQ ID NO: 6601]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 [SEQ ID NO: 248]-[SEQ ID NO: 7811]인 sgRNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 247]-[SEQ ID NO: 6607]을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 [SEQ ID NO: 7812]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 SEQ ID NO: 6660인 tracr을 포함하는 이중 가이드 RNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 247]-[SEQ ID NO: 6601]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 [SEQ ID NO: 247]-[SEQ ID NO: 7811]인 sgRNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 338]-[SEQ ID NO: 6607]을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 [SEQ ID NO: 7812]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 SEQ ID NO: 6660인 tracr을 포함하는 이중 가이드 RNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 338]-[SEQ ID NO: 6601]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 [SEQ ID NO: 338]-[SEQ ID NO: 7811]인 sgRNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 335]-[SEQ ID NO: 6607]을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 [SEQ ID NO: 7812]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 SEQ ID NO: 6660인 tracr을 포함하는 이중 가이드 RNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 335]-[SEQ ID NO: 6601]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 [SEQ ID NO: 335]-[SEQ ID NO: 7811]인 sgRNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 336]-[SEQ ID NO: 6607]을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 [SEQ ID NO: 7812]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 SEQ ID NO: 6660인 tracr을 포함하는 이중 가이드 RNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 336]-[SEQ ID NO: 6601]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 [SEQ ID NO: 336]-[SEQ ID NO: 7811]인 sgRNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 337]-[SEQ ID NO: 6607]을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 [SEQ ID NO: 7812]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 SEQ ID NO: 6660인 tracr을 포함하는 이중 가이드 RNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 337]-[SEQ ID NO: 6601]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 [SEQ ID NO: 337]-[SEQ ID NO: 7811]인 sgRNA이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에서, gRNA의 RNA 성분 중 임의의 것 또는 모두는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 뉴클레오티드에서 변형될 수 있다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 342이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 343이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1762이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 344 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 344 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 345 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 345 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 347이다. 구현예에서 gRNA 분자는 SEQ ID NO: 348이다. 구현예에서 gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1763이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 349 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 349 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 350 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 350 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 351이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 352이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1764이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 353 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 353 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. gRNA 분자는 SEQ ID NO: 354 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 354 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 355이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 356이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1765이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 357 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 357 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 358 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 358 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 359이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 360이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1766이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 361 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 361 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 362 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 362 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 363이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 364이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1767이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 365 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 365 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서 gRNA 분자는 SEQ ID NO: 366 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 366 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 367이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 368이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1768이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 369 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 369 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 370 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 370 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 371이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 372이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1769이다. gRNA 분자는 SEQ ID NO: 373 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 373 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 374 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 374 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다.
구현예에서, 세포는 HPFH 영역에 대한 gRNA와 복합체 형성된, 예를 들어 본원에 기재된 Cas9 분자를 포함하는 RNP와 접촉된다. 구현예에서, gRNA는 CR001030의 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, gRNA는 CR001028의 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, gRNA는 CR001221의 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, gRNA는 CR001137의 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, gRNA는 CR003035의 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, gRNA는 CR003085의 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 98]-[SEQ ID NO: 6607]을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 7812를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 SEQ ID NO: 6660인 tracr을 포함하는 이중 가이드 RNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 98]-[SEQ ID NO: 6601]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 [SEQ ID NO: 98]-[SEQ ID NO: 7811]인 sgRNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 100]-[SEQ ID NO: 6607]을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 7812를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 SEQ ID NO: 6660인 tracr을 포함하는 이중 가이드 RNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 100]-[SEQ ID NO: 6601]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 [SEQ ID NO: 100]-[SEQ ID NO: 7811]인 sgRNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 1589]-[SEQ ID NO: 6607]을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 7812를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 SEQ ID NO: 6660인 tracr을 포함하는 이중 가이드 RNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 1589]-[SEQ ID NO: 6601]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 [SEQ ID NO: 1589]-[SEQ ID NO: 7811]인 sgRNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 1505]-[SEQ ID NO: 6607]을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 7812를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 SEQ ID NO: 6660인 tracr을 포함하는 이중 가이드 RNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 1505]-[SEQ ID NO: 6601]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 [SEQ ID NO: 1505]-[SEQ ID NO: 7811]인 sgRNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 1700]-[SEQ ID NO: 6607]을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 7812를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 SEQ ID NO: 6660인 tracr을 포함하는 이중 가이드 RNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 1700]-[SEQ ID NO: 6601]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 [SEQ ID NO: 1700]-[SEQ ID NO: 7811]인 sgRNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 1750]-[SEQ ID NO: 6607]을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 7812를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 SEQ ID NO: 6660인 tracr을 포함하는 이중 가이드 RNA이다. 구현예에서, gRNA는 [SEQ ID NO: 1750]-[SEQ ID NO: 6601]를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가적인 3' 우라실 뉴클레오티드를 갖는, 예를 들어 [SEQ ID NO: 1750]-[SEQ ID NO: 7811]인 sgRNA이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 375이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 376이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1770이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 377 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 377 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 378 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 378 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 379이다. 구현예에서 gRNA 분자는 SEQ ID NO: 380이다. 구현예에서 gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1771이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 381 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 381 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 382 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 382 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 383이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 384이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1772이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 385 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 385 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. gRNA 분자는 SEQ ID NO: 386 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 386 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 387이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 388이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1773이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 389 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 389 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 390 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 390 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 391이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 392이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1774이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 393 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 393 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 394 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 394 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 395이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 396이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 1775이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 397 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 397 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서 gRNA 분자는 SEQ ID NO: 398 및 SEQ ID NO: 6660으로 구성된 dgRNA 분자이다. 구현예에서, gRNA 분자는 SEQ ID NO: 398 및 SEQ ID NO: 346으로 구성된 dgRNA 분자이다.
구현예에서, 줄기 세포 확장제는 화합물 1이다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 화합물 2이다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 화합물 3이다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 화합물 4이다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 화합물 4이며, 2 내지 0.1 마이크로몰, 예를 들어 1 내지 0.25 마이크로몰, 예를 들어 0.75 내지 0.5 마이크로몰의 농도로 존재한다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 WO2010/059401에 기재된 분자(예를 들어 WO2010/059401의 실시예 1에 기재된 분자)이다.
구현예에서, 세포, 예를 들어 본원에 기재된 HSPC는, 예를 들어 본원에 기재된 CRISPR 시스템과 세포를 접촉시키는 단계 전에, 약 1 시간 내지 약 15 일의 기간, 예를 들어 약 12 시간 내지 약 12 일의 기간, 예를 들어 약 12 시간 내지 4 일의 기간, 예를 들어 약 1 일 내지 약 4 일의 기간, 예를 들어 약 1 일 내지 약 2 일의 기간, 예를 들어 약 1 일의 기간 또는 약 2 일의 기간 동안 생체외에서 배양된다. 구현예에서, 상기 접촉 단계 전의 상기 배양은, 예를 들어 본원에 기재된 줄기 세포 확장제, 예를 들어 화합물 4, 예를 들어 약 0.25 uM 내지 약 1 uM 농도의 화합물 4, 예를 들어 약 0.75 내지 0.5 마이크로몰 농도의 화합물 4를 포함하는 조성물(예를 들어 세포 배양 배지)에서이다. 구현예에서, 세포는 예를 들어 줄기 세포 확장제, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 화합물 4, 예를 들어 약 0.25 uM 내지 약 1 uM 농도의 화합물 4, 예를 들어 약 0.75 내지 0.5 마이크로몰 농도의 화합물 4를 포함하는 세포 배양 배지에서, 예를 들어 본원에 기재된 CRISPR 시스템과 세포를 접촉시키는 단계 후에, 약 약 1 일 이하, 예를 들어 약 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 시간 이하의 기간 동안, 생체외에서 배양된다. 다른 구현예에서, 세포는 예를 들어 줄기 세포 확장제, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 화합물 4, 예를 들어 약 0.25 uM 내지 약 1 uM 농도의 화합물 4, 예를 들어 약 0.75 내지 0.5 마이크로몰 농도의 화합물 4를 포함하는 세포 배양 배지에서, 예를 들어 본원에 기재된 CRISPR 시스템과 세포를 접촉시키는 단계 후에, 약 1 시간 내지 약 15 일의 기간, 예를 들어 약 12 시간 내지 약 10 일의 기간, 예를 들어 약 1 일 내지 10 일의 기간, 예를 들어 약 1 일 내지 5 일의 기간, 예를 들어 약 1 일 내지 약 4 일의 기간, 예를 들어 약 2 일 내지 약 4 일의 기간, 예를 들어 약 2 일, 약 3 일 또는 약 4 일의 기간 동안, 생체외에서 배양된다. 구현예에서, 세포는 약 1 시간 내지 약 20 일, 예를 들어 약 6 내지 12 일의 기간, 예를 들어 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 또는 약 12 일의 기간 동안 생체외에서 배양된다(상기 접촉 단계 전에 배양 및/또는 상기 접촉 단계 후에 배양된다).
복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 적어도 약 1 백만 개의 세포(예를 들어 적어도 약 1 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 적어도 약 2 백만 개의 세포(예를 들어 적어도 약 2 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 적어도 약 3 백만 개의 세포(예를 들어 적어도 약 3 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 적어도 약 4 백만 개의 세포(예를 들어 적어도 약 4 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 적어도 약 5 백만 개의 세포(예를 들어 적어도 약 5 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 적어도 약 6 백만 개의 세포(예를 들어 적어도 약 6 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 적어도 1 백만 개의 세포(예를 들어 적어도 1 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 적어도 2 백만 개의 세포(예를 들어 적어도 2 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 적어도 3 백만 개의 세포(예를 들어 적어도 3 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 적어도 4 백만 개의 세포(예를 들어 적어도 4 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 적어도 5 백만 개의 세포(예를 들어 적어도 5 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 적어도 6 백만 개의 세포(예를 들어 적어도 6 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 약 1 백만 개의 세포(예를 들어 약 1 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 약 2 백만 개의 세포(예를 들어 약 2 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 약 3 백만 개의 세포(예를 들어 약 3 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 약 4 백만 개의 세포(예를 들어 약 4 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 약 5 백만 개의 세포(예를 들어 약 5 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 kg 당 약 6 백만 개의 세포(예를 들어 약 6 백만 개의 CD34+ 세포)를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 환자의 체중 kg 당 약 2 x 106 개의 세포를 포함한다. 구현예에서, 포유동물로 복귀되는 변형된 HSPC를 포함하는 세포 집단은 환자의 체중 kg 당 적어도 2 x 106 개의 세포를 포함한다.
구현예에서, 상기 기재된 방법 중 임의의 것은, 예를 들어 포유동물로의 세포의 재도입 후 적어도 15 일, 예를 들어 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50 또는 적어도 60 일에 측정된 바와 같이, 환자가 본 방법에 사용된 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 게놈 부위에 또는 그 근처에 삽입결실을 포함하는 적어도 80%의 그의 순환 CD34+ 세포를 갖도록 한다.
구현예에서, 상기 기재된 방법 중 임의의 것은, 예를 들어 포유동물로의 세포의 재도입 후 적어도 15 일, 예를 들어 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50 또는 적어도 60 일에 측정된 바와 같이, 환자가 본 방법에 사용된 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 게놈 부위에 또는 그 근처에 삽입결실을 포함하는 적어도 20%의 그의 골수 CD34+ 세포를 갖도록 한다.
구현예에서, 포유동물 내로 재도입되는 HSPC는 생체내에서 적혈구계 계통의 세포, 예를 들어 적혈구로 분화될 수 있고, 상기 분화된 세포는 증가된 태아 헤모글로빈 수준을 나타내어, 예를 들어 세포 당 적어도 6 피코그램의 태아 헤모글로빈을 생산하여, 예를 들어 세포 당 적어도 7 피코그램의 태아 헤모글로빈, 세포 당 적어도 8 피코그램의 태아 헤모글로빈, 세포 당 적어도 9 피코그램의 태아 헤모글로빈, 세포 당 적어도 10 피코그램의 태아 헤모글로빈, 예를 들어 세포 당 약 9와 약 10 피코그램 사이의 태아 헤모글로빈을 생산하여, 예를 들어 포유동물에서 혈색소병증이 치료되도록 한다.
세포가 증가된 태아 헤모글로빈을 갖는 것을 특징으로 하는 경우, 이는 그 세포의 자손, 예를 들어 분화된 자손이 증가된 태아 헤모글로빈을 나타내는 구현예를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어 본원에 기재된 방법에서, 변경된 또는 변형된 CD34+ 세포(또는 세포 집단)는 증가된 태아 헤모글로빈을 발현하지 않을 수 있지만 적혈구계 계통의 세포, 예를 들어 적혈구로 분화될 때, 세포는 증가된 태아 헤모글로빈, 예를 들어 유사한 조건 하에서 변형되지 않은 또는 변경되지 않은 세포에 비해 증가된 태아 헤모글로빈을 발현한다.
XII. 배양 방법 및 세포를 제조하는 방법
본 개시는 세포, 예를 들어 HSPC, 예를 들어 조혈 줄기 세포, 예를 들어 본원에 기재된 gRNA 분자로 변형되거나 변형될 CD34+ 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
DNA 수선 경로 저해제
이론에 얽매이지 않고, 특정 표적 서열에서 주어진 gRNA 분자에 의해 생산된 삽입결실의 패턴은 세포 내의 활성 DNA 수선 메카니즘 각각의 산물(예를 들어 비-상동 말단 접합, 미세상동-매개 말단 접합 등)이라고 여겨진다. 이론에 얽매이지 않고, 편집될 세포를 원하는 삽입결실을 생산하지 않는 DNA 수선 경로의 저해제와 접촉시킴으로써, 특히 유리한 삽입결실에 대해 선택되거나 부화될 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명의 gRNA 분자, CRISPR 시스템, 방법 및 다른 양태는 이러한 저해제와 조합하여 수행될 수있다. 이러한 저해제의 예에는 예를 들어 그 내용의 전문이 참조로 본원에 의해 포함되는 WO2014/130955에 기재된 것들이 포함된다. 구현예에서, 저해제는 DNAPKc 저해제, 예를 들어 NU7441이다.
줄기 세포 확장제
일 양태에서, 본 발명은 제제로 처리되지 않은 세포에 비해 증가된 확장 속도, 증가된 확장 수준, 또는 증가된 이식을 야기하는 하나 이상의 제제와 함께, 본원에 기재된 gRNA 분자로 변형되거나 변형될 세포, 예를 들어 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 배양하는 것에 관한 것이다. 이러한 제제는 본원에서 줄기 세포 확장제로 지칭된다.
양태에서, 제제로 처리되지 않은 세포에 비해 증가된 확장 속도 또는 증가된 확장 수준을 야기하는 하나 이상의 제제, 예를 들어 줄기 세포 확장제는 아릴 탄화수소 수용체(AHR) 경로의 저해제인 제제를 포함한다. 양태에서, 줄기 세포 확장제는, 그 내용의 전문이 참조로 포함되는 WO2013/110198에 개시된 화합물 또는 WO2010/059401에 개시된 화합물이다.
일 양태에서, 제제로 처리되지 않은 세포에 비해 증가된 확장 속도 또는 증가된 확장 수준을 야기하는 하나 이상의 제제는, 예를 들어 그 내용의 전문이 참조로 본원에 의해 포함되는WO2013/110198에 개시된, 피리미도[4,5-b]인돌 유도체이다. 일 구현예에서 제제는 화합물 1((1r,4r)-N1-(2-벤질-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-일)사이클로헥산-1,4-디아민)이다:
화합물 1
Figure pct00125
또다른 양태에서, 제제는 화합물 2(메틸 4-(3-피페리딘-1-일프로필아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카르복실레이트)이다:
화합물 2:
Figure pct00126
또다른 양태에서, 제제로 처리되지 않은 세포에 비해 증가된 확장 속도 또는 증가된 확장 수준을 야기하는 하나 이상의 제제는, 그 내용의 전문이 참조로 본원에 의해 포함되는WO2010/059401에 개시된 제제이다.
일 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 4-(2-(2-(벤조[b]티오펜-3-일)-9-이소프로필-9H-퓨린-6-일아미노)에틸)페놀, 즉 다음의 구조를 갖는, WO2010/059401의 실시예 1로부터의 화합물이다:
화합물 3:
Figure pct00127
또다른 양태에서, 줄기 세포 확장제는 화합물 4((S)-2-(6-(2-(1H-인돌-3-일)에틸아미노)-2-(5-플루오로피리딘-3-일)-9H-퓨린-9-일)프로판-1-올, 즉 다음의 구조를 갖는, WO2010/059401에 따른 화합물 157S이다:
화합물 4:
Figure pct00128
구현예에서, HSPC의 집단은, 상기 HSPC로의 CRISPR 시스템(예를 들어 본 발명의 gRNA 분자 및/또는 Cas9 분자)의 도입 전에, 줄기 세포 확장제, 예를 들어 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 이의 조합(예를 들어 화합물 1과 화합물 4의 조합)과 접촉된다. 구현예에서, HSPC의 집단은, 상기 HSPC로의 CRISPR 시스템(예를 들어 본 발명의 gRNA 분자 및/또는 Cas9 분자)의 도입 후에, 줄기 세포 확장제, 예를 들어 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 이의 조합(예를 들어 화합물 1과 화합물 4의 조합)과 접촉된다. 구현예에서, HSPC의 집단은, 상기 HSPC로의 CRISPR 시스템(예를 들어 본 발명의 gRNA 분자 및/또는 Cas9 분자)의 도입 전 및 후 둘 다에, 줄기 세포 확장제, 예를 들어 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 이의 조합(예를 들어 화합물 1과 화합물 4의 조합)과 접촉된다.
구현예에서, 줄기 세포 확장제는, 줄기 세포 확장제의 부재를 제외하고는 동일한 배지에서의 HSPC에 비해, HSPC의 확장 수준을 증가시키기에 유효량으로 존재한다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 약 0.01 내지 약 10 uM, 예를 들어 약 0.1 uM 내지 약 1 uM 범위의 농도로 존재한다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 약 1 uM, 약 950 nM, 약 900 nM, 약 850 nM, 약 800 nM, 약 750 nM, 약 700 nM, 약 650 nM, 약 600 nM, 약 550 nM, 약 500 nM, 약 450 nM, 약 400 nM, 약 350 nM, 약 300 nM, 약 250 nM, 약 200 nM, 약 150 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 25 nM, 또는 약 10 nM의 농도로 세포 배양 배지에 존재한다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 약 500 nM 내지 약 750 nM 범위의 농도로 존재한다.
구현예에서, 줄기 세포 확장제는 약 0.01 내지 약 10 마이크로몰(uM) 범위의 농도로 세포 배양 배지에 존재하는 화합물 4이다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 약 0.1 내지 약 1 마이크로몰(uM) 범위의 농도로 세포 배양 배지에 존재하는 화합물 4이다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 약 0.75 마이크로몰(uM)의 농도로 세포 배양 배지에 존재하는 화합물 4이다. 구현예에서, 줄기 세포 확장제는 약 0.5 마이크로몰(uM)의 농도로 세포 배양 배지에 존재하는 화합물 4이다. 전술한 것 중 임의의 구현예에서, 세포 배양 배지는 추가로 화합물 1을 포함한다.
구현예에서, 줄기 세포 확장제는 화합물 1과 화합물 4의 혼합물이다.
구현예에서, 본 발명의 세포는 CD34+ 세포의 2 내지 10,000 배 확장, 예를 들어CD34+ 세포의 2 내지 1000 배 확장, 예를 들어CD34+ 세포의 2 내지 100 배 확장, 예를 들어CD34+ 세포의 20 내지 200 배 확장을 야기하기에 충분한 시간 동안 및 충분한 양으로 하나 이상의 줄기 세포 확장제 분자와 접촉된다. 본원에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 줄기 세포 확장제와의 접촉은, 예를 들어 본원에 기재된 CRISPR 시스템과 세포가 접촉되기 전, 예를 들어 본원에 기재된 CRISPR 시스템과 세포가 접촉된 후, 또는 이의 조합일 수 있다. 구현예에서, 세포는 CD34+ 세포, 예를 들어 상기 세포 내로 도입된 CRISPR/Cas9 시스템의 gRNA의 표적화 도메인에 대한 상보성을 갖는 표적 부위에 또는 그 근처에 삽입결실을 포함하는 CD34+ 세포, 의 적어도 2 배 확장을 야기하기에 충분한 시간 동안 및 충분한 양으로 하나 이상의 줄기 세포 확장제 분자, 예를 들어 화합물 4와 접촉된다. 구현예에서, 세포는 CD34+ 세포, 예를 들어 상기 세포 내로 도입된 CRISPR/Cas9 시스템의 gRNA의 표적화 도메인에 대한 상보성을 갖는 표적 부위에 또는 그 근처에 삽입결실을 포함하는 CD34+ 세포, 의 적어도 4 배 확장을 야기하기에 충분한 시간 동안 및 충분한 양으로 하나 이상의 줄기 세포 확장제 분자, 예를 들어 화합물 4와 접촉된다. 구현예에서, 세포는 CD34+ 세포, 예를 들어 상기 세포 내로 도입된 CRISPR/Cas9 시스템의 gRNA의 표적화 도메인에 대한 상보성을 갖는 표적 부위에 또는 그 근처에 삽입결실을 포함하는 CD34+ 세포, 의 적어도 5 배 확장을 야기하기에 충분한 시간 동안 및 충분한 양으로 하나 이상의 줄기 세포 확장제 분자, 예를 들어 화합물 4와 접촉된다. 구현예에서, 세포는 CD34+ 세포의 적어도 10 배 확장을 야기하기에 충분한 시간 동안 및 충분한 양으로 하나 이상의 줄기 세포 확장제 분자와 접촉된다. 구현예에서, 세포는 CD34+ 세포의 적어도 20 배 확장을 야기하기에 충분한 시간 동안 및 충분한 양으로 하나 이상의 줄기 세포 확장제 분자와 접촉된다. 구현예에서, 세포는 CD34+ 세포의 적어도 30 배 확장을 야기하기에 충분한 시간 동안 및 충분한 양으로 하나 이상의 줄기 세포 확장제 분자와 접촉된다. 구현예에서, 세포는 CD34+ 세포의 적어도 40 배 확장을 야기하기에 충분한 시간 동안 및 충분한 양으로 하나 이상의 줄기 세포 확장제 분자와 접촉된다. 구현예에서, 세포는 CD34+ 세포의 적어도 50 배 확장을 야기하기에 충분한 시간 동안 및 충분한 양으로 하나 이상의 줄기 세포 확장제 분자와 접촉된다. 구현예에서, 세포는 CD34+ 세포의 적어도 60 배 확장을 야기하기에 충분한 시간 동안 및 충분한 양으로 하나 이상의 줄기 세포 확장제 분자와 접촉된다. 구현예에서, 세포는 약 1 내지 60 일, 예를 들어 약 1 내지 50 일, 예를 들어 약 1 내지 40 일, 예를 들어 약 1 내지 30 일, 예를 들어 약 1 내지 20 일, 예를 들어 약 1 내지 10 일, 예를 들어 약 7 일, 예를 들어 약 1 내지 5 일, 예를 들어 약 2 내지 5 일, 예를 들어 약 2 내지 4 일, 예를 들어 약 2 일 또는 예를 들어 약 4 일의 기간 동안 하나 이상의 줄기 세포 확장제와 접촉된다.
구현예에서, 세포, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 HSPC는, 예를 들어 본원에 기재된 CRISPR 시스템과 세포를 접촉시키는 단계 전에, 약 1 시간 내지 약 10 일의 기간, 예를 들어 약 12 시간 내지 약 5 일의 기간, 예를 들어 약 12 시간 내지 4 일의 기간, 예를 들어 약 1 일 내지 약 4 일의 기간, 예를 들어 약 1 일 내지 약 2 일의 기간, 예를 들어 약 1 일의 기간 또는 약 2 일의 기간 동안 생체외에서 배양된다. 구현예에서, 상기 접촉 단계 전의 상기 배양은, 예를 들어 본원에 기재된 줄기 세포 확장제, 예를 들어 화합물 4, 예를 들어 약 0.25 uM 내지 약 1 uM 농도의 화합물 4, 예를 들어 약 0.75 내지 0.5 마이크로몰 농도의 화합물 4를 포함하는 조성물(예를 들어 세포 배양 배지)에서이다. 구현예에서, 세포는 예를 들어 줄기 세포 확장제, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 화합물 4, 예를 들어 약 0.25 uM 내지 약 1 uM 농도의 화합물 4, 예를 들어 약 0.75 내지 0.5 마이크로몰 농도의 화합물 4를 포함하는 세포 배양 배지에서, 예를 들어 본원에 기재된 CRISPR 시스템과 세포를 접촉시키는 단계 후에, 약 약 1 일 이하, 예를 들어 약 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 시간 이하의 기간 동안, 생체외에서 배양된다. 다른 구현예에서, 세포는 예를 들어 줄기 세포 확장제, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 화합물 4, 예를 들어 약 0.25 uM 내지 약 1 uM 농도의 화합물 4, 예를 들어 약 0.75 내지 0.5 마이크로몰 농도의 화합물 4를 포함하는 세포 배양 배지에서, 예를 들어 본원에 기재된 CRISPR 시스템과 세포를 접촉시키는 단계 후에, 약 1 시간 내지 약 14 일의 기간, 예를 들어 약 12 시간 내지 약 10 일의 기간, 예를 들어 약 1 일 내지 10 일의 기간, 예를 들어 약 1 일 내지 5 일의 기간, 예를 들어 약 1 일 내지 약 4 일의 기간, 예를 들어 약 2 일 내지 약 4 일의 기간, 예를 들어 약 2 일, 약 3 일 또는 약 4 일의 기간 동안, 생체외에서 배양된다.
구현예에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 정의된 배지이다. 구현예에서, 세포 배양 배지는 예를 들어 StemSpan SFEM(StemCell Technologies; Cat no. 09650)을 추가적으로 함유할 수 있다. 구현예에서, 세포 배양 배지는, 예를 들어 HSC Brew, GMP(Miltenyi)를 대안적으로 또는 추가적으로 함유할 수 있다. 구현예에서, 배지는 트롬보포이에틴(TPO), 인간 Flt3 리간드(Flt-3L), 인간 줄기 세포 인자(SCF), 인간 인터루킨-6, L-글루타민 및/또는 페니실린/스트렙토마이신으로 보충될 수 있다. 구현예에서, 배지는 트롬보포이에틴(TPO), 인간 Flt3 리간드(Flt-3L), 인간 줄기 세포 인자(SCF), 인간 인터루킨-6, 및 L-글루타민으로 보충된다. 다른 구현예에서, 배지는 트롬보포이에틴(TPO), 인간 Flt3 리간드(Flt-3L), 인간 줄기 세포 인자(SCF), 및 인간 인터루킨-6로 보충된다. 다른 구현예에서, 배지는 인간 인터루킨-6이 아닌, 트롬보포이에틴(TPO), 인간 Flt3 리간드(Flt-3L), 및 인간 줄기 세포 인자(SCF)로 보충된다. 배지에 존재할 때, 트롬보포이에틴(TPO), 인간 Flt3 리간드(Flt-3L), 인간 줄기 세포 인자(SCF), 인간 인터루킨-6 및/또는 L-글루타민은 각각 약 1 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL 범위의 농도, 예를 들어 약 10 ng/mL 내지 약 500 ng/mL 범위의 농도, 예를 들어 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL 범위의 농도, 예를 들어 약 25 ng/mL 내지 약 75 ng/mL범위의 농도, 예를 들어 약 50 ng/mL의 농도로 존재한다. 구현예에서, 보충된 성분 각각은 동일한 농도이다. 다른 구현예에서, 보충된 성분 각각은 상이한 농도이다. 구현예에서, 배지는 StemSpan SFEM(StemCell Technologies, Cat no. 09650), 50 ng/mL의 트롬보포이에틴(Tpo), 50 ng/mL의 인간 Flt3 리간드(Flt-3L), 50 ng/mL의 인간 줄기 세포 인자(SCF), 및 50 ng/mL의 인간 인터루킨-6(IL-6)를 포함한다. 구현예에서, 배지는 StemSpan SFEM(StemCell Technologies, Cat no. 09650), 50 ng/mL의 트롬보포이에틴(Tpo), 50 ng/mL의 인간 Flt3 리간드(Flt-3L), 및 50 ng/mL의 인간 줄기 세포 인자(SCF)를 포함하며, IL-6를 포함하지 않는다. 구현예에서, 배지는 줄기 세포 확장제, 예를 들어 화합물 4, 에를 들어 0.75 μM 농도의 화합물 4를 추가로 포함한다. 구현예에서, 배지는 줄기 세포 확장제, 예를 들어 화합물 4, 예를 들어 0.5 μM 농도의 화합물 4를 추가로 포함한다. 구현예에서, 배지는 1% L-글루타민 및 2% 페니실린/스트렙토마이신을 추가로 포함한다. 구현예에서, 세포 배양 배지는 무혈청이다.
XII. 병용 요법
본 개시는 하나 이상의 다른 치료 방식 및/또는 제제 제제와 조합하여, 본원에 기재된 gRNA 분자, 또는 본원에 기재된 gRNA 분자로 변형된 세포(예를 들어 조혈 줄기 세포, 예를 들어 CD34+ 세포)의 사용을 고려한다. 따라서, gRNA 분자 또는 본원에 기재된 gRNA 분자로 변형된 세포의 사용에 추가하여, 혈색소병증을 치료하기 위한 하나 이상의 "표준" 요법을 대상체에게 또한 투여할 수 있다.
혈색소병증을 치료하기 위한 하나 이상의 추가적인 요법에는, 예를 들어 추가적인 줄기 세포 이식, 예를 들어 조혈 줄기 세포 이식이 포함될 수 있다. 줄기 세포 이식은 동종이계 또는 자가 유래일 수 있다.
혈색소병증을 치료하기 위한 하나 이상의 추가적인 요법에는, 예를 들어 혈액 수혈 및/또는 철 킬레이트화(예를 들어 제거) 요법이 포함될 수 있다. 공지된 철 킬레이트화제에는 예를 들어 데페록사민 및 데페라시록스가 포함된다.
혈색소병증을 치료하기 위한 하나 이상의 추가적인 요법에는, 예를 들어 엽산 보충제 또는 하이드록시우레아(예를 들어 5-하이드록시우레아)가 포함될 수 있다. 혈색소병증을 치료하기 위한 하나 이상의 추가적인 요법은 하이드록시우레아일 수 있다. 구현예에서, 하이드록시우레아는 예를 들어 1 일 10 내지 35 mg/kg, 예를 들어 1 일 10 내지 20 mg/kg의 투여량으로 투여될 수 있다. 구현예에서, 하이드록시우레아는 1 일 10 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 구현예에서, 하이드록시우레아는 1 일 10 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 구현예에서, 하이드록시우레아는 1 일 20 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 구현예에서, 하이드록시우레아는 예를 들어 본원에 기재된, 본 발명의 세포(또는 세포 집단), 예를 들어 CD34+ 세포(또는 세포 집단) 전에 및/또는 후에 투여된다.
하나 이상의 추가적인 치료제에는, 예를 들어 항-p-셀렉틴 항체, 예를 들어 SelG1(Selexys)가 포함될 수 있다. P-셀렉틴 항체는 예를 들어 그 각각의 내용의 전문이 본원에 포함된, PCT 공개 WO1993/021956, PCT 공개 WO1995/034324, PCT 공개 WO2005/100402, PCT 공개 WO2008/069999, 미국 특허 출원 공개 US2011/0293617, 미국 특허 제5800815호, 미국 특허 제6667036호, 미국 특허 제8945565호, 미국 특허 제8377440호 및 미국 특허 제9068001호에 기재되어 있다.
하나 이상의 추가적인 제제에는 예를 들어 태아 헤모글로빈을 상향 조절하는 저분자가 포함될 수 있다. 이러한 분자의 예로는 TN1(예를 들어 본원에 참조로 포함된 문헌[Nam, T. et al., ChemMedChem 2011, 6, 777-780, DOI: 10.1002/cmdc.201000505]에 기재됨)이 포함된다.
하나 이상의 추가적인 요법에는 또한 당분야에 공지된 방사선조사 또는 다른 골수 절제 요법이 포함될 수 있다. 이러한 요법의 예는 부술판이다. 이러한 추가적인 요법은 대상체로의 본 발명의 세포의 도입 전에 수행될 수 있다. 본원에 기재된 치료 방법(예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 변형된(예를 들어 HbF 생산을 증가시키기 위해 본원에 기재된 CRISPR 시스템으로 변형된) 세포(예를 들어 HSPC)의 투여를 포함하는 치료 방법) 구현예에서, 방법은 골수 절제 단계를 포함하지 않는다. 구현예에서, 방법은 부분적인 골수 절제 단계를 포함한다.
본원에 기재된 요법(예를 들어 HSPC, 예를 들어 본원에 기재된 CRISPR 시스템을 사용하여 변형된 HSPC의 집단를 투여하는 것을 포함)은 또한 추가적인 치료제와 조합될 수 있다. 구현예에서, 추가적인 치료제는 HDAC 저해제, 예를 들어 파노비노스탯(panobinostat)이다. 구현예에서, 추가적인 치료제는 PCT 공개 WO2014/150256호에 기재된 화합물, 예를 들어 WO2014/150256의 표 1에 기재된 화합물, 예를 들어 GBT440이다. HDAC 저해제의 다른 예로는, 예를 들어 수베로일아닐리드 하이드록삼산(SAHA)이 포함된다. 하나 이상의 추가적인 제제에는 예를 들어 DNA 메틸화 저해제가 포함될 수 있다. 이러한 제제는 감소된 BCL11a 활성을 갖는 세포에서 HbF 유도를 증가시키는 것으로 나타났다(예를 들어 본원에 참조로 포함된 문헌[Jian Xu et al, Science 334, 993(2011); DOI: 0.1126/science.1211053] 참조). 다른 HDAC 저해제에는 당분야에 공지된 임의의 HDAC 저해제, 예를 들어 트리코스타틴 A, HC 독소, DACI-2, FK228, DACI-14, 데푸디신, DACI-16, 투바신, NK57, MAZ1536, NK125, 스크립타이드, 피록사미드, MS-275, ITF-2357, MCG-D0103, CRA-024781, CI-994, 및 LBH589(예를 들어 그 전문이 본원에 참고로 포함된 문헌[Bradner JE, et al., PNAS, 2010(vol. 107:28), 12617-12622] 참조).
본원에 기재된 gRNA 분자, 또는 본원에 기재된 gRNA 분자로 변형된 세포(예를 들어 조혈 줄기 세포, 예를 들어 CD34+ 세포) 및 병용-치료제 또는 병용-요법은 동일한 제형으로 또는 별도로 투여될 수 있다. 별도의 투여의 경우, 본원에 기재된 gRNA 분자 또는 본원에 기재된 gRNA 분자로 변형된 세포는 병용-치료 또는 병용-요법 전, 후 또는 이와 동시에 투여될 수 있다. 하나의 제제는 다른 제제의 투여를 수 분 내지 수 주 범위의 간격 만큼 선행하거나 뒤따를 수 있다. 2 이상의 상이한 종류의 치료제가 대상체에게 별도로 개별적으로 적용되는 구현예에서, 이들 상이한 종류의 제제가 표적 조직 또는 세포 상에 유리하게 조합된 효과를 여전히 발휘할 수 있도록, 일반적으로, 각 전달의 시간 사이에 상당한 시간의 기간이 만료되지 않았음을 보장할 것이다.
XIII. 변형된 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 및 핵산
변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드는 핵산, 예를 들어 특히 gRNA에 존재할 수 있으나, 또한 다른 형태의 RNA, 예를 들어 mRNA, RNAi 또는 siRNA에도 존재할 수 있다. 본원에 기재된 "뉴클레오시드"는 5-탄당 분자(펜토스 또는 리보스) 또는 이의 유도체, 및 유기 염기, 퓨린 또는 피리미딘, 또는 이의 유도체를 함유하는 화합물로 정의된다. 본원에 기재된 "뉴클레오티드"는 포스페이트기를 추가로 포함하는 뉴클레오시드로 정의된다.
변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는:
(i) 포스포디에스테르 백본 연결 내의 하나 또는 둘 다의 비-연결 포스페이트 산소 및/또는 하나 이상의 연결 포스페이트 산소의 변경, 예를 들어 대체;
(ii) 리보스 당의 구성 요소, 예를 들어 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어 대체;
(iii) 포스페이트 모이어티의 "데포스포(dephospho)" 링커로의 대규모 대체;
(iv) 비정준 핵염기로의 변형 또는 치환을 포함하는, 자연적 발생 핵염기의 변형 또는 대체;
(v) 리보스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형;
(vi) 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어 말단 포스페이트기의 제거, 변형 또는 대체, 또는 모이어티, 캡 또는 링커의 접합; 및
(vii) 당의 변형 또는 대체; 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
위에서 나열된 변형들은 조합되어 2, 3, 4 이상의 변형을 가질 수 있는 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 예를 들어 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 구현예에서, gRNA의 모든 염기가 변형되고, 예를 들어 모든 염기가 변형된 포스페이트기를 가지며, 예를 들어 모두가 포스포로티오에이트기이다. 구현예에서, 단 분자 또는 모듈식 gRNA 분자의 포스페이트기의 전부 또는 실질적으로 전부가 포스포로티오에이트기로 대체된다. 구현예에서, gRNA의 5개 3'-말단 염기 중 하나 이상 및/또는 gRNA의 5개 5'-말단 염기 중 하나 이상은 포스포로티오에이트기로 변형된다.
구현예에서, 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 본원에 기재된 변형을 갖는 뉴클레오티드는 핵산, 예를 들어 "변형된 핵산"으로 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 핵산은 1개, 2개, 3개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 핵산 내의 위치의 적어도 5%(예를 들어 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%)는 변형된 뉴클레오티드이다.
변형되지 않은 핵산은 예를 들어 세포 뉴클레아제에 의한 분해되기 쉬울 수 있다. 예를 들어 뉴클레아제는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본원에 기재된 변형된 핵산은 예를 들어 뉴클레아제에 대한 안정성을 도입하기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 함유 할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 뉴클레오시드, 변형된 뉴클레오티드 및 변형된 핵산은 생체내 및 생체외 둘 다에서 세포 집단으로 도입될 때 감소된 선천 면역 반응을 나타낼 수 있다. 용어 "선천 면역 반응"은 일반적으로 바이러스 또는 박테리아 기원의 단일 가닥 핵산을 포함하는 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함하며, 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론의 유도 및 세포 사멸을 수반한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 뉴클레오시드, 변형된 뉴클레오티드 및 변형된 핵산은 주홈(major groove) 상호 작용 파트너와 핵산의 결합을 파괴할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 뉴클레오시드, 변형된 뉴클레오티드 및 변형된 핵산은 생체내 및 생체외 둘 다에서 세포 집단으로 도입될 때 감소된 선천 면역 반응을 나타낼 수 있고, 또한, 주홈 상호 작용 파트너와 핵산의 결합을 파괴 할 수 있다.
화학적 기의 정의
본원에 사용되는 "알킬"은 직쇄 또는 분지형인 포화 탄화수소기를 지칭하는 것으로 여겨진다. 알킬기의 예로는 메틸(Me), 에틸(Et), 프로필(예를 들어 n-프로필 및 이소프로필), 부틸(예를 들어 n-부틸, 이소부틸, t-부틸), 펜틸(예를 들어 n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸) 등이 포함된다. 알킬기는 1개 내지 약 20개, 2개 내지 약 20개, 1개 내지 약 12개, 1개 내지 약 8개, 1개 내지 약 6개, 1개 내지 약 4개, 또는 1개 내지 약 3개의 탄소 원자를 함유할 수 있다.
본원에 사용되는 "아릴"은 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭(예를 들어 2개, 3개 또는 4개의 융합된 고리를 갖는) 방향족 탄화수소, 예를 들어 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 페난트레닐, 인다닐, 인데닐 등을 지칭한다.
구현예에서, 아릴기는 6개 내지 약 20개의 탄소 원자를 갖는다.
본원에 사용되는 "알케닐"은 적어도 1개의 이중 결합을 함유하는 지방족 기를 지칭한다. 본원에 사용되는 "알키닐"은 2 내지 12개의 탄소 원자를 포함하고, 하나 이상의 삼중 결합을 갖는 것을 특징으로 하는 직선 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알키닐 기의 예로는 에티닐, 프로파르길, 및 3-헥시닐을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용되는 "아릴알킬" 또는 "아랄킬"은 알킬 수소 원자가 아릴기로 대체된 알킬 모이어티를 지칭한다. 아랄킬은 하나를 초과하는 수소 원자가 아릴기로 대체된 기를 포함한다. "아릴알킬" 또는 "아랄킬"의 예로는 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필, 9-플루오레닐, 벤즈하이드릴, 및 트리틸기가 포함된다.
본원에 사용되는 "사이클로알킬"은 3개 내지 12개의 탄소를 갖는 사이클릭, 바이사이클릭, 트리사이클릭, 또는 폴리사이클릭 비방향족 탄화수소기를 지칭한다. 사이클로알킬 모이어티의 예로는 사이클로프로필, 사이클로펜틸, 및 사이클로헥실이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용되는 "헤테로사이클릴"은 헤테로사이클릭 고리계의 1 가 라디칼을 지칭한다. 대표적인 헤테로사이클릴에는 비제한적으로, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티에닐, 피롤리디닐, 피롤리도닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 디옥솔라닐, 디제피닐, 옥사제피닐, 티제피닐, 및 모르폴리닐이 포함된다.
본원에 사용되는 "헤테로아릴"은 헤테로방향족 고리계의 1가 라디칼을 지칭한다. 헤테로아릴 모이어티의 예로는 이미다졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 트리아졸릴, 피롤릴, 푸라닐, 인돌릴, 티오페닐 피라졸릴, 피리디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 인돌리지닐, 퓨리닐, 나프티리디닐, 퀴놀릴, 및 프테리디닐이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
포스페이트 백본 변형
포스페이트기
일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드의 포스페이트기는 하나 이상의 산소를 상이한 치환기로 대체함으로써 변형될 수 있다. 추가적으로, 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 변형된 핵산에 존재하는 변형된 뉴클레오티드는, 변형되지 않은 포스페이트 모이어티의 본원에 기재된 변형된 포스페이트로의 대규모 대체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 포스페이트 백본의 변형은 비하전 링커 또는 하전된 링커가 비대칭 전하 분포를 갖도록 야기하는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트기의 예로는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르가 포함된다. 일부 구현예에서, 포스페이트 백본 모이어티에서 비-가교 포스페이트 산소 원자 중 하나는 다음의 기 중 임의의 것으로 대체될 수 있다: 황(S), 셀레늄(Se), BR3(여기서, R은 예를 들어 수소, 알킬, 또는 아릴일 수 있음), C(예를 들어 알킬기, 아릴기 등), H, NR2(여기서, R은 예를 들어 수소, 알킬, 또는 아릴일 수 있음), 또는 OR(여기서, R은 예를 들어 알킬 또는 아릴일 수 있음). 변형되지 않은 포스페이트기에서 인 원자는 아키랄이다. 그러나, 상기 원자 또는 원자 그룹 중 하나로 비-가교 산소 중 하나를 대체하는 것은 인 원자를 키랄로 만들 수 있으며; 다시 말하면 이 방식으로 변형된 포스페이트기에서 인 원자는 입체발생 중심이다. 입체발생 인 원자는 "R" 배열(본원에서 Rp) 또는 "S" 배열(본원에서 Sp)를 보유할 수 있다.
포스포로디티오에이트는 비-가교 산소 둘 다 황으로 대체된다. 포스포로디티오에이트에서 인 중심은 올리고리보뉴클레오티드 부분입체이성질체의 형성을 불가능하게 하는 아키랄이다. 일부 구현예에서, 비-가교 산소 하나 또는 둘 다의 변형은 또한 비-가교 산소를 S, Se, B, C, H, N, 및 OR(R은 예를 들어 알킬 또는 아릴일 수 있음)로부터 독립적으로 선택되는 기로 대체하는 것을 포함할 수 있다.
포스페이트 링커는 또한 가교 산소(즉, 뉴클레오시드에 포스페이트를 연결하는 산소)를 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌포스포네이트)로 대체함으로써 변형될 수 있다. 대체는 연결 산소 중 임의의 것 또는 연결 산소의 둘 다에서 발생할 수 있다.
포스페이트기의 대체
포스페이트기는 비-인 함유 커넥터(non-phosphrous containing connector)에 의해 대체될 수 있다. 구현예에서, 하전 포스페이트기는 중성 모이어티로 대체될 수 있다.
포스페이트기를 대체할 수 있는 모이어티의 예로는, 비제한적으로, 예를 들어 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌히드라조, 메틸렌디메틸히드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노가 포함된다.
리보포스페이트 백본의 대체
포스페이트 링커 및 리보스 당이 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 대용물로 대체된, 핵산을 모방할 수 있는 스캐폴드가 또한 작제될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는 대용물 백본에 의해 묶일 수 있다. 예로는, 비제한적으로, 모르폴리노, 사이클로부틸, 피롤리딘 및 펩티드 핵산(PNA) 뉴클레오시드 대용물을 포함할 수 있다.
당 변형
변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드는 당기에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어 2' 하이드록실기(OH)는 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 대체되거나 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 하이드록실은 더 이상 탈양성자화되지 않아 2'-알콕사이드 이온을 형성할 수 있으므로, 2' 하이드록실기에의 변형은 핵산의 안정성을 향상할 수 있다. 2'-알콕사이드는 링커 인 원자 상에서 분자내 친핵성 공격에 의한 분해를 촉매할 수 있다.
"옥시"-2' 하이드록실기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 여기서 "R"은, 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음); 폴리에틸렌글리콜(PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR 여기서, R은 예를 들어 H 또는 선택적으로 치환된 알킬일 수 있고, n은 0 내지 20(예를 들어 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20)의 정수일 수 있음)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, "옥시"-2' 하이드록실기 변형은 "잠금(locked)" 핵산(LAN)을 포함할 수 있으며, 2' 하이드록실은, 예를 들어 Ci-6 알킬렌 또는 Cj-6 헤테로알킬렌 가교에 의해, 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있으며, 여기서 예시적인 가교는 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 또는 아미노 가교; O-아미노(여기서, 아미노는 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음) 및 아미노알콕시, O(CH2)n-아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, "옥시"-2' 하이드록실기 변형은 메톡시에틸기(MOE), (OCH2CH2OCH3, 예를 들어 PEG 유도체)를 포함할 수 있다.
"데옥시" 변형은 수소(즉, 데옥시리보스 당, 예를 들어 부분적으로 ds RNA의 돌출된 부분에서); 할로(예를 들어 브로모, 클로로, 플루오로, 또는 요오도); 아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디아킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같을 수 있음), -NHC(O)R(여기서, R은, 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 시아노; 메르캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함할 수 있으며, 이는 예를 들어 본원에 기재된 아미노로 선택적으로 치환될 수 있다.
당기는 또한 리보스 내의 상응하는 탄소와 반대의 입체화학 배열을 보유하는 하나 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서, 변형된 핵산은, 당으로서 예를 들어 아라비노스를 함유하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 "단량체"는 당의 Γ 위치에서 알파 연결, 예를 들어 알파-뉴클레오시드를 가질 수 있다. 변형된 핵산은 또한, C- 에서 핵염기가 결여된, "무염기성" 당을 포함할 수 있다. 이들 무염기성 당은 또한 구성 요소 당 원자 중 하나 이상에서 추가로 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 L 형태인 하나 이상의 당, 예를 들어 L-뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
일반적으로, RNA는 당기 리보스를 포함하며, 이는 산소를 갖는 5-원 고리이다. 예시적인 변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드는 비제한적으로, 리보스 중 산소의(예를 들어 황(S), 셀레늄(Se), 또는 예를 들어 메틸렌 또는 에틸렌과 같은 알킬렌으로의) 대체; 이중 결합의 첨가(예를 들어 리보스를 사이클로펜테닐 또는 사이클로헥세닐로 대체); 리보스의 고리 축소(예를 들어 사이클로부탄 또는 옥세탄의 4-원 고리 형성); 리보스의 고리 확장(예를 들어 안하이드로헥시톨, 알트리톨, 만니톨, 사이클로헥사닐, 사이클로헥세닐, 및 포스포르아미데이트 백본을 또한 갖는 모르폴리노와 같은, 예를 들어 추가적인 탄소 또는 헤테로원자를 갖는 6원- 또는 7-원 고리 형성)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 다중사이클릭 형태(예를 들어 트리사이클로; 및 "비잠금(unlocked)" 형태, 예를 들어 글리콜 핵산(GNA)(예를 들어 R-GNA 또는 S-GNA, 여기서 리보스는 포스포디에스테르 결합에 부착된 글리콜 단위로 대체됨), 트레오스 핵산(TNA, 여기서 리보스는 α-L-트레오푸라노실-(3'→2')로 대체됨)을 포함할 수 있다.
핵염기 상의 변형
변형된 핵산으로 혼입될 수 있는, 본원에 기재된 변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드는, 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 핵염기의 예에는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 및 우라실(U)이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 핵염기는 변형되거나 완전히 대체되어 변형된 핵산으로 혼입될 수 있는 변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 뉴클레오티드의 핵염기는 퓨린, 피리미딘, 퓨린 또는 피리미딘 유사체로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는, 예를 들어 자연적-발생 및 합성 염기 유도체를 포함할 수 있다.
우라실
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 우라실이다. 변형된 우라실을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드는 비제한적으로, 슈도우리딘(ψ), 피리딘-4-온 리보뉴클레오시드, 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘(s2U), 4-티오-우리딘(s4U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘(ho5U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘(예를 들어 5-요오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 3-메틸-우리딘(m3U), 5-메톡시-우리딘(mo5U), 우리딘 5-옥시아세트산(cmo5U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르(mcmo^U), 5-카르복시메틸-우리딘(cm5U), 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘(chm5U), 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스테르(mchm5U), 5-메톡시카르보닐메틸-우리딘(mcm5U), 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오-우리딘(mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘(nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-우리딘(mnm5U), 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘(mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘(mnm5se2U), 5-카르바모일메틸-우리딘(ncm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-우리딘(cmnm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘(cmnm ＼s2U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-우리딘(xcm5U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘(Trn5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘, 5-메틸-우리딘(m5U, 즉 핵염기 데옥시티민을 갖는), 1-메틸-슈도우리딘(ιτι'ψ), 5-메틸-2-티오-우리딘(m5s2U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘(m' s ＼|/), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘(m'V), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘 (D), 디하이드로슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 5-메틸-디하이드로우리딘(m5D), 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘(acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필 슈도우리딘 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘(inm5U), 5-(이소펜테닐아미노메티])-2-티오-우리딘(inm5s2U), a-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘(Um), 5,2'-O-디메틸-우리딘(m5Um), 2'-O-메틸-슈도우리딘(ψπι), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘(s2Um), 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘(mcm5Um), 5-카르바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘(ncm5Um), 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘(cmnm5Um), 3,2'-O-디메틸-우리딘(m3Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘(inm5Um), 1-티오-우리딘, 디옥시티미딘, 2'-F-아라-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-아라-우리딘, 5-(2-카르보메톡시비닐) 우리딘, 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)우리딘, 피라졸로[3,4-d]피리미딘, 잔틴, 및 하이포잔틴을 포함한다.
시토신
구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 시토신이다. 변형된 시토신을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드는 비제한적으로, 5-아자-시티딘, 6-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘(m3C), N4-아세틸-시티딘(act), 5-포르밀-시티딘(f5C), N4-메틸-시티딘(m4C), 5-메틸-시티딘(m5C), 5-할로-시티딘(예를 들어 5-요오도-시티딘), 5-하이드록시메틸-시티딘(hm5C), 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘(s2C), 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 제불라린, 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘, 리시딘(k2C), a-티오-시티딘, 2'-O-메틸-시티딘(Cm), 5,2'-O-디메틸-시티딘(m5Cm), N4-아세틸-2'-O-메틸-시티딘(ac4Cm), N4,2'-O-디메틸-시티딘(m4Cm), 5-포르밀-2'-O-메틸-시티딘(f5Cm), N4,N4,2'-O-트리메틸-시티딘(m4 2Cm), 1-티오-시티딘, 2'-F-아라-시티딘, 2'-F-시티딘, 및 2'-OH-아라-시티딘을 포함한다.
아데닌
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 아데닌이다. 변형된 아데닌을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드는, 비제한적으로, 2-아미노-퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노-6-할로-퓨린(예를 들어 2-아미노-6-클로로-퓨린), 6-할로-퓨린(예를 들어 6-클로로-퓨린), 2-아미노-6-메틸-퓨린, 8-아지도-아데노신, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노-퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노-퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-아데노신(m1A), 2-메틸-아데닌(m A), N6-메틸-아데노신(m6A), 2-메틸티오-N6-메틸-아데노신(ms2m6A), N6-이소펜테닐-아데노신(i6A), 2-메틸티오-N6-이소펜테닐-아데노신(ms2i6A), N6-(cis-하이드록시이소펜테닐)아데노신(io6A), 2-메틸티오-N6-(cis-하이드록시이소펜테닐)아데노신(ms2io6A), N6-글리시닐카르바모일-아데노신(g6A), N6-트레오닐카르바모일-아데노신(t6A), N6-메틸-N6-트레오닐카르바모일-아데노신(m6t6A), 2-메틸티오-N6-트레오닐카르바모일-아데노신(ms2g6A), N6,N6-디메틸-아데노신(m6 2A), N6-하이드록시노르발릴카르바모일-아데노신(hn6A), 2-메틸티오-N6-하이드록시노르발릴카르바모일-아데노신(ms2hn6A), N6-아세틸-아데노신(ac6A), 7-메틸-아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 2-메톡시-아데닌, a-티오-아데노신, 2'-O-메틸-아데노신(Am), N6,2'-O-디메틸-아데노신(m5Am), N6-메틸-2'-데옥시아데노신, N6,N6,2'-O-트리메틸-아데노신(m6 2Am), 1,2'-O-디메틸-아데노신(m1Am), 2'-O-리보실아데노신(포스페이트)(Ar(p)), 2-아미노-N6-메틸-퓨린, 1-티오-아데노신, 8-아지도-아데노신, 2'-F-아라-아데노신, 2'-F-아데노신, 2'-OH-아라-아데노신, 및 N6-(19-아미노-펜타옥사논아데실)-아데노신을 포함한다.
구아닌
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 구아닌이다. 변형된 구아닌을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드는 비제한적으로, 이노신 (i), 1-메틸-이노신(m 'l), 와이오신(imG), 메틸와이오신(mimG), 4-데메틸-와이오신(imG-14), 이소와이오신(imG2), 와이부토신(yW), 퍼록시와이부토신(o2yW), 하이드록시와이부토신(OHyW), 저변형 하이드록시와이부토신(OHyW*), 7-데아자-구아노신, 퀘우오신(Q), 에폭시퀘우오신(oQ), 갈락토실-퀘우오신(galQ), 만노실-퀘우오신(manQ), 7-시아노-7-데아자-구아노신(preQ0), 7-아미노메틸-7-데아자-구아노신(preQi), 아르캐오신(G+), 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신(m7G), 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸-이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸-구아노신(m'G), N2-메틸-구아노신(m2G), N2,N2-디메틸-구아노신(m2 2G), N2,7-디메틸-구아노신(m2,7G), N2, N2,7-디메틸-구아노신(m2,2,7G), 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메트 티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신, a-티오-구아노신, 2'-O-메틸-구아노신(Gm), N2-메틸-2'-O-메틸-구아노신(m3/4m), N2,N2-디메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2 2Gm), 1-메틸-2'-O-메틸-구아노신(m'Gm), N2,7-디메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2,7Gm), 2'-O-메틸-이노신(Im), 1,2'-O-디메틸-이노신(m'Im), O6-페닐-2'-디옥시이노신, 2'-O-리보실구아노신(포스페이트)(Gr(p)), 1-티오-구아노신, O6-메틸] -구아노신, O6-메티]-2'-데옥시구아노신, 2'-F-아라-구아노신, 및 2'-F-구아노신을 포함한다.
변형된 gRNA
일부 구현예에서, 변형된 핵산은 변형된 gRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 3' 말단에서 변형될 수 있다. 이 구현예에서, gRNA는 3' 말단 U 리보스에서 변형될 수 있다. 예를 들어 U 리보스의 2개의 말단 하이드록실기는 알데히드기로 산화되고 리보스 고리의 개구가 수반되어 변형된 뉴클레오시드를 제공할 수 있으며, 여기서, U는 변형되지 않은 또는 변형된 우리딘일 수 있다.
또다른 구현예에서, 3' 말단 U는 2'3' 사이클릭 포스페이트로 변형될 수 있으며, 여기서, U는 변형되지 않은 또는 변형된 우리딘일 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA 분자는, 예를 들어 본원에 기재된 변형된 뉴클레오티드 중 하나 이상을 혼입함으로써, 분해에 대하여 안정화될 수 있는 3' 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 이 구현예에서, 예를 들어 우리딘은 변형된 우리딘, 예를 들어 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 및 5-브로모 우리딘, 또는 본원에 기재된 변형된 우리딘 중 임의의 것으로 대체될 수 있으며; 아데노신 및 구아노신은 변형된 아데노신 및 구아노신, 예를 들어 8-위치에서의 변형을 갖는 것, 예를 들어 8-브로모 구아노신, 또는 본원에 기재된 변형된 아데노신 또는 구아노신 중 임의의 것으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 데아자 뉴클레오티드, 예를 들어 7-데아자-아데노신은 gRNA로 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, O- 및 N-알킬화 뉴클레오티드, 예를 들어 N6-메틸 안 데노신은 gRNA로 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 2' OH-기가 H, -OR, -R(여기서, R은 예를 들어 메틸, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 할로, -SH, -SR(여기서, R은 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 아미노(여기서, 아미노는 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); 또는 시아노(-CN)로부터 선택되는 기로 대체되는, 당-변형 리보뉴클레오티드가 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, 포스페이트 백본은 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 포스포티오에이트기로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA의 돌출부 영역의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 변형된 2'-당 변형된, 예를 들어 2-F 2'-O-메틸, 티미딘(T), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘(Teo), 2'-O-메톡시에틸아데노신(Aeo), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸시티딘(m5Ceo), 및 이의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 변형된 또는 변형되지 않은 뉴클레오티드일 수 있다.
구현예에서, RNA 분자, 예를 들어 gRNA 분자의 단일 가닥 돌출부 내의 뉴클레오티드의 하나 이상 또는 모두는 데옥시뉴클레오티드이다.
약학적 조성물
본 발명의 약학적 조성물은 본원에 기재된 gRNA 분자, 예를 들어 본원에 기재된 복수의 gRNA 분자, 또는 본원에 기재된 하나 이상의 gRNA 분자로 변형된 하나 이상의 세포를 포함하는 세포(예를 들어 세포 집단, 예를 들어 조혈 줄기 세포, 예를 들어 CD34+ 세포의 집단)를 약학적으로 또는 생리적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 중성 완충 식염수, 포스페이트 완충 식염수 등의 완충제; 글루코스, 만노스, 수 크로스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 글리신과 같은 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트화제; 보조제(예를 들어 알루미늄 하이드록사이드); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 일 양태에서 정맥내 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료될(또는 예방될) 질병에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있지만, 투여량 및 빈도는 환자의 질환, 및 환자 질병의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 예를 들어 내독소, 미코플라스마, 마우스 항체, 혼합 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 원하지 않는 CRISPR 시스템 성분, 박테리아 및 균류로 구성된 군으로부터 선택되는, 오염 물질이 실질적으로 없고, 예를 들어 검출 가능한 수준의 오염 물질이 없다. 일 구현예에서, 박테리아는 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 및 스트렙토코커스 피오게네스 그룹 A(Streptococcus pyogenes group A)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나이다.
대상체 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 삽입 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 환자에게 경동맥으로, 피하, 피내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 정맥내(i.v.) 주사에 의해 또는 복강내 투여될 수 있다. 일 양태에서, 본 발명의 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 일 양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여된다.
환자에게 투여되는 상기 치료의 투여량은 치료되는 질환의 정확한 본질 및 치료의 수용자에 따라 다를 것이다. 인간 투여를 위한 투여량의 크기 조정은 당분야에서 허용되는 관행에 따라 수행될 수 있다.
세포
본 발명은 또한 본 발명의 gRNA 분자 또는 상기 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포에 관한 것이다.
양태에서, 세포는 본원에 기재된 과정에 의해 제조된 세포이다.
구현예에서, 세포는 조혈 줄기 세포(예를 들어 조혈 줄기 및 전구 세포; HSPC), 예를 들어 CD34+ 줄기 세포이다. 구현예에서, 세포는 CD34+/CD90+ 줄기 세포이다. 구현예에서, 세포는 CD34+/CD90- 줄기 세포이다. 구현예에서, 세포는 인간 조혈 줄기 세포이다. 구현예에서, 세포는 자가 유래이다. 구현예에서, 세포는 동종이계이다.
구현예에서, 세포는 골수, 예를 들어 자가 유래 골수에서 유래된다. 구현예에서, 세포는 말초 혈액, 예를 들어 동원된 말초 혈액, 예를 들어 자가 유래의 동원된 말초 혈액에서 유래된다. 동원 말초 혈액을 사용하는 구현예에서, 세포는 동원 제제를 투여한 환자로부터 단리된다. 구현예에서, 동원 제제는 G-CSF이다. 구현예에서, 동원 제제는 Plerixafor®(AMD3100)이다. 구현예에서, 세포는 제대혈, 예를 들어 동종이계의 제대혈에서 유래된다.
구현예에서, 세포는 포유동물이다. 구현예에서, 세포는 인간이다.
양태에서, 본 발명은, 예를 들어 본원에 기재된, CRISPR 시스템의 부분으로서, 상기 세포 내로 도입된, 예를 들어 본원에 기재된, gRNA 분자 또는 gRNA 분자들에 대한 상보성을 갖는 핵산 서열에 또는 그 근처에(예를 들어 그의 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 뉴클레오티드 이내에) 변형 또는 변경, 예를 들어 삽입결실을 포함하는 세포를 제공한다. 구현예에서, 세포는 CD34+ 세포이다. 구현예에서, 변경된 또는 변형된 세포, 예를 들어 CD34+ 세포는 다양한 계통의 세포로 분화하는 능력을 유지하며, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포로 분화하는 능력을 유지한다. 구현예에서, 변경된 또는 변형된 세포, 예를 들어 CD34+ 세포는, 배양 중에, 예를 들어 줄기 세포 확장제, 예를 들어 화합물 4를 포함하는 배양 중에, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10회 이상의 배가를 겪었거나 겪을 수 있다. 구현예에서, 변경된 또는 변형된 세포, 예를 들어 CD34+ 세포는 배양 중에, 예를 들어 줄기 세포 확장제 분자, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 화합물 4를 포함하는 배양 중에, 적어도 5, 예를 들어 약 5회 배가를 겪었거나 겪을 수 있다. 구현예에서, 변경된 또는 변형된 세포, 예를 들어 CD34+ 세포는, 변형되지 않거나 변경되지 않은 유사한 세포에 비해, 증가된 태아 헤모글로빈 수준(예를 들어 발현 수준 및/또는 단백질 수준)을 나타내는, 예를 들어 태아 헤모글로빈 단백질 수준에서 적어도 20%의 증가를 나타내는 세포, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포, 예를 들어 적혈구를 나타내거나 및/또는 이로 분화될 수 있다. 구현예에서, 변경된 또는 변형된 세포, 예를 들어 CD34+ 세포는, 변형되지 않거나 변경되지 않은 유사한 세포에 비해, 증가된 태아 헤모글로빈 수준(예를 들어 발현 수준 및/또는 단백질 수준)을 나타내며, 예를 들어 적어도 6 피코그램, 예를 들어 적어도 7 피코그램, 적어도 8 피코그램, 적어도 9 피코그램, 또는 적어도 10 피코그램의 태아 헤모글로빈을 생산하는 세포, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포, 예를 들어 적혈구를 나타내거나 및/또는 이로 분화될 수 있다. 구현예에서, 변경된 또는 변형된 세포, 예를 들어 CD34+ 세포는, 변형되지 않거나 변경되지 않은 유사한 세포에 비해, 증가된 태아 헤모글로빈 수준(예를 들어 발현 수준 및/또는 단백질 수준)을 나타내며, 예를 들어 약 6 내지 약 12, 약 6 내지 약 7, 약 7 내지 약 8, 약 8 내지 약 9, 약 9 내지 약 10, 약 10 내지 약 11 또는 약 11 내지 약 12 피코그램의 태아 헤모글로빈을 생산하는 세포, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포, 예를 들어 적혈구를 나타내거나 및/또는 이로 분화될 수 있다.
양태에서, 본 발명은, 예를 들어 본원에 기재된, CRISPR 시스템의 부분으로서, 상기 세포 내로 도입된, 예를 들어 본원에 기재된, gRNA 분자 또는 gRNA 분자들에 대한 상보성을 갖는 핵산 서열에 또는 그 근처에(예를 들어 그의 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 뉴클레오티드 이내에) 변형 또는 변경, 예를 들어 삽입결실을 갖는 세포를 포함하는 세포 집단을 제공한다. 구현예에서, 예를 들어 본 발명의 gRNA 및/또는 CRISPR 시스템의 도입 후 2 일차에, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 NGS에 의해 측정하여, 집단의 세포의 적어도 50%, 예를 들어 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%가 변형 또는 변경을 갖는다(예를 들어 적어도 하나의 변형 또는 변경을 갖는다). 구현예에서, 예를 들어 본 발명의 gRNA 및/또는 CRISPR 시스템의 도입 후 2 일차에, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 NGS에 의해 측정하여, 집단의 세포의 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%가 변형 또는 변경을 갖는다(예를 들어 적어도 하나의 변형 또는 변경을 갖는다). 구현예에서, 세포 집단은 CD34+ 세포를 포함하며, 예를 들어 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98%의 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 변경된 또는 변형된 세포, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함하는 세포 집단은 다양한 계통의 세포를 생산, 예를 들어 이로 분화하는 능력을 유지하고, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포를 생산, 예를 들어 이로 분화하는 능력을 유지한다. 구현예에서, 세포 집단, 예를 들어 CD34+ 세포의 집단은 배양 중에, 예를 들어 줄기 세포 확장제, 예를 들어 화합물 4를 포함하는 배양 중에, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10회 이상의 집단 배가를 겪었거나 겪을 수 있다. 구현예에서, 변경된 또는 변형된 세포의 집단, 예를 들어 CD34+ 세포의 집단은 배양 중에, 예를 들어 줄기 세포 확장제 분자, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 화합물 4를 포함하는 배양 중에, 적어도 5, 예를 들어 약 5회 집단 배가를 겪었거나 겪을 수 있다. 구현예에서, 변경된 또는 변형된 세포, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함하는 세포 집단은, 변형되지 않거나 변경되지 않은 유사한 세포에 비해, 증가된 태아 헤모글로빈 수준(예를 들어 발현 수준 및/또는 단백질 수준)을 나타내는, 예를 들어 태아 헤모글로빈 단백질 수준에서 적어도 20%의 증가를 나타내는 세포 집단, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포 집단, 예를 들어 적혈구 집단을 나타내거나 및/또는 이로 분화될 수 있다. 구현예에서, 변경된 또는 변형된 세포, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함하는 세포 집단은, 변형되지 않거나 변경되지 않은 유사한 세포에 비해, 증가된 태아 헤모글로빈 수준(예를 들어 발현 수준 및/또는 단백질 수준)을 나타내며, 예를 들어 세포 당 적어도 6 피코그램, 예를 들어 적어도 7 피코그램, 적어도 8 피코그램, 적어도 9 피코그램, 또는 적어도 10 피코그램의 태아 헤모글로빈을 생산하는 세포를 포함하는, 세포 집단, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포 집단, 예를 들어 적혈구 집단을 나타내거나 및/또는 이로 분화될 수 있다. 구현예에서, 변경된 또는 변형된 세포, 예를 들어 CD34+ 세포의 집단은, 변형되지 않거나 변경되지 않은 유사한 세포에 비해, 증가된 태아 헤모글로빈 수준(예를 들어 발현 수준 및/또는 단백질 수준)을 나타내며, 예를 들어 세포 당 약 6 내지 약 12, 약 6 내지 약 7, 약 7 내지 약 8, 약 8 내지 약 9, 약 9 내지 약 10, 약 10 내지 약 11 또는 약 11 내지 약 12 피코그램의 태아 헤모글로빈을 생산하는 세포를 포함하는, 세포 집단, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포 집단, 예를 들어 적혈구 집단을 나타내거나 및/또는 이로 분화될 수 있다.
구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 적어도 약 1 e3 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 적어도 약 1 e4 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 적어도 약 1 e5 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 적어도 약 1 e6 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 적어도 약 1 e7 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 적어도 약 1 e8 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 적어도 약 1 e9 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 적어도 약 1 e10 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 적어도 약 1 e11 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 적어도 약 1 e12 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 1 e13 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 1 e6 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 2 e6 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 3 e6 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 4 e6 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 5 e6 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 6 e6 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 7 e6 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 8 e6 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 9 e6 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 1 e7 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 2 e7 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 3 e7 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 4 e7 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 5 e7 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 6 e7 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 7 e7 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 8 e7 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 9 e7 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 1 e8 세포를 포함한다. 전술한 구현예 중 임의의 것에서, 세포 집단은 적어도 약 50%(예를 들어 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%)의 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함할 수 있다. 전술한 구현예 중 임의의 것에서, 세포 집단은 약 60%의 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함할 수 있다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단은 약 3 e7 세포를 포함하고 약 2 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다.
구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 1 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 1.5 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 2 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 3 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 4 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 5 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 6 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 7 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 8 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 9 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 1 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 2 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 3 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 4 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 5 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 6 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 7 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 8 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 9 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 1 e8 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 2 e8 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 3 e8 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 4 e8 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 약 5 e8 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다.
구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 1 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 1.5 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 2 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 3 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 4 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 5 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 6 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 7 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 8 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 9 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 1 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 2 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 3 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 4 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 5 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 6 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 7 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 8 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 9 e7 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 1 e8 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 2 e8 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 3 e8 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 4 e8 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 5 e8 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다.
구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 약 2 e6 내지 약 10 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다. 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 세포 집단은 투여될 환자의 체중 킬로그램 당 2 e6 내지 10 e6 HSPC, 예를 들어 CD34+ 세포를 포함한다.
본 발명의 세포는 본 발명의 gRNA 분자 또는 상기 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 본 발명의 Cas9 분자 또는 상기 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 구현예에서, 본 발명의 세포는 본 발명의 gRNA 분자 및 본 발명의 Cas9 분자를 포함하는 리보핵산 단백질(RNP) 복합체를 포함할 수 있다.
본 발명의 세포는 바람직하게 생체외에서 본 발명의 gRNA 분자를 포함하도록, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해, 예를 들어 전기천공에 의해, 변형된다.
본 발명의 세포는 본 발명의 gRNA를 포함하는 CRISPR 시스템의 도입에 의해 하나 이상의 유전자의 발현이 변경, 예를 들어 감소 또는 저해된 세포를 포함한다. 예를 들어 본 발명의 세포는 변형되지 않은 세포에 비해 감소된 BCL11a 발현 수준을 가질 수 있다. 또다른 예로서, 본 발명의 세포는 변형되지 않은 세포에 비해 증가된 태아 헤모글로빈 발현 수준을 가질 수 있다. 또다른 예로서, 본 발명의 세포는 변형되지 않은 세포에 비해 감소된 베타 글로빈 발현 수준을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 세포는 변형되지 않은 세포로부터 분화된 세포에 비해 감소된 BCL11a 발현 수준을 갖는 또다른 유형의 세포, 예를 들어 적혈구가 생기게 하고, 예를 들어 이로 분화할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 세포는 변형되지 않은 세포로부터 분화된 세포에 비해 증가된 태아 헤모글로빈 발현 수준을 갖는 또다른 유형의 세포, 예를 들어 적혈구가 생기게 하고, 예를 들어 이로 분화할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 세포는 변형되지 않은 세포로부터 분화된 세포에 비해 감소된 베타 글로빈 발현 수준을 갖는 또다른 유형의 세포, 예를 들어 적혈구가 생기게 하고, 예를 들어 이로 분화할 수 있다.
본 발명의 세포는 본 발명의 gRNA를 포함하는 CRISPR 시스템의 도입에 의해 하나 이상의 유전자의 발현이 변경, 예를 들어 감소 또는 저해된 세포를 포함한다. 예를 들어 본 발명의 세포는 변형되지 않은 세포에 비해 감소된 헤모글로빈 베타, 예를 들어 돌연변이된 또는 야생형의 헤모글로빈 베타 발현 수준을 가질 수 있다. 또다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 gRNA를 포함하는 CRISPR 시스템이 도입된 세포에서 유래된, 예를 들어 분화된 세포를 제공한다. 이러한 양태에서, 본 발명의 gRNA를 포함하는 CRISPR 시스템이 도입된 세포는 감소된 수준의 헤모글로빈 베타, 예를 들어 돌연변이된 또는 야생형의 헤모글로빈 베타를 나타내지 않을 수 있지만, 상기 세포에서 유래된, 예를 들어 분화된 세포는 감소된 수준의 헤모글로빈 베타, 예를 들어 돌연변이된 또는 야생형의 헤모글로빈 베타를 나타낸다. 구현예에서, 유래, 예를 들어 분화는 생체내(예를 들어 환자에서) 달성된다. 구현예에서, 본 발명의 gRNA를 포함하는 CRISPR 시스템이 도입된 세포는 CD34+ 세포이며, 이로부터 유래, 예를 들어 분화된 세포는 적혈구계 계통, 예를 들어 적혈구이다.
본 발명의 세포는 본 발명의 gRNA를 포함하는 CRISPR 시스템의 도입에 의해 하나 이상의 유전자의 발현이 변경, 예를 들어 증가 또는 촉진된 세포를 포함한다. 예를 들어 본 발명의 세포는 변형되지 않은 세포에 비해 증가된 태아 헤모글로빈 발현 수준을 가질 수 있다. 또다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 gRNA를 포함하는 CRISPR 시스템이 도입된 세포에서 유래된, 예를 들어 분화된 세포를 제공한다. 이러한 양태에서, 본 발명의 gRNA를 포함하는 CRISPR 시스템이 도입된 세포는 증가된 수준의 태아 헤모글로빈을 나타내지 않을 수 있지만, 상기 세포에서 유래된, 예를 들어 분화된 세포는 증가된 수준의 태아 헤모글로빈을 나타낸다. 구현예에서, 유래, 예를 들어 분화는 생체내(예를 들어 환자에서) 달성된다. 구현예에서, 본 발명의 gRNA를 포함하는 CRISPR 시스템이 도입된 세포는 CD34+ 세포이며, 이로부터 유래, 예를 들어 분화된 세포는 적혈구계 계통, 예를 들어 적혈구이다.
또다른 양태에서, 본 발명은, 상기 세포 내로 도입된 gRNA 분자 또는 gRNA 분자들에 대한 상보성을 갖는 핵산 서열에(예를 들어 서열 내에) 또는 그 근처에(예를 들어 그의 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 뉴클레오티드 내에) 삽입결실을 갖는 세포에 관한 것이다. 구현예에서, 삽입결실은 프레임쉬프트 삽입결실이다. 구현예에서, 삽입결실은 표 15에 나열된 삽입결실이다. 구현예에서, 삽입결실은 표 26, 표 27 또는 표 37에 나열된 삽입결실이다. 구현예에서, 본 발명은 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단에 관한 것되며, 세포 집단은 표 15에 나열된 삽입결실을 갖는 세포를 포함한다. 구현예에서, 본 발명은 예를 들어 본원에 기재된 세포 집단에 관한 것되며, 세포 집단은 표 26, 표 27 또는 표 37에 나열된 삽입결실을 갖는 세포를 포함한다.
양태에서, 본 발명은, 예를 들어 본원에 기재된, 상기 세포 내로 도입된, 예를 들어 본원에 기재된, gRNA 분자 또는 gRNA 분자들에 대한 상보성을 갖는 핵산 서열에 또는 그 근처에(예를 들어 그의 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 뉴클레오티드 내에), 예를 들어 본원에 기재된, 삽입결실, 예를 들어 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37에 기재된 삽입결실 또는 삽입결실 패턴을 포함하는 세포를 포함하는 세포 집단, 예를 들어 HSPC 집단에 관한 것이다. 구현예에서, 삽입결실은 프레임쉬프트 삽입결실이다. 구현예에서, 집단의 세포의 20% 내지 100%는 상기 삽입결실 또는 삽입결실들을 포함한다. 구현예에서, 집단의 세포의 30% 내지 100%는 상기 삽입결실 또는 삽입결실들을 포함한다. 구현예에서, 집단의 세포의 40% 내지 100%는 상기 삽입결실 또는 삽입결실들을 포함한다. 구현예에서, 집단의 세포의 50% 내지 100%는 상기 삽입결실 또는 삽입결실들을 포함한다. 구현예에서, 집단의 세포의 60% 내지 100%는 상기 삽입결실 또는 삽입결실들을 포함한다. 구현예에서, 집단의 세포의 70% 내지 100%는 상기 삽입결실 또는 삽입결실들을 포함한다. 구현예에서, 집단의 세포의 80% 내지 100%는 상기 삽입결실 또는 삽입결실들을 포함한다. 구현예에서, 집단의 세포의 90% 내지 100%는 상기 삽입결실 또는 삽입결실들을 포함한다. 구현예에서, 세포 집단은 다수의 세포 유형으로 분화하는 능력을 보유하고, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포, 예를 들어 적혈구로 분화하는 능력을 유지한다. 구현예에서, 편집되고 분화된 세포(예를 들어 적혈구)는 증식하는 능력, 예를 들어 실시예에 기재된, 적혈구계 분화 배지(EDM)에서 7 일 후, 예를 들어 적어도 5 배, 적어도 10 배, 적어도 15 배, 적어도 20 배, 적어도 25 배, 적어도 30 배, 적어도 35 배, 적어도 40 배, 적어도 45 배, 적어도 50 배 이상 증식, 및/또는 예를 들어 실시예에 기재된, 적혈구계 분화 배지(EDM)에서 21 일 후, 적어도 30 배, 적어도 35 배, 적어도 40 배, 적어도 45 배, 적어도 50 배, 적어도 55 배, 적어도 60 배, 적어도 65 배, 적어도 70 배, 적어도 75 배, 적어도 80 배, 적어도 85 배, 적어도 90 배, 적어도 95 배, 적어도 100 배, 적어도 110 배, 적어도 120 배, 적어도 130 배, 적어도 140 배, 적어도 150 배, 적어도 200 배, 적어도 300 배, 적어도 400 배, 적어도 500 배, 적어도 600 배, 적어도 700 배, 적어도 800 배, 적어도 900 배, 적어도 1000 배, 적어도 1100 배, 적어도 1200 배, 적어도 1300 배, 적어도 1400 배, 적어도 1500 배 이상 증식하는 능력을 유지한다.
구현예에서, 본 발명은 집단의 세포의 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 98%가, 예를 들어 본원에 기재된, 삽입결실(이론에 얽매이지 않고, 본원에 기재된 gRNA 분자 또는 CRISPR 시스템의 세포 집단으로의 도입은 상기 집단에서 삽입결실 패턴을 생산하고, 따라서, 삽입결실을 포함하는 집단의 각 세포는 동일한 삽입결실을 나타내지 않을 수 있다고 여겨진다)을 본원에 기재된 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 부위에 또는 그 근처에 포함하며; 상기 세포는 적혈구계 계통의 세포, 예를 들어 적혈구로 분화하는 능력을 유지하고; 및/또는 세포 집단으로부터 분화된 상기 세포는 유사한 변형되지 않은 세포 집단으로부터 분화된 세포에 비해 증가된 수준의 태아 헤모글로빈을 갖는(예를 들어 집단이 더 높은 % F 세포를 가짐), 세포, 예를 들어 CD34+ 세포 집단을 제공한다. 구현예에서, 세포 집단은 예를 들어 화합물 4를 포함하는 배지에서, 생체외에서 적어도 5 배 확장을 겪었다.
구현예에서, 삽입결실은 약 50 뉴클레오티드 미만, 예를 들어 약 45 미만, 약 40 미만, 약 35 미만, 약 30 미만 또는 약 25 뉴클레오티드 미만이다. 구현예에서, 삽입결실은 약 25 뉴클레오티드 미만이다. 구현예에서, 삽입결실은 약 20 뉴클레오티드 미만이다. 구현예에서, 삽입결실은 약 15 뉴클레오티드 미만이다. 구현예에서, 삽입결실은 약 10 뉴클레오티드 미만이다. 구현예에서, 삽입결실은 약 9 뉴클레오티드 미만이다. 구현예에서, 삽입결실은 약 9 뉴클레오티드 미만이다. 구현예에서, 삽입결실은 약 7 뉴클레오티드 미만이다. 구현예에서, 삽입결실은 약 6 뉴클레오티드 미만이다. 구현예에서, 삽입결실은 약 5 뉴클레오티드 미만이다. 구현예에서, 삽입결실은 약 4 뉴클레오티드 미만이다. 구현예에서, 삽입결실은 약 3 뉴클레오티드 미만이다. 구현예에서, 삽입결실은 약 2 뉴클레오티드 미만이다. 전술한 구현예 중 임의의 것에서, 삽입결실은 적어도 1 뉴클레오티드이다. 구현예에서, 삽입결실은 1 뉴클레오티드이다.
양태에서, 본 발명은 예를 들어 본원에 기재된, 변형된 HSPC 또는 상기 HSPC로부터 분화된(예를 들어 생체외 또는 환자 내에서 분화된) 적혈구계 세포의 집단을 제공하며, 여기서 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 세포가 F 세포이다. 구현예에서, 세포 집단은 상기 세포 내로 도입된, 예를 들어 본원에 기재된, gRNA 분자 또는 gRNA 분자들을 갖지 않은 유사한 세포 집단보다 높은 퍼센트의 F 세포를 함유한다(예를 들어 생체내에서, 함유하는 적혈구 집단으로 분화할 수 있다). 구현예에서, 세포 집단은 상기 세포 내로 도입된, 예를 들어 본원에 기재된, gRNA 분자 또는 gRNA 분자들을 갖지 않은 유사한 세포 집단보다 F 세포에 있어서 적어도 20% 증가, 예를 들어 적어도 21% 증가, 적어도 22% 증가, 적어도 23% 증가, 적어도 24% 증가, 적어도 25% 증가, 적어도 26% 증가, 적어도 27% 증가, 적어도 28% 증가, 또는 적어도 29% 증가를 갖는다(예를 들어 생체내에서, 갖는 적혈구 집단으로 분화할 수 있다). 구현예에서, 세포 집단은 상기 세포 내로 도입된, 예를 들어 본원에 기재된, gRNA 분자 또는 gRNA 분자들을 갖지 않은 유사한 세포 집단보다 F 세포에 있어서 적어도 30% 증가, 예를 들어 적어도 35% 증가, 적어도 40% 증가, 적어도 45% 증가, 적어도 50% 증가, 적어도 55% 증가, 적어도 60% 증가, 적어도 65% 증가, 적어도 70% 증가, 적어도 75% 증가, 적어도 80% 증가, 적어도 85% 증가, 적어도 90% 증가 또는 적어도 95% 증가를 갖는다(예를 들어 생체내에서, 갖는 적혈구 집단으로 분화할 수 있다). 구현예에서, 세포 집단은 상기 세포 내로 도입된, 예를 들어 본원에 기재된, gRNA 분자 또는 gRNA 분자들을 갖지 않은 유사한 세포 집단보다 F 세포에 있어서10 내지 90%, 20% 내지 80%, 20% 내지 70%, 20% 내지 60%, 20% 내지 50%, 20% 내지 40%, 20% 내지 30%, 25% 내지 80%, 25% 내지 70%, 25% 내지 60%, 25% 내지 50%, 25% 내지 40%, 25% 내지 35%, 25% 내지 30%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 30% 내지 50%, 30% 내지 40% 또는 30% 내지 35% 증가를 갖는다(또는 예를 들어 생체내에서, 이와 같은 증가를 갖는 적혈구 집단으로 분화할 수 있다).구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 세포 집단은, 예를 들어 치료적 유효량으로 환자로 도입될 때, 이를 필요로 하는 환자에서, 예를 들어 본원에 기재된, 혈색소병증, 예를 들어 겸상 적혈구 질병 및/또는 베타 탈라세미아를 치료하기에 충분한 수, 또는 세포 및/또는 % F 세포에서의 충분한 증가를 포함한다. 구현예에서, F 세포에서의 증가는 예를 들어 본원에 기재된, 적혈구계 분화 검정에서 측정된 것과 같다.
본원에 기재된 구현예 및 양태 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명은 세포 당 적어도 6 피코그램의 태아 헤모글로빈을 생산하는F 세포를 포함하는, 예를 들어 본원에 기재된 gRNA, 방법 및/또는 CRISPR 시스템 중 임의의 것에 의해 변형된, 세포, 예를 들어 세포 집단에 관한 것이다. 구현예에서, F 세포는 세포 당 적어도 7 피코그램의 태아 헤모글로빈을 생산한다. 구현예에서, F 세포는 세포 당 적어도 8 피코그램의 태아 헤모글로빈을 생산한다. 구현예에서, F 세포는 세포 당 적어도 9 피코그램의 태아 헤모글로빈을 생산한다. 구현예에서, F 세포는 세포 당 적어도 10 피코그램의 태아 헤모글로빈을 생산한다. 구현예에서, F 세포는 세포 당 평균 6.0과 7.0 피코그램 사이, 7.0과 8.0 피코그램 사이, 8.0과 9.0 피코그램 사이, 9.0과 10.0 피코그램 사이, 10.0과 11.0 피코그램 사이, 또는 11.0과 12.0 피코그램 사이의 태아 헤모글로빈을 생산한다.
전술한 구현예 중 임의의 것을 포함하는 구현예에서, 본 발명의 세포 및/또는 세포 집단은 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하지 않는 세포를 포함하고, 예를 들어 이로 구성된다.
치료 방법
전달 시간
구현예에서, Cas 시스템의 성분, 예를 들어 본원에 기재된 Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분 외의 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어 DNA 분자)가 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 하나 이상의 성분이 전달되는 것과 동시에 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 하나 이상의 성분이 전달되기(예를 들어 약 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 6 시간, 9 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 1 주, 2 주 또는 4 주 미만) 전 또는 후에 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 하나 이상의 성분, 예를 들어 Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분이 전달되는 것과 상이한 수단에 의해 전달된다. 핵산 분자는 본원에 기재된 전달 방법 중 임의의 것에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예를 들어 통합-결함있는 렌티바이러스에 의해 전달될 수 있고, Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분은 전기천공에 의해 전달될 수 있어, 예를 들어 핵산에 의해 야기되는 독성(예를 들어 DNA)이 감소될 수 있다. 구현예에서, 핵산 분자는 치료 단백질, 예를 들어 본원에 기재된 단백질을 인코딩한다. 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 분자, 예를 들어 본원에 기재된 RNA 분자를 인코딩한다.
성분들의 두 가지 방식 또는 차등적 전달
Cas 시스템의 성분, 예를 들어 Cas9 분자 성분 및 gRNA 분자 성분의 별도의 전달, 더욱 구체적으로, 상이한 방식에 의한 성분들의 전달은, 예를 들어 조직 특이성 및 안전성을 개선함으로써 성능을 향상시킬 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자 및 gRNA 분자는 상이한 방식(또는 때때로 본원에서 차등적 방식으로 지칭됨)에 의해 전달된다. 본원에 사용되는 상이한 또는 차등적 방식은 대상체 성분 분자, 예를 들어 Cas9 분자, gRNA 분자, 주형 핵산, 또는 페이로드에 대해 상이한 약력학적 또는 약동학적 특성을 부여하는 전달 방식을 지칭한다. 예를 들어 전달 방식은 상이한 조직 분포, 상이한 반감기, 또는 예를 들어 선택된 구획, 조직 또는 기관에서의 상이한 시간 분포를 야기할 수 있다.
일부 전달 방식, 예를 들어 자율적 복제 또는 세포 핵산 내로의 삽입에 의한, 세포 또는 세포의 자손에서 지속되는 핵산 벡터에 의한 전달은 성분의 보다 지속적인 발현 및 존재를 야기한다. 예로는 바이러스, 예를 들어 아데노 관련 바이러스 또는 렌티바이러스, 전달이 포함된다.
예로서, 성분, 예를 들어 Cas9 분자 및 gRNA 분자는 신체, 또는 특정 구획, 조직 또는 기관에서의 전달된 성분의 결과적인 반감기 또는 지속성 면에서 상이한 방식들에 의해 전달될 수 있다. 구현예에서, gRNA 분자는 이러한 방식으로 전달될 수 있다. Cas9 분자 성분은 신체 또는 특정 구획 또는 조직 또는 기관에 대한 더 적은 지속성 또는 더 적은 노출을 야기하는 방식에 의해 전달될 수 있다.
보다 일반적으로, 구현예에서, 제1 전달 방식은 제1 성분을 전달하기 위해 사용되고 제2 전달 방식은 제2 성분을 전달하기 위해 사용된다. 제1 전달 방식은 제1 약력학적 또는 약동학적 특성을 부여한다. 제1 약력학적 특성은 예를 들어 신체, 구획, 조직 또는 기관에서, 성분 또는 성분을 인코딩하는 핵산의 분포, 지속성 또는 노출일 수 있다. 제2 전달 방식은 제2 약력학적 또는 약동학적 특성을 부여한다. 제2 약력학적 특성은 예를 들어 신체, 구획, 조직 또는 기관에서, 성분 또는 성분을 인코딩하는 핵산의 분포, 지속성 또는 노출일 수 있다.
구현예에서, 제1 약력학적 또는 약동학적 특성, 예를 들어 분포, 지속성 또는 노출은 제2 약력학적 또는 약동학적 특성보다 더 제한된다.
구현예에서, 제1 전달 방식은 약력학적 또는 약동학적 특성, 예를 들어 분포, 지속성 또는 노출을 최적화, 예를 들어 최소화하기 위해 선택된다.
구현예에서, 제2 전달 방식은 약력학적 또는 약동학적 특성, 예를 들어 분포, 지속성 또는 노출을 최적화, 예를 들어 최대화하기 위해 선택된다.
구현예에서, 제1 전달 방식은 상대적으로 지속적인 요소, 예를 들어 핵산, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 또는 렌티바이러스의 사용을 포함한다. 이러한 벡터는 상대적으로 지속적이기 때문에 이들로부터 전사된 산물은 상대적으로 지속적일 것이다.
구현예에서, 제2 전달 방식은 상대적으로 일시적인 요소, 예를 들어 RNA 또는 단백질을 포함한다.
구현예에서, 제1 성분은 gRNA를 포함하고, 전달 방식은 상대적으로 지속적이며, 예를 들어 gRNA는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 또는 렌티바이러스로부터 전사된다. 이들 유전자의 전사는 유전자가 단백질 산물을 인코딩하지 않고, gR A 는 별개로 작용할 수 없기 때문에 생리적 중요성이 거의 없을 것이다. 제2 성분, Cas9 분자는 전체 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체가 반드시 짧은 시간 동안에만 존재하고 활성있도록 하기 위해, 일시적 방식으로, 예를 들어 mRNA 또는 단백질로서 전달된다.
추가적으로, 성분들은 안전성 및 조직 특이성을 향상시키기 위해 서로 보완하는 상이한 분자 형태로, 또는 상이한 전달 벡터로 전달될 수 있다.
차등 전달 방식의 사용은 성능, 안전성 및 표능을 향상할 수 있다. 예를 들어 최종적인 표적-외 변형의 가능성이 감소될 수 있다. 박테리아-유래된 Cas 효소로부터의 펩티드가 MHC 분자에 의해 세포 표면 상에 디스플레이되기 때문에, 덜 지속적인 방식에 의한 면역원성 성분, 예를 들어 Cas9 분자의 전달은 면역원성을 감소시킬 수 있다. 2-부분 전달 시스템은 이들 단점을 경감시킬 수 있다.
차등 전달 방식은 상이하지만 겹쳐지는 표적 영역에 성분을 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 활성 복합체의 형성은 표적 영역의 중첩 외부에서 최소화된다. 따라서, 구현예에서, 제1 성분, 예를 들어 gRNA 분자는 제1 공간, 예를 들어 조직, 분포를 야기하는 제1 전달 방식에 의해 전달된다. 제2 성분, 예를 들어 Cas9 분자는 제2 공간, 예를 들어 조직, 분포를 야기하는 제2 전달 방식에 의해 전달된다. 구현예에서, 제1 방식은 리포솜, 나노 입자, 예를 들어 폴리머 나노 입자, 및 핵산, 예를 들어 바이러스 벡터로부터 선택된 제1 요소를 포함한다. 제2 방식은 군으로부터 선택된 제2 요소를 포함한다. 구현예에서, 제1 전달 방식은 제1 표적화 요소, 예를 들어 세포 특이적 수용체 또는 항체를 포함하고, 제2 전달 방식은 그 요소를 포함하지 않는다. 구현예에서, 제2 전달 방식은 제2 표적화 요소, 예를 들어 제2 세포 특이적 수용체 또는 제2 항체를 포함한다.
Cas9 분자가 바이러스 전달 벡터, 리포좀 또는 폴리머 나노 입자에서 전달되는 경우, 단일 조직만을 표적화하는 것이 바람직할 수 있을 때, 다수 조직으로 전달되고 치료 활성 있을 가능성이 있다. 2-부분 전달 시스템은 이 문제를 해결하고 조직 특이성을 향상시킬 수 있다. gRNA 분자와 Cas9 분자가 구별되지만 겹치는 조직 향성을 갖는 분리된 전달 비히클 내에 패키징되는 경우, 완전히 기능적인 복합체는 두 벡터에 의해 표적화된 조직에서만 형성된다.
후보 Cas 분자, 예를 들어 Cas9 분자, 후보 gRNA 분자, 후보 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체, 및 후보 CRISPR 시스템은 당분야에 공지된 방법에 의해 또는 본원에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 예를 들어 Cas9 분자의 엔도뉴클레아제 활성을 평가하기 위한 예시적인 방법은 예를 들어 문헌[Jinek el al., SCIENCE 2012; 337(6096):816-821]에 기재되어 있다.
실시예
실시예 1
가이드 선택 및 설계
관심 영역에서의 PAM을 확인하기 위해, 초기 가이드 선택은 인간 참조 게놈 및 사용자 정의된 관심 게놈 영역(예를 들어 유전자, 유전자의 엑손, 비-코딩 조절 영역 등)을 사용하여 인실리코(in silico)로 수행하였다. 확인된 각 PAM에 대해 분석을 수행하고 통계 보고하였다. gRNA 분자를 추가로 선택하고, 예를 들어 본원에 기재된, 효율 및 효능을 결정하기 위한 다수의 방법에 기반하여 순위 매겼다.
실시예 전반에 걸쳐, 아래 실험에서, sgRNA 분자 또는 dgRNA 분자 중 어느 하나를 사용하였다. 달리 기재되지 않는 한, dgRNA 분자를 사용한 경우, gRNA는 다음을 포함한다:
crRNA: [표적화 도메인]-[SEQ ID NO: 6607]
tracr(trRNA): SEQ ID NO: 6660
달리 표시되지 않는 한, sgRNA 분자를 사용하는 실험에서, 다음 서열을 사용하였다:
[표적화 도메인]-[SEQ ID NO: 6601]-UUUU
달리 표시되지 않는 한, "BC" 표지된 sgRNA 분자를 사용하는 실험에서, 다음 서열을 사용하였다:
[표적화 도메인]-[SEQ ID NO: 6604]-UUUU
일차 가이드 스크리닝을 위한 HEK-293 Cas9GFP 세포의 형질감염
표적 특이적 crRNA의 일차 스크리닝을 위해Cas9GFP 발현 HEK293 세포(HEK-293_Cas9GFP)의 형질 감염을 사용하였다. 본 실시예에서, 예를 들어 본원에 기재된, 인실리코 표적-외 검출을 포함하는 정의된 기준을 사용하여 일차 스크리닝을 위해 표적 특이적 crRNA를 설계 및 선택하였다. 선택된 crRNA를 화학적으로 합성하여 96 웰 형식으로 전달하였다. 스톡 trRNA와 1:1의 비율로 있는 표적 crRNA로HEK-293-Cas9GFP 세포를 형질 감염시켰다. 제조사의 프로토콜(Lipofectamine 2000, Life Technologies)에 따라 리포펙션 기술을 사용하여 형질 감염을 매개하였다. 리포펙션 후 24 시간에 형질 감염된 세포를 용해시키고, T7E1 검정 및/또는 차세대 시퀀싱(NGS; 이하)으로 용해물 내에서 편집(예를 들어 절단)을 검출하였다.
T7E1 검정
Cas9에 의한 DNA 절단 후 비-상동 말단 접합(NHEJ)을 통해 생성된 삽입, 결실 및 치환과 같은 게놈 DNA에서의 돌연변이 이벤트를 검출하기 위하여 T7E1 검정을 사용하였다(문헌[Cho et al., Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 2013; 31, 230-232] 참조).
CRISPR/Cas9에 의한 절단을 위해 표적화된 게놈 DNA 영역을 PCR로 증폭하고, 95℃에서 10 분 동안 변성시킨 다음, 95℃에서 25℃까지 초당 0.5℃로 감소시켜 재-어닐링하였다. 증폭된 영역 내에 돌연변이가 존재하는 경우, DNA는 결합하여 헤테로듀플렉스를 형성하였다. 그런 다음, 재-어닐링된 헤테로듀플렉스를 T7E1(New England Biolabs)로 37℃에서 25 분 이상 동안 분해시켰다. T7E1 엔도뉴클레아제는 DNA 미스매치, 헤테로듀플렉스 및 닉을 갖는 이중 가닥 DNA를 인식하고 이들 부위에서 이중 가닥 단절을 생성한다. 생성된 DNA 단편을 단편 분석기(Fragment Analyzer)를 사용하여 분석하고 절단 효율을 결정하기 위해 정량화하였다.
차세대 시퀀싱(NGS) 및 표적-적중 절단 효율 및 삽입결실 형성에 대한 분석
게놈에서 표적 위치를 편집(예를 들어 절단)하는 효율을 결정하기 위해, 딥 시퀀싱(deep sequencing)을 이용하여 비-상동 말단 접합에 의해 도입된 삽입 및 결실의 존재를 확인하였다.
처음에 표적 부위 주위에PCR 프라이머를 설계하였고, 관심있는 게놈 구역을 PCR 증폭하였다. 시퀀싱에 필요한 화학적 성질을 부가하기 위해 제조사의 프로토콜(Illumina)에 따라 추가적인 PCR을 수행하였다. 그 다음에, 앰플리콘(amplicon)을 Illumina MiSeq 기기 상에서 시퀀싱 하였다. 그 다음에, 리드를, 낮은 품질 점수를 갖는 것들을 제거한 후에, 인간 참조 게놈(예를 들어 hg38)에 맞추어 정렬하였다. 참조 게놈에 매핑된 리드를 함유하는 결과 파일(BAM 파일)로부터, 관심 표적 영역과 겹쳐진 리드를 선택하고, 야생형 리드의 수 대비 삽입 또는 결실을 함유하는 리드의 수를 계산하였다. 그 다음에, 야생형을 포함하는 리드의 총 수에 대한 삽입 또는 결실을 갖는 리드의 총 수로서 편집 백분율을 정의하였다. 편집으로 인한 삽입 및/또는 결실 패턴을 결정하기 위해, 삽입결실을 갖는 정렬된 리드를 선택하고 주어진 삽입결실을 갖는 리드의 수를 합산하였다. 그 다음에, 이 정보를 목록으로서 디스플레이할 뿐만 아니라 각 삽입결실의 빈도를 나타내는 히스토그램 상의 형태로 시각화하였다.
RNP 생성
Cas9 단백질에의 crRNA 및 trRNA의 첨가는 활성 Cas9 리보핵산 단백질 복합체(RNP)의 형성을 야기하며, 이는 crRNA에 의해 특정된 표적 영역에의 결합 및 표적화된 게놈 DNA의 특이적 절단을 매개한다. trRNA 및 crRNA를 Cas9 내로 로딩함으로써 이 복합체를 형성하였으며, 이는 Cas9에 대한 입체 형태 변화를 야기하여 dsDNA에 결합 및 절단 가능하게 하는 것으로 여겨진다.
crRNA와 trRNA를 95℃에서 2 분 동안 개별적으로 변성시키고, 실온이 되게 하였다. Cas9 단백질(10 mg/ml)을 5X CCE 완충제(20 mM HEPES, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% 글리세롤)에 첨가한 다음에, trRNA 및 다양한 crRNA를 첨가하고(별도의 반응으로) 37℃에서 10 분 동안 인큐베이션시켜, 활성 RNP 복합체를 형성하였다. 전기천공 및 다른 방법에 의해, HEK-293 및 CD34+ 조혈 세포를 포함하는, 폭넓게 다양한 세포 내로 복합체를 전달하였다.
RNP의 CD34+ HSC로의 전달
Cas9 RNP를 CD34+ HSC 내로 전달하였다.
CD34+ HSC를 해동하고 IL12, SCF, TPO, Flt3L 및 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 StemSpan SFEM(StemCell Technologies) 배지에서 밤새 (약 500,000 세포/ml로) 배양하였다. 각 RNP 전달 반응 당 대략 90,000개의 세포를 분취하고 펠렛화 하였다. 그 다음에, 세포를 60 ul P3 뉴클레오펙션(nucleofection) 완충제(Lonza)에 재현탁하고 활성 RNP를 이어서 첨가하였다. 그 다음에, HSC를 3회 반복실험으로(20 uL/전기천공) 전기천공(예를 들어 Lonza 뉴클레오펙터(Nucleofector)상의 프로그램 CA-137을 사용하여 뉴클레오펙션)하였다. 전기천공 직후에, StemSpan SFEM 배지(IL12, SCF, TPO, Flt3L 및 페니실린/스트렙토마이신 포함)를 HSC에 첨가하였고, 적어도 24 시간 동안 배양하였다. 그 다음에, HSC를 수확하고 T7E1, NGS 및/또는 표면 마커 발현 분석을 하였다.
HSC 기능적 검정
CD34+ HSC는 유세포 분석 또는 시험관내 콜로니 형성 검정과 같은 공지된 기술을 이용하여 줄기 세포 표현형에 대해 검정될 수 있다. 예로서, 제조사의 프로토콜을 이용하는 Methocult H4034 Optimum 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 시험관내 콜로니 형성 검정(CFC)에 의해 세포를 검정하였다. 간략하게, 100 ul 이하의 용량의 500 내지 2000 CD34+ 세포를 1 내지 1.25 ml methocult에 첨가하였다. 혼합물을 4 내지 5 초 동안 격렬하게 볼텍싱(vortex)하여 완전히 혼합한 다음, 실온에서 적어도 5 분 동안 그대로 있도록 하였다. 시린지를 사용하여, 1 내지 1.25 ml의 MethoCult+ 세포를 35 mm 디쉬 또는 6-웰 플레이트의 웰로 이전하였다. 콜로니 수 및 형태학은 제조사의 프로토콜에 따라 12 내지 14 일 후에 평가하였다.
생체내 이종간 이식
HSC는 자가-갱신 및 다-계통 분화 능력에 의해 기능적으로 정의된다. 이 기능성은 생체내에서만 평가될 수 있다. 인간 HSC 기능을 결정하기 위한 최적 표준은, 일련의 돌연변이를 통해 심하게 면역 약화되어 인간 세포에 대한 수용자로서 작용할 수 있는 NOD-SCID 감마 마우스(NSG)로의 이종간 이식을 통하는 것이다. 유도된 편집이 HSC 기능에 영향을 미치지 않는지 확인하기 위해 편집 후 HSC를 NSG 마우스로 이식할 것이다. 인간 키메라 현상과 계통 발생을 평가하기 위하여 매월 말초 혈액 분석법을 사용할 것이고, 기능성 HSC의 존재를 확립하기 위하여 20 주 후의 2차 이식을 사용할 것이다.
결과
T7E1("T7") 및/또는 NGS에 의해 검정된 바와 같이, HEK293_Cas9GFP 세포에서의, 본원에 기재된 gRNA 분자(예를 들어 상기 기재된 dgRNA 분자)를 사용한 편집 결과가 도 1(+58 BCL11a 인핸서 영역에 대한 gRNA 분자) 및 도 2(+62 BCL11a 인핸서 영역에 대한 gRNA 분자), 및 아래 표에 기재된 바와 같이 요약되어 있다. CD34+ HSPC에서의 평균적인 편집은, 예를 들어 아래 표 10(+58 BCL11a 인핸서 영역에 대한 gRNA 분자), 표 11(+62 BCL11a 인핸서 영역에 대한 gRNA 분자), 표 12b(+55 BCL11a 인핸서 영역에 대한 gRNA 분자), 및 표 13(프렌치 HPFH 영역에 대한 gRNA 분자)에 보고되어 있다. T7E1 검정 결과가 보고되는 경우, "2"는 고효율 절단을 나타내고; "1"은 저효율 절단을 나타내며, "0"은 절단이 없음을 나타낸다. 일반적으로, T7E1 결과는 NGS에 의해 검정된 정량적 절단과 상관 관계에 있다. 상위 15개의 gRNA(CD34+ 세포에서의 가장 높은 % 편집으로 평가됨)를 도 11(+58 BCL11a 인핸서 영역) 및 도 12(+62 BCL11a 인핸서 영역)에 나타냈다.
[표 10]
Figure pct00129
Figure pct00130
Figure pct00131
Figure pct00132
[표 11]
Figure pct00133
Figure pct00134
[표 12a]
Figure pct00135
Figure pct00136
Figure pct00137
상기 실험 후에, NGS 분석을 위해 새롭게 설계된 프라이머 세트를 사용하여 HEK-293-Cas9 세포 및 CD34+ 세포 둘 모두에서 동일한 가이드 RNA 분자를 다시 3회 반복실험하여 테스트 하였다. 그 결과가 아래 표 12b에 보고되어 있다.
[표 12b]
Figure pct00138
Figure pct00139
Figure pct00140
Figure pct00141
[표 13]
Figure pct00142
Figure pct00143
Figure pct00144
Figure pct00145
Figure pct00146
Figure pct00147
Figure pct00148
Figure pct00149
Figure pct00150
BCL11a 인핸서 부위에서의 게놈 편집
BCL11a의 +58 또는 +62 적혈구계 인핸서 영역 내의 게놈 DNA에 특이적인 표적화 도메인을 함유하는 합성 sgRNA 분자를 정리하였다. 도 5는, sgEH1부터 sgEH9까지 명명된, sgRNA에 의해 표적화되는 게놈 DNA를 보여준다.
sgEH1 표적화 도메인(CR00276): AUCACAUAUAGGCACCUAUC(SEQ ID NO: 212)
sgEH2 표적화 도메인(CR00275): CACAGUAGCUGGUACCUGAU(SEQ ID NO: 211)
sgEH8 표적화 도메인(CR00273): CAGGUACCAGCUACUGUGUU(SEQ ID NO: 209)
sgEH9(CR00277) 표적화 도메인: UGAUAGGUGCCUAUAUGUGA(SEQ ID NO: 213)
Cas9와 미리 복합체 형성된 sgEH[X]를 함유하는 RNP를 전기천공(NEON 전기천공기)을 사용하여 CD34+ 골수 세포(골수 CD34+ 세포는 Lonza, Cat# 2M-101C, Lot# 466977, 30y, F, B(96.8%)에서 주문)로 도입시켰다. T7E1 및 NGS를 사용하여 CD34+ 줄기 세포에서 절단을 결정하였다. 결과는 도 6a 내지 도 6d에 요약되어 있으며, 4개의 실험(상이한 두 공여자로부터의 2개의 실험)에 걸친 전체 삽입결실 형성뿐만 아니라 상위 삽입결실 패턴을 보여준다. sgEH1, 2 및 9는 고효율로 절단하도록 할 수 있었다.
놀랍게도, 상이한 공여자로부터의 세포를 사용하는 실험을 포함하는 다수의 실험에 걸쳐, 삽입결실 패턴이 계속 일정하다는 것을 발견하였다(도 6a 내지 도 6d 참조). 즉, 각 gRNA는 일관된 패턴의 삽입결실 형성을 제공하였다. 또한, 결실은 절단 부위 근처의 미세상동 영역과 상관 관계 있는 것으로 나타났다.
이 현상을 추가로 조사하기 위해, 상이한 생물학적 샘플뿐만 아니라 상이한 전달 방법, 및 gRNA 스캐폴드를 사용하여 테스트할 때BCL11a 유전자좌에 대한 gRNA를 설계하였다. 이 실험을 위해, 다음의 표적화 도메인을 갖는 gRNA를 사용하였다:
G7(g7으로도 지칭됨) 표적화 도메인: GUGCCAGAUGAACUUCCCAU(예를 들어 SEQ ID NO: 1191의 3' 20 nt)
G8(g8으로도 지칭됨) 표적화 도메인: CACAAACGGAAACAAUGCAA(예를 들어 SEQ ID NO: 1186의 3' 20 nt)
제1 실험에서, 2개의 상이한 생물학적 샘플에 걸쳐 g7 및 g8을 테스트하였다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 각 gRNA에 대하여 가장 우세한 상위 3개의 삽입결실 패턴이 동일하였다. 다음으로, G7 및 G8 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 상이한 tracrRNA 성분과 함께 테스트하였다. 이전의 실험에서, sgRNA를 형성하기 위하여 gRNA 표적화 도메인에, -UUUU가 뒤따르는 SEQ ID NO: 6601을 바로 부가하였다. 다음 세트의 실험에서는, 상이한 스캐폴드를 갖는 sgRNA 분자(g7BC 또는 g8BC로 불리는 gRNA)를 생성하기 위하여 g7 및 g8의 gRNA 표적화 도메인에, -UUUU가 뒤따르는 SEQ ID NO: 6604를 바로 부가하였다. 도 8에서 나타난 바와 같이, 상이한 sgRNA 스캐폴드가 사용되는 경우에도 삽입결실 패턴은 계속 일정하였다. 최종적으로, 상이한 전달 방법을 사용하여 삽입결실 패턴을 비교하였다. RNP 전기천공을 통해 또는 리포펙타민 2000을 통한 g7-인코딩 플라스미드의 전달에 의해 293 세포로 g7을 전달하는 것을 조사하였고 결과를 도 9에 보고하였다. 나타난 바와 같이, 삽입결실 패턴은 계속 동일하였다. 종합해서, 이들 결과는 삽입결실 패턴 형성이 서열 의존적임을 강력하게 시사한다. 절단이 큰 결실 및/또는 프레임쉬프트 결실을 야기하는 서열을 표적화하는 gRNA 분자는 기능 손실에 유익할 수 있다.
다수의 가이드를 이용한 절제
상기 G7 및 g8은 근접 부위에서 게놈 DNA를 표적화한다(PAM 서열은 BCL11a 유전자 내에서 서로 50 뉴클레오티드 이내이다). 2개의 근접 부위를 동시에 표적화하는 것의 효과를 조사하기 위해, G7의 표적화 도메인을 갖는 gRNA를 포함하는 RNP뿐만 아니라 G8의 표적화 도메인을 갖는 gRNA를 포함하는 RNP로CD34+ 세포를 형질 감염시켰다. 절단 효율 및 삽입결실 패턴을 NGS에 의해 평가하였다. 도 10에 나타난 바와 같이, 일차적인 삽입결실은 두 gRNA 결합 부위 사이의 뉴클레오티드의 결실 이다. 이들 결과는 근접하게 결합하는 복수의, 예를 들어 2개의 가이드가 두 결합 부위 사이에 위치한 DNA의 절제를 일으키는 데 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
CD34+ 줄기 세포에서의 게놈 편집
CD34+ 일차 조혈 줄기 세포에서 BCL11a 유전자좌에서의 게놈 편집을 입증하였다. 간략하게, 제조사의 지시에 따라 면역 선별(Miltenyi)을 이용하여 성인 공여자로부터의 G-CSF 동원된 말초 혈액(AllCells)으로부터 CD34+ 세포를 단리하였다. 세포 게이팅(gating)은 도 3에 나타난다. 세포를 분취하고 동결보존하였다. 해동된 세포를 SFEM(StemCell Technologies) + 1X 항생제/항진균제 + 각 사이토카인(TPO, FLT3L, IL6 및 SCF) 50 ng/ml + 500 nM 화합물 4에 2 x 105/ml로 시딩하고 가습된 배양기에서 37C, 5% CO2에서 5 일 동안 배양하였다. 5 일 후 세포 농도는 1 x 106/ml이었다.
각 Cas9(Genscript #265425-7) 및 sgRNA(TriLink, sgBCL11A_7 표적화 도메인(즉, g7의 표적화 도메인): GTGCCAGATGAACTTCCCATGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT(SEQ ID NO: 2000)을 포함) 150 ng으로 구성된 사전 인큐베이션된 RNP 복합체를 2 x 105 세포에 첨가하고, 제조사의 프로토콜에 따라, 펄스 파라미터: 1600 V, 20 ms, 1 펄스로 Neon 시스템(Lifetechnologies) 상에서 전기천공 하였다. 2회 반복실험으로 전기천공을 수행하였다. RNP 복합체 부재 하에서 모의 전기천공 또한 수행하였다. 전기천공 후, 세포를 밤새 회복시키기 위해 1 ml 배지 내로 시딩하였다.
전기천공 다음 날에, 정렬되지 않은 배양물 중 1/20을 SFEM(StemCell Technologies) + 1X 항생제/항진균제 + 각TPO, FLT3L, IL6, SCF, IL3 및 GCSF 50 ng/ml에 6 일 동안 시딩하였다. 나머지 세포는 인간 CD34 및 인간 CD90에 대한 항체로 염색하고 CD34+CD90+ 및 CD34+CD90- 집단에 대해 유세포 분석으로 정렬하였다. CD34+CD90+ 세포는 면역 결핍 마우스에서의 장기간 다-계통 생착으로 정의된 조혈 줄기 세포를 함유하는 것으로 알려져 있다(문헌[Majeti et al. 2007 Cell Stem Cell 1, 635-645] 참조). 정렬을 위해 선택된 세포 집단은 도 3의 대표적인 도트 플롯에서 게이트에 의해 표시하였다. 정렬된 세포를 SFEM(StemCell Technologies) + 1X 항생제/항진균제 + 각TPO, FLT3L, IL6, SCF, IL3 및 GCSF 50 ng/ml에 6 일 동안 배양하고, 이 시점에 모든 배양물을 게놈 편집 분석을 위해 수확하였다.
수확된 세포로부터 게놈 DNA를 정제하고 다음의 프라이머로 표적화된 영역을 증폭하였다: BCL11A-7 F, gcttggctacagcacctctga; BCL11A-7 R, ggcatggggttgagatgtgct. PCR 산물을 변성시키고 재어닐링한 후, 제조사의 권고에 따라 T7E1(New England Biolabs)와 인큐베이션시켰다. 그 다음에, 아가로스 겔 전기 영동으로 반응을 분석했다(도 4). 상부 밴드는 절단되지 않은 호모듀플렉스 DNA에 해당하고 하부 밴드는 헤테로듀플렉스 DNA로부터 기인한 절단 산물을 나타낸다. 맨 왼쪽 레인은 DNA 사다리이다. 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어에 의한 미처리 이미지의 피크 통합에 의해 계산되었다. % 유전자 변형(삽입결실)은 다음과 같이 계산되었다: % 유전자 변형 = 100 x (1 - (1 - 절단된 비율)1/2), 그리고 겔의 각 대응하는 레인 아래에 표시하였다.
결과는 도 4에 나타난다. 조혈 줄기 세포-함유 CD34+CD90+ 집단에서의 유전자 편집 효율은 CD34+CD90- 세포 또는 정렬되지 않은 것과 동등하였다. 이들 실험은 유전자 편집이CD34+ HSPC 및 HSC에서 추가로 부화된 CD34+CD90+ 세포에서 달성될 수 있음을 입증한다.
실시예 3. 성인 적혈구계 세포에서의 태아 글로빈 발현의 탈억제를 위하여 CRISPR-Cas9를 이용한 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)에서의 BCL11A 적혈구계 인핸서 편집
방법:
인간 CD34+ 세포 배양. 인간 골수 CD34+ 세포를 AllCells(Cat#: ABM017F) 또는 Lonza(Cat#: 2M-101C)에서 구입하고, 50 ng/mL의 트롬보포이에틴(Tpo, Peprotech; Cat# 300-18), 50 ng/mL의 인간 Flt3 리간드(Flt-3L, Peprotech; Cat# 300-19), 50 ng/mL의 인간 줄기 세포 인자(SCF, Peprotech; Cat# 300-07), 인간 인터루킨-6(IL-6, Peprotech; Cat# 200-06), 1% L-글루타민; 2% 페니실린/스트렙토마이신, 및 화합물 4(0.75 μM)로 보충된 StemSpan SFEM(StemCell Technologies, Cat no. 09650)를 이용하여 2 내지 3 일 동안 확장하였다. 2 내지 3 일의 확장 후, 배양물은 AllCells에서 구입한 시작 세포 수에 비해 2 내지 3 배, Lonza로부터의 경우에는 1 내지 1.5 배 확장하였다. 본원에 기재된 CRISPR/Cas 시스템 도입 전후 모두를 포함하여, 모든 CD34+ 확장 단계를 위해 이들 배양 조건을 사용하였다.
Cas9 및 가이드 RNA 리보핵산 단백질(RNP) 복합체의 조립, HSC의 제조 및 HSC로의 RNP의 전기천공. Cas9-가이드 RNA 리보핵산 단백질 복합체(RNP)를 전기천공 직전에 제조하였다. 이중 가이드 RNA(dgRNA)를 사용한 RNP 형성을 위해, 각각 3 μg의 crRNA(2.24 μL에) 및 tracr(1.25 μL에)을 먼저 별도의 튜브에서 2분 동안 95℃에서 변성시킨 다음 실온까지 냉각시켰다. Cas9 단백질의 제조를 위해, 7.3 μg의 CAS9 단백질(1.21 μL에)을 5 x CCE 완충제(20 mM HEPES, 100 mM KCL, 5 mM MgCl2, 5% 글리세롤 및 새로 첨가된 1 mM DTT) 0.52 μL와 혼합하였다. Tracr을 먼저 Cas9 조제물과 혼합하고 5분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음에, crRNA를 Tracr/CAS9 복합체에 첨가하고 37℃에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 200 x g에서 15분 동안 원심 분리하여 HSC를 수집하고 2 x 107/mL의 세포 밀도로 Neon 전기천공 키트(Invitrogen; Cat#: MPK1096)와 함께 제공되는 T 완충제에 재현탁하였다. 부드럽게 3회 상하로 피펫팅하여 RNP를12 μL의 세포와 혼합하였다. 단일 가이드 RNA(sgRNA) 및 Cas9 복합체를 제조하기 위해, 2.25 μg sgRNA(1.5 μL에)를 2.25 μg Cas9 단백질(3 μL에)과 혼합하고RT에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에, 몇 차례 부드럽게 상하로 피펫팅하여 sgRNA/Cas9 복합체를 2 x 107/mL 세포 10.5 μL와 혼합하고 RT에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. RNP/세포 혼합물(10 μL)을 Neon 전기천공 프로브 내로 옮겼다. 전기천공을 1700 볼트/20 밀리초 및 1 펄스를 사용하는 Neon 형질감염 시스템(Invitrogen; MPK5000S)으로 수행하였다. 전기천공 후, 상기 기재된, 성장 인자 및 사이토카인으로 보충된 0.5 mL의 예열된 StemSpan SFEM 배지로 세포를 옮기고, 37℃에서 2일 동안 배양하였다.
게놈 DNA 제조. 전기천공 후 48시간에 편집된 및 편집되지 않은 HSC로부터 게놈 DNA를 제조하였다. 세포를 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.05% SDS 및 새로 첨가된 프로테아제 K 25 μg/mL에서 용해시키고 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음 85℃에서 15분 동안 추가로 인큐베이션하여 프로테아제 K를 불활성화시켰다.
T7E1 검정. HSC의 편집 효율을 결정하기 위해, T7E1 및 검정을 수행하였다. PCR은 Phusion Hot Start II High-Fidelity 키트(Thermo Scientific, Cat#: F-549L)를 사용하여 다음의 사이클 조건으로 수행하였다: 30" 동안 98℃; 5" 동안 98℃, 20' 동안 68℃, 30" 동안 72℃ 35 사이클; 5 분 동안 72℃. 다음의 프라이머를 사용하였다: 정방향 프라이머: 5'-AGCTCCAAACTCTCAAACCACAGGG-3'(SEQ ID NO: 2001) 및 역방향 프라이머: 5'-TACAATTTTGGGAGTCCACACGGCA-3'(SEQ ID NO: 2002). PCR 산물을 다음의 조건을 사용하여 변성시키고 재어닐링하였다: 5분 동안95℃, -2℃/s로 95℃에서 85℃로, -0.1℃/s로 85℃에서 25℃로, 4℃ 유지. 어닐링 후, 1 μL의 미스매치-민감성 T7 E1 뉴클레아제(NEB, Cat# M0302L)를 상기 PCR 산물 10 μL에 첨가하고, 헤테로듀플렉스의 분해를 위해 37℃에서 15분 동안 추가로 인큐베이션하였으며, 생성된 DNA 단편을 아가로스 겔(2%) 전기 영동으로 분석하였다. 편집 효율은 ImageJ 소프트웨어(http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 사용하여 정량하였다.
차세대 시퀀싱(NGS). 편집 효율을 보다 정확하게 그리고 삽입 및 결실(삽입결실) 패턴을 결정하기 위해, PCR 산물을 차세대 시퀀싱(NGS) 하였다. 티타늄 Taq PCR 키트(Clontech Laboratories; Cat#: 639210)를 사용하여 다음의 사이클링 조건으로PCR을 2회 반복실험으로 수행하였다: 5분 동안 98℃; 15초 동안 95℃, 15초 동안 68℃, 72℃ 1분 30 사이클; 7분 동안 72℃. 다음의 프라이머를 사용하였다: 정방향 프라이머: 5'-AGCTCCAAACTCTCAAACCACAGGG-3'(SEQ ID NO: 2001) 및 역방향 프라이머: 5'-TACAATTTTGGGAGTCCACACGGCA-3'(SEQ ID NO: 2002). PCR 산물을 2% 아가로스 겔 전기 영동으로 분석하고 딥 시퀀싱을 위해 제출하였다.
HSPC 배양물의 유세포 분석. 줄기 및 전구 세포 집단의 특징 확인을 위해 HSPC를 유세포 분석하였다. 세포 배양물의 분취물 상에서 게놈 편집 이전 및 이후의 CD34+, CD34+CD90+ 세포 서브세트의 백분율을 결정하였다. 0.5% BSA로 보충된 PBS를 함유하는 염색 완충제 중의 항-CD34(BD Biosciences, Cat# 555824), 항-CD90(Biolegend, Cat# 328109)와 세포를4℃, 암소에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존능은 7AAD로 결정한다. 세포를 염색 완충제로 세척하고 Multicolor FACS 분석을 FACSCanto(Becton Dickinson) 상에서 수행하였다. Flowjo를 사용하여 유세포 분석 결과를 분석하였고 데이터는 전체 세포 집단의 CD34+, CD34+CD90+ 퍼센트로 표시하였다. 배양물 내의 각 세포 유형 집단의 절대 수는 각 집단의 백분율과 곱한 총 세포 수로부터 계산하였다.
시험관내 적혈구 생성 및 HbF 함유 적혈구계 세포에 대한 FACS 분석. 전기천공 후 48시간에 게놈 편집된 HSC를 시험관내에서 적혈구계 분화시켰다. 간략하게, 330 μg/mL 인간 홀로-트랜스페린(Sigma, Cat# T0665), 10 μg/mL 재조합 인간 인슐린(Sigma, Cat# I3536), 2 IU/mL 헤파린(Sigma, Cat# H3149), 5% 인간 혈장(Sigma, Cat# P9523), 3 IU/mL 인간 에리트로포이에틴(R&D, Cat# 287-TC), 1% L-글루타민, 및 2% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 IMDM(Invitrogen, Cat # 31980-097)으로 구성된 적혈구계 분화 배지(EDM)에서 편집된 HSC를 배양하였다. 배양 0 내지 7일 동안, 10-6 M 하이드로코르티손(Sigma, Cat# H0888), 100 ng/mL 인간 SCF(Peprotech, Cat# 300-07) 및 5 ng/mL 인간 IL-3(Peprotech, Cat# 200-03)로 7일 동안 EDM을 추가로 보충하였다. 배양 7 내지 11일 동안은, 100 ng/mL의 인간 SCF만으로 EDM을 보충하였다. 배양 11 내지 21일 동안은 EDM을 추가로 보충하지 않았다. 배양 7, 14 및 21일에, HbF 발현에 대한 세포내 염색으로 세포(2 내지 10 x 105)를 분석하였다. 간략하게, 세포를 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 수집하고 염색 완충제(Biolegend, Cat# 420201)로 1 회 세척하였다. 그 다음에, 세포를 0.5 mL의 고정 완충제(Biolegend, Cat# 420801)로 고정시키고 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 1x 세포내 염색 투과화 세척 완충제(Biolegend, Cat# 421002) 2 mL로 3 회 세척하였다. 그 다음에, 1x 세포내 염색 투과화 세척 완충제100 μL 중 5 μL의 항-HbF 항체(Life technologies, Cat# MHFH01)와 함께 세포를 실온에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1x 세포내 염색 투과화 세척 완충제2 mL로 2 회 세척하고 200 μL 염색 완충제에 재현탁하고 FACS Canto(Becton Dickinson) 상에서 HbF 발현을 분석하였다. Flowjo를 사용하여 결과를 분석하였고 데이터는 전체 세포 집단 내 HbF 양성 세포(F-세포)의 %로 표시하였다.
유전자 발현 검정. RNeasy 미니 키트(Qiagen, Cat# 74104)를 사용하여 RNA를 정제하는 데 약 1 x 106 세포를 사용하였다. qScript cDNA 합성 키트(Quanta, Cat# 95047-500)를 사용하는 제1 가닥 합성에 200 내지 400 ng RNA를 사용하였다. 공급사의 프로토콜에 따라 Taq-Man Fast Advance PR 믹스(Life technologies, Cat# 4444963) 및 GAPDH(Life technologies, ID# Hs02758991_g1), HbB(Life technologies, ID#: Hs00747223_g1), HbG2/HbG1(Life technologies, ID# Hs00361131_g1) 및 BCL11A(Life technologies, ID#: Hs01093197_m1)를 사용하여 Taq-man PCR을 수행하였다. 각 유전자의 상대적 발현을 GAPDH 발현에 대해 정규화하였다.
콜로니 형성 단위 세포 검정. 콜로니 형성 단위(CFU) 검정을 위해, SCF, GM-CSF, IL-3, 및 에리스로포이에틴을 함유하는 Methocult H4434 메틸셀룰로스 배지(StemCell Technologies)에 1.1 mL Methocult/35 mm 디쉬 당 300개 세포를 2회 반복 플레이팅 하였다. 페니실린/스트렙토마이신을 Methocult에 첨가하였다. 배양 디쉬를 37℃의 가습된 배양기에서 인큐베이션하였다. 전체 플레이트의 이미지를 찍기 위해 StemVision(StemCell Technologies)을 사용하여 플레이팅 후 14 일에 적어도 30개 세포를 함유하는 콜로니를 계수하였다. 그 다음에, StemVision 이미지 분석기 소프트웨어로 콜로니 총 수, CFU-GEMM(과립구, 적혈구, 대식세포, 거핵구), CFU-GM(과립구, 대식세포), CFU-M(대식세포), CFU-E(적혈구계) 및 BFU-E(대집락-형성 단위-적혈구계)의 수를 계수하고 StemVision 콜로니 마커 소프트웨어를 사용하여 수동으로 확인하였다.
생체내 생착 연구. IACUC에 의해 승인된 프로토콜에 따라 생체내 생착 연구를 수행한다. 준치사량으로 방사선 조사된(200 cGY) 6 내지 8 주령 NSG 마우스에 30,000개의 시작 세포에 상응하는 게놈 편집된 HSC의 최종 배양물의 분획을 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사한다. 생착은 방사선 조사 후 24시간 내에 수행한다. 주입 후 4, 8, 및 12주에 수집된 혈액을 항-인간 CD45 및 항-마우스 CD45 항체를 사용하여 유세포 분석함으로써 생착을 모니터링한다. 마우스를 이식 후 13주에 희생시키고, 유세포 분석 및 콜로니 형성 세포 단위 검정에 의한 분석을 위해 골수, 비장 및 흉선을 수집하였다. 2차 생착을 위해, 각 수용자 마우스로부터의 골수 중 50%를 한 마리의 2차 준치사량으로 방사선 조사된 NSG 마우스 내로 이식한다. 항-인간 CD45 및 항-마우스 CD45 항체를 사용하는 범백혈구 마커, CD45를 사용하여 주입 후 4, 8, 및 12주에 수집된 혈액을 유세포 분석함으로써 생착을 모니터링한다. 이식 후 15주에, 2차 마우스로부터 골수 및 비장을 수확하고, 유세포 분석 및 콜로니 형성 세포 단위 검정으로 분석하였다.
결과:
이론에 얽매이지 않고, HSC에서 BCL11A 적혈구계 인핸서의 표적화된 유전적 파괴가 적혈구계 세포 계통에서 선택적으로 BCL11A의 발현을 하향 조절하고 γ-글로빈 발현 억제를 완화하여, 높은 HbF 단백질을 함유하는 적혈구, F-세포의 생산을 가능하게 하는 것으로 여겨진다. 높은 HbF는 산소가 제거된 조건 하에서 적혈구의 겸상화를 방지하고 β-탈라세미아 및 SCD 환자 모두에게 치료/치유력이 있을 것이다. SCD 환자로부터의 생체외 게놈 편집된 HSC로 자가 유래 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 하는 것을 또한 줄기 세포 확장 증진 기술, 예를 들어 WO2010/059401(그 내용의 전문이 참조로 포함됨)에 기재된, 예를 들어 아릴 탄화수소 수용체(AHR) 저해제, 예를 들어 화합물 4와 조합하여 생체외 확장을 개선하고 전달되는 유전자 변형된 HSC의 투여량을 증가시켰다.
프로그램 가능한 뉴클레아제, Cas9를 통한 효율적인 게놈 편집을 위해서, 표적 세포 및 조직으로의 가이드 RNA(gRNA) 및 Cas9 단백질의 성공적인 전달이 필수적이다. 최근 보고는 Cas9 리보핵산 단백질(RNP) 복합체가 전기천공에 의해 표적 세포로 전달될 때 몇몇 상이한 세포 유형에서 효율적이고 특이적인 게놈 편집을 달성할 수 있음을 입증하였다. Cas9-RNP 복합체는 거의 전달 직후에 염색체 DNA를 절단하고 세포에서 빠르게 분해되어, 표적-외 효과를 감소시킨다. 대조적으로, Cas9를 전달하는 데 사용되는 플라스미드 및 바이러스 벡터 시스템의 사용은 시스템과 관련된 표적-외 효과를 악화시키는 효소의 연장된 발현을 야기한다. 추가적으로, 표적 세포로 RNP를 전달하는 것은 추가적인 툴을 필요로 하지 않아 클리닉에서의 치료 목적의 게놈 편집의 번역을 크게 촉진할 것이다. 정제된 재조합 Cas9 단백질 및 gRNA 복합체(RNP)를 배양된 HSPC에 전달하였고 사용된 실험 개요를 도 17에 나타냈다.
재조합 Cas9 단백질을 에스케리치아 콜라이로부터 정제하고, crRNA 및 tracr로 구성되는 합성 이중 gRNA(dgRNA) 또는 전장 단일 가이드 RNA(sgRNA)와 복합체 형성하여 리보핵산 단백질(RNP) 복합체를 생성하였다. 연구에 사용된 gRNA의 목록 및 서열을 표 14에 나타내었다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 전기천공을 통해 건강한 또는 SCD 환자 유래 골수 CD34+ HSPC로RNP 복합체를 전기천공 하였다. RNP 복합체 전달 전에 화합물 4를 함유하는 HSC 확장 배지에서 세포를2 일 동안 확장시켰다. 활발하게 분열하는 세포는 전기천공에 의해 전달된 RNP 복합체의 흡수를 촉진 할 수 있다. 형질감염 과정으로부터의 회복을 촉진하기 위해, 화합물 4를 함유하는 개질된 확장 배지에서 세포를 추가 2 일 동안 배양하였다. 전기천공 후 48 시간의 세포의 생존능을 7AAD를 사용하여 유세포 분석으로 결정하였다. 생존능은 살아있는 세포의 80% 초과에서 상대적으로 높았으며(도 18), 이는 문헌에 보고된 Cas9 및 gRNA 전달 시스템의 다른 방법에 비해 HSPC가 RNP 복합체의 전기천공을 상대적으로 잘 용인함을 시사한다.
[표 14]
Figure pct00151
T7E1 검정은 게놈 내 특이적 부위에서의 편집을 평가하는 편리한 방법이다. 전기천공 후 2일에 HSPC로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 표적화된 BCL11A 적혈구계 인핸서 영역을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭하였다. PCR산물을 T7E1 검정하였다. T7E1 검정의 최종 산물을 2% 아가로스 겔 전기 영동하고 편집된 대립유전자 퍼센트를 imageJ(http://rsb.info.nih.gov/ij/)로 정량화하였다. 예상되는 PCR 산물 크기 및 T7E1-분해 단편의 대략적인 예상 크기를 도 19에 나타내었다. 총 편집 빈도는 아가로스 겔 이미지 아래에 총 편집 백분율로 표시하였다. BCL11A 유전자좌에서의 게놈 편집은 BCL11A Cas9 RNP로 처리한 세포에서 관찰되었지만 모의 전기천공된 대조군 세포에서는 관찰되지 않았다(도 19).
BCL11A의 +58 적혈구계 인핸서 영역의 게놈 PCR 산물을 또한 차세대 시퀀싱(NGS)하였다. NGS는 다수의 샘플의 동시적 모니터링을 촉진하여 대립유전자에 대한 전체적인 관점을 제공한다. 또한, 이는 삽입 및 결실(삽입결실)의 이질성에 대한 정보를 제공한다. 서열을 대조군(모의) 처리된 세포로부터의 서열과 비교하였다. 서열 분석의 결과는 CRISPR-Cas9 유도된 이중 가닥 단절이 NHEJ에 의해 수선되어 +58 BCL11A 적혈구계 인핸서 영역에 위치한 Cas9 절단 부위 근처에 가변적인 빈도의 작은 결실 및 삽입(삽입결실)을 야기함을 보여주었다(도 20 및 표 15). 전체적으로, 관찰된 편집 효율은 동일한 서열을 표적화하는 dgRNA에 비해 sgRNA에 대해 더 높았으며, 비록 (이론에 얽매이지 않고) sgRNA와 dgRNA 사이의 효율 차이는 물질 공급원에 의해 영향을 받을 수 있지만, 14개 sgRNA 중 12개가 50%를 초과하는 대립유전자에서 편집을 생산하였다(도 20 및 표 15).
[표 15]
Cas9-RNP로 편집된 HSPC에서 NGS에 의해 확인된 유전자형. 각 집단에 대한 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 각 gRNA에 의해 표적화된 표적 서열은 각 삽입결실 집단 위에 표시되며 PAM 서열은 소문자로 표시된다. 대시는 결실된 염기를 의미하고 소문자는 삽입을 의미한다. gRNA에 대한 기재에서, dgRNA는 표시된 표적화 도메인을 포함하는 이중 gRNA 분자를 지칭한다. sgRNA는 표시된 표적화 도메인을 포함하는 단일 gRNA 분자를 나타낸다. 동일한 dgRNA 또는 sgRNA로 다수의 실험을 수행한 경우 연속적인 실험은 "dgRNA", "d1gRNA", "d2gRNA" 등으로 표지된다.
Figure pct00152
Figure pct00153
Figure pct00154
Figure pct00155
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
Figure pct00159
Figure pct00160
Figure pct00161
Figure pct00162
Figure pct00163
Figure pct00164
게놈 편집을 포함하는 생체외 조작 후에 CD34+ HSPC가 이펙터 세포로 분화하는 다계통 잠재력을 보유하는지 여부를 결정하기 위해, 선택된 gRNA에 대해 시험관내 콜로니 형성 세포(CFC) 단위 검정을 수행하였다. 게놈 편집된 세포를 사이토카인-보충된 메틸셀룰로스에 현탁시키고 5% CO2의 가습된 분위기에서 37℃에서 14 일 동안 유지하였다. 개별 콜로니들이 발생하여 형태학적 및 표현형 기준(STEMvision)을 사용하여, 함유하는 성숙 세포들의 수 및 유형에 기반하여 분류 및 계수하고, 콜로니 형성 단위-적혈구계(CFU-E), 대집락 형성 단위-적혈구계(BFU-E), 콜로니 형성 단위-과립구/대식세포(CFU-GM) 및 콜로니 형성 단위-과립구/적혈구/대식세포/거핵구(CFU-GEMM; 도 21)로의 기여에 대하여 평가하였다. 모의 형질감염된 세포의 콜로니 형성 잠재력이 가장 높았고 BCL11A의 +58 적혈구계 인핸서를 표적화하는 gRNA가 뒤따랐다. BCL11A 적혈구계 인핸서를 표적화하는 gRNA들에 대하여 유사한 수 및 유형의 콜로니를 관찰하였다. BCL11A의 엑손 2를 표적화하는 가이드 RNA는 가장 적은 수의 콜로니를 제공하였다(도 22).
단계통 적혈구계 배양물 내 BCL11A, 감마- 및 베타-글로빈 사슬의 상대적 mRNA 발현 수준을 실시간 PCR로 정량화하였다. 전사체 수준을 인간 GAPDH 전사체 수준에 대비해 정규화하였다. 게놈 편집된 HSPC에서 BCL11A mRNA 수준은 감소하였다. 대조적으로, 적혈구계 분화의 7 일차 및 14 일차에 BCL11A의 엑손 2에서 편집되지 않거나 편집된 HSPC는 BCL11A mRNA 수준이 계속 동일하였다(도 23). 적혈구계 분화 동안 편집된 HSPC에서 감마 글로빈 mRNA 수준은 증가하였고 상응하여 베타-글로빈 mRNA는 점진적으로 감소하였다(도 23). 게놈 편집 세포에서 유래된 적혈구에서의 HbF의 증가 및 베타-글로빈(겸상화된 글로빈) 수준의 감소는 감소된 겸상 적혈구로써 치료적 영향을 미칠 수 있다.
적혈구계 분화의 다양한 단계(7, 14, 21 일차)에서의 게놈 편집된 및 편집되지 않은 HSPC를 태아 글로빈 및 2개의 적혈구계 세포 표면 마커, 트랜스페린 수용체(CD71) 및 글리코포린 A(CD235a)의 발현 수준에 대해 형광 염료에 접합된 항체를 이용하여 유세포 분석하여 분석하였다. 7AAD의 제외에 의해 살아있는 세포를 확인하고 게이팅하였다. 배양된 세포가 말기 적혈구 모세포와 일치하는 유사한 수준의 CD71 및 CD235A 양성을 나타내었으므로 게놈 편집은 적혈구계 분화에 악영향을 미치지 않았다. +58 적혈구계 인핸서 영역의 게놈 편집은 다른 gRNA 및 모의 전기천공된 세포보다 HbF 함유 세포의 더 큰 증가를(67% 까지) 야기했다(도 24). BCL11A의 엑손 2를 표적화하는 g7 gRNA에 의한 HbF 양성 세포의 매우 높은 유도가 관찰되었다. 그러나, 엑손 2 표적화된 세포의 세포 증식 및 콜로니 형성 잠재력은 극적으로 감소되었다(도 21 및 도 22).
표적화된 영역의 딥 시퀀싱 즉시, 게놈 편집된 표적 영역에서 GATA1 및 TAL1 결합 모티프가 손상되지 않았음을 인지하였다(도 25). 최근 문헌은 BCL11A 발현 조절 및 태아 글로빈 탈억제에서 GATA1 결합 부위의 중요성을 입증하였다. 문헌[Viestra et al., Nature Methods. 2015, 12:927]. 성인 적혈구계 세포에서의 BCL11A 수준의 유지를 위한 두 모티프의 중요성을 보여주는 문헌 보고와는 대조적으로, 본 발견은 두 전사 인자 결합 부위의 업스트림 서열 또한 BCL11a 유전자 발현의 조절에 중요하며, 이들 업스트림 부위에서만의 게놈 편집으로, GATA1 및 TAL1 결합 부위가 손상되지 않은 때에도 HbF의 상향 조절을 초래한다는 것을 입증한다.
실시예 3.1
방법:
인간 CD34+ 세포 배양. 제조사의 지시에 따라 면역 선별(Miltenyi)을 이용하여 성인 공여자로부터의 G-CSF 동원된 말초 혈액(AllCells)에서 인간 CD34+ 세포를 단리하고, 트롬보포이에틴(Tpo), Flt3 리간드(Flt-3L, Life Technologies, Cat. #PHC9413), 인간 줄기 세포 인자(SCF, Life Technologies, Cat. #PHC2113) 및 인간 인터루킨-6(IL-6, Life Technologies, Cat. #PHC0063) 각 50 ng/mL뿐만 아니라1x 항생제/항진균제(Gibco, Cat. #10378-016) 및 500nM 화합물 4로 보충된 StemSpan SFEM(StemCell Technologies, Cat no. 09650)를 이용하여 3 일 동안 확장하였다.
Cas9 및 가이드 RNA 리보핵산 단백질(RNP) 복합체의 조립, HSPC의 제조, 및 HSPC로의 RNP의 전기천공. Cas9-가이드 RNA 리보핵산 단백질 복합체(RNP)를 전기천공 직전에 제조하였다. 이중 가이드 RNA(dgRNA)를 사용한 RNP 형성을 위해, 각각 3 μg의 crRNA(2.24 μL에) 및 tracr(1.25 μL에)을 먼저 별도의 튜브에서 95℃에서 2 분 동안 변성시킨 다음 실온까지 냉각시킨다. Cas9 단백질의 제조를 위해, 6 μg의 CAS9 단백질(1 μL에)을 5x CCE 완충제(20 mM HEPES, 100 mM KCL, 5 mM MgCl2, 5% 글리세롤 및 새로 첨가된 1 mM DTT) 0.5 μL와 혼합하였다. Tracr을 먼저 Cas9 조제물과 혼합하고 5분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음에, crRNA를 Tracr/CAS9 복합체에 첨가하고 37℃에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 없음/대조군 조건을 위해, crRNA 대신에 비히클을 Tracr/CAS9 복합체에 첨가하였다. 원심 분리하여 HSC를 수집하고 2.5 x 106 /mL의 세포 밀도로 P3 일차 세포 용액(Lonza cat. No. PBP3-00675)에 재현탁하였다. 상하로 피펫팅하여 RNP를20 μL의 세포와 혼합하고 RT에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. RNP/세포 혼합물(20 μL)을 4D-뉴클레오펙터(Lonza) 상에서 코드 CM-137를 사용하여 전기천공하였다. 20 μL의 전기천공을 2회 반복실험으로 수행하였다. 본 실시예 3.1의 실험에서, 사용된 tracr은 SEQ ID NO: 7808이고, crRNA는 2'O-메틸 (m) 및 포스포로티오에이트 결합(*) 변형이 표시된 다음의 형식 및 서열을 가졌다: mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArU*mG*mC*mU, 여기서 N은 표시된 표적화 도메인의 뉴클레오티드이다(예를 들어 CRxxxxx 식별자에 의해 표시된).
시험관내 적혈구 생성 및 HbF 함유 적혈구계 세포에 대한 FACS 분석. 전기천공 후, 330 μg/mL 인간 홀로-트랜스페린(Invitria Cat# 777TRF029), 10 μg/mL 재조합 인간 인슐린(Gibco Cat#A1138211), 2 IU/mL 헤파린(Sigma, part #H3393), 5% 인간 AB 혈청(Sigma, Cat# H4522), 125 ng/mL 인간 에리트로포이에틴(Peprotech #10779-058), 및 1x 항생제/항진균제(Gibco, Cat. #10378-016)로 보충된 IMDM(Hyclone, Cat. #SH30228.01)으로 구성된 250 μL의 예열된 적혈구계 분화 배지(EDM)로 세포를 즉시 옮겼다. 1 μM 하이드로코르티손(Sigma H8672), 100 ng/mL 인간 SCF(Life Technologies, Cat. #PHC2113) 및 5 ng/mL 인간 IL-3(Peprotech #10779-598)로 EDM을 추가로 보충하였다. 2 일 후에, 세포 배양물을 새 배지에 희석하였다. 배양을 총 7 일 동안 유지하였고, 그 때, HbF 발현에 대한 세포내 염색으로 세포를 분석하였다. 간략하게, 세포를 PBS로 1 회 세척하고, LIVE/DEAD® Fixable Violet Dead 세포 염색(ThermoFisher L34963; PBS에 1:1000)에 재현탁하고 30 분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에, 세포를 세척하고 항-CD71-BV711(Fisher Scientific Company Llc. BDB563767) 및 항-CD235a-APC(BD 551336) 항체로 30 분 동안 염색하였다. 그 다음에, 세포를 세척하고, 그 다음에 고정 완충제(Biolegend, Cat# 420801)로 고정하고 제조사의 지시에 따라 1x 세포내 염색 투과화 세척 완충제(Biolegend, Cat# 421002)로 투과화하였다. 그런 다음, 1x 세포내 염색 투과화 세척 완충제50 μL 중 0.5 μL의 항-HbF-PE 항체(Life Technologies, part #MHFH04)와 함께 세포를 실온에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1x 세포내 염색 투과화 세척 완충제2 mL로 2 회 세척하고 염색 완충제에 재현탁하고 LSRFortessa 유세포 분석기(BD Biosciences) 상에서 HbF 발현을 분석하였다. Flowjo를 사용하여 결과를 분석하였고 데이터는 살아있는 CD71 양성 적혈구계 세포 집단 내 HbF 양성 세포(F-세포)의 %로 표시하였다.
게놈 DNA 제조 및 차세대 시퀀싱(NGS). 전기천공 후 48 시간에 Quick Extract DNA 추출 용액(Epicentre Cat# QE09050)을 사용하여, 편집된 및 편집되지 않은 HSPC로부터 게놈 DNA를 제조하였다. 편집 효율과 삽입 및 결실(삽입결실) 패턴을 결정하기 위해, 표적 부위 양 옆에 배치되는 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 생성하고, 그 다음에 차세대 시퀀싱(NGS)하였다. 편집되지 않은 샘플에서 상응하는 서열의 편집 퍼센트는 전형적으로 1% 미만이었고 3%를 초과하지 않았다.
결과:
이론에 얽매이지 않고, BCL11A 적혈구계 인핸서 영역의 표적화된 유전적 파괴가 γ-글로빈 발현 억제를 완화하여, 높은 HbF 단백질을 함유하는 적혈구의 생산을 가능하게 하는 것으로 여겨진다(태아 헤모글로빈을 발현하는, 예를 들어 높은 수준의 태아 헤모글로빈을 발현하는 세포는 때때로 본원에서 "F-세포"로 지칭된다. 구현예에서, 세포 당 적어도 6 피코그램의 태아 헤모글로빈을 생산하는 경우 세포는 F-세포로 여겨진다). 높은 HbF는 산소가 제거된 조건 하에서 적혈구의 겸상화를 방지하고 β-탈라세미아 및 SCD 환자 모두에게 치료/치유력이 있을 것이다. SCD 환자로부터의 생체외 게놈 편집된 HSC로 자가 유래 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 하는 것을 또한 줄기 세포 확장 증진 기술, 예를 들어 WO2010/059401(그 내용의 전문이 참조로 포함됨)에 기재된, 예를 들어 아릴 탄화수소 수용체(AHR) 저해제, 예를 들어 화합물 4와 조합하여 생체외 확장을 개선하고 전달되는 유전자 변형된 HSC의 투여량을 증가시켰다.
프로그램 가능한 뉴클레아제, Cas9를 통한 효율적인 게놈 편집을 위해서, 표적 세포 및 조직으로의 가이드 RNA(gRNA) 및 Cas9 단백질의 성공적인 전달이 필수적이다. 최근 보고는 Cas9 리보핵산 단백질(RNP) 복합체가 전기천공에 의해 표적 세포로 전달될 때 몇몇 상이한 세포 유형에서 효율적이고 특이적인 게놈 편집을 달성할 수 있음을 입증하였다. Cas9-RNP 복합체는 거의 전달 직후에 염색체 DNA를 절단하고 세포에서 빠르게 분해되어, 표적-외 효과를 감소시킨다. 대조적으로, Cas9를 전달하는 데 사용되는 플라스미드 및 바이러스 벡터 시스템의 사용은 시스템과 관련된 표적-외 효과를 악화시키는 효소의 연장된 발현을 야기한다. 추가적으로, 표적 세포로 RNP를 전달하는 것은 추가적인 툴을 필요로 하지 않아 클리닉에서의 치료 목적의 게놈 편집의 번역을 크게 촉진할 것이다. 정제된 재조합 Cas9 단백질 및 gRNA 복합체(RNP)를 배양된 HSPC에 전달하였고 사용된 실험 개요를 도 17에 나타냈다.
재조합 Cas9 단백질을 에스케리치아 콜라이로부터 정제하고, crRNA 및 tracr로 구성되는 합성 이중 gRNA(dgRNA)와 복합체 형성하여 리보핵산 단백질(RNP) 복합체를 생성하였다. 연구에 사용된 gRNA의 목록을 표 17에 나타내었다(예를 들어 표시된 CRxxxxx 식별자의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA). 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 전기천공을 통해 CD34+ HSPC로RNP 복합체를 전기천공 하였다. RNP 복합체 전달 전에 세포를 확장시켰다. 활발하게 분열하는 세포는 전기천공에 의해 전달된 RNP 복합체의 흡수를 촉진 할 수 있다.
[표 17]
현 연구에 사용된 BCL11A 적혈구계 특이적 인핸서 영역을 표적화하는 gRNA 목록. 모든 gRNA 분자를 재료 및 방법에 기재된 dgRNA 형식으로 2회 반복실험으로 테스트하였다.
Figure pct00165
게놈 편집된 및 편집되지 않은 HSPC를 태아 글로빈 및 2개의 적혈구계 세포 표면 마커, 트랜스페린 수용체(CD71) 및 글리코포린 A(CD235a)의 발현 수준에 대해 형광 염료에 접합된 항체를 이용하여 유세포 분석하여 분석하였다. Live Dead Violet의 제외에 의해 살아있는 세포를 확인하고 게이팅하였다. BCL11A적혈구계 특이적 인핸서 영역 표적화는 모의 전기천공된 세포(22.4%)에 비해 HbF 함유 적혈구계 세포의 증가된 백분율을(50.7% 까지) 야기했다(표 17). BCL11A의 엑손 2를 표적화하는 g8의 표적화 도메인을 포함하는 dgRNA에 의한 HbF 양성 세포의 유도가 또한 병렬적으로 관찰되었다. 세포 집단에서 편집된 대립유전자의 백분율을 결정하기 위해BCL11A 적혈구계 인핸서 영역의 게놈 PCR 산물을 또한 차세대 시퀀싱(NGS)하였다. 40%를 초과하는 HbF+ 세포를 야기하는 dgRNA 처리는 74.8% 내지 94.0%의 범위의 편집을 가졌다(표 17). 동일한 표적화 도메인에 대해, 본 실시예에서의 dgRNA는 실시예 3에서와 tracr 및 crRNA 서열이 상이하지만; 편집 및 HbF 유도는 대부분의 표적화 도메인에서 dgRNA 형식들에 걸쳐 유사하였다. 놀랍게도, 현 연구에서의 dgRNA 형식의 CR000317_EH4는 50.7% HbF+ 세포에 높은 HbF 유도를 야기했다. 게놈 편집된 세포에서 유래된 HbF-함유 적혈구의 증가는 감소된 겸상 적혈구로써 긍정적인 치료적 영향을 미칠 가능성이 있다.
실시예 3.2. HSPC에서 BCL11a 인핸서의 +58 영역을 표적화하는 gRNA를 사용한 gRNA 편집 및 태아 헤모글로빈 상향 조절의 최적화.
BCL11a 인핸서의 +58 영역을 표적화하는 gRNA의 포괄적인 스크리닝으로부터의 편집 결과%에 기반하여, 8 gRNA 표적화 도메인을 추가 연구 및 최적화를 위해 선택하였다. 편집, 적혈구계 분화, 및 태아 헤모글로빈 발현%에 대한 gRNA 분자에의 변형의 효과를 테스트하기 위해, BCL11a 인핸서 영역의 +58 영역 내의 부위를 표적화하는 8개 gRNA 분자의 상이한 형태를 설계하였다. CR00309, CR00311, CR00312, CR00316, CR01125, CR01126, CR01127, 및 CR01128의 표적화 도메인을 포함하는 gRNA의 다음의 형태를 제조하였다:
dgRNA(표적화 도메인 외의 모든 서열은 실시예 1에 기재된 바와 같음):
1. 변형되지 않은 crRNA 및 변형되지 않은 tracr("변형되지 않은" 또는 "비변형")
2. 변형되지 않은 crRNA 및 변형되지 않은 tracr, 표시된 표적화 도메인의 5'-18 nt만 포함(전체 20 nt가 아님)("18nt")
3. crRNA의 3개의 3' nt 및 3개의 5' nt가 포스포로티오에이트 연결로 변형된, 및 변형되지 않은 tracr("PS")
4. crRNA의 5'- 및 3'- 말단 둘 다에 추가적인 역위된 무염기 잔기, 및 변형되지 않은 tracr("Invd")
5. crRNA의 3개의 3' nt 및 3개의 5' nt가 포스포로티오에이트 연결 및 2'-O메틸기로 변형된, 및 변형되지 않은 tracr("OMePS")
6. crRNA의 3개의 3' nt 및 3개의 5' nt가 2'-플루오로기로 변형된, 및 변형되지 않은 tracr("F")
7. crRNA의 3개의 3' nt 및 3개의 5' nt가 포스포로티오에이트 연결 및 2'-플루오로기로 변형된, 및 변형되지 않은 tracr("F-PS")
sgRNA(표적화 도메인 외의 모든 서열은 실시예 1에 기재된 바와 같음):
1. 변형되지 않은 sgRNA("변형되지 않은" 또는 "비변형")
2. 표시된 표적화 도메인의 5'-18 nt만으로 구성되는 표적화 도메인(전체 20 nt가 아님)("18nt")
3. sgRNA의 3개의 3' nt 및 3개의 5' nt가 포스포로티오에이트 연결로 변형된("PS")
4. sgRNA의 5'- 및 3'- 말단 둘 다에 추가적인 역위된 무염기 잔기("Invd")
5. sgRNA의 3개의 3' nt 및 3개의 5' nt가 포스포로티오에이트 연결 및 2'-O메틸기로 변형된("OMePS")
6. sgRNA의 3개의 3' nt 및 3개의 5' nt가 2'-플루오로기로 변형된("F")
7. sgRNA의 3개의 3' nt 및 3개의 5' nt가 포스포로티오에이트 연결 및 2'-플루오로기로 변형된("F-PS")
모든 다른 시약 및 방법은 실시예 3에 기재된 바와 같았다. 모든 결과는 2회 반복실험으로 수행하였고, 결과는 도 28 내지 32에 보고하였다. 도 28a 및 도 28b는 표시된 이중 가이드 RNA(dgRNA)를 포함하는 RNP의 전기천공 2 일 후에 CD34+ 세포에서 NGS에 의해 측정된 편집%을 나타낸다. 도 29는 표시된 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 RNP의 전기천공 2 일 후에 CD34+ 세포에서 NGS에 의해 측정된 편집%을 나타낸다. 도 30은 표시된 이중 가이드 RNA(dgRNA)를 포함하는 RNP의 전기천공 후, 적혈구계 분화 배지로 편집된 CD34+ 세포를 옮긴 후 14 일차에 유세포 분석으로 측정한 HbF 양성 세포%를 나타낸다. 도 31은 표시된 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 RNP의 전기천공 후, 적혈구계 분화 배지로 편집된 CD34+ 세포를 옮긴 후 14 일차에 유세포 분석으로 측정한 HbF 양성 세포%를 나타낸다. 도 32는 적혈구계 분화 배지에서의 14 일 후 편집된 세포의 배수-확장을 나타낸다. 이들 결과는 선택된 gRNA 분자 중 많은 것이 dgRNA 및 sgRNA 형식 둘 다에서, 전기천공을 통해 RNP로서 CD34+ 세포로 전달될 때, 90%를 초과하는 효율로 표적 부위에서 게놈 편집을 달성할 수 있으며, 일부 경우에는, 98%를 초과하는 효율로 게놈 편집을 달성할 수 있음을 나타낸다. 또한, 선택된 gRNA 분자 중 많은 것이 변형되지 않은 세포("모의")에 비해 % F 세포에 있어서 20%를 초과하는 증가를 달성할 수 있었다. 최종적으로, HSPC에서의 BCL11A 적혈구계 인핸서의 게놈 편집은, 다른 gRNA(예를 들어 CR00312)보다 일부 gRNA(예를 들어 CR00309)에서 더 뚜렷한 효과로, 적혈구계 세포의 확장 능력을 저하시켰지만, 적혈구로 분화된 대부분의 편집된 세포 집단은 그럼에도 불구하고 생체외 적혈구계 분화 배지에서 14 일 내에 500 내지 1500 사이의 집단 배가를 달성할 수 있었고 이는 편집된 세포가 환자의 겸상 적혈구 질병 또는 베타 탈라세미아와 같은 혈색소병증을 치료하는데 치료적으로 유용할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4. 성인 적혈구계 세포에서의 태아 글로빈 발현 탈억제를 위한 CRISPR-Cas9를 이용한 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)에서의 HPFH 영역 편집
방법:
인간 CD34+ 세포 배양. 제조사의 지시에 따라 면역 선별(Miltenyi)을 이용하여 성인 공여자로부터의 G-CSF 동원된 말초 혈액(AllCells)에서 인간 CD34+ 세포를 단리하고, 트롬보포이에틴(Tpo), Flt3 리간드(Flt-3L, Life Technologies, Cat. #PHC9413), 인간 줄기 세포 인자(SCF, Life Technologies, Cat. #PHC2113) 및 인간 인터루킨-6(IL-6, Life Technologies, Cat. #PHC0063) 각 50 ng/mL뿐만 아니라1x 항생제/항진균제(Gibco, Cat. #10378-016) 및 500nM 화합물 4로 보충된 StemSpan SFEM(StemCell Technologies, Cat no. 09650)를 이용하여 4 내지 6 일 동안 확장하였다. 본 실시예(하위 실시예를 포함하여) 전반에 걸쳐, 세포를 "확장"했다고 프로토콜이 나타내는 경우, 이 배지를 사용하였다. 이와같은 배지는 본 실시예(하위 실시예를 포함하여) 전반에 걸쳐 또한"줄기 세포 확장 배지" 또는 "확장 배지"로 지칭된다.
Cas9 및 가이드 RNA 리보핵산 단백질(RNP) 복합체의 조립, HSPC의 제조, 및 HSPC로의 RNP의 전기천공. Cas9-가이드 RNA 리보핵산 단백질 복합체(RNP)를 전기천공 직전에 제조하였다. 이중 가이드 RNA(dgRNA)를 사용한 RNP 형성을 위해, 각각 3 μg의 crRNA(2.24 μL에) 및 tracr(1.25 μL에)을 먼저 별도의 튜브에서 95℃에서 2 분 동안 변성시킨 다음 실온까지 냉각시킨다. Cas9 단백질의 제조를 위해, 6 μg의 CAS9 단백질(0.8 내지 1 μL에)을 5x CCE 완충제(20 mM HEPES, 100 mM KCL, 5 mM MgCl2, 5% 글리세롤 및 새로 첨가된 1 mM DTT) 0.5 μL와 혼합하였다. Tracr을 먼저 Cas9 조제물과 혼합하고 5분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음에, crRNA를 Tracr/CAS9 복합체에 첨가하고 37℃에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 없음/대조군 조건을 위해, crRNA 대신에 비히클을 Tracr/CAS9 복합체에 첨가하였다. 원심 분리하여 HSC를 수집하고 Neon 전기천공 키트(Invitrogen; Cat#: MPK1096)와 함께 제공되는 T 완충제에 5 x 106 /mL의 세포 밀도로 재현탁하였다. 상하로 피펫팅하여 RNP를20 μL의 세포와 혼합하고 RT에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. RNP/세포 혼합물(10 μL)을 Neon 전기천공 프로브 내로 옮겼다. 전기천공은 1700 볼트/20 밀리초 및 1 펄스를 사용하는 Neon 형질감염 시스템(Invitrogen; MPK5000S)으로 수행하였다. 10 μL의 전기천공을 2회 반복실험으로 수행하였다.
시험관내 적혈구 생성 및 HbF 함유 적혈구계 세포에 대한 FACS 분석. 전기천공 후, 330 μg/mL 인간 홀로-트랜스페린(Invitria Cat# 777TRF029), 10 μg/mL 재조합 인간 인슐린(Gibco Cat#A1138211), 2 IU/mL 헤파린(Sigma, part #H3393), 5% 인간 AB 혈청(Sigma, Cat# H4522), 125 ng/mL 인간 에리트로포이에틴(Peprotech #10779-058), 및 1x 항생제/항진균제(Gibco, Cat. #10378-016)로 보충된 IMDM(Hyclone, Cat. #SH30228.01)으로 구성된 250 μL의 예열된 적혈구계 분화 배지(EDM)로 세포를 즉시 옮겼다. 1 μM 하이드로코르티손(Sigma H8672), 100 ng/mL 인간 SCF(Life Technologies, Cat. #PHC2113) 및 5 ng/mL 인간 IL-3(Peprotech #10779-598)로 EDM을 추가로 보충하였다. 2 일 후에, 세포 배양물을 새 배지에 희석하였다. 배양을 총 7 일 동안 유지하였고, 그 때, HbF 발현에 대한 세포내 염색으로 세포를 분석하였다. 간략하게, 세포를 PBS로 1 회 세척하고, LIVE/DEAD® Fixable Violet Dead 세포 염색(ThermoFisher L34963; PBS에 1:1000)에 재현탁하고 30 분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에, 세포를 세척하고 항-CD71-BV711(Fisher Scientific Company Llc. BDB563767) 및 항-CD235a-APC(BD 551336) 항체로 30 분 동안 염색하였다. 그 다음에, 세포를 세척하고, 그 다음에 고정 완충제(Biolegend, Cat# 420801)로 고정하고 제조사의 지시에 따라 1x 세포내 염색 투과화 세척 완충제(Biolegend, Cat# 421002)로 투과화하였다. 그 다음에, 1x 세포내 염색 투과화 세척 완충제50 μL 중 0.5 μL의 항-HbF-PE 항체(Life Technologies, part #MHFH04)와 함께 세포를 실온에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1x 세포내 염색 투과화 세척 완충제2 mL로 2 회 세척하고 염색 완충제에 재현탁하고 LSRFortessa 유세포 분석기(BD Biosciences) 상에서 HbF 발현을 분석하였다. Flowjo를 사용하여 결과를 분석하였고 데이터는 살아있는 CD71 양성 적혈구계 세포 집단 내 HbF 양성 세포(F-세포)의 %로 표시하였다.
유전자 발현 분석. 기재된 시험관내 적혈구 생성 7 일 후에, Zymo Research ZR-96 quick RNA 키트(Zymo Cat# R1053)를 사용하여 RNA를 정제하는 데 약 1 x 105 세포를 사용하였다. Quantiscript 역전사 키트(Qiagen, Cat# 205313)를 사용하는 제1 가닥 합성에 1 μg 까지의 RNA를 사용하였다. 공급사의 프로토콜에 따라 2x Taq-Man Fast Advance PR 믹스(Life technologies, Cat# 4444963)를 사용하여 Taq-Man 정량적 실시간 PCR을 수행하였으며, GAPDH(Life technologies, ID# Hs02758991_g1, VIC), HBB(Life technologies, ID# Hs00747223_g1, VIC) 및 HBG2/HBG1(Life technologies, ID# Hs00361131_g1, FAM)에 대한 Taq-Man 유전자 발현 검정을 하였다. 각 유전자의 상대적 발현을 GAPDH 발현에 대해 정규화하였고, ΔΔCt 방법에 의해 없음/대조군 RNP-전달된 샘플의 배수로 보고하였다. 대안적으로, 전사체의 GAPDH 정규화된 상대량(2^-ΔCt)으로 전환한 후에, HBG2/HBG1 발현 수준을 HBB 및 HBG2/HBG1 발현의 합계에 대한 백분율로 계산하였다.
게놈 DNA 제조 및 차세대 시퀀싱(NGS). 전기천공 후 48 시간에 Quick Extract DNA 추출 용액(Epicentre Cat# QE09050)을 사용하여, 편집된 및 편집되지 않은 HSPC로부터 게놈 DNA를 제조하였다. 편집 효율과 삽입 및 결실(삽입결실) 패턴을 결정하기 위해, 표적 부위 양 옆에 배치되는 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 생성하고, 그 다음에 분헌에 기재된 바와 같이 차세대 시퀀싱(NGS)하였다. 편집되지 않은 샘플(Cas9 및 Tracr 만으로 구성된 RNP로 전기천공된)에서 상응하는 서열의 편집 퍼센트는 전형적으로 1% 미만이었고 3%를 초과하지 않았다.
결과:
이론에 얽매이지 않고, HPFH 영역의 표적화된 유전적 파괴가 γ-글로빈 발현 억제를 완화하여, 높은 HbF 단백질을 함유하는 적혈구의 생산을 가능하게 하는 것으로 여겨진다(태아 헤모글로빈을 발현하는 세포는 때때로 본원에서 "F-세포"로 지칭된다). 높은 HbF는 산소가 제거된 조건 하에서 적혈구의 겸상화를 방지하고 β-탈라세미아 및 SCD 환자 모두에게 치료/치유력이 있을 것이다. SCD 환자로부터의 생체외 게놈 편집된 HSC로 자가 유래 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 하는 것을 또한 줄기 세포 확장 증진 기술, 예를 들어 WO2010/059401(그 내용의 전문이 참조로 포함됨)에 기재된, 예를 들어 아릴 탄화수소 수용체(AHR) 저해제, 예를 들어 화합물 4와 조합하여 생체외 확장을 개선하고 전달되는 유전자 변형된 HSC의 투여량을 증가시켰다.
프로그램 가능한 뉴클레아제, Cas9를 통한 효율적인 게놈 편집을 위해서, 표적 세포 및 조직으로의 가이드 RNA(gRNA) 및 Cas9 단백질의 성공적인 전달이 필수적이다. 최근 보고는 Cas9 리보핵산 단백질(RNP) 복합체가 전기천공에 의해 표적 세포로 전달될 때 몇몇 상이한 세포 유형에서 효율적이고 특이적인 게놈 편집을 달성할 수 있음을 입증하였다. Cas9-RNP 복합체는 거의 전달 직후에 염색체 DNA를 절단하고 세포에서 빠르게 분해되어, 표적-외 효과를 감소시킨다. 대조적으로, Cas9를 전달하는 데 사용되는 플라스미드 및 바이러스 벡터 시스템의 사용은 시스템과 관련된 표적-외 효과를 악화시키는 효소의 연장된 발현을 야기한다. 추가적으로, 표적 세포로 RNP를 전달하는 것은 추가적인 툴을 필요로 하지 않아 클리닉에서의 치료 목적의 게놈 편집의 번역을 크게 촉진할 것이다. 정제된 재조합 Cas9 단백질 및 gRNA 복합체(RNP)를 배양된 HSPC에 전달하였고 사용된 실험 개요를 도 17에 나타냈다.
재조합 Cas9 단백질을 에스케리치아 콜라이로부터 정제하고, crRNA 및 tracr로 구성되는 합성 이중 gRNA(dgRNA)와 복합체 형성하여 리보핵산 단백질(RNP) 복합체를 생성하였다. 연구에 사용된 gRNA의 목록 및 서열을 표 16에 나타내었다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 전기천공을 통해 CD34+ HSPC로RNP 복합체를 전기천공 하였다. RNP 복합체 전달 전에 세포를 확장시켰다. 활발하게 분열하는 세포는 전기천공에 의해 전달된 RNP 복합체의 흡수를 촉진 할 수 있다.
[표 16]
현 연구에 사용된HPFH 영역을 표적화하는 gRNA 목록. 모든 gRNA 분자를, g8(crRNA는 mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArU*mG*mC*mU로 구성되고, 여기서 N은 표적화 도메인의 잔기이고, 변형은 다음과 같이 표시된다: 2'O-메틸 (m) 및 포스포로티오에이트 결합(*); tracr 서열은 SEQ ID NO: 7808) 및 없음/대조군을 제외하고, 상기 기재된 dgRNA 형식으로 2회 반복실험으로 테스트하였다. g8 및 없음/대조군은 각각 16 반복 실험으로 테스트하였다.
Figure pct00166
Figure pct00167
Figure pct00168
Figure pct00169
Figure pct00170
Figure pct00171
Figure pct00172
게놈 편집된 및 편집되지 않은 HSPC를 태아 글로빈 및 2개의 적혈구계 세포 표면 마커, 트랜스페린 수용체(CD71) 및 글리코포린 A(CD235a)의 발현 수준에 대해 형광 염료에 접합된 항체를 이용하여 유세포 분석하여 분석하였다. Live Dead Violet의 제외에 의해 살아있는 세포를 확인하고 게이팅하였다. 배양된 세포가 편집되지 않은 세포에 유사한 적혈구 모세포와 일치하는 CD71+ 세포 백분율을 나타내었으므로 게놈 편집은 적혈구계 분화에 악영향을 미치지 않았다. HPFH 영역 표적화는 모의 전기천공된 세포(21.0%)에 비해 HbF 함유 적혈구계 세포의 증가된 백분율을(51.4% 까지) 야기했다(표 16). BCL11A의 엑손 2를 표적화하는 g8의 표적화 도메인을 포함하는 dgRNA에 의한 HbF 양성 세포의 유도가 또한 병렬적으로 관찰되었다. 세포 집단에서 편집된 대립유전자의 백분율을 결정하기 위해HPFH 영역의 게놈 PCR 산물을 또한 차세대 시퀀싱(NGS)하였다. Cas9, 주어진 표적화 도메인의 crRNA 및 Tracr를 함유하는 RNP로 전기천공된 세포 배양물의 많은 것에서는 HPFH 유전자좌에서의 높은 게놈 편집 백분율이 관찰되었으나, 표적화 도메인이 전달되지 않은 대조군 세포(오직 Cas9 및 Tracr만 함유하는 RNP)에서는 그렇지 않았다. 특히, 40%를 초과하는 HbF+ 세포를 야기하는 dgRNA 처리는 43.0% 내지 91.7%의 범위의 편집된 대립유전자를 가졌다(표 16).
[표 18]
현 연구에 사용된HPFH 영역을 표적화하는 gRNA로 편집된 선택 배양물의 유전자 발현 분석. 모든 gRNA 분자를 dgRNA 형식으로 2회 반복실험으로 테스트하였다. 태아 감마-글로빈(γ-글로빈, HBG2/HBG1 유전자), 성인 베타글로빈(β-글로빈, HBB 유전자) 및 글리세랄데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH 유전자) 발현을 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 결정하고 보고하였다.
Figure pct00173
이 연구에서의 일부 배양물은 또한 헤모글로빈 유전자 발현에 대해 분석하였다. 이들 표적화 도메인으로, 태아 감마-글로빈 유전자 발현은 없음/대조군 대비 1.6 내지 3.8 배 유도되었고, 이는 성인 베타-글로빈 발현의 약간의 감소를 동반하였다(없음/대조군의 0.58 내지 0.91 배)(표 18). 이들 효과는, HbF 단백질 유도에 대해 관찰된 것과 유사하게 표적화 도메인들에 걸쳐, 상대적인 태아 글로빈 유도(표 16)와 함께, 세포 집단에서 전체 베타-유형 글로빈의 13.8% 내지 26.6% 범위의 감마-글로빈 발현 수준(γ/[γ+β])(표 17)을 야기하였다. 게놈 편집된 세포에서 유래된 적혈구에서 HbF/γ-글로빈의 증가 또는 베타-글로빈(겸상 글로빈) 수준의 감소와 함께 HbF/γ-글로빈의 증가는 감소된 겸상 적혈구로써 치료적 영향을 미칠 가능성이 있다.
실시예 4.2
방법: 방법은 실시예 4에서와 같고, 다음의 예외를 갖는다.
Cas9 및 가이드 RNA 리보핵산 단백질(RNP) 복합체의 조립, HSPC의 제조, 및 HSPC로의 RNP의 전기천공. 원심 분리로 수집된 HSPC를 P3 일차 세포 용액(Lonza cat. No. PBP3-00675)에 2.5 x 106 /mL의 세포 밀도로 재현탁하였다. 상하로 피펫팅하여 RNP를20 μL의 세포와 혼합하고 RT에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. RNP/세포 혼합물(20 μL)을 4D-뉴클레오펙터(Lonza) 상에서 코드 CM-137를 사용하여 전기천공하였다.
결과:
이론에 얽매이지 않고, HPFH 영역의 표적화된 유전적 파괴가 γ-글로빈 발현 억제를 완화하여, 높은 HbF 단백질을 함유하는 적혈구의 생산을 가능하게 하는 것으로 여겨진다(태아 헤모글로빈을 발현하는 세포는 때때로 본원에서 "F-세포"로 지칭된다). 높은 HbF는 산소가 제거된 조건 하에서 적혈구의 겸상화를 방지하고 β-탈라세미아 및 SCD 환자 모두에게 치료/치유력이 있을 것이다. SCD 환자로부터의 생체외 게놈 편집된 HSC로 자가 유래 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 하는 것을 또한 줄기 세포 확장 증진 기술, 예를 들어 WO2010/059401(그 내용의 전문이 참조로 포함됨)에 기재된, 예를 들어 아릴 탄화수소 수용체(AHR) 저해제, 예를 들어 화합물 4와 조합하여 생체외 확장을 개선하고 전달되는 유전자 변형된 HSC의 투여량을 증가시켰다.
프로그램 가능한 뉴클레아제, Cas9를 통한 효율적인 게놈 편집을 위해서, 표적 세포 및 조직으로의 가이드 RNA(gRNA) 및 Cas9 단백질의 성공적인 전달이 필수적이다. 최근 보고는 Cas9 리보핵산 단백질(RNP) 복합체가 전기천공에 의해 표적 세포로 전달될 때 몇몇 상이한 세포 유형에서 효율적이고 특이적인 게놈 편집을 달성할 수 있음을 입증하였다. Cas9-RNP 복합체는 거의 전달 직후에 염색체 DNA를 절단하고 세포에서 빠르게 분해되어, 표적-외 효과를 감소시킨다. 대조적으로, Cas9를 전달하는 데 사용되는 플라스미드 및 바이러스 벡터 시스템의 사용은 시스템과 관련된 표적-외 효과를 악화시키는 효소의 연장된 발현을 야기한다. 추가적으로, 표적 세포로 RNP를 전달하는 것은 추가적인 툴을 필요로 하지 않아 클리닉에서의 치료 목적의 게놈 편집의 번역을 크게 촉진할 것이다. 정제된 재조합 Cas9 단백질 및 gRNA 복합체(RNP)를 배양된 HSPC에 전달하였고 사용된 실험 개요를 도 17에 나타냈다.
재조합 Cas9 단백질을 에스케리치아 콜라이로부터 정제하고, crRNA 및 tracr로 구성되는 합성 이중 gRNA(dgRNA)와 복합체 형성하여 리보핵산 단백질(RNP) 복합체를 생성하였다. 연구에 사용된 gRNA의 목록을 표 19에 나타내었다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 전기천공을 통해 CD34+ HSPC로RNP 복합체를 전기천공 하였다. RNP 복합체 전달 전에 세포를 확장시켰다. 활발하게 분열하는 세포는 전기천공에 의해 전달된 RNP 복합체의 흡수를 촉진 할 수 있다.
[표 19]
현 연구에 사용된HPFH 영역을 표적화하는 gRNA 목록. 모든 gRNA 분자를 dgRNA 형식으로 테스트하였다 (mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArU*mG*mC*mU로 구성되고, 여기서 N은 표적화 도메인의 잔기이며, 변형은 다음과 같이 표시: 2'O-메틸 (m) 및 포스포로티오에이트 결합(*)인 crRNA; SEQ ID NO: 7808 서열의 tracr를 사용하는 dgRNA 형식으로 테스트된 g8을 제외하고).
Figure pct00174
Figure pct00175
Figure pct00176
게놈 편집된 및 편집되지 않은 HSPC를 태아 글로빈 및 2개의 적혈구계 세포 표면 마커, 트랜스페린 수용체(CD71) 및 글리코포린 A(CD235a)의 발현 수준에 대해 형광 염료에 접합된 항체를 이용하여 유세포 분석하여 분석하였다. Live Dead Violet의 제외에 의해 살아있는 세포를 확인하고 게이팅하였다. 배양된 세포가 편집되지 않은 세포에 유사한 적혈구 모세포와 일치하는 CD71+ 세포 백분율을 나타내었으므로 게놈 편집은 적혈구계 분화에 악영향을 미치지 않았다. HPFH 영역 표적화는 모의 전기천공된 세포(18.9 및 21.1%)에 비해 HbF 함유 적혈구계 세포의 증가된 백분율을(46.6% 까지) 야기했다(표 19). 또한, BCL11A의 엑손 2를 표적화하는 g8의 표적화 도메인을 포함하는 dgRNA에 의한 HbF 양성 세포의 유도를 병렬적으로 관찰하였다.
최종적으로, CR003031, CR003033, CR003035, CR003037, CR003038, CR003052, CR003085의 표적화 도메인을 포함하는 dgRNA에 대한 표적 부위에 또는 그 근처에 생성된 삽입결실 패턴을 NGS로 평가하였다. 각 위치에서의 상위 5개의 가장 빈번한 삽입결실을 표 27에 나타냈다.
[표 27]
표시된 gRNA 분자를 포함하는 RNP에 노출 후 각 표적 서열에서 가장 빈번한 5 개의 삽입결실. 각 gRNA를 dgRNA로 테스트하였다. 대문자는 표적 서열에서 및 그 근처에서 천연 발생 뉴클레오티드이다. 변형되지 않은 표적 서열에 대비하여 결실을 "-"로 나타내고, 삽입을 소문자로 나타낸다.
Figure pct00177
Figure pct00178
Figure pct00179
이들 결과는 표시된 gRNA 분자에 의해 표적화된 HPFH 영역의 작은 삽입결실(예를 들어 이 경우, 1 내지 20 뉴클레오티드부터의 삽입결실)이 HbF의 발현 및 생산에 중대한 영향을 미칠 수 있다는, 본원에 기재된 초기 실험으로부터의 결론을 뒷받침한다. 게놈 편집된 세포에서 유래된 HbF-함유 적혈구의 증가는 감소된 겸상 적혈구로서 치료적 영향을 미칠 가능성이 있다.
실시예 4.3
방법: 방법은 실시예 4에서와 같고, 다음의 예외를 갖는다.
인간 CD34+ 세포 배양. 인간 CD34+ 세포를 RNP 전달 전에 확장 배지에서 3 일 동안 확장하였다.
Cas9 및 가이드 RNA 리보핵산 단백질(RNP) 복합체의 조립, HSPC의 제조, 및 HSPC로의 RNP의 전기천공. 원심 분리하여 HSC를 수집하고 P3 일차 세포 용액(Lonza cat. No. PBP3-00675)에 6.4 x 106/mL의 세포 밀도로 재현탁하였다. 상하로 피펫팅하여 RNP를20 μL의 세포와 혼합하고 RT에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. RNP/세포 혼합물(20 μL)을 4D-뉴클레오펙터(Lonza) 상에서 코드 CM-137를 사용하여 전기천공하였다. 전기천공을 2회 반복실험으로 수행하였다. Tracr는 SEQ ID NO: 7808이고, crRNA은 표시된 2'O-메틸 (m) 및 포스포로티오에이트 결합(*) 변형과 함께 다음의 형식을 가졌다: mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArU*mG*mC*mU, 여기서 N은 표적화 도메인의 뉴클레오티드이다.
시험관내 적혈구 생성 및 HbF 함유 적혈구계 세포에 대한 FACS 분석. 전기천공 후, EDM 및 보충물로 구성된 예열된 배지로 세포를 즉시 옮겼다. 배양 0 내지 7 일 동안, 1 μM 하이드로코르티손(Sigma H8672), 100 ng/mL 인간 SCF(Life Technologies, Cat. #PHC2113) 및 5 ng/mL 인간 IL-3(Peprotech #10779-598)로 EDM을 추가로 보충하였다. 배양 7 내지 11 일 동안은, 100 ng/mL의 인간 SCF만으로 EDM을 보충하였다. 배양 11 내지 21 일 동안은 EDM을 추가로 보충하지 않았다. 0 일차에 세포 배양을 ml 당 2.6 x 104 세포로 개시하고, 7 일차에 ml 당 4.0 x 104 세포로 조정하며, 11 일차에 ml 당 1.0 x 106 세포로 조정하였다. 14 및 19 일차에, 배지를 보충하였다. RNP 전달 후 1, 4, 7, 11, 14 및 21에, 살아있는 세포를 계수하였다. 모든 살아있는 세포 계수는 생존불가 세포를 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 염색으로 식별하여 AccuCheck Counting 비드(ThermoFisher cat. No. PCB100)를 사용하는 유세포 분석으로 결정하였다. 배양 7, 16 및 21 일차에, HbF 발현에 대한 세포내 염색으로 세포(1 x 105)를 분석하였다. 배양 16 및 21 일차에, HbF 발현에 대한 세포내 염색은 항-CD71 및 항-CD235a 항체를 포함하지 않았고, 전체 살아있는 세포 집단 내 HbF 양성 세포(F-세포)의 %를 보고하였다. 21 일 째에, 생존능 염료로서 LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead 세포 염색(ThermoFisher L34975)를 사용하였다.
게놈 DNA 제조 및 차세대 시퀀싱(NGS). 전기천공 후 7 일에 Quick Extract DNA 추출 용액(Epicentre Cat# QE09050)을 사용하여, 편집된 및 편집되지 않은 HSPC로부터 게놈 DNA를 제조하였다.
결과:
이론에 얽매이지 않고, HPFH 영역의 표적화된 유전적 파괴가 γ-글로빈 발현 억제를 완화하여, 높은 HbF 단백질을 함유하는 적혈구의 생산을 가능하게 하는 것으로 여겨진다(태아 헤모글로빈을 발현하는 세포는 때때로 본원에서 "F-세포"로 지칭된다). 높은 HbF는 산소가 제거된 조건 하에서 적혈구의 겸상화를 방지하고 β-탈라세미아 및 SCD 환자 모두에게 치료/치유력이 있을 것이다. SCD 환자로부터의 생체외 게놈 편집된 HSC로 자가 유래 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 하는 것을 또한 줄기 세포 확장 증진 기술, 예를 들어 WO2010/059401(그 내용의 전문이 참조로 포함됨)에 기재된, 예를 들어 아릴 탄화수소 수용체(AHR) 저해제, 예를 들어 화합물 4와 조합하여 생체외 확장을 개선하고 전달되는 유전자 변형된 HSC의 투여량을 증가시켰다.
프로그램 가능한 뉴클레아제, Cas9를 통한 효율적인 게놈 편집을 위해서, 표적 세포 및 조직으로의 가이드 RNA(gRNA) 및 Cas9 단백질의 성공적인 전달이 필수적이다. 최근 보고는 Cas9 리보핵산 단백질(RNP) 복합체가 전기천공에 의해 표적 세포로 전달될 때 몇몇 상이한 세포 유형에서 효율적이고 특이적인 게놈 편집을 달성할 수 있음을 입증하였다. Cas9-RNP 복합체는 거의 전달 직후에 염색체 DNA를 절단하고 세포에서 빠르게 분해되어, 표적-외 효과를 감소시킨다. 대조적으로, Cas9를 전달하는 데 사용되는 플라스미드 및 바이러스 벡터 시스템의 사용은 시스템과 관련된 표적-외 효과를 악화시키는 효소의 연장된 발현을 야기한다. 추가적으로, 표적 세포로 RNP를 전달하는 것은 추가적인 툴을 필요로 하지 않아 클리닉에서의 치료 목적의 게놈 편집의 번역을 크게 촉진할 것이다. 정제된 재조합 Cas9 단백질 및 gRNA 복합체(RNP)를 배양된 HSPC에 전달하였고 사용된 실험 개요를 도 17에 나타냈다.
재조합 Cas9 단백질을 에스케리치아 콜라이로부터 정제하고, crRNA 및 tracr로 구성되는 합성 이중 gRNA(dgRNA)와 복합체 형성하여 리보핵산 단백질(RNP) 복합체를 생성하였다. 연구에 사용된 gRNA의 목록을 표 20에 나타내었다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 전기천공을 통해 CD34+ HSPC로RNP 복합체를 전기천공 하였다. RNP 복합체 전달 전에 세포를 확장시켰다. 활발하게 분열하는 세포는 전기천공에 의해 전달된 RNP 복합체의 흡수를 촉진 할 수 있다.
[표 20]
현 연구에서의 상대적 살아있는 세포 증식. 개개의 전기천공 반복실험이 나타난다. 모든 gRNA 분자를 SEQ ID NO: 7808의 tracr, 및 표시된 2'O-메틸 (m) 및 포스포로티오에이트 결합(*) 변형과 함께 다음의 형식을 갖는 crRNA를 사용하는 dgRNA 형식으로 테스트하였다: mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArU*mG*mC*mU, 여기서 N은 표적화 도메인의 뉴클레오티드이다. (n.d. 결정되지 않음)
Figure pct00180
게놈 편집된 및 편집되지 않은 HSPC는 3 단계 적혈구계 분화 세포 배양 프로토콜에서 증식을 분석하였다. 전기천공 1 일 후에 세포 회복 퍼센트는 58% 내지 96% 범위였고, 편집되지 않았으나 전기천공된 대조군을 포함하는, 조건들에 걸쳐 유사하였다(표 20). BCL11A의 엑손 2를 표적화하는 g8의 표적화 도메인을 포함하는 dgRNA에 의해 편집된 세포에서는 증식이 억제되었으나(21 일차에 편집되지 않은 대조군의 10 내지 12%, 표 20), 포함된 HPFH 영역 표적화하는 dgRNA로 편집된 세포의 증식은 대조군과 유사하였다(21 일차에 편집되지 않은 대조군의 47 내지 99%, 표 20).
[표 21]
현 연구에서의 HbF 유도. 개개의 전기천공 반복실험이 나타난다. 모든 gRNA 분자를 dgRNA 형식으로 테스트하였다. 모든 gRNA 분자를 SEQ ID NO: 7808의 tracr, 및 표시된 2'O-메틸 (m) 및 포스포로티오에이트 결합(*) 변형과 함께 다음의 형식을 갖는 crRNA를 사용하는 dgRNA 형식으로 테스트하였다: mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArU*mG*mC*mU, 여기서 N은 표적화 도메인의 뉴클레오티드이다. (n.d. 결정되지 않음)
Figure pct00181
게놈 편집된 및 편집되지 않은 HSPC를 태아 글로빈 및 2개의 적혈구계 세포 표면 마커, 트랜스페린 수용체(CD71) 및 글리코포린 A(CD235a)의 발현 수준에 대해 형광 염료에 접합된 항체를 이용하여 유세포 분석하여 분석하였다. Live/Dead Fixable Dead 세포 염색의 제외에 의해 살아있는 세포를 확인하고 게이팅하였다. 배양된 세포가 분화 7일차에 편집되지 않은 세포에 유사한 적혈구 모세포와 일치하는 CD71+ 세포 백분율을 나타내었으므로 게놈 편집은 적혈구계 분화에 악영향을 미치지 않았다. 포함된 HPFH 영역 표적화하는 dgRNA로 처리된 배양물은 21 일 배양 기간 전체에 걸쳐 모의 전기천공된 세포에 비해 HbF 함유 적혈구계 세포의 증가된 백분율을 야기했다(표 21). BCL11A의 엑손 2를 표적화하는 g8의 표적화 도메인을 포함하는 dgRNA에 의한 HbF 양성 세포의 유도가 또한 병렬적으로 관찰되었다. 세포 집단에서 편집된 대립유전자의 백분율을 결정하기 위해HPFH 영역의 게놈 PCR 산물을 또한 차세대 시퀀싱(NGS)하였다. Cas9, 주어진 표적화 도메인의 crRNA 및 Tracr를 함유하는 RNP로 전기천공된 세포 배양물에서는 HPFH 유전자좌에서의 게놈 편집이 관찰되었으나(표 21), 표적화 도메인이 전달되지 않은 대조군 세포(오직 Cas9 및 Tracr만 함유하는 RNP)에서는 그렇지 않았다. 게놈 편집된 세포에서 유래된 HbF-함유 적혈구의 증가는 감소된 겸상 적혈구로써 치료적 영향을 미칠 가능성이 있다.
실시예 4.4
방법: 방법은 실시예 4에서와 같고, 다음의 예외를 갖는다.
인간 CD34+ 세포 배양. 인간 CD34+ 세포를 RNP 전달 전에 확장 배지에서 연구에 따라, 3 내지 6 일 동안 확장하였다.
Cas9 및 가이드 RNA 리보핵산 단백질(RNP) 복합체의 조립, HSPC의 제조, 및 HSPC로의 RNP의 전기천공. 일부 연구를 위하여, RNP 복합체를 4D-뉴클레오펙터(Lonza)를 이용하여 전달하였다. 그들 연구에서, 원심 분리하여 HSPC를 수집하고 P3 일차 세포 용액(Lonza cat. No. PBP3-00675)에 연구에 따라, 2.2 x 106 /mL 내지 6.4 x 106 /mL의 세포 밀도로 재현탁하였다. 상하로 피펫팅하여 RNP를20 μL의 세포와 혼합하고 RT에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. RNP/세포 혼합물(20 μL)을 4D-뉴클레오펙터(Lonza) 상에서 코드 CM-137를 사용하여 전기천공하였다. 전기천공을 2회 반복실험으로 수행하였다. dgRNA 형식은 연구들 간에 달랐고 다음의 표기법에 의해 표 22에 표시된다. 형태 A는 표시된 표적화 도메인 서열을 갖는, 상기 실시예 1에 기재된 dgRNA 형식이다. 형태 B는 rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU, 여기서 r은 RNA 염기를 나타내고 N은 표시된 표적화 도메인 서열에 해당하는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 7808로 구성되는 tracr을 사용하는 dgRNA 형식이다. 형태 C는 mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArU*mG*mC*mU, 여기서 r은 RNA 염기를 나타내고 N은 표시된 표적화 도메인 서열에 해당하며, m은 2'O-메틸 변형을 갖는 염기를 나타내고, *는 포스포로티오에이트 결합을 나타내는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 7808로 구성되는 tracr을 사용하는 dgRNA 형식이다.
시험관내 적혈구 생성 및 HbF 함유 적혈구계 세포에 대한 FACS 분석. 일 연구에서, 세포 배양을 0 일차에 ml 당 2.6 x 104 세포로 개시하였다. 250 μl로 바로 시딩(실시예 4에 기재된 바와 같이)함으로써 개시된 것들에 대해서, 세포 배양물을, 연구에 따라, 1 내지 3 일 후 새 배지에 희석하였다.
게놈 DNA 제조 및 차세대 시퀀싱(NGS). 전기천공 후 24 시간 내지 7 일에, 연구에 따라, Quick Extract DNA 추출 용액(Epicentre Cat# QE09050)를 사용하여, 편집된 및 편집되지 않은 HSPC로부터 게놈 DNA를 제조하였다.
결과:
이론에 얽매이지 않고, HPFH 영역의 표적화된 유전적 파괴가 γ-글로빈 발현 억제를 완화하여, 높은 HbF 단백질을 함유하는 적혈구의 생산을 가능하게 하는 것으로 여겨진다(태아 헤모글로빈을 발현하는 세포는 때때로 본원에서 "F-세포"로 지칭된다). 높은 HbF는 산소가 제거된 조건 하에서 적혈구의 겸상화를 방지하고 β-탈라세미아 및 SCD 환자 모두에게 치료/치유력이 있을 것이다. SCD 환자로부터의 생체외 게놈 편집된 HSC로 자가 유래 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 하는 것을 또한 줄기 세포 확장 증진 기술, 예를 들어 WO2010/059401(그 내용의 전문이 참조로 포함됨)에 기재된, 예를 들어 아릴 탄화수소 수용체(AHR) 저해제, 예를 들어 화합물 4와 조합하여 생체외 확장을 개선하고 전달되는 유전자 변형된 HSC의 투여량을 증가시켰다.
프로그램 가능한 뉴클레아제, Cas9를 통한 효율적인 게놈 편집을 위해서, 표적 세포 및 조직으로의 가이드 RNA(gRNA) 및 Cas9 단백질의 성공적인 전달이 필수적이다. 최근 보고는 Cas9 리보핵산 단백질(RNP) 복합체가 전기천공에 의해 표적 세포로 전달될 때 몇몇 상이한 세포 유형에서 효율적이고 특이적인 게놈 편집을 달성할 수 있음을 입증하였다. Cas9-RNP 복합체는 거의 전달 직후에 염색체 DNA를 절단하고 세포에서 빠르게 분해되어, 표적-외 효과를 감소시킨다. 대조적으로, Cas9를 전달하는 데 사용되는 플라스미드 및 바이러스 벡터 시스템의 사용은 시스템과 관련된 표적-외 효과를 악화시키는 효소의 연장된 발현을 야기한다. 추가적으로, 표적 세포로 RNP를 전달하는 것은 추가적인 툴을 필요로 하지 않아 클리닉에서의 치료 목적의 게놈 편집의 번역을 크게 촉진할 것이다. 정제된 재조합 Cas9 단백질 및 gRNA 복합체(RNP)를 배양된 HSPC에 전달하였고 사용된 실험 개요를 도 17에 나타냈다.
재조합 Cas9 단백질을 에스케리치아 콜라이로부터 정제하고, crRNA 및 tracr로 구성되는 합성 이중 gRNA(dgRNA)와 복합체 형성하여 리보핵산 단백질(RNP) 복합체를 생성하였다. 연구에 사용된 gRNA의 목록을 표 22에 나타내었다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 전기천공을 통해 CD34+ HSPC로RNP 복합체를 전기천공 하였다. RNP 복합체 전달 전에 세포를 확장시켰다. 활발하게 분열하는 세포는 전기천공에 의해 전달된 RNP 복합체의 흡수를 촉진 할 수 있다.
[표 22]
HPFH 영역을 표적화하는 표시된 gRNA 및 대조군을 평가하는 다수 연구에 대한 데이터 개요. 모든 gRNA 분자를 dgRNA 형식으로 테스트하였다. 표시된 연구에서의 dgRNA 형식의 상세 내용을 상기 기재된 바와 같이 특정한다. 평가 4 및 5는 병렬적으로 수행하였고 따라서 동일한 대조군 조건을 가짐을 주목한다.
Figure pct00182
Figure pct00183
Figure pct00184
게놈 편집된 및 편집되지 않은 HSPC를 태아 글로빈 및 2개의 적혈구계 세포 표면 마커, 트랜스페린 수용체(CD71) 및 글리코포린 A(CD235a)의 발현 수준에 대해 형광 염료에 접합된 항체를 이용하여 유세포 분석하여 분석하였다. Live Dead Violet의 제외에 의해 살아있는 세포를 확인하고 게이팅하였다. HPFH 영역 표적화는 모의 전기천공된 세포에 비해 HbF 함유 적혈구계 세포의 증가된 백분율을 야기했으며, 다수의 평가 및 dgRNA 형식들에 걸쳐 일관된 결과였다(표 22). 일부 경우에, %HbF+세포의 증가는 특정 dgRNA 형태, 예를 들어 CR001028에 대하여 형태 C와 관련되었다(표 22). BCL11A의 엑손 2를 표적화하는 g8의 표적화 도메인을 포함하는 dgRNA에 의한 HbF 양성 세포의 유도가 또한 병렬적으로 관찰되었다. 세포 집단에서 편집된 대립유전자의 백분율을 결정하기 위해HPFH 영역의 게놈 PCR 산물을 또한 차세대 시퀀싱(NGS)하였다. Cas9, 주어진 표적화 도메인의 crRNA 및 Tracr를 함유하는 RNP로 전기천공된 세포 배양물에서는 HPFH 유전자좌에서의 게놈 편집이 관찰되었으나(표 22), 표적화 도메인이 전달되지 않은 대조군 세포(오직 Cas9 및 Tracr만 함유하는 RNP)에서는 그렇지 않았다.
최종적으로, 각 삽입결실의 삽입결실 패턴뿐만 아니라 빈도를 각 gRNA 에 대하여 NGS로 평가하였다. 각 표적 부위에서 가장 빈번하게 발생하는 삽입결실을 표 26에 나타낸다.
[표 26]
표시된 gRNA 분자를 포함하는 RNP에 노출 후 각 표적 서열에서 가장 빈번한 5 개의 삽입결실. 각 gRNA를 2개의 별개 실험에서 dgRNA 형식으로 테스트하였고, 결과를 각 실험에 대하여 별도로 나타낸다. 대문자는 표적 서열에서 및 그 근처에서 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드이다. 변형되지 않은 표적 서열에 대비하여 결실을 "-"로 나타내고, 삽입을 소문자로 나타낸다.
Figure pct00185
Figure pct00186
Figure pct00187
Figure pct00188
Figure pct00189
Figure pct00190
Figure pct00191
일부 경우에는, 가장 빈번한 삽입결실의 상대적인 과다가 실험마다 달랐지만, 임의의 주어진 gRNA에 대해 두 실험에 걸쳐 상위 삽입결실은 대체로 동일하였다. 이는 이들 dgRNA에 대해, HSC 세포에서 생성된 삽입결실 패턴이 일관되었음을 나타낸다. 또한, 이들 결과는 이들 gRNA에 의해 표적화된 HPFH 영역의 작은 삽입결실(예를 들어 이 경우, 1 내지 20 뉴클레오티드부터의 삽입결실)이 태아 헤모글로빈의 중대한 상향조절을 야기할 수 있다는, 초기 실험으로부터의 놀라운 발견을 뒷받침한다. 게놈 편집된 세포에서 유래된 HbF-함유 적혈구의 증가는 감소된 겸상 적혈구로써 치료적 영향을 미칠 가능성이 있다.
실시예 4.5
방법: 방법은 하위-실시예 4.1에서와 같고, 다음의 예외를 갖는다.
인간 CD34+ 세포 배양. 인간 CD34+ 세포는 골수에서 유래되었다(Hemacare Corporation, Cat. No. BM34C-3). CD34+ 세포를 해동하고 RNP 전달 전에 확장 배지에서 1 일 동안 확장하였다. RNP 전달 후에, 세포를 즉시 200 μl 확장 배지로 다시 옮기고 밤새 회복하도록 하였다. 다음 날, 배양물을 계수하고 ml 당 2.0 x 105 살아있는 세포로 조정하였다. 전기천공된 살아있는 세포 대비 백분율로서 RNP 전달 1 일 후 살아있는 세포 계수로 회복 퍼센트를 계산하였다. 확장 배지에서의 추가적인 7 일 후에(RNP 전달 후 8 일), 살아있는 세포 계수를 다시 결정하였다. 확장 배지에서의 7 일 후의 살아있는 세포 계수를 ml 당 2.0 x 105 세포로 나눈 것으로 증식 배수를 계산하였다. 모든 살아있는 세포 계수는 생존불가 세포를 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 염색으로 식별하여 AccuCheck Counting 비드(ThermoFisher cat. No. PCB100)를 사용하는 유세포 분석으로 측정하였다. 확장 배지에서의 추가적인 1 일 후에(RNP 전달 후 9 일), 세포 표현형 분석 하에 기재된 바와 같이 유세포 분석으로 세포 배양물을 표현형 분석하였다.
Cas9 및 가이드 RNA 리보핵산 단백질(RNP) 복합체의 조립, HSPC의 제조, 및 HSPC로의 RNP의 전기천공. 원심 분리하여 HSPC를 수집하고 P3 일차 세포 용액(Lonza cat. No. PBP3-00675)에 5.4 x 106 /mL의 세포 밀도로 재현탁하였다. 상하로 피펫팅하여 RNP를20 μL의 세포와 혼합하고 RT에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. RNP/세포 혼합물(20 μL)을 4D-뉴클레오펙터(Lonza) 상에서 코드 CM-137를 사용하여 전기천공하였다. 전기천공을 2회 반복실험으로 수행하였다. 사용된 crRNA는 mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArU*mG*mC*mU 서열이고, 여기서 r은 RNA 염기를 나타내고, m은 2'O-메틸 변형을 갖는 염기를 나타내며, *는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. N은 표시된 표적화 도메인의 잔기를 나타낸다. 사용된 tracr 서열은 SEQ ID NO: 7808였다.
콜로니 형성 단위 세포 검정. RNP 전달 다음 날, 인간 CD34+ 세포 배양에 기재된 바와 같이 살아있는 세포를 계수하였다. 과립구/대식세포 전구체 콜로니 형성 단위(CFU) 검정을 위해, Methocult H4035 메틸셀룰로스 배지(StemCell Technologies) 1 mL 당 227 세포를 2 회 플레이팅 하였다. 1x 항생제/항진균제(Gibco, Cat. #10378-016)를 Methocult에 첨가하였다. 배양 디쉬를 37℃의 가습된 배양기에서 인큐베이션하였다. 플레이팅 후 15 일차에 적어도 50개 세포를 함유하는 콜로니를 계수하였다. Methocult ml 당 콜로니 수를 227로 나누고 1000을 곱하여 1000 세포 당 CFU 빈도를 수득하였다.
세포 표현형 분석. 세포를 다음의 항체 패널로 염색 후에 표면 마커 발현에 대하여 분석하였다. 패널 1: CD38(FITC-접합체, BD Biosciences #340926, 클론 HB7), CD133 에피토프 1(PE-접합체, Miltenyi #130-080-801, 클론 AC133), CD34(PerCP-접합체, BD Biosciences #340666, 클론 8G12), CD90(APC-접합체, BD Biosciences #598695, 클론 E10), CD45RA(Pe-Cy7-접합체, eBioscience #25-0458-42, 클론 HI100) 특이적 항체. 패널 2: CD34(PerCP-접합체, BD Biosciences #340666, 클론 8G12), CD33(PE-Cy7-접합체, BD Biosciences #333946, 클론 P67.6), CD14(APC-H7-접합체, BD Biosciences #560270, 클론 MφP9), CD15(PE-접합체, Biolegend #301905, 클론 HI98). 패널 3: CD34(PerCP-접합체, BD Biosciences #340666, 클론 8G12), CD41a(APC-H7-접합체, BD Biosciences #561422, 클론 HIP8), CD71(FITC-접합체, BD Biosciences #555536, 클론 M-A712), CD19(PE-접합체, BD Biosciences #340720, 클론 SJ25C1), CD56(APC-접합체, Biolegend #318310, 클론 HCD56). 상응하는 이소형 대조군 항체 패널을, 항-CD45RA를 그의 이소형 대조군 대신 포함한 것을 제외하고, 병렬적으로 배양물 염색하는 데 사용하였다. 생존불가 세포는 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 염색으로 식별하였다. 염색된 샘플을 LSRFortessa 유세포 분석기(BD Biosciences) 상에서 세포 표면 단백질 발현에 대하여 분석하였다. 결과를 Flowjo를 사용하여 분석하였고, 데이터를 DAPI 음성 살아있는 세포 집단 대비 %로서 표시하였다.
게놈 DNA 제조 및 차세대 시퀀싱(NGS). 전기천공 후 1 및 8 일에, Quick Extract DNA 추출 용액(Epicentre Cat# QE09050)를 사용하여, 편집된 및 편집되지 않은 HSPC로부터 게놈 DNA를 제조하였다.
결과:
이론에 얽매이지 않고, HPFH 또는 BCL11A 적혈구계 인핸서 영역의 표적화된 유전적 파괴가 γ-글로빈 발현 억제를 완화하여, 높은 HbF 단백질을 함유하는 적혈구의 생산을 가능하게 하는 것으로 여겨진다(태아 헤모글로빈을 발현하는 세포는 때때로 본원에서 "F-세포"로 지칭된다). 높은 HbF는 산소가 제거된 조건 하에서 적혈구의 겸상화를 방지하고 β-탈라세미아 및 SCD 환자 모두에게 치료/치유력이 있을 것이다. SCD 환자로부터의 생체외 게놈 편집된 HSC로 자가 유래 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 하는 것을 또한 줄기 세포 확장 증진 기술, 예를 들어 WO2010/059401(그 내용의 전문이 참조로 포함됨)에 기재된, 예를 들어 아릴 탄화수소 수용체(AHR) 저해제, 예를 들어 화합물 4와 조합하여 생체외 확장을 개선하고 전달되는 유전자 변형된 HSC의 투여량을 증가시켰다.
프로그램 가능한 뉴클레아제, Cas9를 통한 효율적인 게놈 편집을 위해서, 표적 세포 및 조직으로의 가이드 RNA(gRNA) 및 Cas9 단백질의 성공적인 전달이 필수적이다. 최근 보고는 Cas9 리보핵산 단백질(RNP) 복합체가 전기천공에 의해 표적 세포로 전달될 때 몇몇 상이한 세포 유형에서 효율적이고 특이적인 게놈 편집을 달성할 수 있음을 입증하였다. Cas9-RNP 복합체는 거의 전달 직후에 염색체 DNA를 절단하고 세포에서 빠르게 분해되어, 표적-외 효과를 감소시킨다. 대조적으로, Cas9를 전달하는 데 사용되는 플라스미드 및 바이러스 벡터 시스템의 사용은 시스템과 관련된 표적-외 효과를 악화시키는 효소의 연장된 발현을 야기한다. 추가적으로, 표적 세포로 RNP를 전달하는 것은 추가적인 툴을 필요로 하지 않아 클리닉에서의 치료 목적의 게놈 편집의 번역을 크게 촉진할 것이다. 정제된 재조합 Cas9 단백질 및 gRNA 복합체(RNP)를 배양된 HSPC에 전달하였고 사용된 실험 개요를 도 17에 나타냈다.
재조합 Cas9 단백질을 에스케리치아 콜라이로부터 정제하고, crRNA 및 tracr로 구성되는 합성 이중 gRNA(dgRNA)와 복합체 형성하여 리보핵산 단백질(RNP) 복합체를 생성하였다. 연구에 사용된 gRNA의 목록을 표 23에 나타내었다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 전기천공을 통해 CD34+ HSPC로RNP 복합체를 전기천공 하였다. RNP 복합체 전달 전에 세포를 확장시켰다. 활발하게 분열하는 세포는 전기천공에 의해 전달된 RNP 복합체의 흡수를 촉진 할 수 있다.
[표 23]
현 연구에서의 편집된 및 편집되지 않은 세포 배양물에 대한 상대적 살아있는 세포 회복, CD34+ 배지에서의 증식, 및 과립구/대식세포 전구체 콜로니 형성 단위(CFU) 빈도. 회복 퍼센트, 증식 배수 및 CFU 빈도를 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 계산하였다. 개개의 전기천공 반복실험이 나타난다. 모든 gRNA 분자를 dgRNA 형식으로 테스트하였다. Tracr 서열은 SEQ ID NO: 7808였고, crRNA는 표시된 2'O-메틸 (m) 및 포스포로티오에이트 결합(*) 변형과 함께 다음의 형식을 갖는다: mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArU*mG*mC*mU, 여기서 N은 표시된 표적화 도메인의 잔기이다.
Figure pct00192
전기천공 1일 후의 세포 회복 퍼센트는 72.5% 내지 89.8% 범위였고 편집되지 않았지만 전기천공된 대조군을 포함하는, 조건들에 걸쳐 유사했다(표 23). 게놈 편집된 및 편집되지 않은 HSPC을 CD34+ 세포 확장 배지에서의 증식에 대해 분석하였다. 증식은 편집된 세포 배양물에 대해서는 7 일 동안 4.8 배 내지 17.3 배의 범위였고 편집되지 않은 세포에 대해서는 19.3 내지 20.5 배의 범위였다(표 22). HPFH 또는 BCL11A 적혈구계 인핸서 영역을 표적화하는 이 연구에서 dgRNA에 의한 편집은 표면 마커 발현에 의해 결정된 바와 같이, 편집되지 않은 대조군에 비해 배양물 내 세포 유형의 조성을 변경하지 않았고, 이는 이들 부위를 표적화하는 것이 이들 조건 하에 HSPC 운명을 변경하지 않는다는 것을 나타낸다(도 26a 내지 도 26b). 대조적으로, BCL11A 엑손에서 g8을 표적화하는 dgRNA로 편집한 것은, 증식에서의 약간의 감소를 야기했으나 세포 조성에서 현저한 변화, 특히 모든 CD34+ HSPC 하위-유형뿐만 아니라 CD71+ 적혈구계 집단의 백분율 감소 및 CD14+ 단구 및 CD15+ 과립구 집단의 백분율 증가를 야기하였다(표 23 및 도 26a 내지 도 26b). 과립구/대식세포 전구체 콜로니 형성 단위(CFU)의 빈도는 편집된 배양물에 걸쳐 유사하였고, 편집되지 않은 배양물(1000 세포 당 154 내지 185 CFU)과 비교하여 편집된 배양물(1000 세포 당 95 내지 145 범위의 CFU)에서 단지 약간의 CFU 감소가 있었으며, 이는 과립구/대식세포 전구체 기능이 이들 부위를 표적화하는 것에 의해 크게 변경되지 않음을 시사한다(표 23).
실시예 4.6
방법: 방법은 실시예 4에서와 같고, 다음의 예외를 갖는다.
Cas9 및 가이드 RNA 리보핵산 단백질(RNP) 복합체의 조립, HSPC의 제조, 및 HSPC로의 RNP의 전기천공. 일부 경우에, 2개의 상이한 표적화 도메인을 함유하는 crRNA를 동일한 세포 배양물 내로 전달하였다. 이들 경우에, 세포로 전달된 총 RNP는 하위-실시예 4.2에서와 같이, 6 μg의 Cas9, 3 μg의 crRNA 및 3 μg의 Tracr를 함유하였으나; 각각 1.5 μg를 함유하는 2개의 crRNA는 1.5 μg Tracr 및 3 μg Cas9를 함유하는 Tracr/CAS9 혼합물과 독립적으로 복합체 형성하고 세포에 첨가될 때에만 조합하였다. 원심 분리로 수집된 HSPC를 P3 일차 세포 용액(Lonza cat. No. PBP3-00675)에 2.5x106 /mL의 세포 밀도로 재현탁하였다. 상하로 피펫팅하여 RNP를20 μL의 세포와 혼합하고 RT에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. RNP/세포 혼합물(20 μL)을 4D-뉴클레오펙터(Lonza) 상에서 코드 CM-137를 사용하여 전기천공하였다. 전기천공을 2회 반복실험으로 수행하였다. dgRNA 형식은 SEQ ID NO: 7808를 갖는 tracr, 및 mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArU*mG*mC*mU 서열의 crRNA를 사용하였고, 여기서 r은 RNA 염기를 나타내고, m은 2'O-메틸 변형을 갖는 염기를 나타내며, *는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, N은 표시된 표적화 도메인의 잔기를 나타낸다.
시험관내 적혈구 생성 및 HbF 함유 적혈구계 세포에 대한 FACS 분석. 3 일 후에, 세포 배양물을 새 배지에 희석하였다.
게놈 DNA 제조 및 차세대 시퀀싱(NGS). 전기천공 후 3 일에 Quick Extract DNA 추출 용액(Epicentre Cat# QE09050)를 사용하여, 편집된 및 편집되지 않은 HSPC로부터 게놈 DNA를 제조하였다.
결과:
이론에 얽매이지 않고, HPFH 또는 BCL11A 적혈구계 인핸서 영역의 표적화된 유전적 파괴가 γ-글로빈 발현 억제를 완화하여, 높은 HbF 단백질을 함유하는 적혈구의 생산을 가능하게 하는 것으로 여겨진다(태아 헤모글로빈을 발현하는 세포는 때때로 본원에서 "F-세포"로 지칭된다). 높은 HbF는 산소가 제거된 조건 하에서 적혈구의 겸상화를 방지하고 β-탈라세미아 및 SCD 환자 모두에게 치료/치유력이 있을 것이다. SCD 환자로부터의 생체외 게놈 편집된 HSC로 자가 유래 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 하는 것을 또한 줄기 세포 확장 증진 기술, 예를 들어 WO2010/059401(그 내용의 전문이 참조로 포함됨)에 기재된, 예를 들어 아릴 탄화수소 수용체(AHR) 저해제, 예를 들어 화합물 4와 조합하여 생체외 확장을 개선하고 전달되는 유전자 변형된 HSC의 투여량을 증가시켰다.
프로그램 가능한 뉴클레아제, Cas9를 통한 효율적인 게놈 편집을 위해서, 표적 세포 및 조직으로의 가이드 RNA(gRNA) 및 Cas9 단백질의 성공적인 전달이 필수적이다. 최근 보고는 Cas9 리보핵산 단백질(RNP) 복합체가 전기천공에 의해 표적 세포로 전달될 때 몇몇 상이한 세포 유형에서 효율적이고 특이적인 게놈 편집을 달성할 수 있음을 입증하였다. Cas9-RNP 복합체는 거의 전달 직후에 염색체 DNA를 절단하고 세포에서 빠르게 분해되어, 표적-외 효과를 감소시킨다. 대조적으로, Cas9를 전달하는 데 사용되는 플라스미드 및 바이러스 벡터 시스템의 사용은 시스템과 관련된 표적-외 효과를 악화시키는 효소의 연장된 발현을 야기한다. 추가적으로, 표적 세포로 RNP를 전달하는 것은 추가적인 툴을 필요로 하지 않아 클리닉에서의 치료 목적의 게놈 편집의 번역을 크게 촉진할 것이다. 정제된 재조합 Cas9 단백질 및 gRNA 복합체(RNP)를 배양된 HSPC에 전달하였고 사용된 실험 개요를 도 17에 나타냈다.
재조합 Cas9 단백질을 에스케리치아 콜라이로부터 정제하고, crRNA 및 tracr로 구성되는 합성 이중 gRNA(dgRNA)와 복합체 형성하여 리보핵산 단백질(RNP) 복합체를 생성하였다. 연구에 사용된 gRNA의 목록을 표 24에 나타내었다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 전기천공을 통해 CD34+ HSPC로RNP 복합체를 전기천공 하였다. RNP 복합체 전달 전에 세포를 확장시켰다. 활발하게 분열하는 세포는 전기천공에 의해 전달된 RNP 복합체의 흡수를 촉진 할 수 있다.
[표 24]
BCL11A 적혈구계 인핸서 및 HPFH 영역 둘 다의 동시 표적화에 의한 HbF 유도. 모든 gRNA 분자를 dgRNA 형식으로 2회 반복실험으로 테스트하였다. 사용된 tracr은 SEQ ID NO: 7808 서열을 가졌고, crRNA는 표시된 2'O-메틸 (m) 및 포스포로티오에이트 결합(*) 변형과 함께 다음의 형식을 가졌다: mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArU*mG*mC*mU, 여기서 N은 표시된 표적화 도메인의 잔기이다.
Figure pct00193
게놈 편집된 및 편집되지 않은 HSPC를 태아 글로빈 및 2개의 적혈구계 세포 표면 마커, 트랜스페린 수용체(CD71) 및 글리코포린 A(CD235a)의 발현 수준에 대해 형광 염료에 접합된 항체를 이용하여 유세포 분석하여 분석하였다. Live Dead Violet의 제외에 의해 살아있는 세포를 확인하고 게이팅하였다. HPFH 영역 또는 BCL11A 적혈구계 인핸서 표적화는 모의 전기천공된 세포에 비해 HbF 함유 적혈구계 세포의 증가된 백분율을 야기했다(표 24). BCL11A의 엑손 2를 표적화하는 g8의 표적화 도메인을 포함하는 dgRNA에 의한 HbF 양성 세포의 유도가 또한 병렬적으로 관찰되었다. HPFH 영역 및 BCL11A 적혈구계 인핸서를 동일한 세포 집단에서 동시에 표적화할 때, HbF 함유 세포의 백분율은 각 영역을 독립적으로 표적화하는 것 이상으로 증가하였다(표 24). 따라서, 편집된 세포에서 유래된 HbF-함유 적혈구의 증가는 HPFH 영역 또는 BCL11A 적혈구계 인핸서를 표적화하는 것뿐만 아니라, 두 영역 모두의 동시 표적화에 의해 더 크게 달성할 수 있다.
세포 집단에서 편집된 대립유전자의 백분율을 결정하기 위해 두 영역 모두의 게놈 PCR 산물을 독립적으로 차세대 시퀀싱(NGS)하였다. Cas9, 주어진 표적화 도메인의 crRNA 및 Tracr를 함유하는 RNP로 전기천공된 세포 배양물에서는 게놈 편집이 관찰되었으나(표 24), 표적화 도메인이 전달되지 않은 대조군 세포(오직 Cas9 및 Tracr만 함유하는 RNP)에서는 그렇지 않았다. 두 부위를 표적화하는 RNP를 동일한 세포 집단으로 전달할 때, 두 부위 모두에서의 편집이 관찰되었다(표 24). 일부 경우에, 주어진 부위에서의 편집된 세포 퍼센트는 오직 1개의 RNP만을 전달하였을 때와 비교하여 2개의 RNP를 전달하였을 때, 아마도 전자의 경우에 주어진 부위를 표적화하는 RNP 농도가 더 낮은 것 때문에, 약간 감소하였다(표 24). 더 높은 편집 백분율 및 잠재적으로 더 높은 HbF 함유 세포 백분율은 2개의 RNP를 동시에 전달할 때 각 개별 RNP 농도를 증가시킴으로써 달성할 수 있다. 게놈 편집된 세포에서 유래된 HbF-함유 적혈구의 증가는 감소된 겸상 적혈구로써 치료적 영향을 미칠 가능성이 있다.
실시예 4.7
방법: 방법은 실시예 4에서와 같고, 다음의 예외를 갖는다.
인간 CD34+ 세포 배양. 인간 CD34+ 세포는 골수에서 유래되었다(Lonza, Cat. No. 2M-101D). CD34+ 세포를 해동하고 RNP 전달 전에 확장 배지에서 2 일 동안 확장하였다.
Cas9 및 가이드 RNA 리보핵산 단백질(RNP) 복합체의 조립, HSPC의 제조, 및 HSPC로의 RNP의 전기천공. 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 사용한 RNP 형성을 위해, 6 μg의 sgRNA를 6 μg의 CAS9 단백질(0.8 내지 1 μL에) 및 0.5 μL의 5x CCE 완충제(20 mM HEPES, 100 mM KCL, 5 mM MgCl2, 5% 글리세롤 및 새로 첨가된 1 mM DTT)와 총 부피 5 μL로 혼합하고 5 분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 원심 분리하여 HSPC를 수집하고 P3 일차 세포 용액(Lonza cat. No. PBP3-00675)에 6.4 x 106 /mL의 세포 밀도로 재현탁하였다. 상하로 피펫팅하여 RNP를20 μL의 세포와 혼합하고 RT에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. RNP/세포 혼합물(20 μL)을 4D-뉴클레오펙터(Lonza) 상에서 코드 CM-137를 사용하여 전기천공하였다. 전기천공을 2회 반복실험으로 수행하였다. dgRNA, dgRNA-PS 및 dgRNA-OMePS를 위해서, Tracr는 SEQ ID NO: 6660이었으며, Tracr SEQ ID NO: 7808과 사용한 g8의 예외를 갖는다. 이 실험에 사용된 모든 gRNA에 대한 형식은 표 36에 나타나고, dgRNA g8 OMePS의 예외를 가지며 이는 mC*mA*mC*AAACGGAAACAAUGCAAGUUUUAGAGCUAU*mG*mC*mU 서열을 갖는 crRNA 및 SEQ ID NO: 7808 서열을 갖는 tracr을 포함한다.
시험관내 적혈구 생성 및 HbF 함유 적혈구계 세포에 대한 FACS 분석. RNP 전달 후, 세포를 프로토콜 1 또는 프로토콜 2에 따라 유지하였다. 프로토콜 1을 위해서, EDM 및 보충물로 구성된 예열된 배지로 세포를 즉시 옮겼다. 배양 0 내지 7 일 동안, 1 μM 하이드로코르티손(Sigma H8672), 100 ng/mL 인간 SCF(Life Technologies, Cat. #PHC2113) 및 5 ng/mL 인간 IL-3(Peprotech #10779-598)로 EDM을 추가로 보충하였다. 배양 7 내지 11 일 동안은, 100 ng/mL의 인간 SCF만으로 EDM을 보충하였다. 배양 11 내지 21 일 동안은 EDM을 추가로 보충하지 않았다. 7 일차에 세포 배양을 ml 당 4.0 x 104 세포로 조정하였다. 11, 14 및 19 일차에, 배지를 보충하였다. 프로토콜 2를 위해서, 세포를 즉시 200 μl 확장 배지로 다시 옮기고 추가적인 2 일 동안 확장하도록 하였다. RNP 전달 2 일 후에 배양물을 계수하였다. 그 다음에, 세포를 펠렛화하고 EDM 및 보충물로 구성된 예열된 배지에 재현탁하였다. EDM 배양 0 내지 7 일 동안, 1 μM 하이드로코르티손(Sigma H8672), 100 ng/mL 인간 SCF(Life Technologies, Cat. #PHC2113) 및 5 ng/mL 인간 IL-3(Peprotech #10779-598)로 EDM을 추가로 보충하였다. 배양 7 내지 11 일 동안은, 100 ng/mL의 인간 SCF만으로 EDM을 보충하였다. 배양 11 내지 21 일 동안은 EDM을 추가로 보충하지 않았다. 세포 배양을 0 일차에ml 당 4.0 x 104 세포로 개시하고, 4 일 째에 새 배지로 4 배 희석하고, 7 일차에 ml 당 2.0 x 105 세포로 조정하였다. 11, 14 및 19 일차에, 배지를 보충하였다. EDM 배양 중 7, 18 및 21에 살아있는 세포를 계수하였다. 모든 살아있는 세포 계수는 생존불가 세포를 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 염색으로 식별하여 AccuCheck 카운팅 비드(ThermoFisher cat. No. PCB100)를 사용하는 유세포 분석으로 결정하였다. 두 프로토콜 모두에 대해서, 적혈구계 분화 배양 7, 14 및 21 일차에, HbF 발현에 대한 세포내 염색으로 세포를 분석하였다. 14 및 21 일차에, HbF 발현에 대한 세포내 염색은 항-CD71 및 항-CD235a 항체를 포함하지 않았고, 전체 살아있는 세포 집단 내 HbF 양성 세포(F-세포)의 %를 보고하였다. 생존능 염료로서 LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead 세포 염색(ThermoFisher L34975)를 사용하였다.
게놈 DNA 제조 및 차세대 시퀀싱(NGS). 전기천공 후 2 및 6 일에 Quick Extract DNA 추출 용액(Epicentre Cat# QE09050)를 사용하여, 프로토콜 2에 의해 배양된, 편집된 및 편집되지 않은 HSPC로부터 게놈 DNA를 제조하였다.
결과:
이론에 얽매이지 않고, HPFH 영역의 표적화된 유전적 파괴가 γ-글로빈 발현 억제를 완화하여, 높은 HbF 단백질을 함유하는 적혈구의 생산을 가능하게 하는 것으로 여겨진다(태아 헤모글로빈을 발현하는 세포는 때때로 본원에서 "F-세포"로 지칭된다). 높은 HbF는 산소가 제거된 조건 하에서 적혈구의 겸상화를 방지하고 β-탈라세미아 및 SCD 환자 모두에게 치료/치유력이 있을 것이다. SCD 환자로부터의 생체외 게놈 편집된 HSC로 자가 유래 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 하는 것을 또한 줄기 세포 확장 증진 기술, 예를 들어 WO2010/059401(그 내용의 전문이 참조로 포함됨)에 기재된, 예를 들어 아릴 탄화수소 수용체(AHR) 저해제, 예를 들어 화합물 4와 조합하여 생체외 확장을 개선하고 전달되는 유전자 변형된 HSC의 투여량을 증가시켰다.
프로그램 가능한 뉴클레아제, Cas9를 통한 효율적인 게놈 편집을 위해서, 표적 세포 및 조직으로의 가이드 RNA(gRNA) 및 Cas9 단백질의 성공적인 전달이 필수적이다. 최근 보고는 Cas9 리보핵산 단백질(RNP) 복합체가 전기천공에 의해 표적 세포로 전달될 때 몇몇 상이한 세포 유형에서 효율적이고 특이적인 게놈 편집을 달성할 수 있음을 입증하였다. Cas9-RNP 복합체는 거의 전달 직후에 염색체 DNA를 절단하고 세포에서 빠르게 분해되어, 표적-외 효과를 감소시킨다. 대조적으로, Cas9를 전달하는 데 사용되는 플라스미드 및 바이러스 벡터 시스템의 사용은 시스템과 관련된 표적-외 효과를 악화시키는 효소의 연장된 발현을 야기한다. 추가적으로, 표적 세포로 RNP를 전달하는 것은 추가적인 툴을 필요로 하지 않아 클리닉에서의 치료 목적의 게놈 편집의 번역을 크게 촉진할 것이다. 정제된 재조합 Cas9 단백질 및 gRNA 복합체(RNP)를 배양된 HSPC에 전달하였고 사용된 실험 개요를 도 17에 나타냈다.
재조합 Cas9 단백질을 에스케리치아 콜라이로부터 정제하고, 합성 단일 gRNA(sgRNA) 또는 crRNA 및 tracr로 구성되는 이중 gRNA(dgRNA)와 복합체 형성하여 리보핵산 단백질(RNP) 복합체를 생성하였다. 연구에 사용된 gRNA의 형식을 표 36에 나타내었다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 전기천공을 통해 CD34+ HSPC로RNP 복합체를 전기천공 하였다. RNP 복합체 전달 전, 및 일부 경우(프로토콜 2)에서는 또한 전기천공 후에 세포를 확장시켰다. 활발하게 분열하는 세포는 전기천공에 의해 전달된 RNP 복합체의 흡수를 촉진 할 수 있다.
세포 집단에서 편집된 대립유전자의 백분율을 결정하기 위해 HPFH 영역의 게놈 PCR 산물을 차세대 시퀀싱(NGS)하였다. Cas9, 주어진 표적화 도메인의 crRNA 및 Tracr를 함유하는 RNP로 전기천공된 세포 배양물에서는 HPFH 유전자좌에서의 게놈 편집이 관찰되었으나(도 43), 표적화 도메인이 전달되지 않은 대조군 세포(오직 Cas9 및 Tracr만 함유하는 RNP)에서는 그렇지 않았다. 일부 경우에, 주어진 표적 부위에서의 편집은 다른 gRNA 형식에 비해 변형된 sgRNA를 사용하여 더 높았다(도 43). 최종적으로, 각 삽입결실의 삽입결실 패턴뿐만 아니라 빈도를 각 gRNA 에 대하여 NGS로 평가하였다. 동일한 gRNA/Cas9를 사용하는 다수의 반복실험들에 걸쳐 삽입결실 패턴은 유사하였다. 각 표적 부위에서 가장 빈번하게 발생하는 대표적 삽입결실을 표 37에 나타냈다.
[표 36]
본 하위-실시예에 기재된 실험에서 사용된 gRNA 서열. N은 표시된 표적화 도메인의 잔기를 나타내고; mN은 2'-OMe-변형된 핵산을 나타내며; *은 포스포로티오에이트 변형을 나타낸다.
Figure pct00194
[표 37]
RNP 도입 후 6 일째에 NGS 시퀀싱으로부터 각 gRNA(표적화 도메인 및 형식)에 대해 관찰된 상위 삽입결실. gRNA 서열은 표 36에 표시된 바와 같다. 대문자는 표적 서열에서 및 그 근처에서 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드이다. 변형되지 않은 표적 서열에 대비하여 결실을 "-"로 나타내고, 삽입을 소문자로 나타낸다.
Figure pct00195
Figure pct00196
Figure pct00197
Figure pct00198
Figure pct00199
Figure pct00200
Figure pct00201
Figure pct00202
Figure pct00203
Figure pct00204
Figure pct00205
Figure pct00206
Figure pct00207
Figure pct00208
Figure pct00209
Figure pct00210
Figure pct00211
Figure pct00212
Figure pct00213
Figure pct00214
게놈 편집된 및 편집되지 않은 HSPC를 3 단계 적혈구계 분화 세포 배양 프로토콜에서 증식 및 HbF 상향조절에 대해 분석하였다. 게놈 편집된 및 편집되지 않은 HSPC를 태아 글로빈의 발현 수준 및 7 일차의 2개의 적혈구계 세포 표면 마커, 트랜스페린 수용체(CD71) 및 글리코포린 A(CD235a)에 대해 형광 염료에 접합된 항체를 이용하여 유세포 분석하여 분석하였다. Live/Dead Fixable Dead 세포 염색의 제외에 의해 살아있는 세포를 확인하고 게이팅하였다. 비록 프로토콜 1 및 프로토콜 2는 조건들에 걸쳐 CD71+ 백분율에 있어서 상이하였지만, 배양된 세포가 분화 7일차에 편집되지 않은 세포에 유사한 적혈구 모세포와 일치하는 CD71+ 세포 백분율을 나타내었으므로, 포함된 HPFH 영역 표적화 및 BCL11A 적혈구계 인핸서 표적화 gRNA를 이용한 게놈 편집은 적혈구계 분화에 악영향을 미치지 않았다(도 44). 포함된 HPFH 영역 표적화 및 BCL11A 적혈구계 인핸서 표적화 gRNA로 처리된 배양물은 21 일 배양 기간 및 두 프로토콜 간 전체에 걸쳐, 모의 전기천공된 세포 대비 HbF 함유 적혈구계 세포의 백분율에서의 상대적 변화의 유사한 패턴을 야기했다(도 45, 도 46 및 도 47). RNP에 노출된 세포에서 HbF가 유도되었고 프로토콜 1 또는 프로토콜 2에서 유지되었으나, HbF 양성인 세포의 백분율은 프로토콜 2의 조건 및 시점에 걸쳐 더 낮은 경향이 있었다(도 45, 도 46 및 도 47). HbF의 유도는 표적화 도메인 CR001030, CR00312 및 CR001128로 구성되는 gRNA에서, 특히 후기 시점에 가장 현저하였다(도 45, 도 46 및 도 47). 표적화 도메인들에 걸쳐서, sgRNA, 특히 OMePS 변형된 sgRNA가 dgRNA보다 더 높은 HbF 유도의 경향이 있었다(도 45, 도 46 및 도 47). 표적화 도메인 CR001137의 상대적으로 낮은 HbF 유도는 이 표적 부위에서의 더 낮은 편집 수준에 의해 설명될 수 있다(도 43, 도 45 내지 도 47). BCL11A의 엑손 2를 표적화하는 g8의 표적화 도메인을 포함하는 dgRNA에 의한 HbF 양성 세포의 유도가 또한 병렬적으로 관찰되었다(도 45 내지 도 47). 게놈 편집된 세포에서 유래된 HbF-함유 적혈구의 증가는 감소된 겸상 적혈구로써 치료적 영향을 미칠 가능성이 있다. 편집된 세포는 적혈구계 분화 조건에서 증식할 수 있었으나(7 일차에 9 내지 53 배 및 21 일차에 36 내지 143 배, 도 48), 일부 경우에, 편집되지 않은 대조군 세포에 비해 증식이 억제되었다(7 일차에 편집되지 않은 대조군의 14 내지 83% 및 21 일차에 편집되지 않은 대조군의 18 내지 95%)(도 48). BCL11A의 엑손 2를 표적화하는 g8의 표적화 도메인을 포함하는 dgRNA에 의해 편집된 세포(7 일차에 편집되지 않은 대조군의 30% 및 21 일차에 편집되지 않은 대조군의 18%) 및 OMePS 변형된 sgRNA 중 많은 것들에서 가장 낮은 증식이 관찰되었다(도 48).
실시예 5 HPFH 영역에 대한 2개의 gRNA를 이용한 절제
HPFH 영역 내의 상이한 부위에 대한 2개의 상이한 gRNA 분자를 함유하는 RNP로 일차 인간 CD34+ HSPC를 전기천공하였다. 각각의 RNP에 대해, 상기 기재된 dgRNA 분자를 사용하였다. 간략하게, 프렌치 HPFH 영역 내의 제1 부위를 표적화하는 dgRNA를 포함하는 RNP 및 프렌치 HPFH 영역 내의 제2 부위를 표적화하는 dgRNA를 포함하는 RNP를 조합하고 다음의 비율로 CD34+ HSPC로 전기천공 하였다: 0.5X 제1 dgRNA RNP + 0.5X 제2 dgRNA RNP; 1.0X g2 dgRNA("g2"=CR000088의 표적화 도메인을 포함하는 양성 대조군, BCL11a 유전자의 코딩 서열을 표적화); RNP 없음("대조군"). 세포를 상기 기재된 바와 같이 배양하고, 상기 기재된 프로토콜을 사용하여 적혈구로 분화시켰다(도 17 참조). 태아 헤모글로빈 발현을 평가하였다. 결과는 도 27 및 표 25에 나타난다. 이론에 얽매이지 않고, 2개의 표적 서열에 대한 gRNA 분자를 포함하는 RNP의 동시 도입은 2개의 절단 부위 사이의 DNA(예를 들어 2개의 절단 부위 사이의 DNA중 모든 또는 대부분)의, 그 영역 내에 함유된 임의의 조절 또는 코딩 서열을 포함하여, 결실(즉, 절제)을 야기할 것으로 여겨진다. 이들 결과는 HPFH 영역 내의 2개의 별도의 영역을 표적화하는 RNP들이 전기천공에 의해 CD34+ HSPC로 동시에 전달될 수 있고 적혈구로 분화된 편집된 세포에서 태아 헤모글로빈 발현을 유도할 수 있음을 보여준다.
[표 25]
Figure pct00215
Figure pct00216
실시예 6. BCL11a 인핸서를 표적화하는 gRNA의 잠재적 표적-외 편집 평가
BCL11a 인핸서를 표적화하는 Cas9에 의해 절단된 잠재적 표적-외 게놈 부위를 결정하기 위해 올리고 삽입 기반 검정(예를 들어 문헌[Tsai et al., Nature Biotechnology. 33, 187-197; 2015] 참조)을 사용하였다. 상기 기재된 Cas9-발현 HEK293 세포에서 BCL11a 인핸서를 표적화하는 총 28개의 가이드(표시된 표적화 도메인을 포함하는 이중 가이드 RNA) 및 HPFH 영역을 표적화하는 10개의 gRNA를 스크리닝하고, 결과를 도 33(BCL11a 인핸서) 및 도 49(HPFH)에 도시하였다. BCL11a 인핸서를 표적화하는 gRNA와 관련하여, 검정으로 일부 가이드에 대한 잠재적 표적-외 부위를 확인하였으나, 잠재적인 부위가 Cas9에 의해 절단된 진성 표적-외 부위인지 여부를 결정하기 위하여 표적화된 딥 시퀀싱을 사용하였다. 잠재적 표적-외 부위의 양 옆에 배치되는 프라이머를 사용하여, 단리된 게놈 DNA를 증폭하고 앰플리콘을 시퀀싱하였다. 잠재적 표적-외 부위가 Cas9에 의해 절단된 경우에는, 부위에서 삽입결실이 검출되어야 한다. 잠재적 표적-외 부위에 대한 이들 후속 조사로부터, 적어도 3개의 가이드 RNA: CR000311, CR000312, CR001128에 대하여 잠재적 표적-외 부위에서 삽입결실이 검출되지 않았다. BCL11a 인핸서를 표적화하는 gRNA와 관련하여, 검정은 적어도 gRNA CR001137, CR001212 및 CR001221에 대해 어떤 잠재적 표적-외 부위도 확인하지 못했다. 다른 gRNA 분자에 대해 확인된 잠재적 표적-외 부위가 Cas9에 의해 절단된 진성 표적-외 부위인지 여부를 결정하기 위해 표적화된 딥 시퀀싱을 수행할 것이다.
실시예 7: Cas9 변이체에 대한 평가
CD34+ 조혈 줄기 세포에서의 평가
일차 인간 조혈 줄기 세포(HSC)에서 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 유전자를 녹아웃하는 효율을 측정함으로써 14개의 정제된 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(SPyCas9) 단백질을 평가하였다. 이들 단백질을 3개의 그룹으로 나누었다: 제1 그룹은 개선된 선택성을 갖는 SPyCas9 변이체로 구성되었다(문헌[Slaymaker et al. 2015, Science 351: 84(e1.0, e1.1 and K855A); Kleinstiver et al. 2016, Nature 529: 490(HF)]). 제2 그룹은 절단 가능한 TEV 부위가 있거나 없는 상이한 수 및/또는 위치의 SV40 핵 국재화 신호(NLS) 및 6x히스티딘(His6) 또는 8x히스티딘(His8) 태그를 갖는 야생형 SPyCas9, 및 구조 연구를 위해 Cas9를 안정화시키는 것으로 보고된(문헌[Nishimasu et al. 2014, Cell 156:935]) 2개의 시스테인 치환(C80L, C574E)을 갖는 SpyCas9 단백질로 구성되었다. 제3 그룹은 상이한 공정에 의해 생산된 동일한 재조합 SPyCas9로 구성되었다(도 60). B2M 녹아웃은 FACS 및 차세대 시퀀싱(NGS)으로 결정하였다.
방법
재료
1. Neon 전기천공 기기(Invitrogen, MPK5000)
2. Neon 전기천공 키트(Invitrogen, MPK1025)
3. crRNA(SEQ ID NO: 6607에 융합된, B2M 유전자 내의 서열에 상보적인, GGCCACGGAGCGAGACAUCU의 표적화 도메인 서열)
4. tracrRNA(SEQ ID NO: 6660)
5. Cas9 저장 완충제: 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2
6. 골수 유래 CD34+ HSC(Lonza, 2M-101C)
7. 세포 배양 배지(Stemcell Technologies, StemSpam CC-100있는 StemSpam SFEM II)
8. FACS 세척 완충제: PBS 중의 2% FCS
9. FACS 블록 완충제: PBS mL 당, 0.5 ug 마우스 IgG, 150 ug Fc 블록, 20 uL FCS 첨가
10. Chelex 현탁액: H2O 중 10% Chelex 100(bioRad, Cat# 142-1253)
11. 항-B2M 항체: Biolegend, cat# 316304
과정
Lonza의 권장 사항에 따라 세포를 해동 및 성장시키고, 2 내지 3 일마다 배지를 추가한다. 5 일차에, 15 분 동안 200 xg에서 세포를 펠렛화하고, PBS로 한 번 세척하고, NEON 키트로부터의 T-완충제로 세포를 2 x 104 /uL로 재현탁하고, 얼음 위에 놓는다. Cas9 저장 완충제로 Cas9 단백질을5 mg/ml로 희석한다. H2O로 crRNA 및 tracrRNA를 100 uM로 재구성한다. 리보핵산 단백질(RNP) 복합체를 CAS9 단백질, crRNA 및 tracrRNA 각각 0.8 uL을 0.6 uL의 Cas9 저장 완충제와 혼합함으로써 제조하고, 실온에서 10 분 동안 인큐베이션한다. 2 분 동안 RNP 복합체와 7 uL의 HSC를 혼합하고, Neon 피펫 팁 내로 전체 10 uL를 옮기고, 1700 v, 20 ms 및 1 펄스에서 전기천공한다. 전기천공 후, 세포를 37℃, 5% CO2에서 사전 보정된 1 ml 배지를 함유하는 24-웰 플레이트의 웰로 즉시 옮긴다. 전기천공 후 72 시간에 FACS 및 NGS 분석을 위해 세포를 수확한다.
FACS: 250 uL의 세포를 24-웰 플레이트의 각 웰로부터 96-웰 U-바닥 플레이트의 웰로 이동시키고 세포를 펠렛화한다. 2% FCS(태아 송아지 혈청)-PBS로 한 번 세척한다. 50 uL FACS 블록 완충제를 세포에 첨가하고 10 분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하고, 1 uL FITC 표지된 B2M 항체를 첨가하고 30 분 동안 인큐베이션한다. 150 uL FACS 세척 완충제로 한 번 세척한 후 재차 200 uL FACS 세척 완충제로 한 번 세척한다. 세포를 200 uL FACS 완충제 FACS 분석에 재현탁시켰다.
NGS 샘플 준비: 250 uL의 세포 현탁액을 24-웰 플레이트의 각 웰로부터 1.5 ml Eppendorf 튜브로 옮기고, 1 mL PBS를 첨가하고 세포를 펠렛화한다. Chelex 현탁액 100 uL를 첨가하고 99℃에서 8 분 동안 인큐베이션하고 10 초 볼텍싱 후 99℃에서 8 분 동안 인큐베이션, 10 초 볼텍싱한다. 10,000 xg에서 3 분간 원심 분리하여 수지를 펠렛화하여 침전시키고 상등액 용해물을 PCR에 사용한다. 4 uL 용해물을 취하여 Titanium 키트(Clonetech, cat# 639208)를 사용하여 b2m 프라이머(b2mg67F: CAGACAGCAAACTCACCCAGT, b2mg67R: CTGACGCTTATCGACGCCCT)로 PCR 반응를 수행하고 제조사의 지시를 따른다. 다음의 PCR 조건을 사용한다: 1 사이클 동안 98℃에서 5 분; 30 사이클 동안 95℃에서 15 초, 62℃에서 15 초, 및 72℃에서 1 분; 마지막으로 1 사이클 동안 72℃에서 3 분. PCR 산물을 NGS에 사용하였다.
통계: FACS에 의한 B2M KO 세포의 백분율 및 NGS에 의한 삽입결실의 백분율을 사용하여 CAS9 절단 효율을 평가하였다. Cas9를 고정 효과로 하여 실험을 설계하였다. 각 실험은 내포된(nested) 임의 효과로서 공여자 내에 내포되어 있다. 따라서 혼합 선형 모델을 FACS 및 NGS 데이터 분석법에 적용하였다.
결과
실험적 및 공여자 변이를 정규화하기 위하여, 야생형 SPyCas9 양 옆에 배치된 2개의 SV40 NLS 및 단백질의 C-말단의 His6 태그를 갖는 원래의 설계인, iProt105026에 대한 각 단백질의 상대적 활성을 그래프로 나타냈다(도 34). 통계 분석법은, 참조 Cas9 단백질 iProt105026와 비교하여, iProt106331, iProt106518, iProt106520 및 iProt106521은 HSC에서 B2M을 녹아웃하는 것에 있어서 유의미하게 상이하지 않은 반면, 테스트된 다른 변이체들(PID426303, iProt106519, iProt106522, iProt106545, iProt106658, iProt106745, iProt106746, iProt106747, iProt106884)은 HSC에서 B2M을 녹아웃하는 것에 있어서 참조 iProt105026와 매우 유의미하게 상이하다는 것을 나타낸다. His6 태그를 C-말단으로부터 N-말단으로 이동시키는 것(iProt106520)이 단백질의 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인했다(도 34). 하나의 NLS는 단백질의 C 말단에 위치했을 때에만 활성을 유지하기에 충분했다(iProt106521 대 iProt106522, 도 34). 공정 1에서 정제된 단백질은 공정 2 및 3보다 일관되게 더 높은 녹아웃 효율을 가졌다(iProt106331 대 iProt106545 및 PID426303, 도 34). 일반적으로, 보고된 개선된 선택성을 갖는 SPyCas9 변이체는 야생형 SPyCas9만큼 활성적이지 않았다(iProt106745, iProt106746 및 iProt106747, 도 34). 흥미롭게도 iProt106884는 표적화 부위를 절단하지 않았다. 이는 이 변이체가 포유류 세포에서 적당한 표적화 부위의 20%까지 절단하지 못했다는 Kleinstiver 등에 의한 보고와 일치한다(문헌Kleinstiver et al. 2016, Nature 529: 490]). 최종적으로, 2개의 시스테인 치환(iProt106518)을 갖는 Cas9 변이체는 높은 수준의 효소 활성을 유지하였다(도 34).
다음으로, 상이한 Cas9 변이체를 포함하는 RNP의 편집 효율을 +58 인핸서 영역을 표적화하는 변형된 또는 변형되지 않은 gRNA로 테스트하였다. cr00312 및 cr1128의 표적화 도메인을 포함하는 sgRNA 분자를 변형되지 않은 것(CR00312=SEQ ID NO: 342; CR001128=SEQ ID NO: 347) 또는 변형된 것(OMePS CR00312=SEQ ID NO: 1762; OMePS CR001128=SEQ ID NO: 1763)으로 테스트하였고, 표 35에 나타난 Cas9 변이체와 미리 복합체 형성시켰다.
[표 35]
Figure pct00217
상기 기재된 바와 같이 형성된 RNP를 상기 기재된 바와 같이 HSPC 세포에 전달하고, 이들 실시예에 기재된 바와 같이, 세포를 % 편집(NGS에 의함) 및 적혈구계 분화 시 % HbF 유도에 대해 평가하였다. 결과를 도 42a(% 편집) 및 도 42b(HbF 유도)에 나타낸다. 결과는 테스트된 변이체들 간에 Cas9 성분을 변화시키는 것이 sgRNA CR00312 및 CR001128의 변형되지 않은 형태 및 변형된 형태 모두의 유전자 편집 효율을 변경하지 않았으며, Cas9 변이체는 적혈구계-분화된 유전자 편집된 세포가 HbF를 생산하는 능력에도 영향을 미치지 않았다는 것을 보여준다.
실시예 8: 유전자 편집된 HSPC의 생체외 확장, 및 HSPC 서브세트에서의 편집 분석
유전자-편집 전의 세포 확장
인간 골수 CD34+ 세포를 AllCells(Cat#: ABM017F) 또는 Lonza(Cat#: 2M-101C)에서 구입하고, 50 ng/mL의 트롬보포이에틴(Tpo, Peprotech; Cat# 300-18), 50 ng/mL의 인간 Flt3 리간드(Flt-3L, Peprotech; Cat# 300-19), 50 ng/mL의 인간 줄기 세포 인자(SCF, Peprotech; Cat# 300-07), 인간 인터루킨-6(IL-6, Peprotech; Cat# 200-06), 1% L-글루타민; 2% 페니실린/스트렙토마이신, 및 화합물 4(0.75 μM)로 보충된 StemSpan SFEM(StemCell Technologies, Cat no. 09650)를 이용하여 2 내지 3 일 동안 확장하였다.
Cas9 및 가이드 RNA 리보핵산 단백질(RNP) 복합체의 세포로의 전기천공
Cas9-가이드 RNA 리보핵산 단백질 복합체(RNP)를 전기천공 직전에 제조하였다. 이중 가이드 RNA를 사용한 RNP 형성을 위해, 각각 3 μg의 crRNA(2.24 μL에) 및 tracr(1.25 μL에)을 먼저 별도의 튜브에서 95℃에서 2 분 동안 변성시킨 다음 실온까지 냉각시킨다. Cas9 단백질의 제조를 위해, 7.3 μg의 CAS9 단백질(1.21 μL에)을 5x CCE 완충제(20 mM HEPES, 100 mM KCL, 5 mM MgCl2, 5% 글리세롤 및 새로 첨가된 1 mM DTT) 0.52 μL와 혼합하였다. TracrRNA를 먼저 Cas9 조제물과 혼합하고 5 분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음에, crRNA를 TracrRNA/CAS9 복합체에 첨가하고 37℃에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 200 xg에서 15 분 동안 원심 분리하여 HSPC를 수집하고 Neon 전기천공 키트(Invitrogen; Cat#: MPK1096)에 부속된 T 완충제에2 x 107 /mL의 세포 밀도로 재현탁하였다. 부드럽게 3 회 상하로 피펫팅하여 RNP를12 μL의 세포와 혼합하였다. 단일 가이드 RNA(sgRNA) 및 Cas9 복합체를 제조하기 위해, 2.25 μg sgRNA(1.5 μL에)를 2.25 μg Cas9 단백질(3 μL에)과 혼합하고RT에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에, 몇 차례 부드럽게 상하로 피펫팅하여 sgRNA/Cas9 복합체를 2 x 107/mL 세포 10.5 μL와 혼합하고 RT에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. RNP/세포 혼합물(10 μL)을 Neon 전기천공 프로브 내로 옮겼다. 전기천공은 1700 볼트/20 밀리초 및 1 펄스를 사용하는 Neon 형질감염 시스템(Invitrogen; MPK5000S)으로 수행하였다.
유전자-편집 후의 세포 확장
전기천공 후, 상기 기재된, 성장 인자 및 사이토카인 및 화합물 4로 보충된 0.5 mL의 예열된 StemSpan SFEM 배지로 세포를 옮기고, 37℃에서 3 일 동안 배양하였다. 총 10 일의 세포 확장, 전기천공 3 일 전 및 전기천공 후 7일, 후에, 총 세포 수는 시작 세포 수에 비해 2 내지 7 배 증가하였다(도 35).
게놈 DNA 제조
전기천공 후 48 시간에 편집된 및 편집되지 않은 HSPC로부터 게놈 DNA를 제조하였다. 세포를 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.05% SDS 및 새로 첨가된 프로테아제 K 25 μg/mL에서 용해시키고 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음 85℃에서 15분 동안 추가로 인큐베이션하여 프로테아제 K를 불활성화시켰다.
T7E1 검정
HSPC의 편집 효율을 결정하기 위해, T7E1 검정을 수행하였다. PCR은 Phusion Hot Start II High-Fidelity 키트(Thermo Scientific, Cat#: F-549L)를 사용하여 다음의 사이클 조건으로 수행하였다: 30"동안 98℃; 5" 동안 98℃, 20' 동안 68℃, 30" 동안 72℃ 35 사이클; 5 분 동안 72℃.다음의 프라이머를 사용하였다: 정방향 프라이머: 5'- AGCTCCAAACTCTCAAACCACAGGG-3' 및 역방향 프라이머: 5'- TACAATTTTGGGAGTCCACACGGCA-3'. PCR 산물을 다음의 조건을 사용하여 변성시키고 재어닐링하였다: 5 분 동안95℃, -2℃/s로 95에서 85℃로, -0.1℃/s로 85에서 25℃로, 4℃ 유지. 어닐링 후, 1 μL의 미스매치-민감성 T7 E1 뉴클레아제(NEB, Cat# M0302L)를 상기 PCR 산물 10 μL에 첨가하고, 헤테로듀플렉스의 분해를 위해 37℃에서 15분 동안 추가로 인큐베이션하였으며, 생성된 DNA 단편을 아가로스 겔(2%) 전기 영동으로 분석하였다. 편집 효율은 ImageJ 소프트웨어(http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 사용하여 정량하였다.
차세대 시퀀싱(NGS)을 위한 PCR 준비
편집 효율을 보다 정확하게 그리고 삽입 및 결실(삽입결실) 패턴을 결정하기 위해, PCR 산물을 차세대 시퀀싱(NGS)하였다. Titanium Taq PCR 키트(Clontech Laboratories; Cat#: 639210)를 사용하여 다음의 사이클 조건으로PCR을 2회 반복실험으로 수행하였다: 5분 동안 98℃; 15 초 동안 95℃, 15 초 동안 68℃, 72℃ 1 분 30 사이클; 7 분 동안 72℃. 다음의 프라이머를 사용하였다: 정방향 프라이머: 5'-AGCTCCAAACTCTCAAACCACAGGG-3' 및 역방향 프라이머: 5'-TACAATTTTGGGAGTCCACACGGCA-3'. PCR 산물을 2% 아가로스 겔 전기 영동으로 분석하고 딥 시퀀싱을 위해 제출하였다.
조혈 줄기 및 전구 하위집단에서의 편집 효율의 유세포 분석
줄기 및 전구 세포(HSPC) 하위집단에서의 편집 효율을 특징 확인하기 위해 세포를 유세포 분석하였다. CD34+ 세포, CD34+CD90+ 세포, CD34+CD90+CD45RA- 세포, 및 CD34+CD90+CD45RA-CD49f+ 세포를 포함하는 HSPC 서브세트의 게놈 편집 이전(배양 중 48 시간) 및 이후(배양 중 10 일; 게놈 편집 3 일 후)의 빈도를 세포 배양물의 분취물 샘플 추출한 것으로부터 결정하였다(도 36, 도 37, 도 38). 0.5% BSA, 2mM EDTA pH7.4로 보충된 PBS를 함유하는 개질된 FACS 완충제 중의 항-CD34(BD Biosciences, Cat# 555824), 항-CD38(BD Biosciences, Cat# 560677), 항-CD90(BD Biosciences, Cat# 555596), 항-CD45RA(BD Biosciences, Cat# 563963), 항-CD49f(BD Biosciences, Cat# 562582)와 세포를4℃, 암소에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존능은 7AAD로 결정한다. 세포를 개질된 FACS 완충제로 세척하고 다색 FACS 분석을 Fortessa(BD Biosciences) 상에서 수행하였다. Flowjo 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석 결과를 분석하였다. 화합물 4(단독으로) 존재 하에서 성장된 게놈 편집된 세포는, CD34+, CD34+CD90+, CD34+CD90+CD45RA-, 및 CD34+CD90+CD45RA-CD49f+ 서브세트를 포함하는, 평가된 모든 HSPC 서브세트를 검출 가능한 수준으로 나타냈으며, 이는 게놈 편집 후 화합물 4(단독으로) 존재 하의 세포 배양에서 장기 HSC 집단이 지속된다는 것을 나타낸다(도 38).
유전자 편집 4 시간 후에, 세포 배양물의 분취물을 샘플 추출하고 세포를 HSPC 서브세트(CD34+, CD34+CD38+, CD34+CD38-, CD34+CD38-CD45RA-, CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f-, CD34+CD38-CD45RA-CD90-CD49f-, 및 CD34+CD38-CD45RA-CD90-CD49f+ 세포)로 정렬하고, 편집 효율을 측정하기 위해 NGS하였다(표 28). 장기 HSC에서 부화된 서브세트를 포함하는, 모든 조혈 서브세트가 유사하게 높은 유전자 편집 효율(95% 초과)을 나타냈음을 주목하는 것이 중요하다. 이들 세포는 장기적으로 환자에 생착할 수 있고 평생 조혈 다-계통 재생을 지속하기 때문에, 장기 HSC에서의 이 높은 유전자 편집 효율은 상당한 치료적 영향을 미친다.
[표 28]
Figure pct00218
실시예 9 잠재적 표적-외 편집의 평가
HSPC 배양 및 CRISPR/Cas9 게놈 편집
RNP 생성 및 세포 조작 방법은 실시예 4에서와 같고, 다음의 예외를 갖는다. 인간 CD34+ 세포 배양. 인간 CD34+ 세포는 제조사의 지시에 따라 면역 선별(Miltenyi)을 이용하여 성인 공여자로부터의 G-CSF 동원된 말초 혈액에서 단리(AllCells, Cat. No. mPB025-Reg.E)되거나 골수에서 유래(Hemacare Corporation, Cat. No. BM34C-3)되었다. CD34+ 세포를 해동하고 RNP 전달 전에 2 일 또는 5 일 동안 확장하였다. RNP 전달 후, 세포를 확장 배지에서 추가적인 13 일 동안 배양하거나 다음과 같이 7 또는 11 일 동안 적혈구계 분화 배지에서 배양하였다. 배양 0 내지 7 일 동안, 1 μM 하이드로코르티손(Sigma H8672), 100 ng/mL 인간 SCF(Life Technologies, Cat. #PHC2113) 및 5 ng/mL 인간 IL-3(Peprotech #10779-598)로 EDM을 추가로 보충하였다. 배양 7 내지 11 일 동안은, 100 ng/mL의 인간 SCF만으로 EDM을 보충하였다. 배양 기간 종결에, 게놈 DNA 제조 및 분석을 위해 세포를 수확하였다.
Cas9 및 가이드 RNA 리보핵산 단백질(RNP) 복합체의 조립, HSPC의 제조, 및 HSPC로의 RNP의 전기천공. 원심 분리하여 HSPC를 수집하고 P3 일차 세포 용액(Lonza cat. No. PBP3-00675)에 재현탁하였다. 상하로 피펫팅하여 RNP를20 μL의 세포와 혼합하고 RT에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. RNP/세포 혼합물(20 μL)을 4D-뉴클레오펙터(Lonza) 상에서 코드 CM-137를 사용하여 전기천공하였다. NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 서열을 갖는 crRNA(여기서 N은 표시된 표적화 도메인의 잔기를 나타낸다) 및 SEQ ID NO: 6660의 서열을 갖는 tracr을 포함하는 dgRNA를 사용하였다.
게놈 DNA 추출
RNP로 처리된 및 처리되지 않은 HSPC로부터 제조사의 권장 사항에 따라 DNeasy Blood & Tissue 키트(Qiagen, Cat # 69506)를 사용하여 게놈 DNA를 단리하였다.
잠재적 gRNA 표적-외 유전자좌의 인실리코 확인
BCL11A+ 58 영역 gRNA CR00309, CR00311, CR00312, CR00316, CR001125, CR001126, CR001127 및 CR001128, 및 HPFH 영역 gRNA CR001028, CR001030, CR001137, CR001221, CR003035 및 CR003085에 대한 잠재적 표적-외 유전자좌를 다음과 같이 확인하였다. 각각의 gRNA에 대해, 5 뉴클레오티드 미스매치까지 허용하는 표준 파라미터를 사용하는, BFAST 서열 정렬기(버전 0.6.4f, 문헌[Homer et al, PLoS One, 2009, 4(11), e7767, PMID: 19907642])를 사용하여 20 뉴클레오티드 gRNA 프로토스페이서(protospacer) 서열을 인간 게놈 참조 서열(build GRCh38)에 정렬하였다. 확인된 유전자좌를 Cas9 정준 5'에 인접한 5'-NGG-3' PAM 서열(즉, 5'-표적-외 유전자좌-PAM-3')인 부위만을 함유하도록 필터링하였다. 5 뉴클레오티드 미스매치를 갖는 부위는 BEDTools 스크립트(버전 2.11.2, 문헌[Quinlan and Hall, Bioinformatics, 2010 26(6):841-2, PMID: 20110278])를 사용하여RefSeq 유전자 주석(문헌[Pruitt et al, Nucleic Acids Res., 2014 42(Database issue):D756-63, PMID: 24259432]) 대비 엑손으로 주석 표시된 유전자좌만 함유하도록 추가로 필터링하였다. BCL11A+ 58 영역 및 HPFH 영역 gRNA에 대해 확인된 잠재적 표적-외 유전자좌의 수를 표 1 및 2에 각각 나타내었다.
[표 29]
BCL11A +58 영역 gRNA CR00309, CR00311, CR00312, CR00316, CR001125, CR001126, CR001127, 및 CR001128에 대해 확인된, 0, 1, 2, 3 및 4 뉴클레오티드 미스매치 및 RefSeq 엑손 내 5 뉴클레오티드 미스매치를 갖는 인실리코 표적-외 유전자좌 수가 나타난다.
Figure pct00219
[표 30]
HPFH 영역 gRNA CR001028, CR001030, CR001137, CR001221, CR003035 및 CR003085에 대해 확인된, 0, 1, 2, 3 및 4 뉴클레오티드 미스매치 및 RefSeq 엑손 내 5 뉴클레오티드 미스매치를 갖는 인실리코 표적-외 유전자좌 수가 나타난다.
Figure pct00220
잠재적 표적-외 부위의 표적화된 증폭을 위한 PCR 프라이머 설계
앰플리콘의 중심에 위치하는 gRNA 프로토스페이서 서열을 갖는, 대략 160 내지 300 염기쌍 길이 범위의 앰플리콘 크기를 목표로 하는 디폴트 파라미터를 사용하는, Primer3(버전 2.3.6, 문헌[Untergasser et al, Nucleic Acids Res., 2012 40(15):e115, PMID: 22730293])를 사용하여 BCL11A +58 영역 gRNA(CR00309, CR00311, CR00312, CR00316, CR001125, CR001126, CR001127 및 CR001128) 및 HPFH 영역 gRNA(CR001028, CR001030, CR001137, CR001221, CR003035 및 CR003085)에 대해 확인된 잠재적 표적-외 유전자좌(및 표적 적중 유전자좌)를 표적화하는 PCR 앰플리콘을 설계하였다. gRNA CR001127에 대해서는 0 내지 4 뉴클레오티드 미스매치를 갖는 부위에 대해서만 PCR 프라이머를 설계하였으며, RefSeq 엑손 내에 5 뉴클레오티드 미스매치를 갖는 부위에 대해서는 프라이머를 설계하지 않았다. 생성된 PCR 프라이머 쌍 및 앰플리콘 서열을 인간 게놈 참조 서열(build GRCh38) 대비 BLAST 서열 검색(버전 2.2.19, 문헌[Altschul et al, J Mol Biol., 1990, 215(3):403-10, PMID: 2231712])하여 유일성을 체크하였다. 하나를 초과하는 앰플리콘 서열을 야기하는 프라이머 쌍을 폐기하고 재설계하였다. 표 3 및 5는 BCL11A +58 영역 및 HPFH 영역 gRNA 각각에 대해 설계된 성공적인 PCR 프라이머 쌍의 수를 나타낸다.
Illumina 시퀀싱 라이브러리 제조, 정량화 및 시퀀싱
제조사의 권장 사항을 이용하는 Quant-iT PicoGreen dsDNA 키트(Thermo Fisher, Cat # P7581)를 사용하여 RNP 처리된(gRNA 당 2 반복실험) 및 처리되지 않은(gRNA 당 1 반복실험) HSPC 샘플로부터의 게놈 DNA를 정량화하였다. 2개의 순차적인 PCR 반응을 사용하여 각 샘플에 대하여 개개의 표적-외 유전자좌(및 표적 적중 유전자좌)를 표적화하는 Illumina 시퀀싱 라이브러리를 생성하였다. 제1 PCR은 보편적인 Illumina 시퀀싱 호환 서열로 테일링(tailing)된 표적 특이적 PCR 프라이머(상기 설계된)를 사용하여 표적 유전자좌를 증폭하였다. 제2 PCR은 시퀀싱 동안 멀티플렉싱을 가능하게 하는 샘플 바코드를 포함하는, 추가적인 Illumina 시퀀싱 호환 서열을 제1 PCR 앰플리콘에 첨가하였다. PCR 1은, 각 반응이 3 내지 6 ng의 gDNA(약 500 내지 1000 세포에 상응), 최종 농도 0.25 μM의 PCR 1 프라이머 쌍(Integrated DNA Technologies) 및 1x 최종 농도의 Q5 Hot Start 마스터 믹스(New England BioLabs, Cat # 102500-140)을 함유하는, 10 μL의 최종 부피로 수행하였다. PCR 1 좌측 프라이머는 5'- TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3' 서열로 5' 테일링되고(즉, 5'-테일-표적 특이적 좌측 프라이머-3'), 우측 프라이머는 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3' 서열로 5' 테일링되었다(즉, 5'-테일-표적 특이적 우측 프라이머-3'). PCR 1은 다음의 사이클 조건을 사용하여 써모사이클러(thermocycler) 상에서 수행하였다: 1 분 동안 98℃ 1 사이클; 10 초 동안 98℃, 20 초 동안 63℃, 30 초 동안 72℃ 25사이클; 2 분 동안 72℃ 1 사이클. 그런 다음, PCR 1을 뉴클레아제 비함유 물(Ambion, Cat# AM9932)을 사용하여 100중 1로 희석하고 PCR 2로의 투입물로 사용하였다. PCR 2는, 각 반응이 2 μL의 희석된 PCR 1 산물, 최종 농도 0.5 μM의 PCR 2 프라이머 쌍(Integrated DNA Technologies) 및 1x 최종 농도의 Q5 Hot Start 마스터 믹스(New England BioLabs, Cat # 102500-140)를 함유하는, 10 μL의 최종 부피로 수행하였다. 사용된 PCR 2 좌측 프라이머 서열은 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNTCGTCGGCAGCGTC-3'였고, 사용된 PCR 2 우측 프라이머 서열은 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTCTCGTGGGCTCGG-3'였으며, 여기서 NNNNNNNN은 표준 Illumina 시퀀싱 과정의 부분으로서 샘플 멀티플렉싱에 사용되는 8 뉴클레오티드 바코드 서열을 의미한다. PCR 2는 다음의 사이클 조건을 사용하여 써모사이클러(thermocycler) 상에서 수행하였다: 3 분 동안 72℃ 1 사이클; 2 분 동안 98℃ 1 사이클; 10 초 동안 98℃, 30 초 동안 63℃, 2 분 동안 72℃ 15사이클. 현재 실행 가능한 Illumina 시퀀싱 라이브러리인, PCR 2 앰플리콘을 제조사의 권장 사항에 따라 Agencourt AMPure XP 비드(Beckman Coulter, Cat # A63882)를 이용하여 정화하였다. 그 다음에, 정화된 Illumina 시퀀싱 라이브러리를 Power SYBR Green PCR 마스터 믹스(Life Technologies, Cat# 4367660) 및 Illumina 시퀀싱 라이브러리 말단에 특이적인 프라이머(정방향 프라이머 서열 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3' 및 역방향 프라이머 서열 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3')를 사용하는 표준 qPCR 정량화 방법을 사용하여 정량화하였다. 그 다음에, Illumina 시퀀싱 라이브러리들을 등몰 푸울링하고, 제조사의 권장 사항에 따라 MiSeq Reagent Kit v3(Illumina, Cat# MS-102-3003)를 사용하여 300 염기의 쌍-말단 리드로 MiSeq 기기(Illumina, Cat# SY-410-1003) 상에서 Illumina 시퀀싱을 하였다. 적어도 하나의 처리된 반복실험에서 각 유전자좌에 대해 최소 1000 배의 서열 커버리지(coverage)가 생성되었다. 처리된 및 처리되지 않은 샘플의 PCR, 정화, 푸울링 및 시퀀싱을 개별적으로 수행하여 처리된 및 처리되지 않은 샘플 또는 그로부터 생성된 PCR 앰플리콘 사이에 교차 오염의 가능성을 피하였다.
Illumina 시퀀싱 데이터 QC 및 변이체 분석
앰플리콘 특이적 FASTQ 시퀀싱 데이터 파일을 생성하기 위하여(문헌[Cock et al, Nucleic Acids Res. 2010, 38(6):1767-71, PMID: 20015970]), 디폴트 파라미터를 사용하여, Illumina MiSeq 분석 소프트웨어(MiSeq reporter, 버전 2.6.2, Illumina)를 사용하였다. 그 다음에 표준 Perl 스크립트 래퍼를 사용하여 함께 합쳐진 일련의 공용 도메인 소프트웨어 패키지로 구성된 내부 개발 변이체 분석 파이프 라인을 통해FASTQ 파일을 처리하였다. 사용된 작업절차은 5 단계로 나뉘어졌다.
단계 1, PCR 프라이머 및 표적-적중 및 표적-외 서열 QC: 표적-적중 부위 및 표적-외 부위 모두에 대하여, BLAST 검색(버전 2.2.29+, 문헌[Altschul et al, J Mol Biol., 1990, 215(3):403-10, PMID: 2231712])을 사용하여 20 뉴클레오티드 gRNA 프로토스페이서 서열과 PAM 서열 및 표적 특이 PCR 프라이머 서열(추가 Illumina 서열 없는 좌측 및 우측)을 인간 게놈 참조 서열(build GRCh38)에 정렬시켰다. 다수 게놈 위치를 갖는 표적-적중 및 표적-외 부위를 표시하였다.
단계 2, 시퀀싱 장치 파일 압축 해제: Illumina 시퀀싱 장치에서 생성된 FASTQ.GZ 파일을 gzip 스크립트(버전 1.3.12)를 사용하여 FASTQ 파일로 압축 해제하였으며 파일 당 리드 수를 계산하였다. 리드가 없는 파일은 추가 분석에서 제외하였다.
단계 3, 서열 리드 정렬 및 품질 트리밍: 'hard-clipping'을 사용하는BWA-MEM 정렬기(버전 0.7.4-r385, 문헌[Li and Durbin, Bioinformatics, 2009, 25(14):1754-60, PMID: 19451168])를 사용하여 FASTQ 파일의 시퀀싱 리드를 인간 게놈 참조 서열(build GRCh38)에 정렬시켜 llumina 서열 및 낮은 품질의 염기의 리드의 3' 말단을 트리밍하였다. 생성된 BAM 파일 형식(문헌[Li et al, Bioinformatics, 2009 25(16):2078-9, PMID: 19505943])의 정렬된 리드를 SAMtools 스크립트(버전 0.1.19-44428cd, 문헌[Li et al, Bioinformatics, 2009 25(16):2078-9, PMID: 19505943])를 사용하여 FASTQ 파일로 변환하였다. 그 다음에 FASTQ 파일을 이번에는 '하드-클리핑(hard-clipping)' 없이 BWA-MEM 정렬기를 사용하여 인간 게놈 참조 서열(build GRCh38)에 다시 정렬시켰다.
단계 4, 변이체(SNP 및 삽입결실) 분석: 변이체(SNP 및 삽입결실)를 확인하기 위하여 대립유전자 빈도 검출 한계가 0.0001 이상으로 설정된 VarDict 변이체 콜러(caller)(버전 1.0개발자에 의해 변형된'Cas9 aware' 문헌[ZhangWu Lia, Lai et al, Nucleic Acids Res., 2016, 44(11):e108, PMID: 27060149])를 사용하여 정렬된 리드의 BAM 파일을 처리하였다. Cas9 aware VarDict 콜러는 공용 도메인 패키지에 기반하지만, 변이체의 정렬 영역에서의 반복 서열 이벤트로 인해 생성된 애매한 변이체 콜(call)을 PAM 서열의 5' 3 염기에 위치한 gRNA 프로토스페이서 서열 내의 잠재적 Cas9 뉴클레아제 절단 부위로 이동시킬 수 있다. 표적-적중 및 표적-외 부위가 1000 배 초과 서열 커버리지에서 커버되었는지 여부를 걸정하기 위해 SAMtools 스크립트를 사용하여 샘플 앰플리콘 당 리드 커버리지를 계산하였다. 1000 배 미만의 서열 커버리지를 갖는 부위를 표시하였다.
단계 5, dbSNP 필터링 및 처리된/처리되지 않은 차등 분석: 확인된 변이체를 dbSNP(build 142, 문헌[Shery et al, Nucleic Acids Res. 2001, 29(1):308-11, PMID: 11125122])에서 발견되는 알려진 변이체(SNP 및 삽입결실)에 대하여 필터링 하였다. 처리된 샘플에서의 변이체를 추가로 필터링하여: 1)처리되지 않은 대조군 샘플에서 확인된 변이체; 2)VarDict 가닥 편향이 2:1인(참조 서열을 지원하는 정방향 및 역방향 리드 수는 균형을 이루지만 비-참조 변이체 콜에 대해서는 불균형인)변이체; 3)잠재적 Cas9 절단 부위 주위 100 bp 윈도우 외부에 위치한 변이체; 4)잠재적 Cas9 절단 부위 주위 100 bp 윈도우 내의 단일 뉴클레오티드 변이체를 배제하였다. 최종적으로 잠재적 Cas9 절단 부위의 100 bp 윈도우 내에서 2%를 초과하는 조합된 삽입결실 빈도(약 10 내지 20을 초과하는 세포에서 편집)를 갖는 부위만 고려하였다. 게놈 참조 서열에 대한 리드 정렬의 시각적 점검을 가능하게 하는 통합 게놈 뷰어(Integrative Genome Viewer)(IGV version 2.3, 문헌[Robinson et al, Nat Biotechnol. 2011, 9(1):24-6, PMID: 21221095])를 사용하여, 잠재적 활성 편집 부위를 리드 정렬 수준에서 추가로 검사하였다.
표적-적중 및 표적-외 분석 결과
BCL11A +58 영역 및 HPFH 영역 gRNA에 대한 표적-적중 부위는 처리된 샘플의 의도된 Cas9 절단 부위에서 모든 gRNA에 대해 88% 초과의 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타냈다. 표 3 및 5는 적어도 하나의 생물학적 반복실험에서 특징 확인된 표적-외 부위의 수를 나타낸다. 특징 확인되지 않은 부위는 PCR 프라이머 설계 또는 PCR 증폭을 하지 못하였고 조사 중에 있다.
BCL11A +58 영역 인실리코 표적화된 분석 결과
gRNA CR00309: gRNA CR00309에 대한 표적-적중 부위는 의도된 Cas9 절단 부위에서 약 92%의 평균 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타냈다. 표 31은 특징 확인된 표적-외 부위의 수를 나타낸다. 특징 확인되지 않은 부위는 PCR 프라이머 설계 또는 PCR 증폭을 하지 못하였고 조사 중에 있다. 잠재적 표적-외 부위의 특징 확인으로, 처리된 반복실험 둘 다에서, 제안된 Cas9 절단 부위 주위 100 bp 윈도우 내에 4개의 표적-외 부위를 확인하였다. 부위 1은 약 18%의 평균 삽입결실 빈도를 갖고, 표적-적중 gRNA 프로토스페이서 서열(5'-CtCaCCtCCACCCTAATCAG-PAM-3', PAM=AGG)에 비해 3 미스매치를 가지며, 염기쌍 위치 22,195,800 내지 22,195,819에, 엑손 1로부터 약 2.3 kb 떨어진, 염색체 11 상의 아녹타민 5 유전자(ANO5)의 인트론 1에 위치한다. 부위 2는 약 18%의 평균 삽입결실 빈도를 갖고, 표적-적중 gRNA 프로토스페이서 서열(5'- CACGCCCaCACCtTAATCAG -PAM-3', PAM=GGG)에 비해 2 미스매치를 가지며, 염기쌍 위치3,311,901 내지 3,311,926에 염색체 12의 유전자간 영역에 위치한다. 부위 3은 약 80%의 평균 삽입결실 빈도를 갖고, 표적-적중 gRNA 프로토스페이서 서열(5'-CACGaCCCaACCCTAATCAG-PAM-3', PAM=AGG)에 비해 2 미스매치를 가지며, 염기쌍 위치 236,065,415 내지 236,065,434에 염색체 1 상의GenBank(문헌[Clark et al., Nucleic Acids Res. 2016 Jan 4; 44(Database issue): D67-D72, PMID: 26590407]) 전사체(RefSeq에 주석 표시되지 않은 BC012501)에 위치한다. 부위 4는 약 2%의 평균 삽입결실 빈도를 갖고, 표적-적중 gRNA 프로토스페이서 서열(5'-CtaGCCCCtACCCTAATaAG-3', PAM=TGG)에 비해 4 미스매치를 가지며, 염기쌍 위치 33,412,659 내지 33,412,678에 염색체 1 상의 폴리호메오틱 2 단백질로 칭하는 GenBank 주석 표시된 전사체(RefSeq에 주석 표시되지 않음) 의 인트론 1에 위치한다.
gRNA CR00311: gRNA CR00311에 대한 표적-적중 부위는 의도된 Cas9 절단 부위에서 약 95%의 평균 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타냈다. 표 31은 성공적으로 특징 확인된 표적-외 부위의 수를 나타낸다. 특징 확인되지 않은 부위는 PCR 프라이머 설계 또는 PCR 증폭을 하지 못하였고 조사 중에 있다. 현재까지 검사된 부위에서 의미있는 표적-외 활성이 관찰되지 않았다.
gRNA CR000312: gRNA CR000312에 대한 표적-적중 부위는 의도된 Cas9 절단 부위에서 약 98%의 평균 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타냈다. 표 31은 성공적으로 특징 확인된 표적-외 부위의 수를 나타낸다. 특징 확인되지 않은 부위는 PCR 프라이머 설계 또는 PCR 증폭을 하지 못하였고 조사 중에 있다. 현재까지 검사된 부위에서 의미있는 표적-외 활성이 관찰되지 않았다.
gRNA CR000316: gRNA CR000316에 대한 표적-적중 부위는 의도된 Cas9 절단 부위에서 약 91%의 평균 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타내지만, 표적-외 부위의 대부분은 아직 특징 확인되어야 한다.
gRNA CR001125: gRNA CR0001125에 대한 표적-적중 부위는 의도된 Cas9 절단 부위에서 약 91%의 평균 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타냈다. 표 31은 성공적으로 특징 확인된 표적-외 부위의 수를 나타낸다. 특징 확인되지 않은 부위는 PCR 프라이머 설계 또는 PCR 증폭을 하지 못하였고 조사 중에 있다. 현재까지 검사된 부위에서 의미있는 표적-외 활성이 관찰되지 않았다.
gRNA CR001126: gRNA CR0001126에 대한 표적-적중 부위는 의도된 Cas9 절단 부위에서 약 92%의 평균 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타냈다. 표 31은 성공적으로 특징 확인된 표적-외 부위의 수를 나타낸다. 특징 확인되지 않은 부위는 PCR 프라이머 설계 또는 PCR 증폭을 하지 못하였고 조사 중에 있다. 잠재적 표적-외 부위의 특징 확인으로, 처리된 반복실험 둘 다에서, 제안된 Cas9 절단 부위 주위 100 bp 윈도우 내에 현재까지 2개의 표적-외 부위를 확인하였다. 제1 부위는 약 2%의 평균 삽입결실 빈도를 갖고, 표적-적중 gRNA 프로토스페이서 서열(5'-TTTATaACAGGCTCCAGaAA-PAM-3', PAM=TGG)에 비해 2 미스매치를 가지며, 염기쌍 위치35,881,815 내지 35,881,834에, 가장 가까운 GenBank 전사체(RefSeq에 주석 표시되지 않음)로부터 약 9.5 kb 떨어진, 염색체 4 상의 유전자간 영역에 위치한다. 제2 부위는 약 1.7%의 평균 삽입결실 빈도를 갖고, 표적-적중 gRNA 프로토스페이서 서열(5' caTATCACAGGCcCCAGGAg-PAM-3', PAM=GGG)에 비해 4 미스매치를 가지며, 염기쌍 위치16,519,907 내지 16,519,926에, 엑손 6으로부터 약 2.7 kb 떨어진, 염색체 6 상의 아탁신 1 유전자(ATXN1)의 인트론 6에 위치한다.
gRNA CR001127: gRNA CR0001127에 대한 표적-적중 부위는 의도된 Cas9 절단 부위에서 약 97%의 평균 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타냈다. 표 31은 성공적으로 특징 확인된 표적-외 부위의 수를 나타낸다. 특징 확인되지 않은 부위는 PCR 프라이머 설계 또는 PCR 증폭을 하지 못하였고 조사 중에 있다. 현재까지 검사된 부위에서 의미있는 표적-외 활성이 관찰되지 않았다.
gRNA CR001128: gRNA CR0001128에 대한 표적-적중 부위는 의도된 Cas9 절단 부위에서 약 94%의 평균 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타냈다. 표 31은 성공적으로 특징 확인된 표적-외 부위의 수를 나타낸다. 특징 확인되지 않은 부위는 PCR 프라이머 설계 또는 PCR 증폭을 하지 못하였고 조사 중에 있다. 현재까지 검사된 부위에서 의미있는 표적-외 활성이 관찰되지 않았다.
확인된 모든 활발히 편집된 BCL11 +58 영역 표적-외 부위에 대한 수동 점검은 Cas9 매개 이중 가닥 단절 비상동 말단 접합 DNA 수선의 전형적인 제안된 Cas9 절단 부위 주위에 전형적인 삽입결실 패턴을 보여주었다. 확인된 부위에서의 편집이 유전자 발현 또는 세포 생존능에 대해 임의의 해로운 효과를 갖는지 여부는 불명확하여, 추가적인 분석이 필요하다.
[표 31]
확인된 인실리코 표적-외 부위, 적어도 하나의 처리된 반복실험에서 성공적으로 특징 확인된 부위, 및 BCL11A +58 영역 gRNA CR00309, CR00311, CR00312, CR00316, CR001125, CR001126, CR001127 및 CR001128에 대해 편집을 나타내는 부위의 수가 나타난다. *0 내지 4 뉴클레오티드 미스매치를 갖는 부위만 검사하였다.
Figure pct00221
BCL11A +58 영역GUIDE-seq 히트 증명 결과
GUIDE-seq(문헌[Tsai et al, Nat Biotechnol. 2015, 33(2):187-97, PMID: 25513782])에 의해 확인된 잠재적 표적-외 히트를 인실리코 정의된 부위에 대하여RNP 처리된 및 처리되지 않은 HSPC에서 상기 기재된 표적화된 시퀀싱 방법을 이용하여 특징 확인하였다. GUIDE-seq 잠재적 히트가 gRNAs CR00312, CR00316, CR001125, CR001126, CR001127 및 CR001128에 대해 확인되었다. gRNA CR00311 및 CR001128에 대해서는 잠재적 히트가 확인되지 않았다. 표적화된 시퀀싱을 이용하여 HSPC 에서 잠재적 히트에 대해 조사하였을 때, gRNA CR00312, CR001125 및 CR001127에 대해서는 처리된 HSPC에서 잠재적 히트 중 어느 것도 증명되지 않았다. gRNA CR001126에 대해서 하나의 잠재적 히트가 ATXN1의 인트론 6(염색체6:16,519,907 내지 16,519,926 염기쌍)에서의 인실리코 지시된 방법에 의해 확인된 동일한 부위로 증명되었다. gRNAs CR00309 및 CR00316에 대한 잠재적 히트 증명은 여전히 진행 중이다.
HPFH 영역 인실리코 표적화된 분석 결과
gRNA CR001028: gRNA CR0001028에 대한 표적-적중 부위는 의도된 Cas9 절단 부위에서 약 91%의 평균 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타냈다. 표 32는 성공적으로 특징 확인된 표적-외 부위의 수를 나타낸다. 특징 확인되지 않은 부위는 PCR 프라이머 설계 또는 PCR 증폭을 하지 못하였고 조사 중에 있다. 잠재적 표적-외 부위의 특징 확인으로, 처리된 반복실험 둘 다에서, 제안된 Cas9 절단 부위 주위 100 bp 윈도우 내에 현재까지 2개의 표적-외 부위를 확인하였다. 부위 1은 약 2.8%의 평균 삽입결실 빈도를 갖고, 표적-적중 gRNA 프로토스페이서 서열(5'-TGgGGTGGGGAGATATGaAG-PAM-3', PAM=AGG)에 비해 2 미스매치를 가지며, 염기쌍 위치58,169,308 내지 58,169,327에, 염색체 4 상에 위치한 비-코딩 RNA(LF330410, RefSeq에 주석 표시되지 않음)의 인트론 2에 위치한다. 부위 2는 약 3.5%의 평균 삽입결실 빈도를 갖고, 표적-적중 gRNA 프로토스페이서 서열(5'-gGaGGTGGGGAGAgATGTAG-PAM-3', PAM=AGG)에 비해 3 미스매치를 가지며, 염기쌍 위치 26,366,733 내지 26,366,752에, 엑손 2로부터 약 1.3 kb 떨어진, 염색체 6 상에 위치한 부티로필린 서브패밀리 3 멤버 A2 유전자(BTN3A2)의 인트론 1에 위치한다.
gRNA CR001030: gRNA CR0001030에 대한 표적-적중 부위는 의도된 Cas9 절단 부위에서 약 89%의 평균 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타냈다. 표 32는 성공적으로 특징 확인된 표적-외 부위의 수를 나타낸다. 특징 확인되지 않은 부위는 PCR 프라이머 설계 또는 PCR 증폭을 하지 못하였고 조사 중에 있다. 잠재적 표적-외 부위의 특징 확인으로, 처리된 반복실험 둘 다에서, 제안된 Cas9 절단 부위 주위 100 bp 윈도우 내에 현재까지 57%의 평균 삽입결실 빈도를 갖는 1개의 표적-외 부위를 확인하였다. 부위는 표적-적중 gRNA 프로토스페이서 서열(5'-caTGCgGAAAGAGATGCGGT-PAM-3', PAM=TGG)에 비해 3 미스매치를 가지며, 염기쌍 위치 24,503,476 내지 24,503,495에, X 염색체 상에 위치한 피루베이트 데하이드로게나제 키나제3 유전자(PDK3)의 엑손 4에 위치한다.
gRNA CR001137: gRNA CR0001037에 대한 표적-적중 부위는 의도된 Cas9 절단 부위에서 약 84%의 평균 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타냈다. 표 32는 성공적으로 특징 확인된 표적-외 부위의 수를 나타낸다. 특징 확인되지 않은 부위는 PCR 프라이머 설계 또는 PCR 증폭을 하지 못하였고 조사 중에 있다. 현재까지 검사된 부위에서 의미있는 표적-외 활성이 관찰되지 않았다.
gRNA CR001221: gRNA CR0001221에 대한 표적-적중 부위는 의도된 Cas9 절단 부위에서 약 95%의 평균 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타냈다. 표 32는 성공적으로 특징 확인된 표적-외 부위의 수를 나타낸다. 특징 확인되지 않은 부위는 PCR 프라이머 설계 또는 PCR 증폭을 하지 못하였고 조사 중에 있다. 현재까지 검사된 부위에서 의미있는 표적-외 활성이 관찰되지 않았다.
gRNA CR003035: gRNA CR0003035에 대한 표적-적중 부위는 의도된 Cas9 절단 부위에서 약 89%의 평균 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타냈다. 표 32는 성공적으로 특징 확인된 표적-외 부위의 수를 나타낸다. 특징 확인되지 않은 부위는 PCR 프라이머 설계 또는 PCR 증폭을 하지 못하였고 조사 중에 있다. 잠재적 표적-외 부위의 특징 확인으로, 처리된 반복실험 둘 다에서, 제안된 Cas9 절단 부위 주위 100 bp 윈도우 내에 현재까지 2개의 표적-외 부위를 확인하였다. 부위 1은 약 20%의 평균 삽입결실 빈도를 갖고, 표적-적중 gRNA 프로토스페이서 서열(5'-AGGtACCTCAaACTCAGCAT-PAM-3', PAM=AGG)에 비해 2 미스매치를 가지며, 염기쌍 위치 66,281,781 내지 66,281,800에 염색체 2 상의 유전자간 영역에 위치하고, 가장 가까운 전사체(JD432564, RefSeq에 주석 표시되지 않음)로부터 약 7.1 kb에 있다. 부위 2는 약 2.5%의 평균 삽입결실 빈도를 갖고, 표적-적중 gRNA 프로토스페이서 서열(5'-AGagACCcCAGACTCAGCAT-PAM-3', PAM=AGG)에 비해 3 미스매치를 가지며, 염기쌍 위치 42,997,289 내지 42,997,308에 염색체 10 상의 유전자간 영역에 위치하고, 마이크로RNA 5100(MIR5100)로부터 약 0.3 kb에 있다.
gRNA CR003085: gRNA CR0003038에 대한 표적-적중 부위는 의도된 Cas9 절단 부위에서 약 94%의 평균 삽입결실 빈도로 강력한 편집을 나타냈다. 표 32는 성공적으로 특징 확인된 표적-외 부위의 수를 나타낸다. 특징 확인되지 않은 부위는 PCR 프라이머 설계 또는 PCR 증폭을 하지 못하였고 조사 중에 있다. 잠재적 표적-외 부위의 특징 확인으로, 처리된 반복실험 둘 다에서, 제안된 Cas9 절단 부위 주위 100 bp 윈도우 내에 현재까지 약 2%의 평균 삽입결실 빈도를 갖는 1개의 표적-외 부위를 확인하였다. 부위는 표적-적중 gRNA 프로토스페이서 서열(5'-ATGGTATGaGAaaTATACTA-PAM-3', PAM=TGG)에 비해 3 미스매치를 가지며, 염기쌍 위치 171,872,630 내지 171,872,649에 염색체 2 상에 위치한 솔루트 캐리어(Solute Carrier) 패밀리 25 멤버 12 유전자(SLC25A12)의 인트론 2에 위치하고, 엑손 3으로부터 약 3.8 kb에 있다.
확인된 모든 활발히 편집된 HPFH 영역 표적-외 부위에 대한 수동 점검은 Cas9 매개 이중 가닥 단절 비상동 말단 접합 DNA 수선의 전형적인 제안된 Cas9 절단 부위 주위에 전형적인 삽입결실 패턴을 나타냈다. 확인된 부위에서의 편집이 유전자 발현 또는 세포 생존능에 대해 임의의 해로운 효과를 갖는지 여부는 불명확하여, 추가적인 분석이 필요하다.
[표 32]
확인된 인실리코 표적-외 부위, 적어도 하나의 처리된 반복실험에서 성공적으로 특징 확인된 부위, 및HPFH 영역 gRNA CR001028, CR001030, CR001137, CR001221, CR003035 및 CR003085에 대해 편집을 나타내는 부위의 수가 나타난다.
Figure pct00222
HPFH 영역GUIDE-seq 히트 증명 결과
GUIDE-seq(문헌[Tsai et al, Nat Biotechnol. 2015, 33(2):187-97, PMID: 25513782])를 사용하여 확인된 잠재적 표적-외 히트를 인실리코 부위에 대하여 기재된 동일한 방법을 이용하여 RNP 처리된 및 처리되지 않은 HSPC에서 조사하였다. GUIDE-seq 잠재적 표적-외 히트가 gRNA CR001028, CR001030, CR003035 및 CR003085(현재까지)에 대해 확인되었다. gRNA CR001137 및 CR001221에 대해서는 현재까지 히트가 확인되지 않았다. gRNA CR001028에 대해서 하나의 히트가 HSPC에서 58,169,308 내지 58,169,327 염기쌍 위치에 염색체 4 상에서의 인실리코 지시된 방법에 의해 확인된 동일한 부위로 증명되었다. gRNA CR001030에 대해서 하나의 히트가 HSPC에서 PDK3 유전자의 엑손 4에서의 인실리코 지시된 방법에 의해 확인된 동일한 부위로 증명되었다. gRNA CR003035에 대해서 하나의 히트가 HSPC에서 66,281,781 내지 66,281,800 염기쌍 위치에 염색체 2의 유전자간 영역에서의 인실리코 지시된 방법에 의해 확인된 동일한 부위로 증명되었다. gRNA CR003085에 대해서 하나의 히트가 HSPC에서 171,872,630 내지 171,872,649 염기쌍 위치에 염색체 2 상에서의 인실리코 지시된 방법에 의해 확인된 것과 동일한 부위로 증명되었다.
gRNA 편집 효율 스크리닝에 대한 표적-적중 분석
gRNA 표적-적중 부위를 표적화하는 PCR 앰플리콘을 제조사의 권장 사항에 따라 Agencourt AMPure XP 비드(Beckman Coulter, Cat# A63882)를 이용하여 정화하였다. 샘플을 제조사의 권장 사항을 이용하는 Quant-iT PicoGreen dsDNA 키트(Thermo Fisher, Cat# P7581)를 이용하여 정량화하였다. 제조사의 권장 사항에 따라 Nextera DNA 라이브러리 제조 키트(Illumina, Cat# FC-121-1031)를 이용하여 앰플리콘을 Illumina 시퀀싱 라이브러리로 변환시켰다. 생성된 시퀀싱 라이브러리를 AMPure 비드 정화시키고, qPCR 정량화하고, 푸울링하고, 및 표적-외 분석 섹션에 기재된 150 염기(Illumina, Cat# MS-102-2002) 또는 250 염기(Illumina, Cat# MS-102-2003) 쌍-말단 리드를 이용하는Illumina MiSeq 기기로 시퀀싱하였다. 각 라이브러리에 대해서, 최소 1000 배의 시퀀싱 커버리지가 생성되었고, 변이체는 일련의 내부 스크립트를 이용하여 콜링(calling) 하였다. 간략하게, gRNA 서열을 중심으로 하는 80 내지 100 염기쌍 윈도우에 걸친 시퀀싱 리드를 문자열 기반 서열 검색을 이용하여 확인하고, 앰플리콘 서열에 비교하고, 서열 차이에 의해 비닝(bin)하였으며, 변이체 빈도를 계산하였다. 추가적으로 시퀀싱 리드를 Illumina MiSeq 리포터 소프트웨어(Illumina 버전 2.6.1)을 이용하여 앰플리콘 서열에 정렬하고 생성된 리드 정렬을 통합 게놈 뷰어(IGV 버전 2.3, 문헌[Robinson et al, Nat Biotechnol. 2011, 9(1):24-6, PMID: 21221095])를 이용하여 검사하였다.
실시예 10: 유전자 편집 및 HbF 유도에 대한 RNP 농도 평가
유전자 편집을 위한 최적의 RNP 농도를 결정하기 위한 RNP 희석 검정
Cas9(iProt: 106331) 및 가이드 리보뉴클레오티드 복합체(RNP) 농도의 순차적 희석을 이용하여 유전자 편집을 수행하였다(표 33). 이 검정에서 사용된 다양한 gRNA, 그 형식, 및 적용된 변형이 표 34에 나열되어 있다.
[표 33]
Figure pct00223
[표 34]
RNP 희석 검정에 사용된 화학적 변형을 갖거나 갖지 않는, 단일 또는 이중 가이드 형식의 gRNA 목록. "OMePS" 변형은, dgRNA 형식에 대해 SEQ ID NO: 6660의 변형되지 않은 tracr(즉 tracrRNA)와 쌍을 이루는 다음의 구조: mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG를 갖는 변형된 crRNA를 지칭하고; sgRNA에 대해 다음의 구조: mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U를 갖는 gRNA를 지칭하며, 여기서 N=표적화 도메인의 뉴클레오티드, mN은 2'-OMe-변형된 뉴클레오티드를 지칭하고, *는 포스포로티오에이트 결합을 지칭한다. "변형되지 않음"은 RNA 변형을 갖지 않는 gRNA를 지칭한다: dgRNA는 SEQ ID NO: 6660과 쌍을 이루는 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG로 구성된다; sgRNA는 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU, 여기서 N=표시된 표적화 도메인의 뉴클레오티드를 지칭한다.
Figure pct00224
CD34+ 세포를 이전에 기재된 바와 같이 전기천공하고, 세포 생존능, 유전자 편집 효율 및 HbF 생산 능력을 측정하였다. 세포 생존능을 평가할 때, 결과는 변화하는 RNP 농도가, 단일 또는 이중 가이드 형식을 사용할 때 모두, 전기천공시 세포 생존능에 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 39a 및 도 39b). CD34+ 세포의 유전자 편집시, NGS 데이터는, 변형되지 않은 CR00312 및 CR001128, 및 변형된 CR00312에 대해 1.47 uM까지의 RNP 농도가 최대 %의 유전자 편집 효율을 달성한 반면 변형된 CR001228에 대한 최대 %의 유전자 편집 효율은 2.94 uM만큼 낮은 RNP 농도에서 달성되었다는 것을 나타낸다(도 40a). sgRNA 형식에 대해서는, 테스트한 모든 gRNA가 0.48 uM까지의 RNP 농도에서 최대 %의 편집을 달성하였다(도 40b). 유전자 편집된 세포의 적혈구계 계통으로 분화하여 HbF를 생산하는 능력을 측정함에 있어서, 데이터는, dgRNA-함유 RNP에 대해서는 2.94 uM까지의 RNP 농도가(도 41a), sgRNA-함유 RNP에 대해서는 0.97 uM까지의 RNP 농도가(도 41b) HbF 유도의 최대 수준을 야기하였음을 나타냈다.
이 출원서는 서열 목록과 함께 제출된다. 서열목록과 명세서 내에 열거된 임의의 서열 사이에 임의의 불일치가 존재하는 경우에, 명세서에 열거된 서열이 정확한 서열로 고려되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 모든 게놈 위치는 hg38에 따른다.
참조로서의 포함
본원에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은, 각 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 기재된 것과 같이, 그 전문이 참조로 본원에 포함된다. 분쟁의 경우에, 본원에서의 임의의 정의를 포함하여, 본 출원이 우선한다.
등가물
당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예의 많은 등가물을 단지 일상적인 실험을 이용하여 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 이 발명은 특정 양태를 참조로 하여 개시되었으나, 본 발명의 다른 양태 및 변형이 본 발명의 진정한 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 당업자에 의해 고안될 수 있음은 자명하다. 첨부된 청구범위는 이러한 양태 및 등가물 변형 모두를 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG INTELLIA THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF HEMOGLOBINOPATHIES <130> PAT057179-WO-PCT <140> PCT/IB2016/058007 <141> 2016-12-26 <150> 62/347,484 <151> 2016-06-08 <150> 62/271,968 <151> 2015-12-28 <160> 7831 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 acaggccgug aaccuaagug 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 uagagggggg aaauuauagg 20 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 cgagcgguaa auccuaaaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 4 agacaaauuc aaauccugca 20 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 5 gcuuuuggug gcuaccaugc 20 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6 aauuuaugcc aucugauaag 20 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 7 uguuccuccu acccacccga 20 <210> 8 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 8 auaaauguug gagcuuuagg 20 <210> 9 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 9 caaccuaauu accuguauug 20 <210> 10 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 10 cgcugucaug agugaugccc 20 <210> 11 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 11 ggcaucacuc augacagcga 20 <210> 12 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 12 agucccauag agagggcccg 20 <210> 13 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 13 acugauucac uguuccaaug 20 <210> 14 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 14 aggacucugu cuucgcacaa 20 <210> 15 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 15 ccacgcugac gucgacuggg 20 <210> 16 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 16 guucuucaca cacccccauu 20 <210> 17 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 17 gcgcuucucc acaccgcccg 20 <210> 18 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 18 gucuggaguc uccgaagcua 20 <210> 19 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 19 aaagaucccu uccuuagcuu 20 <210> 20 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 20 ucgccggcua cgcggccucc 20 <210> 21 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 21 cggagaacgu guacucgcag 20 <210> 22 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 22 gagcuugaug cgcuuagaga 20 <210> 23 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 23 ccccccgagg ccgacucgcc 20 <210> 24 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 24 caccaugccc ugcaugacgu 20 <210> 25 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 25 gagagcgaga ggguggacua 20 <210> 26 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 26 cacggacuug agcgcgcugc 20 <210> 27 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 27 gcccaccaag ucgcuggugc 20 <210> 28 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 28 cccaccaagu cgcuggugcc 20 <210> 29 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 29 ggcgguggag agaccgucgu 20 <210> 30 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 30 gccgcagaac ucgcaugacu 20 <210> 31 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 31 ccgcccccag gcgcucuaug 20 <210> 32 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 32 ugggggucca agugaugucu 20 <210> 33 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 33 cucaacuuac aaauacccug 20 <210> 34 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 34 agugcagaau augccccgca 20 <210> 35 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 35 gcauauucug cacucauccc 20 <210> 36 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 36 gagcucuaau ccccacgccu 20 <210> 37 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 37 agagcuccau gugcagaacg 20 <210> 38 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 38 gauaaacuuc ugcacuggag 20 <210> 39 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 39 uagcuguagu gcuugauuuu 20 <210> 40 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 40 uauccaaauu cauacaauag 20 <210> 41 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 41 augcccugag uaucccaaca 20 <210> 42 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 42 uaguaacaga cccaugugcu 20 <210> 43 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 43 auacuucaag gccucaauga 20 <210> 44 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 44 gacuagguag accuucauug 20 <210> 45 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 45 cugagcuagu gggggcucuu 20 <210> 46 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 46 cugagcacau ucuuacgccu 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 47 uuuauaagac auuaggguat 20 <210> 48 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 48 ugauaggugc cuauauguga 20 <210> 49 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 49 uccacccauc caucacauau 20 <210> 50 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 50 cuucaaaguu guauugaccc 20 <210> 51 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 51 aaaccagacu aguuuauagg 20 <210> 52 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 52 uuugagacag uuaccccuuc 20 <210> 53 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 53 aaccugaggg cuaguuucua 20 <210> 54 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 54 gccuggaccc accgcuucau 20 <210> 55 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 55 aaaccaguga ggucaucuau 20 <210> 56 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 56 accugcuaug uguuccuguu 20 <210> 57 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 57 uagaggaauu ugccccaaac 20 <210> 58 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 58 gauaaacaau cgucauccuc 20 <210> 59 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 59 uggcauccag gucacgccag 20 <210> 60 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 60 gaccuggaug ccaaccucca 20 <210> 61 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 61 aaaagcaucc aaucccgugg 20 <210> 62 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 62 gaugcuuuuu ucaucucgau 20 <210> 63 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 63 ccacagcuuu uucuaagcag 20 <210> 64 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 64 cccccaaugg gaaguucauc 20 <210> 65 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 65 aucaugaccu ccucaccugu 20 <210> 66 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 66 aggaggucau gauccccuuc 20 <210> 67 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 67 ccccuucugg agcucccaac 20 <210> 68 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 68 gcucccaacg ggccgugguc 20 <210> 69 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 69 acagaugaug aaccagacca 20 <210> 70 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 70 ucuguaagaa uggcuucaag 20 <210> 71 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 71 caauuauuag agugccagag 20 <210> 72 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 72 gccuugcuug cggcgagaca 20 <210> 73 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 73 accaugucuc gccgcaagca 20 <210> 74 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 74 gagucuccuu cuuucuaacc 20 <210> 75 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 75 gaauuguggg agagccguca 20 <210> 76 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 76 aaaauagagc gagagugcac 20 <210> 77 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 77 gccccuggcg uccacacgcg 20 <210> 78 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 78 cuccucguuc uuuauuccuc 20 <210> 79 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 79 gacugcccgc gcuuuguccu 20 <210> 80 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 80 uucccaggga cugggacucc 20 <210> 81 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 81 uggcuccugg gugugcgccu 20 <210> 82 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 82 ugaagcccgc uuuuugacag 20 <210> 83 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 83 aggguggaga cgggucgcca 20 <210> 84 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 84 gcucaggguc ucgcgggcca 20 <210> 85 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 85 ugaguccgag cagaagaaga 20 <210> 86 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 86 ucuuaaacca accugcucac 20 <210> 87 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 87 cagguugguu uaagauaagc 20 <210> 88 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 88 agguugguuu aagauaagca 20 <210> 89 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 89 uuaagggaau aguggaauga 20 <210> 90 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 90 agggcaaguu aagggaauag 20 <210> 91 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 91 cccuuaacuu gcccugagau 20 <210> 92 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 92 ccaaucucag ggcaaguuaa 20 <210> 93 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 93 gccaaucuca gggcaaguua 20 <210> 94 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 94 ugacagaaca gccaaucuca 20 <210> 95 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 95 augacagaac agccaaucuc 20 <210> 96 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 96 gagauaugua gaggagaaca 20 <210> 97 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 97 ggagauaugu agaggagaac 20 <210> 98 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 98 ugcggugggg agauauguag 20 <210> 99 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 99 cugcugaaag agaugcggug 20 <210> 100 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 100 acugcugaaa gagaugcggu 20 <210> 101 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 101 aacugcugaa agagaugcgg 20 <210> 102 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 102 aacaacugcu gaaagagaug 20 <210> 103 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 103 ucugcaaaaa ugaaacuagg 20 <210> 104 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 104 acuucugcaa aaaugaaacu 20 <210> 105 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 105 cauuuuugca gaaguguuuu 20 <210> 106 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 106 aguguuuuag gcuaauauag 20 <210> 107 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 107 uuggagacaa aaaucucuag 20 <210> 108 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 108 ucuagagauu uuugucucca 20 <210> 109 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 109 cuagagauuu uugucuccaa 20 <210> 110 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 110 gucuccaagg gaauuuugag 20 <210> 111 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 111 ccaagggaau uuugagaggu 20 <210> 112 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 112 ccaaccucuc aaaauucccu 20 <210> 113 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 113 ggaauuuuga gagguuggaa 20 <210> 114 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 114 ugcuugcuuc cuccuucuuu 20 <210> 115 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 115 aagaauuuac caaaagaagg 20 <210> 116 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 116 aggaagaauu uaccaaaaga 20 <210> 117 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 117 aaaaauuaga guuuuauuau 20 <210> 118 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 118 uuuuuuaaau auucuuuuaa 20 <210> 119 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 119 uauuuaccag uuauugaaau 20 <210> 120 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 120 ccaguuauug aaauagguuc 20 <210> 121 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 121 ccagaaccua uuucaauaac 20 <210> 122 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 122 uucuggaaac augaauuuua 20 <210> 123 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 123 auuuugaaug uuuaaaauua 20 <210> 124 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 124 aaauuuaauc uggcugaaua 20 <210> 125 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 125 gaacuucguu aaauuuaauc 20 <210> 126 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 126 auuaaauuua acgaaguucc 20 <210> 127 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 127 uuaaauuuaa cgaaguuccu 20 <210> 128 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 128 uucuguacua gcauauuccc 20 <210> 129 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 129 uguguucuua aaaaaaaaug 20 <210> 130 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 130 aaaaaugugg aauuagaccc 20 <210> 131 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 131 cuacugggau cuucauuccu 20 <210> 132 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 132 acuacuggga ucuucauucc 20 <210> 133 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 133 gaaaagagug aaaaacuacu 20 <210> 134 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 134 agaaaagagu gaaaaacuac 20 <210> 135 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 135 gaauucaaau aaugccacaa 20 <210> 136 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 136 uguguauuug ucugccauug 20 <210> 137 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 137 cacccaugag cauauccaaa 20 <210> 138 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 138 uuccuuuugg auaugcucau 20 <210> 139 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 139 cuuccuuuug gauaugcuca 20 <210> 140 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 140 caugagcaua uccaaaagga 20 <210> 141 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 141 uauccaaaag gaaggauuga 20 <210> 142 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 142 uuuccuucaa uccuuccuuu 20 <210> 143 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 143 aaggaaggau ugaaggaaag 20 <210> 144 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 144 gaaggauuga aggaaagagg 20 <210> 145 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 145 gaggaggaag aaauggagaa 20 <210> 146 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 146 aggaagaaau ggagaaagga 20 <210> 147 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 147 gaaggaagag gggaagagag 20 <210> 148 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 148 gaagagggga agagagagga 20 <210> 149 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 149 aggggaagag agaggaugga 20 <210> 150 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 150 ggggaagaga gaggauggaa 20 <210> 151 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 151 aagagagagg auggaaggga 20 <210> 152 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 152 agagaggaug gaagggaugg 20 <210> 153 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 153 ggaagggaug gaggagaaga 20 <210> 154 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 154 gaagaaggaa aaauaaauaa 20 <210> 155 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 155 aggaaaaaua aauaauggag 20 <210> 156 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 156 aaauaaauaa uggagaggag 20 <210> 157 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 157 uggagaggag aggagaaaaa 20 <210> 158 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 158 agaggagagg agaaaaaagg 20 <210> 159 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 159 gaggagagga gaaaaaagga 20 <210> 160 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 160 aggagaggag aaaaaaggag 20 <210> 161 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 161 aggagaaaaa aggaggggag 20 <210> 162 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 162 gagaggagag gagaagggau 20 <210> 163 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 163 agaggagagg agaagggaua 20 <210> 164 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 164 gaagagaaag agaaagggaa 20 <210> 165 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 165 aagagaggaa agaagagaag 20 <210> 166 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 166 gagagaaaag aaacgaagag 20 <210> 167 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 167 agagaaaaga aacgaagaga 20 <210> 168 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 168 gagaaaagaa acgaagagag 20 <210> 169 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 169 aaagaaacga agagagggga 20 <210> 170 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 170 aagaaacgaa gagaggggaa 20 <210> 171 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 171 ggaagggaag gaaaaaaaag 20 <210> 172 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 172 aagacugaca guucaaauuu 20 <210> 173 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 173 acugacaguu caaauuuugg 20 <210> 174 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 174 uucaaauuuu gguggugaua 20 <210> 175 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 175 aauagaaacu caaacucugu 20 <210> 176 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 176 guacaauagu auaaccccuu 20 <210> 177 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 177 cuauuaaagg uuuuccaaag 20 <210> 178 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 178 acuauuaaag guuuuccaaa 20 <210> 179 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 179 uacuauuaaa gguuuuccaa 20 <210> 180 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 180 gcauuugugg auacuauuaa 20 <210> 181 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 181 uuaauaguau ccacaaaugc 20 <210> 182 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 182 uaugcaauuu uugccaagau 20 <210> 183 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 183 uuuugccaag augggaguau 20 <210> 184 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 184 uuugccaaga ugggaguaug 20 <210> 185 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 185 ucagugagau gagauaucaa 20 <210> 186 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 186 cagugagaug agauaucaaa 20 <210> 187 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 187 ccaucucccu aaucuccaau 20 <210> 188 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 188 ccaauuggag auuagggaga 20 <210> 189 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 189 gcuuugccaa uuggagauua 20 <210> 190 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 190 ggcuuugcca auuggagauu 20 <210> 191 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 191 aauuggcaaa gccagacuug 20 <210> 192 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 192 agucuguauu gccccaaguc 20 <210> 193 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 193 agacuugggg caauacagac 20 <210> 194 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 194 acauuuggug auaaaucauu 20 <210> 195 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 195 ccaaauguuc uuucuucagc 20 <210> 196 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 196 auaauaguau augcuucaua 20 <210> 197 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 197 cggagcacuu acucugcucu 20 <210> 198 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 198 agcauuuuag uucacaagcu 20 <210> 199 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 199 uguaacuaau aaauaccagg 20 <210> 200 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 200 agguguaacu aauaaauacc 20 <210> 201 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 201 ucugacccaa acuaggaauu 20 <210> 202 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 202 aaggaaaaga auaugacguc 20 <210> 203 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 203 aggaaaagaa uaugacguca 20 <210> 204 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 204 ggaaaagaau augacgucag 20 <210> 205 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 205 gaaaagaaua ugacgucagg 20 <210> 206 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 206 ucagggggag gcaagucagu 20 <210> 207 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 207 cagggggagg caagucaguu 20 <210> 208 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 208 aucacauaua ggcaccuauc 20 <210> 209 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 209 cagguaccag cuacuguguu 20 <210> 210 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 210 acuauccacg gauauacacu 20 <210> 211 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 211 cacaguagcu gguaccugau 20 <210> 212 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 212 aucacauaua ggcaccuauc 20 <210> 213 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 213 ugauaggugc cuauauguga 20 <210> 214 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 214 aggugccuau augugaugga 20 <210> 215 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 215 ggugccuaua ugugauggau 20 <210> 216 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 216 uccacccauc caucacauau 20 <210> 217 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 217 acagcccgac agaugaaaaa 20 <210> 218 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 218 augaaaaaug gacaauuaug 20 <210> 219 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 219 aaaaauggac aauuaugagg 20 <210> 220 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 220 aaaauggaca auuaugagga 20 <210> 221 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 221 aaauggacaa uuaugaggag 20 <210> 222 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 222 gaggagggga gagugcagac 20 <210> 223 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 223 aggaggggag agugcagaca 20 <210> 224 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 224 cuucaccucc uuuacaauuu 20 <210> 225 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 225 uucaccuccu uuacaauuuu 20 <210> 226 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 226 gacucccaaa auuguaaagg 20 <210> 227 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 227 guggacuccc aaaauuguaa 20 <210> 228 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 228 uuuugggagu ccacacggca 20 <210> 229 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 229 aauuuguaug ccaugccgug 20 <210> 230 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 230 ccaagagagc cuuccgaaag 20 <210> 231 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 231 ccaggggggc cucuuucgga 20 <210> 232 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 232 ccuuccgaaa gaggcccccc 20 <210> 233 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 233 cuuccgaaag aggccccccu 20 <210> 234 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 234 aagaggcccc ccugggcaaa 20 <210> 235 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 235 cgguggccgu uugcccaggg 20 <210> 236 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 236 ucgguggccg uuugcccagg 20 <210> 237 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 237 aucgguggcc guuugcccag 20 <210> 238 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 238 caucgguggc cguuugccca 20 <210> 239 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 239 ccugggcaaa cggccaccga 20 <210> 240 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 240 ccaucggugg ccguuugccc 20 <210> 241 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 241 gcaaacggcc accgauggag 20 <210> 242 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 242 cuggcagacc ucuccaucgg 20 <210> 243 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 243 ggacuggcag accucuccau 20 <210> 244 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 244 ucugauuagg gugggggcgu 20 <210> 245 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 245 cacgccccca cccuaaucag 20 <210> 246 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 246 uuggccucug auuagggugg 20 <210> 247 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 247 uuuggccucu gauuagggug 20 <210> 248 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 248 guuuggccuc ugauuagggu 20 <210> 249 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 249 gguuuggccu cugauuaggg 20 <210> 250 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 250 aaggguuugg ccucugauua 20 <210> 251 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 251 gaaggguuug gccucugauu 20 <210> 252 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 252 uugcuuuuau cacaggcucc 20 <210> 253 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 253 cuaacaguug cuuuuaucac 20 <210> 254 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 254 cuucaaaguu guauugaccc 20 <210> 255 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 255 acucuuagac auaacacacc 20 <210> 256 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 256 uagaugccau aucucuuuuc 20 <210> 257 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 257 cauaggccag aaaagagaua 20 <210> 258 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 258 ggccuauguu auuaccugua 20 <210> 259 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 259 guccauacag guaauaacau 20 <210> 260 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 260 uaccuguaug gacuuugcac 20 <210> 261 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 261 uuccagugca aaguccauac 20 <210> 262 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 262 ugcucuuacu uaugcacacc 20 <210> 263 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 263 gcucuuacuu augcacaccu 20 <210> 264 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 264 cucuuacuua ugcacaccug 20 <210> 265 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 265 cagggcuggc ucuaugcccc 20 <210> 266 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 266 gcugaaaagc gauacagggc 20 <210> 267 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 267 gauggcugaa aagcgauaca 20 <210> 268 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 268 agauggcuga aaagcgauac 20 <210> 269 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 269 gggaguuauc uguagugaga 20 <210> 270 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 270 aaggcagcua gacaggacuu 20 <210> 271 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 271 gaaggcagcu agacaggacu 20 <210> 272 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 272 gauaaggaag gcagcuagac 20 <210> 273 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 273 cuagcugccu uccuuaucac 20 <210> 274 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 274 ugggugcuau uccugugaua 20 <210> 275 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 275 uaucacagga auagcaccca 20 <210> 276 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 276 cugagguacu gauggaccuu 20 <210> 277 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 277 ucugagguac ugauggaccu 20 <210> 278 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 278 agcucuggaa ugauggcuua 20 <210> 279 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 279 auuguggagc ucuggaauga 20 <210> 280 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 280 cuggaauaga aaauuggagu 20 <210> 281 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 281 uggguacggg gaacuaagac 20 <210> 282 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 282 uuaguucccc guacccauca 20 <210> 283 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 283 uauuuuccuu gauggguacg 20 <210> 284 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 284 auauuuuccu ugauggguac 20 <210> 285 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 285 aauauuuucc uugaugggua 20 <210> 286 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 286 ggaaggaaau gagaacggaa 20 <210> 287 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 287 aggaaggaaa ugagaacgga 20 <210> 288 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 288 auacuucaag gccucaauga 20 <210> 289 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 289 gacuagguag accuucauug 20 <210> 290 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 290 uucuucuugc uaaggugacu 20 <210> 291 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 291 gagauugauu cuucuugcua 20 <210> 292 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 292 guguucuaug agguuggaga 20 <210> 293 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 293 ggaugagugu ucuaugaggu 20 <210> 294 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 294 caugggauga guguucuaug 20 <210> 295 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 295 ugagucaggg aguggugcau 20 <210> 296 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 296 augagucagg gaguggugca 20 <210> 297 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 297 ccacucccug acucauaucu 20 <210> 298 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 298 uaaggccuag auaugaguca 20 <210> 299 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 299 guaaggccua gauaugaguc 20 <210> 300 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 300 auaucuaggc cuuacauugc 20 <210> 301 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 301 aaauuaauua gaggcauaga 20 <210> 302 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 302 gaaauuaauu agaggcauag 20 <210> 303 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 303 gaacacauga aauuaauuag 20 <210> 304 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 304 ccaaugaguu ucuucaauac 20 <210> 305 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 305 caaauauaau agaagcaagu 20 <210> 306 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 306 aaauaacuuc ccuuuuagga 20 <210> 307 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 307 ggaaaaauaa cuucccuuuu 20 <210> 308 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 308 uuuugaacag aaaugauauu 20 <210> 309 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 309 aguucaagua gauaucagaa 20 <210> 310 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 310 aaguucaagu agauaucaga 20 <210> 311 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 311 ggguggcugu uuaaagaggg 20 <210> 312 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 312 gugggguggc uguuuaaaga 20 <210> 313 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 313 uguggggugg cuguuuaaag 20 <210> 314 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 314 ugccaaccag acugugcgcc 20 <210> 315 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 315 aaccuggcgc acagucuggu 20 <210> 316 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 316 aaccagacug ugcgccaggu 20 <210> 317 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 317 uaccaaccug gcgcacaguc 20 <210> 318 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 318 ucugucagac uuuaccaacc 20 <210> 319 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 319 auaugugaag cccaacuacg 20 <210> 320 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 320 aguugcacaa ccacguaguu 20 <210> 321 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 321 gaguugcaca accacguagu 20 <210> 322 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 322 cuauagcuga cuuucaacca 20 <210> 323 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 323 aacuucuuug cagaugacca 20 <210> 324 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 324 uugcauugag gaugcgcagg 20 <210> 325 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 325 uuuuugcauu gaggaugcgc 20 <210> 326 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 326 gaccucauuu ugaugccaga 20 <210> 327 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 327 ugcccucugg caucaaaaug 20 <210> 328 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 328 augccagagg gcagcaaaca 20 <210> 329 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 329 cuguacuuaa uagcugaagg 20 <210> 330 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 330 acuguacuua auagcugaag 20 <210> 331 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 331 cagcuauuaa guacaguaaa 20 <210> 332 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 332 gagcauuuca aaugauaguu 20 <210> 333 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 333 cauuugaaau gcucccggcc 20 <210> 334 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 334 uuaggguggg ggcgugggug 20 <210> 335 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 335 uuuuaucaca ggcuccagga 20 <210> 336 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 336 uuuaucacag gcuccaggaa 20 <210> 337 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 337 cacaggcucc aggaaggguu 20 <210> 338 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 338 aucagaggcc aaacccuucc 20 <210> 339 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 339 cucugauuag ggugggggcg 20 <210> 340 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 340 gauuagggug ggggcguggg 20 <210> 341 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 341 auuagggugg gggcgugggu 20 <210> 342 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 342 guuuggccuc ugauuagggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 343 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 343 guuuggccuc ugauuagggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 344 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 344 guuuggccuc ugauuagggu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 345 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 345 guuuggccuc ugauuagggu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 346 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 346 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu uuuu 74 <210> 347 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 347 aucagaggcc aaacccuucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 348 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 348 aucagaggcc aaacccuucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 349 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 349 aucagaggcc aaacccuucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 350 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 350 aucagaggcc aaacccuucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 351 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 351 uuuaucacag gcuccaggaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 352 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 352 uuuaucacag gcuccaggaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 353 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 353 uuuaucacag gcuccaggaa guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 354 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 354 uuuaucacag gcuccaggaa guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 355 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 355 uuuggccucu gauuagggug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 356 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 356 uuuggccucu gauuagggug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 357 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 357 uuuggccucu gauuagggug guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 358 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 358 uuuggccucu gauuagggug guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 359 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 359 cacgccccca cccuaaucag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 360 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 360 cacgccccca cccuaaucag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 361 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 361 cacgccccca cccuaaucag guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 362 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 362 cacgccccca cccuaaucag guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 363 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 363 cacaggcucc aggaaggguu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 364 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 364 cacaggcucc aggaaggguu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 365 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 365 cacaggcucc aggaaggguu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 366 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 366 cacaggcucc aggaaggguu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 367 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 367 uugcuuuuau cacaggcucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 368 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 368 uugcuuuuau cacaggcucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 369 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 369 uugcuuuuau cacaggcucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 370 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 370 uugcuuuuau cacaggcucc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 371 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 371 uuuuaucaca ggcuccagga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 372 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 372 uuuuaucaca ggcuccagga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 373 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 373 uuuuaucaca ggcuccagga guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 374 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 374 uuuuaucaca ggcuccagga guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 375 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 375 acugcugaaa gagaugcggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 376 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 376 acugcugaaa gagaugcggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 377 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 377 acugcugaaa gagaugcggu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 378 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 378 acugcugaaa gagaugcggu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 379 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 379 ugcggugggg agauauguag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 380 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 380 ugcggugggg agauauguag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 381 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 381 ugcggugggg agauauguag guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 382 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 382 ugcggugggg agauauguag guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 383 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 383 gaaacaauga ggaccugacu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 384 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 384 gaaacaauga ggaccugacu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 385 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 385 gaaacaauga ggaccugacu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 386 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 386 gaaacaauga ggaccugacu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 387 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 387 guaagcauuu aaguggcuac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 388 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 388 guaagcauuu aaguggcuac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 389 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 389 guaagcauuu aaguggcuac guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 390 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 390 guaagcauuu aaguggcuac guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 391 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 391 aggcaccuca gacucagcau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 392 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 392 aggcaccuca gacucagcau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 393 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 393 aggcaccuca gacucagcau guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 394 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 394 aggcaccuca gacucagcau guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 395 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 395 augguauggg agguauacua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 396 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 396 augguauggg agguauacua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 397 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 397 augguauggg agguauacua guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 398 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 398 augguauggg agguauacua guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 399 <400> 399 000 <210> 400 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 400 cagucauuau uuauuaugaa uaagc 25 <210> 401 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 401 ggaaauaauu cacaugccaa uuauu 25 <210> 402 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 402 uauuuggcua ucuuuucacu aagcu 25 <210> 403 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 403 cacuaagcua gguaaucuag ccaga 25 <210> 404 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 404 uaagcuaggu aaucuagcca gaagg 25 <210> 405 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 405 uagguaaucu agccagaagg uggau 25 <210> 406 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 406 uaaucuagcc agaaggugga uaggu 25 <210> 407 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 407 uggauaggua ggauuuuccc cacuu 25 <210> 408 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 408 guaggauuuu ccccacuuag guuca 25 <210> 409 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 409 gccuguaugu gaaucuacag cacac 25 <210> 410 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 410 ugcuauguug uuucuaauuc ucuuc 25 <210> 411 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 411 ugagaaaagu ucugugcaaa uuaac 25 <210> 412 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 412 gagaaaaguu cugugcaaau uaacu 25 <210> 413 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 413 ccuguuugua gauguaacuu auuug 25 <210> 414 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 414 aacuuauuug uggcacuaau uucua 25 <210> 415 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 415 gucugcauua agauauauuu ccuga 25 <210> 416 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 416 cauuaagaua uauuuccuga agguu 25 <210> 417 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 417 auuaagauau auuuccugaa gguuu 25 <210> 418 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 418 acuacugaca uuuaucaccu ucuuu 25 <210> 419 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 419 uuaaaagaca aauucaaauc cugca 25 <210> 420 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 420 caccaaaagc auauauuuga aaaac 25 <210> 421 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 421 aagcauauau uugaaaaaca ggauu 25 <210> 422 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 422 gcgugccaua uuaugcauua uuuaa 25 <210> 423 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 423 uaugcaaauu auaagucaga caguu 25 <210> 424 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 424 uugaaaauuu augccaucug auaag 25 <210> 425 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 425 aaaucuguuc cuccuaccca cccga 25 <210> 426 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 426 aaucuguucc uccuacccac ccgau 25 <210> 427 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 427 uccuacccac ccgaugggug ucugu 25 <210> 428 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 428 cacccgaugg gugucuguag gaaac 25 <210> 429 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 429 agacaacaua gaauguauag aaaca 25 <210> 430 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 430 gacaacauag aauguauaga aacaa 25 <210> 431 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 431 acaacauaga auguauagaa acaag 25 <210> 432 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 432 cauagaaugu auagaaacaa ggggu 25 <210> 433 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 433 auagaaugua uagaaacaag ggguu 25 <210> 434 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 434 uagaauguau agaaacaagg gguug 25 <210> 435 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 435 ggacucaugc gcauuuccac aauac 25 <210> 436 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 436 gcgcauuucc acaauacagg uaauu 25 <210> 437 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 437 auuuccacaa uacagguaau uaggu 25 <210> 438 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 438 ccacaauaca gguaauuagg uuggc 25 <210> 439 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 439 gguaauuagg uuggcugguu ucaga 25 <210> 440 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 440 guaauuaggu uggcugguuu cagaa 25 <210> 441 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 441 uagguuggcu gguuucagaa gggcc 25 <210> 442 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 442 agguuggcug guuucagaag ggcca 25 <210> 443 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 443 gccagggcau cacucaugac agcga 25 <210> 444 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 444 caucacucau gacagcgaug gucca 25 <210> 445 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 445 aucacucaug acagcgaugg uccac 25 <210> 446 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 446 agcgaugguc cacgggcccu cucua 25 <210> 447 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 447 gcgauggucc acgggcccuc ucuau 25 <210> 448 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 448 augggacuga uucacuguuc caaug 25 <210> 449 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 449 ugggacugau ucacuguucc aaugu 25 <210> 450 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 450 uuuuuauuaa aaaauauaaa uaaaa 25 <210> 451 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 451 aaaaauauaa auaaaauggc gcugc 25 <210> 452 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 452 auaaauaaaa uggcgcugca ggccu 25 <210> 453 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 453 auaaaauggc gcugcaggcc uaggc 25 <210> 454 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 454 aauggcgcug caggccuagg cugga 25 <210> 455 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 455 caggccuagg cuggaaggac ucugc 25 <210> 456 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 456 ucugcaggac ucugucuucg cacaa 25 <210> 457 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 457 acucugucuu cgcacaacgg cuucu 25 <210> 458 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 458 cugucuucgc acaacggcuu cuugg 25 <210> 459 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 459 cugucagaaa acaucacaaa cuagc 25 <210> 460 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 460 gaugacagac cacgcugacg ucgac 25 <210> 461 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 461 augacagacc acgcugacgu cgacu 25 <210> 462 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 462 acagaccacg cugacgucga cuggg 25 <210> 463 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 463 gggcggcacg cguccacccc acccc 25 <210> 464 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 464 ggcggcacgc guccacccca ccccu 25 <210> 465 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 465 gcggcacgcg uccaccccac cccug 25 <210> 466 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 466 cggcacgcgu ccaccccacc ccugg 25 <210> 467 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 467 gggcuucaaa uuuucucaga acuua 25 <210> 468 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 468 ggcuucaaau uuucucagaa cuuaa 25 <210> 469 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 469 aaacugccac acaucuugag cucuc 25 <210> 470 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 470 aacugccaca caucuugagc ucucu 25 <210> 471 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 471 ugagcucucu ggguacuacg ccgaa 25 <210> 472 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 472 gagcucucug gguacuacgc cgaau 25 <210> 473 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 473 agcucucugg guacuacgcc gaaug 25 <210> 474 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 474 gcucucuggg uacuacgccg aaugg 25 <210> 475 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 475 gggggugugu gaagaaccua gaaag 25 <210> 476 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 476 gugugugaag aaccuagaaa gaggu 25 <210> 477 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 477 gaaccuagaa agagguugga gacag 25 <210> 478 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 478 cuuagugaaa agauagccaa auaau 25 <210> 479 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 479 gggaaaaucc uaccuaucca ccuuc 25 <210> 480 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 480 cacauacagg ccgugaaccu aagug 25 <210> 481 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 481 ucacauacag gccgugaacc uaagu 25 <210> 482 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 482 uucacauaca ggccgugaac cuaag 25 <210> 483 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 483 accugugugc uguagauuca cauac 25 <210> 484 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 484 uagaaacaac auagcaaauu aaaau 25 <210> 485 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 485 ucucaguuug guauuuuuua cugcu 25 <210> 486 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 486 aauuugcaca gaacuuuucu caguu 25 <210> 487 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 487 acaaacaggu gguaaaaauu cuuuc 25 <210> 488 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 488 caaauaaguu acaucuacaa acagg 25 <210> 489 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 489 ccacaaauaa guuacaucua caaac 25 <210> 490 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 490 gauuuuagag gggggaaauu auagg 25 <210> 491 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 491 gcagauuuua gaggggggaa auuau 25 <210> 492 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 492 gaaauuuggg gcagauuuua gaggg 25 <210> 493 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 493 ggaaauuugg ggcagauuuu agagg 25 <210> 494 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 494 aggaaauuug gggcagauuu uagag 25 <210> 495 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 495 caggaaauuu ggggcagauu uuaga 25 <210> 496 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 496 ucaggaaauu uggggcagau uuuag 25 <210> 497 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 497 uuuaguacuu acaucaggaa auuug 25 <210> 498 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 498 cuuuaguacu uacaucagga aauuu 25 <210> 499 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 499 ucuuuaguac uuacaucagg aaauu 25 <210> 500 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 500 auaaaacuuc uuuaguacuu acauc 25 <210> 501 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 501 ucuaauuuua gguucccaaa ccuuc 25 <210> 502 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 502 guuucuuauu aaauauucua auuuu 25 <210> 503 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 503 cugggcgagc gguaaauccu aaaga 25 <210> 504 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 504 uuaggaaaga acaucacugg gcgag 25 <210> 505 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 505 auuuagcuua ggaaagaaca ucacu 25 <210> 506 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 506 aauuuagcuu aggaaagaac aucac 25 <210> 507 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 507 uugaauuugu cuuuuaauuu agcuu 25 <210> 508 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 508 uauaugcuuu ugguggcuac caugc 25 <210> 509 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 509 cuguuuuuca aauauaugcu uuugg 25 <210> 510 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 510 auccuguuuu ucaaauauau gcuuu 25 <210> 511 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 511 gcauaccauu aaauaaugca uaaua 25 <210> 512 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 512 auugcuguuu auuaaugcug aagug 25 <210> 513 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 513 caaggagaau caaaaugcaa aacuu 25 <210> 514 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 514 ucaaggagaa ucaaaaugca aaacu 25 <210> 515 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 515 gcuuaucaga uggcauaaau uuuca 25 <210> 516 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 516 gggaacuagg uuaccgcuua ucaga 25 <210> 517 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 517 gggcaggaga uguaggaggg gaacu 25 <210> 518 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 518 gagaaauggg caggagaugu aggag 25 <210> 519 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 519 ugagaaaugg gcaggagaug uagga 25 <210> 520 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 520 uugagaaaug ggcaggagau guagg 25 <210> 521 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 521 gauuugagaa augggcagga gaugu 25 <210> 522 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 522 ggaggaacag auuugagaaa ugggc 25 <210> 523 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 523 gguaggagga acagauuuga gaaau 25 <210> 524 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 524 ggguaggagg aacagauuug agaaa 25 <210> 525 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 525 uacagacacc caucgggugg guagg 25 <210> 526 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 526 uccuacagac acccaucggg ugggu 25 <210> 527 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 527 uguuuccuac agacacccau cgggu 25 <210> 528 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 528 cuguuuccua cagacaccca ucggg 25 <210> 529 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 529 uaccuguuuc cuacagacac ccauc 25 <210> 530 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 530 guaccuguuu ccuacagaca cccau 25 <210> 531 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 531 aauuuuuaau gcuuauaaga caaug 25 <210> 532 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 532 acacaauaaa uguuggagcu uuagg 25 <210> 533 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 533 uugacacaau aaauguugga gcuuu 25 <210> 534 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 534 ugcuuaacau ugacacaaua aaugu 25 <210> 535 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 535 ccagccaacc uaauuaccug uauug 25 <210> 536 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 536 accaucgcug ucaugaguga ugccc 25 <210> 537 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 537 gaaucagucc cauagagagg gcccg 25 <210> 538 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 538 gaacagugaa ucagucccau agaga 25 <210> 539 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 539 ggaacaguga aucaguccca uagag 25 <210> 540 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 540 uaaaaacaaa aaaacagacc cacau 25 <210> 541 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 541 gaguccugca gaguccuucc agccu 25 <210> 542 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 542 gcgugccgcc cagucgacgu cagcg 25 <210> 543 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 543 aaauuugaag cccccagggg ugggg 25 <210> 544 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 544 agaaaauuug aagcccccag gggug 25 <210> 545 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 545 gagaaaauuu gaagccccca ggggu 25 <210> 546 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 546 ugagaaaauu ugaagccccc agggg 25 <210> 547 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 547 uucugagaaa auuugaagcc cccag 25 <210> 548 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 548 guucugagaa aauuugaagc cccca 25 <210> 549 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 549 aguucugaga aaauuugaag ccccc 25 <210> 550 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 550 cucaagaugu guggcaguuu ucgga 25 <210> 551 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 551 agagcucaag auguguggca guuuu 25 <210> 552 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 552 uaguacccag agagcucaag augug 25 <210> 553 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 553 ucuagguucu ucacacaccc ccauu 25 <210> 554 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 554 uuaauuuuuu uuauuuuuuc aauaa 25 <210> 555 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 555 uaauuuuuuu uauuuuuuca auaaa 25 <210> 556 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 556 uuauuuuuuc aauaaaggga caaaa 25 <210> 557 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 557 uauuuuuuca auaaagggac aaaau 25 <210> 558 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 558 aaagggacaa aaugggugua ugaac 25 <210> 559 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 559 acaacugcca aaaaaacaca gacag 25 <210> 560 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 560 ccagaaacaa auacaauaaa aagcc 25 <210> 561 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 561 uaaaaagcca gguuguaaug accuu 25 <210> 562 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 562 caaauuaagu gccucuguuu ugaac 25 <210> 563 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 563 aaauuaagug ccucuguuuu gaaca 25 <210> 564 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 564 aguuacgaca aacagcuuuc auuac 25 <210> 565 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 565 acagcuuuca uuacaggaau agaaa 25 <210> 566 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 566 auuuacaaaa aaguauugac uaaag 25 <210> 567 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 567 uuuacaaaaa aguauugacu aaagc 25 <210> 568 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 568 uaaauauaaa gcaccauuua guuuu 25 <210> 569 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 569 ggcaaugaaa aaaacugcaa aacau 25 <210> 570 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 570 ucuuucuuuc uuuuacugca uauga 25 <210> 571 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 571 uuuacugcau augaagguaa gaugc 25 <210> 572 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 572 auaugaaggu aagaugcugg aaugu 25 <210> 573 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 573 uaugaaggua agaugcugga augua 25 <210> 574 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 574 agaugcugga auguagggug auaga 25 <210> 575 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 575 cuggaaugua gggugauaga aggaa 25 <210> 576 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 576 uggaauguag ggugauagaa ggaaa 25 <210> 577 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 577 uuagcuugca guacugcaua cagua 25 <210> 578 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 578 gcaguacugc auacaguaug gcagc 25 <210> 579 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 579 ugcauacagu auggcagcag gaaaa 25 <210> 580 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 580 uggcagcagg aaaaaggaac aaaaa 25 <210> 581 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 581 acagccaucc augugacauu cuagc 25 <210> 582 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 582 caggcucccc caaaccgcca uuaua 25 <210> 583 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 583 ccugccaaau uaaaaaaaua uacug 25 <210> 584 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 584 ucuuuuuuuu uuccacuacc aaaaa 25 <210> 585 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 585 aaagaccaua aauguauuuu agcau 25 <210> 586 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 586 uuuuuuuuuu uuacaaccug aagag 25 <210> 587 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 587 caaccugaag agcggugugu aucca 25 <210> 588 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 588 uagaauuucc acuaccauuu uuaaa 25 <210> 589 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 589 aagucuugua acaccaccaa gacaa 25 <210> 590 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 590 uaaguaagcu caauagucaa guaaa 25 <210> 591 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 591 uaagcucaau agucaaguaa auggc 25 <210> 592 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 592 uucccuuaag uauagaccug uaaac 25 <210> 593 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 593 ucccuuaagu auagaccugu aaacu 25 <210> 594 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 594 gugcacuuaa uuguccuauc ugagc 25 <210> 595 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 595 auuagagaaa agauacagau aucac 25 <210> 596 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 596 agucaagugc uauuugaaca ccaac 25 <210> 597 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 597 gucaagugcu auuugaacac caacu 25 <210> 598 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 598 ucaagugcua uuugaacacc aacug 25 <210> 599 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 599 guuaacacaa auagcacaca gugua 25 <210> 600 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 600 ggaaaagaaa ugaaguacaa cuuuu 25 <210> 601 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 601 gaaaagaaau gaaguacaac uuuua 25 <210> 602 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 602 cuuauauacc uguucuaguu uuaaa 25 <210> 603 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 603 uauugucagc cucuuccuuu caaua 25 <210> 604 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 604 ccucuuccuu ucaauauggu auaca 25 <210> 605 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 605 uguccacuug acaaccaagu agauc 25 <210> 606 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 606 caaguagauc uggaucuauu ucuuu 25 <210> 607 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 607 uuacuagugu auuuaauugc guucc 25 <210> 608 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 608 uacuagugua uuuaauugcg uucca 25 <210> 609 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 609 ucauuguuua aaaaaaauaa aacuu 25 <210> 610 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 610 cauuguuuaa aaaaaauaaa acuuu 25 <210> 611 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 611 agcccauuuc uuuuaagcuc ucacc 25 <210> 612 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 612 accaggagca aaguagcuuu uauac 25 <210> 613 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 613 aguuuuguuu auaaaauuaa acuaa 25 <210> 614 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 614 acuaaaggaa aaaugaugau uaacu 25 <210> 615 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 615 aaaaugauga uuaacuagga cauaa 25 <210> 616 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 616 aaaugaugau uaacuaggac auaau 25 <210> 617 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 617 cuaggacaua augggucauc uuuuu 25 <210> 618 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 618 auauagaauu auaugcuagu uccua 25 <210> 619 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 619 uaacaaguag aaagaaccau cgaug 25 <210> 620 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 620 caucgaugug guuuuaauag aucca 25 <210> 621 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 621 guuuuucugu uaauuuguca auuca 25 <210> 622 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 622 ucagugcuau cuauucuguc uauag 25 <210> 623 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 623 cagugcuauc uauucugucu auaga 25 <210> 624 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 624 uauguauuac agaauguaug cagca 25 <210> 625 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 625 cucucucucu cuuuuucucu cagaa 25 <210> 626 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 626 cucucuuuuu cucucagaac ggaac 25 <210> 627 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 627 caacauguuu gcucagcaac gaauu 25 <210> 628 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 628 aacauguuug cucagcaacg aauua 25 <210> 629 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 629 acauguaaau uauugcacaa gagaa 25 <210> 630 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 630 gccccauaca gaucaugcau ucaaa 25 <210> 631 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 631 augcauucaa acggugagaa cauaa 25 <210> 632 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 632 aaagaaaaag aaaaagaaaa aaaac 25 <210> 633 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 633 agaaaaagaa aaaaaacagg ugugc 25 <210> 634 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 634 uguuuguuug uuuguuuaaa ucaca 25 <210> 635 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 635 guuuguuugu uuguuuaaau cacau 25 <210> 636 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 636 acaugggacu agaaaaaaau ccuac 25 <210> 637 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 637 caugggacua gaaaaaaauc cuaca 25 <210> 638 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 638 gacuagaaaa aaauccuaca gggag 25 <210> 639 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 639 acuagaaaaa aauccuacag ggagu 25 <210> 640 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 640 cuagaaaaaa auccuacagg gagug 25 <210> 641 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 641 aaaaaaaucc uacagggagu ggggc 25 <210> 642 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 642 aaaauccuac agggaguggg gcugg 25 <210> 643 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 643 aaauccuaca gggagugggg cugga 25 <210> 644 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 644 uacagggagu ggggcuggag ggcga 25 <210> 645 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 645 acagggagug gggcuggagg gcgau 25 <210> 646 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 646 cagggagugg ggcuggaggg cgaug 25 <210> 647 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 647 gaguggggcu ggagggcgau gggga 25 <210> 648 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 648 aguggggcug gagggcgaug gggaa 25 <210> 649 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 649 guggggcugg agggcgaugg ggaag 25 <210> 650 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 650 gcuggagggc gauggggaag gggag 25 <210> 651 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 651 cgauggggaa ggggaguggu gaaaa 25 <210> 652 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 652 gauggggaag gggaguggug aaaaa 25 <210> 653 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 653 auggggaagg ggagugguga aaaag 25 <210> 654 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 654 uggggaaggg gaguggugaa aaagg 25 <210> 655 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 655 ggggaguggu gaaaaagggg guguc 25 <210> 656 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 656 gaguggugaa aaagggggug ucagg 25 <210> 657 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 657 aguggugaaa aagggggugu caggu 25 <210> 658 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 658 aaaaaggggg ugucaggugg gagug 25 <210> 659 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 659 aaaagggggu gucagguggg aguga 25 <210> 660 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 660 aggggguguc aggugggagu gaggg 25 <210> 661 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 661 ggggguguca ggugggagug aggga 25 <210> 662 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 662 ggggugucag gugggaguga gggag 25 <210> 663 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 663 gugccauuuu uucauguguu ucucc 25 <210> 664 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 664 ugccauuuuu ucauguguuu cucca 25 <210> 665 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 665 ucuccagggu acuguacacg cuaaa 25 <210> 666 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 666 acauuuguaa acguccuucc ccacc 25 <210> 667 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 667 accuggccau gcguuuucau gugcc 25 <210> 668 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 668 caugugccug gugagcuugc uacuc 25 <210> 669 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 669 augugccugg ugagcuugcu acucu 25 <210> 670 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 670 cuggugagcu ugcuacucug ggcac 25 <210> 671 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 671 cauaguugca cagcucgcau uuaua 25 <210> 672 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 672 gcauuuauaa ggccuuucgc ccgug 25 <210> 673 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 673 ccuuucgccc guguggcuuc uccug 25 <210> 674 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 674 ucgcugcguc ugcccucuuu ugagc 25 <210> 675 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 675 cgcugcgucu gcccucuuuu gagcu 25 <210> 676 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 676 ugcccucuuu ugagcugggc cugcc 25 <210> 677 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 677 gcccucuuuu gagcugggcc ugccc 25 <210> 678 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 678 cuuuugagcu gggccugccc gggcc 25 <210> 679 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 679 ccugcccggg cccggaccac uaaua 25 <210> 680 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 680 cugcccgggc ccggaccacu aauau 25 <210> 681 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 681 ugcccgggcc cggaccacua auaug 25 <210> 682 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 682 cccgagaucc cuccguccag cuccc 25 <210> 683 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 683 ccgagauccc uccguccagc ucccc 25 <210> 684 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 684 agaucccucc guccagcucc ccggg 25 <210> 685 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 685 ccuccgucca gcuccccggg cggug 25 <210> 686 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 686 gagaagcgca aacucccguu cuccg 25 <210> 687 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 687 ccguucuccg aggagugcuc cgacg 25 <210> 688 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 688 uucuccgagg agugcuccga cgagg 25 <210> 689 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 689 aggagugcuc cgacgaggag gcaaa 25 <210> 690 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 690 gacgaggagg caaaaggcga uuguc 25 <210> 691 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 691 cgauugucug gagucuccga agcua 25 <210> 692 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 692 ugucuggagu cuccgaagcu aagga 25 <210> 693 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 693 gucuggaguc uccgaagcua aggaa 25 <210> 694 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 694 cuaaggaagg gaucuuugag cugcc 25 <210> 695 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 695 aggaagggau cuuugagcug ccugg 25 <210> 696 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 696 uugagcugcc uggaggccgc guagc 25 <210> 697 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 697 cacugcgagu acacguucuc cgugu 25 <210> 698 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 698 acugcgagua cacguucucc guguu 25 <210> 699 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 699 uacacguucu ccguguuggg caucg 25 <210> 700 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 700 cguucuccgu guugggcauc gcggc 25 <210> 701 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 701 guucuccgug uugggcaucg cggcc 25 <210> 702 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 702 uucuccgugu ugggcaucgc ggccg 25 <210> 703 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 703 ucuccguguu gggcaucgcg gccgg 25 <210> 704 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 704 cguguugggc aucgcggccg ggggc 25 <210> 705 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 705 uucucgagcu ugaugcgcuu agaga 25 <210> 706 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 706 ucucgagcuu gaugcgcuua gagaa 25 <210> 707 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 707 cucgagcuug augcgcuuag agaag 25 <210> 708 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 708 cgcuuagaga aggggcucag cgagc 25 <210> 709 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 709 gcuuagagaa ggggcucagc gagcu 25 <210> 710 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 710 cuuagagaag gggcucagcg agcug 25 <210> 711 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 711 cuggggcugc ccagcagcag cuuuu 25 <210> 712 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 712 gcugcccagc agcagcuuuu uggac 25 <210> 713 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 713 agcagcuuuu uggacaggcc ccccg 25 <210> 714 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 714 acaggccccc cgaggccgac ucgcc 25 <210> 715 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 715 caggcccccc gaggccgacu cgccc 25 <210> 716 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 716 aggccccccg aggccgacuc gcccg 25 <210> 717 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 717 ggccgacucg cccggggagc agccg 25 <210> 718 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 718 gccauuaaca gugccaucgu cuaug 25 <210> 719 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 719 ccaucgucua ugcgguccga cucgc 25 <210> 720 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 720 cgagucuucg ucgcaagugu cccug 25 <210> 721 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 721 ucgucgcaag ugucccugug gcccu 25 <210> 722 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 722 caaguguccc uguggcccuc ggccu 25 <210> 723 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 723 gucccugugg cccucggccu cggcc 25 <210> 724 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 724 ccuguggccc ucggccucgg ccagg 25 <210> 725 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 725 guggccgcgc uuaugcuucu cgccc 25 <210> 726 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 726 gcgcuuaugc uucucgccca ggacc 25 <210> 727 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 727 cuuaugcuuc ucgcccagga ccugg 25 <210> 728 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 728 ugcuucucgc ccaggaccug gugga 25 <210> 729 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 729 uggaaggccu cgcugaagug cugca 25 <210> 730 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 730 cugagcacca ugcccugcau gacgu 25 <210> 731 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 731 ugagcaccau gcccugcaug acguc 25 <210> 732 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 732 caccaugccc ugcaugacgu cgggc 25 <210> 733 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 733 accaugcccu gcaugacguc gggca 25 <210> 734 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 734 gcccugcaug acgucgggca gggcg 25 <210> 735 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 735 gaccgcgccc cgcgagcugu ucucg 25 <210> 736 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 736 cgcgccccgc gagcuguucu cgugg 25 <210> 737 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 737 guucucgugg uggcgcgccg ccucc 25 <210> 738 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 738 ccucuuccuc cucguccccg uucuc 25 <210> 739 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 739 cucuuccucc ucguccccgu ucucc 25 <210> 740 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 740 cuccucgucc ccguucuccg ggauc 25 <210> 741 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 741 ucguccccgu ucuccgggau caggu 25 <210> 742 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 742 cguccccguu cuccgggauc agguu 25 <210> 743 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 743 guccccguuc uccgggauca gguug 25 <210> 744 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 744 uuggggucgu ucucgcucuu gaacu 25 <210> 745 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 745 uucucgcucu ugaacuuggc cacca 25 <210> 746 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 746 gccaccacgg acuugagcgc gcugc 25 <210> 747 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 747 cugcuggcgc ugcccaccaa gucgc 25 <210> 748 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 748 gcgcugccca ccaagucgcu ggugc 25 <210> 749 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 749 cgcugcccac caagucgcug gugcc 25 <210> 750 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 750 ccaccaaguc gcuggugccg gguuc 25 <210> 751 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 751 caccaagucg cuggugccgg guucc 25 <210> 752 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 752 accaagucgc uggugccggg uuccg 25 <210> 753 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 753 ucgcuggugc cggguuccgg ggagc 25 <210> 754 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 754 cuggugccgg guuccgggga gcugg 25 <210> 755 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 755 gugccggguu ccggggagcu ggcgg 25 <210> 756 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 756 gagcuggcgg uggagagacc gucgu 25 <210> 757 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 757 agaccgucgu cggacuugac cguca 25 <210> 758 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 758 gaccgucguc ggacuugacc gucau 25 <210> 759 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 759 accgucgucg gacuugaccg ucaug 25 <210> 760 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 760 ccgucgucgg acuugaccgu caugg 25 <210> 761 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 761 cgauuugugc augugcgucu ucaug 25 <210> 762 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 762 gucuucaugu ggcgcuucag cuugc 25 <210> 763 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 763 cauguggcgc uucagcuugc uggcc 25 <210> 764 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 764 auguggcgcu ucagcuugcu ggccu 25 <210> 765 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 765 cagcuugcug gccugggugc acgcg 25 <210> 766 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 766 ggccugggug cacgcguggu cgcac 25 <210> 767 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 767 gcguggucgc acagguugca cuugu 25 <210> 768 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 768 cguggucgca cagguugcac uugua 25 <210> 769 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 769 gcacuuguag ggcuucucgc ccgug 25 <210> 770 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 770 gggcuucucg cccguguggc ugcgc 25 <210> 771 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 771 cguguggcug cgccggugca ccacc 25 <210> 772 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 772 gucuugccgc agaacucgca ugacu 25 <210> 773 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 773 agaacucgca ugacuuggac uugac 25 <210> 774 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 774 gaacucgcau gacuuggacu ugacc 25 <210> 775 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 775 aacucgcaug acuuggacuu gaccg 25 <210> 776 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 776 acucgcauga cuuggacuug accgg 25 <210> 777 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 777 gcaugacuug gacuugaccg ggggc 25 <210> 778 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 778 caugacuugg acuugaccgg gggcu 25 <210> 779 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 779 gacuuggacu ugaccggggg cuggg 25 <210> 780 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 780 acuuggacuu gaccgggggc uggga 25 <210> 781 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 781 uggacuugac cgggggcugg gaggg 25 <210> 782 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 782 acuugaccgg gggcugggag ggagg 25 <210> 783 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 783 cuugaccggg ggcugggagg gagga 25 <210> 784 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 784 uugaccgggg gcugggaggg aggag 25 <210> 785 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 785 accgggggcu gggagggagg agggg 25 <210> 786 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 786 gggagggagg aggggcggau ugcag 25 <210> 787 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 787 agggaggagg ggcggauugc agagg 25 <210> 788 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 788 gggaggaggg gcggauugca gagga 25 <210> 789 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 789 aggaggggcg gauugcagag gaggg 25 <210> 790 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 790 ggaggggcgg auugcagagg aggga 25 <210> 791 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 791 gaggggcgga uugcagagga gggag 25 <210> 792 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 792 aggggcggau ugcagaggag ggagg 25 <210> 793 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 793 ggggcggauu gcagaggagg gaggg 25 <210> 794 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 794 gggcggauug cagaggaggg agggg 25 <210> 795 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 795 cagaggaggg agggggggcg ucgcc 25 <210> 796 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 796 ggagggaggg ggggcgucgc cagga 25 <210> 797 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 797 gagggagggg gggcgucgcc aggaa 25 <210> 798 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 798 ggaggggggg cgucgccagg aaggg 25 <210> 799 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 799 ucgccaggaa gggcggcuug cuacc 25 <210> 800 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 800 caggaagggc ggcuugcuac cuggc 25 <210> 801 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 801 agggcggcuu gcuaccuggc uggaa 25 <210> 802 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 802 ggaaugguug caguaaccuu ugcau 25 <210> 803 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 803 gaaugguugc aguaaccuuu gcaua 25 <210> 804 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 804 gguugcagua accuuugcau agggc 25 <210> 805 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 805 guugcaguaa ccuuugcaua gggcu 25 <210> 806 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 806 caguaaccuu ugcauagggc ugggc 25 <210> 807 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 807 accuuugcau agggcugggc cggcc 25 <210> 808 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 808 ccuuugcaua gggcugggcc ggccu 25 <210> 809 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 809 cuuugcauag ggcugggccg gccug 25 <210> 810 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 810 uagggcuggg ccggccuggg gacag 25 <210> 811 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 811 ggcugggccg gccuggggac agcgg 25 <210> 812 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 812 gcugggccgg ccuggggaca gcggu 25 <210> 813 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 813 ucucuaaguc uccuagagaa aucca 25 <210> 814 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 814 cuaagucucc uagagaaauc caugg 25 <210> 815 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 815 uaagucuccu agagaaaucc auggc 25 <210> 816 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 816 gucuccuaga gaaauccaug gcggg 25 <210> 817 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 817 ccauggcggg aggcuccaua gccau 25 <210> 818 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 818 ggauucaacc gcagcacccu gucaa 25 <210> 819 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 819 accgcagcac ccugucaaag gcacu 25 <210> 820 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 820 ccgcagcacc cugucaaagg cacuc 25 <210> 821 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 821 cacccuguca aaggcacucg gguga 25 <210> 822 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 822 acccugucaa aggcacucgg gugau 25 <210> 823 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 823 cugucaaagg cacucgggug auggg 25 <210> 824 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 824 aaaggcacuc gggugauggg uggcc 25 <210> 825 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 825 aaggcacucg ggugaugggu ggcca 25 <210> 826 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 826 ggccagggcc aucucuuccg ccccc 25 <210> 827 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 827 cucuuccgcc cccaggcgcu cuaug 25 <210> 828 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 828 uuccgccccc aggcgcucua ugcgg 25 <210> 829 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 829 uccgccccca ggcgcucuau gcggu 25 <210> 830 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 830 ccgcccccag gcgcucuaug cggug 25 <210> 831 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 831 cgcccccagg cgcucuaugc ggugg 25 <210> 832 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 832 ugcggugggg guccaaguga ugucu 25 <210> 833 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 833 gguggggguc caagugaugu cucgg 25 <210> 834 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 834 ggggguccaa gugaugucuc ggugg 25 <210> 835 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 835 gugaugucuc ggugguggac uaaac 25 <210> 836 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 836 ugaugucucg gugguggacu aaaca 25 <210> 837 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 837 gaugucucgg ugguggacua aacag 25 <210> 838 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 838 augucucggu gguggacuaa acagg 25 <210> 839 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 839 ugucucggug guggacuaaa caggg 25 <210> 840 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 840 gucucggugg uggacuaaac agggg 25 <210> 841 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 841 ggugguggac uaaacagggg gggag 25 <210> 842 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 842 gugguggacu aaacaggggg ggagu 25 <210> 843 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 843 guggacuaaa caggggggga guggg 25 <210> 844 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 844 agugggugga aagcgcccuu cugcc 25 <210> 845 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 845 gguggaaagc gcccuucugc caggc 25 <210> 846 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 846 cggaagccuc ucucgauacu gaucc 25 <210> 847 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 847 cgauacugau ccugguauuc uuagc 25 <210> 848 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 848 gauccuggua uucuuagcag guuaa 25 <210> 849 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 849 auccugguau ucuuagcagg uuaaa 25 <210> 850 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 850 uccugguauu cuuagcaggu uaaag 25 <210> 851 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 851 guuauugucu gcaauaugaa uccca 25 <210> 852 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 852 ugucugcaau augaauccca uggag 25 <210> 853 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 853 cugcaauaug aaucccaugg agagg 25 <210> 854 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 854 aauaugaauc ccauggagag guggc 25 <210> 855 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 855 auaugaaucc cauggagagg uggcu 25 <210> 856 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 856 gaaucccaug gagagguggc uggga 25 <210> 857 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 857 aaggacauuc ugcaccuagu ccuga 25 <210> 858 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 858 aggacauucu gcaccuaguc cugaa 25 <210> 859 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 859 cuaguccuga agggauacca acccg 25 <210> 860 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 860 uaguccugaa gggauaccaa cccgc 25 <210> 861 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 861 aguccugaag ggauaccaac ccgcg 25 <210> 862 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 862 ugaagggaua ccaacccgcg ggguc 25 <210> 863 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 863 gaagggauac caacccgcgg gguca 25 <210> 864 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 864 aagggauacc aacccgcggg gucag 25 <210> 865 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 865 gcguguugca agagaaacca ugcac 25 <210> 866 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 866 gcaagagaaa ccaugcacug gugaa 25 <210> 867 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 867 uugcaaguug uacaugugua gcugc 25 <210> 868 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 868 ugcaaguugu acauguguag cugcu 25 <210> 869 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 869 ggaaaaacca cugucugugu uuuuu 25 <210> 870 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 870 guuucugguc uuuguuaagu ucuau 25 <210> 871 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 871 ccuggcuuuu uauuguauuu guuuc 25 <210> 872 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 872 aagaugacca aaggucauua caacc 25 <210> 873 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 873 aaaaaaaaaa auaaaagaug accaa 25 <210> 874 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 874 ugcuuaugug cccuguucaa aacag 25 <210> 875 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 875 aacuugaaau uuuaucuuuu acuau 25 <210> 876 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 876 uaacuugaaa uuuuaucuuu uacua 25 <210> 877 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 877 auggcaaugc agaauauuuu guuau 25 <210> 878 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 878 gcuuuaguca auacuuuuuu guaaa 25 <210> 879 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 879 acuaaauggu gcuuuauauu uagau 25 <210> 880 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 880 guuuuuuuca uugccaaaaa cuaaa 25 <210> 881 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 881 augcaguacu gcaagcuaau aacgu 25 <210> 882 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 882 aaugucacau ggauggcugu cauag 25 <210> 883 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 883 gaaugucaca uggauggcug ucaua 25 <210> 884 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 884 agaaugucac auggauggcu gucau 25 <210> 885 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 885 ggagccugcu agaaugucac augga 25 <210> 886 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 886 ugggggagcc ugcuagaaug ucaca 25 <210> 887 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 887 gagaagccau auaauggcgg uuugg 25 <210> 888 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 888 ugagaagcca uauaauggcg guuug 25 <210> 889 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 889 augagaagcc auauaauggc gguuu 25 <210> 890 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 890 gaugagaagc cauauaaugg cgguu 25 <210> 891 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 891 uuacagauga gaagccauau aaugg 25 <210> 892 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 892 acauuacaga ugagaagcca uauaa 25 <210> 893 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 893 ccacaguaua uuuuuuuaau uuggc 25 <210> 894 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 894 gcugccacag uauauuuuuu uaauu 25 <210> 895 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 895 uuuugguagu ggaaaaaaaa aagac 25 <210> 896 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 896 gguaucaaug uaccuuuuuu gguag 25 <210> 897 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 897 uuaaaaggua ucaauguacc uuuuu 25 <210> 898 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 898 uuuaacuguu gcuuguucuc uuaaa 25 <210> 899 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 899 uugaauuaaa uguucaucua guguu 25 <210> 900 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 900 uggucuuuuu ucuguauuuc uagaa 25 <210> 901 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 901 ugauuccuau gcuaaaauac auuua 25 <210> 902 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 902 uuaagauuau auaguacuua aauau 25 <210> 903 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 903 aaaaaaaaaa acauacauug gggaa 25 <210> 904 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 904 uuguaaaaaa aaaaaacaua cauug 25 <210> 905 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 905 guuguaaaaa aaaaaaacau acauu 25 <210> 906 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 906 gguuguaaaa aaaaaaaaca uacau 25 <210> 907 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 907 augccuugga uacacaccgc ucuuc 25 <210> 908 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 908 aaaugguagu ggaaauucua ugccu 25 <210> 909 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 909 cuuguuaucc auuuaaaaau gguag 25 <210> 910 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 910 acaagacuug uuauccauuu aaaaa 25 <210> 911 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 911 gcauuuuagg guuccauugu cuugg 25 <210> 912 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 912 acugcauuuu aggguuccau ugucu 25 <210> 913 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 913 auguuuaggg gggaacugca uuuua 25 <210> 914 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 914 uauguuuagg ggggaacugc auuuu 25 <210> 915 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 915 aaaaaacacu ucauuauguu uaggg 25 <210> 916 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 916 uaaaaaacac uucauuaugu uuagg 25 <210> 917 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 917 uuaaaaaaca cuucauuaug uuuag 25 <210> 918 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 918 uuuaaaaaac acuucauuau guuua 25 <210> 919 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 919 uuuuaaaaaa cacuucauua uguuu 25 <210> 920 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 920 ugauugcuuu cgcuucuaca gugca 25 <210> 921 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 921 gacgcaacau ugcaagcgcu gugaa 25 <210> 922 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 922 uacuugacua uugagcuuac uuacu 25 <210> 923 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 923 aaaaaaauug aacacaaucu cauug 25 <210> 924 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 924 ucccaguuua caggucuaua cuuaa 25 <210> 925 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 925 uucccaguuu acaggucuau acuua 25 <210> 926 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 926 gcacuguaca auuuucccag uuuac 25 <210> 927 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 927 gaguauaaaa uaaaccugcu cagau 25 <210> 928 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 928 aucuuuucuc uaaucagaga uacag 25 <210> 929 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 929 aauaaaagcu agcaucugcc ccagu 25 <210> 930 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 930 ugugcuauuu guguuaacau ggaag 25 <210> 931 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 931 acacugugug cuauuugugu uaaca 25 <210> 932 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 932 acuauuugcc auuuaaaacu agaac 25 <210> 933 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 933 aauaauauga uuuauuagca caacg 25 <210> 934 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 934 aggcugacaa uaagguuuga cagag 25 <210> 935 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 935 gaggcugaca auaagguuug acaga 25 <210> 936 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 936 agaggcugac aauaagguuu gacag 25 <210> 937 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 937 uauugaaagg aagaggcuga caaua 25 <210> 938 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 938 ccuuguauac cauauugaaa ggaag 25 <210> 939 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 939 uuaagaccuu guauaccaua uugaa 25 <210> 940 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 940 gauccagauc uacuugguug ucaag 25 <210> 941 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 941 caaaagaaau agauccagau cuacu 25 <210> 942 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 942 uuuaauaaug ucuuuuuaaa aauac 25 <210> 943 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 943 uggaacgcaa uuaaauacac uagua 25 <210> 944 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 944 uugaaugugu aaugugcaaa agccc 25 <210> 945 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 945 cuccugguga gagcuuaaaa gaaau 25 <210> 946 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 946 gcuccuggug agagcuuaaa agaaa 25 <210> 947 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 947 accaguauaa aagcuacuuu gcucc 25 <210> 948 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 948 uucuauauug uauuucucac aacaa 25 <210> 949 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 949 agcauugggu gagguaauaa accuu 25 <210> 950 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 950 uuguagcuua auucagcauu gggug 25 <210> 951 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 951 uaaacuugua gcuuaauuca gcauu 25 <210> 952 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 952 auaaacuugu agcuuaauuc agcau 25 <210> 953 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 953 cuuggaucua uuaaaaccac aucga 25 <210> 954 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 954 auuugguuuu aaaauaugag ugccu 25 <210> 955 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 955 aacagaacaa guuuauucua ucauu 25 <210> 956 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 956 uguaucaauu ggaaaggaag aaaaa 25 <210> 957 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 957 aaaggguuaa auguaucaau uggaa 25 <210> 958 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 958 ucucuaaagg guuaaaugua ucaau 25 <210> 959 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 959 uaugagcuaa augucugucu cuaaa 25 <210> 960 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 960 cuaugagcua aaugucuguc ucuaa 25 <210> 961 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 961 uaacgugagg aggaaaaaca gucuu 25 <210> 962 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 962 uacaguuuua uuuuauaacg ugagg 25 <210> 963 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 963 auguacaguu uuauuuuaua acgug 25 <210> 964 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 964 cuuagacagc auguauggua uguua 25 <210> 965 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 965 uuuuuuuaaa cuuagacagc augua 25 <210> 966 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 966 accguuugaa ugcaugaucu guaug 25 <210> 967 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 967 caccguuuga augcaugauc uguau 25 <210> 968 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 968 ucaccguuug aaugcaugau cugua 25 <210> 969 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 969 aucgcccucc agccccacuc ccugu 25 <210> 970 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 970 gaauaaugau auaaaaacug aauag 25 <210> 971 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 971 uacccuggag aaacacauga aaaaa 25 <210> 972 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 972 augccuuuua gcguguacag uaccc 25 <210> 973 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 973 augaaaacgc auggccaggu gggga 25 <210> 974 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 974 gcacaugaaa acgcauggcc aggug 25 <210> 975 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 975 ggcacaugaa aacgcauggc caggu 25 <210> 976 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 976 aggcacauga aaacgcaugg ccagg 25 <210> 977 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 977 accaggcaca ugaaaacgca uggcc 25 <210> 978 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 978 agcucaccag gcacaugaaa acgca 25 <210> 979 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 979 cugugcccag aguagcaagc ucacc 25 <210> 980 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 980 ccacaggaga agccacacgg gcgaa 25 <210> 981 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 981 ucacugucca caggagaagc cacac 25 <210> 982 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 982 cucacugucc acaggagaag ccaca 25 <210> 983 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 983 gaacuguagc aaucucacug uccac 25 <210> 984 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 984 acgcagcgac acuugugagu acugu 25 <210> 985 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 985 gacgcagcga cacuugugag uacug 25 <210> 986 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 986 gcccgggcag gcccagcuca aaaga 25 <210> 987 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 987 ggcccgggca ggcccagcuc aaaag 25 <210> 988 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 988 ccauauuagu gguccgggcc cgggc 25 <210> 989 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 989 cgccccauau uagugguccg ggccc 25 <210> 990 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 990 acgccccaua uuaguggucc gggcc 25 <210> 991 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 991 ggagcacgcc ccauauuagu ggucc 25 <210> 992 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 992 gggagcacgc cccauauuag ugguc 25 <210> 993 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 993 guggagggag cacgccccau auuag 25 <210> 994 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 994 ggggcgcagc ggcacgggaa gugga 25 <210> 995 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 995 cggggcgcag cggcacggga agugg 25 <210> 996 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 996 ucucggggcg cagcggcacg ggaag 25 <210> 997 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 997 gagggaucuc ggggcgcagc ggcac 25 <210> 998 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 998 ggagggaucu cggggcgcag cggca 25 <210> 999 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 999 uggacggagg gaucucgggg cgcag 25 <210> 1000 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1000 cggggagcug gacggaggga ucucg 25 <210> 1001 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1001 ccggggagcu ggacggaggg aucuc 25 <210> 1002 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1002 cccggggagc uggacggagg gaucu 25 <210> 1003 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1003 cacaccgccc ggggagcugg acgga 25 <210> 1004 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1004 ccacaccgcc cggggagcug gacgg 25 <210> 1005 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1005 ucuccacacc gcccggggag cugga 25 <210> 1006 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1006 cgcuucucca caccgcccgg ggagc 25 <210> 1007 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1007 aguuugcgcu ucuccacacc gcccg 25 <210> 1008 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1008 gaguuugcgc uucuccacac cgccc 25 <210> 1009 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1009 ggaguuugcg cuucuccaca ccgcc 25 <210> 1010 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1010 cucgucggag cacuccucgg agaac 25 <210> 1011 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1011 ccucgucgga gcacuccucg gagaa 25 <210> 1012 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1012 uuugccuccu cgucggagca cuccu 25 <210> 1013 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1013 agacaaucgc cuuuugccuc cucgu 25 <210> 1014 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1014 agcucaaaga ucccuuccuu agcuu 25 <210> 1015 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1015 guggcucgcc ggcuacgcgg ccucc 25 <210> 1016 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1016 uacucgcagu ggcucgccgg cuacg 25 <210> 1017 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1017 agaacgugua cucgcagugg cucgc 25 <210> 1018 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1018 caacacggag aacguguacu cgcag 25 <210> 1019 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1019 cugcccccgg ccgcgaugcc caaca 25 <210> 1020 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1020 cucgagaagg aguucgaccu gcccc 25 <210> 1021 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1021 uucucuaagc gcaucaagcu cgaga 25 <210> 1022 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1022 ggggccuguc caaaaagcug cugcu 25 <210> 1023 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1023 gggggccugu ccaaaaagcu gcugc 25 <210> 1024 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1024 gcuccccggg cgagucggcc ucggg 25 <210> 1025 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1025 ugcuccccgg gcgagucggc cucgg 25 <210> 1026 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1026 cugcuccccg ggcgagucgg ccucg 25 <210> 1027 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1027 gcugcucccc gggcgagucg gccuc 25 <210> 1028 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1028 ggcugcuccc cgggcgaguc ggccu 25 <210> 1029 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1029 ggccgcggcu gcuccccggg cgagu 25 <210> 1030 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1030 cuguuaaugg ccgcggcugc ucccc 25 <210> 1031 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1031 acuguuaaug gccgcggcug cuccc 25 <210> 1032 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1032 uagacgaugg cacuguuaau ggccg 25 <210> 1033 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1033 accgcauaga cgauggcacu guuaa 25 <210> 1034 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1034 ccggcgaguc ggaccgcaua gacga 25 <210> 1035 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1035 gacgaagacu cgguggccgg cgagu 25 <210> 1036 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1036 acacuugcga cgaagacucg guggc 25 <210> 1037 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1037 agggacacuu gcgacgaaga cucgg 25 <210> 1038 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1038 cacagggaca cuugcgacga agacu 25 <210> 1039 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1039 caccuggccg aggccgaggg ccaca 25 <210> 1040 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1040 ccaccuggcc gaggccgagg gccac 25 <210> 1041 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1041 agcgcggcca ccuggccgag gccga 25 <210> 1042 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1042 aagcgcggcc accuggccga ggccg 25 <210> 1043 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1043 aagcauaagc gcggccaccu ggccg 25 <210> 1044 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1044 ggcgagaagc auaagcgcgg ccacc 25 <210> 1045 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1045 agguccuggg cgagaagcau aagcg 25 <210> 1046 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1046 ucagcgaggc cuuccaccag guccu 25 <210> 1047 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1047 uucagcgagg ccuuccacca ggucc 25 <210> 1048 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1048 cagcacuuca gcgaggccuu ccacc 25 <210> 1049 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1049 cucagcucca ugcagcacuu cagcg 25 <210> 1050 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1050 gcccugcccg acgucaugca gggca 25 <210> 1051 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1051 gccgcgcccu gcccgacguc augca 25 <210> 1052 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1052 agccgcgccc ugcccgacgu caugc 25 <210> 1053 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1053 gcucgcgggg cgcggucgug ggcgu 25 <210> 1054 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1054 agcucgcggg gcgcggucgu gggcg 25 <210> 1055 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1055 agaacagcuc gcggggcgcg gucgu 25 <210> 1056 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1056 gagaacagcu cgcggggcgc ggucg 25 <210> 1057 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1057 caccacgaga acagcucgcg gggcg 25 <210> 1058 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1058 cgcgccacca cgagaacagc ucgcg 25 <210> 1059 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1059 gcgcgccacc acgagaacag cucgc 25 <210> 1060 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1060 ggcgcgccac cacgagaaca gcucg 25 <210> 1061 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1061 uacggcuucg ggcugagccu ggagg 25 <210> 1062 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1062 gacuacggcu ucgggcugag ccugg 25 <210> 1063 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1063 cuggacuacg gcuucgggcu gagcc 25 <210> 1064 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1064 cucgcucucc cuggacuacg gcuuc 25 <210> 1065 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1065 ucucgcucuc ccuggacuac ggcuu 25 <210> 1066 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1066 acugccucuc gcucucccug gacua 25 <210> 1067 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1067 cuccucgacu gccucucgcu cuccc 25 <210> 1068 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1068 gccagcagcg cgcucaaguc cgugg 25 <210> 1069 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1069 agcgccagca gcgcgcucaa guccg 25 <210> 1070 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1070 cggaacccgg caccagcgac uuggu 25 <210> 1071 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1071 ccggaacccg gcaccagcga cuugg 25 <210> 1072 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1072 uccccggaac ccggcaccag cgacu 25 <210> 1073 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1073 ucuccaccgc cagcuccccg gaacc 25 <210> 1074 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1074 gacggucucu ccaccgccag cuccc 25 <210> 1075 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1075 cccccaugac ggucaagucc gacga 25 <210> 1076 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1076 cacaugcaca aaucgucccc cauga 25 <210> 1077 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1077 aaccugugcg accacgcgug caccc 25 <210> 1078 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1078 ugguggugca ccggcgcagc cacac 25 <210> 1079 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1079 cugguggugc accggcgcag ccaca 25 <210> 1080 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1080 auuucagagc aaccuggugg ugcac 25 <210> 1081 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1081 acguucaaau uucagagcaa ccugg 25 <210> 1082 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1082 aagacguuca aauuucagag caacc 25 <210> 1083 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1083 ucaaguccaa gucaugcgag uucug 25 <210> 1084 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1084 uccgccccuc cucccuccca gcccc 25 <210> 1085 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1085 cagccaggua gcaagccgcc cuucc 25 <210> 1086 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1086 aaagguuacu gcaaccauuc cagcc 25 <210> 1087 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1087 cccaggccgg cccagcccua ugcaa 25 <210> 1088 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1088 gucuagccca ccgcuguccc caggc 25 <210> 1089 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1089 acacgucuag cccaccgcug ucccc 25 <210> 1090 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1090 cucuaggaga cuuagagagc uggca 25 <210> 1091 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1091 ucucuaggag acuuagagag cuggc 25 <210> 1092 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1092 gauuucucua ggagacuuag agagc 25 <210> 1093 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1093 ggagccuccc gccauggauu ucucu 25 <210> 1094 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1094 ccaauggcua uggagccucc cgcca 25 <210> 1095 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1095 gugcugcggu ugaauccaau ggcua 25 <210> 1096 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1096 gacagggugc ugcgguugaa uccaa 25 <210> 1097 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1097 cccgagugcc uuugacaggg ugcug 25 <210> 1098 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1098 acccaucacc cgagugccuu ugaca 25 <210> 1099 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1099 cacccaucac ccgagugccu uugac 25 <210> 1100 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1100 cgccuggggg cggaagagau ggccc 25 <210> 1101 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1101 auagagcgcc ugggggcgga agaga 25 <210> 1102 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1102 ccccaccgca uagagcgccu ggggg 25 <210> 1103 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1103 gacccccacc gcauagagcg ccugg 25 <210> 1104 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1104 ggacccccac cgcauagagc gccug 25 <210> 1105 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1105 uggaccccca ccgcauagag cgccu 25 <210> 1106 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1106 uuggaccccc accgcauaga gcgcc 25 <210> 1107 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1107 uuuaguccac caccgagaca ucacu 25 <210> 1108 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1108 gagagaggcu uccggccugg cagaa 25 <210> 1109 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1109 cgagagaggc uuccggccug gcaga 25 <210> 1110 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1110 ucaguaucga gagaggcuuc cggcc 25 <210> 1111 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1111 caggaucagu aucgagagag gcuuc 25 <210> 1112 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1112 agaauaccag gaucaguauc gagag 25 <210> 1113 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1113 accccuuuaa ccugcuaaga auacc 25 <210> 1114 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1114 auguccuucc cagccaccuc uccau 25 <210> 1115 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1115 aauguccuuc ccagccaccu cucca 25 <210> 1116 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1116 cgcggguugg uaucccuuca ggacu 25 <210> 1117 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1117 ugaccccgcg gguugguauc ccuuc 25 <210> 1118 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1118 acggaagucc ccugaccccg cgggu 25 <210> 1119 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1119 gaacacggaa guccccugac cccgc 25 <210> 1120 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1120 cgaacacgga aguccccuga ccccg 25 <210> 1121 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1121 uaagaaucua cuuagaaagc gaaca 25 <210> 1122 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1122 ucuugcaaca cgcacagaac acuca 25 <210> 1123 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1123 uugcaaacag ccauucacca gugca 25 <210> 1124 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1124 uaaggcucaa cuuacaaaua cccug 25 <210> 1125 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1125 aaggcucaac uuacaaauac ccugc 25 <210> 1126 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1126 aggcucaacu uacaaauacc cugcg 25 <210> 1127 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1127 gcggggcaua uucugcacuc auccc 25 <210> 1128 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1128 gcauauucug cacucauccc aggcg 25 <210> 1129 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1129 cauauucugc acucauccca ggcgu 25 <210> 1130 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1130 auauucugca cucaucccag gcgug 25 <210> 1131 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1131 ggauuagagc uccaugugca gaacg 25 <210> 1132 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1132 gauuagagcu ccaugugcag aacga 25 <210> 1133 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1133 auuagagcuc caugugcaga acgag 25 <210> 1134 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1134 agagcuccau gugcagaacg agggg 25 <210> 1135 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1135 uccaugugca gaacgagggg aggag 25 <210> 1136 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1136 ggaugagugc agaauaugcc ccgca 25 <210> 1137 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1137 gggaugagug cagaauaugc cccgc 25 <210> 1138 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1138 acauggagcu cuaaucccca cgccu 25 <210> 1139 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1139 cacauggagc ucuaaucccc acgcc 25 <210> 1140 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1140 gccucuccuc cccucguucu gcaca 25 <210> 1141 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1141 ucacagauaa acuucugcac uggag 25 <210> 1142 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1142 uucacagaua aacuucugca cugga 25 <210> 1143 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1143 uuucacagau aaacuucugc acugg 25 <210> 1144 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1144 uucuuucaca gauaaacuuc ugcac 25 <210> 1145 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1145 cauuuaccug cuauguguuc cuguu 25 <210> 1146 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1146 auuuaccugc uauguguucc uguuu 25 <210> 1147 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1147 uuuaccugcu auguguuccu guuug 25 <210> 1148 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1148 acguugauaa acaaucguca uccuc 25 <210> 1149 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1149 acaaucguca uccucuggcg ugacc 25 <210> 1150 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1150 ggcgugaccu ggaugccaac cucca 25 <210> 1151 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1151 gcgugaccug gaugccaacc uccac 25 <210> 1152 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1152 accuggaugc caaccuccac gggau 25 <210> 1153 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1153 gauuggaugc uuuuuucauc ucgau 25 <210> 1154 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1154 augcuuuuuu caucucgauu gguga 25 <210> 1155 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1155 ugcuuuuuuc aucucgauug gugaa 25 <210> 1156 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1156 gcuuuuuuca ucucgauugg ugaag 25 <210> 1157 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1157 uuuucaucuc gauuggugaa gggga 25 <210> 1158 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1158 ucaucucgau uggugaaggg gaagg 25 <210> 1159 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1159 cuuauccaca gcuuuuucua agcag 25 <210> 1160 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1160 cgauaaaaau aagaaugucc cccaa 25 <210> 1161 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1161 gauaaaaaua agaauguccc ccaau 25 <210> 1162 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1162 aauguccccc aaugggaagu ucauc 25 <210> 1163 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1163 gggaaguuca ucuggcacug cccac 25 <210> 1164 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1164 guucaucugg cacugcccac aggug 25 <210> 1165 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1165 caucuggcac ugcccacagg ugagg 25 <210> 1166 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1166 aggugaggag gucaugaucc ccuuc 25 <210> 1167 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1167 caugaucccc uucuggagcu cccaa 25 <210> 1168 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1168 augauccccu ucuggagcuc ccaac 25 <210> 1169 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1169 cccuucugga gcucccaacg ggccg 25 <210> 1170 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1170 cuggagcucc caacgggccg ugguc 25 <210> 1171 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1171 uggucugguu caucaucugu aagaa 25 <210> 1172 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1172 caucaucugu aagaauggcu ucaag 25 <210> 1173 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1173 ucuguaagaa uggcuucaag aggcu 25 <210> 1174 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1174 agaauggcuu caagaggcuc ggcug 25 <210> 1175 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1175 uggcuucaag aggcucggcu guggu 25 <210> 1176 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1176 acacauagca gguaaaugag aagca 25 <210> 1177 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1177 uuugccccaa acaggaacac auagc 25 <210> 1178 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1178 ucaucuagag gaauuugccc caaac 25 <210> 1179 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1179 acgauuguuu aucaacguca ucuag 25 <210> 1180 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1180 gagguuggca uccaggucac gccag 25 <210> 1181 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1181 uccaaucccg uggagguugg caucc 25 <210> 1182 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1182 aaaaagcauc caaucccgug gaggu 25 <210> 1183 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1183 augaaaaaag cauccaaucc cgugg 25 <210> 1184 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1184 gagaugaaaa aagcauccaa ucccg 25 <210> 1185 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1185 ggcagccucu gcuuagaaaa agcug 25 <210> 1186 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1186 ucgagcacaa acggaaacaa ugcaa 25 <210> 1187 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1187 cauucuuauu uuuaucgagc acaaa 25 <210> 1188 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1188 cagugccaga ugaacuuccc auugg 25 <210> 1189 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1189 gcagugccag augaacuucc cauug 25 <210> 1190 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1190 ggcagugcca gaugaacuuc ccauu 25 <210> 1191 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1191 gggcagugcc agaugaacuu cccau 25 <210> 1192 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1192 aggggaucau gaccuccuca ccugu 25 <210> 1193 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1193 aaggggauca ugaccuccuc accug 25 <210> 1194 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1194 cacggcccgu ugggagcucc agaag 25 <210> 1195 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1195 ccacggcccg uugggagcuc cagaa 25 <210> 1196 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1196 accacggccc guugggagcu ccaga 25 <210> 1197 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1197 augaugaacc agaccacggc ccguu 25 <210> 1198 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1198 gaugaugaac cagaccacgg cccgu 25 <210> 1199 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1199 uucuuacaga ugaugaacca gacca 25 <210> 1200 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1200 cgagaauucc cguuugcuua agugc 25 <210> 1201 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1201 gagaauuccc guuugcuuaa gugcu 25 <210> 1202 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1202 agaauucccg uuugcuuaag ugcug 25 <210> 1203 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1203 uaagugcugg gguuugccuu gcuug 25 <210> 1204 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1204 gguuugccuu gcuugcggcg agaca 25 <210> 1205 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1205 uugccuugcu ugcggcgaga caugg 25 <210> 1206 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1206 ugccuugcuu gcggcgagac auggu 25 <210> 1207 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1207 gcuugcggcg agacauggug ggcug 25 <210> 1208 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1208 cuugcggcga gacauggugg gcugc 25 <210> 1209 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1209 uugcggcgag acaugguggg cugcg 25 <210> 1210 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1210 cggcggcggc ggcggcggcg gcggg 25 <210> 1211 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1211 ggcggcggcg gcggcgggcg gacga 25 <210> 1212 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1212 cggcggcggc gggcggacga cggcu 25 <210> 1213 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1213 gggcggacga cggcucgguu cacau 25 <210> 1214 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1214 ggcggacgac ggcucgguuc acauc 25 <210> 1215 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1215 acggcucggu ucacaucggg agagc 25 <210> 1216 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1216 cggcucgguu cacaucggga gagcc 25 <210> 1217 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1217 caucgggaga gccggguuag aaaga 25 <210> 1218 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1218 aaauaaauua gaaauaauac aaaga 25 <210> 1219 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1219 auuagaaaua auacaaagau ggcgc 25 <210> 1220 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1220 uuagaaauaa uacaaagaug gcgca 25 <210> 1221 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1221 aagauggcgc agggaagaug aauug 25 <210> 1222 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1222 agauggcgca gggaagauga auugu 25 <210> 1223 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1223 aagaugaauu gugggagagc cguca 25 <210> 1224 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1224 ggcaaacccc agcacuuaag caaac 25 <210> 1225 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1225 aggcaaaccc cagcacuuaa gcaaa 25 <210> 1226 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1226 agcccaccau gucucgccgc aagca 25 <210> 1227 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1227 cucuggaguc uccuucuuuc uaacc 25 <210> 1228 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1228 aaggcacuga ugaagauauu uucuc 25 <210> 1229 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1229 uuucuaauuu auuuuggaug ucaaa 25 <210> 1230 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1230 ucuuuguauu auuucuaauu uauuu 25 <210> 1231 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1231 aaaaaagcuu aaaaaaaagc cauga 25 <210> 1232 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1232 gggaguuugg cuucucaucu gugca 25 <210> 1233 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1233 ucucaucugu gcauggccuc uaaac 25 <210> 1234 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1234 cucaucugug cauggccucu aaacu 25 <210> 1235 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1235 uggccucuaa acugggcagu gacca 25 <210> 1236 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1236 ucuaaacugg gcagugacca uggcc 25 <210> 1237 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1237 ccauggccug gucaccuccc cacuc 25 <210> 1238 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1238 ccuggucacc uccccacucu ggacc 25 <210> 1239 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1239 cuggucaccu ccccacucug gaccu 25 <210> 1240 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1240 gaccuggguu gccccucugu aaaca 25 <210> 1241 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1241 cuggguugcc ccucuguaaa caagg 25 <210> 1242 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1242 aaaucuuaug caauuuuugc caaga 25 <210> 1243 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1243 aaucuuaugc aauuuuugcc aagau 25 <210> 1244 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1244 ugcaauuuuu gccaagaugg gagua 25 <210> 1245 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1245 gcaauuuuug ccaagauggg aguau 25 <210> 1246 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1246 caauuuuugc caagauggga guaug 25 <210> 1247 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1247 agaugggagu auggggagag aagag 25 <210> 1248 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1248 gaguaugggg agagaagagu ggaaa 25 <210> 1249 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1249 agagcucagu gagaugagau aucaa 25 <210> 1250 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1250 gagcucagug agaugagaua ucaaa 25 <210> 1251 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1251 agcucaguga gaugagauau caaag 25 <210> 1252 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1252 ucauuccauc ucccuaaucu ccaau 25 <210> 1253 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1253 aaucuccaau uggcaaagcc agacu 25 <210> 1254 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1254 aucuccaauu ggcaaagcca gacuu 25 <210> 1255 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1255 ucuccaauug gcaaagccag acuug 25 <210> 1256 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1256 aagccagacu uggggcaaua cagac 25 <210> 1257 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1257 uaucaccaaa uguucuuucu ucagc 25 <210> 1258 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1258 cuuucuucag cuggaauuua aaaua 25 <210> 1259 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1259 uaaaauaugg acucauccgu aaaau 25 <210> 1260 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1260 ggaauaauaa uaguauaugc uucau 25 <210> 1261 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1261 gaauaauaau aguauaugcu ucaua 25 <210> 1262 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1262 gcuugugaac uaaaaugcug ccucc 25 <210> 1263 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1263 acaccucagc agaaacaaag uuauc 25 <210> 1264 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1264 caggcccuuu ccccaauucc uaguu 25 <210> 1265 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1265 aggcccuuuc cccaauuccu aguuu 25 <210> 1266 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1266 aauuccuagu uugggucaga agaaa 25 <210> 1267 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1267 auuccuaguu ugggucagaa gaaaa 25 <210> 1268 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1268 aguuuggguc agaagaaaag ggaaa 25 <210> 1269 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1269 guuuggguca gaagaaaagg gaaaa 25 <210> 1270 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1270 ggucagaaga aaagggaaaa gggag 25 <210> 1271 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1271 agaaaaggga aaagggagag gaaaa 25 <210> 1272 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1272 ggaaaaagga aaagaauaug acguc 25 <210> 1273 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1273 gaaaaaggaa aagaauauga cguca 25 <210> 1274 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1274 aaaaaggaaa agaauaugac gucag 25 <210> 1275 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1275 aaaaggaaaa gaauaugacg ucagg 25 <210> 1276 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1276 aggaaaagaa uaugacguca ggggg 25 <210> 1277 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1277 ugacgucagg gggaggcaag ucagu 25 <210> 1278 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1278 gacgucaggg ggaggcaagu caguu 25 <210> 1279 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1279 ggaacacaga uccuaacaca guagc 25 <210> 1280 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1280 ccuaacacag uagcugguac cugau 25 <210> 1281 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1281 guaccugaua ggugccuaua uguga 25 <210> 1282 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1282 cugauaggug ccuauaugug augga 25 <210> 1283 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1283 ugauaggugc cuauauguga uggau 25 <210> 1284 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1284 uaggugccua uaugugaugg auggg 25 <210> 1285 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1285 gguggacagc ccgacagaug aaaaa 25 <210> 1286 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1286 gacagaugaa aaauggacaa uuaug 25 <210> 1287 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1287 agaugaaaaa uggacaauua ugagg 25 <210> 1288 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1288 gaugaaaaau ggacaauuau gagga 25 <210> 1289 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1289 augaaaaaug gacaauuaug aggag 25 <210> 1290 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1290 auuaugagga ggggagagug cagac 25 <210> 1291 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1291 uuaugaggag gggagagugc agaca 25 <210> 1292 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1292 uaugaggagg ggagagugca gacag 25 <210> 1293 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1293 ggaagcuuca ccuccuuuac aauuu 25 <210> 1294 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1294 gaagcuucac cuccuuuaca auuuu 25 <210> 1295 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1295 uccuuuacaa uuuugggagu ccaca 25 <210> 1296 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1296 uacaauuuug ggaguccaca cggca 25 <210> 1297 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1297 caucaccaag agagccuucc gaaag 25 <210> 1298 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1298 gagagccuuc cgaaagaggc ccccc 25 <210> 1299 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1299 agagccuucc gaaagaggcc ccccu 25 <210> 1300 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1300 uccgaaagag gccccccugg gcaaa 25 <210> 1301 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1301 gccccccugg gcaaacggcc accga 25 <210> 1302 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1302 ccugggcaaa cggccaccga uggag 25 <210> 1303 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1303 ccacccacgc ccccacccua aucag 25 <210> 1304 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1304 cccuaaucag aggccaaacc cuucc 25 <210> 1305 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1305 acuagcuuca aaguuguauu gaccc 25 <210> 1306 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1306 aagaguagau gccauaucuc uuuuc 25 <210> 1307 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1307 uuucuggccu auguuauuac cugua 25 <210> 1308 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1308 guuauuaccu guauggacuu ugcac 25 <210> 1309 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1309 cuaucugcuc uuacuuaugc acacc 25 <210> 1310 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1310 uaucugcucu uacuuaugca caccu 25 <210> 1311 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1311 aucugcucuu acuuaugcac accug 25 <210> 1312 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1312 ccugucuagc ugccuuccuu aucac 25 <210> 1313 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1313 uuccuuauca caggaauagc accca 25 <210> 1314 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1314 gaguagaacc cccuauaaac uaguc 25 <210> 1315 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1315 ccuauaaacu agucugguuu gccca 25 <210> 1316 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1316 cuauaaacua gucugguuug cccau 25 <210> 1317 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1317 uauaaacuag ucugguuugc ccaug 25 <210> 1318 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1318 ucugguuugc ccauggggca caguc 25 <210> 1319 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1319 auggggcaca gucaggcugu uuucc 25 <210> 1320 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1320 uggggcacag ucaggcuguu uucca 25 <210> 1321 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1321 ggcacaguca ggcuguuuuc caggg 25 <210> 1322 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1322 gcacagucag gcuguuuucc agggu 25 <210> 1323 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1323 cacagucagg cuguuuucca gggug 25 <210> 1324 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1324 acacacguau guguugugau cccug 25 <210> 1325 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1325 uugugauccc ugugguuuga gaguu 25 <210> 1326 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1326 ucccuaaaag ucaaaauauu cucaa 25 <210> 1327 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1327 cccuaaaagu caaaauauuc ucaau 25 <210> 1328 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1328 cccucaauca gcacauacac acaaa 25 <210> 1329 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1329 ucagcacaua cacacaaaag guacc 25 <210> 1330 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1330 uguaauucuu uuccugcuca aagac 25 <210> 1331 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1331 ccccaaccaa aaacccuugc cacca 25 <210> 1332 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1332 cccaaccaaa aacccuugcc accau 25 <210> 1333 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1333 aaaaacccuu gccaccaugg gagcc 25 <210> 1334 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1334 aaaacccuug ccaccauggg agccu 25 <210> 1335 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1335 aaacccuugc caccauggga gccug 25 <210> 1336 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1336 ccaccauggg agccuggggc agaga 25 <210> 1337 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1337 cacagugaag ucaaacugua auucc 25 <210> 1338 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1338 ucaaacugua auuccaggcu cuaaa 25 <210> 1339 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1339 uuuuucugag agucucuaaa uuaca 25 <210> 1340 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1340 uuuucugaga gucucuaaau uacaa 25 <210> 1341 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1341 acaccuaaga aacauacugc agcuc 25 <210> 1342 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1342 aaagagaaca aacaaaccaa agaga 25 <210> 1343 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1343 aagagaacaa acaaaccaaa gagaa 25 <210> 1344 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1344 aacaaaccaa agagaaggga uccag 25 <210> 1345 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1345 uaugugaaaa gucaauugau aauga 25 <210> 1346 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1346 aaagucaauu gauaaugaag gcuuu 25 <210> 1347 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1347 uugauaauga aggcuuuagg auaac 25 <210> 1348 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1348 auaaugaagg cuuuaggaua accgg 25 <210> 1349 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1349 uaaugaaggc uuuaggauaa ccgga 25 <210> 1350 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1350 aaugaaggcu uuaggauaac cggag 25 <210> 1351 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1351 augauugaaa gcaaugcacc ugugc 25 <210> 1352 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1352 gaaagcaaug caccugugca ggaaa 25 <210> 1353 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1353 augcaccugu gcaggaaaug gauua 25 <210> 1354 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1354 ugugcaggaa auggauuacg gaaac 25 <210> 1355 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1355 gugcaggaaa uggauuacgg aaaca 25 <210> 1356 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1356 ucaugaaauc ccagaaaacc agaac 25 <210> 1357 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1357 caugaaaucc cagaaaacca gaacc 25 <210> 1358 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1358 cagaaaacca gaaccgggaa aguuc 25 <210> 1359 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1359 ccagaaccgg gaaaguucug gaagu 25 <210> 1360 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1360 gaaaaacaaa ucaugacuua agcaa 25 <210> 1361 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1361 cguuuacaga augccuuguc ccacg 25 <210> 1362 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1362 aggccauggu cacugcccag uuuag 25 <210> 1363 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1363 ccagaguggg gaggugacca ggcca 25 <210> 1364 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1364 ccagguccag aguggggagg ugacc 25 <210> 1365 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1365 ggggcaaccc agguccagag ugggg 25 <210> 1366 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1366 agaggggcaa cccaggucca gagug 25 <210> 1367 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1367 cagaggggca acccaggucc agagu 25 <210> 1368 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1368 acagaggggc aacccagguc cagag 25 <210> 1369 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1369 cuccuuguuu acagaggggc aaccc 25 <210> 1370 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1370 uauuacaacc uccuuguuua cagag 25 <210> 1371 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1371 uuauuacaac cuccuuguuu acaga 25 <210> 1372 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1372 uuuauuacaa ccuccuuguu uacag 25 <210> 1373 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1373 uaagauuuau aagacauuag gguau 25 <210> 1374 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1374 auugcauaag auuuauaaga cauua 25 <210> 1375 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1375 aauugcauaa gauuuauaag acauu 25 <210> 1376 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1376 cucuucucuc cccauacucc caucu 25 <210> 1377 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1377 uugauaucuc aucucacuga gcucu 25 <210> 1378 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1378 uuugauaucu caucucacug agcuc 25 <210> 1379 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1379 cuuugccaau uggagauuag ggaga 25 <210> 1380 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1380 gucuggcuuu gccaauugga gauua 25 <210> 1381 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1381 agucuggcuu ugccaauugg agauu 25 <210> 1382 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1382 uugccccaag ucuggcuuug ccaau 25 <210> 1383 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1383 gaaccagucu guauugcccc aaguc 25 <210> 1384 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1384 ggugauaaau cauuaggaau gagcu 25 <210> 1385 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1385 aaagaacauu uggugauaaa ucauu 25 <210> 1386 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1386 aaauuccagc ugaagaaaga acauu 25 <210> 1387 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1387 auauacuauu auuauuccua uuuua 25 <210> 1388 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1388 aagcucggag cacuuacucu gcucu 25 <210> 1389 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1389 gaggcagcau uuuaguucac aagcu 25 <210> 1390 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1390 ugagguguaa cuaauaaaua ccagg 25 <210> 1391 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1391 ugcugaggug uaacuaauaa auacc 25 <210> 1392 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1392 gggccugaua acuuuguuuc ugcug 25 <210> 1393 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1393 ugacccaaac uaggaauugg ggaaa 25 <210> 1394 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1394 cugacccaaa cuaggaauug gggaa 25 <210> 1395 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1395 uucuucugac ccaaacuagg aauug 25 <210> 1396 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1396 uuucuucuga cccaaacuag gaauu 25 <210> 1397 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1397 uuuucuucug acccaaacua ggaau 25 <210> 1398 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1398 uuucccuuuu cuucugaccc aaacu 25 <210> 1399 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1399 ccuaucaggu accagcuacu guguu 25 <210> 1400 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1400 cauccaucac auauaggcac cuauc 25 <210> 1401 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1401 ggcuguccac ccauccauca cauau 25 <210> 1402 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1402 cauaauuguc cauuuuucau cuguc 25 <210> 1403 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1403 ucauaauugu ccauuuuuca ucugu 25 <210> 1404 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1404 guguggacuc ccaaaauugu aaagg 25 <210> 1405 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1405 gccgugugga cucccaaaau uguaa 25 <210> 1406 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1406 gaaauaauuu guaugccaug ccgug 25 <210> 1407 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1407 ggagaauugg auuuuauuuc ucaau 25 <210> 1408 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1408 uggagaauug gauuuuauuu cucaa 25 <210> 1409 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1409 gaaggcucuc uuggugaugg agaau 25 <210> 1410 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1410 cucuuucgga aggcucucuu gguga 25 <210> 1411 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1411 gggggccucu uucggaaggc ucucu 25 <210> 1412 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1412 uuugcccagg ggggccucuu ucgga 25 <210> 1413 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1413 gccguuugcc caggggggcc ucuuu 25 <210> 1414 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1414 uccaucggug gccguuugcc caggg 25 <210> 1415 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1415 cuccaucggu ggccguuugc ccagg 25 <210> 1416 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1416 ucuccaucgg uggccguuug cccag 25 <210> 1417 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1417 cucuccaucg guggccguuu gccca 25 <210> 1418 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1418 ccucuccauc gguggccguu ugccc 25 <210> 1419 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1419 gaggacuggc agaccucucc aucgg 25 <210> 1420 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1420 gaagaggacu ggcagaccuc uccau 25 <210> 1421 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1421 gggcgugggu gggguagaag aggac 25 <210> 1422 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1422 ggugggggcg uggguggggu agaag 25 <210> 1423 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1423 ucugauuagg gugggggcgu gggug 25 <210> 1424 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1424 cucugauuag ggugggggcg ugggu 25 <210> 1425 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1425 ccucugauua gggugggggc guggg 25 <210> 1426 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1426 uggccucuga uuaggguggg ggcgu 25 <210> 1427 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1427 uuggccucug auuagggugg gggcg 25 <210> 1428 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1428 aggguuuggc cucugauuag ggugg 25 <210> 1429 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1429 aaggguuugg ccucugauua gggug 25 <210> 1430 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1430 gaaggguuug gccucugauu agggu 25 <210> 1431 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1431 ggaaggguuu ggccucugau uaggg 25 <210> 1432 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1432 ccaggaaggg uuuggccucu gauua 25 <210> 1433 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1433 uccaggaagg guuuggccuc ugauu 25 <210> 1434 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1434 uuuaucacag gcuccaggaa ggguu 25 <210> 1435 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1435 uugcuuuuau cacaggcucc aggaa 25 <210> 1436 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1436 guugcuuuua ucacaggcuc cagga 25 <210> 1437 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1437 aacaguugcu uuuaucacag gcucc 25 <210> 1438 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1438 gcaagcuaac aguugcuuuu aucac 25 <210> 1439 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1439 aucuacucuu agacauaaca cacca 25 <210> 1440 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1440 caucuacucu uagacauaac acacc 25 <210> 1441 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1441 aauaacauag gccagaaaag agaua 25 <210> 1442 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1442 gcaaagucca uacagguaau aacau 25 <210> 1443 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1443 gcugauucca gugcaaaguc cauac 25 <210> 1444 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1444 cgauacaggg cuggcucuau gcccc 25 <210> 1445 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1445 agauggcuga aaagcgauac agggc 25 <210> 1446 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1446 agugagaugg cugaaaagcg auaca 25 <210> 1447 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1447 uagugagaug gcugaaaagc gauac 25 <210> 1448 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1448 gacuugggag uuaucuguag ugaga 25 <210> 1449 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1449 uaaggaaggc agcuagacag gacuu 25 <210> 1450 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1450 auaaggaagg cagcuagaca ggacu 25 <210> 1451 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1451 ccugugauaa ggaaggcagc uagac 25 <210> 1452 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1452 uugggugcua uuccugugau aagga 25 <210> 1453 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1453 gaccuugggu gcuauuccug ugaua 25 <210> 1454 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1454 cuacucugag guacugaugg accuu 25 <210> 1455 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1455 ucuacucuga gguacugaug gaccu 25 <210> 1456 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1456 aggggguucu acucugaggu acuga 25 <210> 1457 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1457 cuaguuuaua ggggguucua cucug 25 <210> 1458 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1458 ugggcaaacc agacuaguuu auagg 25 <210> 1459 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1459 augggcaaac cagacuaguu uauag 25 <210> 1460 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1460 caugggcaaa ccagacuagu uuaua 25 <210> 1461 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1461 ccaugggcaa accagacuag uuuau 25 <210> 1462 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1462 ggaaaacagc cugacugugc cccau 25 <210> 1463 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1463 uggaaaacag ccugacugug cccca 25 <210> 1464 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1464 ggcagagaau gucugcaccc caccc 25 <210> 1465 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1465 ugacguuaua uguaagcauc acaac 25 <210> 1466 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1466 ggaagcucca aacucucaaa ccaca 25 <210> 1467 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1467 gggaagcucc aaacucucaa accac 25 <210> 1468 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1468 cccauugaga auauuuugac uuuua 25 <210> 1469 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1469 gcccauugag aauauuuuga cuuuu 25 <210> 1470 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1470 ccuuuugugu guaugugcug auuga 25 <210> 1471 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1471 accuuuugug uguaugugcu gauug 25 <210> 1472 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1472 agcaggaaaa gaauuacagu uuucc 25 <210> 1473 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1473 gguauugaau ugccugucuu ugagc 25 <210> 1474 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1474 ggcaaggguu uuugguuggg ggaag 25 <210> 1475 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1475 uggcaagggu uuuugguugg gggaa 25 <210> 1476 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1476 guggcaaggg uuuuugguug gggga 25 <210> 1477 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1477 caugguggca aggguuuuug guugg 25 <210> 1478 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1478 ccaugguggc aaggguuuuu gguug 25 <210> 1479 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1479 cccauggugg caaggguuuu ugguu 25 <210> 1480 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1480 ucccauggug gcaaggguuu uuggu 25 <210> 1481 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1481 aggcucccau gguggcaagg guuuu 25 <210> 1482 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1482 cugccccagg cucccauggu ggcaa 25 <210> 1483 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1483 ucugccccag gcucccaugg uggca 25 <210> 1484 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1484 ccuucucugc cccaggcucc caugg 25 <210> 1485 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1485 gugccuucuc ugccccaggc uccca 25 <210> 1486 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1486 gacuucacug ugccuucucu gcccc 25 <210> 1487 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1487 aaaaaugaca gcaccauuua gagcc 25 <210> 1488 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1488 uuuccagagc ugcaguaugu uucuu 25 <210> 1489 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1489 gggugaccuc uggaucccuu cucuu 25 <210> 1490 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1490 acuuuucaca uaugagggug accuc 25 <210> 1491 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1491 uuaucaauug acuuuucaca uauga 25 <210> 1492 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1492 auuaucaauu gacuuuucac auaug 25 <210> 1493 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1493 gcauugcuuu caaucaucuc cccuc 25 <210> 1494 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1494 uguuuccgua auccauuucc ugcac 25 <210> 1495 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1495 agaacuuucc cgguucuggu uuucu 25 <210> 1496 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1496 cagaacuuuc ccgguucugg uuuuc 25 <210> 1497 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1497 ccgacuucca gaacuuuccc gguuc 25 <210> 1498 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1498 guuuuuccga cuuccagaac uuucc 25 <210> 1499 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1499 gacaaggcau ucuguaaacg uguau 25 <210> 1500 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1500 uaucaagcau ccagcauuug 20 <210> 1501 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1501 uaucuaaaaa uguaauugcu 20 <210> 1502 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1502 agcauuucua uacaugucuu 20 <210> 1503 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1503 uaaucauaaa aaccucaaac 20 <210> 1504 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1504 uuuaaguggc uaccgguuug 20 <210> 1505 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1505 guaagcauuu aaguggcuac 20 <210> 1506 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1506 acuguuggua agcauuuaag 20 <210> 1507 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1507 uaauuuauca auucuacugu 20 <210> 1508 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1508 acaguagaau ugauaaauua 20 <210> 1509 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1509 caaaugcauu uuacagcauu 20 <210> 1510 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1510 gguugauuaa aaguaaccag 20 <210> 1511 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1511 auauaguuug aacucaccuc 20 <210> 1512 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1512 uuuauuugua uauagaaaga 20 <210> 1513 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1513 ugccugagau ucugaucaca 20 <210> 1514 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1514 gccugagauu cugaucacaa 20 <210> 1515 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1515 ccugagauuc ugaucacaag 20 <210> 1516 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1516 ccccuuguga ucagaaucuc 20 <210> 1517 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1517 aaggggaaau guuauaaaau 20 <210> 1518 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1518 aggggaaaug uuauaaaaua 20 <210> 1519 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1519 uguuauaaaa uaggguagag 20 <210> 1520 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1520 caaaguuuaa aggucauuca 20 <210> 1521 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1521 uaacuuguaa caaaguuuaa 20 <210> 1522 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1522 caaguuauuu uucuguaacc 20 <210> 1523 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1523 aauaucuuuc guuggcuucc 20 <210> 1524 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1524 aauuauucaa uaucuuucgu 20 <210> 1525 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1525 gauauugaau aauucaagaa 20 <210> 1526 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1526 auugaauaau ucaagaaagg 20 <210> 1527 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1527 gaauaauuca agaaaggugg 20 <210> 1528 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1528 auucaagaaa ggugguggca 20 <210> 1529 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1529 uauuuuagaa guagagaaaa 20 <210> 1530 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1530 auuuuagaag uagagaaaau 20 <210> 1531 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1531 gaaaauggga gacaaauagc 20 <210> 1532 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1532 aaaaugggag acaaauagcu 20 <210> 1533 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1533 agcugggcuu cuguugcagu 20 <210> 1534 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1534 gcugggcuuc uguugcagua 20 <210> 1535 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1535 gccauuucua uuaucagacu 20 <210> 1536 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1536 uccaagucug auaauagaaa 20 <210> 1537 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1537 uuaucagacu uggaccauga 20 <210> 1538 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1538 cacgacugac aucaccguca 20 <210> 1539 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1539 ucagucguga acacaagaau 20 <210> 1540 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1540 cagucgugaa cacaagaaua 20 <210> 1541 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1541 ggccacauuu gugaguuuag 20 <210> 1542 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1542 uaccacuaaa cucacaaaug 20 <210> 1543 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1543 uaaaaucaga aauacagucu 20 <210> 1544 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1544 aaaagaugua cuuagauaug 20 <210> 1545 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1545 uguacuuaga uauguggauc 20 <210> 1546 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1546 agcucagaaa gaauacaacc 20 <210> 1547 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1547 accaggucaa gaauacagaa 20 <210> 1548 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1548 uccauucugu auucuugacc 20 <210> 1549 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1549 cugucauuuu uaacagguag 20 <210> 1550 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1550 caucaucugu cauuuuuaac 20 <210> 1551 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1551 aaacacauuc uaagauuuua 20 <210> 1552 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1552 aaucuuagaa uguguuugug 20 <210> 1553 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1553 aucuuagaau guguuuguga 20 <210> 1554 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1554 uuagaaugug uuugugaggg 20 <210> 1555 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1555 caauuuucuu auauaugaau 20 <210> 1556 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1556 uugauucuaa aaaaaauguu 20 <210> 1557 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1557 aaauguuagg uaaauucuua 20 <210> 1558 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1558 gguaaauucu uaaggccaug 20 <210> 1559 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1559 agaucaaaua acaguccuca 20 <210> 1560 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1560 gucuguuaau uccaaagacu 20 <210> 1561 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1561 aaagugaaaa gccaagucuu 20 <210> 1562 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1562 ccugaaauga uuuuacacau 20 <210> 1563 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1563 ccaaugugua aaaucauuuc 20 <210> 1564 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1564 cugaaaugau uuuacacauu 20 <210> 1565 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1565 auuuuacaca uugggagauc 20 <210> 1566 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1566 gguuacaugu uuauucuaua 20 <210> 1567 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1567 ucuauaugga uugcauugag 20 <210> 1568 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1568 aggauuugua uaacagaaua 20 <210> 1569 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1569 uuuucuuuuc ucuucugaga 20 <210> 1570 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1570 gcacucuagc uugggcaaua 20 <210> 1571 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1571 ugcacucuag cuugggcaau 20 <210> 1572 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1572 ugcaccauug cacucuagcu 20 <210> 1573 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1573 gcuauucagg uggcugaggc 20 <210> 1574 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1574 accugaauag cugggacugc 20 <210> 1575 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1575 gcaggcaugc accacacgcc 20 <210> 1576 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1576 uacaaaauca gccgggcgug 20 <210> 1577 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1577 ggcuuguaaa cccagcacuu 20 <210> 1578 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1578 cuggcuggau gcgguggcuc 20 <210> 1579 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1579 cugagccacc gcauccagcc 20 <210> 1580 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1580 cuuauccugg cuggaugcgg 20 <210> 1581 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1581 caccgcaucc agccaggaua 20 <210> 1582 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1582 gaccuuaucc uggcuggaug 20 <210> 1583 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1583 cuuuuagacc uuauccuggc 20 <210> 1584 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1584 gccaggauaa ggucuaaaag 20 <210> 1585 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1585 uccacuuuua gaccuuaucc 20 <210> 1586 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1586 aauagcaucu acucuuguuc 20 <210> 1587 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1587 cucuuguuca ggaaacaaug 20 <210> 1588 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1588 ggaaacaaug aggaccugac 20 <210> 1589 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1589 gaaacaauga ggaccugacu 20 <210> 1590 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1590 accugacugg gcaguaagag 20 <210> 1591 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1591 accacucuua cugcccaguc 20 <210> 1592 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1592 aagaguggug auuaauagau 20 <210> 1593 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1593 agagugguga uuaauagaua 20 <210> 1594 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1594 agaaucgaac uguugauuag 20 <210> 1595 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1595 ucgaacuguu gauuagaggu 20 <210> 1596 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1596 ccuggcagac ccucaagagc 20 <210> 1597 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1597 ccuggcagac ccucaagagc 20 <210> 1598 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1598 cuggcagacc cucaagagca 20 <210> 1599 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1599 uggcagaccc ucaagagcag 20 <210> 1600 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1600 cccucaagag caggggucuu 20 <210> 1601 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1601 ccucaagagc aggggucuuc 20 <210> 1602 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1602 uaaggccagu ggaaagaauu 20 <210> 1603 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1603 aagagcaggg gucuucucuu 20 <210> 1604 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1604 agagcagggg ucuucucuuu 20 <210> 1605 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1605 gagcaggggu cuucucuuug 20 <210> 1606 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1606 agcagggguc uucucuuugg 20 <210> 1607 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1607 aggggucuuc ucuuuggggg 20 <210> 1608 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1608 gggaggacau cacucuuagc 20 <210> 1609 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1609 ggaggacauc acucuuagca 20 <210> 1610 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1610 gccagacucc aaguucugcc 20 <210> 1611 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1611 gacaucacuc uuagcagggc 20 <210> 1612 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1612 acaucacucu uagcagggcu 20 <210> 1613 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1613 caucacucuu agcagggcug 20 <210> 1614 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1614 gcugggguga gucaaaaguc 20 <210> 1615 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1615 cuggggugag ucaaaagucu 20 <210> 1616 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1616 gagucaaaag ucugggagaa 20 <210> 1617 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1617 ucaaaagucu gggagaaugg 20 <210> 1618 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1618 agucugggag aauggaggug 20 <210> 1619 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1619 cugggagaau ggaggugugg 20 <210> 1620 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1620 ugggagaaug gaggugugga 20 <210> 1621 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1621 gggagaaugg agguguggag 20 <210> 1622 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1622 ggaggugugg aggggauaac 20 <210> 1623 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1623 ggcagcgagg aguccacagu 20 <210> 1624 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1624 gaggugugga ggggauaacu 20 <210> 1625 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1625 aacuggguca gaccccaagc 20 <210> 1626 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1626 gggucagacc ccaagcagga 20 <210> 1627 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1627 ggucagaccc caagcaggaa 20 <210> 1628 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1628 ccccaagcag gaagggccuc 20 <210> 1629 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1629 cccaagcagg aagggccucu 20 <210> 1630 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1630 ccaagcagga agggccucua 20 <210> 1631 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1631 aggaagggcc ucuauguaga 20 <210> 1632 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1632 ggaagggccu cuauguagac 20 <210> 1633 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1633 ccucuaugua gacgggugug 20 <210> 1634 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1634 ccucuaugua gacgggugug 20 <210> 1635 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1635 gacgggugug uggcuccuua 20 <210> 1636 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1636 ccuuaaggug acccagcagc 20 <210> 1637 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1637 uuaaggugac ccagcagccc 20 <210> 1638 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1638 uaaggugacc cagcagcccu 20 <210> 1639 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1639 cccagcagcc cugggcacag 20 <210> 1640 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1640 ccagcagccc ugggcacaga 20 <210> 1641 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1641 gccagacucc aaguucugcc 20 <210> 1642 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1642 agcagcccug ggcacagaag 20 <210> 1643 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1643 cccugggcac agaaguggug 20 <210> 1644 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1644 ccugggcaca gaaguggugc 20 <210> 1645 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1645 cugggcacag aaguggugcg 20 <210> 1646 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1646 ugccaacagu gauaaccagc 20 <210> 1647 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1647 gccaacagug auaaccagca 20 <210> 1648 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1648 uaaggccagu ggaaagaauu 20 <210> 1649 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1649 ccaacaguga uaaccagcag 20 <210> 1650 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1650 ccagcagggc cugucagaag 20 <210> 1651 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1651 ccagcagggc cugucagaag 20 <210> 1652 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1652 gggccuguca gaagaggccc 20 <210> 1653 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1653 ccugucagaa gaggcccugg 20 <210> 1654 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1654 gaagaggccc uggacacuga 20 <210> 1655 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1655 aggcccugga cacugaaggc 20 <210> 1656 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1656 ggcccuggac acugaaggcu 20 <210> 1657 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1657 ucuuuccacu ggccuuaacc 20 <210> 1658 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1658 cccuggacac ugaaggcugg 20 <210> 1659 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1659 ccuggacacu gaaggcuggg 20 <210> 1660 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1660 cugaaggcug ggcacagccu 20 <210> 1661 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1661 ugaaggcugg gcacagccuu 20 <210> 1662 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1662 gaaggcuggg cacagccuug 20 <210> 1663 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1663 cagccuuggg gaccgcucac 20 <210> 1664 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1664 ccuuggggac cgcucacagg 20 <210> 1665 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1665 ccgcucacag gacaugcagc 20 <210> 1666 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1666 ccgacaacuc ccuaccgcga 20 <210> 1667 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1667 cccuaccgcg accccuauca 20 <210> 1668 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1668 ccuaccgcga ccccuaucag 20 <210> 1669 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1669 ccgcgacccc uaucagugcc 20 <210> 1670 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1670 ccccuaucag ugccgaccaa 20 <210> 1671 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1671 cccuaucagu gccgaccaag 20 <210> 1672 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1672 ccuaucagug ccgaccaagc 20 <210> 1673 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1673 ccgaccaagc acacaagaug 20 <210> 1674 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1674 ccaagcacac aagaugcaca 20 <210> 1675 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1675 agcacacaag augcacaccc 20 <210> 1676 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1676 cacaagaugc acacccaggc 20 <210> 1677 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1677 acaagaugca cacccaggcu 20 <210> 1678 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1678 ucuuuccacu ggccuuaacc 20 <210> 1679 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1679 gaugcacacc caggcugggc 20 <210> 1680 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1680 acccaggcug ggcuggacag 20 <210> 1681 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1681 cccaggcugg gcuggacaga 20 <210> 1682 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1682 cccaggcugg gcuggacaga 20 <210> 1683 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1683 ccaggcuggg cuggacagag 20 <210> 1684 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1684 ccaggcuggg cuggacagag 20 <210> 1685 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1685 gagggguccc acaagaucac 20 <210> 1686 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1686 agggguccca caagaucaca 20 <210> 1687 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1687 cccacaagau cacagggugu 20 <210> 1688 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1688 ggcagcgagg aguccacagu 20 <210> 1689 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1689 ccacaagauc acagggugug 20 <210> 1690 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1690 ucacagggug ugcccugaga 20 <210> 1691 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1691 cagggugugc ccugagaagg 20 <210> 1692 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1692 cgaacuguug auuagaggua 20 <210> 1693 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1693 augauuuuaa ucugugaccu 20 <210> 1694 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1694 uaaucuguga ccuuggugaa 20 <210> 1695 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1695 aaucugugac cuuggugaau 20 <210> 1696 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1696 agcuacuugc ccauucacca 20 <210> 1697 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1697 uagcuaucua augacuaaaa 20 <210> 1698 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1698 augacuaaaa uggaaaacac 20 <210> 1699 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1699 aaauacccau gcugagucug 20 <210> 1700 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1700 aggcaccuca gacucagcau 20 <210> 1701 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1701 uaggcaccuc agacucagca 20 <210> 1702 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1702 gcugagucug aggugccuau 20 <210> 1703 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1703 uauuuauaua gauguccuau 20 <210> 1704 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1704 cauauaucaa acaauguacu 20 <210> 1705 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1705 ccaguacauu guuugauaua 20 <210> 1706 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1706 ccauauauca aacaauguac 20 <210> 1707 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1707 caguacauug uuugauauau 20 <210> 1708 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1708 cauuguuuga uauauggguu 20 <210> 1709 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1709 gauauauggg uuuggcacug 20 <210> 1710 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1710 uauggguuug gcacugaggu 20 <210> 1711 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1711 ggguuuggca cugagguugg 20 <210> 1712 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1712 gcacugaggu uggaggucag 20 <210> 1713 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1713 cagagguuag aaaucagagu 20 <210> 1714 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1714 agagguuaga aaucagaguu 20 <210> 1715 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1715 uagaaaucag aguugggaau 20 <210> 1716 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1716 agaaaucaga guugggaauu 20 <210> 1717 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1717 guugggaauu gggauuauac 20 <210> 1718 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1718 cuuuguauuc aucacacucu 20 <210> 1719 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1719 augaauacaa aguuaaauga 20 <210> 1720 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1720 uaaauguugg uguucauuaa 20 <210> 1721 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1721 ugagauuuca cauuaaaugu 20 <210> 1722 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1722 acauuuaaug ugaaaucuca 20 <210> 1723 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1723 uaaaaucauc ggggauuuug 20 <210> 1724 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1724 cuaaaaucau cggggauuuu 20 <210> 1725 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1725 ucuaaaauca ucggggauuu 20 <210> 1726 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1726 acugaguucu aaaaucaucg 20 <210> 1727 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1727 uacugaguuc uaaaaucauc 20 <210> 1728 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1728 auacugaguu cuaaaaucau 20 <210> 1729 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1729 uaauuagugu aaugccaaug 20 <210> 1730 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1730 aauuagugua augccaaugu 20 <210> 1731 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1731 aaugccaaug uggguuagaa 20 <210> 1732 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1732 acuuccauuc uaacccacau 20 <210> 1733 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1733 aauggaaguc aacuugcugu 20 <210> 1734 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1734 cuugcuguug guuucagagc 20 <210> 1735 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1735 cuguugguuu cagagcaggu 20 <210> 1736 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1736 uucagagcag guaggagaua 20 <210> 1737 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1737 agugaaaagc ugaaacaaaa 20 <210> 1738 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1738 aagcugaaac aaaaaggaaa 20 <210> 1739 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1739 ugaaacaaaa aggaaaaggu 20 <210> 1740 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1740 gaaacaaaaa ggaaaaggua 20 <210> 1741 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1741 ggaaaaggua gggugaaaga 20 <210> 1742 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1742 gaaaagguag ggugaaagau 20 <210> 1743 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1743 aaagauggga aauguaugua 20 <210> 1744 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1744 gaugggaaau guauguaagg 20 <210> 1745 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1745 uguaaggagg augagccaca 20 <210> 1746 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1746 ggaggaugag ccacauggua 20 <210> 1747 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1747 gaggaugagc cacaugguau 20 <210> 1748 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1748 gaugagccac augguauggg 20 <210> 1749 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1749 aguauaccuc ccauaccaug 20 <210> 1750 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1750 augguauggg agguauacua 20 <210> 1751 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1751 ggagguauac uaaggacucu 20 <210> 1752 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1752 gagguauacu aaggacucua 20 <210> 1753 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1753 acucuagggu cagagaaaua 20 <210> 1754 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1754 cucuaggguc agagaaauau 20 <210> 1755 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1755 aagaauguga auuuuguaga 20 <210> 1756 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1756 uucuacaaaa uucacauucu 20 <210> 1757 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1757 acaaaauuca cauucuuggc 20 <210> 1758 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1758 caaaauucac auucuuggcu 20 <210> 1759 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1759 uucacauucu uggcugggug 20 <210> 1760 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1760 aggguggauc accugauguu 20 <210> 1761 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1761 gaucucgaac uccuaacauc 20 <210> 1762 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1762 guuuggccuc ugauuagggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1763 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1763 aucagaggcc aaacccuucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1764 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1764 uuuaucacag gcuccaggaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1765 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1765 uuuggccucu gauuagggug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1766 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1766 cacgccccca cccuaaucag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1767 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1767 cacaggcucc aggaaggguu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1768 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1768 uugcuuuuau cacaggcucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1769 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1769 uuuuaucaca ggcuccagga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1770 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1770 acugcugaaa gagaugcggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1771 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1771 ugcggugggg agauauguag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1772 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1772 gaaacaauga ggaccugacu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1773 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1773 guaagcauuu aaguggcuac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1774 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1774 aggcaccuca gacucagcau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1775 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1775 augguauggg agguauacua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1776 <400> 1776 000 <210> 1777 <400> 1777 000 <210> 1778 <400> 1778 000 <210> 1779 <400> 1779 000 <210> 1780 <400> 1780 000 <210> 1781 <400> 1781 000 <210> 1782 <400> 1782 000 <210> 1783 <400> 1783 000 <210> 1784 <400> 1784 000 <210> 1785 <400> 1785 000 <210> 1786 <400> 1786 000 <210> 1787 <400> 1787 000 <210> 1788 <400> 1788 000 <210> 1789 <400> 1789 000 <210> 1790 <400> 1790 000 <210> 1791 <400> 1791 000 <210> 1792 <400> 1792 000 <210> 1793 <400> 1793 000 <210> 1794 <400> 1794 000 <210> 1795 <400> 1795 000 <210> 1796 <400> 1796 000 <210> 1797 <400> 1797 000 <210> 1798 <400> 1798 000 <210> 1799 <400> 1799 000 <210> 1800 <400> 1800 000 <210> 1801 <400> 1801 000 <210> 1802 <400> 1802 000 <210> 1803 <400> 1803 000 <210> 1804 <400> 1804 000 <210> 1805 <400> 1805 000 <210> 1806 <400> 1806 000 <210> 1807 <400> 1807 000 <210> 1808 <400> 1808 000 <210> 1809 <400> 1809 000 <210> 1810 <400> 1810 000 <210> 1811 <400> 1811 000 <210> 1812 <400> 1812 000 <210> 1813 <400> 1813 000 <210> 1814 <400> 1814 000 <210> 1815 <400> 1815 000 <210> 1816 <400> 1816 000 <210> 1817 <400> 1817 000 <210> 1818 <400> 1818 000 <210> 1819 <400> 1819 000 <210> 1820 <400> 1820 000 <210> 1821 <400> 1821 000 <210> 1822 <400> 1822 000 <210> 1823 <400> 1823 000 <210> 1824 <400> 1824 000 <210> 1825 <400> 1825 000 <210> 1826 <400> 1826 000 <210> 1827 <400> 1827 000 <210> 1828 <400> 1828 000 <210> 1829 <400> 1829 000 <210> 1830 <400> 1830 000 <210> 1831 <400> 1831 000 <210> 1832 <400> 1832 000 <210> 1833 <400> 1833 000 <210> 1834 <400> 1834 000 <210> 1835 <400> 1835 000 <210> 1836 <400> 1836 000 <210> 1837 <400> 1837 000 <210> 1838 <400> 1838 000 <210> 1839 <400> 1839 000 <210> 1840 <400> 1840 000 <210> 1841 <400> 1841 000 <210> 1842 <400> 1842 000 <210> 1843 <400> 1843 000 <210> 1844 <400> 1844 000 <210> 1845 <400> 1845 000 <210> 1846 <400> 1846 000 <210> 1847 <400> 1847 000 <210> 1848 <400> 1848 000 <210> 1849 <400> 1849 000 <210> 1850 <400> 1850 000 <210> 1851 <400> 1851 000 <210> 1852 <400> 1852 000 <210> 1853 <400> 1853 000 <210> 1854 <400> 1854 000 <210> 1855 <400> 1855 000 <210> 1856 <400> 1856 000 <210> 1857 <400> 1857 000 <210> 1858 <400> 1858 000 <210> 1859 <400> 1859 000 <210> 1860 <400> 1860 000 <210> 1861 <400> 1861 000 <210> 1862 <400> 1862 000 <210> 1863 <400> 1863 000 <210> 1864 <400> 1864 000 <210> 1865 <400> 1865 000 <210> 1866 <400> 1866 000 <210> 1867 <400> 1867 000 <210> 1868 <400> 1868 000 <210> 1869 <400> 1869 000 <210> 1870 <400> 1870 000 <210> 1871 <400> 1871 000 <210> 1872 <400> 1872 000 <210> 1873 <400> 1873 000 <210> 1874 <400> 1874 000 <210> 1875 <400> 1875 000 <210> 1876 <400> 1876 000 <210> 1877 <400> 1877 000 <210> 1878 <400> 1878 000 <210> 1879 <400> 1879 000 <210> 1880 <400> 1880 000 <210> 1881 <400> 1881 000 <210> 1882 <400> 1882 000 <210> 1883 <400> 1883 000 <210> 1884 <400> 1884 000 <210> 1885 <400> 1885 000 <210> 1886 <400> 1886 000 <210> 1887 <400> 1887 000 <210> 1888 <400> 1888 000 <210> 1889 <400> 1889 000 <210> 1890 <400> 1890 000 <210> 1891 <400> 1891 000 <210> 1892 <400> 1892 000 <210> 1893 <400> 1893 000 <210> 1894 <400> 1894 000 <210> 1895 <400> 1895 000 <210> 1896 <400> 1896 000 <210> 1897 <400> 1897 000 <210> 1898 <400> 1898 000 <210> 1899 <400> 1899 000 <210> 1900 <400> 1900 000 <210> 1901 <400> 1901 000 <210> 1902 <400> 1902 000 <210> 1903 <400> 1903 000 <210> 1904 <400> 1904 000 <210> 1905 <400> 1905 000 <210> 1906 <400> 1906 000 <210> 1907 <400> 1907 000 <210> 1908 <400> 1908 000 <210> 1909 <400> 1909 000 <210> 1910 <400> 1910 000 <210> 1911 <400> 1911 000 <210> 1912 <400> 1912 000 <210> 1913 <400> 1913 000 <210> 1914 <400> 1914 000 <210> 1915 <400> 1915 000 <210> 1916 <400> 1916 000 <210> 1917 <400> 1917 000 <210> 1918 <400> 1918 000 <210> 1919 <400> 1919 000 <210> 1920 <400> 1920 000 <210> 1921 <400> 1921 000 <210> 1922 <400> 1922 000 <210> 1923 <400> 1923 000 <210> 1924 <400> 1924 000 <210> 1925 <400> 1925 000 <210> 1926 <400> 1926 000 <210> 1927 <400> 1927 000 <210> 1928 <400> 1928 000 <210> 1929 <400> 1929 000 <210> 1930 <400> 1930 000 <210> 1931 <400> 1931 000 <210> 1932 <400> 1932 000 <210> 1933 <400> 1933 000 <210> 1934 <400> 1934 000 <210> 1935 <400> 1935 000 <210> 1936 <400> 1936 000 <210> 1937 <400> 1937 000 <210> 1938 <400> 1938 000 <210> 1939 <400> 1939 000 <210> 1940 <400> 1940 000 <210> 1941 <400> 1941 000 <210> 1942 <400> 1942 000 <210> 1943 <400> 1943 000 <210> 1944 <400> 1944 000 <210> 1945 <400> 1945 000 <210> 1946 <400> 1946 000 <210> 1947 <400> 1947 000 <210> 1948 <400> 1948 000 <210> 1949 <400> 1949 000 <210> 1950 <400> 1950 000 <210> 1951 <400> 1951 000 <210> 1952 <400> 1952 000 <210> 1953 <400> 1953 000 <210> 1954 <400> 1954 000 <210> 1955 <400> 1955 000 <210> 1956 <400> 1956 000 <210> 1957 <400> 1957 000 <210> 1958 <400> 1958 000 <210> 1959 <400> 1959 000 <210> 1960 <400> 1960 000 <210> 1961 <400> 1961 000 <210> 1962 <400> 1962 000 <210> 1963 <400> 1963 000 <210> 1964 <400> 1964 000 <210> 1965 <400> 1965 000 <210> 1966 <400> 1966 000 <210> 1967 <400> 1967 000 <210> 1968 <400> 1968 000 <210> 1969 <400> 1969 000 <210> 1970 <400> 1970 000 <210> 1971 <400> 1971 000 <210> 1972 <400> 1972 000 <210> 1973 <400> 1973 000 <210> 1974 <400> 1974 000 <210> 1975 <400> 1975 000 <210> 1976 <400> 1976 000 <210> 1977 <400> 1977 000 <210> 1978 <400> 1978 000 <210> 1979 <400> 1979 000 <210> 1980 <400> 1980 000 <210> 1981 <400> 1981 000 <210> 1982 <400> 1982 000 <210> 1983 <400> 1983 000 <210> 1984 <400> 1984 000 <210> 1985 <400> 1985 000 <210> 1986 <400> 1986 000 <210> 1987 <400> 1987 000 <210> 1988 <400> 1988 000 <210> 1989 <400> 1989 000 <210> 1990 <400> 1990 000 <210> 1991 <400> 1991 000 <210> 1992 <400> 1992 000 <210> 1993 <400> 1993 000 <210> 1994 <400> 1994 000 <210> 1995 <400> 1995 000 <210> 1996 <400> 1996 000 <210> 1997 <400> 1997 000 <210> 1998 <400> 1998 000 <210> 1999 <400> 1999 000 <210> 2000 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2000 gtgccagatg aacttcccat gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat 60 aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 110 <210> 2001 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2001 agctccaaac tctcaaacca caggg 25 <210> 2002 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2002 tacaattttg ggagtccaca cggca 25 <210> 2003 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2003 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2004 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2004 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2005 <211> 835 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2005 Met Ser Arg Arg Lys Gln Gly Lys Pro Gln His Leu Ser Lys Arg Glu 1 5 10 15 Phe Ser Pro Glu Pro Leu Glu Ala Ile Leu Thr Asp Asp Glu Pro Asp 20 25 30 His Gly Pro Leu Gly Ala Pro Glu Gly Asp His Asp Leu Leu Thr Cys 35 40 45 Gly Gln Cys Gln Met Asn Phe Pro Leu Gly Asp Ile Leu Ile Phe Ile 50 55 60 Glu His Lys Arg Lys Gln Cys Asn Gly Ser Leu Cys Leu Glu Lys Ala 65 70 75 80 Val Asp Lys Pro Pro Ser Pro Ser Pro Ile Glu Met Lys Lys Ala Ser 85 90 95 Asn Pro Val Glu Val Gly Ile Gln Val Thr Pro Glu Asp Asp Asp Cys 100 105 110 Leu Ser Thr Ser Ser Arg Gly Ile Cys Pro Lys Gln Glu His Ile Ala 115 120 125 Asp Lys Leu Leu His Trp Arg Gly Leu Ser Ser Pro Arg Ser Ala His 130 135 140 Gly Ala Leu Ile Pro Thr Pro Gly Met Ser Ala Glu Tyr Ala Pro Gln 145 150 155 160 Gly Ile Cys Lys Asp Glu Pro Ser Ser Tyr Thr Cys Thr Thr Cys Lys 165 170 175 Gln Pro Phe Thr Ser Ala Trp Phe Leu Leu Gln His Ala Gln Asn Thr 180 185 190 His Gly Leu Arg Ile Tyr Leu Glu Ser Glu His Gly Ser Pro Leu Thr 195 200 205 Pro Arg Val Gly Ile Pro Ser Gly Leu Gly Ala Glu Cys Pro Ser Gln 210 215 220 Pro Pro Leu His Gly Ile His Ile Ala Asp Asn Asn Pro Phe Asn Leu 225 230 235 240 Leu Arg Ile Pro Gly Ser Val Ser Arg Glu Ala Ser Gly Leu Ala Glu 245 250 255 Gly Arg Phe Pro Pro Thr Pro Pro Leu Phe Ser Pro Pro Pro Arg His 260 265 270 His Leu Asp Pro His Arg Ile Glu Arg Leu Gly Ala Glu Glu Met Ala 275 280 285 Leu Ala Thr His His Pro Ser Ala Phe Asp Arg Val Leu Arg Leu Asn 290 295 300 Pro Met Ala Met Glu Pro Pro Ala Met Asp Phe Ser Arg Arg Leu Arg 305 310 315 320 Glu Leu Ala Gly Asn Thr Ser Ser Pro Pro Leu Ser Pro Gly Arg Pro 325 330 335 Ser Pro Met Gln Arg Leu Leu Gln Pro Phe Gln Pro Gly Ser Lys Pro 340 345 350 Pro Phe Leu Ala Thr Pro Pro Leu Pro Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro 355 360 365 Pro Ser Gln Pro Pro Val Lys Ser Lys Ser Cys Glu Phe Cys Gly Lys 370 375 380 Thr Phe Lys Phe Gln Ser Asn Leu Val Val His Arg Arg Ser His Thr 385 390 395 400 Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Asn Leu Cys Asp His Ala Cys Thr Gln 405 410 415 Ala Ser Lys Leu Lys Arg His Met Lys Thr His Met His Lys Ser Ser 420 425 430 Pro Met Thr Val Lys Ser Asp Asp Gly Leu Ser Thr Ala Ser Ser Pro 435 440 445 Glu Pro Gly Thr Ser Asp Leu Val Gly Ser Ala Ser Ser Ala Leu Lys 450 455 460 Ser Val Val Ala Lys Phe Lys Ser Glu Asn Asp Pro Asn Leu Ile Pro 465 470 475 480 Glu Asn Gly Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu 485 490 495 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Leu Thr Glu Ser Glu Arg Val Asp 500 505 510 Tyr Gly Phe Gly Leu Ser Leu Glu Ala Ala Arg His His Glu Asn Ser 515 520 525 Ser Arg Gly Ala Val Val Gly Val Gly Asp Glu Ser Arg Ala Leu Pro 530 535 540 Asp Val Met Gln Gly Met Val Leu Ser Ser Met Gln His Phe Ser Glu 545 550 555 560 Ala Phe His Gln Val Leu Gly Glu Lys His Lys Arg Gly His Leu Ala 565 570 575 Glu Ala Glu Gly His Arg Asp Thr Cys Asp Glu Asp Ser Val Ala Gly 580 585 590 Glu Ser Asp Arg Ile Asp Asp Gly Thr Val Asn Gly Arg Gly Cys Ser 595 600 605 Pro Gly Glu Ser Ala Ser Gly Gly Leu Ser Lys Lys Leu Leu Leu Gly 610 615 620 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Pro Phe Ser Lys Arg Ile Lys Leu Glu Lys 625 630 635 640 Glu Phe Asp Leu Pro Pro Ala Ala Met Pro Asn Thr Glu Asn Val Tyr 645 650 655 Ser Gln Trp Leu Ala Gly Tyr Ala Ala Ser Arg Gln Leu Lys Asp Pro 660 665 670 Phe Leu Ser Phe Gly Asp Ser Arg Gln Ser Pro Phe Ala Ser Ser Ser 675 680 685 Glu His Ser Ser Glu Asn Gly Ser Leu Arg Phe Ser Thr Pro Pro Gly 690 695 700 Glu Leu Asp Gly Gly Ile Ser Gly Arg Ser Gly Thr Gly Ser Gly Gly 705 710 715 720 Ser Thr Pro His Ile Ser Gly Pro Gly Pro Gly Arg Pro Ser Ser Lys 725 730 735 Glu Gly Arg Arg Ser Asp Thr Cys Glu Tyr Cys Gly Lys Val Phe Lys 740 745 750 Asn Cys Ser Asn Leu Thr Val His Arg Arg Ser His Thr Gly Glu Arg 755 760 765 Pro Tyr Lys Cys Glu Leu Cys Asn Tyr Ala Cys Ala Gln Ser Ser Lys 770 775 780 Leu Thr Arg His Met Lys Thr His Gly Gln Val Gly Lys Asp Val Tyr 785 790 795 800 Lys Cys Glu Ile Cys Lys Met Pro Phe Ser Val Tyr Ser Thr Leu Glu 805 810 815 Lys His Met Lys Lys Trp His Ser Asp Arg Val Leu Asn Asn Asp Ile 820 825 830 Lys Thr Glu 835 <210> 2006 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> /note="This sequence may encompass 1-10 nucleotides" <400> 2006 uuuuuuuuuu 10 <210> 2007 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> /note="This sequence may encompass 1-10 nucleotides" <400> 2007 aaaaaaaaaa 10 <210> 2008 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2008 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2009 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2009 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2010 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2010 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 2011 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2011 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 2012 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2012 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 2013 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2013 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2014 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2014 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2015 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2015 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2016 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2016 gugccagaug aacuucccau 20 <210> 2017 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2017 cacaaacgga aacaaugcaa 20 <210> 2018 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2018 gcttggctac agcacctctg a 21 <210> 2019 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2019 ggcatggggt tgagatgtgc t 21 <210> 2020 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2020 tcagtgagat gagatatcaa 20 <210> 2021 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2021 cagtgagatg agatatcaaa 20 <210> 2022 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2022 tgtaactaat aaataccagg 20 <210> 2023 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2023 ttagggtggg ggcgtgggtg 20 <210> 2024 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2024 attagggtgg gggcgtgggt 20 <210> 2025 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2025 cacgccccca ccctaatcag 20 <210> 2026 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2026 tctgattagg gtgggggcgt 20 <210> 2027 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2027 ttggcctctg attagggtgg 20 <210> 2028 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2028 tttggcctct gattagggtg 20 <210> 2029 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2029 gtttggcctc tgattagggt 20 <210> 2030 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2030 ggtttggcct ctgattaggg 20 <210> 2031 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2031 aagggtttgg cctctgatta 20 <210> 2032 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2032 gaagggtttg gcctctgatt 20 <210> 2033 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2033 atcagaggcc aaacccttcc 20 <210> 2034 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2034 cacaggctcc aggaagggtt 20 <210> 2035 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2035 tttatcacag gctccaggaa 20 <210> 2036 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2036 ttttatcaca ggctccagga 20 <210> 2037 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2037 ttgcttttat cacaggctcc 20 <210> 2038 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2038 ctaacagttg cttttatcac 20 <210> 2039 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2039 ctaacagttg cttttatcac agg 23 <210> 2040 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2040 tagtgcaagc taacaggctc caggaagggt ttggcctctg attag 45 <210> 2041 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2041 tagtgcaagc taacagttgc ttttattcac aggctccagg aagggtttgg cctctgatta 60 g 61 <210> 2042 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2042 tagtgcaagc taacagttgc tccaggaagg gtttggcctc tgattag 47 <210> 2043 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2043 tagtgcaagc taacagttgc ttttatcagg ctccaggaag ggtttggcct ctgattag 58 <210> 2044 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2044 tagtgcaagc taacagttgc ttttacacag gctccaggaa gggtttggcc tctgattag 59 <210> 2045 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2045 tagtgcaagc taacagttgc ttttcacagg ctccaggaag ggtttggcct ctgattag 58 <210> 2046 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2046 tagtgcaagc tccaggaagg gtttggcctc tgattag 37 <210> 2047 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2047 atcagaggcc aaacccttcc acc 23 <210> 2048 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2048 agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggagggtttg gcctctgatt agggtgggg 59 <210> 2049 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2049 agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggtttggcct ctgattaggg tgggg 55 <210> 2050 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2050 agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaaagggtt tggcctctga ttagggtggg 60 g 61 <210> 2051 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2051 agctaacagt tgcttttatc acaggctcca gggtttggcc tctgattagg gtgggg 56 <210> 2052 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2052 agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaggtttgg cctctgatta gggtgggg 58 <210> 2053 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2053 agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggagggtttg gcctctgatt agggtgggg 59 <210> 2054 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2054 agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaaggtttg gcctctgatt agggtgggg 59 <210> 2055 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2055 agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaaagggtt tggcctctga ttagggtggg 60 g 61 <210> 2056 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2056 agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaggtttgg cctctgatta gggtgggg 58 <210> 2057 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2057 agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagtttgg cctctgatta gggtgggg 58 <210> 2058 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2058 agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggcctctgat tagggtgggg 50 <210> 2059 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2059 agctaacagt tgcttttatc acaggcctct gattagggtg ggg 43 <210> 2060 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2060 agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggagtttggc ctctgattag ggtgggg 57 <210> 2061 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2061 ttgcttttat cacaggctcc agg 23 <210> 2062 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2062 agctaacagt tgcttttatc acaggaaggg tttggcctct gattagggtg ggg 53 <210> 2063 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2063 agctaacagt tgcttttatc acaggcttcc aggaagggtt tggcctctga ttagggtggg 60 g 61 <210> 2064 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2064 agctaacagt tgcttttatc caggaagggt ttggcctctg attagggtgg gg 52 <210> 2065 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2065 agctaacagt tgcttttatc acaggcctcc aggaagggtt tggcctctga ttagggtggg 60 g 61 <210> 2066 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2066 agctaacagt tgcttttatc acaggcccag gaagggtttg gcctctgatt agggtgggg 59 <210> 2067 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2067 agctaacagt tgcttttatc acaggccagg aagggtttgg cctctgatta gggtgggg 58 <210> 2068 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2068 agctaacagt tgcttttatc acaggaaggg tttggcctct gattagggtg ggg 53 <210> 2069 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2069 agctaacagt tgcttttatc acaggcttcc aggaagggtt tggcctctga ttagggtggg 60 g 61 <210> 2070 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2070 agctaacagt tgcttttatc caggaagggt ttggcctctg attagggtgg gg 52 <210> 2071 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2071 agctaacagt tgcttttatc acaggcctcc aggaagggtt tggcctctga ttagggtggg 60 g 61 <210> 2072 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2072 agctaacagt tgcttttatc acaggaaggg tttggcctct gattagggtg ggg 53 <210> 2073 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2073 agctaacagt tgcttttatc caggaagggt ttggcctctg attagggtgg gg 52 <210> 2074 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2074 agctaacagt tgcttttatc acaggcttcc aggaagggtt tggcctctga ttagggtggg 60 g 61 <210> 2075 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2075 agctaacagt gattagggtg ggg 23 <210> 2076 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2076 agctaacagt tgcttttatc acaggcccag gaagggtttg gcctctgatt agggtgggg 59 <210> 2077 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2077 agctaacagt tgcttttatc acaggaaggg tttggcctct gattagggtg ggg 53 <210> 2078 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2078 agctaacagt tgcttttatc caggaagggt ttggcctctg attagggtgg gg 52 <210> 2079 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2079 agctaacagt tgcttttatc acaggcttcc aggaagggtt tggcctctga ttagggtggg 60 g 61 <210> 2080 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2080 agctaacagt tgcttttatc acaggcctcc aggaagggtt tggcctctga ttagggtggg 60 g 61 <210> 2081 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2081 agctaacagt tgcttttatc acaggcgaag ggtttggcct ctgattaggg tgggg 55 <210> 2082 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2082 ttttatcaca ggctccagga agg 23 <210> 2083 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2083 aacagttgct tttatcacag gctccaagga agggtttggc ctctgattag ggtgggggcg 60 t 61 <210> 2084 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2084 aacagttgct tttatcacag gcctctgatt agggtggggg cgt 43 <210> 2085 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2085 aacagttgct tttatcacag ggtttggcct ctgattaggg tgggggcgt 49 <210> 2086 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2086 aacagttgct tttatcacag gaagggtttg gcctctgatt agggtggggg cgt 53 <210> 2087 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2087 aacagttgct tttggtgggg gcgt 24 <210> 2088 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2088 aacagttgct tttatcacag gctccaagga agggtttggc ctctgattag ggtgggggcg 60 t 61 <210> 2089 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2089 aacagttgct tttatcacag ggtttggcct ctgattaggg tgggggcgt 49 <210> 2090 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2090 aacagttgct tttatcacag gaagggtttg gcctctgatt agggtggggg cgt 53 <210> 2091 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2091 aacagttgct tttatcacag gcctctgatt agggtggggg cgt 43 <210> 2092 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2092 aacagttgct tttatcacag gcttggcctc tgattagggt gggggcgt 48 <210> 2093 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2093 aacagttgct tttatcacag gctccggaag ggtttggcct ctgattaggg tgggggcgt 59 <210> 2094 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2094 tttatcacag gctccaggaa ggg 23 <210> 2095 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2095 acagttgctt ttatcacagg ctccagaagg gtttggcctc tgattagggt gggggcgtg 59 <210> 2096 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2096 acagttgctt ttatcacagg gtttggcctc tgattagggt gggggcgtg 49 <210> 2097 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2097 acagttgctt ttatcacagg ctccagggaa gggtttggcc tctgattagg gtgggggcgt 60 g 61 <210> 2098 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2098 acagttgctt ttatcacagg cctctgatta gggtgggggc gtg 43 <210> 2099 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2099 acagttgctt ttgggggcgt g 21 <210> 2100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2100 acagttgctt tgggggcgtg 20 <210> 2101 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2101 acagttgctt ttatcacagg ctccagaagg gtttggcctc tgattagggt gggggcgtg 59 <210> 2102 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2102 acagttgctt ttatcacagg gtttggcctc tgattagggt gggggcgtg 49 <210> 2103 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2103 acagttgctt ttatcacagg ctccagggaa gggtttggcc tctgattagg gtgggggcgt 60 g 61 <210> 2104 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2104 acagttgctt ttatcacagg ctccagataa ggtgggggcg tg 42 <210> 2105 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2105 acagttgctt ttatcacagg cctctgatta gggtgggggc gtg 43 <210> 2106 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2106 acagttgctt ttatcacagg ctccagggtt tggcctctga ttagggtggg ggcgtg 56 <210> 2107 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2107 acagttgctt ttatcacagg ctccagcgaa gggtttggcc tctgattagg gtgggggcgt 60 g 61 <210> 2108 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2108 acagttgctt ttatcacagg ctccggaagg gtttggcctc tgattagggt gggggcgtg 59 <210> 2109 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2109 cacaggctcc aggaagggtt tgg 23 <210> 2110 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2110 tgcttttatc acaggctcca ggaaggtttg gcctctgatt agggtggggg cgtgggtgg 59 <210> 2111 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2111 tgcttttatc acaggcctgg ggcgtgggtg g 31 <210> 2112 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2112 tgcttttatc acaggcgtgg gtgg 24 <210> 2113 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2113 tgcttttatc acaggcctct gattagggtg ggggcgtggg tgg 43 <210> 2114 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2114 tgcttttatc acaggctcca ggaaggcctc tgattagggt gggggcgtgg gtgg 54 <210> 2115 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2115 tgcttttatc acaggctcca ggagggtttg gcctctgatt agggtggggg cgtgggtgg 59 <210> 2116 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2116 tgcttttatc acaggctcca ggaaggtttg gcctctgatt agggtggggg cgtgggtgg 59 <210> 2117 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2117 tgcttttatc acaggcctct gattagggtg ggggcgtggg tgg 43 <210> 2118 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2118 tgcttttatc acaggctcca ggaaagggtt tggcctctga ttagggtggg ggcgtgggtg 60 g 61 <210> 2119 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2119 tgcttttatc acaggctcca gggcgtgggt gg 32 <210> 2120 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2120 tgcttttatc acaggctcca ggtttggcct ctgattaggg tgggggcgtg ggtgg 55 <210> 2121 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2121 tgcttttatc acaggcgtgg gtgg 24 <210> 2122 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2122 tgcttttatc acaggctcca ggaagtttgg cctctgatta gggtgggggc gtgggtgg 58 <210> 2123 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2123 tgcttttatc acaggctcca ggaaggtccg tttgcgtggg tgg 43 <210> 2124 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2124 cacgccccca ccctaatcag agg 23 <210> 2125 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2125 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcgtg ggtggggtag a 41 <210> 2126 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2126 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgaattaggg tgggggcgtg ggtggggtag 60 a 61 <210> 2127 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2127 tatcacaggc tccaggaagg gcgtgggtgg ggtaga 36 <210> 2128 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2128 tatcacaggc tccaggaagg gggcgtgggt ggggtaga 38 <210> 2129 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2129 tatcacaggc tccaggaagg gtttgggcgt gggtggggta ga 42 <210> 2130 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2130 tatcacaggc tccaggaagg gtttgggtgg ggtaga 36 <210> 2131 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2131 tatcacaggc tccaggggcg tgggtggggt aga 33 <210> 2132 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2132 gaagggtttg gcctctgatt agg 23 <210> 2133 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2133 aggctccagg aagggtttgg cgtgggtggg gtagaagagg a 41 <210> 2134 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2134 aggctccagg aagggtttgg gcgtgggtgg ggtagaagag ga 42 <210> 2135 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2135 aggctccagg ggcgtgggtg gggtagaaga gga 33 <210> 2136 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2136 aggctccagg aagggtgggg tagaagagga 30 <210> 2137 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2137 aggctccagg aagggtttgg cctctggcgt gggtggggta gaagagga 48 <210> 2138 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2138 aggctccagg aagggcgtgg gtggggtaga agagga 36 <210> 2139 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2139 aggctccagg aagggtttgg cctctgcgta gaagagga 38 <210> 2140 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2140 aggctccagg aagggttggg tggggtagaa gagga 35 <210> 2141 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2141 aggctccagg aagggtttgg cgtgggtggg gtagaagagg a 41 <210> 2142 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2142 aggctccagg aagggtttgg gcgtgggtgg ggtagaagag ga 42 <210> 2143 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2143 aggctccagg aagggtgggg tagaagagga 30 <210> 2144 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2144 aggctccagg aagggtttgg ggtagaagag ga 32 <210> 2145 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2145 aggctccagg aagggggcgt gggtggggta gaagagga 38 <210> 2146 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2146 aggctccagg cgtgggtggg gtagaagagg a 31 <210> 2147 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2147 aggctccagg aagggcgtgg gtggggtaga agagga 36 <210> 2148 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2148 aggctccagg gtagaagagg a 21 <210> 2149 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2149 aggctccagg aagggtttgg gtggggtaga agagga 36 <210> 2150 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2150 aagggtttgg cctctgatta ggg 23 <210> 2151 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2151 ggctccagga agggtttggc ctctgattcc ccattgtggg ggcgtgggtg gggtagaaga 60 ggac 64 <210> 2152 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2152 ggctccagga agggtttggt ggggtagaag aggac 35 <210> 2153 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2153 ggctccagga agggtttggc gtgggtgggg tagaagagga c 41 <210> 2154 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2154 ggctccagga agggcgtggg tggggtagaa gaggac 36 <210> 2155 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2155 ggctccagga agggtttggg tggggtagaa gaggac 36 <210> 2156 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2156 ggctccagga agggtttggc ctctgagggc gtgggtgggg tagaagagga c 51 <210> 2157 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2157 ggctccagga agggtttggc cgtgggtggg gtagaagagg ac 42 <210> 2158 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2158 ggctccagga agggtttggc ctctgaatta gggtgggggc gtgggtgggg tagaagagga 60 c 61 <210> 2159 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2159 ggctccagga agggtttgcg tgggtggggt agaagaggac 40 <210> 2160 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2160 ggctccagga agggtttggg gtagaagagg ac 32 <210> 2161 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2161 ggctccagga agggtgggtg gggtagaaga ggac 34 <210> 2162 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2162 ggtttggcct ctgattaggg tgg 23 <210> 2163 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2163 tccaggaagg gtttggcgtg ggtggggtag aagaggactg g 41 <210> 2164 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2164 tccaggaagg gtggggtaga agaggactgg 30 <210> 2165 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2165 tccaggaagg gtttggcctc tgattaggtg ggggcgtggg tggggtagaa gaggactgg 59 <210> 2166 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2166 tccaggaagg gtagaagagg actgg 25 <210> 2167 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2167 tccaggaagg gggcgtgggt ggggtagaag aggactgg 38 <210> 2168 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2168 tccaggaagg gcgtgggtgg ggtagaagag gactgg 36 <210> 2169 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2169 tccaggaagg gtttgggtgg ggtagaagag gactgg 36 <210> 2170 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2170 tccaggaagg gtttggcctc tgattgggtg ggggcgtggg tggggtagaa gaggactgg 59 <210> 2171 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2171 tccaggaagg gtttggcgtg ggtggggtag aagaggactg g 41 <210> 2172 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2172 tccaggaagg gggcgtgggt ggggtagaag aggactgg 38 <210> 2173 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2173 tccaggaagg gtttgggtgg ggtagaagag gactgg 36 <210> 2174 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2174 tccaggaagg gtttggcctc tgattaggtg ggggcgtggg tggggtagaa gaggactgg 59 <210> 2175 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2175 tccaggaagg gttggggtag aagaggactg g 31 <210> 2176 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2176 tccaggaagg gtttggcctg ggtggggtag aagaggactg g 41 <210> 2177 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2177 tccaggaagg gtttggtaga agaggactgg 30 <210> 2178 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2178 gtttggcctc tgattagggt ggg 23 <210> 2179 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2179 ccaggaaggg tttggcctct gattaggtgg gggcgtgggt ggggtagaag aggactggc 59 <210> 2180 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2180 ccaggaaggg tttggcgtgg gtggggtaga agaggactgg c 41 <210> 2181 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2181 ccaggaaggg tttggcctct gattggtggg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggc 58 <210> 2182 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2182 ccaggaaggg cgtgggtggg gtagaagagg actggc 36 <210> 2183 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2183 ccaggaaggg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggc 38 <210> 2184 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2184 ccaggaaggg tttgggtggg gtagaagagg actggc 36 <210> 2185 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2185 ccaggaaggg tttggcctct gaggtggggg cgtgggtggg gtagaagagg actggc 56 <210> 2186 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2186 ccaggaaggg tttggcctct gattaggtgg gggcgtgggt ggggtagaag aggactggc 59 <210> 2187 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2187 ccaggaaggg tttggcgtgg gtggggtaga agaggactgg c 41 <210> 2188 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2188 ccaggaaggg tttgggtggg gtagaagagg actggc 36 <210> 2189 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2189 ccaggaaggg tttggcctct gattggtggg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggc 58 <210> 2190 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2190 ccaggaaggg tttggcctct gattaggggc gtgggtgggg tagaagagga ctggc 55 <210> 2191 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2191 ccaggaaggg cgtgggtggg gtagaagagg actggc 36 <210> 2192 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2192 ccaggaaggg tttggcctct gattagaggt gggggcgtgg gtggggtaga agaggactgg 60 c 61 <210> 2193 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2193 ccaggaaggg tttggcctct gattaggtgg gggcgtgggt ggggtagaag aggactggc 59 <210> 2194 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2194 ccaggaaggg tttggcctct gattggtggg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggc 58 <210> 2195 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2195 ccaggaaggg tttgggtggg gtagaagagg actggc 36 <210> 2196 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2196 ccaggaaggg tttggcgtgg gtggggtaga agaggactgg c 41 <210> 2197 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2197 ccaggaaggg tttgggggcg tgggtggggt agaagaggac tggc 44 <210> 2198 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2198 ccaggaaggg tttggcctct gattagtggg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggc 58 <210> 2199 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2199 ccaggaaggg cgtgggtggg gtagaagagg actggc 36 <210> 2200 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2200 ccaggaaggg tttggcctct gattaggtgg gggcgtgggt ggggtagaag aggactggc 59 <210> 2201 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2201 ccaggaaggg tttggcgtgg gtggggtaga agaggactgg c 41 <210> 2202 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2202 ccaggaaggg tttggcctct gattggtggg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggc 58 <210> 2203 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2203 ccaggaaggg gcgtgggtgg ggtagaagag gactggc 37 <210> 2204 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2204 ccaggaaggg cgtgggtggg gtagaagagg actggc 36 <210> 2205 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2205 ccaggaaggg tttggcctct gattagtggg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggc 58 <210> 2206 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2206 ccaggaaggg tttgggggcg tgggtggggt agaagaggac tggc 44 <210> 2207 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2207 tttggcctct gattagggtg ggg 23 <210> 2208 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2208 caggaagggt ttggcctctg attaggtggg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggca 59 <210> 2209 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2209 caggaagggt ttggcgtggg tggggtagaa gaggactggc a 41 <210> 2210 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2210 caggaagggt ttggcctctg attagtgggg gcgtgggtgg ggtagaagag gactggca 58 <210> 2211 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2211 caggaagggt ttggcctctg attaggggcg tgggtggggt agaagaggac tggca 55 <210> 2212 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2212 caggaagggt ttgggtgggg tagaagagga ctggca 36 <210> 2213 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2213 caggaagggt ttggtggggg cgtgggtggg gtagaagagg actggca 47 <210> 2214 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2214 caggaagggt ttggcctctg tgggggcgtg ggtggggtag aagaggactg gca 53 <210> 2215 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2215 caggaagggt ggggtagaag aggactggca 30 <210> 2216 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2216 caggaagggt ttggcctctg attaggtggg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggca 59 <210> 2217 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2217 caggaagggt ttggcgtggg tggggtagaa gaggactggc a 41 <210> 2218 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2218 caggaagggt ggggtagaag aggactggca 30 <210> 2219 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2219 caggaagggt ttggcctctg attagtgggg gcgtgggtgg ggtagaagag gactggca 58 <210> 2220 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2220 caggaagggt ttggcctctg attagggggc gtgggtgggg tagaagagga ctggca 56 <210> 2221 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2221 caggaagggt ttggcctctg attaggggcg tgggtggggt agaagaggac tggca 55 <210> 2222 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2222 caggaagggt ttggcctctg attaggtggg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggca 59 <210> 2223 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2223 caggaagggt ttggcctctg attagtgggg gcgtgggtgg ggtagaagag gactggca 58 <210> 2224 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2224 caggaagggt ttggcctaag aggactggca 30 <210> 2225 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2225 caggaagggt ttgggaggac tggca 25 <210> 2226 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2226 caggaagggt ttagaagagg actggca 27 <210> 2227 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2227 caggaagggt ttggcctcga ggactggca 29 <210> 2228 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2228 caggaagggt ttggcctctg attagggggc gtgggtgggg tagaagagga ctggca 56 <210> 2229 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2229 caggaagggt ttggcctctg attagggggg cgtgggtggg gtagaagagg actggca 57 <210> 2230 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2230 caggaagggt ttggcctctg attaggtggg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggca 59 <210> 2231 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2231 caggaagggt ttggcgtggg tggggtagaa gaggactggc a 41 <210> 2232 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2232 caggaagggt ttggcctctg attagtgggg gcgtgggtgg ggtagaagag gactggca 58 <210> 2233 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2233 caggaagggt ttggggtaga agaggactgg ca 32 <210> 2234 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2234 caggaagggt ttggcctctg attaggggcg tgggtggggt agaagaggac tggca 55 <210> 2235 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2235 caggaagggt ttggcctctg attagggggc gtgggtgggg tagaagagga ctggca 56 <210> 2236 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2236 caggaagggt ttgggggcgt gggtggggta gaagaggact ggca 44 <210> 2237 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2237 ttggcctctg attagggtgg ggg 23 <210> 2238 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2238 aggaagggtt tggcctctga ttagggggcg tgggtggggt agaagaggac tggcag 56 <210> 2239 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2239 aggaagggtt tggcctctga ttagggcgtg ggtggggtag aagaggactg gcag 54 <210> 2240 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2240 aggaagggtt tggcctctga ttaggggcgt gggtggggta gaagaggact ggcag 55 <210> 2241 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2241 aggaagggtt tggcctctga ttaggtgggg gcgtgggtgg ggtagaagag gactggcag 59 <210> 2242 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2242 aggaagggtt tggcctctga ttagtggggg cgtgggtggg gtagaagagg actggcag 58 <210> 2243 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2243 aggaagggtt tggcctctga ttgggggcgt gggtggggta gaagaggact ggcag 55 <210> 2244 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2244 aggaagggtt tggcctctga ttagggtggg ggcgtgggtg ggtagaagag gactggcag 59 <210> 2245 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2245 tctgattagg gtgggggcgt ggg 23 <210> 2246 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2246 ggtttggcct ctgattaggg tggggtagaa gaggactggc agacctct 48 <210> 2247 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2247 ggtttggcct ctgattaggg tgggggtaga agaggactgg cagacctct 49 <210> 2248 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2248 ggtttggcct ctgattaggg tgggtggggt agaagaggac tggcagacct ct 52 <210> 2249 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2249 ggtttggcct ctgatggggt agaagaggac tggcagacct ct 42 <210> 2250 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2250 ggtttggcct ctgatttact ggcagacctc t 31 <210> 2251 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2251 ggtttggcct ctgattggcc gtgggtgggg tagaagagga ctggcagacc tct 53 <210> 2252 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2252 ggtttggcct ctgattaggg gtagaagagg actggcagac ctct 44 <210> 2253 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2253 ggtttggcct ctgatccaag agcccgtggg tggggtagaa gaggactggc agacctct 58 <210> 2254 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2254 ggtttggcct ctgattaggg tgggggcgtg ggtgggtaga agaggactgg cagacctct 59 <210> 2255 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2255 attagggtgg gggcgtgggt ggg 23 <210> 2256 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2256 tggcctctga ttagggtggg gtagaagagg actggcagac ctctccat 48 <210> 2257 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2257 tggcctctga ttagggtggg ggtagaagag gactggcaga cctctccat 49 <210> 2258 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2258 tggcctctga ttagggtggg ggcgtggtgg ggtagaagag gactggcaga cctctccat 59 <210> 2259 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2259 tggcctctga ttagggtggg ggcgaagagg actggcagac ctctccat 48 <210> 2260 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2260 ttagggtggg ggcgtgggtg ggg 23 <210> 2261 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2261 ggcctctgat tagggtgggg tagaagagga ctggcagacc tctccatc 48 <210> 2262 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2262 ggcctctgat tagggtgggg gcgtggtggg gtagaagagg actggcagac ctctccatc 59 <210> 2263 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2263 ggcctctgat tagggtgggg gtagaagagg actggcagac ctctccatc 49 <210> 2264 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2264 tgtaactaat aaataccagg 20 <210> 2265 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2265 ctgctgaggt gtaactaata aataccggag gcagcatttt agttcacaag ctcggagca 59 <210> 2266 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2266 ctgctgaggt gtaactaata aatacaggag gcagcatttt agttcacaag ctcggagca 59 <210> 2267 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2267 ctgctgaggt gtaactaata aatacccagg aggcagcatt ttagttcaca agctcggagc 60 a 61 <210> 2268 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2268 ctgctgaggt gtaactaata aataccgagg cagcatttta gttcacaagc tcggagca 58 <210> 2269 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2269 ctgctgaggt gtaactaata aatcaggagg cagcatttta gttcacaagc tcggagca 58 <210> 2270 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2270 ctgctgaggt gtaactaata aataggaggc agcattttag ttcacaagct cggagca 57 <210> 2271 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2271 cagtgagatg agatatcaaa ggg 23 <210> 2272 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2272 gggagatgga atgaacactt ttcgtcccct ttggatatct catctcactg agctctgggc 60 c 61 <210> 2273 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2273 gggagatgga atgaacactt ttcgtcccct ttgatctcat ctcactgagc tctgggcc 58 <210> 2274 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2274 gggagatgga atgaacactt ttcgtcccct ttgcatctca ctgagctctg ggcc 54 <210> 2275 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2275 gggagatgga atgaacactt ttcgtcccct ttctcatctc actgagctct gggcc 55 <210> 2276 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2276 gggagatgga atgaacactt ttcgtcccct ttatatctca tctcactgag ctctgggcc 59 <210> 2277 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2277 gggagatgga atgaacactt ttcgtcccct ttgtctcatc tcactgagct ctgggcc 57 <210> 2278 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2278 gggagatgga atgaacactt ttcgtcccct tttatctcat ctcactgagc tctgggcc 58 <210> 2279 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2279 gggagatgga atgaacactt ttcgtcccct ttgtatctca tctcactgag ctctgggcc 59 <210> 2280 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2280 tcagtgagat gagatatcaa agg 23 <210> 2281 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2281 ggagatggaa tgaacacttt tcgtcccctt tgaatatctc atctcactga gctctgggcc 60 g 61 <210> 2282 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2282 ggagatggaa tgaacacttt tcgtcccctt tgaatctcat ctcactgagc tctgggccg 59 <210> 2283 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2283 ggagatggaa tgaacacttt tcgtcccctt tgatctcatc tcactgagct ctgggccg 58 <210> 2284 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2284 ggagatggaa tgaacacttt tcgtcccctt tgtatctcat ctcactgagc tctgggccg 59 <210> 2285 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2285 ggagatggaa tgaacacttt tcgtcccctt atatctcatc tcactgagct ctgggccg 58 <210> 2286 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2286 ggagatggaa tgaacacttt tcgtcccctt tgacatctca ctgagctctg ggccg 55 <210> 2287 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2287 gtgccagatg aacttcccat tgg 23 <210> 2288 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2288 ctgtgggcag tgccagatga acttccattg ggggacattc ttatttttat cgagcacaa 59 <210> 2289 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2289 ctgtgggcag tgccagatga acttcattgg gggacattct tatttttatc gagcacaa 58 <210> 2290 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2290 ctgtgggcag tgccagatga acttccccat tgggggacat tcttattttt atcgagcaca 60 a 61 <210> 2291 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2291 ctgtgggcag tgccagatga acattggggg acattcttat ttttatcgag cacaa 55 <210> 2292 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2292 ctgtgggcag tgccagatga acttccttgg gggacattct tatttttatc gagcacaa 58 <210> 2293 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2293 ctgtgggcag tgccagatga acttccattg ggggacattc ttatttttat cgagcacaa 59 <210> 2294 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2294 ctgtgggcag tgccagatga acttcattgg gggacattct tatttttatc gagcacaa 58 <210> 2295 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2295 ctgtgggcag tgccagatga acttccccat tgggggacat tcttattttt atcgagcaca 60 a 61 <210> 2296 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2296 ctgtgggcag tgccagatga acttccttgg gggacattct tatttttatc gagcacaa 58 <210> 2297 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2297 ctgtgggcag tgccagatga actcattggg ggacattctt atttttatcg agcacaa 57 <210> 2298 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2298 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2299 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2299 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2300 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2300 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2301 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2301 actgttgatt agaggtaggg aaatgatttt aatctgtgac cttgggcaag tagctatcta 60 atgactaaaa tgg 73 <210> 2302 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2302 actgttgatt agaggtaggg aaatgatttt aatctgtgac cttggttgaa tgggcaagta 60 gctatctaat gactaaaatg g 81 <210> 2303 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2303 actgttgatt agaggtaggg aaatgatttt aatctgtgac cttgaatggg caagtagcta 60 tctaatgact aaaatgg 77 <210> 2304 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2304 actgttgatt agaggtaggg aaatgatttt aatctgtgac cttgtgaatg ggcaagtagc 60 tatctaatga ctaaaatgg 79 <210> 2305 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2305 actgttgatt agaggtaggg aaatgatttt aatctgtgaa tgggcaagta gctatctaat 60 gactaaaatg g 71 <210> 2306 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2306 atgggcaagt agctatctaa tgactaaaat ggaagagaaa cagttttagt ataacaagtg 60 aaatacccat 70 <210> 2307 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2307 atgggcaagt agctatctaa tgactaaaat ggaaaaacac tggaagagaa acagttttag 60 tataacaagt gaaataccca t 81 <210> 2308 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2308 atgggcaagt agctatctaa tgactaaaat ggaacactgg aagagaaaca gttttagtat 60 aacaagtgaa atacccat 78 <210> 2309 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2309 atgggcaagt agctatctaa tgactaaaat ggaaaactgg aagagaaaca gttttagtat 60 aacaagtgaa atacccat 78 <210> 2310 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2310 atgggcaagt agctatctaa tgactaaaat ggaaaaccac tggaagagaa acagttttag 60 tataacaagt gaaataccca t 81 <210> 2311 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2311 cactggaaga gaaacagttt tagtataaca agtgaaatac ccatgagtct gaggtgccta 60 taggacatct atataaa 77 <210> 2312 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2312 cactggaaga gaaacagttt tagtataaca agtgaaatac ccatctgagt ctgaggtgcc 60 tataggacat ctatataaa 79 <210> 2313 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2313 cactggaaga gaaacagttt tagtataaca agtgaaatac ccactgagtc tgaggtgcct 60 ataggacatc tatataaa 78 <210> 2314 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2314 cactggaaga gaaacagttt tagtataaca agtgaaatac ccatggagtc tgaggtgcct 60 ataggacatc tatataaa 78 <210> 2315 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2315 cactggaaga gaaacagttt tagtataaca agtgaaatac cctgagtctg aggtgcctat 60 aggacatcta tataaa 76 <210> 2316 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2316 taacaagtga aatacccatg ctgagtctga ggacatctat ataaataagc ccagtacatt 60 gtttgatata 70 <210> 2317 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2317 taacaagtga aatacccatg ctgagtctga ggtgccatag gacatctata taaataagcc 60 cagtacattg tttgatata 79 <210> 2318 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2318 taacaagtga aatacccatg ctgagtctga ggtgccctat aggacatcta tataaataag 60 cccagtacat tgtttgatat a 81 <210> 2319 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2319 taacaagtga aatacccatg ctgagtctga ggtgccttat aggacatcta tataaataag 60 cccagtacat tgtttgatat a 81 <210> 2320 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2320 taacaagtga aatacccatg ctgagtctga ggtgctatag gacatctata taaataagcc 60 cagtacattg tttgatata 79 <210> 2321 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2321 tagtataaca agtgaaatac ccatgctgag tctgaggtgc ctatataaat aagcccagta 60 cattgtttg 69 <210> 2322 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2322 tagtataaca agtgaaatac ccatgctgag tctgaggtgc ctatagacat ctatataaat 60 aagcccagta cattgtttg 79 <210> 2323 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2323 tagtataaca agtgaaatac ccatgctgag tctgaggtgc ctatggacat ctatataaat 60 aagcccagta cattgtttg 79 <210> 2324 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2324 tagtataaca agtgaaatac ccatgctgag tctgaggtgc ctatagggac atctatataa 60 ataagcccag tacattgttt g 81 <210> 2325 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2325 tagtataaca agtgaaatac ccatgctgag tctgaggtgc ctataaggac atctatataa 60 ataagcccag tacattgttt g 81 <210> 2326 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2326 tcagaggtta gaaatcagag ttgggaattg ggattacagg ctgtatttaa gagtttagat 60 ataactgtga atccaaga 78 <210> 2327 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2327 tcagaggtta gaaatcagag ttgggaattg ggattaatac aggctgtatt taagagttta 60 gatataactg tgaatccaag a 81 <210> 2328 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2328 tcagaggtta gaaatcagag ttgggaattg ggatttacag gctgtattta agagtttaga 60 tataactgtg aatccaaga 79 <210> 2329 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2329 tcagaggtta gaaatcagag ttgggaattg ggattattac aggctgtatt taagagttta 60 gatataactg tgaatccaag a 81 <210> 2330 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2330 tcagaggtta gaaatcagag ttgggaattg ggattaaata caggctgtat ttaagagttt 60 agatataact gtgaatccaa ga 82 <210> 2331 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2331 tgtaaggagg atgagccaca tggtatggga ggtatctaag gactctaggg tcagagaaat 60 atgggttata tccttctac 79 <210> 2332 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2332 tgtaaggagg atgagccaca tggtatggga ggactctagg gtcagagaaa tatgggttat 60 atccttctac 70 <210> 2333 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2333 tgtaaggagg atgagccaca tggtatggga ctctagggtc agagaaatat gggttatatc 60 cttctac 67 <210> 2334 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2334 tgtaaggagg atgagccaca tggtatggga ggtataacta aggactctag ggtcagagaa 60 atatgggtta tatccttcta c 81 <210> 2335 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2335 tgtaaggagg atgagccaca tggtatggga ggtaaggact ctagggtcag agaaatatgg 60 gttatatcct tctac 75 <210> 2336 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2336 gatgagccac atggtatggg aggtatacta aggacttcta gggtcagaga aatatgggtt 60 atatccttct acaaaattca c 81 <210> 2337 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2337 gatgagccac atggtatggg aggtatacta gggtcagaga aatatgggtt atatccttct 60 acaaaattca c 71 <210> 2338 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2338 gatgagccac atggtatggg aggtatacta agggtcagag aaatatgggt tatatccttc 60 tacaaaattc ac 72 <210> 2339 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2339 gatgagccac atggtatggg aggtatacta aggactaggg tcagagaaat atgggttata 60 tccttctaca aaattcac 78 <210> 2340 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2340 gatgagccac atggtatggg aggtatacta aggtcagaga aatatgggtt atatccttct 60 acaaaattca c 71 <210> 2341 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2341 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2342 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2342 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2343 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2343 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2344 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2344 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2345 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2345 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2346 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2346 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctaatatctc cccaccgcat 60 ctctttcagc agttgtttc 79 <210> 2347 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2347 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctccc caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2348 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2348 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatctcccc accgcatctc 60 tttcagcagt tgtttc 76 <210> 2349 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2349 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatatctcc ccaccgcatc 60 tctttcagca gttgtttc 78 <210> 2350 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2350 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2351 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2351 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctccc caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2352 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2352 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctaatatctc cccaccgcat 60 ctctttcagc agttgtttc 79 <210> 2353 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2353 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatatctcc ccaccgcatc 60 tctttcagca gttgtttc 78 <210> 2354 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2354 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatctcccc accgcatctc 60 tttcagcagt tgtttc 76 <210> 2355 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2355 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2356 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2356 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcttt cagcagttgt ttctaaaaat 60 atcctcc 67 <210> 2357 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2357 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc acccatctct ttcagcagtt 60 gtttctaaaa atatcctcc 79 <210> 2358 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2358 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accatctctt tcagcagttg 60 tttctaaaaa tatcctcc 78 <210> 2359 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2359 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accggcatct ctttcagcag 60 ttgtttctaa aaatatcctc c 81 <210> 2360 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2360 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc atctctttca gcagttgttt 60 ctaaaaatat cctcc 75 <210> 2361 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2361 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcttt cagcagttgt ttctaaaaat 60 atcctcc 67 <210> 2362 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2362 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc acccatctct ttcagcagtt 60 gtttctaaaa atatcctcc 79 <210> 2363 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2363 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accatctctt tcagcagttg 60 tttctaaaaa tatcctcc 78 <210> 2364 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2364 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accggcatct ctttcagcag 60 ttgtttctaa aaatatcctc c 81 <210> 2365 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2365 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc acgcatctct ttcagcagtt 60 gtttctaaaa atatcctcc 79 <210> 2366 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2366 cctagtttca tttttgcaga agtgttttag gctaattagt ggaatgtatc ttagagttta 60 acttatttgt ttctgtcac 79 <210> 2367 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2367 cctagtttca tttttgcaga agtgttttag gctaatagtg gaatgtatct tagagtttaa 60 cttatttgtt tctgtcac 78 <210> 2368 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2368 cctagtttca tttttgcaga agtgttttag tggaatgtat cttagagttt aacttatttg 60 tttctgtcac 70 <210> 2369 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2369 cctagtttca tttttgcaga agtgttttag gctaataata gtggaatgta tcttagagtt 60 taacttattt gtttctgtca c 81 <210> 2370 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2370 cctagtttca tttttgcaga agtgttttag gctaataagt ggaatgtatc ttagagttta 60 acttatttgt ttctgtcac 79 <210> 2371 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2371 cctagtttca tttttgcaga agtgttttag gctaatagtg gaatgtatct tagagtttaa 60 cttatttgtt tctgtcac 78 <210> 2372 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2372 cctagtttca tttttgcaga agtgttttag gctaattagt ggaatgtatc ttagagttta 60 acttatttgt ttctgtcac 79 <210> 2373 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2373 cctagtttca tttttgcaga agtgttttag tggaatgtat cttagagttt aacttatttg 60 tttctgtcac 70 <210> 2374 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2374 cctagtttca tttttgcaga agtgttttag gctaataagt ggaatgtatc ttagagttta 60 acttatttgt ttctgtcac 79 <210> 2375 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2375 cctagtttca tttttgcaga agtgttttag gaatgtatct tagagtttaa cttatttgtt 60 tctgtcac 68 <210> 2376 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2376 tagagatttt tgtctccaag ggaattttga gaggttgaat ggacaaatct attgctgcag 60 tttaaacttg cttgcttcc 79 <210> 2377 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2377 tagagatttt tgtctccaag ggaattttga gaggttggac aaatctattg ctgcagttta 60 aacttgcttg cttcc 75 <210> 2378 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2378 tagagatttt tgtctccaag ggaattttga atggacaaat ctattgctgc agtttaaact 60 tgcttgcttc c 71 <210> 2379 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2379 tagagatttt tgtctccaag ggaattttga gaggacaaat ctattgctgc agtttaaact 60 tgcttgcttc c 71 <210> 2380 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2380 tagagatttt tgtctccaag ggaattttga gaggttggga atggacaaat ctattgctgc 60 agtttaaact tgcttgcttc c 81 <210> 2381 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2381 tagagatttt tgtctccaag ggaattttga gaggttgaat ggacaaatct attgctgcag 60 tttaaacttg cttgcttcc 79 <210> 2382 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2382 tagagatttt tgtctccaag ggaattttga gaggacaaat ctattgctgc agtttaaact 60 tgcttgcttc c 71 <210> 2383 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2383 tagagatttt tgtctccaag ggaattttga gaggttggac aaatctattg ctgcagttta 60 aacttgcttg cttcc 75 <210> 2384 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2384 tagagatttt tgtctccaag ggaattttga gaggttggga atggacaaat ctattgctgc 60 agtttaaact tgcttgcttc c 81 <210> 2385 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2385 tagagatttt tgtctccaag ggaattttga atggacaaat ctattgctgc agtttaaact 60 tgcttgcttc c 71 <210> 2386 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2386 gagaaaggaa ggaaggaaga ggggaagaga gaggatgaag ggatggagga gaagaaggaa 60 aaataaataa tggagagga 79 <210> 2387 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2387 gagaaaggaa ggaaggaaga ggggaagaga gaggatggag gagaagaagg aaaaataaat 60 aatggagagg a 71 <210> 2388 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2388 gagaaaggaa ggaaggaaga ggggaagaga gagggatgga ggagaagaag gaaaaataaa 60 taatggagag ga 72 <210> 2389 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2389 gagaaaggaa ggaaggaaga ggggaagaga gaggatggga agggatggag gagaagaagg 60 aaaaataaat aatggagagg a 81 <210> 2390 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2390 gagaaaggaa ggaaggaaga ggggaagaga gaggaaggga tggaggagaa gaaggaaaaa 60 taaataatgg agagga 76 <210> 2391 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2391 gagaaaggaa ggaaggaaga ggggaagaga gaggatggag gagaagaagg aaaaataaat 60 aatggagagg a 71 <210> 2392 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2392 gagaaaggaa ggaaggaaga ggggaagaga gaggatgaag ggatggagga gaagaaggaa 60 aaataaataa tggagagga 79 <210> 2393 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2393 gagaaaggaa ggaaggaaga ggggaagaga agggatggag gagaagaagg aaaaataaat 60 aatggagagg a 71 <210> 2394 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2394 gagaaaggaa ggaaggaaga ggggaagaga gaggaaggga tggaggagaa gaaggaaaaa 60 taaataatgg agagga 76 <210> 2395 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2395 gagaaaggaa ggaaggaaga ggggaagaga gagggatgga ggagaagaag gaaaaataaa 60 taatggagag ga 72 <210> 2396 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2396 gagaaagaga aagggaaggg aagagaggaa agaagaagag gagagaaaag aaacgaagag 60 aggggaaggg aaggaaaa 78 <210> 2397 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2397 gagaaagaga aagggaaggg aagagaggaa agaagaggag agaaaagaaa cgaagagagg 60 ggaagggaag gaaaa 75 <210> 2398 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2398 gagaaagaga aagggaaggg aagagaggag agaaaagaaa cgaagagagg ggaagggaag 60 gaaaa 65 <210> 2399 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2399 gagaaagaga aagggaaggg aagagaggaa agaaacgaag agaggggaag ggaaggaaaa 60 <210> 2400 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2400 gagaaagaga aagggaaggg aagagaggaa agaggagaga aaagaaacga agagagggga 60 agggaaggaa aa 72 <210> 2401 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2401 gagaaagaga aagggaaggg aagagaggaa agaagaggag agaaaagaaa cgaagagagg 60 ggaagggaag gaaaa 75 <210> 2402 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2402 gagaaagaga aagggaaggg aagagaggaa agaagaagag gagagaaaag aaacgaagag 60 aggggaaggg aaggaaaa 78 <210> 2403 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2403 gagaaagaga aagggaaggg aagagaggag agaaaagaaa cgaagagagg ggaagggaag 60 gaaaa 65 <210> 2404 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2404 gagaaagaga aagggaaggg aagagaggaa agaagaggaa gaggagagaa aagaaacgaa 60 gagaggggaa gggaaggaaa a 81 <210> 2405 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2405 gagaaagaga aagggaaggg aggagagaaa agaaacgaag agaggggaag ggaaggaaaa 60 <210> 2406 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2406 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaacca cttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2407 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2407 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaggccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2408 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2408 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaagccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2409 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2409 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcagccac ttaaatgctt accaacagta 60 gaattgataa at 72 <210> 2410 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2410 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa ccacttaaat gcttaccaac agtagaattg 60 ataaat 66 <210> 2411 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2411 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaacca cttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2412 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2412 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaggccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2413 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2413 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaagccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2414 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2414 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaaatgctt accaacagta 60 gaattgataa at 72 <210> 2415 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2415 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2416 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2416 aaatgcattt tacagcattt ggttgattaa aagtaaccca gaggtgagtt caaactatat 60 gactttattt gtatatagaa a 81 <210> 2417 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2417 aaatgcattt tacagcattt ggttgattaa aagaggtgag ttcaaactat atgactttat 60 ttgtatatag aaa 73 <210> 2418 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2418 aaatgcattt tacagcattt ggttgattaa aagtaacaga ggtgagttca aactatatga 60 ctttatttgt atatagaaa 79 <210> 2419 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2419 aaatgcattt tacagcattt ggttgattaa aaggtgagtt caaactatat gactttattt 60 gtatatagaa a 71 <210> 2420 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2420 aaatgcattt tacagcattt ggttgagttc aaactatatg actttatttg tatatagaaa 60 <210> 2421 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2421 aaatgcattt tacagcattt ggttgattaa aagtaaccca gaggtgagtt caaactatat 60 gactttattt gtatatagaa a 81 <210> 2422 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2422 aaatgcattt tacagcattt ggttgattaa aagaggtgag ttcaaactat atgactttat 60 ttgtatatag aaa 73 <210> 2423 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2423 aaatgcattt tacagcattt ggttgattaa aagtaacaga ggtgagttca aactatatga 60 ctttatttgt atatagaaa 79 <210> 2424 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2424 aaatgcattt tacagcattt ggttgattaa aaggtgagtt caaactatat gactttattt 60 gtatatagaa a 71 <210> 2425 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2425 aaatgcattt tacagcattt ggttgagttc aaactatatg actttatttg tatatagaaa 60 <210> 2426 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2426 cctggaagcc aacgaaagat attgaataat tcaagaaaag gtggtggcat ggtttgattt 60 gtgtctttaa aagattattc t 81 <210> 2427 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2427 cctggaagcc aacgaaagat attgaataat tcaaggtggt ggcatggttt gatttgtgtc 60 tttaaaagat tattct 76 <210> 2428 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2428 cctggaagcc aacgaaagat attgaataat tcaagaaggt ggtggcatgg tttgatttgt 60 gtctttaaaa gattattct 79 <210> 2429 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2429 cctggaagcc aacgaaagat attgaataat tcaagaggtg gtggcatggt ttgatttgtg 60 tctttaaaag attattct 78 <210> 2430 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2430 cctggaagcc aacgaaagat attgaataat tcaggtggtg gcatggtttg atttgtgtct 60 ttaaaagatt attct 75 <210> 2431 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2431 cctggaagcc aacgaaagat attgaataat tcaagaaaag gtggtggcat ggtttgattt 60 gtgtctttaa aagattattc t 81 <210> 2432 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2432 cctggaagcc aacgaaagat attgaataat tcaaggtggt ggcatggttt gatttgtgtc 60 tttaaaagat tattct 76 <210> 2433 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2433 cctggaagcc aacgaaagat attgaataat tcaagaaggt ggtggcatgg tttgatttgt 60 gtctttaaaa gattattct 79 <210> 2434 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2434 cctggaagcc aacgaaagat attgaataat tcaagaggtg gtggcatggt ttgatttgtg 60 tctttaaaag attattct 78 <210> 2435 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2435 cctggaagcc aacgaaagat attgaataat tcaagaacaa ggtggtggca tggtttgatt 60 tgtgtcttta aaagattatt ct 82 <210> 2436 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2436 ccttggcctc ccaaagtgct gggtttacaa gcctgagcca ggataaggtc taaaagtgga 60 aagaata 67 <210> 2437 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2437 ccttggcctc ccaaagtgct gggtttacaa gcctgagcca cccatccagc caggataagg 60 tctaaaagtg gaaagaata 79 <210> 2438 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2438 ccttggcctc ccaaagtgct gggtttacaa gcctgagcca tccagccagg ataaggtcta 60 aaagtggaaa gaata 75 <210> 2439 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2439 ccttggcctc ccaaagtgct gggtttacaa gcctgagcca ccgatccagc caggataagg 60 tctaaaagtg gaaagaata 79 <210> 2440 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2440 ccttggcctc ccaaagtgct gggtttacaa gcctgagcca ccagccagga taaggtctaa 60 aagtggaaag aata 74 <210> 2441 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2441 ccttggcctc ccaaagtgct gggtttacaa gcctgagcca ggataaggtc taaaagtgga 60 aagaata 67 <210> 2442 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2442 ccttggcctc ccaaagtgct gggtttacaa gcctgagcca cccatccagc caggataagg 60 tctaaaagtg gaaagaata 79 <210> 2443 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2443 ccttggcctc ccaaagtgct gggtttacaa gcctgagcca ccgatccagc caggataagg 60 tctaaaagtg gaaagaata 79 <210> 2444 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2444 ccttggcctc ccaaagtgct gggtttacaa gcctgagcca ccgtccagcc aggataaggt 60 ctaaaagtgg aaagaata 78 <210> 2445 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2445 ccttggcctc ccaaagtgct gggtttacaa gcctgagcca ccagccagga taaggtctaa 60 aagtggaaag aata 74 <210> 2446 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2446 aagtgctggg tttacaagcc tgagccaccg catccagcca ggtctaaaag tggaaagaat 60 agcatctact cttg 74 <210> 2447 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2447 aagtgctggg tttacaagcc tgagccaccg catccagcca ggattaaggt ctaaaagtgg 60 aaagaatagc atctactctt g 81 <210> 2448 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2448 aagtgctggg tttacaagcc tgagccaccg catccagcca ggaataaggt ctaaaagtgg 60 aaagaatagc atctactctt g 81 <210> 2449 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2449 aagtgctggg tttacaagcc tgagccaccg catccagcca ggaaaggtct aaaagtggaa 60 agaatagcat ctactcttg 79 <210> 2450 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2450 aagtgctggg tttacaagcc tgagccaccg catccagcca ggatctaaaa gtggaaagaa 60 tagcatctac tcttg 75 <210> 2451 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2451 aagtgctggg tttacaagcc tgagccaccg catccagcca ggtctaaaag tggaaagaat 60 agcatctact cttg 74 <210> 2452 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2452 aagtgctggg tttacaagcc tgagccaccg catccagcca ggattaaggt ctaaaagtgg 60 aaagaatagc atctactctt g 81 <210> 2453 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2453 aagtgctggg tttacaagcc tgagccaccg catccagcca ggaataaggt ctaaaagtgg 60 aaagaatagc atctactctt g 81 <210> 2454 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2454 aagtgctggg tttacaagcc tgagccaccg catccagcca ggaaaggtct aaaagtggaa 60 agaatagcat ctactcttg 79 <210> 2455 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2455 aagtgctggg tttacaagcc tgagccaccg catccagcca ggatctaaaa gtggaaagaa 60 tagcatctac tcttg 75 <210> 2456 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2456 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgggc agtaagagtg gtgattaata 60 gatagggaca aattga 76 <210> 2457 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2457 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctactg ggcagtaaga gtggtgatta 60 atagataggg acaaattga 79 <210> 2458 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2458 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggactgggca gtaagagtgg tgattaatag 60 atagggacaa attga 75 <210> 2459 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2459 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggcagtaaga gtggtgatta atagataggg 60 acaaattga 69 <210> 2460 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2460 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatgg gcagtaagag tggtgattaa tagataggga 60 caaattga 68 <210> 2461 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2461 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgggc agtaagagtg gtgattaata 60 gatagggaca aattga 76 <210> 2462 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2462 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctactg ggcagtaaga gtggtgatta 60 atagataggg acaaattga 79 <210> 2463 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2463 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggactgggca gtaagagtgg tgattaatag 60 atagggacaa attga 75 <210> 2464 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2464 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacagtaag agtggtgatt aatagatagg 60 gacaaattga 70 <210> 2465 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2465 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggcagtaaga gtggtgatta atagataggg 60 acaaattga 69 <210> 2466 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2466 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2467 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2467 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2468 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2468 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2469 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2469 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2470 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2470 cacaaacgga aacaaugcaa guuuuagagc uaugcu 36 <210> 2471 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2471 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2472 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2472 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2473 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2473 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2474 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2474 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 2475 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2475 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 2476 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2476 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 2477 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2477 acattcttat ttttatcgag cacaaacgga aacaatggca gcctctgctt agaaaaagct 60 gtggataagc cacct 75 <210> 2478 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2478 acattcttat ttttatcgag cacaaacgga aacaatgaat ggcagcctct gcttagaaaa 60 agctgtggat aagccacct 79 <210> 2479 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2479 acattcttat ttttatcgag cacaaacgga aacaatgatg gcagcctctg cttagaaaaa 60 gctgtggata agccacct 78 <210> 2480 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2480 acattcttat ttttatcgag cacaaacgga aacaatgcag cctctgctta gaaaaagctg 60 tggataagcc acct 74 <210> 2481 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2481 acattcttat ttttatcgag cacaaacgga aacaatcaat ggcagcctct gcttagaaaa 60 agctgtggat aagccacct 79 <210> 2482 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2482 acattcttat ttttatcgag cacaaacgga aacaaatgca atggcagcct ctgcttagaa 60 aaagctgtgg ataagccacc t 81 <210> 2483 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2483 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctccc caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2484 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2484 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctgcatatct ccccaccgca 60 tctctttcag cagttgtttc 80 <210> 2485 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2485 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctaatatctc cccaccgcat 60 ctctttcagc agttgtttc 79 <210> 2486 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2486 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2487 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2487 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatctcccc accgcatctc 60 tttcagcagt tgtttc 76 <210> 2488 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2488 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatatctcc ccaccgcatc 60 tctttcagca gttgtttc 78 <210> 2489 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2489 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctccc caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2490 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2490 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctgcatatct ccccaccgca 60 tctctttcag cagttgtttc 80 <210> 2491 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2491 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2492 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2492 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctaatatctc cccaccgcat 60 ctctttcagc agttgtttc 79 <210> 2493 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2493 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatctcccc accgcatctc 60 tttcagcagt tgtttc 76 <210> 2494 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2494 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatatctcc ccaccgcatc 60 tctttcagca gttgtttc 78 <210> 2495 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2495 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctccc caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2496 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2496 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctgcatatct ccccaccgca 60 tctctttcag cagttgtttc 80 <210> 2497 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2497 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatctcccc accgcatctc 60 tttcagcagt tgtttc 76 <210> 2498 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2498 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2499 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2499 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctaatatctc cccaccgcat 60 ctctttcagc agttgtttc 79 <210> 2500 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2500 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ttgttctcct ctacatatct ccccaccgca 60 tctctttcag cagttgtttc 80 <210> 2501 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2501 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctccc caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2502 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2502 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctgcatatct ccccaccgca 60 tctctttcag cagttgtttc 80 <210> 2503 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2503 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctaatatctc cccaccgcat 60 ctctttcagc agttgtttc 79 <210> 2504 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2504 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2505 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2505 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatctcccc accgcatctc 60 tttcagcagt tgtttc 76 <210> 2506 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2506 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatatctcc ccaccgcatc 60 tctttcagca gttgtttc 78 <210> 2507 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2507 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctccc caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2508 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2508 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2509 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2509 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctgcatatct ccccaccgca 60 tctctttcag cagttgtttc 80 <210> 2510 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2510 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatctcccc accgcatctc 60 tttcagcagt tgtttc 76 <210> 2511 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2511 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatatctcc ccaccgcatc 60 tctttcagca gttgtttc 78 <210> 2512 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2512 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctaatatctc cccaccgcat 60 ctctttcagc agttgtttc 79 <210> 2513 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2513 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctccc caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2514 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2514 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctgcatatct ccccaccgca 60 tctctttcag cagttgtttc 80 <210> 2515 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2515 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctaatatctc cccaccgcat 60 ctctttcagc agttgtttc 79 <210> 2516 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2516 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatatctcc ccaccgcatc 60 tctttcagca gttgtttc 78 <210> 2517 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2517 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct caccgcatct ctttcagcag 60 ttgtttc 67 <210> 2518 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2518 ttctgtcatg tgtgtcttga ctcagaaacc ctgttctcct ctatctcccc accgcatctc 60 tttcagcagt tgtttc 76 <210> 2519 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2519 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcttt cagcagttgt ttctaaaaat 60 atcctcc 67 <210> 2520 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2520 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctgc atatctcccc accgcatctc tttcagcagt 60 tgtttctaaa aatatcctcc 80 <210> 2521 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2521 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc atctctttca gcagttgttt 60 ctaaaaatat cctcc 75 <210> 2522 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2522 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc acccatctct ttcagcagtt 60 gtttctaaaa atatcctcc 79 <210> 2523 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2523 tcttgactca gaaaccttgt tctcctctac atatctcccc accgcatctc tttcagcagt 60 tgtttctaaa aatatcctcc 80 <210> 2524 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2524 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accatctctt tcagcagttg 60 tttctaaaaa tatcctcc 78 <210> 2525 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2525 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcttt cagcagttgt ttctaaaaat 60 atcctcc 67 <210> 2526 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2526 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accggcatct ctttcagcag 60 ttgtttctaa aaatatcctc c 81 <210> 2527 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2527 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc acgcatctct ttcagcagtt 60 gtttctaaaa atatcctcc 79 <210> 2528 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2528 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accatctctt tcagcagttg 60 tttctaaaaa tatcctcc 78 <210> 2529 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2529 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc atctctttca gcagttgttt 60 ctaaaaatat cctcc 75 <210> 2530 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2530 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctttca gcagttgttt ctaaaaatat 60 cctcc 65 <210> 2531 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2531 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcttt cagcagttgt ttctaaaaat 60 atcctcc 67 <210> 2532 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2532 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accggcatct ctttcagcag 60 ttgtttctaa aaatatcctc c 81 <210> 2533 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2533 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc acccatctct ttcagcagtt 60 gtttctaaaa atatcctcc 79 <210> 2534 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2534 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accatctctt tcagcagttg 60 tttctaaaaa tatcctcc 78 <210> 2535 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2535 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctgc atatctcccc accgcatctc tttcagcagt 60 tgtttctaaa aatatcctcc 80 <210> 2536 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2536 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc atctctttca gcagttgttt 60 ctaaaaatat cctcc 75 <210> 2537 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2537 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcttt cagcagttgt ttctaaaaat 60 atcctcc 67 <210> 2538 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2538 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc acccatctct ttcagcagtt 60 gtttctaaaa atatcctcc 79 <210> 2539 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2539 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accggcatct ctttcagcag 60 ttgtttctaa aaatatcctc c 81 <210> 2540 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2540 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accgtctttc agcagttgtt 60 tctaaaaata tcctcc 76 <210> 2541 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2541 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc actctttcag cagttgtttc 60 taaaaatatc ctcc 74 <210> 2542 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2542 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctgc atatctttca gcagttgttt ctaaaaatat 60 cctcc 65 <210> 2543 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2543 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcttt cagcagttgt ttctaaaaat 60 atcctcc 67 <210> 2544 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2544 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctgc atatctcccc accgcatctc tttcagcagt 60 tgtttctaaa aatatcctcc 80 <210> 2545 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2545 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accggcatct ctttcagcag 60 ttgtttctaa aaatatcctc c 81 <210> 2546 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2546 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc acgcatctct ttcagcagtt 60 gtttctaaaa atatcctcc 79 <210> 2547 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2547 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc atctctttca gcagttgttt 60 ctaaaaatat cctcc 75 <210> 2548 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2548 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc acccatctct ttcagcagtt 60 gtttctaaaa atatcctcc 79 <210> 2549 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2549 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcttt cagcagttgt ttctaaaaat 60 atcctcc 67 <210> 2550 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2550 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctgc atatctcccc accgcatctc tttcagcagt 60 tgtttctaaa aatatcctcc 80 <210> 2551 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2551 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accggcatct ctttcagcag 60 ttgtttctaa aaatatcctc c 81 <210> 2552 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2552 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc atctctttca gcagttgttt 60 ctaaaaatat cctcc 75 <210> 2553 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2553 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc acccatctct ttcagcagtt 60 gtttctaaaa atatcctcc 79 <210> 2554 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2554 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accatctctt tcagcagttg 60 tttctaaaaa tatcctcc 78 <210> 2555 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2555 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcttt cagcagttgt ttctaaaaat 60 atcctcc 67 <210> 2556 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2556 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc acccatctct ttcagcagtt 60 gtttctaaaa atatcctcc 79 <210> 2557 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2557 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accggcatct ctttcagcag 60 ttgtttctaa aaatatcctc c 81 <210> 2558 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2558 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accatctctt tcagcagttg 60 tttctaaaaa tatcctcc 78 <210> 2559 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2559 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc atctctttca gcagttgttt 60 ctaaaaatat cctcc 75 <210> 2560 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2560 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atctctttca gcagttgttt ctaaaaatat 60 cctcc 65 <210> 2561 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2561 tcttgactca gaaaccctgt tctctttcag cagttgtttc taaaaatatc ctcc 54 <210> 2562 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2562 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcttt cagcagttgt ttctaaaaat 60 atcctcc 67 <210> 2563 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2563 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc acccatctct ttcagcagtt 60 gtttctaaaa atatcctcc 79 <210> 2564 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2564 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc accggcatct ctttcagcag 60 ttgtttctaa aaatatcctc c 81 <210> 2565 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2565 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc atctctttca gcagttgttt 60 ctaaaaatat cctcc 75 <210> 2566 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2566 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc acgcatctct ttcagcagtt 60 gtttctaaaa atatcctcc 79 <210> 2567 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2567 tcttgactca gaaaccctgt tctcctctac atatctcccc actctttcag cagttgtttc 60 taaaaatatc ctcc 74 <210> 2568 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2568 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaggccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2569 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2569 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaacca cttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2570 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2570 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaagccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2571 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2571 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaaatgctt accaacagta 60 gaattgataa at 72 <210> 2572 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2572 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2573 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2573 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaagcc acttaaatgc ttaccaacag 60 tagaattgat aaat 74 <210> 2574 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2574 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtgccactta aatgcttacc 60 aacagtagaa ttgataaat 79 <210> 2575 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2575 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaggccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2576 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2576 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaacca cttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2577 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2577 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaagcca cttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2578 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2578 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaaatgctt accaacagta 60 gaattgataa at 72 <210> 2579 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2579 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaagccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2580 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2580 aaatgcttat gacagcaata attaccaaca gtagaattga taaat 45 <210> 2581 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2581 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaatgc ttaccaacag tagaattgat 60 aaat 64 <210> 2582 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2582 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaggccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2583 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2583 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaacca cttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2584 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2584 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaaatgctt accaacagta 60 gaattgataa at 72 <210> 2585 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2585 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2586 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2586 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaagccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2587 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2587 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaagcca cttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2588 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2588 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcagccac ttaaatgctt accaacagta 60 gaattgataa at 72 <210> 2589 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2589 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaacca cttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2590 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2590 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaggccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2591 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2591 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaaatgctt accaacagta 60 gaattgataa at 72 <210> 2592 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2592 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaagccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2593 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2593 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gccacttaaa tgcttaccaa 60 cagtagaatt gataaat 77 <210> 2594 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2594 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaactt aaatgcttac caacagtaga 60 attgataaat 70 <210> 2595 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2595 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2596 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2596 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaggccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2597 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2597 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaacca cttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2598 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2598 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtagaattga taaat 55 <210> 2599 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2599 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtgccactta aatgcttacc 60 aacagtagaa ttgataaat 79 <210> 2600 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2600 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaagccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2601 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2601 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaccactta aatgcttacc 60 aacagtagaa ttgataaat 79 <210> 2602 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2602 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaacttaaa tgcttaccaa 60 cagtagaatt gataaat 77 <210> 2603 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2603 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaacca cttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2604 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2604 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaggccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2605 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2605 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaagccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2606 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2606 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gttaaatgct taccaacagt 60 agaattgata aat 73 <210> 2607 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2607 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtaaatgctt accaacagta 60 gaattgataa at 72 <210> 2608 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2608 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtacttaaat gcttaccaac 60 agtagaattg ataaat 76 <210> 2609 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2609 aaatgcttat gacagcaata atcataaaaa cctcaaaccg gtatgccact taaatgctta 60 ccaacagtag aattgataaa t 81 <210> 2610 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2610 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgggc agtaagagtg gtgattaata 60 gatagggaca aattga 76 <210> 2611 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2611 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctactg ggcagtaaga gtggtgatta 60 atagataggg acaaattga 79 <210> 2612 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2612 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggactgggca gtaagagtgg tgattaatag 60 atagggacaa attga 75 <210> 2613 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2613 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga gggcagtaag agtggtgatt aatagatagg 60 gacaaattga 70 <210> 2614 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2614 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacagtaag agtggtgatt aatagatagg 60 gacaaattga 70 <210> 2615 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2615 tagcatctac tcttgttcag gtaagagtgg tgattaatag atagggacaa attga 55 <210> 2616 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2616 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggaccttact gggcagtaag agtggtgatt 60 aatagatagg gacaaattga 80 <210> 2617 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2617 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgggc agtaagagtg gtgattaata 60 gatagggaca aattga 76 <210> 2618 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2618 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctactg ggcagtaaga gtggtgatta 60 atagataggg acaaattga 79 <210> 2619 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2619 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggactgggca gtaagagtgg tgattaatag 60 atagggacaa attga 75 <210> 2620 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2620 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgtgg gcagtaagag tggtgattaa 60 tagataggga caaattga 78 <210> 2621 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2621 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgtac tgggcagtaa gagtggtgat 60 taatagatag ggacaaattg a 81 <210> 2622 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2622 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacagtaag agtggtgatt aatagatagg 60 gacaaattga 70 <210> 2623 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2623 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgaac tgggcagtaa gagtggtgat 60 taatagatag ggacaaattg a 81 <210> 2624 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2624 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgggc agtaagagtg gtgattaata 60 gatagggaca aattga 76 <210> 2625 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2625 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctactg ggcagtaaga gtggtgatta 60 atagataggg acaaattga 79 <210> 2626 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2626 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggactgggca gtaagagtgg tgattaatag 60 atagggacaa attga 75 <210> 2627 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2627 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggcagtaaga gtggtgatta atagataggg 60 acaaattga 69 <210> 2628 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2628 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga gggcagtaag agtggtgatt aatagatagg 60 gacaaattga 70 <210> 2629 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2629 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgtac tgggcagtaa gagtggtgat 60 taatagatag ggacaaattg a 81 <210> 2630 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2630 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatgg gcagtaagag tggtgattaa tagataggga 60 caaattga 68 <210> 2631 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2631 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgggc agtaagagtg gtgattaata 60 gatagggaca aattga 76 <210> 2632 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2632 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctactg ggcagtaaga gtggtgatta 60 atagataggg acaaattga 79 <210> 2633 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2633 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggactgggca gtaagagtgg tgattaatag 60 atagggacaa attga 75 <210> 2634 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2634 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacagtaag agtggtgatt aatagatagg 60 gacaaattga 70 <210> 2635 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2635 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgtac tgggcagtaa gagtggtgat 60 taatagatag ggacaaattg a 81 <210> 2636 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2636 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatgg gcagtaagag tggtgattaa tagataggga 60 caaattga 68 <210> 2637 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2637 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggcagtaaga gtggtgatta atagataggg 60 acaaattga 69 <210> 2638 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2638 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgggc agtaagagtg gtgattaata 60 gatagggaca aattga 76 <210> 2639 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2639 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctactg ggcagtaaga gtggtgatta 60 atagataggg acaaattga 79 <210> 2640 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2640 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggactgggca gtaagagtgg tgattaatag 60 atagggacaa attga 75 <210> 2641 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2641 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgtac tgggcagtaa gagtggtgat 60 taatagatag ggacaaattg a 81 <210> 2642 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2642 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggaccactgg gcagtaagag tggtgattaa 60 tagataggga caaattga 78 <210> 2643 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2643 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacagtaag agtggtgatt aatagatagg 60 gacaaattga 70 <210> 2644 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2644 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctggta agagtggtga ttaatagata 60 gggacaaatt ga 72 <210> 2645 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2645 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgggc agtaagagtg gtgattaata 60 gatagggaca aattga 76 <210> 2646 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2646 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctactg ggcagtaaga gtggtgatta 60 atagataggg acaaattga 79 <210> 2647 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2647 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggactgggca gtaagagtgg tgattaatag 60 atagggacaa attga 75 <210> 2648 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2648 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacagtaag agtggtgatt aatagatagg 60 gacaaattga 70 <210> 2649 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2649 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggcagtaaga gtggtgatta atagataggg 60 acaaattga 69 <210> 2650 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2650 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatga ggacctgtaa gagtggtgat taatagatag 60 ggacaaattg a 71 <210> 2651 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2651 tagcatctac tcttgttcag gaaacaatgg gcagtaagag tggtgattaa tagataggga 60 caaattga 68 <210> 2652 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2652 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atgagtctga ggtgcctata 60 ggacatctat ataaata 77 <210> 2653 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2653 ctggaagaga aatagtttta gtataacaag tgaaataccc atgctgagtc tgaggtgcct 60 ataggacatc tatataaata 80 <210> 2654 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2654 ctggaagaga aatagtttta gtataacaag tgaaataccc atgagtctga ggtgcctata 60 ggacatctat ataaata 77 <210> 2655 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2655 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atctgagtct gaggtgccta 60 taggacatct atataaata 79 <210> 2656 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2656 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgagtctgag gtgcctatag gacatctata 60 taaata 66 <210> 2657 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2657 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atggagtctg aggtgcctat 60 aggacatcta tataaata 78 <210> 2658 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2658 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaatactg agtctgaggt gcctatagga 60 catctatata aata 74 <210> 2659 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2659 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atgagtctga ggtgcctata 60 ggacatctat ataaata 77 <210> 2660 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2660 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc actgagtctg aggtgcctat 60 aggacatcta tataaata 78 <210> 2661 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2661 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atctgagtct gaggtgccta 60 taggacatct atataaata 79 <210> 2662 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2662 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atggagtctg aggtgcctat 60 aggacatcta tataaata 78 <210> 2663 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2663 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgagtctgag gtgcctatag gacatctata 60 taaata 66 <210> 2664 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2664 ctggaagaga aatagtttta gtataacaag tgaaataccc atgagtctga ggtgcctata 60 ggacatctat ataaata 77 <210> 2665 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2665 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atgtgagtct gaggtgccta 60 taggacatct atataaata 79 <210> 2666 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2666 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atgagtctga ggtgcctata 60 ggacatctat ataaata 77 <210> 2667 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2667 ctggaagaga aatagtttta gtataacaag tgaaataccc atgctgagtc tgaggtgcct 60 ataggacatc tatataaata 80 <210> 2668 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2668 ctggaagaga aatagtttta gtataacaag tgaaataccc atgagtctga ggtgcctata 60 ggacatctat ataaata 77 <210> 2669 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2669 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atctgagtct gaggtgccta 60 taggacatct atataaata 79 <210> 2670 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2670 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc actgagtctg aggtgcctat 60 aggacatcta tataaata 78 <210> 2671 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2671 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgagtctgag gtgcctatag gacatctata 60 taaata 66 <210> 2672 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2672 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaatacct gagtctgagg tgcctatagg 60 acatctatat aaata 75 <210> 2673 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2673 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atgagtctga ggtgcctata 60 ggacatctat ataaata 77 <210> 2674 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2674 ctggaagaga aatagtttta gtataacaag tgaaataccc atgagtctga ggtgcctata 60 ggacatctat ataaata 77 <210> 2675 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2675 ctggaagaga aatagtttta gtataacaag tgaaataccc atgctgagtc tgaggtgcct 60 ataggacatc tatataaata 80 <210> 2676 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2676 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atctgagtct gaggtgccta 60 taggacatct atataaata 79 <210> 2677 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2677 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atggagtctg aggtgcctat 60 aggacatcta tataaata 78 <210> 2678 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2678 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc actgagtctg aggtgcctat 60 aggacatcta tataaata 78 <210> 2679 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2679 ctggaagaga aatagtttta gtataacaag tgaaataccc atctgagtct gaggtgccta 60 taggacatct atataaata 79 <210> 2680 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2680 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atctgagtct gaggtgccta 60 taggacatct atataaata 79 <210> 2681 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2681 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atgagtctga ggtgcctata 60 ggacatctat ataaata 77 <210> 2682 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2682 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atggagtctg aggtgcctat 60 aggacatcta tataaata 78 <210> 2683 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2683 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc actgagtctg aggtgcctat 60 aggacatcta tataaata 78 <210> 2684 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2684 ctggaagaga aatagtttta gtataacaag tgaaataccc atctgagtct gaggtgccta 60 taggacatct atataaata 79 <210> 2685 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2685 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc tgagtctgag gtgcctatag 60 gacatctata taaata 76 <210> 2686 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2686 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaatacct gagtctgagg tgcctatagg 60 acatctatat aaata 75 <210> 2687 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2687 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atgagtctga ggtgcctata 60 ggacatctat ataaata 77 <210> 2688 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2688 ctggaagaga aatagtttta gtataacaag tgaaataccc atgagtctga ggtgcctata 60 ggacatctat ataaata 77 <210> 2689 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2689 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atctgagtct gaggtgccta 60 taggacatct atataaata 79 <210> 2690 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2690 ctggaagaga aatagtttta gtataacaag tgaaataccc atgctgagtc tgaggtgcct 60 ataggacatc tatataaata 80 <210> 2691 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2691 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc actgagtctg aggtgcctat 60 aggacatcta tataaata 78 <210> 2692 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2692 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc atggagtctg aggtgcctat 60 aggacatcta tataaata 78 <210> 2693 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2693 ctggaagaga aacagtttta gtataacaag tgaaataccc tgagtctgag gtgcctatag 60 gacatctata taaata 76 <210> 2694 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2694 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggagggtttg gcctctgatt 60 agggtggggg cgtgggtgg 79 <210> 2695 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2695 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca gggtttggcc tctgattagg 60 gtgggggcgt gggtgg 76 <210> 2696 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2696 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaaagggtt tggcctctga 60 ttagggtggg ggcgtgggtg g 81 <210> 2697 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2697 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggtttggcct ctgattaggg 60 tgggggcgtg ggtgg 75 <210> 2698 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2698 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggcgtgg gtgg 44 <210> 2699 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2699 gtctagtgca agctaacaac atcacaggct ccaggatagg gggcgtgggt gg 52 <210> 2700 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2700 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaggtttgg cctctgatta 60 gggtgggggc gtgggtgg 78 <210> 2701 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2701 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggtgggggcg tgggtgg 57 <210> 2702 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2702 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca gggtttggcc tctgattagg 60 gtgggggcgt gggtgg 76 <210> 2703 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2703 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggtttggcct ctgattaggg 60 tgggggcgtg ggtgg 75 <210> 2704 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2704 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggagggtttg gcctctgatt 60 agggtggggg cgtgggtgg 79 <210> 2705 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2705 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaaagggtt tggcctctga 60 ttagggtggg ggcgtgggtg g 81 <210> 2706 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2706 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggcctctgat tagggtgggg 60 gcgtgggtgg 70 <210> 2707 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2707 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggagggtttg gcctctgatt 60 agggtggggg cgtgggtgg 79 <210> 2708 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2708 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggtttggcct ctgattaggg 60 tgggggcgtg ggtgg 75 <210> 2709 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2709 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca gggtttggcc tctgattagg 60 gtgggggcgt gggtgg 76 <210> 2710 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2710 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaaagggtt tggcctctga 60 ttagggtggg ggcgtgggtg g 81 <210> 2711 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2711 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggggcgtggg tgg 53 <210> 2712 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2712 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca gcgtgggtgg 50 <210> 2713 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2713 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggcctct gattagggtg ggggcgtggg 60 tgg 63 <210> 2714 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2714 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggtttggcct ctgattaggg 60 tgggggcgtg ggtgg 75 <210> 2715 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2715 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca gggtttggcc tctgattagg 60 gtgggggcgt gggtgg 76 <210> 2716 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2716 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggagggtttg gcctctgatt 60 agggtggggg cgtgggtgg 79 <210> 2717 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2717 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaaagggtt tggcctctga 60 ttagggtggg ggcgtgggtg g 81 <210> 2718 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2718 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagagggt ttggcctctg 60 attagggtgg gggcgtgggt gg 82 <210> 2719 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2719 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggattagggt gggggcgtgg 60 gtgg 64 <210> 2720 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2720 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaggtttgg cctctgatta 60 gggtgggggc gtgggtgg 78 <210> 2721 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2721 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgattaggtg ggggcgtggg tggggtagaa 60 gaggactggc agacctctc 79 <210> 2722 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2722 tatcacaggc tccaggaagg gtttgggggc gtgggtgggg tagaagagga ctggcagacc 60 tctc 64 <210> 2723 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2723 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcgtg ggtggggtag aagaggactg gcagacctct 60 c 61 <210> 2724 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2724 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgattggtgg gggcgtgggt ggggtagaag 60 aggactggca gacctctc 78 <210> 2725 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2725 tatcacaggc tccaggaagg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggcag acctctc 57 <210> 2726 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2726 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tggtgggggc gtgggtgggg tagaagagga 60 ctggcagacc tctc 74 <210> 2727 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2727 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgggggcgtg ggtggggtag aagaggactg 60 gcagacctct c 71 <210> 2728 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2728 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgattaggtg ggggcgtggg tggggtagaa 60 gaggactggc agacctctc 79 <210> 2729 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2729 tatcacaggc tccaggaagg gtttggtggg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggcag 60 acctctc 67 <210> 2730 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2730 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgattggtgg gggcgtgggt ggggtagaag 60 aggactggca gacctctc 78 <210> 2731 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2731 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcgtg ggtggggtag aagaggactg gcagacctct 60 c 61 <210> 2732 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2732 tatcacaggc tccaggaagg gtttgggggc gtgggtgggg tagaagagga ctggcagacc 60 tctc 64 <210> 2733 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2733 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgattagagg tgggggcgtg ggtggggtag 60 aagaggactg gcagacctct c 81 <210> 2734 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2734 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgattagtgg gggcgtgggt ggggtagaag 60 aggactggca gacctctc 78 <210> 2735 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2735 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgattagtgg gggcgtgggt ggggtagaag 60 aggactggca gacctctc 78 <210> 2736 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2736 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgattaggtg ggggcgtggg tggggtagaa 60 gaggactggc agacctctc 79 <210> 2737 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2737 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgaaggactg gcagacctct c 51 <210> 2738 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2738 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgattagagg tgggggcgtg ggtggggtag 60 aagaggactg gcagacctct c 81 <210> 2739 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2739 tatcacaggc tccaggaagg gtttgggggc gtgggtgggg tagaagagga ctggcagacc 60 tctc 64 <210> 2740 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2740 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgggggcgtg ggtggggtag aagaggactg 60 gcagacctct c 71 <210> 2741 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2741 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgattagggc gtgggtgggg tagaagagga 60 ctggcagacc tctc 74 <210> 2742 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2742 tatcacaggc tccaggaagg gtttggtggg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggcag 60 acctctc 67 <210> 2743 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2743 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgattaggtg ggggcgtggg tggggtagaa 60 gaggactggc agacctctc 79 <210> 2744 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2744 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgattggtgg gggcgtgggt ggggtagaag 60 aggactggca gacctctc 78 <210> 2745 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2745 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgggggcgtg ggtggggtag aagaggactg 60 gcagacctct c 71 <210> 2746 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2746 tatcacaggc tccaggaagg gtttgggggc gtgggtgggg tagaagagga ctggcagacc 60 tctc 64 <210> 2747 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2747 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcgtg ggtggggtag aagaggactg gcagacctct 60 c 61 <210> 2748 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2748 tatcacaggc tccaggaagg gggcgtgggt ggggtagaag aggactggca gacctctc 58 <210> 2749 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2749 tatcacaggc tccaggaagg gtttggtggg ggcgtgggtg gggtagaaga ggactggcag 60 acctctc 67 <210> 2750 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2750 tatcacaggc tccaggaagg gtttggcctc tgattagtgg gggcgtgggt ggggtagaag 60 aggactggca gacctctc 78 <210> 2751 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2751 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggactctag ggtcagagaa atatgggtta 60 tatccttcta 70 <210> 2752 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2752 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtatctaa ggactctagg gtcagagaaa 60 tatgggttat atccttcta 79 <210> 2753 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2753 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtataact aaggactcta gggtcagaga 60 aatatgggtt atatccttct a 81 <210> 2754 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2754 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg actctagggt cagagaaata tgggttatat 60 ccttcta 67 <210> 2755 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2755 atgtaaggag gatgagccac atggtaagga ctctagggtc agagaaatat gggttatatc 60 cttcta 66 <210> 2756 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2756 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtaaggac tctagggtca gagaaatatg 60 ggttatatcc ttcta 75 <210> 2757 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2757 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtataagg actctagggt cagagaaata 60 tgggttatat ccttcta 77 <210> 2758 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2758 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtatataa ggactctagg gtcagagaaa 60 tatgggttat atccttcta 79 <210> 2759 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2759 atgtaaggag gatgagccac atggtatggt aaggactcta gggtcagaga aatatgggtt 60 atatccttct a 71 <210> 2760 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2760 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtataaag gactctaggg tcagagaaat 60 atgggttata tccttcta 78 <210> 2761 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2761 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtataact aaggactcta gggtcagaga 60 aatatgggtt atatccttct a 81 <210> 2762 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2762 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggactctag ggtcagagaa atatgggtta 60 tatccttcta 70 <210> 2763 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2763 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg actctagggt cagagaaata tgggttatat 60 ccttcta 67 <210> 2764 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2764 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtatctaa ggactctagg gtcagagaaa 60 tatgggttat atccttcta 79 <210> 2765 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2765 atgtaaggag gatgagccac atggtaagga ctctagggtc agagaaatat gggttatatc 60 cttcta 66 <210> 2766 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2766 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtaaggac tctagggtca gagaaatatg 60 ggttatatcc ttcta 75 <210> 2767 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2767 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtataagg actctagggt cagagaaata 60 tgggttatat ccttcta 77 <210> 2768 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2768 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtactaag gactctaggg tcagagaaat 60 atgggttata tccttcta 78 <210> 2769 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2769 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtatataa ggactctagg gtcagagaaa 60 tatgggttat atccttcta 79 <210> 2770 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2770 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg ttatatcctt cta 43 <210> 2771 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2771 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtataact aaggactcta gggtcagaga 60 aatatgggtt atatccttct a 81 <210> 2772 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2772 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggactctag ggtcagagaa atatgggtta 60 tatccttcta 70 <210> 2773 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2773 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtatctaa ggactctagg gtcagagaaa 60 tatgggttat atccttcta 79 <210> 2774 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2774 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg actctagggt cagagaaata tgggttatat 60 ccttcta 67 <210> 2775 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2775 atgtaaggag gatgagccac atggtaagga ctctagggtc agagaaatat gggttatatc 60 cttcta 66 <210> 2776 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2776 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtaaggac tctagggtca gagaaatatg 60 ggttatatcc ttcta 75 <210> 2777 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2777 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtactaag gactctaggg tcagagaaat 60 atgggttata tccttcta 78 <210> 2778 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2778 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtataagg actctagggt cagagaaata 60 tgggttatat ccttcta 77 <210> 2779 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2779 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtatataa ggactctagg gtcagagaaa 60 tatgggttat atccttcta 79 <210> 2780 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2780 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggttatatc cttcta 46 <210> 2781 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2781 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggactctag ggtcagagaa atatgggtta 60 tatccttcta 70 <210> 2782 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2782 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtatctaa ggactctagg gtcagagaaa 60 tatgggttat atccttcta 79 <210> 2783 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2783 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtataact aaggactcta gggtcagaga 60 aatatgggtt atatccttct a 81 <210> 2784 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2784 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg actctagggt cagagaaata tgggttatat 60 ccttcta 67 <210> 2785 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2785 atgtaaggag gatgagccac atggtaagga ctctagggtc agagaaatat gggttatatc 60 cttcta 66 <210> 2786 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2786 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtaaggac tctagggtca gagaaatatg 60 ggttatatcc ttcta 75 <210> 2787 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2787 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtataagg actctagggt cagagaaata 60 tgggttatat ccttcta 77 <210> 2788 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2788 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtactaag gactctaggg tcagagaaat 60 atgggttata tccttcta 78 <210> 2789 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2789 atgtaaggag gatgagccac atggtatgga ctctagggtc agagaaatat gggttatatc 60 cttcta 66 <210> 2790 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2790 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtatataa ggactctagg gtcagagaaa 60 tatgggttat atccttcta 79 <210> 2791 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2791 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtatctaa ggactctagg gtcagagaaa 60 tatgggttat atccttcta 79 <210> 2792 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2792 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtataact aaggactcta gggtcagaga 60 aatatgggtt atatccttct a 81 <210> 2793 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2793 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggactctag ggtcagagaa atatgggtta 60 tatccttcta 70 <210> 2794 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2794 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg actctagggt cagagaaata tgggttatat 60 ccttcta 67 <210> 2795 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2795 atgtaaggag gatgagccac atggtaagga ctctagggtc agagaaatat gggttatatc 60 cttcta 66 <210> 2796 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2796 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtataagg actctagggt cagagaaata 60 tgggttatat ccttcta 77 <210> 2797 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2797 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtactaag gactctaggg tcagagaaat 60 atgggttata tccttcta 78 <210> 2798 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2798 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtatataa ggactctagg gtcagagaaa 60 tatgggttat atccttcta 79 <210> 2799 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2799 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtaaggac tctagggtca gagaaatatg 60 ggttatatcc ttcta 75 <210> 2800 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2800 atgtaaggag gatgagccac atggtataag gactctaggg tcagagaaat atgggttata 60 tccttcta 68 <210> 2801 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2801 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggactctag ggtcagagaa atatgggtta 60 tatccttcta 70 <210> 2802 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2802 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtatctaa ggactctagg gtcagagaaa 60 tatgggttat atccttcta 79 <210> 2803 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2803 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtataact aaggactcta gggtcagaga 60 aatatgggtt atatccttct a 81 <210> 2804 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2804 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg actctagggt cagagaaata tgggttatat 60 ccttcta 67 <210> 2805 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2805 atgtaaggag gatgagccac atggtaagga ctctagggtc agagaaatat gggttatatc 60 cttcta 66 <210> 2806 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2806 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtaaggac tctagggtca gagaaatatg 60 ggttatatcc ttcta 75 <210> 2807 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2807 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtataagg actctagggt cagagaaata 60 tgggttatat ccttcta 77 <210> 2808 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2808 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtactaag gactctaggg tcagagaaat 60 atgggttata tccttcta 78 <210> 2809 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2809 atgtaaggag gatgagccac atggtatggg aggtatataa ggactctagg gtcagagaaa 60 tatgggttat atccttcta 79 <210> 2810 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2810 atgtaaggag gatgagccac atggtatgga ctctagggtc agagaaatat gggttatatc 60 cttcta 66 <210> 2811 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2811 ggccacggag cgagacaucu 20 <210> 2812 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2812 cagacagcaa actcacccag t 21 <210> 2813 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2813 ctgacgctta tcgacgccct 20 <210> 2814 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2814 agctccaaac tctcaaacca caggg 25 <210> 2815 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2815 tacaattttg ggagtccaca cggca 25 <210> 2816 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2816 agctccaaac tctcaaacca caggg 25 <210> 2817 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2817 tacaattttg ggagtccaca cggca 25 <210> 2818 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2818 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 2819 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2819 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33 <210> 2820 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2820 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34 <210> 2821 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <220> <221> modified_base <222> (30)..(37) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 2821 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnntcg tcggcagcgt c 51 <210> 2822 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <220> <221> modified_base <222> (25)..(32) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 2822 caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtctcgtg ggctcgg 47 <210> 2823 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2823 caagcagaag acggcatacg a 21 <210> 2824 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2824 aatgatacgg cgaccaccga ga 22 <210> 2825 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2825 ctcacctcca ccctaatcag agg 23 <210> 2826 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2826 cacgcccaca ccttaatcag ggg 23 <210> 2827 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2827 cacgacccaa ccctaatcag agg 23 <210> 2828 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2828 ctagccccta ccctaataag tgg 23 <210> 2829 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2829 tttataacag gctccagaaa tgg 23 <210> 2830 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2830 catatcacag gccccaggag ggg 23 <210> 2831 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2831 tggggtgggg agatatgaag agg 23 <210> 2832 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2832 ggaggtgggg agagatgtag agg 23 <210> 2833 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2833 catgcggaaa gagatgcggt tgg 23 <210> 2834 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2834 aggtacctca aactcagcat agg 23 <210> 2835 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2835 agagacccca gactcagcat agg 23 <210> 2836 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2836 atggtatgag aaatatacta tgg 23 <210> 2837 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2837 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 2838 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2838 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2839 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2839 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 2840 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 2840 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2841 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2841 ctgtccaccc atccatcaca tataggcacc tatcaggtac cagctactgt gttaggatct 60 gtgttcccaa ctgacttgcc tccccctgac gtc 93 <210> 2842 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2842 cacccatcca tcacatatag gcacctatca ggtaccagct actgtgttag gatctg 56 <210> 2843 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2843 cacccatcca tcacatatag gcaccttatc aggtaccagc tactgtgtta ggatctg 57 <210> 2844 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2844 cacccatcca tcacatatag gcaccagcta ctgtgttagg atctg 45 <210> 2845 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2845 cacccatcca tcacatatag gcaccatcag gtaccagcta ctgtgttagg atctg 55 <210> 2846 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2846 cacccatcca tcacatatag gcaccttatc aggtaccagc tactgtgtta ggatctg 57 <210> 2847 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2847 cacccatcca tcacatatag gcaccagcta ctgtgttagg atctg 45 <210> 2848 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2848 cacccatcca tcacatatag gtaccagcta ctgtgttagg atctg 45 <210> 2849 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2849 cacccatcca tcacatatag gcaccttatc aggtaccagc tactgtgtta ggatctg 57 <210> 2850 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2850 cacccatcca tcacatatag gcaccagcta ctgtgttagg atctg 45 <210> 2851 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2851 cacccatcca tcacatatag gtaccagcta ctgtgttagg atctg 45 <210> 2852 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2852 cacccatcca tcacatatag gcaccttatc aggtaccagc tactgtgtta ggatctg 57 <210> 2853 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2853 cacccatcca tcacatatag gcaccagcta ctgtgttagg atctg 45 <210> 2854 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2854 cacccatcca tcacatatag gtaccagcta ctgtgttagg atctg 45 <210> 2855 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2855 cacccatcca tcacatatag gcacctatca ggtaccagct actgtgttag gatctg 56 <210> 2856 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2856 cacccatcca tcacatatag gcacctatca aggtaccagc tactgtgtta ggatctg 57 <210> 2857 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2857 cacccatcca tcacatatag gtaccagcta ctgtgttagg atctg 45 <210> 2858 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2858 cacccatcca tcacatatag gcacctatcg gtaccagcta ctgtgttagg atctg 55 <210> 2859 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2859 cacccatcca tcacatatag gcacctatca aggtaccagc tactgtgtta ggatctg 57 <210> 2860 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2860 cacccatcca tcacatatag gcaccagcta ctgtgttagg atctg 45 <210> 2861 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2861 cacccatcca tcacatatag gcacctatcg gtaccagcta ctgtgttagg atctg 55 <210> 2862 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2862 cacccatcca tcacatatag gcacctatca aggtaccagc tactgtgtta ggatctg 57 <210> 2863 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2863 cacccatcca tcacatatag gcacctatcg gtaccagcta ctgtgttagg atctg 55 <210> 2864 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2864 cacccatcca tcacatatag gcaccagcta ctgtgttagg atctg 45 <210> 2865 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2865 cacccatcca tcacatatag gcacctatca aggtaccagc tactgtgtta ggatctg 57 <210> 2866 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2866 cacccatcca tcacatatag gcaccagcta ctgtgttagg atctg 45 <210> 2867 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2867 cacccatcca tcacatatag gcacctatcg gtaccagcta ctgtgttagg atctg 55 <210> 2868 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2868 ggcacctatc aggtaccagc tactgtgtta ggatctgtgt tcccaactga cttgcctccc 60 <210> 2869 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2869 ggcacctatc aggtaccagc tactgttgtt aggatctgtg ttcccaactg acttgcctcc 60 c 61 <210> 2870 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2870 ggcacctatc aggtaccagc tactgttagg atctgtgttc ccaactgact tgcctccc 58 <210> 2871 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2871 ggcacctatc aggtaccagc tactgtgttc ccaactgact tgcctccc 48 <210> 2872 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2872 ggcacctatc aggtaccagc tactgttgtt aggatctgtg ttcccaactg acttgcctcc 60 c 61 <210> 2873 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2873 ggcacctatc aggtaccagc tactgttagg atctgtgttc ccaactgact tgcctccc 58 <210> 2874 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2874 ggcacctatc aggtaccagc tactgtgttc ccaactgact tgcctccc 48 <210> 2875 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2875 ggcacctatc aggtaccagc tactgttgtt aggatctgtg ttcccaactg acttgcctcc 60 c 61 <210> 2876 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2876 ggcacctatc aggtaccagc tactgttagg atctgtgttc ccaactgact tgcctccc 58 <210> 2877 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2877 ggcacctatc aggtaccagc tactgtgttc ccaactgact tgcctccc 48 <210> 2878 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2878 ggcacctatc aggtaccagc tactgttgtt aggatctgtg ttcccaactg acttgcctcc 60 c 61 <210> 2879 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2879 ggcacctatc aggtaccagc tactgttagg atctgtgttc ccaactgact tgcctccc 58 <210> 2880 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2880 ggcacctatc aggtaccagc tactgtgttc ccaactgact tgcctccc 48 <210> 2881 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2881 ttttcatctg tcgggctgtc cacccatcca tcacatatag gcacctatca ggtaccagct 60 <210> 2882 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2882 ttttcatctg tcgggctgtc cacccatcca tcatataggc acctatcagg taccagct 58 <210> 2883 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2883 ttttcatctg tcgggctgtc cacccatcca tataggcacc tatcaggtac cagct 55 <210> 2884 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2884 ttttcatctg tcgggctgtc cacccatcca tcaggtacca gct 43 <210> 2885 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2885 ttttcatctg tcgggctgtc cacccatcca tcatataggc acctatcagg taccagct 58 <210> 2886 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2886 ttttcatctg tcgggctgtc cacccatcca tataggcacc tatcaggtac cagct 55 <210> 2887 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2887 ttttcatctg tcgggctgtc cacccatcca tcaggtacca gct 43 <210> 2888 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2888 ttttcatctg tcgggctgtc cacccatcca tcatataggc acctatcagg taccagct 58 <210> 2889 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2889 ttttcatctg tcgggctgtc cacccatcca tcaggtacca gct 43 <210> 2890 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2890 ttttcatctg tcgggctgtc cacccatcca tataggcacc tatcaggtac cagct 55 <210> 2891 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2891 ttttcatctg tcgggctgtc cacccatcca tcatataggc acctatcagg taccagct 58 <210> 2892 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2892 ttttcatctg tcgggctgtc cacccatcca tataggcacc tatcaggtac cagct 55 <210> 2893 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2893 ttttcatctg tcgggctgtc cacccatcca tcaggtacca gct 43 <210> 2894 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2894 cctgtgggca gtgccagatg aacttcccat tgggggacat tcttattttt atcgagcaca 60 <210> 2895 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2895 cctgtgggca gtgccagatg aacttccatt gggggacatt cttattttta tcgagcaca 59 <210> 2896 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2896 cctgtgggca gtgccagatg aacttcattg ggggacattc ttatttttat cgagcaca 58 <210> 2897 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2897 cctgtgggca gtgccagatg aacttcccca ttgggggaca ttcttatttt tatcgagcac 60 a 61 <210> 2898 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2898 cctgtgggca gtgccagatg aacttccatt gggggacatt cttattttta tcgagcaca 59 <210> 2899 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2899 cctgtgggca gtgccagatg aacttcattg ggggacattc ttatttttat cgagcaca 58 <210> 2900 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2900 cctgtgggca gtgccagatg aacttcccca ttgggggaca ttcttatttt tatcgagcac 60 a 61 <210> 2901 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2901 ttttatcgag cacaaacgga aacaatgcaa tggcagcctc tgcttagaaa aagctgtgga 60 <210> 2902 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2902 ttttatcgag cacaaacgga aacaatggca gcctctgctt agaaaaagct gtgga 55 <210> 2903 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2903 ttttatcgag cacaaacgga aacaatgaat ggcagcctct gcttagaaaa agctgtgga 59 <210> 2904 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2904 ttttatcgag cacaaacgga aacaatcaat ggcagcctct gcttagaaaa agctgtgga 59 <210> 2905 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2905 ttttatcgag cacaaacgga aacaatggca gcctctgctt agaaaaagct gtgga 55 <210> 2906 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2906 ttttatcgag cacaaacgga aacaatgaat ggcagcctct gcttagaaaa agctgtgga 59 <210> 2907 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2907 ttttatcgag cacaaacgga aacaatcaat ggcagcctct gcttagaaaa agctgtgga 59 <210> 2908 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2908 atgagtgcag aatatgcccc gcagggtatt tgtaagttga gccttatttc ttctacgaaa 60 <210> 2909 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2909 atgagtgcag ggtatttgta agttgagcct tatttcttct acaaa 45 <210> 2910 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2910 atgagtgcag aatatgcagg gtatttgtaa gttgagcctt atttcttcta caaa 54 <210> 2911 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2911 atgagtgcag aatatgcccg cagggtattt gtaagttgag ccttatttct tctacgaaa 59 <210> 2912 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2912 gggcagtgcc agatgaactt cccattgggg gacattctta tttttatcga gcacaaacgg 60 aaacaatgca atggcagc 78 <210> 2913 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2913 gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60 ggcaccgagt cggtgctttt 80 <210> 2914 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2914 gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat aaggctagtc cgttatcaac 60 ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 90 <210> 2915 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2915 agtgccagat gaacttccca ttgggggaca ttcttatttt ta 42 <210> 2916 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2916 agtgccagat gaacttccat tgggggacat tcttattttt a 41 <210> 2917 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2917 agtgccagat gaacttcatt gggggacatt cttattttta 40 <210> 2918 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2918 agtgccagat gaacttcccc attgggggac attcttattt tta 43 <210> 2919 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2919 agtgccagat gaacttccat tgggggacat tcttattttt a 41 <210> 2920 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2920 agtgccagat gaacttcatt gggggacatt cttattttta 40 <210> 2921 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2921 agtgccagat gaacttcccc attgggggac attcttattt tta 43 <210> 2922 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2922 cctgtgggca gtgccagatg aacttcccat tgggggacat tcttattttt atcgagcaca 60 <210> 2923 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2923 cctgtgggca gtgccagatg aacttccatt gggggacatt cttattttta tcgagcaca 59 <210> 2924 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2924 cctgtgggca gtgccagatg aacttcattg ggggacattc ttatttttat cgagcaca 58 <210> 2925 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2925 cctgtgggca gtgccagatg aacttcccca ttgggggaca ttcttatttt tatcgagcac 60 a 61 <210> 2926 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2926 cctgtgggca gtgccagatg aacttccatt gggggacatt cttattttta tcgagcaca 59 <210> 2927 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2927 cctgtgggca gtgccagatg aacttcattg ggggacattc ttatttttat cgagcaca 58 <210> 2928 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2928 cctgtgggca gtgccagatg aacttcccca ttgggggaca ttcttatttt tatcgagcac 60 a 61 <210> 2929 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2929 cctgtgggca gtgccagatg aacttccatt gggggacatt cttattttta tcgagcaca 59 <210> 2930 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2930 cctgtgggca gtgccagatg aacttcattg ggggacattc ttatttttat cgagcaca 58 <210> 2931 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2931 cctgtgggca gtgccagatg aacattgggg gacattctta tttttatcga gcaca 55 <210> 2932 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2932 cctgtgggca gtgccagatg aacttccatt gggggacatt cttattttta tcgagcaca 59 <210> 2933 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2933 cctgtgggca gtgccagatg aacttcattg ggggacattc ttatttttat cgagcaca 58 <210> 2934 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2934 cctgtgggca gtgccagatg aacattgggg gacattctta tttttatcga gcaca 55 <210> 2935 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2935 cctgtgggca gtgccagatg aacttccatt gggggacatt cttattttta tcgagcaca 59 <210> 2936 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2936 cctgtgggca gtgccagatg aacttcccca ttgggggaca ttcttatttt tatcgagcac 60 a 61 <210> 2937 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2937 cctgtgggca gtgccagatg aacttcattg ggggacattc ttatttttat cgagcaca 58 <210> 2938 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2938 cctgtgggca gtgccagatg aacttccatt gggggacatt cttattttta tcgagcaca 59 <210> 2939 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2939 cctgtgggca gtgccagatg aacttcccca ttgggggaca ttcttatttt tatcgagcac 60 a 61 <210> 2940 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2940 cctgtgggca gtgccagatg aacttccttg ggggacattc ttatttttat cgagcaca 58 <210> 2941 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2941 cctgtgggca gtgccagatg aacttccatt gggggacatt cttattttta tcgagcaca 59 <210> 2942 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2942 cctgtgggca gtgccagatg aacattgggg gacattctta tttttatcga gcaca 55 <210> 2943 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2943 cctgtgggca gtgccagatg aacttcattg ggggacattc ttatttttat cgagcaca 58 <210> 2944 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2944 cctgtgggca gtgccagatg aacttccatt gggggacatt cttattttta tcgagcaca 59 <210> 2945 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2945 cctgtgggca gtgccagatg aacattgggg gacattctta tttttatcga gcaca 55 <210> 2946 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2946 cctgtgggca gtgccagatg aacttcattg ggggacattc ttatttttat cgagcaca 58 <210> 2947 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2947 gggcagtgcc agatgaactt cccattgggg gacattctta tttttatcga gcacaaacgg 60 aaacaatgca atggcagcct ctgcttagaa aaagc 95 <210> 2948 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2948 gggcagtgcc agatgaactt cccaatggca gcctctgctt agaaaaagc 49 <210> 2949 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2949 gggcagtgcc agatgaactt cccattgggg gacattctta tttttatcga gcacaaacaa 60 tgcaatggca gcctctgctt agaaaaagc 89 <210> 2950 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2950 gggcagtgcc agatgaactt cccaatggca gcctctgctt agaaaaagc 49 <210> 2951 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2951 gggcagtgcc agatgaactt cccattgggg gacattctta tttttatcga gcacaaacaa 60 tgcaatggca gcctctgctt agaaaaagc 89 <210> 2952 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2952 gggcagtgcc agatgaactt cccaatggca gcctctgctt agaaaaagc 49 <210> 2953 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2953 gggcagtgcc agatgaactt ccaatggcag cctctgctta gaaaaagc 48 <210> 2954 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2954 gggcagtgcc agatgaactt cccaatggca gcctctgctt agaaaaagc 49 <210> 2955 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2955 gggcagtgcc agatgaactt ccaatggcag cctctgctta gaaaaagc 48 <210> 2956 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2956 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagggttt ggcctctgat 60 tagggtgggg gcgtgggtgg ggtagaagag 90 <210> 2957 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2957 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagggttt ggcctctgat 60 taggtggggg cgtgggtggg gtagaagag 89 <210> 2958 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2958 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagggttt ggcctctggg 60 ggcgtgggtg gggtagaaga g 81 <210> 2959 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2959 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagggttt ggcgtgggtg 60 gggtagaaga g 71 <210> 2960 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2960 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagggttt ggcgtgggtg 60 gggtagaaga g 71 <210> 2961 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2961 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagggttt ggcctctgat 60 taggtggggg cgtgggtggg gtagaagag 89 <210> 2962 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2962 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagggcgt gggtggggta 60 gaagag 66 <210> 2963 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2963 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagggttt ggcgtgggtg 60 gggtagaaga g 71 <210> 2964 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2964 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagggttt ggtgggggcg 60 tgggtggggt agaagag 77 <210> 2965 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2965 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagggttt gggggcgtgg 60 gtggggtaga agag 74 <210> 2966 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2966 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagggttt ggcgtgggtg 60 gggtagaaga g 71 <210> 2967 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2967 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagggttt gggcgtgggt 60 ggggtagaag ag 72 <210> 2968 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2968 gtctagtgca agctaacagt tgcttttatc acaggctcca ggaagggttt gggtggggta 60 gaagag 66 <210> 2969 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 2969 His His His His His His 1 5 <210> 2970 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 8xHis tag" <400> 2970 His His His His His His His His 1 5 <210> 2971 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> /note="This sequence may encompass 3-10 residues" <400> 2971 His His His His His His His His His His 1 5 10 <210> 2972 <400> 2972 000 <210> 2973 <400> 2973 000 <210> 2974 <400> 2974 000 <210> 2975 <400> 2975 000 <210> 2976 <400> 2976 000 <210> 2977 <400> 2977 000 <210> 2978 <400> 2978 000 <210> 2979 <400> 2979 000 <210> 2980 <400> 2980 000 <210> 2981 <400> 2981 000 <210> 2982 <400> 2982 000 <210> 2983 <400> 2983 000 <210> 2984 <400> 2984 000 <210> 2985 <400> 2985 000 <210> 2986 <400> 2986 000 <210> 2987 <400> 2987 000 <210> 2988 <400> 2988 000 <210> 2989 <400> 2989 000 <210> 2990 <400> 2990 000 <210> 2991 <400> 2991 000 <210> 2992 <400> 2992 000 <210> 2993 <400> 2993 000 <210> 2994 <400> 2994 000 <210> 2995 <400> 2995 000 <210> 2996 <400> 2996 000 <210> 2997 <400> 2997 000 <210> 2998 <400> 2998 000 <210> 2999 <400> 2999 000 <210> 3000 <400> 3000 000 <210> 3001 <400> 3001 000 <210> 3002 <400> 3002 000 <210> 3003 <400> 3003 000 <210> 3004 <400> 3004 000 <210> 3005 <400> 3005 000 <210> 3006 <400> 3006 000 <210> 3007 <400> 3007 000 <210> 3008 <400> 3008 000 <210> 3009 <400> 3009 000 <210> 3010 <400> 3010 000 <210> 3011 <400> 3011 000 <210> 3012 <400> 3012 000 <210> 3013 <400> 3013 000 <210> 3014 <400> 3014 000 <210> 3015 <400> 3015 000 <210> 3016 <400> 3016 000 <210> 3017 <400> 3017 000 <210> 3018 <400> 3018 000 <210> 3019 <400> 3019 000 <210> 3020 <400> 3020 000 <210> 3021 <400> 3021 000 <210> 3022 <400> 3022 000 <210> 3023 <400> 3023 000 <210> 3024 <400> 3024 000 <210> 3025 <400> 3025 000 <210> 3026 <400> 3026 000 <210> 3027 <400> 3027 000 <210> 3028 <400> 3028 000 <210> 3029 <400> 3029 000 <210> 3030 <400> 3030 000 <210> 3031 <400> 3031 000 <210> 3032 <400> 3032 000 <210> 3033 <400> 3033 000 <210> 3034 <400> 3034 000 <210> 3035 <400> 3035 000 <210> 3036 <400> 3036 000 <210> 3037 <400> 3037 000 <210> 3038 <400> 3038 000 <210> 3039 <400> 3039 000 <210> 3040 <400> 3040 000 <210> 3041 <400> 3041 000 <210> 3042 <400> 3042 000 <210> 3043 <400> 3043 000 <210> 3044 <400> 3044 000 <210> 3045 <400> 3045 000 <210> 3046 <400> 3046 000 <210> 3047 <400> 3047 000 <210> 3048 <400> 3048 000 <210> 3049 <400> 3049 000 <210> 3050 <400> 3050 000 <210> 3051 <400> 3051 000 <210> 3052 <400> 3052 000 <210> 3053 <400> 3053 000 <210> 3054 <400> 3054 000 <210> 3055 <400> 3055 000 <210> 3056 <400> 3056 000 <210> 3057 <400> 3057 000 <210> 3058 <400> 3058 000 <210> 3059 <400> 3059 000 <210> 3060 <400> 3060 000 <210> 3061 <400> 3061 000 <210> 3062 <400> 3062 000 <210> 3063 <400> 3063 000 <210> 3064 <400> 3064 000 <210> 3065 <400> 3065 000 <210> 3066 <400> 3066 000 <210> 3067 <400> 3067 000 <210> 3068 <400> 3068 000 <210> 3069 <400> 3069 000 <210> 3070 <400> 3070 000 <210> 3071 <400> 3071 000 <210> 3072 <400> 3072 000 <210> 3073 <400> 3073 000 <210> 3074 <400> 3074 000 <210> 3075 <400> 3075 000 <210> 3076 <400> 3076 000 <210> 3077 <400> 3077 000 <210> 3078 <400> 3078 000 <210> 3079 <400> 3079 000 <210> 3080 <400> 3080 000 <210> 3081 <400> 3081 000 <210> 3082 <400> 3082 000 <210> 3083 <400> 3083 000 <210> 3084 <400> 3084 000 <210> 3085 <400> 3085 000 <210> 3086 <400> 3086 000 <210> 3087 <400> 3087 000 <210> 3088 <400> 3088 000 <210> 3089 <400> 3089 000 <210> 3090 <400> 3090 000 <210> 3091 <400> 3091 000 <210> 3092 <400> 3092 000 <210> 3093 <400> 3093 000 <210> 3094 <400> 3094 000 <210> 3095 <400> 3095 000 <210> 3096 <400> 3096 000 <210> 3097 <400> 3097 000 <210> 3098 <400> 3098 000 <210> 3099 <400> 3099 000 <210> 3100 <400> 3100 000 <210> 3101 <400> 3101 000 <210> 3102 <400> 3102 000 <210> 3103 <400> 3103 000 <210> 3104 <400> 3104 000 <210> 3105 <400> 3105 000 <210> 3106 <400> 3106 000 <210> 3107 <400> 3107 000 <210> 3108 <400> 3108 000 <210> 3109 <400> 3109 000 <210> 3110 <400> 3110 000 <210> 3111 <400> 3111 000 <210> 3112 <400> 3112 000 <210> 3113 <400> 3113 000 <210> 3114 <400> 3114 000 <210> 3115 <400> 3115 000 <210> 3116 <400> 3116 000 <210> 3117 <400> 3117 000 <210> 3118 <400> 3118 000 <210> 3119 <400> 3119 000 <210> 3120 <400> 3120 000 <210> 3121 <400> 3121 000 <210> 3122 <400> 3122 000 <210> 3123 <400> 3123 000 <210> 3124 <400> 3124 000 <210> 3125 <400> 3125 000 <210> 3126 <400> 3126 000 <210> 3127 <400> 3127 000 <210> 3128 <400> 3128 000 <210> 3129 <400> 3129 000 <210> 3130 <400> 3130 000 <210> 3131 <400> 3131 000 <210> 3132 <400> 3132 000 <210> 3133 <400> 3133 000 <210> 3134 <400> 3134 000 <210> 3135 <400> 3135 000 <210> 3136 <400> 3136 000 <210> 3137 <400> 3137 000 <210> 3138 <400> 3138 000 <210> 3139 <400> 3139 000 <210> 3140 <400> 3140 000 <210> 3141 <400> 3141 000 <210> 3142 <400> 3142 000 <210> 3143 <400> 3143 000 <210> 3144 <400> 3144 000 <210> 3145 <400> 3145 000 <210> 3146 <400> 3146 000 <210> 3147 <400> 3147 000 <210> 3148 <400> 3148 000 <210> 3149 <400> 3149 000 <210> 3150 <400> 3150 000 <210> 3151 <400> 3151 000 <210> 3152 <400> 3152 000 <210> 3153 <400> 3153 000 <210> 3154 <400> 3154 000 <210> 3155 <400> 3155 000 <210> 3156 <400> 3156 000 <210> 3157 <400> 3157 000 <210> 3158 <400> 3158 000 <210> 3159 <400> 3159 000 <210> 3160 <400> 3160 000 <210> 3161 <400> 3161 000 <210> 3162 <400> 3162 000 <210> 3163 <400> 3163 000 <210> 3164 <400> 3164 000 <210> 3165 <400> 3165 000 <210> 3166 <400> 3166 000 <210> 3167 <400> 3167 000 <210> 3168 <400> 3168 000 <210> 3169 <400> 3169 000 <210> 3170 <400> 3170 000 <210> 3171 <400> 3171 000 <210> 3172 <400> 3172 000 <210> 3173 <400> 3173 000 <210> 3174 <400> 3174 000 <210> 3175 <400> 3175 000 <210> 3176 <400> 3176 000 <210> 3177 <400> 3177 000 <210> 3178 <400> 3178 000 <210> 3179 <400> 3179 000 <210> 3180 <400> 3180 000 <210> 3181 <400> 3181 000 <210> 3182 <400> 3182 000 <210> 3183 <400> 3183 000 <210> 3184 <400> 3184 000 <210> 3185 <400> 3185 000 <210> 3186 <400> 3186 000 <210> 3187 <400> 3187 000 <210> 3188 <400> 3188 000 <210> 3189 <400> 3189 000 <210> 3190 <400> 3190 000 <210> 3191 <400> 3191 000 <210> 3192 <400> 3192 000 <210> 3193 <400> 3193 000 <210> 3194 <400> 3194 000 <210> 3195 <400> 3195 000 <210> 3196 <400> 3196 000 <210> 3197 <400> 3197 000 <210> 3198 <400> 3198 000 <210> 3199 <400> 3199 000 <210> 3200 <400> 3200 000 <210> 3201 <400> 3201 000 <210> 3202 <400> 3202 000 <210> 3203 <400> 3203 000 <210> 3204 <400> 3204 000 <210> 3205 <400> 3205 000 <210> 3206 <400> 3206 000 <210> 3207 <400> 3207 000 <210> 3208 <400> 3208 000 <210> 3209 <400> 3209 000 <210> 3210 <400> 3210 000 <210> 3211 <400> 3211 000 <210> 3212 <400> 3212 000 <210> 3213 <400> 3213 000 <210> 3214 <400> 3214 000 <210> 3215 <400> 3215 000 <210> 3216 <400> 3216 000 <210> 3217 <400> 3217 000 <210> 3218 <400> 3218 000 <210> 3219 <400> 3219 000 <210> 3220 <400> 3220 000 <210> 3221 <400> 3221 000 <210> 3222 <400> 3222 000 <210> 3223 <400> 3223 000 <210> 3224 <400> 3224 000 <210> 3225 <400> 3225 000 <210> 3226 <400> 3226 000 <210> 3227 <400> 3227 000 <210> 3228 <400> 3228 000 <210> 3229 <400> 3229 000 <210> 3230 <400> 3230 000 <210> 3231 <400> 3231 000 <210> 3232 <400> 3232 000 <210> 3233 <400> 3233 000 <210> 3234 <400> 3234 000 <210> 3235 <400> 3235 000 <210> 3236 <400> 3236 000 <210> 3237 <400> 3237 000 <210> 3238 <400> 3238 000 <210> 3239 <400> 3239 000 <210> 3240 <400> 3240 000 <210> 3241 <400> 3241 000 <210> 3242 <400> 3242 000 <210> 3243 <400> 3243 000 <210> 3244 <400> 3244 000 <210> 3245 <400> 3245 000 <210> 3246 <400> 3246 000 <210> 3247 <400> 3247 000 <210> 3248 <400> 3248 000 <210> 3249 <400> 3249 000 <210> 3250 <400> 3250 000 <210> 3251 <400> 3251 000 <210> 3252 <400> 3252 000 <210> 3253 <400> 3253 000 <210> 3254 <400> 3254 000 <210> 3255 <400> 3255 000 <210> 3256 <400> 3256 000 <210> 3257 <400> 3257 000 <210> 3258 <400> 3258 000 <210> 3259 <400> 3259 000 <210> 3260 <400> 3260 000 <210> 3261 <400> 3261 000 <210> 3262 <400> 3262 000 <210> 3263 <400> 3263 000 <210> 3264 <400> 3264 000 <210> 3265 <400> 3265 000 <210> 3266 <400> 3266 000 <210> 3267 <400> 3267 000 <210> 3268 <400> 3268 000 <210> 3269 <400> 3269 000 <210> 3270 <400> 3270 000 <210> 3271 <400> 3271 000 <210> 3272 <400> 3272 000 <210> 3273 <400> 3273 000 <210> 3274 <400> 3274 000 <210> 3275 <400> 3275 000 <210> 3276 <400> 3276 000 <210> 3277 <400> 3277 000 <210> 3278 <400> 3278 000 <210> 3279 <400> 3279 000 <210> 3280 <400> 3280 000 <210> 3281 <400> 3281 000 <210> 3282 <400> 3282 000 <210> 3283 <400> 3283 000 <210> 3284 <400> 3284 000 <210> 3285 <400> 3285 000 <210> 3286 <400> 3286 000 <210> 3287 <400> 3287 000 <210> 3288 <400> 3288 000 <210> 3289 <400> 3289 000 <210> 3290 <400> 3290 000 <210> 3291 <400> 3291 000 <210> 3292 <400> 3292 000 <210> 3293 <400> 3293 000 <210> 3294 <400> 3294 000 <210> 3295 <400> 3295 000 <210> 3296 <400> 3296 000 <210> 3297 <400> 3297 000 <210> 3298 <400> 3298 000 <210> 3299 <400> 3299 000 <210> 3300 <400> 3300 000 <210> 3301 <400> 3301 000 <210> 3302 <400> 3302 000 <210> 3303 <400> 3303 000 <210> 3304 <400> 3304 000 <210> 3305 <400> 3305 000 <210> 3306 <400> 3306 000 <210> 3307 <400> 3307 000 <210> 3308 <400> 3308 000 <210> 3309 <400> 3309 000 <210> 3310 <400> 3310 000 <210> 3311 <400> 3311 000 <210> 3312 <400> 3312 000 <210> 3313 <400> 3313 000 <210> 3314 <400> 3314 000 <210> 3315 <400> 3315 000 <210> 3316 <400> 3316 000 <210> 3317 <400> 3317 000 <210> 3318 <400> 3318 000 <210> 3319 <400> 3319 000 <210> 3320 <400> 3320 000 <210> 3321 <400> 3321 000 <210> 3322 <400> 3322 000 <210> 3323 <400> 3323 000 <210> 3324 <400> 3324 000 <210> 3325 <400> 3325 000 <210> 3326 <400> 3326 000 <210> 3327 <400> 3327 000 <210> 3328 <400> 3328 000 <210> 3329 <400> 3329 000 <210> 3330 <400> 3330 000 <210> 3331 <400> 3331 000 <210> 3332 <400> 3332 000 <210> 3333 <400> 3333 000 <210> 3334 <400> 3334 000 <210> 3335 <400> 3335 000 <210> 3336 <400> 3336 000 <210> 3337 <400> 3337 000 <210> 3338 <400> 3338 000 <210> 3339 <400> 3339 000 <210> 3340 <400> 3340 000 <210> 3341 <400> 3341 000 <210> 3342 <400> 3342 000 <210> 3343 <400> 3343 000 <210> 3344 <400> 3344 000 <210> 3345 <400> 3345 000 <210> 3346 <400> 3346 000 <210> 3347 <400> 3347 000 <210> 3348 <400> 3348 000 <210> 3349 <400> 3349 000 <210> 3350 <400> 3350 000 <210> 3351 <400> 3351 000 <210> 3352 <400> 3352 000 <210> 3353 <400> 3353 000 <210> 3354 <400> 3354 000 <210> 3355 <400> 3355 000 <210> 3356 <400> 3356 000 <210> 3357 <400> 3357 000 <210> 3358 <400> 3358 000 <210> 3359 <400> 3359 000 <210> 3360 <400> 3360 000 <210> 3361 <400> 3361 000 <210> 3362 <400> 3362 000 <210> 3363 <400> 3363 000 <210> 3364 <400> 3364 000 <210> 3365 <400> 3365 000 <210> 3366 <400> 3366 000 <210> 3367 <400> 3367 000 <210> 3368 <400> 3368 000 <210> 3369 <400> 3369 000 <210> 3370 <400> 3370 000 <210> 3371 <400> 3371 000 <210> 3372 <400> 3372 000 <210> 3373 <400> 3373 000 <210> 3374 <400> 3374 000 <210> 3375 <400> 3375 000 <210> 3376 <400> 3376 000 <210> 3377 <400> 3377 000 <210> 3378 <400> 3378 000 <210> 3379 <400> 3379 000 <210> 3380 <400> 3380 000 <210> 3381 <400> 3381 000 <210> 3382 <400> 3382 000 <210> 3383 <400> 3383 000 <210> 3384 <400> 3384 000 <210> 3385 <400> 3385 000 <210> 3386 <400> 3386 000 <210> 3387 <400> 3387 000 <210> 3388 <400> 3388 000 <210> 3389 <400> 3389 000 <210> 3390 <400> 3390 000 <210> 3391 <400> 3391 000 <210> 3392 <400> 3392 000 <210> 3393 <400> 3393 000 <210> 3394 <400> 3394 000 <210> 3395 <400> 3395 000 <210> 3396 <400> 3396 000 <210> 3397 <400> 3397 000 <210> 3398 <400> 3398 000 <210> 3399 <400> 3399 000 <210> 3400 <400> 3400 000 <210> 3401 <400> 3401 000 <210> 3402 <400> 3402 000 <210> 3403 <400> 3403 000 <210> 3404 <400> 3404 000 <210> 3405 <400> 3405 000 <210> 3406 <400> 3406 000 <210> 3407 <400> 3407 000 <210> 3408 <400> 3408 000 <210> 3409 <400> 3409 000 <210> 3410 <400> 3410 000 <210> 3411 <400> 3411 000 <210> 3412 <400> 3412 000 <210> 3413 <400> 3413 000 <210> 3414 <400> 3414 000 <210> 3415 <400> 3415 000 <210> 3416 <400> 3416 000 <210> 3417 <400> 3417 000 <210> 3418 <400> 3418 000 <210> 3419 <400> 3419 000 <210> 3420 <400> 3420 000 <210> 3421 <400> 3421 000 <210> 3422 <400> 3422 000 <210> 3423 <400> 3423 000 <210> 3424 <400> 3424 000 <210> 3425 <400> 3425 000 <210> 3426 <400> 3426 000 <210> 3427 <400> 3427 000 <210> 3428 <400> 3428 000 <210> 3429 <400> 3429 000 <210> 3430 <400> 3430 000 <210> 3431 <400> 3431 000 <210> 3432 <400> 3432 000 <210> 3433 <400> 3433 000 <210> 3434 <400> 3434 000 <210> 3435 <400> 3435 000 <210> 3436 <400> 3436 000 <210> 3437 <400> 3437 000 <210> 3438 <400> 3438 000 <210> 3439 <400> 3439 000 <210> 3440 <400> 3440 000 <210> 3441 <400> 3441 000 <210> 3442 <400> 3442 000 <210> 3443 <400> 3443 000 <210> 3444 <400> 3444 000 <210> 3445 <400> 3445 000 <210> 3446 <400> 3446 000 <210> 3447 <400> 3447 000 <210> 3448 <400> 3448 000 <210> 3449 <400> 3449 000 <210> 3450 <400> 3450 000 <210> 3451 <400> 3451 000 <210> 3452 <400> 3452 000 <210> 3453 <400> 3453 000 <210> 3454 <400> 3454 000 <210> 3455 <400> 3455 000 <210> 3456 <400> 3456 000 <210> 3457 <400> 3457 000 <210> 3458 <400> 3458 000 <210> 3459 <400> 3459 000 <210> 3460 <400> 3460 000 <210> 3461 <400> 3461 000 <210> 3462 <400> 3462 000 <210> 3463 <400> 3463 000 <210> 3464 <400> 3464 000 <210> 3465 <400> 3465 000 <210> 3466 <400> 3466 000 <210> 3467 <400> 3467 000 <210> 3468 <400> 3468 000 <210> 3469 <400> 3469 000 <210> 3470 <400> 3470 000 <210> 3471 <400> 3471 000 <210> 3472 <400> 3472 000 <210> 3473 <400> 3473 000 <210> 3474 <400> 3474 000 <210> 3475 <400> 3475 000 <210> 3476 <400> 3476 000 <210> 3477 <400> 3477 000 <210> 3478 <400> 3478 000 <210> 3479 <400> 3479 000 <210> 3480 <400> 3480 000 <210> 3481 <400> 3481 000 <210> 3482 <400> 3482 000 <210> 3483 <400> 3483 000 <210> 3484 <400> 3484 000 <210> 3485 <400> 3485 000 <210> 3486 <400> 3486 000 <210> 3487 <400> 3487 000 <210> 3488 <400> 3488 000 <210> 3489 <400> 3489 000 <210> 3490 <400> 3490 000 <210> 3491 <400> 3491 000 <210> 3492 <400> 3492 000 <210> 3493 <400> 3493 000 <210> 3494 <400> 3494 000 <210> 3495 <400> 3495 000 <210> 3496 <400> 3496 000 <210> 3497 <400> 3497 000 <210> 3498 <400> 3498 000 <210> 3499 <400> 3499 000 <210> 3500 <400> 3500 000 <210> 3501 <400> 3501 000 <210> 3502 <400> 3502 000 <210> 3503 <400> 3503 000 <210> 3504 <400> 3504 000 <210> 3505 <400> 3505 000 <210> 3506 <400> 3506 000 <210> 3507 <400> 3507 000 <210> 3508 <400> 3508 000 <210> 3509 <400> 3509 000 <210> 3510 <400> 3510 000 <210> 3511 <400> 3511 000 <210> 3512 <400> 3512 000 <210> 3513 <400> 3513 000 <210> 3514 <400> 3514 000 <210> 3515 <400> 3515 000 <210> 3516 <400> 3516 000 <210> 3517 <400> 3517 000 <210> 3518 <400> 3518 000 <210> 3519 <400> 3519 000 <210> 3520 <400> 3520 000 <210> 3521 <400> 3521 000 <210> 3522 <400> 3522 000 <210> 3523 <400> 3523 000 <210> 3524 <400> 3524 000 <210> 3525 <400> 3525 000 <210> 3526 <400> 3526 000 <210> 3527 <400> 3527 000 <210> 3528 <400> 3528 000 <210> 3529 <400> 3529 000 <210> 3530 <400> 3530 000 <210> 3531 <400> 3531 000 <210> 3532 <400> 3532 000 <210> 3533 <400> 3533 000 <210> 3534 <400> 3534 000 <210> 3535 <400> 3535 000 <210> 3536 <400> 3536 000 <210> 3537 <400> 3537 000 <210> 3538 <400> 3538 000 <210> 3539 <400> 3539 000 <210> 3540 <400> 3540 000 <210> 3541 <400> 3541 000 <210> 3542 <400> 3542 000 <210> 3543 <400> 3543 000 <210> 3544 <400> 3544 000 <210> 3545 <400> 3545 000 <210> 3546 <400> 3546 000 <210> 3547 <400> 3547 000 <210> 3548 <400> 3548 000 <210> 3549 <400> 3549 000 <210> 3550 <400> 3550 000 <210> 3551 <400> 3551 000 <210> 3552 <400> 3552 000 <210> 3553 <400> 3553 000 <210> 3554 <400> 3554 000 <210> 3555 <400> 3555 000 <210> 3556 <400> 3556 000 <210> 3557 <400> 3557 000 <210> 3558 <400> 3558 000 <210> 3559 <400> 3559 000 <210> 3560 <400> 3560 000 <210> 3561 <400> 3561 000 <210> 3562 <400> 3562 000 <210> 3563 <400> 3563 000 <210> 3564 <400> 3564 000 <210> 3565 <400> 3565 000 <210> 3566 <400> 3566 000 <210> 3567 <400> 3567 000 <210> 3568 <400> 3568 000 <210> 3569 <400> 3569 000 <210> 3570 <400> 3570 000 <210> 3571 <400> 3571 000 <210> 3572 <400> 3572 000 <210> 3573 <400> 3573 000 <210> 3574 <400> 3574 000 <210> 3575 <400> 3575 000 <210> 3576 <400> 3576 000 <210> 3577 <400> 3577 000 <210> 3578 <400> 3578 000 <210> 3579 <400> 3579 000 <210> 3580 <400> 3580 000 <210> 3581 <400> 3581 000 <210> 3582 <400> 3582 000 <210> 3583 <400> 3583 000 <210> 3584 <400> 3584 000 <210> 3585 <400> 3585 000 <210> 3586 <400> 3586 000 <210> 3587 <400> 3587 000 <210> 3588 <400> 3588 000 <210> 3589 <400> 3589 000 <210> 3590 <400> 3590 000 <210> 3591 <400> 3591 000 <210> 3592 <400> 3592 000 <210> 3593 <400> 3593 000 <210> 3594 <400> 3594 000 <210> 3595 <400> 3595 000 <210> 3596 <400> 3596 000 <210> 3597 <400> 3597 000 <210> 3598 <400> 3598 000 <210> 3599 <400> 3599 000 <210> 3600 <400> 3600 000 <210> 3601 <400> 3601 000 <210> 3602 <400> 3602 000 <210> 3603 <400> 3603 000 <210> 3604 <400> 3604 000 <210> 3605 <400> 3605 000 <210> 3606 <400> 3606 000 <210> 3607 <400> 3607 000 <210> 3608 <400> 3608 000 <210> 3609 <400> 3609 000 <210> 3610 <400> 3610 000 <210> 3611 <400> 3611 000 <210> 3612 <400> 3612 000 <210> 3613 <400> 3613 000 <210> 3614 <400> 3614 000 <210> 3615 <400> 3615 000 <210> 3616 <400> 3616 000 <210> 3617 <400> 3617 000 <210> 3618 <400> 3618 000 <210> 3619 <400> 3619 000 <210> 3620 <400> 3620 000 <210> 3621 <400> 3621 000 <210> 3622 <400> 3622 000 <210> 3623 <400> 3623 000 <210> 3624 <400> 3624 000 <210> 3625 <400> 3625 000 <210> 3626 <400> 3626 000 <210> 3627 <400> 3627 000 <210> 3628 <400> 3628 000 <210> 3629 <400> 3629 000 <210> 3630 <400> 3630 000 <210> 3631 <400> 3631 000 <210> 3632 <400> 3632 000 <210> 3633 <400> 3633 000 <210> 3634 <400> 3634 000 <210> 3635 <400> 3635 000 <210> 3636 <400> 3636 000 <210> 3637 <400> 3637 000 <210> 3638 <400> 3638 000 <210> 3639 <400> 3639 000 <210> 3640 <400> 3640 000 <210> 3641 <400> 3641 000 <210> 3642 <400> 3642 000 <210> 3643 <400> 3643 000 <210> 3644 <400> 3644 000 <210> 3645 <400> 3645 000 <210> 3646 <400> 3646 000 <210> 3647 <400> 3647 000 <210> 3648 <400> 3648 000 <210> 3649 <400> 3649 000 <210> 3650 <400> 3650 000 <210> 3651 <400> 3651 000 <210> 3652 <400> 3652 000 <210> 3653 <400> 3653 000 <210> 3654 <400> 3654 000 <210> 3655 <400> 3655 000 <210> 3656 <400> 3656 000 <210> 3657 <400> 3657 000 <210> 3658 <400> 3658 000 <210> 3659 <400> 3659 000 <210> 3660 <400> 3660 000 <210> 3661 <400> 3661 000 <210> 3662 <400> 3662 000 <210> 3663 <400> 3663 000 <210> 3664 <400> 3664 000 <210> 3665 <400> 3665 000 <210> 3666 <400> 3666 000 <210> 3667 <400> 3667 000 <210> 3668 <400> 3668 000 <210> 3669 <400> 3669 000 <210> 3670 <400> 3670 000 <210> 3671 <400> 3671 000 <210> 3672 <400> 3672 000 <210> 3673 <400> 3673 000 <210> 3674 <400> 3674 000 <210> 3675 <400> 3675 000 <210> 3676 <400> 3676 000 <210> 3677 <400> 3677 000 <210> 3678 <400> 3678 000 <210> 3679 <400> 3679 000 <210> 3680 <400> 3680 000 <210> 3681 <400> 3681 000 <210> 3682 <400> 3682 000 <210> 3683 <400> 3683 000 <210> 3684 <400> 3684 000 <210> 3685 <400> 3685 000 <210> 3686 <400> 3686 000 <210> 3687 <400> 3687 000 <210> 3688 <400> 3688 000 <210> 3689 <400> 3689 000 <210> 3690 <400> 3690 000 <210> 3691 <400> 3691 000 <210> 3692 <400> 3692 000 <210> 3693 <400> 3693 000 <210> 3694 <400> 3694 000 <210> 3695 <400> 3695 000 <210> 3696 <400> 3696 000 <210> 3697 <400> 3697 000 <210> 3698 <400> 3698 000 <210> 3699 <400> 3699 000 <210> 3700 <400> 3700 000 <210> 3701 <400> 3701 000 <210> 3702 <400> 3702 000 <210> 3703 <400> 3703 000 <210> 3704 <400> 3704 000 <210> 3705 <400> 3705 000 <210> 3706 <400> 3706 000 <210> 3707 <400> 3707 000 <210> 3708 <400> 3708 000 <210> 3709 <400> 3709 000 <210> 3710 <400> 3710 000 <210> 3711 <400> 3711 000 <210> 3712 <400> 3712 000 <210> 3713 <400> 3713 000 <210> 3714 <400> 3714 000 <210> 3715 <400> 3715 000 <210> 3716 <400> 3716 000 <210> 3717 <400> 3717 000 <210> 3718 <400> 3718 000 <210> 3719 <400> 3719 000 <210> 3720 <400> 3720 000 <210> 3721 <400> 3721 000 <210> 3722 <400> 3722 000 <210> 3723 <400> 3723 000 <210> 3724 <400> 3724 000 <210> 3725 <400> 3725 000 <210> 3726 <400> 3726 000 <210> 3727 <400> 3727 000 <210> 3728 <400> 3728 000 <210> 3729 <400> 3729 000 <210> 3730 <400> 3730 000 <210> 3731 <400> 3731 000 <210> 3732 <400> 3732 000 <210> 3733 <400> 3733 000 <210> 3734 <400> 3734 000 <210> 3735 <400> 3735 000 <210> 3736 <400> 3736 000 <210> 3737 <400> 3737 000 <210> 3738 <400> 3738 000 <210> 3739 <400> 3739 000 <210> 3740 <400> 3740 000 <210> 3741 <400> 3741 000 <210> 3742 <400> 3742 000 <210> 3743 <400> 3743 000 <210> 3744 <400> 3744 000 <210> 3745 <400> 3745 000 <210> 3746 <400> 3746 000 <210> 3747 <400> 3747 000 <210> 3748 <400> 3748 000 <210> 3749 <400> 3749 000 <210> 3750 <400> 3750 000 <210> 3751 <400> 3751 000 <210> 3752 <400> 3752 000 <210> 3753 <400> 3753 000 <210> 3754 <400> 3754 000 <210> 3755 <400> 3755 000 <210> 3756 <400> 3756 000 <210> 3757 <400> 3757 000 <210> 3758 <400> 3758 000 <210> 3759 <400> 3759 000 <210> 3760 <400> 3760 000 <210> 3761 <400> 3761 000 <210> 3762 <400> 3762 000 <210> 3763 <400> 3763 000 <210> 3764 <400> 3764 000 <210> 3765 <400> 3765 000 <210> 3766 <400> 3766 000 <210> 3767 <400> 3767 000 <210> 3768 <400> 3768 000 <210> 3769 <400> 3769 000 <210> 3770 <400> 3770 000 <210> 3771 <400> 3771 000 <210> 3772 <400> 3772 000 <210> 3773 <400> 3773 000 <210> 3774 <400> 3774 000 <210> 3775 <400> 3775 000 <210> 3776 <400> 3776 000 <210> 3777 <400> 3777 000 <210> 3778 <400> 3778 000 <210> 3779 <400> 3779 000 <210> 3780 <400> 3780 000 <210> 3781 <400> 3781 000 <210> 3782 <400> 3782 000 <210> 3783 <400> 3783 000 <210> 3784 <400> 3784 000 <210> 3785 <400> 3785 000 <210> 3786 <400> 3786 000 <210> 3787 <400> 3787 000 <210> 3788 <400> 3788 000 <210> 3789 <400> 3789 000 <210> 3790 <400> 3790 000 <210> 3791 <400> 3791 000 <210> 3792 <400> 3792 000 <210> 3793 <400> 3793 000 <210> 3794 <400> 3794 000 <210> 3795 <400> 3795 000 <210> 3796 <400> 3796 000 <210> 3797 <400> 3797 000 <210> 3798 <400> 3798 000 <210> 3799 <400> 3799 000 <210> 3800 <400> 3800 000 <210> 3801 <400> 3801 000 <210> 3802 <400> 3802 000 <210> 3803 <400> 3803 000 <210> 3804 <400> 3804 000 <210> 3805 <400> 3805 000 <210> 3806 <400> 3806 000 <210> 3807 <400> 3807 000 <210> 3808 <400> 3808 000 <210> 3809 <400> 3809 000 <210> 3810 <400> 3810 000 <210> 3811 <400> 3811 000 <210> 3812 <400> 3812 000 <210> 3813 <400> 3813 000 <210> 3814 <400> 3814 000 <210> 3815 <400> 3815 000 <210> 3816 <400> 3816 000 <210> 3817 <400> 3817 000 <210> 3818 <400> 3818 000 <210> 3819 <400> 3819 000 <210> 3820 <400> 3820 000 <210> 3821 <400> 3821 000 <210> 3822 <400> 3822 000 <210> 3823 <400> 3823 000 <210> 3824 <400> 3824 000 <210> 3825 <400> 3825 000 <210> 3826 <400> 3826 000 <210> 3827 <400> 3827 000 <210> 3828 <400> 3828 000 <210> 3829 <400> 3829 000 <210> 3830 <400> 3830 000 <210> 3831 <400> 3831 000 <210> 3832 <400> 3832 000 <210> 3833 <400> 3833 000 <210> 3834 <400> 3834 000 <210> 3835 <400> 3835 000 <210> 3836 <400> 3836 000 <210> 3837 <400> 3837 000 <210> 3838 <400> 3838 000 <210> 3839 <400> 3839 000 <210> 3840 <400> 3840 000 <210> 3841 <400> 3841 000 <210> 3842 <400> 3842 000 <210> 3843 <400> 3843 000 <210> 3844 <400> 3844 000 <210> 3845 <400> 3845 000 <210> 3846 <400> 3846 000 <210> 3847 <400> 3847 000 <210> 3848 <400> 3848 000 <210> 3849 <400> 3849 000 <210> 3850 <400> 3850 000 <210> 3851 <400> 3851 000 <210> 3852 <400> 3852 000 <210> 3853 <400> 3853 000 <210> 3854 <400> 3854 000 <210> 3855 <400> 3855 000 <210> 3856 <400> 3856 000 <210> 3857 <400> 3857 000 <210> 3858 <400> 3858 000 <210> 3859 <400> 3859 000 <210> 3860 <400> 3860 000 <210> 3861 <400> 3861 000 <210> 3862 <400> 3862 000 <210> 3863 <400> 3863 000 <210> 3864 <400> 3864 000 <210> 3865 <400> 3865 000 <210> 3866 <400> 3866 000 <210> 3867 <400> 3867 000 <210> 3868 <400> 3868 000 <210> 3869 <400> 3869 000 <210> 3870 <400> 3870 000 <210> 3871 <400> 3871 000 <210> 3872 <400> 3872 000 <210> 3873 <400> 3873 000 <210> 3874 <400> 3874 000 <210> 3875 <400> 3875 000 <210> 3876 <400> 3876 000 <210> 3877 <400> 3877 000 <210> 3878 <400> 3878 000 <210> 3879 <400> 3879 000 <210> 3880 <400> 3880 000 <210> 3881 <400> 3881 000 <210> 3882 <400> 3882 000 <210> 3883 <400> 3883 000 <210> 3884 <400> 3884 000 <210> 3885 <400> 3885 000 <210> 3886 <400> 3886 000 <210> 3887 <400> 3887 000 <210> 3888 <400> 3888 000 <210> 3889 <400> 3889 000 <210> 3890 <400> 3890 000 <210> 3891 <400> 3891 000 <210> 3892 <400> 3892 000 <210> 3893 <400> 3893 000 <210> 3894 <400> 3894 000 <210> 3895 <400> 3895 000 <210> 3896 <400> 3896 000 <210> 3897 <400> 3897 000 <210> 3898 <400> 3898 000 <210> 3899 <400> 3899 000 <210> 3900 <400> 3900 000 <210> 3901 <400> 3901 000 <210> 3902 <400> 3902 000 <210> 3903 <400> 3903 000 <210> 3904 <400> 3904 000 <210> 3905 <400> 3905 000 <210> 3906 <400> 3906 000 <210> 3907 <400> 3907 000 <210> 3908 <400> 3908 000 <210> 3909 <400> 3909 000 <210> 3910 <400> 3910 000 <210> 3911 <400> 3911 000 <210> 3912 <400> 3912 000 <210> 3913 <400> 3913 000 <210> 3914 <400> 3914 000 <210> 3915 <400> 3915 000 <210> 3916 <400> 3916 000 <210> 3917 <400> 3917 000 <210> 3918 <400> 3918 000 <210> 3919 <400> 3919 000 <210> 3920 <400> 3920 000 <210> 3921 <400> 3921 000 <210> 3922 <400> 3922 000 <210> 3923 <400> 3923 000 <210> 3924 <400> 3924 000 <210> 3925 <400> 3925 000 <210> 3926 <400> 3926 000 <210> 3927 <400> 3927 000 <210> 3928 <400> 3928 000 <210> 3929 <400> 3929 000 <210> 3930 <400> 3930 000 <210> 3931 <400> 3931 000 <210> 3932 <400> 3932 000 <210> 3933 <400> 3933 000 <210> 3934 <400> 3934 000 <210> 3935 <400> 3935 000 <210> 3936 <400> 3936 000 <210> 3937 <400> 3937 000 <210> 3938 <400> 3938 000 <210> 3939 <400> 3939 000 <210> 3940 <400> 3940 000 <210> 3941 <400> 3941 000 <210> 3942 <400> 3942 000 <210> 3943 <400> 3943 000 <210> 3944 <400> 3944 000 <210> 3945 <400> 3945 000 <210> 3946 <400> 3946 000 <210> 3947 <400> 3947 000 <210> 3948 <400> 3948 000 <210> 3949 <400> 3949 000 <210> 3950 <400> 3950 000 <210> 3951 <400> 3951 000 <210> 3952 <400> 3952 000 <210> 3953 <400> 3953 000 <210> 3954 <400> 3954 000 <210> 3955 <400> 3955 000 <210> 3956 <400> 3956 000 <210> 3957 <400> 3957 000 <210> 3958 <400> 3958 000 <210> 3959 <400> 3959 000 <210> 3960 <400> 3960 000 <210> 3961 <400> 3961 000 <210> 3962 <400> 3962 000 <210> 3963 <400> 3963 000 <210> 3964 <400> 3964 000 <210> 3965 <400> 3965 000 <210> 3966 <400> 3966 000 <210> 3967 <400> 3967 000 <210> 3968 <400> 3968 000 <210> 3969 <400> 3969 000 <210> 3970 <400> 3970 000 <210> 3971 <400> 3971 000 <210> 3972 <400> 3972 000 <210> 3973 <400> 3973 000 <210> 3974 <400> 3974 000 <210> 3975 <400> 3975 000 <210> 3976 <400> 3976 000 <210> 3977 <400> 3977 000 <210> 3978 <400> 3978 000 <210> 3979 <400> 3979 000 <210> 3980 <400> 3980 000 <210> 3981 <400> 3981 000 <210> 3982 <400> 3982 000 <210> 3983 <400> 3983 000 <210> 3984 <400> 3984 000 <210> 3985 <400> 3985 000 <210> 3986 <400> 3986 000 <210> 3987 <400> 3987 000 <210> 3988 <400> 3988 000 <210> 3989 <400> 3989 000 <210> 3990 <400> 3990 000 <210> 3991 <400> 3991 000 <210> 3992 <400> 3992 000 <210> 3993 <400> 3993 000 <210> 3994 <400> 3994 000 <210> 3995 <400> 3995 000 <210> 3996 <400> 3996 000 <210> 3997 <400> 3997 000 <210> 3998 <400> 3998 000 <210> 3999 <400> 3999 000 <210> 4000 <400> 4000 000 <210> 4001 <400> 4001 000 <210> 4002 <400> 4002 000 <210> 4003 <400> 4003 000 <210> 4004 <400> 4004 000 <210> 4005 <400> 4005 000 <210> 4006 <400> 4006 000 <210> 4007 <400> 4007 000 <210> 4008 <400> 4008 000 <210> 4009 <400> 4009 000 <210> 4010 <400> 4010 000 <210> 4011 <400> 4011 000 <210> 4012 <400> 4012 000 <210> 4013 <400> 4013 000 <210> 4014 <400> 4014 000 <210> 4015 <400> 4015 000 <210> 4016 <400> 4016 000 <210> 4017 <400> 4017 000 <210> 4018 <400> 4018 000 <210> 4019 <400> 4019 000 <210> 4020 <400> 4020 000 <210> 4021 <400> 4021 000 <210> 4022 <400> 4022 000 <210> 4023 <400> 4023 000 <210> 4024 <400> 4024 000 <210> 4025 <400> 4025 000 <210> 4026 <400> 4026 000 <210> 4027 <400> 4027 000 <210> 4028 <400> 4028 000 <210> 4029 <400> 4029 000 <210> 4030 <400> 4030 000 <210> 4031 <400> 4031 000 <210> 4032 <400> 4032 000 <210> 4033 <400> 4033 000 <210> 4034 <400> 4034 000 <210> 4035 <400> 4035 000 <210> 4036 <400> 4036 000 <210> 4037 <400> 4037 000 <210> 4038 <400> 4038 000 <210> 4039 <400> 4039 000 <210> 4040 <400> 4040 000 <210> 4041 <400> 4041 000 <210> 4042 <400> 4042 000 <210> 4043 <400> 4043 000 <210> 4044 <400> 4044 000 <210> 4045 <400> 4045 000 <210> 4046 <400> 4046 000 <210> 4047 <400> 4047 000 <210> 4048 <400> 4048 000 <210> 4049 <400> 4049 000 <210> 4050 <400> 4050 000 <210> 4051 <400> 4051 000 <210> 4052 <400> 4052 000 <210> 4053 <400> 4053 000 <210> 4054 <400> 4054 000 <210> 4055 <400> 4055 000 <210> 4056 <400> 4056 000 <210> 4057 <400> 4057 000 <210> 4058 <400> 4058 000 <210> 4059 <400> 4059 000 <210> 4060 <400> 4060 000 <210> 4061 <400> 4061 000 <210> 4062 <400> 4062 000 <210> 4063 <400> 4063 000 <210> 4064 <400> 4064 000 <210> 4065 <400> 4065 000 <210> 4066 <400> 4066 000 <210> 4067 <400> 4067 000 <210> 4068 <400> 4068 000 <210> 4069 <400> 4069 000 <210> 4070 <400> 4070 000 <210> 4071 <400> 4071 000 <210> 4072 <400> 4072 000 <210> 4073 <400> 4073 000 <210> 4074 <400> 4074 000 <210> 4075 <400> 4075 000 <210> 4076 <400> 4076 000 <210> 4077 <400> 4077 000 <210> 4078 <400> 4078 000 <210> 4079 <400> 4079 000 <210> 4080 <400> 4080 000 <210> 4081 <400> 4081 000 <210> 4082 <400> 4082 000 <210> 4083 <400> 4083 000 <210> 4084 <400> 4084 000 <210> 4085 <400> 4085 000 <210> 4086 <400> 4086 000 <210> 4087 <400> 4087 000 <210> 4088 <400> 4088 000 <210> 4089 <400> 4089 000 <210> 4090 <400> 4090 000 <210> 4091 <400> 4091 000 <210> 4092 <400> 4092 000 <210> 4093 <400> 4093 000 <210> 4094 <400> 4094 000 <210> 4095 <400> 4095 000 <210> 4096 <400> 4096 000 <210> 4097 <400> 4097 000 <210> 4098 <400> 4098 000 <210> 4099 <400> 4099 000 <210> 4100 <400> 4100 000 <210> 4101 <400> 4101 000 <210> 4102 <400> 4102 000 <210> 4103 <400> 4103 000 <210> 4104 <400> 4104 000 <210> 4105 <400> 4105 000 <210> 4106 <400> 4106 000 <210> 4107 <400> 4107 000 <210> 4108 <400> 4108 000 <210> 4109 <400> 4109 000 <210> 4110 <400> 4110 000 <210> 4111 <400> 4111 000 <210> 4112 <400> 4112 000 <210> 4113 <400> 4113 000 <210> 4114 <400> 4114 000 <210> 4115 <400> 4115 000 <210> 4116 <400> 4116 000 <210> 4117 <400> 4117 000 <210> 4118 <400> 4118 000 <210> 4119 <400> 4119 000 <210> 4120 <400> 4120 000 <210> 4121 <400> 4121 000 <210> 4122 <400> 4122 000 <210> 4123 <400> 4123 000 <210> 4124 <400> 4124 000 <210> 4125 <400> 4125 000 <210> 4126 <400> 4126 000 <210> 4127 <400> 4127 000 <210> 4128 <400> 4128 000 <210> 4129 <400> 4129 000 <210> 4130 <400> 4130 000 <210> 4131 <400> 4131 000 <210> 4132 <400> 4132 000 <210> 4133 <400> 4133 000 <210> 4134 <400> 4134 000 <210> 4135 <400> 4135 000 <210> 4136 <400> 4136 000 <210> 4137 <400> 4137 000 <210> 4138 <400> 4138 000 <210> 4139 <400> 4139 000 <210> 4140 <400> 4140 000 <210> 4141 <400> 4141 000 <210> 4142 <400> 4142 000 <210> 4143 <400> 4143 000 <210> 4144 <400> 4144 000 <210> 4145 <400> 4145 000 <210> 4146 <400> 4146 000 <210> 4147 <400> 4147 000 <210> 4148 <400> 4148 000 <210> 4149 <400> 4149 000 <210> 4150 <400> 4150 000 <210> 4151 <400> 4151 000 <210> 4152 <400> 4152 000 <210> 4153 <400> 4153 000 <210> 4154 <400> 4154 000 <210> 4155 <400> 4155 000 <210> 4156 <400> 4156 000 <210> 4157 <400> 4157 000 <210> 4158 <400> 4158 000 <210> 4159 <400> 4159 000 <210> 4160 <400> 4160 000 <210> 4161 <400> 4161 000 <210> 4162 <400> 4162 000 <210> 4163 <400> 4163 000 <210> 4164 <400> 4164 000 <210> 4165 <400> 4165 000 <210> 4166 <400> 4166 000 <210> 4167 <400> 4167 000 <210> 4168 <400> 4168 000 <210> 4169 <400> 4169 000 <210> 4170 <400> 4170 000 <210> 4171 <400> 4171 000 <210> 4172 <400> 4172 000 <210> 4173 <400> 4173 000 <210> 4174 <400> 4174 000 <210> 4175 <400> 4175 000 <210> 4176 <400> 4176 000 <210> 4177 <400> 4177 000 <210> 4178 <400> 4178 000 <210> 4179 <400> 4179 000 <210> 4180 <400> 4180 000 <210> 4181 <400> 4181 000 <210> 4182 <400> 4182 000 <210> 4183 <400> 4183 000 <210> 4184 <400> 4184 000 <210> 4185 <400> 4185 000 <210> 4186 <400> 4186 000 <210> 4187 <400> 4187 000 <210> 4188 <400> 4188 000 <210> 4189 <400> 4189 000 <210> 4190 <400> 4190 000 <210> 4191 <400> 4191 000 <210> 4192 <400> 4192 000 <210> 4193 <400> 4193 000 <210> 4194 <400> 4194 000 <210> 4195 <400> 4195 000 <210> 4196 <400> 4196 000 <210> 4197 <400> 4197 000 <210> 4198 <400> 4198 000 <210> 4199 <400> 4199 000 <210> 4200 <400> 4200 000 <210> 4201 <400> 4201 000 <210> 4202 <400> 4202 000 <210> 4203 <400> 4203 000 <210> 4204 <400> 4204 000 <210> 4205 <400> 4205 000 <210> 4206 <400> 4206 000 <210> 4207 <400> 4207 000 <210> 4208 <400> 4208 000 <210> 4209 <400> 4209 000 <210> 4210 <400> 4210 000 <210> 4211 <400> 4211 000 <210> 4212 <400> 4212 000 <210> 4213 <400> 4213 000 <210> 4214 <400> 4214 000 <210> 4215 <400> 4215 000 <210> 4216 <400> 4216 000 <210> 4217 <400> 4217 000 <210> 4218 <400> 4218 000 <210> 4219 <400> 4219 000 <210> 4220 <400> 4220 000 <210> 4221 <400> 4221 000 <210> 4222 <400> 4222 000 <210> 4223 <400> 4223 000 <210> 4224 <400> 4224 000 <210> 4225 <400> 4225 000 <210> 4226 <400> 4226 000 <210> 4227 <400> 4227 000 <210> 4228 <400> 4228 000 <210> 4229 <400> 4229 000 <210> 4230 <400> 4230 000 <210> 4231 <400> 4231 000 <210> 4232 <400> 4232 000 <210> 4233 <400> 4233 000 <210> 4234 <400> 4234 000 <210> 4235 <400> 4235 000 <210> 4236 <400> 4236 000 <210> 4237 <400> 4237 000 <210> 4238 <400> 4238 000 <210> 4239 <400> 4239 000 <210> 4240 <400> 4240 000 <210> 4241 <400> 4241 000 <210> 4242 <400> 4242 000 <210> 4243 <400> 4243 000 <210> 4244 <400> 4244 000 <210> 4245 <400> 4245 000 <210> 4246 <400> 4246 000 <210> 4247 <400> 4247 000 <210> 4248 <400> 4248 000 <210> 4249 <400> 4249 000 <210> 4250 <400> 4250 000 <210> 4251 <400> 4251 000 <210> 4252 <400> 4252 000 <210> 4253 <400> 4253 000 <210> 4254 <400> 4254 000 <210> 4255 <400> 4255 000 <210> 4256 <400> 4256 000 <210> 4257 <400> 4257 000 <210> 4258 <400> 4258 000 <210> 4259 <400> 4259 000 <210> 4260 <400> 4260 000 <210> 4261 <400> 4261 000 <210> 4262 <400> 4262 000 <210> 4263 <400> 4263 000 <210> 4264 <400> 4264 000 <210> 4265 <400> 4265 000 <210> 4266 <400> 4266 000 <210> 4267 <400> 4267 000 <210> 4268 <400> 4268 000 <210> 4269 <400> 4269 000 <210> 4270 <400> 4270 000 <210> 4271 <400> 4271 000 <210> 4272 <400> 4272 000 <210> 4273 <400> 4273 000 <210> 4274 <400> 4274 000 <210> 4275 <400> 4275 000 <210> 4276 <400> 4276 000 <210> 4277 <400> 4277 000 <210> 4278 <400> 4278 000 <210> 4279 <400> 4279 000 <210> 4280 <400> 4280 000 <210> 4281 <400> 4281 000 <210> 4282 <400> 4282 000 <210> 4283 <400> 4283 000 <210> 4284 <400> 4284 000 <210> 4285 <400> 4285 000 <210> 4286 <400> 4286 000 <210> 4287 <400> 4287 000 <210> 4288 <400> 4288 000 <210> 4289 <400> 4289 000 <210> 4290 <400> 4290 000 <210> 4291 <400> 4291 000 <210> 4292 <400> 4292 000 <210> 4293 <400> 4293 000 <210> 4294 <400> 4294 000 <210> 4295 <400> 4295 000 <210> 4296 <400> 4296 000 <210> 4297 <400> 4297 000 <210> 4298 <400> 4298 000 <210> 4299 <400> 4299 000 <210> 4300 <400> 4300 000 <210> 4301 <400> 4301 000 <210> 4302 <400> 4302 000 <210> 4303 <400> 4303 000 <210> 4304 <400> 4304 000 <210> 4305 <400> 4305 000 <210> 4306 <400> 4306 000 <210> 4307 <400> 4307 000 <210> 4308 <400> 4308 000 <210> 4309 <400> 4309 000 <210> 4310 <400> 4310 000 <210> 4311 <400> 4311 000 <210> 4312 <400> 4312 000 <210> 4313 <400> 4313 000 <210> 4314 <400> 4314 000 <210> 4315 <400> 4315 000 <210> 4316 <400> 4316 000 <210> 4317 <400> 4317 000 <210> 4318 <400> 4318 000 <210> 4319 <400> 4319 000 <210> 4320 <400> 4320 000 <210> 4321 <400> 4321 000 <210> 4322 <400> 4322 000 <210> 4323 <400> 4323 000 <210> 4324 <400> 4324 000 <210> 4325 <400> 4325 000 <210> 4326 <400> 4326 000 <210> 4327 <400> 4327 000 <210> 4328 <400> 4328 000 <210> 4329 <400> 4329 000 <210> 4330 <400> 4330 000 <210> 4331 <400> 4331 000 <210> 4332 <400> 4332 000 <210> 4333 <400> 4333 000 <210> 4334 <400> 4334 000 <210> 4335 <400> 4335 000 <210> 4336 <400> 4336 000 <210> 4337 <400> 4337 000 <210> 4338 <400> 4338 000 <210> 4339 <400> 4339 000 <210> 4340 <400> 4340 000 <210> 4341 <400> 4341 000 <210> 4342 <400> 4342 000 <210> 4343 <400> 4343 000 <210> 4344 <400> 4344 000 <210> 4345 <400> 4345 000 <210> 4346 <400> 4346 000 <210> 4347 <400> 4347 000 <210> 4348 <400> 4348 000 <210> 4349 <400> 4349 000 <210> 4350 <400> 4350 000 <210> 4351 <400> 4351 000 <210> 4352 <400> 4352 000 <210> 4353 <400> 4353 000 <210> 4354 <400> 4354 000 <210> 4355 <400> 4355 000 <210> 4356 <400> 4356 000 <210> 4357 <400> 4357 000 <210> 4358 <400> 4358 000 <210> 4359 <400> 4359 000 <210> 4360 <400> 4360 000 <210> 4361 <400> 4361 000 <210> 4362 <400> 4362 000 <210> 4363 <400> 4363 000 <210> 4364 <400> 4364 000 <210> 4365 <400> 4365 000 <210> 4366 <400> 4366 000 <210> 4367 <400> 4367 000 <210> 4368 <400> 4368 000 <210> 4369 <400> 4369 000 <210> 4370 <400> 4370 000 <210> 4371 <400> 4371 000 <210> 4372 <400> 4372 000 <210> 4373 <400> 4373 000 <210> 4374 <400> 4374 000 <210> 4375 <400> 4375 000 <210> 4376 <400> 4376 000 <210> 4377 <400> 4377 000 <210> 4378 <400> 4378 000 <210> 4379 <400> 4379 000 <210> 4380 <400> 4380 000 <210> 4381 <400> 4381 000 <210> 4382 <400> 4382 000 <210> 4383 <400> 4383 000 <210> 4384 <400> 4384 000 <210> 4385 <400> 4385 000 <210> 4386 <400> 4386 000 <210> 4387 <400> 4387 000 <210> 4388 <400> 4388 000 <210> 4389 <400> 4389 000 <210> 4390 <400> 4390 000 <210> 4391 <400> 4391 000 <210> 4392 <400> 4392 000 <210> 4393 <400> 4393 000 <210> 4394 <400> 4394 000 <210> 4395 <400> 4395 000 <210> 4396 <400> 4396 000 <210> 4397 <400> 4397 000 <210> 4398 <400> 4398 000 <210> 4399 <400> 4399 000 <210> 4400 <400> 4400 000 <210> 4401 <400> 4401 000 <210> 4402 <400> 4402 000 <210> 4403 <400> 4403 000 <210> 4404 <400> 4404 000 <210> 4405 <400> 4405 000 <210> 4406 <400> 4406 000 <210> 4407 <400> 4407 000 <210> 4408 <400> 4408 000 <210> 4409 <400> 4409 000 <210> 4410 <400> 4410 000 <210> 4411 <400> 4411 000 <210> 4412 <400> 4412 000 <210> 4413 <400> 4413 000 <210> 4414 <400> 4414 000 <210> 4415 <400> 4415 000 <210> 4416 <400> 4416 000 <210> 4417 <400> 4417 000 <210> 4418 <400> 4418 000 <210> 4419 <400> 4419 000 <210> 4420 <400> 4420 000 <210> 4421 <400> 4421 000 <210> 4422 <400> 4422 000 <210> 4423 <400> 4423 000 <210> 4424 <400> 4424 000 <210> 4425 <400> 4425 000 <210> 4426 <400> 4426 000 <210> 4427 <400> 4427 000 <210> 4428 <400> 4428 000 <210> 4429 <400> 4429 000 <210> 4430 <400> 4430 000 <210> 4431 <400> 4431 000 <210> 4432 <400> 4432 000 <210> 4433 <400> 4433 000 <210> 4434 <400> 4434 000 <210> 4435 <400> 4435 000 <210> 4436 <400> 4436 000 <210> 4437 <400> 4437 000 <210> 4438 <400> 4438 000 <210> 4439 <400> 4439 000 <210> 4440 <400> 4440 000 <210> 4441 <400> 4441 000 <210> 4442 <400> 4442 000 <210> 4443 <400> 4443 000 <210> 4444 <400> 4444 000 <210> 4445 <400> 4445 000 <210> 4446 <400> 4446 000 <210> 4447 <400> 4447 000 <210> 4448 <400> 4448 000 <210> 4449 <400> 4449 000 <210> 4450 <400> 4450 000 <210> 4451 <400> 4451 000 <210> 4452 <400> 4452 000 <210> 4453 <400> 4453 000 <210> 4454 <400> 4454 000 <210> 4455 <400> 4455 000 <210> 4456 <400> 4456 000 <210> 4457 <400> 4457 000 <210> 4458 <400> 4458 000 <210> 4459 <400> 4459 000 <210> 4460 <400> 4460 000 <210> 4461 <400> 4461 000 <210> 4462 <400> 4462 000 <210> 4463 <400> 4463 000 <210> 4464 <400> 4464 000 <210> 4465 <400> 4465 000 <210> 4466 <400> 4466 000 <210> 4467 <400> 4467 000 <210> 4468 <400> 4468 000 <210> 4469 <400> 4469 000 <210> 4470 <400> 4470 000 <210> 4471 <400> 4471 000 <210> 4472 <400> 4472 000 <210> 4473 <400> 4473 000 <210> 4474 <400> 4474 000 <210> 4475 <400> 4475 000 <210> 4476 <400> 4476 000 <210> 4477 <400> 4477 000 <210> 4478 <400> 4478 000 <210> 4479 <400> 4479 000 <210> 4480 <400> 4480 000 <210> 4481 <400> 4481 000 <210> 4482 <400> 4482 000 <210> 4483 <400> 4483 000 <210> 4484 <400> 4484 000 <210> 4485 <400> 4485 000 <210> 4486 <400> 4486 000 <210> 4487 <400> 4487 000 <210> 4488 <400> 4488 000 <210> 4489 <400> 4489 000 <210> 4490 <400> 4490 000 <210> 4491 <400> 4491 000 <210> 4492 <400> 4492 000 <210> 4493 <400> 4493 000 <210> 4494 <400> 4494 000 <210> 4495 <400> 4495 000 <210> 4496 <400> 4496 000 <210> 4497 <400> 4497 000 <210> 4498 <400> 4498 000 <210> 4499 <400> 4499 000 <210> 4500 <400> 4500 000 <210> 4501 <400> 4501 000 <210> 4502 <400> 4502 000 <210> 4503 <400> 4503 000 <210> 4504 <400> 4504 000 <210> 4505 <400> 4505 000 <210> 4506 <400> 4506 000 <210> 4507 <400> 4507 000 <210> 4508 <400> 4508 000 <210> 4509 <400> 4509 000 <210> 4510 <400> 4510 000 <210> 4511 <400> 4511 000 <210> 4512 <400> 4512 000 <210> 4513 <400> 4513 000 <210> 4514 <400> 4514 000 <210> 4515 <400> 4515 000 <210> 4516 <400> 4516 000 <210> 4517 <400> 4517 000 <210> 4518 <400> 4518 000 <210> 4519 <400> 4519 000 <210> 4520 <400> 4520 000 <210> 4521 <400> 4521 000 <210> 4522 <400> 4522 000 <210> 4523 <400> 4523 000 <210> 4524 <400> 4524 000 <210> 4525 <400> 4525 000 <210> 4526 <400> 4526 000 <210> 4527 <400> 4527 000 <210> 4528 <400> 4528 000 <210> 4529 <400> 4529 000 <210> 4530 <400> 4530 000 <210> 4531 <400> 4531 000 <210> 4532 <400> 4532 000 <210> 4533 <400> 4533 000 <210> 4534 <400> 4534 000 <210> 4535 <400> 4535 000 <210> 4536 <400> 4536 000 <210> 4537 <400> 4537 000 <210> 4538 <400> 4538 000 <210> 4539 <400> 4539 000 <210> 4540 <400> 4540 000 <210> 4541 <400> 4541 000 <210> 4542 <400> 4542 000 <210> 4543 <400> 4543 000 <210> 4544 <400> 4544 000 <210> 4545 <400> 4545 000 <210> 4546 <400> 4546 000 <210> 4547 <400> 4547 000 <210> 4548 <400> 4548 000 <210> 4549 <400> 4549 000 <210> 4550 <400> 4550 000 <210> 4551 <400> 4551 000 <210> 4552 <400> 4552 000 <210> 4553 <400> 4553 000 <210> 4554 <400> 4554 000 <210> 4555 <400> 4555 000 <210> 4556 <400> 4556 000 <210> 4557 <400> 4557 000 <210> 4558 <400> 4558 000 <210> 4559 <400> 4559 000 <210> 4560 <400> 4560 000 <210> 4561 <400> 4561 000 <210> 4562 <400> 4562 000 <210> 4563 <400> 4563 000 <210> 4564 <400> 4564 000 <210> 4565 <400> 4565 000 <210> 4566 <400> 4566 000 <210> 4567 <400> 4567 000 <210> 4568 <400> 4568 000 <210> 4569 <400> 4569 000 <210> 4570 <400> 4570 000 <210> 4571 <400> 4571 000 <210> 4572 <400> 4572 000 <210> 4573 <400> 4573 000 <210> 4574 <400> 4574 000 <210> 4575 <400> 4575 000 <210> 4576 <400> 4576 000 <210> 4577 <400> 4577 000 <210> 4578 <400> 4578 000 <210> 4579 <400> 4579 000 <210> 4580 <400> 4580 000 <210> 4581 <400> 4581 000 <210> 4582 <400> 4582 000 <210> 4583 <400> 4583 000 <210> 4584 <400> 4584 000 <210> 4585 <400> 4585 000 <210> 4586 <400> 4586 000 <210> 4587 <400> 4587 000 <210> 4588 <400> 4588 000 <210> 4589 <400> 4589 000 <210> 4590 <400> 4590 000 <210> 4591 <400> 4591 000 <210> 4592 <400> 4592 000 <210> 4593 <400> 4593 000 <210> 4594 <400> 4594 000 <210> 4595 <400> 4595 000 <210> 4596 <400> 4596 000 <210> 4597 <400> 4597 000 <210> 4598 <400> 4598 000 <210> 4599 <400> 4599 000 <210> 4600 <400> 4600 000 <210> 4601 <400> 4601 000 <210> 4602 <400> 4602 000 <210> 4603 <400> 4603 000 <210> 4604 <400> 4604 000 <210> 4605 <400> 4605 000 <210> 4606 <400> 4606 000 <210> 4607 <400> 4607 000 <210> 4608 <400> 4608 000 <210> 4609 <400> 4609 000 <210> 4610 <400> 4610 000 <210> 4611 <400> 4611 000 <210> 4612 <400> 4612 000 <210> 4613 <400> 4613 000 <210> 4614 <400> 4614 000 <210> 4615 <400> 4615 000 <210> 4616 <400> 4616 000 <210> 4617 <400> 4617 000 <210> 4618 <400> 4618 000 <210> 4619 <400> 4619 000 <210> 4620 <400> 4620 000 <210> 4621 <400> 4621 000 <210> 4622 <400> 4622 000 <210> 4623 <400> 4623 000 <210> 4624 <400> 4624 000 <210> 4625 <400> 4625 000 <210> 4626 <400> 4626 000 <210> 4627 <400> 4627 000 <210> 4628 <400> 4628 000 <210> 4629 <400> 4629 000 <210> 4630 <400> 4630 000 <210> 4631 <400> 4631 000 <210> 4632 <400> 4632 000 <210> 4633 <400> 4633 000 <210> 4634 <400> 4634 000 <210> 4635 <400> 4635 000 <210> 4636 <400> 4636 000 <210> 4637 <400> 4637 000 <210> 4638 <400> 4638 000 <210> 4639 <400> 4639 000 <210> 4640 <400> 4640 000 <210> 4641 <400> 4641 000 <210> 4642 <400> 4642 000 <210> 4643 <400> 4643 000 <210> 4644 <400> 4644 000 <210> 4645 <400> 4645 000 <210> 4646 <400> 4646 000 <210> 4647 <400> 4647 000 <210> 4648 <400> 4648 000 <210> 4649 <400> 4649 000 <210> 4650 <400> 4650 000 <210> 4651 <400> 4651 000 <210> 4652 <400> 4652 000 <210> 4653 <400> 4653 000 <210> 4654 <400> 4654 000 <210> 4655 <400> 4655 000 <210> 4656 <400> 4656 000 <210> 4657 <400> 4657 000 <210> 4658 <400> 4658 000 <210> 4659 <400> 4659 000 <210> 4660 <400> 4660 000 <210> 4661 <400> 4661 000 <210> 4662 <400> 4662 000 <210> 4663 <400> 4663 000 <210> 4664 <400> 4664 000 <210> 4665 <400> 4665 000 <210> 4666 <400> 4666 000 <210> 4667 <400> 4667 000 <210> 4668 <400> 4668 000 <210> 4669 <400> 4669 000 <210> 4670 <400> 4670 000 <210> 4671 <400> 4671 000 <210> 4672 <400> 4672 000 <210> 4673 <400> 4673 000 <210> 4674 <400> 4674 000 <210> 4675 <400> 4675 000 <210> 4676 <400> 4676 000 <210> 4677 <400> 4677 000 <210> 4678 <400> 4678 000 <210> 4679 <400> 4679 000 <210> 4680 <400> 4680 000 <210> 4681 <400> 4681 000 <210> 4682 <400> 4682 000 <210> 4683 <400> 4683 000 <210> 4684 <400> 4684 000 <210> 4685 <400> 4685 000 <210> 4686 <400> 4686 000 <210> 4687 <400> 4687 000 <210> 4688 <400> 4688 000 <210> 4689 <400> 4689 000 <210> 4690 <400> 4690 000 <210> 4691 <400> 4691 000 <210> 4692 <400> 4692 000 <210> 4693 <400> 4693 000 <210> 4694 <400> 4694 000 <210> 4695 <400> 4695 000 <210> 4696 <400> 4696 000 <210> 4697 <400> 4697 000 <210> 4698 <400> 4698 000 <210> 4699 <400> 4699 000 <210> 4700 <400> 4700 000 <210> 4701 <400> 4701 000 <210> 4702 <400> 4702 000 <210> 4703 <400> 4703 000 <210> 4704 <400> 4704 000 <210> 4705 <400> 4705 000 <210> 4706 <400> 4706 000 <210> 4707 <400> 4707 000 <210> 4708 <400> 4708 000 <210> 4709 <400> 4709 000 <210> 4710 <400> 4710 000 <210> 4711 <400> 4711 000 <210> 4712 <400> 4712 000 <210> 4713 <400> 4713 000 <210> 4714 <400> 4714 000 <210> 4715 <400> 4715 000 <210> 4716 <400> 4716 000 <210> 4717 <400> 4717 000 <210> 4718 <400> 4718 000 <210> 4719 <400> 4719 000 <210> 4720 <400> 4720 000 <210> 4721 <400> 4721 000 <210> 4722 <400> 4722 000 <210> 4723 <400> 4723 000 <210> 4724 <400> 4724 000 <210> 4725 <400> 4725 000 <210> 4726 <400> 4726 000 <210> 4727 <400> 4727 000 <210> 4728 <400> 4728 000 <210> 4729 <400> 4729 000 <210> 4730 <400> 4730 000 <210> 4731 <400> 4731 000 <210> 4732 <400> 4732 000 <210> 4733 <400> 4733 000 <210> 4734 <400> 4734 000 <210> 4735 <400> 4735 000 <210> 4736 <400> 4736 000 <210> 4737 <400> 4737 000 <210> 4738 <400> 4738 000 <210> 4739 <400> 4739 000 <210> 4740 <400> 4740 000 <210> 4741 <400> 4741 000 <210> 4742 <400> 4742 000 <210> 4743 <400> 4743 000 <210> 4744 <400> 4744 000 <210> 4745 <400> 4745 000 <210> 4746 <400> 4746 000 <210> 4747 <400> 4747 000 <210> 4748 <400> 4748 000 <210> 4749 <400> 4749 000 <210> 4750 <400> 4750 000 <210> 4751 <400> 4751 000 <210> 4752 <400> 4752 000 <210> 4753 <400> 4753 000 <210> 4754 <400> 4754 000 <210> 4755 <400> 4755 000 <210> 4756 <400> 4756 000 <210> 4757 <400> 4757 000 <210> 4758 <400> 4758 000 <210> 4759 <400> 4759 000 <210> 4760 <400> 4760 000 <210> 4761 <400> 4761 000 <210> 4762 <400> 4762 000 <210> 4763 <400> 4763 000 <210> 4764 <400> 4764 000 <210> 4765 <400> 4765 000 <210> 4766 <400> 4766 000 <210> 4767 <400> 4767 000 <210> 4768 <400> 4768 000 <210> 4769 <400> 4769 000 <210> 4770 <400> 4770 000 <210> 4771 <400> 4771 000 <210> 4772 <400> 4772 000 <210> 4773 <400> 4773 000 <210> 4774 <400> 4774 000 <210> 4775 <400> 4775 000 <210> 4776 <400> 4776 000 <210> 4777 <400> 4777 000 <210> 4778 <400> 4778 000 <210> 4779 <400> 4779 000 <210> 4780 <400> 4780 000 <210> 4781 <400> 4781 000 <210> 4782 <400> 4782 000 <210> 4783 <400> 4783 000 <210> 4784 <400> 4784 000 <210> 4785 <400> 4785 000 <210> 4786 <400> 4786 000 <210> 4787 <400> 4787 000 <210> 4788 <400> 4788 000 <210> 4789 <400> 4789 000 <210> 4790 <400> 4790 000 <210> 4791 <400> 4791 000 <210> 4792 <400> 4792 000 <210> 4793 <400> 4793 000 <210> 4794 <400> 4794 000 <210> 4795 <400> 4795 000 <210> 4796 <400> 4796 000 <210> 4797 <400> 4797 000 <210> 4798 <400> 4798 000 <210> 4799 <400> 4799 000 <210> 4800 <400> 4800 000 <210> 4801 <400> 4801 000 <210> 4802 <400> 4802 000 <210> 4803 <400> 4803 000 <210> 4804 <400> 4804 000 <210> 4805 <400> 4805 000 <210> 4806 <400> 4806 000 <210> 4807 <400> 4807 000 <210> 4808 <400> 4808 000 <210> 4809 <400> 4809 000 <210> 4810 <400> 4810 000 <210> 4811 <400> 4811 000 <210> 4812 <400> 4812 000 <210> 4813 <400> 4813 000 <210> 4814 <400> 4814 000 <210> 4815 <400> 4815 000 <210> 4816 <400> 4816 000 <210> 4817 <400> 4817 000 <210> 4818 <400> 4818 000 <210> 4819 <400> 4819 000 <210> 4820 <400> 4820 000 <210> 4821 <400> 4821 000 <210> 4822 <400> 4822 000 <210> 4823 <400> 4823 000 <210> 4824 <400> 4824 000 <210> 4825 <400> 4825 000 <210> 4826 <400> 4826 000 <210> 4827 <400> 4827 000 <210> 4828 <400> 4828 000 <210> 4829 <400> 4829 000 <210> 4830 <400> 4830 000 <210> 4831 <400> 4831 000 <210> 4832 <400> 4832 000 <210> 4833 <400> 4833 000 <210> 4834 <400> 4834 000 <210> 4835 <400> 4835 000 <210> 4836 <400> 4836 000 <210> 4837 <400> 4837 000 <210> 4838 <400> 4838 000 <210> 4839 <400> 4839 000 <210> 4840 <400> 4840 000 <210> 4841 <400> 4841 000 <210> 4842 <400> 4842 000 <210> 4843 <400> 4843 000 <210> 4844 <400> 4844 000 <210> 4845 <400> 4845 000 <210> 4846 <400> 4846 000 <210> 4847 <400> 4847 000 <210> 4848 <400> 4848 000 <210> 4849 <400> 4849 000 <210> 4850 <400> 4850 000 <210> 4851 <400> 4851 000 <210> 4852 <400> 4852 000 <210> 4853 <400> 4853 000 <210> 4854 <400> 4854 000 <210> 4855 <400> 4855 000 <210> 4856 <400> 4856 000 <210> 4857 <400> 4857 000 <210> 4858 <400> 4858 000 <210> 4859 <400> 4859 000 <210> 4860 <400> 4860 000 <210> 4861 <400> 4861 000 <210> 4862 <400> 4862 000 <210> 4863 <400> 4863 000 <210> 4864 <400> 4864 000 <210> 4865 <400> 4865 000 <210> 4866 <400> 4866 000 <210> 4867 <400> 4867 000 <210> 4868 <400> 4868 000 <210> 4869 <400> 4869 000 <210> 4870 <400> 4870 000 <210> 4871 <400> 4871 000 <210> 4872 <400> 4872 000 <210> 4873 <400> 4873 000 <210> 4874 <400> 4874 000 <210> 4875 <400> 4875 000 <210> 4876 <400> 4876 000 <210> 4877 <400> 4877 000 <210> 4878 <400> 4878 000 <210> 4879 <400> 4879 000 <210> 4880 <400> 4880 000 <210> 4881 <400> 4881 000 <210> 4882 <400> 4882 000 <210> 4883 <400> 4883 000 <210> 4884 <400> 4884 000 <210> 4885 <400> 4885 000 <210> 4886 <400> 4886 000 <210> 4887 <400> 4887 000 <210> 4888 <400> 4888 000 <210> 4889 <400> 4889 000 <210> 4890 <400> 4890 000 <210> 4891 <400> 4891 000 <210> 4892 <400> 4892 000 <210> 4893 <400> 4893 000 <210> 4894 <400> 4894 000 <210> 4895 <400> 4895 000 <210> 4896 <400> 4896 000 <210> 4897 <400> 4897 000 <210> 4898 <400> 4898 000 <210> 4899 <400> 4899 000 <210> 4900 <400> 4900 000 <210> 4901 <400> 4901 000 <210> 4902 <400> 4902 000 <210> 4903 <400> 4903 000 <210> 4904 <400> 4904 000 <210> 4905 <400> 4905 000 <210> 4906 <400> 4906 000 <210> 4907 <400> 4907 000 <210> 4908 <400> 4908 000 <210> 4909 <400> 4909 000 <210> 4910 <400> 4910 000 <210> 4911 <400> 4911 000 <210> 4912 <400> 4912 000 <210> 4913 <400> 4913 000 <210> 4914 <400> 4914 000 <210> 4915 <400> 4915 000 <210> 4916 <400> 4916 000 <210> 4917 <400> 4917 000 <210> 4918 <400> 4918 000 <210> 4919 <400> 4919 000 <210> 4920 <400> 4920 000 <210> 4921 <400> 4921 000 <210> 4922 <400> 4922 000 <210> 4923 <400> 4923 000 <210> 4924 <400> 4924 000 <210> 4925 <400> 4925 000 <210> 4926 <400> 4926 000 <210> 4927 <400> 4927 000 <210> 4928 <400> 4928 000 <210> 4929 <400> 4929 000 <210> 4930 <400> 4930 000 <210> 4931 <400> 4931 000 <210> 4932 <400> 4932 000 <210> 4933 <400> 4933 000 <210> 4934 <400> 4934 000 <210> 4935 <400> 4935 000 <210> 4936 <400> 4936 000 <210> 4937 <400> 4937 000 <210> 4938 <400> 4938 000 <210> 4939 <400> 4939 000 <210> 4940 <400> 4940 000 <210> 4941 <400> 4941 000 <210> 4942 <400> 4942 000 <210> 4943 <400> 4943 000 <210> 4944 <400> 4944 000 <210> 4945 <400> 4945 000 <210> 4946 <400> 4946 000 <210> 4947 <400> 4947 000 <210> 4948 <400> 4948 000 <210> 4949 <400> 4949 000 <210> 4950 <400> 4950 000 <210> 4951 <400> 4951 000 <210> 4952 <400> 4952 000 <210> 4953 <400> 4953 000 <210> 4954 <400> 4954 000 <210> 4955 <400> 4955 000 <210> 4956 <400> 4956 000 <210> 4957 <400> 4957 000 <210> 4958 <400> 4958 000 <210> 4959 <400> 4959 000 <210> 4960 <400> 4960 000 <210> 4961 <400> 4961 000 <210> 4962 <400> 4962 000 <210> 4963 <400> 4963 000 <210> 4964 <400> 4964 000 <210> 4965 <400> 4965 000 <210> 4966 <400> 4966 000 <210> 4967 <400> 4967 000 <210> 4968 <400> 4968 000 <210> 4969 <400> 4969 000 <210> 4970 <400> 4970 000 <210> 4971 <400> 4971 000 <210> 4972 <400> 4972 000 <210> 4973 <400> 4973 000 <210> 4974 <400> 4974 000 <210> 4975 <400> 4975 000 <210> 4976 <400> 4976 000 <210> 4977 <400> 4977 000 <210> 4978 <400> 4978 000 <210> 4979 <400> 4979 000 <210> 4980 <400> 4980 000 <210> 4981 <400> 4981 000 <210> 4982 <400> 4982 000 <210> 4983 <400> 4983 000 <210> 4984 <400> 4984 000 <210> 4985 <400> 4985 000 <210> 4986 <400> 4986 000 <210> 4987 <400> 4987 000 <210> 4988 <400> 4988 000 <210> 4989 <400> 4989 000 <210> 4990 <400> 4990 000 <210> 4991 <400> 4991 000 <210> 4992 <400> 4992 000 <210> 4993 <400> 4993 000 <210> 4994 <400> 4994 000 <210> 4995 <400> 4995 000 <210> 4996 <400> 4996 000 <210> 4997 <400> 4997 000 <210> 4998 <400> 4998 000 <210> 4999 <400> 4999 000 <210> 5000 <400> 5000 000 <210> 5001 <400> 5001 000 <210> 5002 <400> 5002 000 <210> 5003 <400> 5003 000 <210> 5004 <400> 5004 000 <210> 5005 <400> 5005 000 <210> 5006 <400> 5006 000 <210> 5007 <400> 5007 000 <210> 5008 <400> 5008 000 <210> 5009 <400> 5009 000 <210> 5010 <400> 5010 000 <210> 5011 <400> 5011 000 <210> 5012 <400> 5012 000 <210> 5013 <400> 5013 000 <210> 5014 <400> 5014 000 <210> 5015 <400> 5015 000 <210> 5016 <400> 5016 000 <210> 5017 <400> 5017 000 <210> 5018 <400> 5018 000 <210> 5019 <400> 5019 000 <210> 5020 <400> 5020 000 <210> 5021 <400> 5021 000 <210> 5022 <400> 5022 000 <210> 5023 <400> 5023 000 <210> 5024 <400> 5024 000 <210> 5025 <400> 5025 000 <210> 5026 <400> 5026 000 <210> 5027 <400> 5027 000 <210> 5028 <400> 5028 000 <210> 5029 <400> 5029 000 <210> 5030 <400> 5030 000 <210> 5031 <400> 5031 000 <210> 5032 <400> 5032 000 <210> 5033 <400> 5033 000 <210> 5034 <400> 5034 000 <210> 5035 <400> 5035 000 <210> 5036 <400> 5036 000 <210> 5037 <400> 5037 000 <210> 5038 <400> 5038 000 <210> 5039 <400> 5039 000 <210> 5040 <400> 5040 000 <210> 5041 <400> 5041 000 <210> 5042 <400> 5042 000 <210> 5043 <400> 5043 000 <210> 5044 <400> 5044 000 <210> 5045 <400> 5045 000 <210> 5046 <400> 5046 000 <210> 5047 <400> 5047 000 <210> 5048 <400> 5048 000 <210> 5049 <400> 5049 000 <210> 5050 <400> 5050 000 <210> 5051 <400> 5051 000 <210> 5052 <400> 5052 000 <210> 5053 <400> 5053 000 <210> 5054 <400> 5054 000 <210> 5055 <400> 5055 000 <210> 5056 <400> 5056 000 <210> 5057 <400> 5057 000 <210> 5058 <400> 5058 000 <210> 5059 <400> 5059 000 <210> 5060 <400> 5060 000 <210> 5061 <400> 5061 000 <210> 5062 <400> 5062 000 <210> 5063 <400> 5063 000 <210> 5064 <400> 5064 000 <210> 5065 <400> 5065 000 <210> 5066 <400> 5066 000 <210> 5067 <400> 5067 000 <210> 5068 <400> 5068 000 <210> 5069 <400> 5069 000 <210> 5070 <400> 5070 000 <210> 5071 <400> 5071 000 <210> 5072 <400> 5072 000 <210> 5073 <400> 5073 000 <210> 5074 <400> 5074 000 <210> 5075 <400> 5075 000 <210> 5076 <400> 5076 000 <210> 5077 <400> 5077 000 <210> 5078 <400> 5078 000 <210> 5079 <400> 5079 000 <210> 5080 <400> 5080 000 <210> 5081 <400> 5081 000 <210> 5082 <400> 5082 000 <210> 5083 <400> 5083 000 <210> 5084 <400> 5084 000 <210> 5085 <400> 5085 000 <210> 5086 <400> 5086 000 <210> 5087 <400> 5087 000 <210> 5088 <400> 5088 000 <210> 5089 <400> 5089 000 <210> 5090 <400> 5090 000 <210> 5091 <400> 5091 000 <210> 5092 <400> 5092 000 <210> 5093 <400> 5093 000 <210> 5094 <400> 5094 000 <210> 5095 <400> 5095 000 <210> 5096 <400> 5096 000 <210> 5097 <400> 5097 000 <210> 5098 <400> 5098 000 <210> 5099 <400> 5099 000 <210> 5100 <400> 5100 000 <210> 5101 <400> 5101 000 <210> 5102 <400> 5102 000 <210> 5103 <400> 5103 000 <210> 5104 <400> 5104 000 <210> 5105 <400> 5105 000 <210> 5106 <400> 5106 000 <210> 5107 <400> 5107 000 <210> 5108 <400> 5108 000 <210> 5109 <400> 5109 000 <210> 5110 <400> 5110 000 <210> 5111 <400> 5111 000 <210> 5112 <400> 5112 000 <210> 5113 <400> 5113 000 <210> 5114 <400> 5114 000 <210> 5115 <400> 5115 000 <210> 5116 <400> 5116 000 <210> 5117 <400> 5117 000 <210> 5118 <400> 5118 000 <210> 5119 <400> 5119 000 <210> 5120 <400> 5120 000 <210> 5121 <400> 5121 000 <210> 5122 <400> 5122 000 <210> 5123 <400> 5123 000 <210> 5124 <400> 5124 000 <210> 5125 <400> 5125 000 <210> 5126 <400> 5126 000 <210> 5127 <400> 5127 000 <210> 5128 <400> 5128 000 <210> 5129 <400> 5129 000 <210> 5130 <400> 5130 000 <210> 5131 <400> 5131 000 <210> 5132 <400> 5132 000 <210> 5133 <400> 5133 000 <210> 5134 <400> 5134 000 <210> 5135 <400> 5135 000 <210> 5136 <400> 5136 000 <210> 5137 <400> 5137 000 <210> 5138 <400> 5138 000 <210> 5139 <400> 5139 000 <210> 5140 <400> 5140 000 <210> 5141 <400> 5141 000 <210> 5142 <400> 5142 000 <210> 5143 <400> 5143 000 <210> 5144 <400> 5144 000 <210> 5145 <400> 5145 000 <210> 5146 <400> 5146 000 <210> 5147 <400> 5147 000 <210> 5148 <400> 5148 000 <210> 5149 <400> 5149 000 <210> 5150 <400> 5150 000 <210> 5151 <400> 5151 000 <210> 5152 <400> 5152 000 <210> 5153 <400> 5153 000 <210> 5154 <400> 5154 000 <210> 5155 <400> 5155 000 <210> 5156 <400> 5156 000 <210> 5157 <400> 5157 000 <210> 5158 <400> 5158 000 <210> 5159 <400> 5159 000 <210> 5160 <400> 5160 000 <210> 5161 <400> 5161 000 <210> 5162 <400> 5162 000 <210> 5163 <400> 5163 000 <210> 5164 <400> 5164 000 <210> 5165 <400> 5165 000 <210> 5166 <400> 5166 000 <210> 5167 <400> 5167 000 <210> 5168 <400> 5168 000 <210> 5169 <400> 5169 000 <210> 5170 <400> 5170 000 <210> 5171 <400> 5171 000 <210> 5172 <400> 5172 000 <210> 5173 <400> 5173 000 <210> 5174 <400> 5174 000 <210> 5175 <400> 5175 000 <210> 5176 <400> 5176 000 <210> 5177 <400> 5177 000 <210> 5178 <400> 5178 000 <210> 5179 <400> 5179 000 <210> 5180 <400> 5180 000 <210> 5181 <400> 5181 000 <210> 5182 <400> 5182 000 <210> 5183 <400> 5183 000 <210> 5184 <400> 5184 000 <210> 5185 <400> 5185 000 <210> 5186 <400> 5186 000 <210> 5187 <400> 5187 000 <210> 5188 <400> 5188 000 <210> 5189 <400> 5189 000 <210> 5190 <400> 5190 000 <210> 5191 <400> 5191 000 <210> 5192 <400> 5192 000 <210> 5193 <400> 5193 000 <210> 5194 <400> 5194 000 <210> 5195 <400> 5195 000 <210> 5196 <400> 5196 000 <210> 5197 <400> 5197 000 <210> 5198 <400> 5198 000 <210> 5199 <400> 5199 000 <210> 5200 <400> 5200 000 <210> 5201 <400> 5201 000 <210> 5202 <400> 5202 000 <210> 5203 <400> 5203 000 <210> 5204 <400> 5204 000 <210> 5205 <400> 5205 000 <210> 5206 <400> 5206 000 <210> 5207 <400> 5207 000 <210> 5208 <400> 5208 000 <210> 5209 <400> 5209 000 <210> 5210 <400> 5210 000 <210> 5211 <400> 5211 000 <210> 5212 <400> 5212 000 <210> 5213 <400> 5213 000 <210> 5214 <400> 5214 000 <210> 5215 <400> 5215 000 <210> 5216 <400> 5216 000 <210> 5217 <400> 5217 000 <210> 5218 <400> 5218 000 <210> 5219 <400> 5219 000 <210> 5220 <400> 5220 000 <210> 5221 <400> 5221 000 <210> 5222 <400> 5222 000 <210> 5223 <400> 5223 000 <210> 5224 <400> 5224 000 <210> 5225 <400> 5225 000 <210> 5226 <400> 5226 000 <210> 5227 <400> 5227 000 <210> 5228 <400> 5228 000 <210> 5229 <400> 5229 000 <210> 5230 <400> 5230 000 <210> 5231 <400> 5231 000 <210> 5232 <400> 5232 000 <210> 5233 <400> 5233 000 <210> 5234 <400> 5234 000 <210> 5235 <400> 5235 000 <210> 5236 <400> 5236 000 <210> 5237 <400> 5237 000 <210> 5238 <400> 5238 000 <210> 5239 <400> 5239 000 <210> 5240 <400> 5240 000 <210> 5241 <400> 5241 000 <210> 5242 <400> 5242 000 <210> 5243 <400> 5243 000 <210> 5244 <400> 5244 000 <210> 5245 <400> 5245 000 <210> 5246 <400> 5246 000 <210> 5247 <400> 5247 000 <210> 5248 <400> 5248 000 <210> 5249 <400> 5249 000 <210> 5250 <400> 5250 000 <210> 5251 <400> 5251 000 <210> 5252 <400> 5252 000 <210> 5253 <400> 5253 000 <210> 5254 <400> 5254 000 <210> 5255 <400> 5255 000 <210> 5256 <400> 5256 000 <210> 5257 <400> 5257 000 <210> 5258 <400> 5258 000 <210> 5259 <400> 5259 000 <210> 5260 <400> 5260 000 <210> 5261 <400> 5261 000 <210> 5262 <400> 5262 000 <210> 5263 <400> 5263 000 <210> 5264 <400> 5264 000 <210> 5265 <400> 5265 000 <210> 5266 <400> 5266 000 <210> 5267 <400> 5267 000 <210> 5268 <400> 5268 000 <210> 5269 <400> 5269 000 <210> 5270 <400> 5270 000 <210> 5271 <400> 5271 000 <210> 5272 <400> 5272 000 <210> 5273 <400> 5273 000 <210> 5274 <400> 5274 000 <210> 5275 <400> 5275 000 <210> 5276 <400> 5276 000 <210> 5277 <400> 5277 000 <210> 5278 <400> 5278 000 <210> 5279 <400> 5279 000 <210> 5280 <400> 5280 000 <210> 5281 <400> 5281 000 <210> 5282 <400> 5282 000 <210> 5283 <400> 5283 000 <210> 5284 <400> 5284 000 <210> 5285 <400> 5285 000 <210> 5286 <400> 5286 000 <210> 5287 <400> 5287 000 <210> 5288 <400> 5288 000 <210> 5289 <400> 5289 000 <210> 5290 <400> 5290 000 <210> 5291 <400> 5291 000 <210> 5292 <400> 5292 000 <210> 5293 <400> 5293 000 <210> 5294 <400> 5294 000 <210> 5295 <400> 5295 000 <210> 5296 <400> 5296 000 <210> 5297 <400> 5297 000 <210> 5298 <400> 5298 000 <210> 5299 <400> 5299 000 <210> 5300 <400> 5300 000 <210> 5301 <400> 5301 000 <210> 5302 <400> 5302 000 <210> 5303 <400> 5303 000 <210> 5304 <400> 5304 000 <210> 5305 <400> 5305 000 <210> 5306 <400> 5306 000 <210> 5307 <400> 5307 000 <210> 5308 <400> 5308 000 <210> 5309 <400> 5309 000 <210> 5310 <400> 5310 000 <210> 5311 <400> 5311 000 <210> 5312 <400> 5312 000 <210> 5313 <400> 5313 000 <210> 5314 <400> 5314 000 <210> 5315 <400> 5315 000 <210> 5316 <400> 5316 000 <210> 5317 <400> 5317 000 <210> 5318 <400> 5318 000 <210> 5319 <400> 5319 000 <210> 5320 <400> 5320 000 <210> 5321 <400> 5321 000 <210> 5322 <400> 5322 000 <210> 5323 <400> 5323 000 <210> 5324 <400> 5324 000 <210> 5325 <400> 5325 000 <210> 5326 <400> 5326 000 <210> 5327 <400> 5327 000 <210> 5328 <400> 5328 000 <210> 5329 <400> 5329 000 <210> 5330 <400> 5330 000 <210> 5331 <400> 5331 000 <210> 5332 <400> 5332 000 <210> 5333 <400> 5333 000 <210> 5334 <400> 5334 000 <210> 5335 <400> 5335 000 <210> 5336 <400> 5336 000 <210> 5337 <400> 5337 000 <210> 5338 <400> 5338 000 <210> 5339 <400> 5339 000 <210> 5340 <400> 5340 000 <210> 5341 <400> 5341 000 <210> 5342 <400> 5342 000 <210> 5343 <400> 5343 000 <210> 5344 <400> 5344 000 <210> 5345 <400> 5345 000 <210> 5346 <400> 5346 000 <210> 5347 <400> 5347 000 <210> 5348 <400> 5348 000 <210> 5349 <400> 5349 000 <210> 5350 <400> 5350 000 <210> 5351 <400> 5351 000 <210> 5352 <400> 5352 000 <210> 5353 <400> 5353 000 <210> 5354 <400> 5354 000 <210> 5355 <400> 5355 000 <210> 5356 <400> 5356 000 <210> 5357 <400> 5357 000 <210> 5358 <400> 5358 000 <210> 5359 <400> 5359 000 <210> 5360 <400> 5360 000 <210> 5361 <400> 5361 000 <210> 5362 <400> 5362 000 <210> 5363 <400> 5363 000 <210> 5364 <400> 5364 000 <210> 5365 <400> 5365 000 <210> 5366 <400> 5366 000 <210> 5367 <400> 5367 000 <210> 5368 <400> 5368 000 <210> 5369 <400> 5369 000 <210> 5370 <400> 5370 000 <210> 5371 <400> 5371 000 <210> 5372 <400> 5372 000 <210> 5373 <400> 5373 000 <210> 5374 <400> 5374 000 <210> 5375 <400> 5375 000 <210> 5376 <400> 5376 000 <210> 5377 <400> 5377 000 <210> 5378 <400> 5378 000 <210> 5379 <400> 5379 000 <210> 5380 <400> 5380 000 <210> 5381 <400> 5381 000 <210> 5382 <400> 5382 000 <210> 5383 <400> 5383 000 <210> 5384 <400> 5384 000 <210> 5385 <400> 5385 000 <210> 5386 <400> 5386 000 <210> 5387 <400> 5387 000 <210> 5388 <400> 5388 000 <210> 5389 <400> 5389 000 <210> 5390 <400> 5390 000 <210> 5391 <400> 5391 000 <210> 5392 <400> 5392 000 <210> 5393 <400> 5393 000 <210> 5394 <400> 5394 000 <210> 5395 <400> 5395 000 <210> 5396 <400> 5396 000 <210> 5397 <400> 5397 000 <210> 5398 <400> 5398 000 <210> 5399 <400> 5399 000 <210> 5400 <400> 5400 000 <210> 5401 <400> 5401 000 <210> 5402 <400> 5402 000 <210> 5403 <400> 5403 000 <210> 5404 <400> 5404 000 <210> 5405 <400> 5405 000 <210> 5406 <400> 5406 000 <210> 5407 <400> 5407 000 <210> 5408 <400> 5408 000 <210> 5409 <400> 5409 000 <210> 5410 <400> 5410 000 <210> 5411 <400> 5411 000 <210> 5412 <400> 5412 000 <210> 5413 <400> 5413 000 <210> 5414 <400> 5414 000 <210> 5415 <400> 5415 000 <210> 5416 <400> 5416 000 <210> 5417 <400> 5417 000 <210> 5418 <400> 5418 000 <210> 5419 <400> 5419 000 <210> 5420 <400> 5420 000 <210> 5421 <400> 5421 000 <210> 5422 <400> 5422 000 <210> 5423 <400> 5423 000 <210> 5424 <400> 5424 000 <210> 5425 <400> 5425 000 <210> 5426 <400> 5426 000 <210> 5427 <400> 5427 000 <210> 5428 <400> 5428 000 <210> 5429 <400> 5429 000 <210> 5430 <400> 5430 000 <210> 5431 <400> 5431 000 <210> 5432 <400> 5432 000 <210> 5433 <400> 5433 000 <210> 5434 <400> 5434 000 <210> 5435 <400> 5435 000 <210> 5436 <400> 5436 000 <210> 5437 <400> 5437 000 <210> 5438 <400> 5438 000 <210> 5439 <400> 5439 000 <210> 5440 <400> 5440 000 <210> 5441 <400> 5441 000 <210> 5442 <400> 5442 000 <210> 5443 <400> 5443 000 <210> 5444 <400> 5444 000 <210> 5445 <400> 5445 000 <210> 5446 <400> 5446 000 <210> 5447 <400> 5447 000 <210> 5448 <400> 5448 000 <210> 5449 <400> 5449 000 <210> 5450 <400> 5450 000 <210> 5451 <400> 5451 000 <210> 5452 <400> 5452 000 <210> 5453 <400> 5453 000 <210> 5454 <400> 5454 000 <210> 5455 <400> 5455 000 <210> 5456 <400> 5456 000 <210> 5457 <400> 5457 000 <210> 5458 <400> 5458 000 <210> 5459 <400> 5459 000 <210> 5460 <400> 5460 000 <210> 5461 <400> 5461 000 <210> 5462 <400> 5462 000 <210> 5463 <400> 5463 000 <210> 5464 <400> 5464 000 <210> 5465 <400> 5465 000 <210> 5466 <400> 5466 000 <210> 5467 <400> 5467 000 <210> 5468 <400> 5468 000 <210> 5469 <400> 5469 000 <210> 5470 <400> 5470 000 <210> 5471 <400> 5471 000 <210> 5472 <400> 5472 000 <210> 5473 <400> 5473 000 <210> 5474 <400> 5474 000 <210> 5475 <400> 5475 000 <210> 5476 <400> 5476 000 <210> 5477 <400> 5477 000 <210> 5478 <400> 5478 000 <210> 5479 <400> 5479 000 <210> 5480 <400> 5480 000 <210> 5481 <400> 5481 000 <210> 5482 <400> 5482 000 <210> 5483 <400> 5483 000 <210> 5484 <400> 5484 000 <210> 5485 <400> 5485 000 <210> 5486 <400> 5486 000 <210> 5487 <400> 5487 000 <210> 5488 <400> 5488 000 <210> 5489 <400> 5489 000 <210> 5490 <400> 5490 000 <210> 5491 <400> 5491 000 <210> 5492 <400> 5492 000 <210> 5493 <400> 5493 000 <210> 5494 <400> 5494 000 <210> 5495 <400> 5495 000 <210> 5496 <400> 5496 000 <210> 5497 <400> 5497 000 <210> 5498 <400> 5498 000 <210> 5499 <400> 5499 000 <210> 5500 <400> 5500 000 <210> 5501 <400> 5501 000 <210> 5502 <400> 5502 000 <210> 5503 <400> 5503 000 <210> 5504 <400> 5504 000 <210> 5505 <400> 5505 000 <210> 5506 <400> 5506 000 <210> 5507 <400> 5507 000 <210> 5508 <400> 5508 000 <210> 5509 <400> 5509 000 <210> 5510 <400> 5510 000 <210> 5511 <400> 5511 000 <210> 5512 <400> 5512 000 <210> 5513 <400> 5513 000 <210> 5514 <400> 5514 000 <210> 5515 <400> 5515 000 <210> 5516 <400> 5516 000 <210> 5517 <400> 5517 000 <210> 5518 <400> 5518 000 <210> 5519 <400> 5519 000 <210> 5520 <400> 5520 000 <210> 5521 <400> 5521 000 <210> 5522 <400> 5522 000 <210> 5523 <400> 5523 000 <210> 5524 <400> 5524 000 <210> 5525 <400> 5525 000 <210> 5526 <400> 5526 000 <210> 5527 <400> 5527 000 <210> 5528 <400> 5528 000 <210> 5529 <400> 5529 000 <210> 5530 <400> 5530 000 <210> 5531 <400> 5531 000 <210> 5532 <400> 5532 000 <210> 5533 <400> 5533 000 <210> 5534 <400> 5534 000 <210> 5535 <400> 5535 000 <210> 5536 <400> 5536 000 <210> 5537 <400> 5537 000 <210> 5538 <400> 5538 000 <210> 5539 <400> 5539 000 <210> 5540 <400> 5540 000 <210> 5541 <400> 5541 000 <210> 5542 <400> 5542 000 <210> 5543 <400> 5543 000 <210> 5544 <400> 5544 000 <210> 5545 <400> 5545 000 <210> 5546 <400> 5546 000 <210> 5547 <400> 5547 000 <210> 5548 <400> 5548 000 <210> 5549 <400> 5549 000 <210> 5550 <400> 5550 000 <210> 5551 <400> 5551 000 <210> 5552 <400> 5552 000 <210> 5553 <400> 5553 000 <210> 5554 <400> 5554 000 <210> 5555 <400> 5555 000 <210> 5556 <400> 5556 000 <210> 5557 <400> 5557 000 <210> 5558 <400> 5558 000 <210> 5559 <400> 5559 000 <210> 5560 <400> 5560 000 <210> 5561 <400> 5561 000 <210> 5562 <400> 5562 000 <210> 5563 <400> 5563 000 <210> 5564 <400> 5564 000 <210> 5565 <400> 5565 000 <210> 5566 <400> 5566 000 <210> 5567 <400> 5567 000 <210> 5568 <400> 5568 000 <210> 5569 <400> 5569 000 <210> 5570 <400> 5570 000 <210> 5571 <400> 5571 000 <210> 5572 <400> 5572 000 <210> 5573 <400> 5573 000 <210> 5574 <400> 5574 000 <210> 5575 <400> 5575 000 <210> 5576 <400> 5576 000 <210> 5577 <400> 5577 000 <210> 5578 <400> 5578 000 <210> 5579 <400> 5579 000 <210> 5580 <400> 5580 000 <210> 5581 <400> 5581 000 <210> 5582 <400> 5582 000 <210> 5583 <400> 5583 000 <210> 5584 <400> 5584 000 <210> 5585 <400> 5585 000 <210> 5586 <400> 5586 000 <210> 5587 <400> 5587 000 <210> 5588 <400> 5588 000 <210> 5589 <400> 5589 000 <210> 5590 <400> 5590 000 <210> 5591 <400> 5591 000 <210> 5592 <400> 5592 000 <210> 5593 <400> 5593 000 <210> 5594 <400> 5594 000 <210> 5595 <400> 5595 000 <210> 5596 <400> 5596 000 <210> 5597 <400> 5597 000 <210> 5598 <400> 5598 000 <210> 5599 <400> 5599 000 <210> 5600 <400> 5600 000 <210> 5601 <400> 5601 000 <210> 5602 <400> 5602 000 <210> 5603 <400> 5603 000 <210> 5604 <400> 5604 000 <210> 5605 <400> 5605 000 <210> 5606 <400> 5606 000 <210> 5607 <400> 5607 000 <210> 5608 <400> 5608 000 <210> 5609 <400> 5609 000 <210> 5610 <400> 5610 000 <210> 5611 <400> 5611 000 <210> 5612 <400> 5612 000 <210> 5613 <400> 5613 000 <210> 5614 <400> 5614 000 <210> 5615 <400> 5615 000 <210> 5616 <400> 5616 000 <210> 5617 <400> 5617 000 <210> 5618 <400> 5618 000 <210> 5619 <400> 5619 000 <210> 5620 <400> 5620 000 <210> 5621 <400> 5621 000 <210> 5622 <400> 5622 000 <210> 5623 <400> 5623 000 <210> 5624 <400> 5624 000 <210> 5625 <400> 5625 000 <210> 5626 <400> 5626 000 <210> 5627 <400> 5627 000 <210> 5628 <400> 5628 000 <210> 5629 <400> 5629 000 <210> 5630 <400> 5630 000 <210> 5631 <400> 5631 000 <210> 5632 <400> 5632 000 <210> 5633 <400> 5633 000 <210> 5634 <400> 5634 000 <210> 5635 <400> 5635 000 <210> 5636 <400> 5636 000 <210> 5637 <400> 5637 000 <210> 5638 <400> 5638 000 <210> 5639 <400> 5639 000 <210> 5640 <400> 5640 000 <210> 5641 <400> 5641 000 <210> 5642 <400> 5642 000 <210> 5643 <400> 5643 000 <210> 5644 <400> 5644 000 <210> 5645 <400> 5645 000 <210> 5646 <400> 5646 000 <210> 5647 <400> 5647 000 <210> 5648 <400> 5648 000 <210> 5649 <400> 5649 000 <210> 5650 <400> 5650 000 <210> 5651 <400> 5651 000 <210> 5652 <400> 5652 000 <210> 5653 <400> 5653 000 <210> 5654 <400> 5654 000 <210> 5655 <400> 5655 000 <210> 5656 <400> 5656 000 <210> 5657 <400> 5657 000 <210> 5658 <400> 5658 000 <210> 5659 <400> 5659 000 <210> 5660 <400> 5660 000 <210> 5661 <400> 5661 000 <210> 5662 <400> 5662 000 <210> 5663 <400> 5663 000 <210> 5664 <400> 5664 000 <210> 5665 <400> 5665 000 <210> 5666 <400> 5666 000 <210> 5667 <400> 5667 000 <210> 5668 <400> 5668 000 <210> 5669 <400> 5669 000 <210> 5670 <400> 5670 000 <210> 5671 <400> 5671 000 <210> 5672 <400> 5672 000 <210> 5673 <400> 5673 000 <210> 5674 <400> 5674 000 <210> 5675 <400> 5675 000 <210> 5676 <400> 5676 000 <210> 5677 <400> 5677 000 <210> 5678 <400> 5678 000 <210> 5679 <400> 5679 000 <210> 5680 <400> 5680 000 <210> 5681 <400> 5681 000 <210> 5682 <400> 5682 000 <210> 5683 <400> 5683 000 <210> 5684 <400> 5684 000 <210> 5685 <400> 5685 000 <210> 5686 <400> 5686 000 <210> 5687 <400> 5687 000 <210> 5688 <400> 5688 000 <210> 5689 <400> 5689 000 <210> 5690 <400> 5690 000 <210> 5691 <400> 5691 000 <210> 5692 <400> 5692 000 <210> 5693 <400> 5693 000 <210> 5694 <400> 5694 000 <210> 5695 <400> 5695 000 <210> 5696 <400> 5696 000 <210> 5697 <400> 5697 000 <210> 5698 <400> 5698 000 <210> 5699 <400> 5699 000 <210> 5700 <400> 5700 000 <210> 5701 <400> 5701 000 <210> 5702 <400> 5702 000 <210> 5703 <400> 5703 000 <210> 5704 <400> 5704 000 <210> 5705 <400> 5705 000 <210> 5706 <400> 5706 000 <210> 5707 <400> 5707 000 <210> 5708 <400> 5708 000 <210> 5709 <400> 5709 000 <210> 5710 <400> 5710 000 <210> 5711 <400> 5711 000 <210> 5712 <400> 5712 000 <210> 5713 <400> 5713 000 <210> 5714 <400> 5714 000 <210> 5715 <400> 5715 000 <210> 5716 <400> 5716 000 <210> 5717 <400> 5717 000 <210> 5718 <400> 5718 000 <210> 5719 <400> 5719 000 <210> 5720 <400> 5720 000 <210> 5721 <400> 5721 000 <210> 5722 <400> 5722 000 <210> 5723 <400> 5723 000 <210> 5724 <400> 5724 000 <210> 5725 <400> 5725 000 <210> 5726 <400> 5726 000 <210> 5727 <400> 5727 000 <210> 5728 <400> 5728 000 <210> 5729 <400> 5729 000 <210> 5730 <400> 5730 000 <210> 5731 <400> 5731 000 <210> 5732 <400> 5732 000 <210> 5733 <400> 5733 000 <210> 5734 <400> 5734 000 <210> 5735 <400> 5735 000 <210> 5736 <400> 5736 000 <210> 5737 <400> 5737 000 <210> 5738 <400> 5738 000 <210> 5739 <400> 5739 000 <210> 5740 <400> 5740 000 <210> 5741 <400> 5741 000 <210> 5742 <400> 5742 000 <210> 5743 <400> 5743 000 <210> 5744 <400> 5744 000 <210> 5745 <400> 5745 000 <210> 5746 <400> 5746 000 <210> 5747 <400> 5747 000 <210> 5748 <400> 5748 000 <210> 5749 <400> 5749 000 <210> 5750 <400> 5750 000 <210> 5751 <400> 5751 000 <210> 5752 <400> 5752 000 <210> 5753 <400> 5753 000 <210> 5754 <400> 5754 000 <210> 5755 <400> 5755 000 <210> 5756 <400> 5756 000 <210> 5757 <400> 5757 000 <210> 5758 <400> 5758 000 <210> 5759 <400> 5759 000 <210> 5760 <400> 5760 000 <210> 5761 <400> 5761 000 <210> 5762 <400> 5762 000 <210> 5763 <400> 5763 000 <210> 5764 <400> 5764 000 <210> 5765 <400> 5765 000 <210> 5766 <400> 5766 000 <210> 5767 <400> 5767 000 <210> 5768 <400> 5768 000 <210> 5769 <400> 5769 000 <210> 5770 <400> 5770 000 <210> 5771 <400> 5771 000 <210> 5772 <400> 5772 000 <210> 5773 <400> 5773 000 <210> 5774 <400> 5774 000 <210> 5775 <400> 5775 000 <210> 5776 <400> 5776 000 <210> 5777 <400> 5777 000 <210> 5778 <400> 5778 000 <210> 5779 <400> 5779 000 <210> 5780 <400> 5780 000 <210> 5781 <400> 5781 000 <210> 5782 <400> 5782 000 <210> 5783 <400> 5783 000 <210> 5784 <400> 5784 000 <210> 5785 <400> 5785 000 <210> 5786 <400> 5786 000 <210> 5787 <400> 5787 000 <210> 5788 <400> 5788 000 <210> 5789 <400> 5789 000 <210> 5790 <400> 5790 000 <210> 5791 <400> 5791 000 <210> 5792 <400> 5792 000 <210> 5793 <400> 5793 000 <210> 5794 <400> 5794 000 <210> 5795 <400> 5795 000 <210> 5796 <400> 5796 000 <210> 5797 <400> 5797 000 <210> 5798 <400> 5798 000 <210> 5799 <400> 5799 000 <210> 5800 <400> 5800 000 <210> 5801 <400> 5801 000 <210> 5802 <400> 5802 000 <210> 5803 <400> 5803 000 <210> 5804 <400> 5804 000 <210> 5805 <400> 5805 000 <210> 5806 <400> 5806 000 <210> 5807 <400> 5807 000 <210> 5808 <400> 5808 000 <210> 5809 <400> 5809 000 <210> 5810 <400> 5810 000 <210> 5811 <400> 5811 000 <210> 5812 <400> 5812 000 <210> 5813 <400> 5813 000 <210> 5814 <400> 5814 000 <210> 5815 <400> 5815 000 <210> 5816 <400> 5816 000 <210> 5817 <400> 5817 000 <210> 5818 <400> 5818 000 <210> 5819 <400> 5819 000 <210> 5820 <400> 5820 000 <210> 5821 <400> 5821 000 <210> 5822 <400> 5822 000 <210> 5823 <400> 5823 000 <210> 5824 <400> 5824 000 <210> 5825 <400> 5825 000 <210> 5826 <400> 5826 000 <210> 5827 <400> 5827 000 <210> 5828 <400> 5828 000 <210> 5829 <400> 5829 000 <210> 5830 <400> 5830 000 <210> 5831 <400> 5831 000 <210> 5832 <400> 5832 000 <210> 5833 <400> 5833 000 <210> 5834 <400> 5834 000 <210> 5835 <400> 5835 000 <210> 5836 <400> 5836 000 <210> 5837 <400> 5837 000 <210> 5838 <400> 5838 000 <210> 5839 <400> 5839 000 <210> 5840 <400> 5840 000 <210> 5841 <400> 5841 000 <210> 5842 <400> 5842 000 <210> 5843 <400> 5843 000 <210> 5844 <400> 5844 000 <210> 5845 <400> 5845 000 <210> 5846 <400> 5846 000 <210> 5847 <400> 5847 000 <210> 5848 <400> 5848 000 <210> 5849 <400> 5849 000 <210> 5850 <400> 5850 000 <210> 5851 <400> 5851 000 <210> 5852 <400> 5852 000 <210> 5853 <400> 5853 000 <210> 5854 <400> 5854 000 <210> 5855 <400> 5855 000 <210> 5856 <400> 5856 000 <210> 5857 <400> 5857 000 <210> 5858 <400> 5858 000 <210> 5859 <400> 5859 000 <210> 5860 <400> 5860 000 <210> 5861 <400> 5861 000 <210> 5862 <400> 5862 000 <210> 5863 <400> 5863 000 <210> 5864 <400> 5864 000 <210> 5865 <400> 5865 000 <210> 5866 <400> 5866 000 <210> 5867 <400> 5867 000 <210> 5868 <400> 5868 000 <210> 5869 <400> 5869 000 <210> 5870 <400> 5870 000 <210> 5871 <400> 5871 000 <210> 5872 <400> 5872 000 <210> 5873 <400> 5873 000 <210> 5874 <400> 5874 000 <210> 5875 <400> 5875 000 <210> 5876 <400> 5876 000 <210> 5877 <400> 5877 000 <210> 5878 <400> 5878 000 <210> 5879 <400> 5879 000 <210> 5880 <400> 5880 000 <210> 5881 <400> 5881 000 <210> 5882 <400> 5882 000 <210> 5883 <400> 5883 000 <210> 5884 <400> 5884 000 <210> 5885 <400> 5885 000 <210> 5886 <400> 5886 000 <210> 5887 <400> 5887 000 <210> 5888 <400> 5888 000 <210> 5889 <400> 5889 000 <210> 5890 <400> 5890 000 <210> 5891 <400> 5891 000 <210> 5892 <400> 5892 000 <210> 5893 <400> 5893 000 <210> 5894 <400> 5894 000 <210> 5895 <400> 5895 000 <210> 5896 <400> 5896 000 <210> 5897 <400> 5897 000 <210> 5898 <400> 5898 000 <210> 5899 <400> 5899 000 <210> 5900 <400> 5900 000 <210> 5901 <400> 5901 000 <210> 5902 <400> 5902 000 <210> 5903 <400> 5903 000 <210> 5904 <400> 5904 000 <210> 5905 <400> 5905 000 <210> 5906 <400> 5906 000 <210> 5907 <400> 5907 000 <210> 5908 <400> 5908 000 <210> 5909 <400> 5909 000 <210> 5910 <400> 5910 000 <210> 5911 <400> 5911 000 <210> 5912 <400> 5912 000 <210> 5913 <400> 5913 000 <210> 5914 <400> 5914 000 <210> 5915 <400> 5915 000 <210> 5916 <400> 5916 000 <210> 5917 <400> 5917 000 <210> 5918 <400> 5918 000 <210> 5919 <400> 5919 000 <210> 5920 <400> 5920 000 <210> 5921 <400> 5921 000 <210> 5922 <400> 5922 000 <210> 5923 <400> 5923 000 <210> 5924 <400> 5924 000 <210> 5925 <400> 5925 000 <210> 5926 <400> 5926 000 <210> 5927 <400> 5927 000 <210> 5928 <400> 5928 000 <210> 5929 <400> 5929 000 <210> 5930 <400> 5930 000 <210> 5931 <400> 5931 000 <210> 5932 <400> 5932 000 <210> 5933 <400> 5933 000 <210> 5934 <400> 5934 000 <210> 5935 <400> 5935 000 <210> 5936 <400> 5936 000 <210> 5937 <400> 5937 000 <210> 5938 <400> 5938 000 <210> 5939 <400> 5939 000 <210> 5940 <400> 5940 000 <210> 5941 <400> 5941 000 <210> 5942 <400> 5942 000 <210> 5943 <400> 5943 000 <210> 5944 <400> 5944 000 <210> 5945 <400> 5945 000 <210> 5946 <400> 5946 000 <210> 5947 <400> 5947 000 <210> 5948 <400> 5948 000 <210> 5949 <400> 5949 000 <210> 5950 <400> 5950 000 <210> 5951 <400> 5951 000 <210> 5952 <400> 5952 000 <210> 5953 <400> 5953 000 <210> 5954 <400> 5954 000 <210> 5955 <400> 5955 000 <210> 5956 <400> 5956 000 <210> 5957 <400> 5957 000 <210> 5958 <400> 5958 000 <210> 5959 <400> 5959 000 <210> 5960 <400> 5960 000 <210> 5961 <400> 5961 000 <210> 5962 <400> 5962 000 <210> 5963 <400> 5963 000 <210> 5964 <400> 5964 000 <210> 5965 <400> 5965 000 <210> 5966 <400> 5966 000 <210> 5967 <400> 5967 000 <210> 5968 <400> 5968 000 <210> 5969 <400> 5969 000 <210> 5970 <400> 5970 000 <210> 5971 <400> 5971 000 <210> 5972 <400> 5972 000 <210> 5973 <400> 5973 000 <210> 5974 <400> 5974 000 <210> 5975 <400> 5975 000 <210> 5976 <400> 5976 000 <210> 5977 <400> 5977 000 <210> 5978 <400> 5978 000 <210> 5979 <400> 5979 000 <210> 5980 <400> 5980 000 <210> 5981 <400> 5981 000 <210> 5982 <400> 5982 000 <210> 5983 <400> 5983 000 <210> 5984 <400> 5984 000 <210> 5985 <400> 5985 000 <210> 5986 <400> 5986 000 <210> 5987 <400> 5987 000 <210> 5988 <400> 5988 000 <210> 5989 <400> 5989 000 <210> 5990 <400> 5990 000 <210> 5991 <400> 5991 000 <210> 5992 <400> 5992 000 <210> 5993 <400> 5993 000 <210> 5994 <400> 5994 000 <210> 5995 <400> 5995 000 <210> 5996 <400> 5996 000 <210> 5997 <400> 5997 000 <210> 5998 <400> 5998 000 <210> 5999 <400> 5999 000 <210> 6000 <400> 6000 000 <210> 6001 <400> 6001 000 <210> 6002 <400> 6002 000 <210> 6003 <400> 6003 000 <210> 6004 <400> 6004 000 <210> 6005 <400> 6005 000 <210> 6006 <400> 6006 000 <210> 6007 <400> 6007 000 <210> 6008 <400> 6008 000 <210> 6009 <400> 6009 000 <210> 6010 <400> 6010 000 <210> 6011 <400> 6011 000 <210> 6012 <400> 6012 000 <210> 6013 <400> 6013 000 <210> 6014 <400> 6014 000 <210> 6015 <400> 6015 000 <210> 6016 <400> 6016 000 <210> 6017 <400> 6017 000 <210> 6018 <400> 6018 000 <210> 6019 <400> 6019 000 <210> 6020 <400> 6020 000 <210> 6021 <400> 6021 000 <210> 6022 <400> 6022 000 <210> 6023 <400> 6023 000 <210> 6024 <400> 6024 000 <210> 6025 <400> 6025 000 <210> 6026 <400> 6026 000 <210> 6027 <400> 6027 000 <210> 6028 <400> 6028 000 <210> 6029 <400> 6029 000 <210> 6030 <400> 6030 000 <210> 6031 <400> 6031 000 <210> 6032 <400> 6032 000 <210> 6033 <400> 6033 000 <210> 6034 <400> 6034 000 <210> 6035 <400> 6035 000 <210> 6036 <400> 6036 000 <210> 6037 <400> 6037 000 <210> 6038 <400> 6038 000 <210> 6039 <400> 6039 000 <210> 6040 <400> 6040 000 <210> 6041 <400> 6041 000 <210> 6042 <400> 6042 000 <210> 6043 <400> 6043 000 <210> 6044 <400> 6044 000 <210> 6045 <400> 6045 000 <210> 6046 <400> 6046 000 <210> 6047 <400> 6047 000 <210> 6048 <400> 6048 000 <210> 6049 <400> 6049 000 <210> 6050 <400> 6050 000 <210> 6051 <400> 6051 000 <210> 6052 <400> 6052 000 <210> 6053 <400> 6053 000 <210> 6054 <400> 6054 000 <210> 6055 <400> 6055 000 <210> 6056 <400> 6056 000 <210> 6057 <400> 6057 000 <210> 6058 <400> 6058 000 <210> 6059 <400> 6059 000 <210> 6060 <400> 6060 000 <210> 6061 <400> 6061 000 <210> 6062 <400> 6062 000 <210> 6063 <400> 6063 000 <210> 6064 <400> 6064 000 <210> 6065 <400> 6065 000 <210> 6066 <400> 6066 000 <210> 6067 <400> 6067 000 <210> 6068 <400> 6068 000 <210> 6069 <400> 6069 000 <210> 6070 <400> 6070 000 <210> 6071 <400> 6071 000 <210> 6072 <400> 6072 000 <210> 6073 <400> 6073 000 <210> 6074 <400> 6074 000 <210> 6075 <400> 6075 000 <210> 6076 <400> 6076 000 <210> 6077 <400> 6077 000 <210> 6078 <400> 6078 000 <210> 6079 <400> 6079 000 <210> 6080 <400> 6080 000 <210> 6081 <400> 6081 000 <210> 6082 <400> 6082 000 <210> 6083 <400> 6083 000 <210> 6084 <400> 6084 000 <210> 6085 <400> 6085 000 <210> 6086 <400> 6086 000 <210> 6087 <400> 6087 000 <210> 6088 <400> 6088 000 <210> 6089 <400> 6089 000 <210> 6090 <400> 6090 000 <210> 6091 <400> 6091 000 <210> 6092 <400> 6092 000 <210> 6093 <400> 6093 000 <210> 6094 <400> 6094 000 <210> 6095 <400> 6095 000 <210> 6096 <400> 6096 000 <210> 6097 <400> 6097 000 <210> 6098 <400> 6098 000 <210> 6099 <400> 6099 000 <210> 6100 <400> 6100 000 <210> 6101 <400> 6101 000 <210> 6102 <400> 6102 000 <210> 6103 <400> 6103 000 <210> 6104 <400> 6104 000 <210> 6105 <400> 6105 000 <210> 6106 <400> 6106 000 <210> 6107 <400> 6107 000 <210> 6108 <400> 6108 000 <210> 6109 <400> 6109 000 <210> 6110 <400> 6110 000 <210> 6111 <400> 6111 000 <210> 6112 <400> 6112 000 <210> 6113 <400> 6113 000 <210> 6114 <400> 6114 000 <210> 6115 <400> 6115 000 <210> 6116 <400> 6116 000 <210> 6117 <400> 6117 000 <210> 6118 <400> 6118 000 <210> 6119 <400> 6119 000 <210> 6120 <400> 6120 000 <210> 6121 <400> 6121 000 <210> 6122 <400> 6122 000 <210> 6123 <400> 6123 000 <210> 6124 <400> 6124 000 <210> 6125 <400> 6125 000 <210> 6126 <400> 6126 000 <210> 6127 <400> 6127 000 <210> 6128 <400> 6128 000 <210> 6129 <400> 6129 000 <210> 6130 <400> 6130 000 <210> 6131 <400> 6131 000 <210> 6132 <400> 6132 000 <210> 6133 <400> 6133 000 <210> 6134 <400> 6134 000 <210> 6135 <400> 6135 000 <210> 6136 <400> 6136 000 <210> 6137 <400> 6137 000 <210> 6138 <400> 6138 000 <210> 6139 <400> 6139 000 <210> 6140 <400> 6140 000 <210> 6141 <400> 6141 000 <210> 6142 <400> 6142 000 <210> 6143 <400> 6143 000 <210> 6144 <400> 6144 000 <210> 6145 <400> 6145 000 <210> 6146 <400> 6146 000 <210> 6147 <400> 6147 000 <210> 6148 <400> 6148 000 <210> 6149 <400> 6149 000 <210> 6150 <400> 6150 000 <210> 6151 <400> 6151 000 <210> 6152 <400> 6152 000 <210> 6153 <400> 6153 000 <210> 6154 <400> 6154 000 <210> 6155 <400> 6155 000 <210> 6156 <400> 6156 000 <210> 6157 <400> 6157 000 <210> 6158 <400> 6158 000 <210> 6159 <400> 6159 000 <210> 6160 <400> 6160 000 <210> 6161 <400> 6161 000 <210> 6162 <400> 6162 000 <210> 6163 <400> 6163 000 <210> 6164 <400> 6164 000 <210> 6165 <400> 6165 000 <210> 6166 <400> 6166 000 <210> 6167 <400> 6167 000 <210> 6168 <400> 6168 000 <210> 6169 <400> 6169 000 <210> 6170 <400> 6170 000 <210> 6171 <400> 6171 000 <210> 6172 <400> 6172 000 <210> 6173 <400> 6173 000 <210> 6174 <400> 6174 000 <210> 6175 <400> 6175 000 <210> 6176 <400> 6176 000 <210> 6177 <400> 6177 000 <210> 6178 <400> 6178 000 <210> 6179 <400> 6179 000 <210> 6180 <400> 6180 000 <210> 6181 <400> 6181 000 <210> 6182 <400> 6182 000 <210> 6183 <400> 6183 000 <210> 6184 <400> 6184 000 <210> 6185 <400> 6185 000 <210> 6186 <400> 6186 000 <210> 6187 <400> 6187 000 <210> 6188 <400> 6188 000 <210> 6189 <400> 6189 000 <210> 6190 <400> 6190 000 <210> 6191 <400> 6191 000 <210> 6192 <400> 6192 000 <210> 6193 <400> 6193 000 <210> 6194 <400> 6194 000 <210> 6195 <400> 6195 000 <210> 6196 <400> 6196 000 <210> 6197 <400> 6197 000 <210> 6198 <400> 6198 000 <210> 6199 <400> 6199 000 <210> 6200 <400> 6200 000 <210> 6201 <400> 6201 000 <210> 6202 <400> 6202 000 <210> 6203 <400> 6203 000 <210> 6204 <400> 6204 000 <210> 6205 <400> 6205 000 <210> 6206 <400> 6206 000 <210> 6207 <400> 6207 000 <210> 6208 <400> 6208 000 <210> 6209 <400> 6209 000 <210> 6210 <400> 6210 000 <210> 6211 <400> 6211 000 <210> 6212 <400> 6212 000 <210> 6213 <400> 6213 000 <210> 6214 <400> 6214 000 <210> 6215 <400> 6215 000 <210> 6216 <400> 6216 000 <210> 6217 <400> 6217 000 <210> 6218 <400> 6218 000 <210> 6219 <400> 6219 000 <210> 6220 <400> 6220 000 <210> 6221 <400> 6221 000 <210> 6222 <400> 6222 000 <210> 6223 <400> 6223 000 <210> 6224 <400> 6224 000 <210> 6225 <400> 6225 000 <210> 6226 <400> 6226 000 <210> 6227 <400> 6227 000 <210> 6228 <400> 6228 000 <210> 6229 <400> 6229 000 <210> 6230 <400> 6230 000 <210> 6231 <400> 6231 000 <210> 6232 <400> 6232 000 <210> 6233 <400> 6233 000 <210> 6234 <400> 6234 000 <210> 6235 <400> 6235 000 <210> 6236 <400> 6236 000 <210> 6237 <400> 6237 000 <210> 6238 <400> 6238 000 <210> 6239 <400> 6239 000 <210> 6240 <400> 6240 000 <210> 6241 <400> 6241 000 <210> 6242 <400> 6242 000 <210> 6243 <400> 6243 000 <210> 6244 <400> 6244 000 <210> 6245 <400> 6245 000 <210> 6246 <400> 6246 000 <210> 6247 <400> 6247 000 <210> 6248 <400> 6248 000 <210> 6249 <400> 6249 000 <210> 6250 <400> 6250 000 <210> 6251 <400> 6251 000 <210> 6252 <400> 6252 000 <210> 6253 <400> 6253 000 <210> 6254 <400> 6254 000 <210> 6255 <400> 6255 000 <210> 6256 <400> 6256 000 <210> 6257 <400> 6257 000 <210> 6258 <400> 6258 000 <210> 6259 <400> 6259 000 <210> 6260 <400> 6260 000 <210> 6261 <400> 6261 000 <210> 6262 <400> 6262 000 <210> 6263 <400> 6263 000 <210> 6264 <400> 6264 000 <210> 6265 <400> 6265 000 <210> 6266 <400> 6266 000 <210> 6267 <400> 6267 000 <210> 6268 <400> 6268 000 <210> 6269 <400> 6269 000 <210> 6270 <400> 6270 000 <210> 6271 <400> 6271 000 <210> 6272 <400> 6272 000 <210> 6273 <400> 6273 000 <210> 6274 <400> 6274 000 <210> 6275 <400> 6275 000 <210> 6276 <400> 6276 000 <210> 6277 <400> 6277 000 <210> 6278 <400> 6278 000 <210> 6279 <400> 6279 000 <210> 6280 <400> 6280 000 <210> 6281 <400> 6281 000 <210> 6282 <400> 6282 000 <210> 6283 <400> 6283 000 <210> 6284 <400> 6284 000 <210> 6285 <400> 6285 000 <210> 6286 <400> 6286 000 <210> 6287 <400> 6287 000 <210> 6288 <400> 6288 000 <210> 6289 <400> 6289 000 <210> 6290 <400> 6290 000 <210> 6291 <400> 6291 000 <210> 6292 <400> 6292 000 <210> 6293 <400> 6293 000 <210> 6294 <400> 6294 000 <210> 6295 <400> 6295 000 <210> 6296 <400> 6296 000 <210> 6297 <400> 6297 000 <210> 6298 <400> 6298 000 <210> 6299 <400> 6299 000 <210> 6300 <400> 6300 000 <210> 6301 <400> 6301 000 <210> 6302 <400> 6302 000 <210> 6303 <400> 6303 000 <210> 6304 <400> 6304 000 <210> 6305 <400> 6305 000 <210> 6306 <400> 6306 000 <210> 6307 <400> 6307 000 <210> 6308 <400> 6308 000 <210> 6309 <400> 6309 000 <210> 6310 <400> 6310 000 <210> 6311 <400> 6311 000 <210> 6312 <400> 6312 000 <210> 6313 <400> 6313 000 <210> 6314 <400> 6314 000 <210> 6315 <400> 6315 000 <210> 6316 <400> 6316 000 <210> 6317 <400> 6317 000 <210> 6318 <400> 6318 000 <210> 6319 <400> 6319 000 <210> 6320 <400> 6320 000 <210> 6321 <400> 6321 000 <210> 6322 <400> 6322 000 <210> 6323 <400> 6323 000 <210> 6324 <400> 6324 000 <210> 6325 <400> 6325 000 <210> 6326 <400> 6326 000 <210> 6327 <400> 6327 000 <210> 6328 <400> 6328 000 <210> 6329 <400> 6329 000 <210> 6330 <400> 6330 000 <210> 6331 <400> 6331 000 <210> 6332 <400> 6332 000 <210> 6333 <400> 6333 000 <210> 6334 <400> 6334 000 <210> 6335 <400> 6335 000 <210> 6336 <400> 6336 000 <210> 6337 <400> 6337 000 <210> 6338 <400> 6338 000 <210> 6339 <400> 6339 000 <210> 6340 <400> 6340 000 <210> 6341 <400> 6341 000 <210> 6342 <400> 6342 000 <210> 6343 <400> 6343 000 <210> 6344 <400> 6344 000 <210> 6345 <400> 6345 000 <210> 6346 <400> 6346 000 <210> 6347 <400> 6347 000 <210> 6348 <400> 6348 000 <210> 6349 <400> 6349 000 <210> 6350 <400> 6350 000 <210> 6351 <400> 6351 000 <210> 6352 <400> 6352 000 <210> 6353 <400> 6353 000 <210> 6354 <400> 6354 000 <210> 6355 <400> 6355 000 <210> 6356 <400> 6356 000 <210> 6357 <400> 6357 000 <210> 6358 <400> 6358 000 <210> 6359 <400> 6359 000 <210> 6360 <400> 6360 000 <210> 6361 <400> 6361 000 <210> 6362 <400> 6362 000 <210> 6363 <400> 6363 000 <210> 6364 <400> 6364 000 <210> 6365 <400> 6365 000 <210> 6366 <400> 6366 000 <210> 6367 <400> 6367 000 <210> 6368 <400> 6368 000 <210> 6369 <400> 6369 000 <210> 6370 <400> 6370 000 <210> 6371 <400> 6371 000 <210> 6372 <400> 6372 000 <210> 6373 <400> 6373 000 <210> 6374 <400> 6374 000 <210> 6375 <400> 6375 000 <210> 6376 <400> 6376 000 <210> 6377 <400> 6377 000 <210> 6378 <400> 6378 000 <210> 6379 <400> 6379 000 <210> 6380 <400> 6380 000 <210> 6381 <400> 6381 000 <210> 6382 <400> 6382 000 <210> 6383 <400> 6383 000 <210> 6384 <400> 6384 000 <210> 6385 <400> 6385 000 <210> 6386 <400> 6386 000 <210> 6387 <400> 6387 000 <210> 6388 <400> 6388 000 <210> 6389 <400> 6389 000 <210> 6390 <400> 6390 000 <210> 6391 <400> 6391 000 <210> 6392 <400> 6392 000 <210> 6393 <400> 6393 000 <210> 6394 <400> 6394 000 <210> 6395 <400> 6395 000 <210> 6396 <400> 6396 000 <210> 6397 <400> 6397 000 <210> 6398 <400> 6398 000 <210> 6399 <400> 6399 000 <210> 6400 <400> 6400 000 <210> 6401 <400> 6401 000 <210> 6402 <400> 6402 000 <210> 6403 <400> 6403 000 <210> 6404 <400> 6404 000 <210> 6405 <400> 6405 000 <210> 6406 <400> 6406 000 <210> 6407 <400> 6407 000 <210> 6408 <400> 6408 000 <210> 6409 <400> 6409 000 <210> 6410 <400> 6410 000 <210> 6411 <400> 6411 000 <210> 6412 <400> 6412 000 <210> 6413 <400> 6413 000 <210> 6414 <400> 6414 000 <210> 6415 <400> 6415 000 <210> 6416 <400> 6416 000 <210> 6417 <400> 6417 000 <210> 6418 <400> 6418 000 <210> 6419 <400> 6419 000 <210> 6420 <400> 6420 000 <210> 6421 <400> 6421 000 <210> 6422 <400> 6422 000 <210> 6423 <400> 6423 000 <210> 6424 <400> 6424 000 <210> 6425 <400> 6425 000 <210> 6426 <400> 6426 000 <210> 6427 <400> 6427 000 <210> 6428 <400> 6428 000 <210> 6429 <400> 6429 000 <210> 6430 <400> 6430 000 <210> 6431 <400> 6431 000 <210> 6432 <400> 6432 000 <210> 6433 <400> 6433 000 <210> 6434 <400> 6434 000 <210> 6435 <400> 6435 000 <210> 6436 <400> 6436 000 <210> 6437 <400> 6437 000 <210> 6438 <400> 6438 000 <210> 6439 <400> 6439 000 <210> 6440 <400> 6440 000 <210> 6441 <400> 6441 000 <210> 6442 <400> 6442 000 <210> 6443 <400> 6443 000 <210> 6444 <400> 6444 000 <210> 6445 <400> 6445 000 <210> 6446 <400> 6446 000 <210> 6447 <400> 6447 000 <210> 6448 <400> 6448 000 <210> 6449 <400> 6449 000 <210> 6450 <400> 6450 000 <210> 6451 <400> 6451 000 <210> 6452 <400> 6452 000 <210> 6453 <400> 6453 000 <210> 6454 <400> 6454 000 <210> 6455 <400> 6455 000 <210> 6456 <400> 6456 000 <210> 6457 <400> 6457 000 <210> 6458 <400> 6458 000 <210> 6459 <400> 6459 000 <210> 6460 <400> 6460 000 <210> 6461 <400> 6461 000 <210> 6462 <400> 6462 000 <210> 6463 <400> 6463 000 <210> 6464 <400> 6464 000 <210> 6465 <400> 6465 000 <210> 6466 <400> 6466 000 <210> 6467 <400> 6467 000 <210> 6468 <400> 6468 000 <210> 6469 <400> 6469 000 <210> 6470 <400> 6470 000 <210> 6471 <400> 6471 000 <210> 6472 <400> 6472 000 <210> 6473 <400> 6473 000 <210> 6474 <400> 6474 000 <210> 6475 <400> 6475 000 <210> 6476 <400> 6476 000 <210> 6477 <400> 6477 000 <210> 6478 <400> 6478 000 <210> 6479 <400> 6479 000 <210> 6480 <400> 6480 000 <210> 6481 <400> 6481 000 <210> 6482 <400> 6482 000 <210> 6483 <400> 6483 000 <210> 6484 <400> 6484 000 <210> 6485 <400> 6485 000 <210> 6486 <400> 6486 000 <210> 6487 <400> 6487 000 <210> 6488 <400> 6488 000 <210> 6489 <400> 6489 000 <210> 6490 <400> 6490 000 <210> 6491 <400> 6491 000 <210> 6492 <400> 6492 000 <210> 6493 <400> 6493 000 <210> 6494 <400> 6494 000 <210> 6495 <400> 6495 000 <210> 6496 <400> 6496 000 <210> 6497 <400> 6497 000 <210> 6498 <400> 6498 000 <210> 6499 <400> 6499 000 <210> 6500 <400> 6500 000 <210> 6501 <400> 6501 000 <210> 6502 <400> 6502 000 <210> 6503 <400> 6503 000 <210> 6504 <400> 6504 000 <210> 6505 <400> 6505 000 <210> 6506 <400> 6506 000 <210> 6507 <400> 6507 000 <210> 6508 <400> 6508 000 <210> 6509 <400> 6509 000 <210> 6510 <400> 6510 000 <210> 6511 <400> 6511 000 <210> 6512 <400> 6512 000 <210> 6513 <400> 6513 000 <210> 6514 <400> 6514 000 <210> 6515 <400> 6515 000 <210> 6516 <400> 6516 000 <210> 6517 <400> 6517 000 <210> 6518 <400> 6518 000 <210> 6519 <400> 6519 000 <210> 6520 <400> 6520 000 <210> 6521 <400> 6521 000 <210> 6522 <400> 6522 000 <210> 6523 <400> 6523 000 <210> 6524 <400> 6524 000 <210> 6525 <400> 6525 000 <210> 6526 <400> 6526 000 <210> 6527 <400> 6527 000 <210> 6528 <400> 6528 000 <210> 6529 <400> 6529 000 <210> 6530 <400> 6530 000 <210> 6531 <400> 6531 000 <210> 6532 <400> 6532 000 <210> 6533 <400> 6533 000 <210> 6534 <400> 6534 000 <210> 6535 <400> 6535 000 <210> 6536 <400> 6536 000 <210> 6537 <400> 6537 000 <210> 6538 <400> 6538 000 <210> 6539 <400> 6539 000 <210> 6540 <400> 6540 000 <210> 6541 <400> 6541 000 <210> 6542 <400> 6542 000 <210> 6543 <400> 6543 000 <210> 6544 <400> 6544 000 <210> 6545 <400> 6545 000 <210> 6546 <400> 6546 000 <210> 6547 <400> 6547 000 <210> 6548 <400> 6548 000 <210> 6549 <400> 6549 000 <210> 6550 <400> 6550 000 <210> 6551 <400> 6551 000 <210> 6552 <400> 6552 000 <210> 6553 <400> 6553 000 <210> 6554 <400> 6554 000 <210> 6555 <400> 6555 000 <210> 6556 <400> 6556 000 <210> 6557 <400> 6557 000 <210> 6558 <400> 6558 000 <210> 6559 <400> 6559 000 <210> 6560 <400> 6560 000 <210> 6561 <400> 6561 000 <210> 6562 <400> 6562 000 <210> 6563 <400> 6563 000 <210> 6564 <400> 6564 000 <210> 6565 <400> 6565 000 <210> 6566 <400> 6566 000 <210> 6567 <400> 6567 000 <210> 6568 <400> 6568 000 <210> 6569 <400> 6569 000 <210> 6570 <400> 6570 000 <210> 6571 <400> 6571 000 <210> 6572 <400> 6572 000 <210> 6573 <400> 6573 000 <210> 6574 <400> 6574 000 <210> 6575 <400> 6575 000 <210> 6576 <400> 6576 000 <210> 6577 <400> 6577 000 <210> 6578 <400> 6578 000 <210> 6579 <400> 6579 000 <210> 6580 <400> 6580 000 <210> 6581 <400> 6581 000 <210> 6582 <400> 6582 000 <210> 6583 <400> 6583 000 <210> 6584 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6584 guuuuagagc ua 12 <210> 6585 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6585 guuuaagagc ua 12 <210> 6586 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6586 ugcug 5 <210> 6587 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6587 uuuug 5 <210> 6588 <211> 4 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6588 gaaa 4 <210> 6589 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6589 uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60 <210> 6590 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6590 uagcaaguuu aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60 <210> 6591 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6591 cagca 5 <210> 6592 <400> 6592 000 <210> 6593 <400> 6593 000 <210> 6594 <400> 6594 000 <210> 6595 <400> 6595 000 <210> 6596 <211> 5000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> /note="This sequence may encompass 50-5000 nucleotides" <400> 6596 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000 <210> 6597 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6597 uagcaaguua aaa 13 <210> 6598 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6598 uagcaaguuu aaa 13 <210> 6599 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6599 uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugc 47 <210> 6600 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6600 uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcuuu u 51 <210> 6601 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6601 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugc 76 <210> 6602 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6602 guuuaagagc uagaaauagc aaguuuaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugc 76 <210> 6603 <211> 86 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6603 guuuuagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac 60 uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 86 <210> 6604 <211> 86 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6604 guuuaagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuuaaau aaggcuaguc cguuaucaac 60 uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 86 <210> 6605 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6605 guuuuagagc uaugcug 17 <210> 6606 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6606 guuuaagagc uaugcug 17 <210> 6607 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6607 guuuuagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 6608 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6608 guuuaagagc uaugcuguuu ug 22 <210> 6609 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6609 cagcauagca aguuaaaaua aggcuagucc guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc 60 ggugc 65 <210> 6610 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6610 cagcauagca aguuuaaaua aggcuagucc guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc 60 ggugc 65 <210> 6611 <211> 1368 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 6611 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala 1010 1015 1020 Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe 1025 1030 1035 Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 <210> 6612 <211> 7 <212> PRT <213> Simian virus 40 <400> 6612 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 6613 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Nucleoplasmin bipartite NLS sequence" <400> 6613 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 6614 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: C-myc NLS sequence" <400> 6614 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 6615 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: C-myc NLS sequence" <400> 6615 Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro 1 5 10 <210> 6616 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6616 Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro 20 25 30 Arg Asn Gln Gly Gly Tyr 35 <210> 6617 <211> 42 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: IBB domain from importin-alpha sequence" <400> 6617 Arg Met Arg Ile Glx Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Thr Ala Glu Leu 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Val Glu Val Ser Val Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys 20 25 30 Asp Glu Gln Ile Leu Lys Arg Arg Asn Val 35 40 <210> 6618 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Myoma T protein sequence" <400> 6618 Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro 1 5 <210> 6619 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Myoma T protein sequence" <400> 6619 Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp 1 5 <210> 6620 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6620 Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu 1 5 <210> 6621 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6621 Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro 1 5 10 <210> 6622 <211> 5 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 6622 Asp Arg Leu Arg Arg 1 5 <210> 6623 <211> 7 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 6623 Pro Lys Gln Lys Lys Arg Lys 1 5 <210> 6624 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis delta virus <400> 6624 Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 6625 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6625 Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg 1 5 10 <210> 6626 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6626 Lys Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys 1 5 10 15 Lys Ser Lys Lys 20 <210> 6627 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6627 Arg Lys Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys 1 5 10 15 Lys <210> 6628 <211> 4107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6628 atggataaaa agtacagcat cgggctggac atcggtacaa actcagtggg gtgggccgtg 60 attacggacg agtacaaggt accctccaaa aaatttaaag tgctgggtaa cacggacaga 120 cactctataa agaaaaatct tattggagcc ttgctgttcg actcaggcga gacagccgaa 180 gccacaaggt tgaagcggac cgccaggagg cggtatacca ggagaaagaa ccgcatatgc 240 tacctgcaag aaatcttcag taacgagatg gcaaaggttg acgatagctt tttccatcgc 300 ctggaagaat cctttcttgt tgaggaagac aagaagcacg aacggcaccc catctttggc 360 aatattgtcg acgaagtggc atatcacgaa aagtacccga ctatctacca cctcaggaag 420 aagctggtgg actctaccga taaggcggac ctcagactta tttatttggc actcgcccac 480 atgattaaat ttagaggaca tttcttgatc gagggcgacc tgaacccgga caacagtgac 540 gtcgataagc tgttcatcca acttgtgcag acctacaatc aactgttcga agaaaaccct 600 ataaatgctt caggagtcga cgctaaagca atcctgtccg cgcgcctctc aaaatctaga 660 agacttgaga atctgattgc tcagttgccc ggggaaaaga aaaatggatt gtttggcaac 720 ctgatcgccc tcagtctcgg actgacccca aatttcaaaa gtaacttcga cctggccgaa 780 gacgctaagc tccagctgtc caaggacaca tacgatgacg acctcgacaa tctgctggcc 840 cagattgggg atcagtacgc cgatctcttt ttggcagcaa agaacctgtc cgacgccatc 900 ctgttgagcg atatcttgag agtgaacacc gaaattacta aagcacccct tagcgcatct 960 atgatcaagc ggtacgacga gcatcatcag gatctgaccc tgctgaaggc tcttgtgagg 1020 caacagctcc ccgaaaaata caaggaaatc ttctttgacc agagcaaaaa cggctacgct 1080 ggctatatag atggtggggc cagtcaggag gaattctata aattcatcaa gcccattctc 1140 gagaaaatgg acggcacaga ggagttgctg gtcaaactta acagggagga cctgctgcgg 1200 aagcagcgga cctttgacaa cgggtctatc ccccaccaga ttcatctggg cgaactgcac 1260 gcaatcctga ggaggcagga ggatttttat ccttttctta aagataaccg cgagaaaata 1320 gaaaagattc ttacattcag gatcccgtac tacgtgggac ctctcgcccg gggcaattca 1380 cggtttgcct ggatgacaag gaagtcagag gagactatta caccttggaa cttcgaagaa 1440 gtggtggaca agggtgcatc tgcccagtct ttcatcgagc ggatgacaaa ttttgacaag 1500 aacctcccta atgagaaggt gctgcccaaa cattctctgc tctacgagta ctttaccgtc 1560 tacaatgaac tgactaaagt caagtacgtc accgagggaa tgaggaagcc ggcattcctt 1620 agtggagaac agaagaaggc gattgtagac ctgttgttca agaccaacag gaaggtgact 1680 gtgaagcaac ttaaagaaga ctactttaag aagatcgaat gttttgacag tgtggaaatt 1740 tcaggggttg aagaccgctt caatgcgtca ttggggactt accatgatct tctcaagatc 1800 ataaaggaca aagacttcct ggacaacgaa gaaaatgagg atattctcga agacatcgtc 1860 ctcaccctga ccctgttcga agacagggaa atgatagaag agcgcttgaa aacctatgcc 1920 cacctcttcg acgataaagt tatgaagcag ctgaagcgca ggagatacac aggatgggga 1980 agattgtcaa ggaagctgat caatggaatt agggataaac agagtggcaa gaccatactg 2040 gatttcctca aatctgatgg cttcgccaat aggaacttca tgcaactgat tcacgatgac 2100 tctcttacct tcaaggagga cattcaaaag gctcaggtga gcgggcaggg agactccctt 2160 catgaacaca tcgcgaattt ggcaggttcc cccgctatta aaaagggcat ccttcaaact 2220 gtcaaggtgg tggatgaatt ggtcaaggta atgggcagac ataagccaga aaatattgtg 2280 atcgagatgg cccgcgaaaa ccagaccaca cagaagggcc agaaaaatag tagagagcgg 2340 atgaagagga tcgaggaggg catcaaagag ctgggatctc agattctcaa agaacacccc 2400 gtagaaaaca cacagctgca gaacgaaaaa ttgtacttgt actatctgca gaacggcaga 2460 gacatgtacg tcgaccaaga acttgatatt aatagactgt ccgactatga cgtagaccat 2520 atcgtgcccc agtccttcct gaaggacgac tccattgata acaaagtctt gacaagaagc 2580 gacaagaaca ggggtaaaag tgataatgtg cctagcgagg aggtggtgaa aaaaatgaag 2640 aactactggc gacagctgct taatgcaaag ctcattacac aacggaagtt cgataatctg 2700 acgaaagcag agagaggtgg cttgtctgag ttggacaagg cagggtttat taagcggcag 2760 ctggtggaaa ctaggcagat cacaaagcac gtggcgcaga ttttggacag ccggatgaac 2820 acaaaatacg acgaaaatga taaactgata cgagaggtca aagttatcac gctgaaaagc 2880 aagctggtgt ccgattttcg gaaagacttc cagttctaca aagttcgcga gattaataac 2940 taccatcatg ctcacgatgc gtacctgaac gctgttgtcg ggaccgcctt gataaagaag 3000 tacccaaagc tggaatccga gttcgtatac ggggattaca aagtgtacga tgtgaggaaa 3060 atgatagcca agtccgagca ggagattgga aaggccacag ctaagtactt cttttattct 3120 aacatcatga atttttttaa gacggaaatt accctggcca acggagagat cagaaagcgg 3180 ccccttatag agacaaatgg tgaaacaggt gaaatcgtct gggataaggg cagggatttc 3240 gctactgtga ggaaggtgct gagtatgcca caggtaaata tcgtgaaaaa aaccgaagta 3300 cagaccggag gattttccaa ggaaagcatt ttgcctaaaa gaaactcaga caagctcatc 3360 gcccgcaaga aagattggga ccctaagaaa tacgggggat ttgactcacc caccgtagcc 3420 tattctgtgc tggtggtagc taaggtggaa aaaggaaagt ctaagaagct gaagtccgtg 3480 aaggaactct tgggaatcac tatcatggaa agatcatcct ttgaaaagaa ccctatcgat 3540 ttcctggagg ctaagggtta caaggaggtc aagaaagacc tcatcattaa actgccaaaa 3600 tactctctct tcgagctgga aaatggcagg aagagaatgt tggccagcgc cggagagctg 3660 caaaagggaa acgagcttgc tctgccctcc aaatatgtta attttctcta tctcgcttcc 3720 cactatgaaa agctgaaagg gtctcccgaa gataacgagc agaagcagct gttcgtcgaa 3780 cagcacaagc actatctgga tgaaataatc gaacaaataa gcgagttcag caaaagggtt 3840 atcctggcgg atgctaattt ggacaaagta ctgtctgctt ataacaagca ccgggataag 3900 cctattaggg aacaagccga gaatataatt cacctcttta cactcacgaa tctcggagcc 3960 cccgccgcct tcaaatactt tgatacgact atcgaccgga aacggtatac cagtaccaaa 4020 gaggtcctcg atgccaccct catccaccag tcaattactg gcctgtacga aacacggatc 4080 gacctctctc aactgggcgg cgactag 4107 <210> 6629 <400> 6629 000 <210> 6630 <400> 6630 000 <210> 6631 <400> 6631 000 <210> 6632 <400> 6632 000 <210> 6633 <400> 6633 000 <210> 6634 <400> 6634 000 <210> 6635 <400> 6635 000 <210> 6636 <400> 6636 000 <210> 6637 <400> 6637 000 <210> 6638 <400> 6638 000 <210> 6639 <400> 6639 000 <210> 6640 <400> 6640 000 <210> 6641 <400> 6641 000 <210> 6642 <400> 6642 000 <210> 6643 <400> 6643 000 <210> 6644 <400> 6644 000 <210> 6645 <400> 6645 000 <210> 6646 <400> 6646 000 <210> 6647 <400> 6647 000 <210> 6648 <400> 6648 000 <210> 6649 <400> 6649 000 <210> 6650 <400> 6650 000 <210> 6651 <400> 6651 000 <210> 6652 <400> 6652 000 <210> 6653 <400> 6653 000 <210> 6654 <400> 6654 000 <210> 6655 <400> 6655 000 <210> 6656 <400> 6656 000 <210> 6657 <400> 6657 000 <210> 6658 <400> 6658 000 <210> 6659 <400> 6659 000 <210> 6660 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6660 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu uuuu 74 <210> 6661 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6661 aacagcauag caaguuuaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugcuuu uuuu 74 <210> 6662 <400> 6662 000 <210> 6663 <400> 6663 000 <210> 6664 <400> 6664 000 <210> 6665 <400> 6665 000 <210> 6666 <400> 6666 000 <210> 6667 <400> 6667 000 <210> 6668 <400> 6668 000 <210> 6669 <400> 6669 000 <210> 6670 <400> 6670 000 <210> 6671 <400> 6671 000 <210> 6672 <400> 6672 000 <210> 6673 <400> 6673 000 <210> 6674 <400> 6674 000 <210> 6675 <400> 6675 000 <210> 6676 <400> 6676 000 <210> 6677 <400> 6677 000 <210> 6678 <400> 6678 000 <210> 6679 <400> 6679 000 <210> 6680 <400> 6680 000 <210> 6681 <400> 6681 000 <210> 6682 <400> 6682 000 <210> 6683 <400> 6683 000 <210> 6684 <400> 6684 000 <210> 6685 <400> 6685 000 <210> 6686 <400> 6686 000 <210> 6687 <400> 6687 000 <210> 6688 <400> 6688 000 <210> 6689 <400> 6689 000 <210> 6690 <400> 6690 000 <210> 6691 <400> 6691 000 <210> 6692 <400> 6692 000 <210> 6693 <400> 6693 000 <210> 6694 <400> 6694 000 <210> 6695 <400> 6695 000 <210> 6696 <400> 6696 000 <210> 6697 <400> 6697 000 <210> 6698 <400> 6698 000 <210> 6699 <400> 6699 000 <210> 6700 <400> 6700 000 <210> 6701 <400> 6701 000 <210> 6702 <400> 6702 000 <210> 6703 <400> 6703 000 <210> 6704 <400> 6704 000 <210> 6705 <400> 6705 000 <210> 6706 <400> 6706 000 <210> 6707 <400> 6707 000 <210> 6708 <400> 6708 000 <210> 6709 <400> 6709 000 <210> 6710 <400> 6710 000 <210> 6711 <400> 6711 000 <210> 6712 <400> 6712 000 <210> 6713 <400> 6713 000 <210> 6714 <400> 6714 000 <210> 6715 <400> 6715 000 <210> 6716 <400> 6716 000 <210> 6717 <400> 6717 000 <210> 6718 <400> 6718 000 <210> 6719 <400> 6719 000 <210> 6720 <400> 6720 000 <210> 6721 <400> 6721 000 <210> 6722 <400> 6722 000 <210> 6723 <400> 6723 000 <210> 6724 <400> 6724 000 <210> 6725 <400> 6725 000 <210> 6726 <400> 6726 000 <210> 6727 <400> 6727 000 <210> 6728 <400> 6728 000 <210> 6729 <400> 6729 000 <210> 6730 <400> 6730 000 <210> 6731 <400> 6731 000 <210> 6732 <400> 6732 000 <210> 6733 <400> 6733 000 <210> 6734 <400> 6734 000 <210> 6735 <400> 6735 000 <210> 6736 <400> 6736 000 <210> 6737 <400> 6737 000 <210> 6738 <400> 6738 000 <210> 6739 <400> 6739 000 <210> 6740 <400> 6740 000 <210> 6741 <400> 6741 000 <210> 6742 <400> 6742 000 <210> 6743 <400> 6743 000 <210> 6744 <400> 6744 000 <210> 6745 <400> 6745 000 <210> 6746 <400> 6746 000 <210> 6747 <400> 6747 000 <210> 6748 <400> 6748 000 <210> 6749 <400> 6749 000 <210> 6750 <400> 6750 000 <210> 6751 <400> 6751 000 <210> 6752 <400> 6752 000 <210> 6753 <400> 6753 000 <210> 6754 <400> 6754 000 <210> 6755 <400> 6755 000 <210> 6756 <400> 6756 000 <210> 6757 <400> 6757 000 <210> 6758 <400> 6758 000 <210> 6759 <400> 6759 000 <210> 6760 <400> 6760 000 <210> 6761 <400> 6761 000 <210> 6762 <400> 6762 000 <210> 6763 <400> 6763 000 <210> 6764 <400> 6764 000 <210> 6765 <400> 6765 000 <210> 6766 <400> 6766 000 <210> 6767 <400> 6767 000 <210> 6768 <400> 6768 000 <210> 6769 <400> 6769 000 <210> 6770 <400> 6770 000 <210> 6771 <400> 6771 000 <210> 6772 <400> 6772 000 <210> 6773 <400> 6773 000 <210> 6774 <400> 6774 000 <210> 6775 <400> 6775 000 <210> 6776 <400> 6776 000 <210> 6777 <400> 6777 000 <210> 6778 <400> 6778 000 <210> 6779 <400> 6779 000 <210> 6780 <400> 6780 000 <210> 6781 <400> 6781 000 <210> 6782 <400> 6782 000 <210> 6783 <400> 6783 000 <210> 6784 <400> 6784 000 <210> 6785 <400> 6785 000 <210> 6786 <400> 6786 000 <210> 6787 <400> 6787 000 <210> 6788 <400> 6788 000 <210> 6789 <400> 6789 000 <210> 6790 <400> 6790 000 <210> 6791 <400> 6791 000 <210> 6792 <400> 6792 000 <210> 6793 <400> 6793 000 <210> 6794 <400> 6794 000 <210> 6795 <400> 6795 000 <210> 6796 <400> 6796 000 <210> 6797 <400> 6797 000 <210> 6798 <400> 6798 000 <210> 6799 <400> 6799 000 <210> 6800 <400> 6800 000 <210> 6801 <400> 6801 000 <210> 6802 <400> 6802 000 <210> 6803 <400> 6803 000 <210> 6804 <400> 6804 000 <210> 6805 <400> 6805 000 <210> 6806 <400> 6806 000 <210> 6807 <400> 6807 000 <210> 6808 <400> 6808 000 <210> 6809 <400> 6809 000 <210> 6810 <400> 6810 000 <210> 6811 <400> 6811 000 <210> 6812 <400> 6812 000 <210> 6813 <400> 6813 000 <210> 6814 <400> 6814 000 <210> 6815 <400> 6815 000 <210> 6816 <400> 6816 000 <210> 6817 <400> 6817 000 <210> 6818 <400> 6818 000 <210> 6819 <400> 6819 000 <210> 6820 <400> 6820 000 <210> 6821 <400> 6821 000 <210> 6822 <400> 6822 000 <210> 6823 <400> 6823 000 <210> 6824 <400> 6824 000 <210> 6825 <400> 6825 000 <210> 6826 <400> 6826 000 <210> 6827 <400> 6827 000 <210> 6828 <400> 6828 000 <210> 6829 <400> 6829 000 <210> 6830 <400> 6830 000 <210> 6831 <400> 6831 000 <210> 6832 <400> 6832 000 <210> 6833 <400> 6833 000 <210> 6834 <400> 6834 000 <210> 6835 <400> 6835 000 <210> 6836 <400> 6836 000 <210> 6837 <400> 6837 000 <210> 6838 <400> 6838 000 <210> 6839 <400> 6839 000 <210> 6840 <400> 6840 000 <210> 6841 <400> 6841 000 <210> 6842 <400> 6842 000 <210> 6843 <400> 6843 000 <210> 6844 <400> 6844 000 <210> 6845 <400> 6845 000 <210> 6846 <400> 6846 000 <210> 6847 <400> 6847 000 <210> 6848 <400> 6848 000 <210> 6849 <400> 6849 000 <210> 6850 <400> 6850 000 <210> 6851 <400> 6851 000 <210> 6852 <400> 6852 000 <210> 6853 <400> 6853 000 <210> 6854 <400> 6854 000 <210> 6855 <400> 6855 000 <210> 6856 <400> 6856 000 <210> 6857 <400> 6857 000 <210> 6858 <400> 6858 000 <210> 6859 <400> 6859 000 <210> 6860 <400> 6860 000 <210> 6861 <400> 6861 000 <210> 6862 <400> 6862 000 <210> 6863 <400> 6863 000 <210> 6864 <400> 6864 000 <210> 6865 <400> 6865 000 <210> 6866 <400> 6866 000 <210> 6867 <400> 6867 000 <210> 6868 <400> 6868 000 <210> 6869 <400> 6869 000 <210> 6870 <400> 6870 000 <210> 6871 <400> 6871 000 <210> 6872 <400> 6872 000 <210> 6873 <400> 6873 000 <210> 6874 <400> 6874 000 <210> 6875 <400> 6875 000 <210> 6876 <400> 6876 000 <210> 6877 <400> 6877 000 <210> 6878 <400> 6878 000 <210> 6879 <400> 6879 000 <210> 6880 <400> 6880 000 <210> 6881 <400> 6881 000 <210> 6882 <400> 6882 000 <210> 6883 <400> 6883 000 <210> 6884 <400> 6884 000 <210> 6885 <400> 6885 000 <210> 6886 <400> 6886 000 <210> 6887 <400> 6887 000 <210> 6888 <400> 6888 000 <210> 6889 <400> 6889 000 <210> 6890 <400> 6890 000 <210> 6891 <400> 6891 000 <210> 6892 <400> 6892 000 <210> 6893 <400> 6893 000 <210> 6894 <400> 6894 000 <210> 6895 <400> 6895 000 <210> 6896 <400> 6896 000 <210> 6897 <400> 6897 000 <210> 6898 <400> 6898 000 <210> 6899 <400> 6899 000 <210> 6900 <400> 6900 000 <210> 6901 <400> 6901 000 <210> 6902 <400> 6902 000 <210> 6903 <400> 6903 000 <210> 6904 <400> 6904 000 <210> 6905 <400> 6905 000 <210> 6906 <400> 6906 000 <210> 6907 <400> 6907 000 <210> 6908 <400> 6908 000 <210> 6909 <400> 6909 000 <210> 6910 <400> 6910 000 <210> 6911 <400> 6911 000 <210> 6912 <400> 6912 000 <210> 6913 <400> 6913 000 <210> 6914 <400> 6914 000 <210> 6915 <400> 6915 000 <210> 6916 <400> 6916 000 <210> 6917 <400> 6917 000 <210> 6918 <400> 6918 000 <210> 6919 <400> 6919 000 <210> 6920 <400> 6920 000 <210> 6921 <400> 6921 000 <210> 6922 <400> 6922 000 <210> 6923 <400> 6923 000 <210> 6924 <400> 6924 000 <210> 6925 <400> 6925 000 <210> 6926 <400> 6926 000 <210> 6927 <400> 6927 000 <210> 6928 <400> 6928 000 <210> 6929 <400> 6929 000 <210> 6930 <400> 6930 000 <210> 6931 <400> 6931 000 <210> 6932 <400> 6932 000 <210> 6933 <400> 6933 000 <210> 6934 <400> 6934 000 <210> 6935 <400> 6935 000 <210> 6936 <400> 6936 000 <210> 6937 <400> 6937 000 <210> 6938 <400> 6938 000 <210> 6939 <400> 6939 000 <210> 6940 <400> 6940 000 <210> 6941 <400> 6941 000 <210> 6942 <400> 6942 000 <210> 6943 <400> 6943 000 <210> 6944 <400> 6944 000 <210> 6945 <400> 6945 000 <210> 6946 <400> 6946 000 <210> 6947 <400> 6947 000 <210> 6948 <400> 6948 000 <210> 6949 <400> 6949 000 <210> 6950 <400> 6950 000 <210> 6951 <400> 6951 000 <210> 6952 <400> 6952 000 <210> 6953 <400> 6953 000 <210> 6954 <400> 6954 000 <210> 6955 <400> 6955 000 <210> 6956 <400> 6956 000 <210> 6957 <400> 6957 000 <210> 6958 <400> 6958 000 <210> 6959 <400> 6959 000 <210> 6960 <400> 6960 000 <210> 6961 <400> 6961 000 <210> 6962 <400> 6962 000 <210> 6963 <400> 6963 000 <210> 6964 <400> 6964 000 <210> 6965 <400> 6965 000 <210> 6966 <400> 6966 000 <210> 6967 <400> 6967 000 <210> 6968 <400> 6968 000 <210> 6969 <400> 6969 000 <210> 6970 <400> 6970 000 <210> 6971 <400> 6971 000 <210> 6972 <400> 6972 000 <210> 6973 <400> 6973 000 <210> 6974 <400> 6974 000 <210> 6975 <400> 6975 000 <210> 6976 <400> 6976 000 <210> 6977 <400> 6977 000 <210> 6978 <400> 6978 000 <210> 6979 <400> 6979 000 <210> 6980 <400> 6980 000 <210> 6981 <400> 6981 000 <210> 6982 <400> 6982 000 <210> 6983 <400> 6983 000 <210> 6984 <400> 6984 000 <210> 6985 <400> 6985 000 <210> 6986 <400> 6986 000 <210> 6987 <400> 6987 000 <210> 6988 <400> 6988 000 <210> 6989 <400> 6989 000 <210> 6990 <400> 6990 000 <210> 6991 <400> 6991 000 <210> 6992 <400> 6992 000 <210> 6993 <400> 6993 000 <210> 6994 <400> 6994 000 <210> 6995 <400> 6995 000 <210> 6996 <400> 6996 000 <210> 6997 <400> 6997 000 <210> 6998 <400> 6998 000 <210> 6999 <400> 6999 000 <210> 7000 <400> 7000 000 <210> 7001 <400> 7001 000 <210> 7002 <400> 7002 000 <210> 7003 <400> 7003 000 <210> 7004 <400> 7004 000 <210> 7005 <400> 7005 000 <210> 7006 <400> 7006 000 <210> 7007 <400> 7007 000 <210> 7008 <400> 7008 000 <210> 7009 <400> 7009 000 <210> 7010 <400> 7010 000 <210> 7011 <400> 7011 000 <210> 7012 <400> 7012 000 <210> 7013 <400> 7013 000 <210> 7014 <400> 7014 000 <210> 7015 <400> 7015 000 <210> 7016 <400> 7016 000 <210> 7017 <400> 7017 000 <210> 7018 <400> 7018 000 <210> 7019 <400> 7019 000 <210> 7020 <400> 7020 000 <210> 7021 <400> 7021 000 <210> 7022 <400> 7022 000 <210> 7023 <400> 7023 000 <210> 7024 <400> 7024 000 <210> 7025 <400> 7025 000 <210> 7026 <400> 7026 000 <210> 7027 <400> 7027 000 <210> 7028 <400> 7028 000 <210> 7029 <400> 7029 000 <210> 7030 <400> 7030 000 <210> 7031 <400> 7031 000 <210> 7032 <400> 7032 000 <210> 7033 <400> 7033 000 <210> 7034 <400> 7034 000 <210> 7035 <400> 7035 000 <210> 7036 <400> 7036 000 <210> 7037 <400> 7037 000 <210> 7038 <400> 7038 000 <210> 7039 <400> 7039 000 <210> 7040 <400> 7040 000 <210> 7041 <400> 7041 000 <210> 7042 <400> 7042 000 <210> 7043 <400> 7043 000 <210> 7044 <400> 7044 000 <210> 7045 <400> 7045 000 <210> 7046 <400> 7046 000 <210> 7047 <400> 7047 000 <210> 7048 <400> 7048 000 <210> 7049 <400> 7049 000 <210> 7050 <400> 7050 000 <210> 7051 <400> 7051 000 <210> 7052 <400> 7052 000 <210> 7053 <400> 7053 000 <210> 7054 <400> 7054 000 <210> 7055 <400> 7055 000 <210> 7056 <400> 7056 000 <210> 7057 <400> 7057 000 <210> 7058 <400> 7058 000 <210> 7059 <400> 7059 000 <210> 7060 <400> 7060 000 <210> 7061 <400> 7061 000 <210> 7062 <400> 7062 000 <210> 7063 <400> 7063 000 <210> 7064 <400> 7064 000 <210> 7065 <400> 7065 000 <210> 7066 <400> 7066 000 <210> 7067 <400> 7067 000 <210> 7068 <400> 7068 000 <210> 7069 <400> 7069 000 <210> 7070 <400> 7070 000 <210> 7071 <400> 7071 000 <210> 7072 <400> 7072 000 <210> 7073 <400> 7073 000 <210> 7074 <400> 7074 000 <210> 7075 <400> 7075 000 <210> 7076 <400> 7076 000 <210> 7077 <400> 7077 000 <210> 7078 <400> 7078 000 <210> 7079 <400> 7079 000 <210> 7080 <400> 7080 000 <210> 7081 <400> 7081 000 <210> 7082 <400> 7082 000 <210> 7083 <400> 7083 000 <210> 7084 <400> 7084 000 <210> 7085 <400> 7085 000 <210> 7086 <400> 7086 000 <210> 7087 <400> 7087 000 <210> 7088 <400> 7088 000 <210> 7089 <400> 7089 000 <210> 7090 <400> 7090 000 <210> 7091 <400> 7091 000 <210> 7092 <400> 7092 000 <210> 7093 <400> 7093 000 <210> 7094 <400> 7094 000 <210> 7095 <400> 7095 000 <210> 7096 <400> 7096 000 <210> 7097 <400> 7097 000 <210> 7098 <400> 7098 000 <210> 7099 <400> 7099 000 <210> 7100 <400> 7100 000 <210> 7101 <400> 7101 000 <210> 7102 <400> 7102 000 <210> 7103 <400> 7103 000 <210> 7104 <400> 7104 000 <210> 7105 <400> 7105 000 <210> 7106 <400> 7106 000 <210> 7107 <400> 7107 000 <210> 7108 <400> 7108 000 <210> 7109 <400> 7109 000 <210> 7110 <400> 7110 000 <210> 7111 <400> 7111 000 <210> 7112 <400> 7112 000 <210> 7113 <400> 7113 000 <210> 7114 <400> 7114 000 <210> 7115 <400> 7115 000 <210> 7116 <400> 7116 000 <210> 7117 <400> 7117 000 <210> 7118 <400> 7118 000 <210> 7119 <400> 7119 000 <210> 7120 <400> 7120 000 <210> 7121 <400> 7121 000 <210> 7122 <400> 7122 000 <210> 7123 <400> 7123 000 <210> 7124 <400> 7124 000 <210> 7125 <400> 7125 000 <210> 7126 <400> 7126 000 <210> 7127 <400> 7127 000 <210> 7128 <400> 7128 000 <210> 7129 <400> 7129 000 <210> 7130 <400> 7130 000 <210> 7131 <400> 7131 000 <210> 7132 <400> 7132 000 <210> 7133 <400> 7133 000 <210> 7134 <400> 7134 000 <210> 7135 <400> 7135 000 <210> 7136 <400> 7136 000 <210> 7137 <400> 7137 000 <210> 7138 <400> 7138 000 <210> 7139 <400> 7139 000 <210> 7140 <400> 7140 000 <210> 7141 <400> 7141 000 <210> 7142 <400> 7142 000 <210> 7143 <400> 7143 000 <210> 7144 <400> 7144 000 <210> 7145 <400> 7145 000 <210> 7146 <400> 7146 000 <210> 7147 <400> 7147 000 <210> 7148 <400> 7148 000 <210> 7149 <400> 7149 000 <210> 7150 <400> 7150 000 <210> 7151 <400> 7151 000 <210> 7152 <400> 7152 000 <210> 7153 <400> 7153 000 <210> 7154 <400> 7154 000 <210> 7155 <400> 7155 000 <210> 7156 <400> 7156 000 <210> 7157 <400> 7157 000 <210> 7158 <400> 7158 000 <210> 7159 <400> 7159 000 <210> 7160 <400> 7160 000 <210> 7161 <400> 7161 000 <210> 7162 <400> 7162 000 <210> 7163 <400> 7163 000 <210> 7164 <400> 7164 000 <210> 7165 <400> 7165 000 <210> 7166 <400> 7166 000 <210> 7167 <400> 7167 000 <210> 7168 <400> 7168 000 <210> 7169 <400> 7169 000 <210> 7170 <400> 7170 000 <210> 7171 <400> 7171 000 <210> 7172 <400> 7172 000 <210> 7173 <400> 7173 000 <210> 7174 <400> 7174 000 <210> 7175 <400> 7175 000 <210> 7176 <400> 7176 000 <210> 7177 <400> 7177 000 <210> 7178 <400> 7178 000 <210> 7179 <400> 7179 000 <210> 7180 <400> 7180 000 <210> 7181 <400> 7181 000 <210> 7182 <400> 7182 000 <210> 7183 <400> 7183 000 <210> 7184 <400> 7184 000 <210> 7185 <400> 7185 000 <210> 7186 <400> 7186 000 <210> 7187 <400> 7187 000 <210> 7188 <400> 7188 000 <210> 7189 <400> 7189 000 <210> 7190 <400> 7190 000 <210> 7191 <400> 7191 000 <210> 7192 <400> 7192 000 <210> 7193 <400> 7193 000 <210> 7194 <400> 7194 000 <210> 7195 <400> 7195 000 <210> 7196 <400> 7196 000 <210> 7197 <400> 7197 000 <210> 7198 <400> 7198 000 <210> 7199 <400> 7199 000 <210> 7200 <400> 7200 000 <210> 7201 <400> 7201 000 <210> 7202 <400> 7202 000 <210> 7203 <400> 7203 000 <210> 7204 <400> 7204 000 <210> 7205 <400> 7205 000 <210> 7206 <400> 7206 000 <210> 7207 <400> 7207 000 <210> 7208 <400> 7208 000 <210> 7209 <400> 7209 000 <210> 7210 <400> 7210 000 <210> 7211 <400> 7211 000 <210> 7212 <400> 7212 000 <210> 7213 <400> 7213 000 <210> 7214 <400> 7214 000 <210> 7215 <400> 7215 000 <210> 7216 <400> 7216 000 <210> 7217 <400> 7217 000 <210> 7218 <400> 7218 000 <210> 7219 <400> 7219 000 <210> 7220 <400> 7220 000 <210> 7221 <400> 7221 000 <210> 7222 <400> 7222 000 <210> 7223 <400> 7223 000 <210> 7224 <400> 7224 000 <210> 7225 <400> 7225 000 <210> 7226 <400> 7226 000 <210> 7227 <400> 7227 000 <210> 7228 <400> 7228 000 <210> 7229 <400> 7229 000 <210> 7230 <400> 7230 000 <210> 7231 <400> 7231 000 <210> 7232 <400> 7232 000 <210> 7233 <400> 7233 000 <210> 7234 <400> 7234 000 <210> 7235 <400> 7235 000 <210> 7236 <400> 7236 000 <210> 7237 <400> 7237 000 <210> 7238 <400> 7238 000 <210> 7239 <400> 7239 000 <210> 7240 <400> 7240 000 <210> 7241 <400> 7241 000 <210> 7242 <400> 7242 000 <210> 7243 <400> 7243 000 <210> 7244 <400> 7244 000 <210> 7245 <400> 7245 000 <210> 7246 <400> 7246 000 <210> 7247 <400> 7247 000 <210> 7248 <400> 7248 000 <210> 7249 <400> 7249 000 <210> 7250 <400> 7250 000 <210> 7251 <400> 7251 000 <210> 7252 <400> 7252 000 <210> 7253 <400> 7253 000 <210> 7254 <400> 7254 000 <210> 7255 <400> 7255 000 <210> 7256 <400> 7256 000 <210> 7257 <400> 7257 000 <210> 7258 <400> 7258 000 <210> 7259 <400> 7259 000 <210> 7260 <400> 7260 000 <210> 7261 <400> 7261 000 <210> 7262 <400> 7262 000 <210> 7263 <400> 7263 000 <210> 7264 <400> 7264 000 <210> 7265 <400> 7265 000 <210> 7266 <400> 7266 000 <210> 7267 <400> 7267 000 <210> 7268 <400> 7268 000 <210> 7269 <400> 7269 000 <210> 7270 <400> 7270 000 <210> 7271 <400> 7271 000 <210> 7272 <400> 7272 000 <210> 7273 <400> 7273 000 <210> 7274 <400> 7274 000 <210> 7275 <400> 7275 000 <210> 7276 <400> 7276 000 <210> 7277 <400> 7277 000 <210> 7278 <400> 7278 000 <210> 7279 <400> 7279 000 <210> 7280 <400> 7280 000 <210> 7281 <400> 7281 000 <210> 7282 <400> 7282 000 <210> 7283 <400> 7283 000 <210> 7284 <400> 7284 000 <210> 7285 <400> 7285 000 <210> 7286 <400> 7286 000 <210> 7287 <400> 7287 000 <210> 7288 <400> 7288 000 <210> 7289 <400> 7289 000 <210> 7290 <400> 7290 000 <210> 7291 <400> 7291 000 <210> 7292 <400> 7292 000 <210> 7293 <400> 7293 000 <210> 7294 <400> 7294 000 <210> 7295 <400> 7295 000 <210> 7296 <400> 7296 000 <210> 7297 <400> 7297 000 <210> 7298 <400> 7298 000 <210> 7299 <400> 7299 000 <210> 7300 <400> 7300 000 <210> 7301 <400> 7301 000 <210> 7302 <400> 7302 000 <210> 7303 <400> 7303 000 <210> 7304 <400> 7304 000 <210> 7305 <400> 7305 000 <210> 7306 <400> 7306 000 <210> 7307 <400> 7307 000 <210> 7308 <400> 7308 000 <210> 7309 <400> 7309 000 <210> 7310 <400> 7310 000 <210> 7311 <400> 7311 000 <210> 7312 <400> 7312 000 <210> 7313 <400> 7313 000 <210> 7314 <400> 7314 000 <210> 7315 <400> 7315 000 <210> 7316 <400> 7316 000 <210> 7317 <400> 7317 000 <210> 7318 <400> 7318 000 <210> 7319 <400> 7319 000 <210> 7320 <400> 7320 000 <210> 7321 <400> 7321 000 <210> 7322 <400> 7322 000 <210> 7323 <400> 7323 000 <210> 7324 <400> 7324 000 <210> 7325 <400> 7325 000 <210> 7326 <400> 7326 000 <210> 7327 <400> 7327 000 <210> 7328 <400> 7328 000 <210> 7329 <400> 7329 000 <210> 7330 <400> 7330 000 <210> 7331 <400> 7331 000 <210> 7332 <400> 7332 000 <210> 7333 <400> 7333 000 <210> 7334 <400> 7334 000 <210> 7335 <400> 7335 000 <210> 7336 <400> 7336 000 <210> 7337 <400> 7337 000 <210> 7338 <400> 7338 000 <210> 7339 <400> 7339 000 <210> 7340 <400> 7340 000 <210> 7341 <400> 7341 000 <210> 7342 <400> 7342 000 <210> 7343 <400> 7343 000 <210> 7344 <400> 7344 000 <210> 7345 <400> 7345 000 <210> 7346 <400> 7346 000 <210> 7347 <400> 7347 000 <210> 7348 <400> 7348 000 <210> 7349 <400> 7349 000 <210> 7350 <400> 7350 000 <210> 7351 <400> 7351 000 <210> 7352 <400> 7352 000 <210> 7353 <400> 7353 000 <210> 7354 <400> 7354 000 <210> 7355 <400> 7355 000 <210> 7356 <400> 7356 000 <210> 7357 <400> 7357 000 <210> 7358 <400> 7358 000 <210> 7359 <400> 7359 000 <210> 7360 <400> 7360 000 <210> 7361 <400> 7361 000 <210> 7362 <400> 7362 000 <210> 7363 <400> 7363 000 <210> 7364 <400> 7364 000 <210> 7365 <400> 7365 000 <210> 7366 <400> 7366 000 <210> 7367 <400> 7367 000 <210> 7368 <400> 7368 000 <210> 7369 <400> 7369 000 <210> 7370 <400> 7370 000 <210> 7371 <400> 7371 000 <210> 7372 <400> 7372 000 <210> 7373 <400> 7373 000 <210> 7374 <400> 7374 000 <210> 7375 <400> 7375 000 <210> 7376 <400> 7376 000 <210> 7377 <400> 7377 000 <210> 7378 <400> 7378 000 <210> 7379 <400> 7379 000 <210> 7380 <400> 7380 000 <210> 7381 <400> 7381 000 <210> 7382 <400> 7382 000 <210> 7383 <400> 7383 000 <210> 7384 <400> 7384 000 <210> 7385 <400> 7385 000 <210> 7386 <400> 7386 000 <210> 7387 <400> 7387 000 <210> 7388 <400> 7388 000 <210> 7389 <400> 7389 000 <210> 7390 <400> 7390 000 <210> 7391 <400> 7391 000 <210> 7392 <400> 7392 000 <210> 7393 <400> 7393 000 <210> 7394 <400> 7394 000 <210> 7395 <400> 7395 000 <210> 7396 <400> 7396 000 <210> 7397 <400> 7397 000 <210> 7398 <400> 7398 000 <210> 7399 <400> 7399 000 <210> 7400 <400> 7400 000 <210> 7401 <400> 7401 000 <210> 7402 <400> 7402 000 <210> 7403 <400> 7403 000 <210> 7404 <400> 7404 000 <210> 7405 <400> 7405 000 <210> 7406 <400> 7406 000 <210> 7407 <400> 7407 000 <210> 7408 <400> 7408 000 <210> 7409 <400> 7409 000 <210> 7410 <400> 7410 000 <210> 7411 <400> 7411 000 <210> 7412 <400> 7412 000 <210> 7413 <400> 7413 000 <210> 7414 <400> 7414 000 <210> 7415 <400> 7415 000 <210> 7416 <400> 7416 000 <210> 7417 <400> 7417 000 <210> 7418 <400> 7418 000 <210> 7419 <400> 7419 000 <210> 7420 <400> 7420 000 <210> 7421 <400> 7421 000 <210> 7422 <400> 7422 000 <210> 7423 <400> 7423 000 <210> 7424 <400> 7424 000 <210> 7425 <400> 7425 000 <210> 7426 <400> 7426 000 <210> 7427 <400> 7427 000 <210> 7428 <400> 7428 000 <210> 7429 <400> 7429 000 <210> 7430 <400> 7430 000 <210> 7431 <400> 7431 000 <210> 7432 <400> 7432 000 <210> 7433 <400> 7433 000 <210> 7434 <400> 7434 000 <210> 7435 <400> 7435 000 <210> 7436 <400> 7436 000 <210> 7437 <400> 7437 000 <210> 7438 <400> 7438 000 <210> 7439 <400> 7439 000 <210> 7440 <400> 7440 000 <210> 7441 <400> 7441 000 <210> 7442 <400> 7442 000 <210> 7443 <400> 7443 000 <210> 7444 <400> 7444 000 <210> 7445 <400> 7445 000 <210> 7446 <400> 7446 000 <210> 7447 <400> 7447 000 <210> 7448 <400> 7448 000 <210> 7449 <400> 7449 000 <210> 7450 <400> 7450 000 <210> 7451 <400> 7451 000 <210> 7452 <400> 7452 000 <210> 7453 <400> 7453 000 <210> 7454 <400> 7454 000 <210> 7455 <400> 7455 000 <210> 7456 <400> 7456 000 <210> 7457 <400> 7457 000 <210> 7458 <400> 7458 000 <210> 7459 <400> 7459 000 <210> 7460 <400> 7460 000 <210> 7461 <400> 7461 000 <210> 7462 <400> 7462 000 <210> 7463 <400> 7463 000 <210> 7464 <400> 7464 000 <210> 7465 <400> 7465 000 <210> 7466 <400> 7466 000 <210> 7467 <400> 7467 000 <210> 7468 <400> 7468 000 <210> 7469 <400> 7469 000 <210> 7470 <400> 7470 000 <210> 7471 <400> 7471 000 <210> 7472 <400> 7472 000 <210> 7473 <400> 7473 000 <210> 7474 <400> 7474 000 <210> 7475 <400> 7475 000 <210> 7476 <400> 7476 000 <210> 7477 <400> 7477 000 <210> 7478 <400> 7478 000 <210> 7479 <400> 7479 000 <210> 7480 <400> 7480 000 <210> 7481 <400> 7481 000 <210> 7482 <400> 7482 000 <210> 7483 <400> 7483 000 <210> 7484 <400> 7484 000 <210> 7485 <400> 7485 000 <210> 7486 <400> 7486 000 <210> 7487 <400> 7487 000 <210> 7488 <400> 7488 000 <210> 7489 <400> 7489 000 <210> 7490 <400> 7490 000 <210> 7491 <400> 7491 000 <210> 7492 <400> 7492 000 <210> 7493 <400> 7493 000 <210> 7494 <400> 7494 000 <210> 7495 <400> 7495 000 <210> 7496 <400> 7496 000 <210> 7497 <400> 7497 000 <210> 7498 <400> 7498 000 <210> 7499 <400> 7499 000 <210> 7500 <400> 7500 000 <210> 7501 <400> 7501 000 <210> 7502 <400> 7502 000 <210> 7503 <400> 7503 000 <210> 7504 <400> 7504 000 <210> 7505 <400> 7505 000 <210> 7506 <400> 7506 000 <210> 7507 <400> 7507 000 <210> 7508 <400> 7508 000 <210> 7509 <400> 7509 000 <210> 7510 <400> 7510 000 <210> 7511 <400> 7511 000 <210> 7512 <400> 7512 000 <210> 7513 <400> 7513 000 <210> 7514 <400> 7514 000 <210> 7515 <400> 7515 000 <210> 7516 <400> 7516 000 <210> 7517 <400> 7517 000 <210> 7518 <400> 7518 000 <210> 7519 <400> 7519 000 <210> 7520 <400> 7520 000 <210> 7521 <400> 7521 000 <210> 7522 <400> 7522 000 <210> 7523 <400> 7523 000 <210> 7524 <400> 7524 000 <210> 7525 <400> 7525 000 <210> 7526 <400> 7526 000 <210> 7527 <400> 7527 000 <210> 7528 <400> 7528 000 <210> 7529 <400> 7529 000 <210> 7530 <400> 7530 000 <210> 7531 <400> 7531 000 <210> 7532 <400> 7532 000 <210> 7533 <400> 7533 000 <210> 7534 <400> 7534 000 <210> 7535 <400> 7535 000 <210> 7536 <400> 7536 000 <210> 7537 <400> 7537 000 <210> 7538 <400> 7538 000 <210> 7539 <400> 7539 000 <210> 7540 <400> 7540 000 <210> 7541 <400> 7541 000 <210> 7542 <400> 7542 000 <210> 7543 <400> 7543 000 <210> 7544 <400> 7544 000 <210> 7545 <400> 7545 000 <210> 7546 <400> 7546 000 <210> 7547 <400> 7547 000 <210> 7548 <400> 7548 000 <210> 7549 <400> 7549 000 <210> 7550 <400> 7550 000 <210> 7551 <400> 7551 000 <210> 7552 <400> 7552 000 <210> 7553 <400> 7553 000 <210> 7554 <400> 7554 000 <210> 7555 <400> 7555 000 <210> 7556 <400> 7556 000 <210> 7557 <400> 7557 000 <210> 7558 <400> 7558 000 <210> 7559 <400> 7559 000 <210> 7560 <400> 7560 000 <210> 7561 <400> 7561 000 <210> 7562 <400> 7562 000 <210> 7563 <400> 7563 000 <210> 7564 <400> 7564 000 <210> 7565 <400> 7565 000 <210> 7566 <400> 7566 000 <210> 7567 <400> 7567 000 <210> 7568 <400> 7568 000 <210> 7569 <400> 7569 000 <210> 7570 <400> 7570 000 <210> 7571 <400> 7571 000 <210> 7572 <400> 7572 000 <210> 7573 <400> 7573 000 <210> 7574 <400> 7574 000 <210> 7575 <400> 7575 000 <210> 7576 <400> 7576 000 <210> 7577 <400> 7577 000 <210> 7578 <400> 7578 000 <210> 7579 <400> 7579 000 <210> 7580 <400> 7580 000 <210> 7581 <400> 7581 000 <210> 7582 <400> 7582 000 <210> 7583 <400> 7583 000 <210> 7584 <400> 7584 000 <210> 7585 <400> 7585 000 <210> 7586 <400> 7586 000 <210> 7587 <400> 7587 000 <210> 7588 <400> 7588 000 <210> 7589 <400> 7589 000 <210> 7590 <400> 7590 000 <210> 7591 <400> 7591 000 <210> 7592 <400> 7592 000 <210> 7593 <400> 7593 000 <210> 7594 <400> 7594 000 <210> 7595 <400> 7595 000 <210> 7596 <400> 7596 000 <210> 7597 <400> 7597 000 <210> 7598 <400> 7598 000 <210> 7599 <400> 7599 000 <210> 7600 <400> 7600 000 <210> 7601 <400> 7601 000 <210> 7602 <400> 7602 000 <210> 7603 <400> 7603 000 <210> 7604 <400> 7604 000 <210> 7605 <400> 7605 000 <210> 7606 <400> 7606 000 <210> 7607 <400> 7607 000 <210> 7608 <400> 7608 000 <210> 7609 <400> 7609 000 <210> 7610 <400> 7610 000 <210> 7611 <400> 7611 000 <210> 7612 <400> 7612 000 <210> 7613 <400> 7613 000 <210> 7614 <400> 7614 000 <210> 7615 <400> 7615 000 <210> 7616 <400> 7616 000 <210> 7617 <400> 7617 000 <210> 7618 <400> 7618 000 <210> 7619 <400> 7619 000 <210> 7620 <400> 7620 000 <210> 7621 <400> 7621 000 <210> 7622 <400> 7622 000 <210> 7623 <400> 7623 000 <210> 7624 <400> 7624 000 <210> 7625 <400> 7625 000 <210> 7626 <400> 7626 000 <210> 7627 <400> 7627 000 <210> 7628 <400> 7628 000 <210> 7629 <400> 7629 000 <210> 7630 <400> 7630 000 <210> 7631 <400> 7631 000 <210> 7632 <400> 7632 000 <210> 7633 <400> 7633 000 <210> 7634 <400> 7634 000 <210> 7635 <400> 7635 000 <210> 7636 <400> 7636 000 <210> 7637 <400> 7637 000 <210> 7638 <400> 7638 000 <210> 7639 <400> 7639 000 <210> 7640 <400> 7640 000 <210> 7641 <400> 7641 000 <210> 7642 <400> 7642 000 <210> 7643 <400> 7643 000 <210> 7644 <400> 7644 000 <210> 7645 <400> 7645 000 <210> 7646 <400> 7646 000 <210> 7647 <400> 7647 000 <210> 7648 <400> 7648 000 <210> 7649 <400> 7649 000 <210> 7650 <400> 7650 000 <210> 7651 <400> 7651 000 <210> 7652 <400> 7652 000 <210> 7653 <400> 7653 000 <210> 7654 <400> 7654 000 <210> 7655 <400> 7655 000 <210> 7656 <400> 7656 000 <210> 7657 <400> 7657 000 <210> 7658 <400> 7658 000 <210> 7659 <400> 7659 000 <210> 7660 <400> 7660 000 <210> 7661 <400> 7661 000 <210> 7662 <400> 7662 000 <210> 7663 <400> 7663 000 <210> 7664 <400> 7664 000 <210> 7665 <400> 7665 000 <210> 7666 <400> 7666 000 <210> 7667 <400> 7667 000 <210> 7668 <400> 7668 000 <210> 7669 <400> 7669 000 <210> 7670 <400> 7670 000 <210> 7671 <400> 7671 000 <210> 7672 <400> 7672 000 <210> 7673 <400> 7673 000 <210> 7674 <400> 7674 000 <210> 7675 <400> 7675 000 <210> 7676 <400> 7676 000 <210> 7677 <400> 7677 000 <210> 7678 <400> 7678 000 <210> 7679 <400> 7679 000 <210> 7680 <400> 7680 000 <210> 7681 <400> 7681 000 <210> 7682 <400> 7682 000 <210> 7683 <400> 7683 000 <210> 7684 <400> 7684 000 <210> 7685 <400> 7685 000 <210> 7686 <400> 7686 000 <210> 7687 <400> 7687 000 <210> 7688 <400> 7688 000 <210> 7689 <400> 7689 000 <210> 7690 <400> 7690 000 <210> 7691 <400> 7691 000 <210> 7692 <400> 7692 000 <210> 7693 <400> 7693 000 <210> 7694 <400> 7694 000 <210> 7695 <400> 7695 000 <210> 7696 <400> 7696 000 <210> 7697 <400> 7697 000 <210> 7698 <400> 7698 000 <210> 7699 <400> 7699 000 <210> 7700 <400> 7700 000 <210> 7701 <400> 7701 000 <210> 7702 <400> 7702 000 <210> 7703 <400> 7703 000 <210> 7704 <400> 7704 000 <210> 7705 <400> 7705 000 <210> 7706 <400> 7706 000 <210> 7707 <400> 7707 000 <210> 7708 <400> 7708 000 <210> 7709 <400> 7709 000 <210> 7710 <400> 7710 000 <210> 7711 <400> 7711 000 <210> 7712 <400> 7712 000 <210> 7713 <400> 7713 000 <210> 7714 <400> 7714 000 <210> 7715 <400> 7715 000 <210> 7716 <400> 7716 000 <210> 7717 <400> 7717 000 <210> 7718 <400> 7718 000 <210> 7719 <400> 7719 000 <210> 7720 <400> 7720 000 <210> 7721 <400> 7721 000 <210> 7722 <400> 7722 000 <210> 7723 <400> 7723 000 <210> 7724 <400> 7724 000 <210> 7725 <400> 7725 000 <210> 7726 <400> 7726 000 <210> 7727 <400> 7727 000 <210> 7728 <400> 7728 000 <210> 7729 <400> 7729 000 <210> 7730 <400> 7730 000 <210> 7731 <400> 7731 000 <210> 7732 <400> 7732 000 <210> 7733 <400> 7733 000 <210> 7734 <400> 7734 000 <210> 7735 <400> 7735 000 <210> 7736 <400> 7736 000 <210> 7737 <400> 7737 000 <210> 7738 <400> 7738 000 <210> 7739 <400> 7739 000 <210> 7740 <400> 7740 000 <210> 7741 <400> 7741 000 <210> 7742 <400> 7742 000 <210> 7743 <400> 7743 000 <210> 7744 <400> 7744 000 <210> 7745 <400> 7745 000 <210> 7746 <400> 7746 000 <210> 7747 <400> 7747 000 <210> 7748 <400> 7748 000 <210> 7749 <400> 7749 000 <210> 7750 <400> 7750 000 <210> 7751 <400> 7751 000 <210> 7752 <400> 7752 000 <210> 7753 <400> 7753 000 <210> 7754 <400> 7754 000 <210> 7755 <400> 7755 000 <210> 7756 <400> 7756 000 <210> 7757 <400> 7757 000 <210> 7758 <400> 7758 000 <210> 7759 <400> 7759 000 <210> 7760 <400> 7760 000 <210> 7761 <400> 7761 000 <210> 7762 <400> 7762 000 <210> 7763 <400> 7763 000 <210> 7764 <400> 7764 000 <210> 7765 <400> 7765 000 <210> 7766 <400> 7766 000 <210> 7767 <400> 7767 000 <210> 7768 <400> 7768 000 <210> 7769 <400> 7769 000 <210> 7770 <400> 7770 000 <210> 7771 <400> 7771 000 <210> 7772 <400> 7772 000 <210> 7773 <400> 7773 000 <210> 7774 <400> 7774 000 <210> 7775 <400> 7775 000 <210> 7776 <400> 7776 000 <210> 7777 <400> 7777 000 <210> 7778 <400> 7778 000 <210> 7779 <400> 7779 000 <210> 7780 <400> 7780 000 <210> 7781 <400> 7781 000 <210> 7782 <400> 7782 000 <210> 7783 <400> 7783 000 <210> 7784 <400> 7784 000 <210> 7785 <400> 7785 000 <210> 7786 <400> 7786 000 <210> 7787 <400> 7787 000 <210> 7788 <400> 7788 000 <210> 7789 <400> 7789 000 <210> 7790 <400> 7790 000 <210> 7791 <400> 7791 000 <210> 7792 <400> 7792 000 <210> 7793 <400> 7793 000 <210> 7794 <400> 7794 000 <210> 7795 <400> 7795 000 <210> 7796 <400> 7796 000 <210> 7797 <400> 7797 000 <210> 7798 <400> 7798 000 <210> 7799 <400> 7799 000 <210> 7800 <400> 7800 000 <210> 7801 <400> 7801 000 <210> 7802 <400> 7802 000 <210> 7803 <400> 7803 000 <210> 7804 <400> 7804 000 <210> 7805 <400> 7805 000 <210> 7806 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 7806 guuuuagagc uaugcu 16 <210> 7807 <211> 90 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 7807 guuuaagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuuaaau aaggcuaguc cguuaucaac 60 uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 90 <210> 7808 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 7808 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg 60 gugcuuu 67 <210> 7809 <211> 85 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 7809 guuggaacca uucaaaacag cauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu aucaacuuga 60 aaaaguggca ccgagucggu gcuuu 85 <210> 7810 <211> 7 <212> PRT <213> Tobacco etch virus <400> 7810 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 7811 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 7811 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 7812 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 7812 aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60 ucggugc 67 <210> 7813 <400> 7813 000 <210> 7814 <400> 7814 000 <210> 7815 <400> 7815 000 <210> 7816 <400> 7816 000 <210> 7817 <400> 7817 000 <210> 7818 <400> 7818 000 <210> 7819 <400> 7819 000 <210> 7820 <400> 7820 000 <210> 7821 <211> 1393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7821 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly 1 5 10 15 Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu 20 25 30 Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg 35 40 45 His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr 65 70 75 80 Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn 85 90 95 Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser 100 105 110 Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly 115 120 125 Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr 130 135 140 His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg 145 150 155 160 Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe 165 170 175 Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu 180 185 190 Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro 195 200 205 Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu 210 215 220 Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu 225 230 235 240 Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu 245 250 255 Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu 260 265 270 Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala 275 280 285 Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu 290 295 300 Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile 305 310 315 320 Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His 325 330 335 His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro 340 345 350 Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala 355 360 365 Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile 370 375 380 Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys 385 390 395 400 Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly 405 410 415 Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg 420 425 430 Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile 435 440 445 Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala 450 455 460 Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr 465 470 475 480 Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala 485 490 495 Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn 500 505 510 Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val 515 520 525 Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys 530 535 540 Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu 545 550 555 560 Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr 565 570 575 Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu 580 585 590 Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile 595 600 605 Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu 610 615 620 Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile 625 630 635 640 Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met 645 650 655 Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg 660 665 670 Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu 675 680 685 Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu 690 695 700 Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln 705 710 715 720 Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala 725 730 735 Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val 740 745 750 Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val 755 760 765 Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn 770 775 780 Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly 785 790 795 800 Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn 805 810 815 Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val 820 825 830 Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His 835 840 845 Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val 850 855 860 Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser 865 870 875 880 Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn 885 890 895 Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu 900 905 910 Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln 915 920 925 Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp 930 935 940 Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu 945 950 955 960 Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys 965 970 975 Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala 980 985 990 His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys 995 1000 1005 Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val 1010 1015 1020 Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly 1025 1030 1035 Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe 1040 1045 1050 Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg 1055 1060 1065 Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp 1070 1075 1080 Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro 1085 1090 1095 Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe 1100 1105 1110 Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1115 1120 1125 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp 1130 1135 1140 Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu 1145 1150 1155 Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly 1160 1165 1170 Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp 1175 1180 1185 Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile 1190 1195 1200 Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg 1205 1210 1215 Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu 1220 1225 1230 Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser 1235 1240 1245 His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys 1250 1255 1260 Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile 1265 1270 1275 Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala 1280 1285 1290 Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys 1295 1300 1305 Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu 1310 1315 1320 Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr 1325 1330 1335 Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala 1340 1345 1350 Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1355 1360 1365 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Ser Arg Ala Asp Pro Lys Lys 1370 1375 1380 Lys Arg Lys Val His His His His His His 1385 1390 <210> 7822 <211> 1393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7822 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly 1 5 10 15 Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu 20 25 30 Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg 35 40 45 His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr 65 70 75 80 Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Leu Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn 85 90 95 Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser 100 105 110 Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly 115 120 125 Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr 130 135 140 His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg 145 150 155 160 Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe 165 170 175 Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu 180 185 190 Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro 195 200 205 Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu 210 215 220 Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu 225 230 235 240 Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu 245 250 255 Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu 260 265 270 Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala 275 280 285 Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu 290 295 300 Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile 305 310 315 320 Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His 325 330 335 His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro 340 345 350 Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala 355 360 365 Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile 370 375 380 Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys 385 390 395 400 Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly 405 410 415 Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg 420 425 430 Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile 435 440 445 Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala 450 455 460 Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr 465 470 475 480 Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala 485 490 495 Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn 500 505 510 Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val 515 520 525 Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys 530 535 540 Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu 545 550 555 560 Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr 565 570 575 Phe Lys Lys Ile Glu Glu Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu 580 585 590 Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile 595 600 605 Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu 610 615 620 Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile 625 630 635 640 Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met 645 650 655 Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg 660 665 670 Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu 675 680 685 Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu 690 695 700 Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln 705 710 715 720 Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala 725 730 735 Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val 740 745 750 Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val 755 760 765 Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn 770 775 780 Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly 785 790 795 800 Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn 805 810 815 Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val 820 825 830 Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His 835 840 845 Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val 850 855 860 Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser 865 870 875 880 Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn 885 890 895 Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu 900 905 910 Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln 915 920 925 Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp 930 935 940 Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu 945 950 955 960 Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys 965 970 975 Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala 980 985 990 His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys 995 1000 1005 Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val 1010 1015 1020 Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly 1025 1030 1035 Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe 1040 1045 1050 Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg 1055 1060 1065 Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp 1070 1075 1080 Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro 1085 1090 1095 Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe 1100 1105 1110 Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1115 1120 1125 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp 1130 1135 1140 Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu 1145 1150 1155 Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly 1160 1165 1170 Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp 1175 1180 1185 Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile 1190 1195 1200 Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg 1205 1210 1215 Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu 1220 1225 1230 Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser 1235 1240 1245 His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys 1250 1255 1260 Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile 1265 1270 1275 Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala 1280 1285 1290 Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys 1295 1300 1305 Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu 1310 1315 1320 Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr 1325 1330 1335 Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala 1340 1345 1350 Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1355 1360 1365 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Ser Arg Ala Asp Pro Lys Lys 1370 1375 1380 Lys Arg Lys Val His His His His His His 1385 1390 <210> 7823 <211> 1399 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7823 Met Gly Ser Ser His His His His His His His His Glu Asn Leu Tyr 1 5 10 15 Phe Gln Gly Ser Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly 20 25 30 Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro 35 40 45 Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys 50 55 60 Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu 65 70 75 80 Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys 85 90 95 Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys 100 105 110 Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu 115 120 125 Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp 130 135 140 Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys 145 150 155 160 Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu 165 170 175 Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly 180 185 190 Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu 195 200 205 Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser 210 215 220 Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg 225 230 235 240 Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly 245 250 255 Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe 260 265 270 Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys 275 280 285 Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp 290 295 300 Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile 305 310 315 320 Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro 325 330 335 Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu 340 345 350 Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys 355 360 365 Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp 370 375 380 Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu 385 390 395 400 Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu 405 410 415 Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His 420 425 430 Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp 435 440 445 Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu 450 455 460 Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser 465 470 475 480 Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp 485 490 495 Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile 500 505 510 Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu 515 520 525 Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu 530 535 540 Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu 545 550 555 560 Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn 565 570 575 Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile 580 585 590 Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn 595 600 605 Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys 610 615 620 Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val 625 630 635 640 Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu 645 650 655 Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys 660 665 670 Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn 675 680 685 Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys 690 695 700 Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp 705 710 715 720 Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln 725 730 735 Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala 740 745 750 Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val 755 760 765 Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala 770 775 780 Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg 785 790 795 800 Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu 805 810 815 Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr 820 825 830 Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu 835 840 845 Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln 850 855 860 Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser 865 870 875 880 Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val 885 890 895 Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile 900 905 910 Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu 915 920 925 Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr 930 935 940 Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn 945 950 955 960 Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile 965 970 975 Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe 980 985 990 Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr 995 1000 1005 Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys 1010 1015 1020 Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val 1025 1030 1035 Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr 1040 1045 1050 Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr 1055 1060 1065 Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile 1070 1075 1080 Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg 1085 1090 1095 Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn 1100 1105 1110 Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu 1115 1120 1125 Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys 1130 1135 1140 Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr 1145 1150 1155 Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys 1160 1165 1170 Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile 1175 1180 1185 Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu 1190 1195 1200 Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu 1205 1210 1215 Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met 1220 1225 1230 Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu 1235 1240 1245 Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu 1250 1255 1260 Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe 1265 1270 1275 Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile 1280 1285 1290 Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp 1295 1300 1305 Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg 1310 1315 1320 Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu 1325 1330 1335 Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg 1340 1345 1350 Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile 1355 1360 1365 His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser 1370 1375 1380 Gln Leu Gly Gly Asp Gly Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys 1385 1390 1395 Val <210> 7824 <211> 1396 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7824 Met Ala His His His His His His Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg 1 5 10 15 Lys Val Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser 20 25 30 Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys 35 40 45 Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu 50 55 60 Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg 65 70 75 80 Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile 85 90 95 Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp 100 105 110 Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys 115 120 125 Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala 130 135 140 Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val 145 150 155 160 Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala 165 170 175 His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn 180 185 190 Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr 195 200 205 Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp 210 215 220 Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu 225 230 235 240 Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly 245 250 255 Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn 260 265 270 Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr 275 280 285 Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala 290 295 300 Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser 305 310 315 320 Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala 325 330 335 Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu 340 345 350 Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe 355 360 365 Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala 370 375 380 Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met 385 390 395 400 Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu 405 410 415 Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His 420 425 430 Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro 435 440 445 Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg 450 455 460 Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala 465 470 475 480 Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu 485 490 495 Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met 500 505 510 Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His 515 520 525 Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val 530 535 540 Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu 545 550 555 560 Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val 565 570 575 Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe 580 585 590 Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu 595 600 605 Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu 610 615 620 Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu 625 630 635 640 Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr 645 650 655 Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg 660 665 670 Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg 675 680 685 Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly 690 695 700 Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr 705 710 715 720 Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser 725 730 735 Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys 740 745 750 Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met 755 760 765 Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn 770 775 780 Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg 785 790 795 800 Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His 805 810 815 Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr 820 825 830 Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn 835 840 845 Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu 850 855 860 Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn 865 870 875 880 Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met 885 890 895 Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg 900 905 910 Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu 915 920 925 Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile 930 935 940 Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr 945 950 955 960 Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys 965 970 975 Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val 980 985 990 Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala 995 1000 1005 Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser 1010 1015 1020 Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met 1025 1030 1035 Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr 1040 1045 1050 Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr 1055 1060 1065 Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn 1070 1075 1080 Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala 1085 1090 1095 Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys 1100 1105 1110 Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu 1115 1120 1125 Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp 1130 1135 1140 Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr 1145 1150 1155 Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys 1160 1165 1170 Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg 1175 1180 1185 Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly 1190 1195 1200 Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr 1205 1210 1215 Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser 1220 1225 1230 Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys 1235 1240 1245 Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys 1250 1255 1260 Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln 1265 1270 1275 His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe 1280 1285 1290 Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu 1295 1300 1305 Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala 1310 1315 1320 Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro 1325 1330 1335 Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr 1340 1345 1350 Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser 1355 1360 1365 Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly 1370 1375 1380 Gly Asp Ser Arg Ala Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1385 1390 1395 <210> 7825 <211> 1386 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7825 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly 1 5 10 15 Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu 20 25 30 Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg 35 40 45 His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr 65 70 75 80 Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn 85 90 95 Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser 100 105 110 Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly 115 120 125 Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr 130 135 140 His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg 145 150 155 160 Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe 165 170 175 Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu 180 185 190 Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro 195 200 205 Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu 210 215 220 Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu 225 230 235 240 Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu 245 250 255 Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu 260 265 270 Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala 275 280 285 Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu 290 295 300 Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile 305 310 315 320 Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His 325 330 335 His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro 340 345 350 Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala 355 360 365 Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile 370 375 380 Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys 385 390 395 400 Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly 405 410 415 Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg 420 425 430 Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile 435 440 445 Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala 450 455 460 Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr 465 470 475 480 Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala 485 490 495 Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn 500 505 510 Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val 515 520 525 Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys 530 535 540 Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu 545 550 555 560 Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr 565 570 575 Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu 580 585 590 Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile 595 600 605 Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu 610 615 620 Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile 625 630 635 640 Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met 645 650 655 Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg 660 665 670 Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu 675 680 685 Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu 690 695 700 Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln 705 710 715 720 Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala 725 730 735 Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val 740 745 750 Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val 755 760 765 Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn 770 775 780 Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly 785 790 795 800 Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn 805 810 815 Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val 820 825 830 Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His 835 840 845 Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val 850 855 860 Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser 865 870 875 880 Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn 885 890 895 Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu 900 905 910 Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln 915 920 925 Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp 930 935 940 Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu 945 950 955 960 Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys 965 970 975 Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala 980 985 990 His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys 995 1000 1005 Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val 1010 1015 1020 Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly 1025 1030 1035 Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe 1040 1045 1050 Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg 1055 1060 1065 Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp 1070 1075 1080 Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro 1085 1090 1095 Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe 1100 1105 1110 Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1115 1120 1125 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp 1130 1135 1140 Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu 1145 1150 1155 Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly 1160 1165 1170 Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp 1175 1180 1185 Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile 1190 1195 1200 Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg 1205 1210 1215 Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu 1220 1225 1230 Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser 1235 1240 1245 His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys 1250 1255 1260 Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile 1265 1270 1275 Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala 1280 1285 1290 Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys 1295 1300 1305 Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu 1310 1315 1320 Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr 1325 1330 1335 Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala 1340 1345 1350 Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1355 1360 1365 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Ser Arg Ala Asp His His His 1370 1375 1380 His His His 1385 <210> 7826 <211> 1389 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7826 Met Ala His His His His His His Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser 1 5 10 15 Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr 20 25 30 Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr 35 40 45 Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp 50 55 60 Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg 65 70 75 80 Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe 85 90 95 Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu 100 105 110 Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile 115 120 125 Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr 130 135 140 Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp 145 150 155 160 Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly 165 170 175 His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp 180 185 190 Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu 195 200 205 Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala 210 215 220 Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro 225 230 235 240 Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu 245 250 255 Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala 260 265 270 Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu 275 280 285 Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys 290 295 300 Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr 305 310 315 320 Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp 325 330 335 Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln 340 345 350 Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly 355 360 365 Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys 370 375 380 Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu 385 390 395 400 Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp 405 410 415 Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile 420 425 430 Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu 435 440 445 Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro 450 455 460 Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu 465 470 475 480 Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala 485 490 495 Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu 500 505 510 Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe 515 520 525 Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met 530 535 540 Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp 545 550 555 560 Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu 565 570 575 Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly 580 585 590 Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu 595 600 605 Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp 610 615 620 Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu 625 630 635 640 Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys 645 650 655 Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu 660 665 670 Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr 675 680 685 Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met 690 695 700 Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys 705 710 715 720 Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn 725 730 735 Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys 740 745 750 Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn 755 760 765 Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln 770 775 780 Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu 785 790 795 800 Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu 805 810 815 Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met 820 825 830 Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val 835 840 845 Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn 850 855 860 Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val 865 870 875 880 Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu 885 890 895 Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys 900 905 910 Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys 915 920 925 Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile 930 935 940 Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile 945 950 955 960 Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe 965 970 975 Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His 980 985 990 His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile 995 1000 1005 Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr 1010 1015 1020 Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu 1025 1030 1035 Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met 1040 1045 1050 Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg 1055 1060 1065 Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val 1070 1075 1080 Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser 1085 1090 1095 Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly 1100 1105 1110 Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys 1115 1120 1125 Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly 1130 1135 1140 Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys 1145 1150 1155 Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu 1160 1165 1170 Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro 1175 1180 1185 Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp 1190 1195 1200 Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn 1205 1210 1215 Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly 1220 1225 1230 Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu 1235 1240 1245 Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu 1250 1255 1260 Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu 1265 1270 1275 Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala 1280 1285 1290 Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg 1295 1300 1305 Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe 1310 1315 1320 Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp 1325 1330 1335 Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu 1340 1345 1350 Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr 1355 1360 1365 Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Ser Arg Ala Asp Pro 1370 1375 1380 Lys Lys Lys Arg Lys Val 1385 <210> 7827 <211> 1399 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7827 Met Gly Ser Ser His His His His His His His His Glu Asn Leu Tyr 1 5 10 15 Phe Gln Gly Ser Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly 20 25 30 Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro 35 40 45 Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys 50 55 60 Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu 65 70 75 80 Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys 85 90 95 Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys 100 105 110 Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu 115 120 125 Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp 130 135 140 Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys 145 150 155 160 Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu 165 170 175 Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly 180 185 190 Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu 195 200 205 Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser 210 215 220 Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg 225 230 235 240 Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly 245 250 255 Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe 260 265 270 Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys 275 280 285 Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp 290 295 300 Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile 305 310 315 320 Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro 325 330 335 Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu 340 345 350 Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys 355 360 365 Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp 370 375 380 Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu 385 390 395 400 Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu 405 410 415 Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His 420 425 430 Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp 435 440 445 Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu 450 455 460 Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser 465 470 475 480 Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp 485 490 495 Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile 500 505 510 Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu 515 520 525 Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu 530 535 540 Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu 545 550 555 560 Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn 565 570 575 Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile 580 585 590 Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn 595 600 605 Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys 610 615 620 Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val 625 630 635 640 Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu 645 650 655 Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys 660 665 670 Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn 675 680 685 Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys 690 695 700 Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp 705 710 715 720 Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln 725 730 735 Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala 740 745 750 Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val 755 760 765 Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala 770 775 780 Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg 785 790 795 800 Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu 805 810 815 Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr 820 825 830 Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu 835 840 845 Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln 850 855 860 Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser 865 870 875 880 Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val 885 890 895 Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile 900 905 910 Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu 915 920 925 Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr 930 935 940 Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn 945 950 955 960 Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile 965 970 975 Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe 980 985 990 Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr 995 1000 1005 Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys 1010 1015 1020 Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val 1025 1030 1035 Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr 1040 1045 1050 Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr 1055 1060 1065 Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile 1070 1075 1080 Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg 1085 1090 1095 Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn 1100 1105 1110 Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu 1115 1120 1125 Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys 1130 1135 1140 Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr 1145 1150 1155 Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys 1160 1165 1170 Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile 1175 1180 1185 Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu 1190 1195 1200 Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu 1205 1210 1215 Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met 1220 1225 1230 Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu 1235 1240 1245 Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu 1250 1255 1260 Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe 1265 1270 1275 Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile 1280 1285 1290 Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp 1295 1300 1305 Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg 1310 1315 1320 Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu 1325 1330 1335 Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg 1340 1345 1350 Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile 1355 1360 1365 His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser 1370 1375 1380 Gln Leu Gly Gly Asp Gly Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys 1385 1390 1395 Val <210> 7828 <211> 1393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7828 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly 1 5 10 15 Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu 20 25 30 Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg 35 40 45 His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr 65 70 75 80 Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn 85 90 95 Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser 100 105 110 Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly 115 120 125 Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr 130 135 140 His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg 145 150 155 160 Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe 165 170 175 Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu 180 185 190 Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro 195 200 205 Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu 210 215 220 Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu 225 230 235 240 Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu 245 250 255 Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu 260 265 270 Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala 275 280 285 Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu 290 295 300 Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile 305 310 315 320 Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His 325 330 335 His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro 340 345 350 Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala 355 360 365 Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile 370 375 380 Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys 385 390 395 400 Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly 405 410 415 Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg 420 425 430 Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile 435 440 445 Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala 450 455 460 Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr 465 470 475 480 Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala 485 490 495 Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn 500 505 510 Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val 515 520 525 Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys 530 535 540 Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu 545 550 555 560 Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr 565 570 575 Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu 580 585 590 Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile 595 600 605 Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu 610 615 620 Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile 625 630 635 640 Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met 645 650 655 Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg 660 665 670 Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu 675 680 685 Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu 690 695 700 Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln 705 710 715 720 Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala 725 730 735 Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val 740 745 750 Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val 755 760 765 Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn 770 775 780 Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly 785 790 795 800 Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn 805 810 815 Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val 820 825 830 Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His 835 840 845 Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Ala Val 850 855 860 Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser 865 870 875 880 Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn 885 890 895 Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu 900 905 910 Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln 915 920 925 Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp 930 935 940 Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu 945 950 955 960 Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys 965 970 975 Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala 980 985 990 His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys 995 1000 1005 Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val 1010 1015 1020 Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly 1025 1030 1035 Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe 1040 1045 1050 Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg 1055 1060 1065 Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp 1070 1075 1080 Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro 1085 1090 1095 Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe 1100 1105 1110 Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1115 1120 1125 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp 1130 1135 1140 Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu 1145 1150 1155 Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly 1160 1165 1170 Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp 1175 1180 1185 Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile 1190 1195 1200 Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg 1205 1210 1215 Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu 1220 1225 1230 Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser 1235 1240 1245 His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys 1250 1255 1260 Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile 1265 1270 1275 Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala 1280 1285 1290 Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys 1295 1300 1305 Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu 1310 1315 1320 Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr 1325 1330 1335 Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala 1340 1345 1350 Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1355 1360 1365 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Ser Arg Ala Asp Pro Lys Lys 1370 1375 1380 Lys Arg Lys Val His His His His His His 1385 1390 <210> 7829 <211> 1393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7829 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly 1 5 10 15 Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu 20 25 30 Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg 35 40 45 His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr 65 70 75 80 Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn 85 90 95 Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser 100 105 110 Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly 115 120 125 Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr 130 135 140 His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg 145 150 155 160 Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe 165 170 175 Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu 180 185 190 Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro 195 200 205 Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu 210 215 220 Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu 225 230 235 240 Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu 245 250 255 Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu 260 265 270 Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala 275 280 285 Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu 290 295 300 Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile 305 310 315 320 Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His 325 330 335 His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro 340 345 350 Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala 355 360 365 Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile 370 375 380 Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys 385 390 395 400 Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly 405 410 415 Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg 420 425 430 Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile 435 440 445 Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala 450 455 460 Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr 465 470 475 480 Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala 485 490 495 Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn 500 505 510 Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val 515 520 525 Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys 530 535 540 Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu 545 550 555 560 Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr 565 570 575 Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu 580 585 590 Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile 595 600 605 Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu 610 615 620 Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile 625 630 635 640 Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met 645 650 655 Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg 660 665 670 Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu 675 680 685 Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu 690 695 700 Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln 705 710 715 720 Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala 725 730 735 Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val 740 745 750 Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val 755 760 765 Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn 770 775 780 Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly 785 790 795 800 Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn 805 810 815 Glu Ala Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val 820 825 830 Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His 835 840 845 Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val 850 855 860 Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser 865 870 875 880 Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn 885 890 895 Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu 900 905 910 Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln 915 920 925 Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp 930 935 940 Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu 945 950 955 960 Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys 965 970 975 Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala 980 985 990 His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys 995 1000 1005 Tyr Pro Ala Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val 1010 1015 1020 Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly 1025 1030 1035 Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe 1040 1045 1050 Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Ala 1055 1060 1065 Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp 1070 1075 1080 Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro 1085 1090 1095 Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe 1100 1105 1110 Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1115 1120 1125 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp 1130 1135 1140 Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu 1145 1150 1155 Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly 1160 1165 1170 Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp 1175 1180 1185 Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile 1190 1195 1200 Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg 1205 1210 1215 Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu 1220 1225 1230 Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser 1235 1240 1245 His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys 1250 1255 1260 Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile 1265 1270 1275 Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala 1280 1285 1290 Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys 1295 1300 1305 Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu 1310 1315 1320 Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr 1325 1330 1335 Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala 1340 1345 1350 Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1355 1360 1365 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Ser Arg Ala Asp Pro Lys Lys 1370 1375 1380 Lys Arg Lys Val His His His His His His 1385 1390 <210> 7830 <211> 1393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7830 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly 1 5 10 15 Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu 20 25 30 Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg 35 40 45 His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr 65 70 75 80 Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn 85 90 95 Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser 100 105 110 Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly 115 120 125 Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr 130 135 140 His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg 145 150 155 160 Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe 165 170 175 Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu 180 185 190 Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro 195 200 205 Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu 210 215 220 Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu 225 230 235 240 Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu 245 250 255 Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu 260 265 270 Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala 275 280 285 Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu 290 295 300 Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile 305 310 315 320 Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His 325 330 335 His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro 340 345 350 Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala 355 360 365 Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile 370 375 380 Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys 385 390 395 400 Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly 405 410 415 Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg 420 425 430 Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile 435 440 445 Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala 450 455 460 Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr 465 470 475 480 Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala 485 490 495 Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn 500 505 510 Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val 515 520 525 Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys 530 535 540 Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu 545 550 555 560 Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr 565 570 575 Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu 580 585 590 Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile 595 600 605 Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu 610 615 620 Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile 625 630 635 640 Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met 645 650 655 Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg 660 665 670 Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu 675 680 685 Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu 690 695 700 Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln 705 710 715 720 Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala 725 730 735 Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val 740 745 750 Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val 755 760 765 Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn 770 775 780 Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly 785 790 795 800 Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn 805 810 815 Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val 820 825 830 Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His 835 840 845 Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Ala Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val 850 855 860 Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser 865 870 875 880 Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn 885 890 895 Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu 900 905 910 Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln 915 920 925 Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp 930 935 940 Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu 945 950 955 960 Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys 965 970 975 Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala 980 985 990 His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys 995 1000 1005 Tyr Pro Ala Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val 1010 1015 1020 Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly 1025 1030 1035 Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe 1040 1045 1050 Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Ala 1055 1060 1065 Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp 1070 1075 1080 Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro 1085 1090 1095 Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe 1100 1105 1110 Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1115 1120 1125 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp 1130 1135 1140 Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu 1145 1150 1155 Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly 1160 1165 1170 Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp 1175 1180 1185 Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile 1190 1195 1200 Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg 1205 1210 1215 Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu 1220 1225 1230 Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser 1235 1240 1245 His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys 1250 1255 1260 Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile 1265 1270 1275 Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala 1280 1285 1290 Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys 1295 1300 1305 Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu 1310 1315 1320 Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr 1325 1330 1335 Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala 1340 1345 1350 Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1355 1360 1365 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Ser Arg Ala Asp Pro Lys Lys 1370 1375 1380 Lys Arg Lys Val His His His His His His 1385 1390 <210> 7831 <211> 1393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7831 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly 1 5 10 15 Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu 20 25 30 Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg 35 40 45 His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr 65 70 75 80 Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn 85 90 95 Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser 100 105 110 Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly 115 120 125 Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr 130 135 140 His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg 145 150 155 160 Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe 165 170 175 Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu 180 185 190 Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro 195 200 205 Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu 210 215 220 Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu 225 230 235 240 Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu 245 250 255 Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu 260 265 270 Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala 275 280 285 Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu 290 295 300 Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile 305 310 315 320 Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His 325 330 335 His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro 340 345 350 Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala 355 360 365 Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile 370 375 380 Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys 385 390 395 400 Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly 405 410 415 Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg 420 425 430 Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile 435 440 445 Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala 450 455 460 Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr 465 470 475 480 Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala 485 490 495 Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Ala Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn 500 505 510 Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val 515 520 525 Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys 530 535 540 Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu 545 550 555 560 Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr 565 570 575 Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu 580 585 590 Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile 595 600 605 Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu 610 615 620 Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile 625 630 635 640 Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met 645 650 655 Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Ala Leu Ser Arg 660 665 670 Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu 675 680 685 Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Ala Leu 690 695 700 Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln 705 710 715 720 Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala 725 730 735 Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val 740 745 750 Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val 755 760 765 Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn 770 775 780 Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly 785 790 795 800 Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn 805 810 815 Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val 820 825 830 Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His 835 840 845 Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val 850 855 860 Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser 865 870 875 880 Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn 885 890 895 Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu 900 905 910 Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln 915 920 925 Leu Val Glu Thr Arg Ala Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp 930 935 940 Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu 945 950 955 960 Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys 965 970 975 Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala 980 985 990 His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys 995 1000 1005 Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val 1010 1015 1020 Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly 1025 1030 1035 Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe 1040 1045 1050 Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg 1055 1060 1065 Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp 1070 1075 1080 Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro 1085 1090 1095 Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe 1100 1105 1110 Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1115 1120 1125 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp 1130 1135 1140 Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu 1145 1150 1155 Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly 1160 1165 1170 Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp 1175 1180 1185 Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile 1190 1195 1200 Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg 1205 1210 1215 Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu 1220 1225 1230 Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser 1235 1240 1245 His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys 1250 1255 1260 Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile 1265 1270 1275 Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala 1280 1285 1290 Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys 1295 1300 1305 Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu 1310 1315 1320 Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr 1325 1330 1335 Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala 1340 1345 1350 Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1355 1360 1365 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Ser Arg Ala Asp Pro Lys Lys 1370 1375 1380 Lys Arg Lys Val His His His His His His 1385 1390

Claims (230)

  1. tracr 및 crRNA를 포함하며, crRNA는 BCL11A 유전자(예를 들어 인간 BCL11a 유전자), BCL11a 인핸서(예를 들어 인간 BCL11a 인핸서) 또는 HPFH 영역(예를 들어 인간 HPFH 영역)의 표적 서열에 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 것인, gRNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, 표적 서열은 BCL11A 유전자의 것이며, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 85 또는 SEQ ID NO: 400 내지 SEQ ID NO: 1231 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  3. 제1항에 있어서, 표적 서열은 BCL11a 인핸서의 것이며, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 1232 내지 SEQ ID NO: 1499 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  4. 제1항에 있어서, 표적 서열은 BCL11a 인핸서의 것이며, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 182 내지 SEQ ID NO: 277 또는 SEQ ID NO: 334 내지 SEQ ID NO: 341 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  5. 제4항에 있어서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 336 또는 SEQ ID NO: 337 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  6. 제4항에 있어서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 337, 또는 SEQ ID NO: 338 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  7. 제4항에 있어서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 248 또는 SEQ ID NO: 338 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  8. 제4항에 있어서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 248을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  9. 제4항에 있어서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 338을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  10. 제1항에 있어서, 표적 서열은 BCL11a 인핸서의 것이며, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 278 내지 SEQ ID NO: 333 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  11. 제10항에 있어서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 289, 또는 SEQ ID NO: 281 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  12. 제10항에 있어서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 318을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인 것인, gRNA 분자.
  13. 제1항에 있어서, 표적 서열은 BCL11a 인핸서의 것이며, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 1596 내지 SEQ ID NO: 1691 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  14. 제13항에 있어서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 1683, SEQ ID NO: 1638, SEQ ID NO: 1647, SEQ ID NO: 1609, SEQ ID NO: 1621, SEQ ID NO: 1617, SEQ ID NO: 1654, SEQ ID NO: 1631, SEQ ID NO: 1620, SEQ ID NO: 1637, SEQ ID NO: 1612, SEQ ID NO: 1656, SEQ ID NO: 1619, SEQ ID NO: 1675, SEQ ID NO: 1645, SEQ ID NO: 1598, SEQ ID NO: 1599, SEQ ID NO: 1663, SEQ ID NO: 1677, 또는 SEQ ID NO: 1626 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  15. 제1항에 있어서, 표적 서열은 HPFH 영역(예를 들어 프렌치 HPFH 영역)의 것이며, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 86 내지 SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 1500 내지 SEQ ID NO: 1595, 또는 SEQ ID NO: 1692 내지 SEQ ID NO: 1761 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  16. 제15항에 있어서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 1580, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 1503, SEQ ID NO: 1589, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 1537, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 1536, SEQ ID NO: 1539, SEQ ID NO: 1585 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  17. 제15항에 있어서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 1505, SEQ ID NO: 1589, SEQ ID NO: 1700, 또는 SEQ ID NO: 1750 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  18. 제15항에 있어서, 표적화 도메인은 SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 165, 또는 SEQ ID NO: 113 중 어느 하나를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  19. 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 도메인은 열거된 표적화 도메인 서열 중 어느 하나의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속적 핵산을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  20. 제16항에 있어서, 열거된 표적화 도메인 서열 중 어느 하나의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 3' 말단에 배치된 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속적 핵산인, gRNA 분자.
  21. 제16항에 있어서, 열거된 표적화 도메인 서열 중 어느 하나의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 5' 말단에 배치된 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속적 핵산인, gRNA 분자.
  22. 제16항에 있어서, 열거된 표적화 도메인 서열 중 어느 하나의 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속적 핵산은 열거된 표적화 도메인 서열의 5' 또는 3' 핵산을 포함하지 않는 것인, gRNA 분자.
  23. 제2항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 도메인은 열거된 표적화 도메인 서열로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, crRNA의 일부분 및 tracr의 일부분은 혼성화하여 SEQ ID NO: 6584 또는 6585를 포함하는 플래그폴(flagpole)을 형성하는 것인, gRNA 분자.
  25. 제24항에 있어서, 플래그폴은 플래그폴의 crRNA 부분에 대해 3'에 위치하는 제1 플래그폴 연장을 추가로 포함하며, 상기 제1 플래그폴 연장은 SEQ ID NO: 6586을 포함하는 것인, gRNA 분자.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 플래그폴은 플래그폴의 crRNA 부분에 대해 3'에 위치하는 제2 플래그폴 연장, 및 존재하는 경우에 제1 플래그폴 연장을 추가로 포함하며, 상기 제2 플래그폴 연장은 SEQ ID NO: 6587을 포함하는 것인, gRNA 분자.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, tracr은 SEQ ID NO: 6660 또는 SEQ ID NO: 6661을 포함하는 것인, gRNA 분자.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, tracr은 SEQ ID NO: 7812를 포함하며, 선택적으로 추가적인 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 우라실 (U) 뉴클레오티드를 3' 말단에 추가로 포함하는 것인, gRNA 분자.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, crRNA는 5'에서 3'으로 [표적화 도메인]-:
    a) SEQ ID NO: 6584;
    b) SEQ ID NO: 6585;
    c) SEQ ID NO: 6605;
    d) SEQ ID NO: 6606;
    e) SEQ ID NO: 6607;
    f) SEQ ID NO: 6608; 또는
    g) SEQ ID NO: 7806
    을 포함하는 것인, gRNA 분자.
  30. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항 또는 제29항에 있어서, tracr은 5'에서 3'으로
    a) SEQ ID NO: 6589;
    b) SEQ ID NO: 6590;
    c) SEQ ID NO: 6609;
    d) SEQ ID NO: 6610;
    e) SEQ ID NO: 6660;
    f) SEQ ID NO: 6661;
    g) SEQ ID NO: 7812;
    h) SEQ ID NO: 7807;
    i) SEQ ID NO: 7808;
    j) SEQ ID NO: 7809;
    k) 3' 말단에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 우라실 (U) 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 우라실 (U) 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 상기 a) 내지 j) 중 임의의 것;
    l) 3' 말단에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 상기 a) 내지 k) 중 임의의 것; 또는
    m) 5' 말단(예를 들어 5' 말미)에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아데닌 (A) 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 상기 a) 내지 l) 중 임의의 것
    을 포함하는, gRNA 분자.
  31. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 도메인 및 tracr은 별개의 핵산 분자 상에 배치되며, 표적화 도메인을 포함하는 핵산 분자는 선택적으로 표적화 도메인에 대해 3' 바로 옆에 배치되는 SEQ ID NO: 6607을 포함하고, tracr을 포함하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  32. 제27항 또는 제28항에 있어서, 플래그폴의 crRNA 부분은 SEQ ID NO: 6607 또는 SEQ ID NO: 6608을 포함하는 것인, gRNA 분자.
  33. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, tracr은 SEQ ID NO: 6589 또는 6590, 및 선택적으로 제1 플래그폴 연장이 존재하는 경우, SEQ ID NO: 6589 또는 6590에 대해 5'에 배치되는 제1 tracr 연장을 포함하며, 상기 제1 tracr 연장은 SEQ ID NO: 6591을 포함하는 것인, gRNA 분자.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 도메인 및 tracr은 별개의 핵산 분자 상에 배치되는 것인, gRNA 분자.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 도메인 및 tracr은 단일 핵산 분자 상에 배치되며, tracr은 표적화 도메인에 대해 3'에 배치되는 것인, gRNA 분자.
  36. 제35항에 있어서, 표적화 도메인에 대해 3' 및 tracr에 대해 5'에 배치되는 루프를 추가로 포함하는, gRNA 분자.
  37. 제36항에 있어서, 루프는 SEQ ID NO: 6588을 포함하는 것인, gRNA 분자.
  38. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 5'에서 3'으로 [표적화 도메인]-:
    (a) SEQ ID NO: 6601;
    (b) SEQ ID NO: 6602;
    (c) SEQ ID NO: 6603;
    (d) SEQ ID NO: 6604;
    (e) SEQ ID NO: 7811; 또는
    (f) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 우라실 (U) 뉴클레오티드를 3' 말단에 추가로 포함하는, 상기 (a) 내지 (e) 중 임의의 것
    을 포함하는, gRNA 분자.
  39. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 도메인 및 tracr은 단일 핵산 분자 상에 배치되며, 상기 핵산 분자는 상기 표적화 도메인, 및 선택적으로 상기 표적화 도메인에 대해 3' 바로 옆에 배치되는 SEQ ID NO: 7811을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, gRNA 분자.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자를 포함하는 핵산 분자 중 하나 또는 또는 선택적으로 하나 초과는:
    a) 상기 핵산 분자 또는 분자들의 3' 말단에 하나 이상의, 예를 들어 3개의 포스포로티오에이트 변형;
    b) 상기 핵산 분자 또는 분자들의 5' 말단에 하나 이상의, 예를 들어 3개의 포스포로티오에이트 변형;
    c) 상기 핵산 분자 또는 분자들의 3' 말단에 하나 이상의, 예를 들어 3개의 2'-O-메틸 변형;
    d) 상기 핵산 분자 또는 분자들의 5' 말단에 하나 이상의, 예를 들어 3개의 2'-O-메틸 변형;
    e) 상기 핵산 분자 또는 분자들의 3' 말미 방향으로 4 번째, 3' 말미 방향으로 3 번째, 및 3' 말미 방향으로 2 번째 잔기 각각에 2' O-메틸 변형;
    f) 상기 핵산 분자 또는 분자들의 5' 말미 방향으로 4 번째, 5' 말미 방향으로 3 번째, 및 5' 말미 방향으로 2 번째 잔기 각각에 2' O-메틸 변형; 또는
    f) 이의 임의의 조합
    을 포함하는 것인, gRNA 분자.
  41. 제1항에 있어서, 서열:
    (a) SEQ ID NO: 342;
    (b) SEQ ID NO: 343; 또는
    (c) SEQ ID NO: 1762
    를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  42. 제1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 344를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (b) SEQ ID NO: 344를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (c) SEQ ID NO: 345를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; 또는
    (d) SEQ ID NO: 345를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  43. 제1항에 있어서, 서열:
    (a) SEQ ID NO: 347;
    (b) SEQ ID NO: 348; 또는
    (c) SEQ ID NO: 1763
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  44. 제1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 349를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (b) SEQ ID NO: 349를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (c) SEQ ID NO: 350을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; 또는
    (d) SEQ ID NO: 350을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  45. 제1항에 있어서, 서열:
    (a) SEQ ID NO: 351;
    (b) SEQ ID NO: 352; 또는
    (c) SEQ ID NO: 1764
    를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  46. 제1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 353을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (b) SEQ ID NO: 353을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (c) SEQ ID NO: 354를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; 또는
    (d) SEQ ID NO: 354를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  47. 제1항에 있어서, 서열:
    (a) SEQ ID NO: 355;
    (b) SEQ ID NO: 356; 또는
    (c) SEQ ID NO: 1765
    를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  48. 제1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 357을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (b) SEQ ID NO: 357을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (c) SEQ ID NO: 358을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; 또는
    (d) SEQ ID NO: 358을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  49. 제1항에 있어서, 서열:
    (a) SEQ ID NO: 359;
    (b) SEQ ID NO: 360; 또는
    (c) SEQ ID NO: 1766
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  50. 제1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 361을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (b) SEQ ID NO: 361을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (c) SEQ ID NO: 362를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; 또는
    (d) SEQ ID NO: 362를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  51. 제1항에 있어서, 서열:
    (a) SEQ ID NO: 363;
    (b) SEQ ID NO: 364; 또는
    (c) SEQ ID NO: 1767
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  52. 제1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 365를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (b) SEQ ID NO: 365를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (c) SEQ ID NO: 366을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; 또는
    (d) SEQ ID NO: 366을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  53. 제1항에 있어서, 서열:
    (a) SEQ ID NO: 367;
    (b) SEQ ID NO: 368; 또는
    (c) SEQ ID NO: 1768
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  54. 제1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 369를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (b) SEQ ID NO: 369를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (c) SEQ ID NO: 370을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; 또는
    (d) SEQ ID NO: 370을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  55. 제1항에 있어서, 서열:
    (a) SEQ ID NO: 371;
    (b) SEQ ID NO: 372; 또는
    (c) SEQ ID NO: 1769
    를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  56. 제1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 373을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (b) SEQ ID NO: 373을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (c) SEQ ID NO: 374를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; 또는
    (d) SEQ ID NO: 374를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  57. 제1항에 있어서, 서열:
    (a) SEQ ID NO: 375;
    (b) SEQ ID NO: 376; 또는
    (c) SEQ ID NO: 1770
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  58. 제1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 377을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (b) SEQ ID NO: 377을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (c) SEQ ID NO: 378을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; 또는
    (d) SEQ ID NO: 378을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  59. 제1항에 있어서, 서열:
    (a) SEQ ID NO: 379;
    (b) SEQ ID NO: 380; 또는
    (c) SEQ ID NO: 1771
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  60. 제1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 381을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (b) SEQ ID NO: 381을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (c) SEQ ID NO: 382를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; 또는
    (d) SEQ ID NO: 382를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  61. 제1항에 있어서, 서열:
    (a) SEQ ID NO: 383;
    (b) SEQ ID NO: 384; 또는
    (c) SEQ ID NO: 1772
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  62. 제1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 385를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (b) SEQ ID NO: 385를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (c) SEQ ID NO: 386을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; 또는
    (d) SEQ ID NO: 386을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  63. 제1항에 있어서, 서열:
    (a) SEQ ID NO: 387;
    (b) SEQ ID NO: 388; 또는
    (c) SEQ ID NO: 1773
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  64. 제1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 389를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (b) SEQ ID NO: 389를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (c) SEQ ID NO: 390을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; 또는
    (d) SEQ ID NO: 390을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  65. 제1항에 있어서, 서열:
    (a) SEQ ID NO: 391;
    (b) SEQ ID NO: 392; 또는
    (c) SEQ ID NO: 1774
    를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  66. 제1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 393을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는,예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (b) SEQ ID NO: 393을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (c) SEQ ID NO: 394를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; 또는
    (d) SEQ ID NO: 394를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  67. 제1항에 있어서, 서열:
    (a) SEQ ID NO: 395;
    (b) SEQ ID NO: 396; 또는
    (c) SEQ ID NO: 1775
    를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  68. 제1항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 397을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (b) SEQ ID NO: 397을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr;
    (c) SEQ ID NO: 398을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 6660을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr; 또는
    (d) SEQ ID NO: 398을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 crRNA, 및 SEQ ID NO: 346을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 tracr
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, gRNA 분자.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 RNP)이 세포 내로 도입될 때, gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열에 또는 그 근처에 삽입결실(indel)이 형성되는 것인, gRNA 분자.
  70. 제69항에 있어서, 삽입결실은 GATA-1 또는 TAL-1 결합 부위의 뉴클레오티드를 포함하지 않는 것인, gRNA 분자.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 RNP)이 세포 집단 내로 도입될 때, 집단 내 적어도 약 40%, 예를 들어 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 60%, 예를 들어 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 80%, 예를 들어 적어도 약 90%, 예를 들어 적어도 약 95%, 예를 들어 적어도 약 96%, 예를 들어 적어도 약 97%, 예를 들어 적어도 약 98%, 예를 들어 적어도 약 99%의 세포에서 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열에 또는 그 근처에 삽입결실이 형성되는 것인, gRNA 분자.
  72. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 RNP)이 세포 집단 내로 도입될 때, GATA-1 또는 TAL-1 결합 부위의 뉴클레오티드를 포함하지 않는 삽입결실은 집단 내 적어도 약 20%, 예를 들어 적어도 약 30%, 예를 들어 적어도 약 35%, 예를 들어 적어도 약 40%, 예를 들어 적어도 약 45%, 예를 들어 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 55%, 예를 들어 적어도 약 60%, 예를 들어 적어도 약 65%, 예를 들어 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 75%, 예를 들어 적어도 약 80%, 예를 들어 적어도 약 85%, 예를 들어 적어도 약 90%, 예를 들어 적어도 약 95%, 예를 들어 적어도 약 99%의 세포에서 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열에 또는 그 근처에 형성되는 것인, gRNA 분자.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 집단 내 적어도 약 30%, 예를 들어 적어도 약 40%, 예를 들어 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 60%, 예를 들어 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 80%, 예를 들어 적어도 약 90%, 예를 들어 적어도 약 95%, 예를 들어 적어도 약 96%, 예를 들어 적어도 약 97%, 예를 들어 적어도 약 98%, 예를 들어 적어도 약 99%의 세포에서, 삽입결실은 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37 중 임의의 것에 나열된 삽입결실인, gRNA 분자.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단에서 3종의 가장 빈번하게 검출되는 삽입결실은 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37 중 임의의 것에 나열된 임의의 gRNA 분자와 회합된 삽입결실을 포함하는 것인, gRNA 분자.
  75. 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입결실은 차세대 서열분석(NGS)에 의해 측정된 바와 같은 것인, gRNA 분자.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 RNP)이 세포 내로 도입될 때, 태아 헤모글로빈의 발현은 상기 세포 또는 그의 자손, 예를 들어 그의 적혈구계 자손, 예를 들어 그의 적혈구 자손에서 증가되는 것인, gRNA 분자.
  77. 제76항에 있어서, 태아 헤모글로빈의 발현은 상기 세포 또는 그의 자손, 예를 들어 그의 적혈구계 자손, 예를 들어 그의 적혈구 자손에서 적어도 약 20%, 예를 들어 적어도 약 30%, 예를 들어 적어도 약 40%, 예를 들어 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 60%, 예를 들어 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 80%, 예를 들어 적어도 약 90%, 예를 들어 적어도 약 95%, 예를 들어 적어도 약 96%, 예를 들어 적어도 약 97%, 예를 들어 적어도 약 98%, 예를 들어 적어도 약 99% 만큼 증가되는 것인, gRNA 분자.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 세포 또는 그의 자손, 예를 들어 그의 적혈구계 자손, 예를 들어 그의 적혈구 자손은 세포 당 적어도 약 6 피코그램(예를 들어 적어도 약 7 피코그램, 적어도 약 8 피코그램, 적어도 약 9 피코그램, 적어도 약 10 피코그램, 또는 약 8 내지 약 9 피코그램, 또는 약 9 내지 약 10 피코그램)의 태아 헤모글로빈을 생산하는 것인, gRNA 분자.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 RNP)이 세포 내로 도입될 때, 예를 들어 차세대 서열분석 및/또는 뉴클레오티드 삽입 검정에 의해 검출 가능한 바와 같이, 상기 세포에서 표적-외 삽입결실은 형성되지 않는 것인, gRNA 분자.
  80. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 분자를 포함하는 CRISPR 시스템(예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 RNP)이 세포 집단에 도입될 때, 예를 들어 차세대 서열분석 및/또는 뉴클레오티드 삽입 검정에 의해 검출 가능한 바와 같이, 세포 집단 내 약 5% 초과, 예를 들어 약 1% 초과, 예를 들어 약 0.1% 초과, 예를 들어 약 0.01% 초과의 세포에서 표적-외 삽입결실은 검출되지 않는 것인, gRNA 분자.
  81. 제69항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 포유동물, 영장류 또는 인간 세포, 예를 들어 인간 세포인(또는 세포 집단은 이를 포함하는 것인), gRNA 분자.
  82. 제81항에 있어서, 세포는 HSPC인(또는 세포 집단은 이를 포함하는 것인), gRNA 분자.
  83. 제82항에 있어서, HSPC는 CD34+인, gRNA 분자.
  84. 제83항에 있어서, HSPC는 CD34+CD90+인, gRNA 분자.
  85. 제69항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 상기 세포를 투여할 환자에 대해 자가 유래인, gRNA 분자.
  86. 제69항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 상기 세포를 투여할 환자에 대해 동종이계인, gRNA 분자.
  87. 1) 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 하나 이상의 gRNA 분자(제1 gRNA 분자를 포함), 및 Cas9 분자;
    2) 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 하나 이상의 gRNA 분자(제1 gRNA 분자를 포함), 및 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산;
    3) 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 하나 이상의 gRNA 분자(제1 gRNA 분자를 포함)를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자;
    4) 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 하나 이상의 gRNA 분자(제1 gRNA 분자를 포함)를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산; 또는
    5) 상기 1) 내지 4) 중 임의의 것, 및 주형 핵산; 또는
    6) 상기 1) 내지 4) 중 임의의 것, 및 주형 핵산을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산
    을 포함하는 조성물.
  88. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 제1 gRNA 분자를 포함하며, Cas9 분자를 추가로 포함하는 조성물.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, Cas9 분자는 활성 또는 불활성 에스. 피오게네스(s. pyogenes) Cas9인, 조성물.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는 SEQ ID NO: 6611을 포함하는 것인, 조성물.
  91. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 분자는
    (a) SEQ ID NO: 7821;
    (b) SEQ ID NO: 7822;
    (c) SEQ ID NO: 7823;
    (d) SEQ ID NO: 7824;
    (e) SEQ ID NO: 7825;
    (f) SEQ ID NO: 7826;
    (g) SEQ ID NO: 7827;
    (h) SEQ ID NO: 7828;
    (i) SEQ ID NO: 7829;
    (j) SEQ ID NO: 7830; 또는
    (k) SEQ ID NO: 7831
    을 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는 것인, 조성물.
  92. 제88항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 gRNA 분자 및 Cas9 분자는 리보핵산 단백질 복합체(RNP)로 존재하는 것인, 조성물.
  93. 제87항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 gRNA 분자; 제2 gRNA 분자 및 제3 gRNA 분자; 또는 제2 gRNA 분자, 선택적으로 제3 gRNA 분자, 및 선택적으로 제4 gRNA 분자를 추가로 포함하며, 여기서 제2 gRNA 분자, 선택적인 제3 gRNA 분자, 및 선택적인 제4 gRNA 분자는 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 gRNA 분자이고, 조성물의 각각의 gRNA 분자는 상이한 표적 서열에 상보적인 것인, 조성물.
  94. 제93항에 있어서, 제1 gRNA 분자, 제2 gRNA 분자, 선택적인 제3 gRNA 분자, 및 선택적인 제4 gRNA 분자 중 둘 이상은 동일한 유전자 또는 영역 내의 표적 서열에 상보적인 것인, 조성물.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, 제1 gRNA 분자, 제2 gRNA 분자, 선택적인 제3 gRNA 분자, 및 선택적인 제4 gRNA 분자는 20000개 이하의 뉴클레오티드, 10000개 이하의 뉴클레오티드, 6000개 이하의 뉴클레오티드, 5000개 이하의 뉴클레오티드, 4000개 이하의 뉴클레오티드, 1000개 이하의 뉴클레오티드, 500개 이하의 뉴클레오티드, 400개 이하의 뉴클레오티드, 300개 이하의 뉴클레오티드, 200개 이하의 뉴클레오티드, 100개 이하의 뉴클레오티드, 90개 이하의 뉴클레오티드, 80개 이하의 뉴클레오티드, 70개 이하의 뉴클레오티드, 60개 이하의 뉴클레오티드, 50개 이하의 뉴클레오티드, 40개 이하의 뉴클레오티드, 30개 이하의 뉴클레오티드, 20개 이하의 뉴클레오티드 또는 10개 이하의 뉴클레오티드만큼 떨어진 표적 서열에 상보적인 것인, 조성물.
  96. 제93항에 있어서, 제1 gRNA 분자, 제2 gRNA 분자, 선택적인 제3 gRNA 분자, 및 선택적인 제4 gRNA 분자 중 둘 이상은 상이한 유전자 또는 영역 내의 표적 서열에 상보적인 것인, 조성물.
  97. 제94항 또는 제95항에 있어서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하며, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는:
    (a) 제4항의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
    (b) 제5항의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
    (c) 제6항의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
    (d) 제7항의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
    (e) 제41항 내지 제56항 중 어느 한 항의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적인 것인, 조성물.
  98. 제94항 또는 제95항에 있어서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하며, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는:
    (a) 제10항의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
    (b) 제11항의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적인 것인, 조성물.
  99. 제94항 또는 제95항에 있어서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하며, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는:
    (a) 제13항의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
    (b) 제14항의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적인 것인, 조성물.
  100. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하며, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는:
    (a) 제16항의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
    (b) 제17항의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
    (c) 제18항의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적이거나;
    (d) 제57항 내지 제68항 중 어느 한 항의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되며, 상이한 표적 서열에 상보적인 것인, 조성물.
  101. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하며:
    (1) 제1 gRNA 분자는 (a) 제4항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) 제5항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) 제6항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) 제7항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (e) 제41항 내지 제56항 중 어느 한 항의 gRNA 분자들로부터 선택되고;
    (2) 제2 gRNA 분자는 (a) 제10항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) 제11항의 gRNA 분자들로부터 선택되는 것인, 조성물.
  102. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하며:
    (1) 제1 gRNA 분자는 (a) 제4항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) 제5항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) 제6항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) 제7항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (e) 제41항 내지 제56항 중 어느 한 항의 gRNA 분자들로부터 선택되고;
    (2) 제2 gRNA 분자는 (a) 제13항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) 제14항의 gRNA 분자들로부터 선택되는 것인, 조성물.
  103. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하며:
    (1) 제1 gRNA 분자는 (a) 제4항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) 제5항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) 제6항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) 제7항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (e) 제41항 내지 제56항 중 어느 한 항의 gRNA 분자들로부터 선택되고;
    (2) 제2 gRNA 분자는 (a) 제16항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) 제17항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) 제18항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) 제57항 내지 제68항 중 어느 한 항의 gRNA 분자들로부터 선택되는 것인, 조성물.
  104. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하며:
    (1) 제1 gRNA 분자는 (a) 제10항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) 제11항의 gRNA 분자들로부터 선택되고;
    (2) 제2 gRNA 분자는 (a) 제13항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) 제14항의 gRNA 분자들로부터 선택되는 것인, 조성물.
  105. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하며:
    (1) 제1 gRNA 분자는 (a) 제10항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) 제11항의 gRNA 분자들로부터 선택되고;
    (2) 제2 gRNA 분자는 (a) 제16항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) 제17항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) 제18항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) 제57항 내지 제68항 중 어느 한 항의 gRNA 분자들로부터 선택되는 것인, 조성물.
  106. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하며:
    (1) 제1 gRNA 분자는 (a) 제13항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) 제14항의 gRNA 분자들로부터 선택되고;
    (2) 제2 gRNA 분자는 (a) 제16항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) 제17항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) 제18항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) 제57항 내지 제68항 중 어느 한 항의 gRNA 분자들로부터 선택되는 것인, 조성물.
  107. 제96항에 있어서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하며:
    (1) 제1 gRNA 분자는 (a) 제16항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) 제17항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) 제18항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) 제57항 내지 제68항 중 어느 한 항의 gRNA 분자들로부터 선택되고; (2) 제2 gRNA 분자는 베타 글로빈 유전자의 표적 서열에 상보적인 표적화 도메인을 포함하거나;
    (2) 제1 gRNA 분자는 (a) 제4항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (b) 제5항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (c) 제6항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (d) 제7항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (e) 제41항 내지 제56항 중 어느 한 항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (f) 제10항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (g) 제11항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (h) 제13항의 gRNA 분자들로부터 선택되거나, (i) 제14항의 gRNA 분자들로부터 선택되고; (2) 제2 gRNA 분자는 베타 글로빈 유전자의 표적 서열에 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 것인, 조성물.
  108. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 제41항 내지 제68항 중 어느 한 항의 gRNA 분자들로부터 독립적으로 선택되는 것인, 조성물.
  109. 제87항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 gRNA 분자 성분에 관하여 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자로 구성되는, 조성물.
  110. 제87항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA 분자 각각은 본원에 기재된 Cas9 분자, 예를 들어 제90항 또는 제91항의 Cas9 분자와의 리보핵산 단백질 복합체(RNP)로 존재하는 것인, 조성물.
  111. 제87항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 핵산을 포함하며, 주형 핵산은 제1 gRNA 분자의 표적 서열의 또는 그 근처의 뉴클레오티드에 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 조성물.
  112. 제111항에 있어서, 주형 핵산은:
    (a) 인간 베타 글로빈, 예를 들어 돌연변이 G16D, E22A 및 T87Q 중 하나 이상을 포함하는 인간 베타 글로빈, 또는 이의 단편; 또는
    (b) 인간 감마 글로빈, 또는 이의 단편
    을 인코딩하는 핵산을 포함하는 것인, 조성물.
  113. 제87항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 전기천공에 적합한 매질 중에 제형화되는, 조성물.
  114. 제87항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA 분자 각각은 본원에 기재된 Cas9 분자와의 RNP로 존재하며, 상기 RNP 각각은 약 10 uM 미만, 예를 들어 약 3 uM 미만, 예를 들어 약 1 uM 미만, 예를 들어 약 0.5 uM 미만, 예를 들어 약 0.3 uM 미만, 예를 들어 약 0.1 uM 미만의 농도로 존재하는 것인, 조성물.
  115. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 하나 이상의 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산 서열.
  116. 제115항에 있어서, 핵산은 하나 이상의 gRNA 분자를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것인, 핵산 서열.
  117. 제116항에 있어서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 II 또는 RNA 폴리머라제 III에 의해 인식되는 프로모터인, 핵산 서열.
  118. 제117항에 있어서, 프로모터는 U6 프로모터 또는 HI 프로모터인, 핵산 서열.
  119. 제115항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 Cas9 분자를 추가로 인코딩하는 것인, 핵산 서열.
  120. 제119항에 있어서, Cas9 분자는 SEQ ID NO: 6611, SEQ ID NO: 7821, SEQ ID NO: 7822, SEQ ID NO: 7823, SEQ ID NO: 7824, SEQ ID NO: 7825, SEQ ID NO: 7826, SEQ ID NO: 7827, SEQ ID NO: 7828, SEQ ID NO: 7829, SEQ ID NO: 7830, 또는 SEQ ID NO: 7831 중 임의의 것을 포함하는 것인, 핵산 서열.
  121. 제119항 또는 제120항에 있어서, 상기 핵산은 Cas9 분자를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것인, 핵산 서열.
  122. 제121항에 있어서, 프로모터는 EF-1 프로모터, CMV IE 유전자 프로모터, EF-1α 프로모터, 유비퀴틴 C프로모터, 또는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터인, 핵산 서열.
  123. 제115항 내지 제122항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  124. 제123항에 있어서, 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터, 플라스미드, 미니 서클, 나노 플라스미드 및 RNA 벡터로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 벡터.
  125. 1) 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 하나 이상의 gRNA 분자, 및 Cas9 분자;
    2) 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 하나 이상의 gRNA 분자, 및 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산;
    3) 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 하나 이상의 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자;
    4) 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 하나 이상의 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산;
    5) 상기 1) 내지 4) 중 임의의 것, 및 주형 핵산;
    6) 상기 1) 내지 4) 중 임의의 것, 및 주형 핵산을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산;
    7) 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 조성물; 또는
    8) 제123항 또는 제124항의 벡터
    와 세포(예를 들어 세포 집단)를 접촉시키는(예를 들어 그 내로 도입시키는) 것을 포함하는, 세포(예를 들어 세포 집단)를 상기 세포 내 표적 서열에서 또는 그 근처에서 변경하는(예를 들어 핵산의 구조(예를 들어 서열)를 변경하는) 방법.
  126. 제125항에 있어서, gRNA 분자 또는 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자 또는 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산은 단일 조성물 내에 제형화된 것인, 방법.
  127. 제125항에 있어서, gRNA 분자 또는 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산, 및 Cas9 분자 또는 Cas9 분자를 인코딩하는 핵산은 하나 초과의 조성물 내에 제형화된 것인, 방법.
  128. 제127항에 있어서, 하나 초과의 조성물은 동시에 또는 순차적으로 전달되는 것인, 방법.
  129. 제125항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 동물 세포인, 방법.
  130. 제125항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 포유동물, 영장류 또는 인간 세포인, 방법.
  131. 제130항에 있어서, 세포는 조혈 줄기 또는 전구 세포(HSPC)(예를 들어 HSPC의 집단)인, 방법.
  132. 제125항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 CD34+ 세포인, 방법.
  133. 제125항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 CD34+CD90+ 세포인, 방법.
  134. 제125항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 CD34+ 세포에 대해 풍부화된 세포 집단을 포함하는 조성물 내에 배치되는 것인, 방법.
  135. 제125항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 세포(예를 들어 세포 집단)는 골수, 동원된 말초 혈액 또는 제대혈로부터 분리된 것인, 방법.
  136. 제125항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 상기 세포를 투여할 환자에 대해 자가 유래 또는 동종이계인, 방법.
  137. 제125항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 변경은 하나 이상의 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 게놈 DNA 서열에 또는 그 근처에 삽입결실을 야기하는 것인, 방법.
  138. 제137항에 있어서, 삽입결실은 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37에 나타난 삽입결실인, 방법.
  139. 제137항 또는 제138항에 있어서, 삽입결실은 약 40개 미만의 뉴클레오티드, 예를 들어 30개 미만의 뉴클레오티드, 예를 들어 20개 미만의 뉴클레오티드, 예를 들어 10개 미만의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인, 방법.
  140. 제139항에 있어서, 삽입결실은 단일 뉴클레오티드 결실인, 방법.
  141. 제137항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 집단 내 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 60%, 예를 들어 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 80%, 예를 들어 적어도 약 90%(예를 들어 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%)의 세포가 변경되는, 예를 들어 삽입결실을 포함하는, 세포 집단을 야기하는, 방법.
  142. 제125항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 변경은 적혈구계 계통의 분화된 세포(예를 들어 적혈구)로 분화할 수 있는 세포(예를 들어 세포 집단)를 야기하며, 상기 분화된 세포는, 예를 들어 변경되지 않은 세포(예를 들어 세포 집단)에 비해, 증가된 태아 헤모글로빈 수준을 나타내는 것인, 방법.
  143. 제125항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 변경은 분화된 세포 집단, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포 집단(예를 들어 적혈구 집단)으로 분화할 수 있는 세포 집단을 야기하며, 상기 분화된 세포 집단은, 예를 들어 변경되지 않은 세포 집단에 비해, F 세포의 비율이 증가된(예를 들어 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40% 더 높은) 것인, 방법.
  144. 제125항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 변경은 분화된 세포, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포(예를 들어 적혈구)로 분화할 수 있는 세포를 야기하며, 상기 분화된 세포는 세포 당 적어도 약 6 피코그램(예를 들어 적어도 약 7 피코그램, 적어도 약 8 피코그램, 적어도 약 9 피코그램, 적어도 약 10 피코그램, 또는 약 8 내지 약 9 피코그램, 또는 약 9 내지 약 10 피코그램)의 태아 헤모글로빈을 생산하는 것인, 방법.
  145. 제125항 내지 제144항 중 어느 한 항의 방법에 의해 변경된, 세포.
  146. 제125항 내지 제144항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득 가능한, 세포.
  147. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 제1 gRNA 분자, 또는 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 조성물, 제115항 내지 제122항 중 어느 한 항의 핵산, 또는 제123항 또는 제124항의 벡터를 포함하는, 세포.
  148. 제147항에 있어서, Cas9 분자를 포함하는, 세포.
  149. 제148항에 있어서, Cas9 분자는 SEQ ID NO: 6611, SEQ ID NO: 7821, SEQ ID NO: 7822, SEQ ID NO: 7823, SEQ ID NO: 7824, SEQ ID NO: 7825, SEQ ID NO: 7826, SEQ ID NO: 7827, SEQ ID NO: 7828, SEQ ID NO: 7829, SEQ ID NO: 7830 또는 SEQ ID NO: 7831 중 임의의 것을 포함하는 것인, 세포.
  150. 제145항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 제2 gRNA 분자, 또는 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 제2 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 포함하였거나, 포함할 것이며, 제1 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 동일하지 않은 표적화 도메인을 포함하는 것인, 세포.
  151. 제145항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 태아 헤모글로빈의 발현은 상기 세포 또는 그의 자손(예를 들어 그의 적혈구계 자손, 예를 들어 그의 적혈구 자손)에서, gRNA 분자를 포함하도록 변형되지 않은 동일한 세포 유형의 세포 또는 그의 자손에 비해 증가되는 것인, 세포.
  152. 제145항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 분화된 세포, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포(예를 들어 적혈구)로 분화할 수 있으며, 상기 분화된 세포는, 예를 들어 gRNA 분자를 포함하도록 변형되지 않은 동일한 세포 유형의 세포에 비해 증가된 수준의 태아 헤모글로빈을 나타내는 것인, 세포.
  153. 제152항에 있어서, 분화된 세포(예를 들어 적혈구계 계통의 세포, 예를 들어 적혈구)는, 예를 들어 gRNA 분자를 포함하도록 변형되지 않은 동일한 세포 유형의 세포에 비해, 적어도 약 6 피코그램(예를 들어 적어도 약 7 피코그램, 적어도 약 8 피코그램, 적어도 약 9 피코그램, 적어도 약 10 피코그램, 또는 약 8 내지 약 9 피코그램, 또는 약 9 내지 약 10 피코그램)의 태아 헤모글로빈을 생산하는 것인, 세포.
  154. 제145항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포 확장제와 접촉된, 세포.
  155. 제154항에 있어서, 줄기 세포 확장제는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 이의 조합(예를 들어 화합물 1 및 화합물 4)인, 세포.
  156. 제155항에 있어서, 줄기 세포 확장제는 화합물 4인, 세포.
  157. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 게놈 DNA 서열에 또는 그 근처에 삽입결실을 포함하는, 세포, 예를 들어 제145항 내지 제156항 중 어느 한 항의 세포.
  158. 제157항에 있어서, 삽입결실은 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37 상에 나타난 삽입결실인, 세포.
  159. 제157항 또는 제158항에 있어서, 삽입결실은 약 40개 미만의 뉴클레오티드, 예를 들어 30개 미만의 뉴클레오티드, 예를 들어 20개 미만의 뉴클레오티드, 예를 들어 10개 미만의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인, 세포.
  160. 제157항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입결실은 단일 뉴클레오티드 결실인, 세포.
  161. 제145항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 세포인, 세포.
  162. 제161항에 있어서, 포유동물, 영장류 또는 인간 세포인, 세포.
  163. 제145항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 또는 전구 세포(HSPC)(예를 들어 HSPC의 집단)인, 세포.
  164. 제145항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, CD34+ 세포인, 세포.
  165. 제164항에 있어서, CD34+CD90+ 세포인, 세포.
  166. 제145항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 세포(예를 들어 세포 집단)는 골수, 동원된 말초 혈액 또는 제대혈로부터 분리된 것인, 세포.
  167. 제145항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 상기 세포를 투여할 환자에 대해 자가 유래인, 세포.
  168. 제145항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 상기 세포를 투여할 환자에 대해 동종이계인, 세포.
  169. 제145항 내지 제168항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 세포 집단.
  170. 제169항에 있어서, 집단 내 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 60%, 예를 들어 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 80%, 예를 들어 적어도 약 90% (예를 들어 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%)의 세포가 제145항 내지 제168항 중 어느 한 항에 따른 세포인, 세포 집단.
  171. 제169항 또는 제170항에 있어서, 세포 집단은 분화된 세포 집단, 예를 들어 적혈구계 계통의 세포 집단(예를 들어 적혈구 집단)으로 분화할 수 있으며, 상기 분화된 세포 집단은, 예를 들어 동일한 유형의 변형되지 않은 세포 집단에 비해, F 세포의 비율이 증가된(예를 들어 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40% 더 높은) 것인, 세포 집단.
  172. 제171항에 있어서, 분화된 세포 집단 중 F 세포는 세포 당 평균 적어도 약 6 피코그램(예를 들어 적어도 약 7 피코그램, 적어도 약 8 피코그램, 적어도 약 9 피코그램, 적어도 약 10 피코그램, 또는 약 8 내지 약 9 피코그램, 또는 약 9 내지 약 10 피코그램)의 태아 헤모글로빈을 생산하는 것인, 세포 집단.
  173. 제169항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서,
    1) 세포가 투여될 환자의 체중 kg 당 적어도 1e6 CD34+ 세포;
    2) 세포가 투여될 환자의 체중 kg 당 적어도 2e6 CD34+ 세포;
    3) 세포가 투여될 환자의 체중 kg 당 적어도 3e6 CD34+ 세포;
    4) 세포가 투여될 환자의 체중 kg 당 적어도 4e6 CD34+ 세포; 또는
    5) 세포가 투여될 환자의 체중 kg 당 2e6 내지 10e6 CD34+ 세포
    를 포함하는, 세포 집단.
  174. 제169항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 집단 내 적어도 약 40%, 예를 들어 적어도 약 50%(예를 들어 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%)의 세포는 CD34+ 세포인, 세포 집단.
  175. 제174항에 있어서, 집단 내 적어도 약 10%, 예를 들어 적어도 약 15%, 예를 들어 적어도 약 20%, 예를 들어 적어도 약 30%의 세포는 CD34+CD90+ 세포인, 세포 집단.
  176. 제169항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 골수에서 유래된 것인, 세포 집단.
  177. 제169항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포를 포함하는, 예를 들어 이로 구성되는, 세포 집단.
  178. 제169항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 그것이 투여될 환자에 대해 자가 유래인, 세포 집단.
  179. 제169항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은 그것이 투여될 환자에 대해 동종이계인, 세포 집단.
  180. 제145항 내지 제168항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제169항 내지 제179항 중 어느 한 항의 세포 집단을 포함하는 조성물.
  181. 제180항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 매질, 예를 들어 동결 보존에 적합한 약학적으로 허용 가능한 매질을 포함하는, 조성물.
  182. 제145항 내지 제168항 중 어느 한 항의 세포, 제169항 내지 제179항 중 어느 한 항의 세포 집단, 또는 제180항 또는 제181항의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 혈색소병증을 치료하는 방법.
  183. 제145항 내지 제168항 중 어느 한 항의 세포, 제169항 내지 제179항 중 어느 한 항의 세포 집단, 또는 제180항 또는 제181항의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 태아 헤모글로빈 발현을 증가시키는 방법.
  184. 제182항에 있어서, 혈색소병증은 베타-탈라세미아 또는 겸상 적혈구 질병인, 방법.
  185. (a) 세포(예를 들어 세포 집단)(예를 들어 HSPC(예를 들어 HSPC 집단))를 제공하는 단계;
    (b) 줄기 세포 확장제를 포함하는 세포 배양 배지에서 생체외로 상기 세포(예를 들어 상기 세포 집단)를 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 세포 내로 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 제1 gRNA 분자, 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항의 제1 gRNA 분자를 인코딩하는 핵산 분자, 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 조성물, 제115항 내지 제122항 중 어느 한 항의 핵산, 또는 제123항 또는 제124항의 벡터를 도입시키는 단계
    를 포함하는, 세포(예를 들어 세포 집단)를 제조하는 방법.
  186. 제185항에 있어서, 상기 단계 (c)의 도입 후에, 상기 세포(예를 들어 세포 집단)는 분화된 세포(예를 들어 분화된 세포 집단), 예를 들어 적혈구계 계통의 세포(예를 들어 적혈구계 계통의 세포 집단), 예를 들어 적혈구(예를 들어 적혈구 집단)로 분화할 수 있으며, 상기 분화된 세포(예를 들어 분화된 세포 집단)는, 예를 들어 단계 (c)를 거치지 않은 동일 세포에 비해, 증가된 태아 헤모글로빈을 생산하는 것인, 방법.
  187. 제185항 또는 제186항에 있어서, 줄기 세포 확장제는 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 이의 조합(예를 들어 화합물 1 및 화합물 4)인, 방법.
  188. 제187항에 있어서, 줄기 세포 확장제는 화합물 4인, 방법.
  189. 제185항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지는 트롬보포이에틴(Tpo), Flt3 리간드(Flt-3L) 및 인간 줄기 세포 인자(SCF)를 포함하는 것인, 방법.
  190. 제189항에 있어서, 세포 배양 배지는 인간 인터루킨-6(IL-6)을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  191. 제189항 또는 제190항에 있어서, 세포 배양 배지는 각각 약 10 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL 범위의 농도로 트롬보포이에틴(Tpo), Flt3 리간드(Flt-3L) 및 인간 줄기 세포 인자(SCF)를 포함하는 것인, 방법.
  192. 제191항에 있어서, 세포 배양 배지는 각각 약 50 ng/mL의 농도, 예를 들어 50 ng/mL의 농도로 트롬보포이에틴(Tpo), Flt3 리간드(Flt-3L) 및 인간 줄기 세포 인자(SCF)를 포함하는, 방법.
  193. 제190항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지는 약 10 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL 범위의 농도로 인간 인터루킨-6(IL-6)을 포함하는 것인, 방법.
  194. 제193항에 있어서, 세포 배양 배지는 약 50 ng/mL의 농도, 예를 들어 50 ng/mL의 농도로 인간 인터루킨-6(IL-6)을 포함하는 것인, 방법.
  195. 제185항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지는 약 1 nM 내지 약 1 mM 범위의 농도로 줄기 세포 확장제를 포함하는 것인, 방법.
  196. 제195항에 있어서, 세포 배양 배지는 약 1 uM 내지 약 100 uM 범위의 농도로 줄기 세포 확장제를 포함하는 것인, 방법.
  197. 제196항에 있어서, 세포 배양 배지는 약 50 uM 내지 약 75 uM 범위의 농도로 줄기 세포 확장제를 포함하는 것인, 방법.
  198. 제197항에 있어서, 세포 배양 배지는 약 50 uM의 농도, 예를 들어 50 uM의 농도로 줄기 세포 확장제를 포함하는 것인, 방법.
  199. 제197항에 있어서, 세포 배양 배지는 약 75 uM의 농도, 예를 들어 75 uM의 농도로 줄기 세포 확장제를 포함하는 것인, 방법.
  200. 제185항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 배양은 단계 (c)의 도입 전 배양 기간을 포함하는 것인, 방법.
  201. 제200항에 있어서, 단계 (c)의 도입 전 배양 기간은 적어도 12시간, 예를 들어 약 1일 내지 약 3일의 기간, 예를 들어 약 1일 내지 약 2일의 기간, 예를 들어 약 2일의 기간인, 방법.
  202. 제185항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 배양은 단계 (c)의 도입 후 배양 기간을 포함하는 것인, 방법.
  203. 제202항에 있어서, 단계 (c)의 도입 후 배양 기간은 적어도 12시간, 예를 들어 약 1일 내지 약 10일의 기간, 예를 들어 약 1일 내지 약 5일의 기간, 예를 들어 약 2일 내지 약 4일의 기간, 예를 들어 약 2일의 기간 또는 약 3일의 기간 또는 약 4일의 기간인, 방법.
  204. 제185항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단은, 예를 들어 단계 (b)에 따라서 배양되지 않은 세포들에 비해, 적어도 4배, 예를 들어 적어도 5 배, 예를 들어 적어도 10 배 확장되는 것인, 방법.
  205. 제185항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 도입은 전기천공을 포함하는 것인, 방법.
  206. 제205항에 있어서, 전기천공은 1 내지 5 펄스, 예를 들어 1 펄스를 포함하며, 각 펄스는 700 볼트 내지 2000 볼트 범위의 펄스 전압을 가지며, 10 ms 내지 100 ms 범위의 펄스 지속 기간을 갖는 것인, 방법.
  207. 제206항에 있어서, 전기천공은 1 펄스를 포함하는 것인, 방법.
  208. 제206항 또는 제207항에 있어서, 펄스 전압은 1500 내지 1900 볼트의 범위, 예를 들어 1700 볼트인, 방법.
  209. 제206항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 펄스 지속 기간은 10 ms 내지 40 ms의 범위, 예를 들어 20 ms인, 방법.
  210. 제185항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에 제공된 세포(예를 들어 세포 집단)는 인간 세포(예를 들어 인간 세포 집단)인, 방법.
  211. 제210항에 있어서, 단계 (a)에 제공된 세포(예를 들어 세포 집단)는 골수, 말초 혈액(예를 들어 동원된 말초 혈액) 또는 제대혈로부터 단리되는 것인, 방법.
  212. 제211항에 있어서, 단계 (a)에 제공된 세포(예를 들어 세포 집단)는 골수로부터 단리되고, 예를 들어 혈색소병증을 앓고 있는 환자의 골수로부터 단리되는 것인, 방법.
  213. 제185항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에 제공된 세포 집단은 CD34+ 세포에 대해 풍부화되는 것인, 방법.
  214. 제185항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 도입 후에 세포(예를 들어 세포 집단)는 동결 보존되는 것인, 방법.
  215. 제185항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 도입 후에 세포(예를 들어 세포 집단)는 제1 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 게놈 DNA 서열에 또는 그 근처에 삽입결실을 포함하는 것인, 방법.
  216. 제132항에 있어서, 삽입결실은 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37 상에 나타난 삽입결실인, 방법.
  217. 제185항 내지 제216항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 도입 후, 세포 집단 내 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 세포가 제1 gRNA 분자의 표적화 도메인에 상보적인 게놈 DNA 서열에 또는 그 근처에 삽입결실을 포함하는 것인, 방법.
  218. 제217항에 있어서, 세포 집단 내 상기 세포 각각에서의 삽입결실은 도 25, 표 15, 표 26, 표 27 또는 표 37에 나타난 삽입결실인, 방법.
  219. 제185항 내지 제218항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득 가능한, 세포(예를 들어 세포 집단).
  220. 제219항의 세포(예를 들어 세포 집단)를 포함하는 조성물을 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 혈색소병증을 치료하는 방법.
  221. 제219항의 세포(예를 들어 세포 집단)를 포함하는 조성물을 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 태아 헤모글로빈 발현을 증가시키는 방법.
  222. 제220항에 있어서, 혈색소병증은 베타-탈라세미아 또는 겸상 적혈구 질병인, 방법.
  223. 제220항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 환자에게 인간 환자의 체중 kg 당 적어도 약 1e6의 제219항의 세포, 예를 들어 인간 환자의 체중 kg 당 적어도 약 1e6의 제219항의 CD34+ 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  224. 제223항에 있어서, 인간 환자에게 인간 환자의 체중 kg 당 적어도 약 2e6의 제219항의 세포, 예를 들어 인간 환자의 체중 kg 당 적어도 약 2e6의 제219항의 CD34+ 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  225. 제223항에 있어서, 인간 환자에게 인간 환자의 체중 kg 당 약 2e6 내지 약 10e6의 제219항의 세포, 예를 들어 인간 환자의 체중 kg 당 적어도 약 2e6 내지 약 10e6의 제219항의 CD34+ 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  226. 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 gRNA 분자, 제87항 내지 제114항 또는 제180항 또는 제181항 중 어느 한 항의 조성물, 제115항 내지 제122항 중 어느 한 항의 핵산, 제123항 또는 제124항의 벡터, 제145항 내지 제168항 또는 제219항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제169항 내지 제179항 중 어느 한 항의 세포 집단.
  227. 약제의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 gRNA 분자, 제87항 내지 제114항 또는 제180항 또는 제181항 중 어느 한 항의 조성물, 제115항 내지 제122항 중 어느 한 항의 핵산, 제123항 또는 제124항의 벡터, 제145항 내지 제168항 또는 제219항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제169항 내지 제179항 중 어느 한 항의 세포 집단.
  228. 질병의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 gRNA 분자, 제87항 내지 제114항 또는 제180항 또는 제181항 중 어느 한 항의 조성물, 제115항 내지 제122항 중 어느 한 항의 핵산, 제123항 또는 제124항의 벡터, 제145항 내지 제168항 또는 제219항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제169항 내지 제179항 중 어느 한 항의 세포 집단.
  229. 질병의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 gRNA 분자, 제87항 내지 제114항 또는 제180항 또는 제181항 중 어느 한 항의 조성물, 제115항 내지 제122항 중 어느 한 항의 핵산, 제123항 또는 제124항의 벡터, 제145항 내지 제168항 또는 제219항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제169항 내지 제179항 중 어느 한 항의 세포 집단으로서, 질병은 혈색소병증인, gRNA 분자, 조성물, 핵산, 벡터, 세포, 또는 세포 집단.
  230. 질병의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항의 gRNA 분자, 제87항 내지 제114항 또는 제180항 또는 제181항 중 어느 한 항의 조성물, 제115항 내지 제122항 중 어느 한 항의 핵산, 제123항 또는 제124항의 벡터, 제145항 내지 제168항 또는 제219항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제169항 내지 제179항 중 어느 한 항의 세포 집단으로서, 혈색소병증은 베타-탈라세미아 또는 겸상 적혈구 질병인, gRNA 분자, 조성물, 핵산, 벡터, 세포, 또는 세포 집단.
KR1020187021444A 2015-12-28 2016-12-26 혈색소병증의 치료를 위한 조성물 및 방법 KR20180103923A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562271968P 2015-12-28 2015-12-28
US62/271,968 2015-12-28
US201662347484P 2016-06-08 2016-06-08
US62/347,484 2016-06-08
PCT/IB2016/058007 WO2017115268A1 (en) 2015-12-28 2016-12-26 Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180103923A true KR20180103923A (ko) 2018-09-19

Family

ID=57822008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187021444A KR20180103923A (ko) 2015-12-28 2016-12-26 혈색소병증의 치료를 위한 조성물 및 방법

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20190010495A1 (ko)
EP (2) EP4053277A1 (ko)
JP (3) JP2019500043A (ko)
KR (1) KR20180103923A (ko)
CN (1) CN108779462A (ko)
AU (3) AU2016381313B2 (ko)
BR (1) BR112018013065A2 (ko)
CA (1) CA3009727A1 (ko)
EA (1) EA201891532A1 (ko)
HK (1) HK1258205A1 (ko)
IL (2) IL260257B2 (ko)
MX (2) MX2018007987A (ko)
MY (1) MY192848A (ko)
PH (1) PH12018501378A1 (ko)
SG (1) SG11201805217XA (ko)
WO (1) WO2017115268A1 (ko)

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US9725710B2 (en) 2014-01-08 2017-08-08 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
BR112017017812A2 (pt) 2015-02-23 2018-04-10 Crispr Therapeutics Ag materiais e métodos para tratamento de hemoglobinopatias
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
WO2016182917A1 (en) * 2015-05-08 2016-11-17 Children's Medical Center Corporation Targeting bcl11a enhancer functional regions for fetal hemoglobin reinduction
CA2986310A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
KR20170141217A (ko) 2015-05-12 2017-12-22 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 유전자 발현의 뉴클레아제-매개된 조절
AU2016276702B2 (en) 2015-06-09 2022-07-28 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for improving transplantation
JP7109784B2 (ja) 2015-10-23 2022-08-01 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝子編集のための進化したＣａｓ９蛋白質
US12043843B2 (en) 2015-11-04 2024-07-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
CN110214183A (zh) 2016-08-03 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 腺苷核碱基编辑器及其用途
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
EP3519577A1 (en) 2016-09-28 2019-08-07 Novartis AG Porous membrane-based macromolecule delivery system
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
WO2018170184A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
US20210222201A1 (en) * 2017-04-24 2021-07-22 Seattie Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Homology directed repair compositions for the treatment of hemoglobinopathies
WO2018209158A2 (en) * 2017-05-10 2018-11-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
WO2018218135A1 (en) * 2017-05-25 2018-11-29 The Children's Medical Center Corporation Bcl11a guide delivery
US20200140896A1 (en) 2017-06-30 2020-05-07 Novartis Ag Methods for the treatment of disease with gene editing systems
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
EP3658573A1 (en) 2017-07-28 2020-06-03 President and Fellows of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace)
EP3676376A2 (en) 2017-08-30 2020-07-08 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
AU2018338967A1 (en) 2017-09-29 2020-05-07 Intellia Therapeutics, Inc. In vitro method of mRNA delivery using lipid nanoparticles
CN109706148A (zh) * 2017-09-30 2019-05-03 广东赤萌医疗科技有限公司 一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的gRNA、gRNA组合物以及电转方法
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
EP3701029A1 (en) * 2017-10-26 2020-09-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
CN109722414A (zh) * 2017-10-27 2019-05-07 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种高效制备成熟红细胞的方法以及用于制备成熟红细胞的培养基
WO2019087113A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Novartis Ag Synthetic rnas and methods of use
CN111742049A (zh) * 2017-11-16 2020-10-02 财团法人牧岩生命科学研究所 转化的人细胞及其用途
WO2019106522A1 (en) * 2017-11-28 2019-06-06 Novartis Ag Pooled crispr/cas9 screening in primary cells using guide swap technology
EP3720473A1 (en) * 2017-12-05 2020-10-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Crispr-cas9 modified cd34+ human hematopoietic stem and progenitor cells and uses thereof
AU2018385759B2 (en) 2017-12-14 2021-10-21 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic transducer driver and controller
JP2021510150A (ja) * 2018-01-03 2021-04-15 マジェンタ セラピューティクス インコーポレイテッドＭａｇｅｎｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． 造血幹細胞および前駆細胞の増幅ならびに遺伝性代謝障害の処置のための組成物および方法
WO2019147302A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 Bauer Daniel E Targeting bcl11a distal regulatory elements with a cas9-cas9 fusion for fetal hemoglobin reinduction
MA51787A (fr) * 2018-02-05 2020-12-16 Vertex Pharma Substances et méthodes de traitement d'hémoglobinopathies
US11268077B2 (en) 2018-02-05 2022-03-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
AU2019236209A1 (en) 2018-03-14 2020-10-01 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
US20210115420A1 (en) * 2018-05-01 2021-04-22 The Children's Medical Center Corporation Enhanced bcl11a rnp / crispr delivery & editing using a 3xnls-cas9
CN112105732A (zh) * 2018-05-10 2020-12-18 先正达参股股份有限公司 用于多核苷酸的靶向编辑的方法和组合物
WO2019222545A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Synthego Corporation Methods and systems for guide rna design and use
SG11202102737XA (en) * 2018-09-21 2021-04-29 Apstem Therapeutics Inc Human pluripotent adult stem cells
US20220047637A1 (en) * 2018-11-29 2022-02-17 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2020191241A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
CR20210591A (es) * 2019-04-30 2022-03-11 Edigene Inc Método para la predicción de eficacia del tratamiento de hemoglobinopatía
CN111939271A (zh) * 2019-04-30 2020-11-17 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种血红蛋白病治疗有效性预测方法
WO2021037232A1 (zh) * 2019-08-28 2021-03-04 甘李药业股份有限公司 编辑造血干/祖细胞中bcl11a基因的方法
CA3177481A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 David R. Liu Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
CN114149990A (zh) * 2020-09-08 2022-03-08 甘李药业股份有限公司 编辑造血干/祖细胞中bcl11a基因的方法
WO2022240787A1 (en) * 2021-05-13 2022-11-17 The Children's Medical Center Corporation Methods for stratifying subjects for fetal hemoglobin reinduction
CN113584167B (zh) * 2021-07-07 2023-10-03 武汉大学中南医院 一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试剂盒
EP4273242A1 (en) * 2022-05-03 2023-11-08 ETH Zurich Crispr-based modification of human hbd gene
WO2024025908A2 (en) * 2022-07-25 2024-02-01 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for genome editing

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060019912A1 (en) 2003-12-19 2006-01-26 Chiron Corporation Cell transfecting formulations of small interfering RNA related compositions and methods of making and use
PE20100362A1 (es) * 2008-10-30 2010-05-27 Irm Llc Derivados de purina que expanden las celulas madre hematopoyeticas
CN102905763B (zh) 2009-12-23 2015-06-17 诺华股份有限公司 脂质、脂质组合物和使用它们的方法
WO2012006378A1 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Novartis Ag Liposomes with lipids having an advantageous pka- value for rna delivery
TR201908635T4 (tr) 2010-08-31 2019-07-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Protein kodlayıcı rna?nın lipozomal verilmesine uygun lipitler.
EP4115876A1 (en) 2011-07-06 2023-01-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
JP6219832B2 (ja) 2011-10-17 2017-10-25 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 細胞内送達
US9394547B2 (en) 2012-01-03 2016-07-19 City University Of Hong Kong Method and apparatus for delivery of molecules to cells
WO2013103467A1 (en) 2012-01-06 2013-07-11 Alcon Research, Ltd. Interfering rna delivery system and uses thereof
ES2733946T3 (es) * 2012-01-27 2019-12-03 Univ Montreal Derivados de pirimido[4,5-b]indol y su uso en la expansión de células madre hematopoyéticas
KR101833589B1 (ko) * 2012-02-24 2018-03-02 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 이상혈색소증 치료를 위한 조성물 및 방법
EP2925864B1 (en) * 2012-11-27 2018-10-31 The Children's Medical Center Corporation Targeting bcl11a distal regulatory elements for fetal hemoglobin reinduction
US8697359B1 (en) * 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
JP6352950B2 (ja) 2013-03-08 2018-07-04 ノバルティス アーゲー 活性薬物の送達のための脂質と脂質組成物
EP3865586A1 (en) * 2013-03-15 2021-08-18 The General Hospital Corporation Increasing specificity for rna-guided genome editing
CA2906281A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rna purification methods
CN116083487A (zh) * 2013-05-15 2023-05-09 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
WO2014204725A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
AU2014306423B2 (en) 2013-08-16 2019-04-18 Massachusetts Institute Of Technology Selective delivery of material to cells
EP3960856A1 (en) * 2013-11-13 2022-03-02 Children's Medical Center Corporation Nuclease-mediated regulation of gene expression
US10557151B2 (en) * 2013-11-28 2020-02-11 Horizon Discovery Limited Somatic human cell line mutations
PT3083556T (pt) 2013-12-19 2020-03-05 Novartis Ag Lípidos e composições lipídicas para a entrega de agentes ativos
US10426737B2 (en) 2013-12-19 2019-10-01 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
WO2015148860A1 (en) * 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta-thalassemia
EP3981876A1 (en) * 2014-03-26 2022-04-13 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
JP6695795B2 (ja) * 2014-03-31 2020-05-20 株式会社サイエンス・ラスター 造血細胞の増殖ペプチドおよびその用途
WO2015158860A1 (de) * 2014-04-16 2015-10-22 Sika Technology Ag Schnell härtende migrationsfreie zusammensetzung auf basis von silangruppen-haltigen polymeren
MX2016013832A (es) * 2014-04-25 2017-03-09 Children´S Medical Center Corp Composiciones y metodos para tratar hemoglobinopatias.
CN104480144B (zh) * 2014-12-12 2017-04-12 武汉大学 用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒
WO2016182917A1 (en) * 2015-05-08 2016-11-17 Children's Medical Center Corporation Targeting bcl11a enhancer functional regions for fetal hemoglobin reinduction
CN109706148A (zh) * 2017-09-30 2019-05-03 广东赤萌医疗科技有限公司 一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的gRNA、gRNA组合物以及电转方法
CN109722414A (zh) * 2017-10-27 2019-05-07 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种高效制备成熟红细胞的方法以及用于制备成熟红细胞的培养基
AU2019236209A1 (en) * 2018-03-14 2020-10-01 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies

Also Published As

Publication number Publication date
MY192848A (en) 2022-09-12
IL260257B1 (en) 2024-01-01
IL308706A (en) 2024-01-01
AU2020223733A1 (en) 2020-09-17
AU2022202558A1 (en) 2022-05-12
CN108779462A (zh) 2018-11-09
AU2016381313A1 (en) 2018-07-12
MX2018007987A (es) 2019-01-10
SG11201805217XA (en) 2018-07-30
AU2020223733B2 (en) 2022-01-27
PH12018501378A1 (en) 2019-04-08
IL260257A (en) 2018-07-31
HK1258205A1 (zh) 2019-11-08
AU2016381313B2 (en) 2020-11-26
RU2018127636A3 (ko) 2020-10-23
US20240002843A1 (en) 2024-01-04
JP2023159185A (ja) 2023-10-31
EP3397767A1 (en) 2018-11-07
US20190010495A1 (en) 2019-01-10
IL260257B2 (en) 2024-05-01
JP2019500043A (ja) 2019-01-10
MX2022009148A (es) 2022-08-16
RU2018127636A (ru) 2020-02-03
JP2021166514A (ja) 2021-10-21
EA201891532A1 (ru) 2019-01-31
CA3009727A1 (en) 2017-07-06
WO2017115268A1 (en) 2017-07-06
BR112018013065A2 (pt) 2018-12-11
EP4053277A1 (en) 2022-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020223733B2 (en) Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
KR102630217B1 (ko) 혈색소병증의 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2020150534A9 (en) Modified immune cells having enhanced anti-neoplasia activity and immunosuppression resistance
WO2023023515A1 (en) Persistent allogeneic modified immune cells and methods of use thereof
US20240016934A1 (en) Compositions and Methods for Reducing MHC Class II in a Cell
RU2812491C2 (ru) Композиции и способы лечения гемоглобинопатий
CN110546262B (zh) 用于治疗血红蛋白病的组合物和方法
WO2024006772A2 (en) Adenosine deaminase base editors and methods for use thereof
WO2023108107A2 (en) Modified immune cells and methods of using the same
WO2022109275A2 (en) Vectors, systems and methods for eukaryotic gene editing

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal