KR20170141217A - 유전자 발현의 뉴클레아제-매개된 조절 - Google Patents

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상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 유전자 가공 분야, 특히 조혈 세포의 게놈의 표적화된 변형에 관한 것이다.

Description

유전자 발현의 뉴클레아제-매개된 조절
관련 출원에 대한 교차 -참고
본원은 2015년 5월 12일자로 출원된 미국 가특허원 제62/160,396호, 및 2016년 3월 4일자로 출원된 미국 가특허원 제62/303,595호의 이익을 청구하며, 이의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 게놈 가공 분야, 특히 조혈 세포의 게놈의 표적화된 변형의 분야이다.
게놈 서열분석 노력은, 사람 게놈이 20,000 내지 25,000개의 게놈을 함유하지만, 2000개보다 더 적은 전사 조절인자를 함유함을 나타내었음을 고려하는 경우, 다수의 인자들이 모든 이의 다양한 일시적이고 발달된 조직 특이적인 표현(manifestation)에서 유전자 발현을 조절하기 위해 상호작용하여야만 하는 것이 명백하다. 유전자의 발현은 일반적인 및 특이한 전사 조절인자의 고도로 복잡한 혼합물에 의해 조절되며 발현은 또한 시스-작용성(cis-acting) DNA 요소에 의해 조절될 수 있다. 이들 DNA 요소는 코어 프로모터(core promoter) 및 이의 관련된 전사 인자 결합 부위와 같은 국소 DNA 요소 및 또한 인핸서(enhancer), 사일런서(silencer), 인슐레이터(insulator) 및 국소 조절 영역(LCR)과 같은 원위 요소(distal element) 둘 다를 포함한다(참고: Matson et al (2006) Ann Rev Genome Hum Genet 7: 29-50).
인핸서 요소는 SV40 바이러스 게놈에서 처음 확인된 후, 사람 면역글로불린 중쇄 유전자자리(heavy chain locus)에서 발견되었다. 현재는 많은 유전자의 발현에 있어 조절 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 인핸서는 유전자 발현의 일시적이고 공간적인 패턴에 주로 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 또한, 인핸서는 유전자의 코어 프로모터로부터의 거리에 의존하지 않으며, 각각의 프로모터와 어떠한 특이적인 서열 배향에 의존하지 않는다. 인핸서는 코어 프로모터 영역의 수백 킬로염기(kilobase)의 상부 또는 하부에 위치할 수 있으며, 여기서 이들은 인트론 서열(intron sequence), 또는 심지어 유전자의 3' 말단 이상에 위치할 수 있다.
게놈 DNA의 표적화된 절단을 위한 다양한 방법 및 조성물이 기술되어 왔다. 이러한 표적화된 절단 현상은 예를 들면, 표적화된 돌연변이유발(mutagenesis)을 유도하고, 세포 DNA 서열의 표적화된 결실을 유도하며, 예정된 염색체 유전자자리에서 표적화된 조합을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 9,255,250; 9,200,266; 9,045,763; 9,005,973; 9,150,847; 8,956,828; 8,945,868; 8,703,489; 8,586,526; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,067,317; 7,262,054; 7,888,121; 7,972,854; 7,914,796; 7,951,925; 8,110,379; 8,409,861; 미국 특허 공보 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983; 20130196373; 20150056705 및 20150335708을 참고하며, 이의 개시내용은 이의 전문이 참고로 포함된다.
이들 방법은 흔히 표적 DNA 서열 내에서 이본쇄 브레이크(double strand break: DSB) 또는 닉(nick)을 유도함으로써 비-상동성 말단 결합(NHEJ) 또는 보수 주형(repair template(상동성 지시된 보수 또는 HDR)과 같은 오류 태생 공정(error born process)에 의한 브레이크의 보수가 유전자의 녹 아웃(knock out) 또는 목적한 서열의 삽입(표적화된 통합)을 생성할 수 있는 가공된 절단 시스템의 사용을 포함한다. 이러한 기술은 또한 게놈 영역의 특이적인 결실, 또는 특이적인 점 돌연변이 또는 국재화된 변경(또한 유전자 교정으로 공지됨)의 도입을 포함하는, 공여체 올리고뉴클레오타이드의 사용을 통해 게놈 서열내 부위 특이적인 변화를 도입할 수 있다. 절단은 가공된 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사-활성화제 유사 효과인자 뉴클레아제(TALEN)와 같은 특이적인 뉴클레아제의 사용을 통해서, 또는 특이적인 절단을 가이드하기 위한 가공된 crRNA/tracr RNA('단일 가이드 RNA')를 사용하는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 발생할 수 있다. 또한, 표적화된 뉴클레아제는 아르고너트 시스템(Argonaute system)(예를 들면, 'TtAgo'로서 공지된 티. 써모필러스(T. thermophilus)로부터), 참고: Swarts et al (2014) Nature 507(7491): 258-261)을 기반으로 개발되고 있으며, 이는 또한 게놈 에디팅(genome editing) 및 게놈 치료요법에서 사용하기 위한 잠재능을 가질 수 있다.
적혈 세포(RBC), 또는 적혈구는 혈액의 주요 세포 요소이다. 실제로, RBC는 사람에서 세포의 1/4을 차지한다. 성숙한 RBC는 사람에서 핵 및 많은 다른 기관을 결여하고 있으며, 산소를 조직으로 운반하고 이산화탄소를 조직 밖으로 운반하고 제거를 위해 다시 폐로 운반하는 기능을 하는 금속단백질(metalloprotein)인, 헤모글로빈으로 가득차 있다. 당해 단백질은 RBC의 무수 중량의 대략 97%를 차지하며 혈액의 산소 운반능을 약 70배까지 증가시킨다. 헤모글로빈은 2개의 알파(α)-유사 글로빈 쇄 및 2개의 베타(β)-유사 글로빈 쇄 및 4개의 헴 그룹(heme group)을 포함하는 이종사량체이다. 성체에서 α2β2 사량체는 헤모글로빈 A(HbA) 또는 성체 헤모글로빈으로 언급된다. 전형적으로, 알파 및 베타 글로빈 쇄는 대략 1:1의 비로 합성되며 당해 비는 헤모글로빈 및 RBC 안정화의 측면에서 중요한 것으로 여겨진다. 발달하는 태아에서, 헤모글로빈의 상이한 형태인, 태아 헤모글로빈(HbF)은 산소가 모체의 혈류를 통해 태아의 시스템으로 전달될 수 있도록 헤모글로빈 A보다 산소에 대한 결합 친화성이 훨씬 더 높다. 서열에 있어서 매우 유사하며 HPG1(또한 G감마로 언급됨) 및 HPG2(A감마)로 명명되는 태아 글로빈을 암호화하는 2개의 유전자가 존재한다. 태아 헤모글로빈 단백질은 또한 2개의 α 글로빈 쇄를 함유하지만, 성체 β-글로빈 쇄 대신에, 이는 2개의 태아 감마(γ)-글로빈 쇄를 갖는다(즉, 태아 헤모글로빈은 α2γ2이다). 임신 대략 30주째에, 태아에서 감마 글로빈의 합성은 정지하기 시작하는 반면 베타 글로빈의 생산이 증가한다. 대략 10개월령까지, 태아의 헤모글로빈은 일부 HbF가 성체로 지속되지만(전체 헤모글로빈의 대략 1 내지 3%) 태아의 헤모글로빈은 거의 모두 α2β2이다. 감마- 내지 베타-글로빈의 생산으로부터 스위치의 조절은 매우 복잡하며, 주로 베타 글로빈 전사의 동시 상향-조절과 함께 감마 글로빈 전사의 하향-조절을 포함한다.
헤모글로빈 쇄를 암호화하는 쇄내 유전적 결함은 겸상 적혈구 질환 및 지중해빈혈을 포함하는, 헤모글로빈혈증으로 공지된 다수의 질환에 관여할 수 있다. 헤모글로빈혈증을 지닌 대부분의 환자에서, 감마 글로빈을 암호화하는 유전자는 존재하지만, 발현은 위에서 기술한 바와 같이 출산 즈음에 발생하는 정상 유전자 억압(repression)으로 인하여 비교적 낮다.
미국에서 1 내지 5000명의 사람 중 1명이 사하라사막 이남의 아프리카 혈통의 사람들에게서 흔한, 겸상 적혈구 질환(SCD)을 갖는다. 말라리아에 대한 보호를 위해 겸상 적혈구 돌연변이의 이형성 담체가 유리한 것으로 여겨지므로, 이러한 특성이 수회에 걸쳐서 긍정적으로 선택되어져 왔을 수 있으므로, 사하라사막 이남의 아프리카에서, 인구의 1/3이 겸상 적혈구 특성을 가지는 것으로 추정된다. 겸상 적혈구 질환은 β 글로빈 유전자내 돌연변이에 의해 유발되며 이의 결과로 발린은 6번 아미노산에서 글루탐산으로 치환되며(DNA 수준에서 GAG가 GTG로), 여기서 수득되는 헤모글로빈은 "헤모글로빈S" 또는 "HbS"로 언급된다. 보다 낮은 산소 조건 하에서, HbS의 데옥시 형태의 구조적 이동(conformational shift)은 E와 F 나선 사이의 단백질에서 소수성 패치(hydrophobic patch)를 노출시킨다. 헤모글로빈내 베타 쇄의 6번 위치에서 발린의 소수성 잔기는 소수성 패치와 연합하여, HbS 분자가 응집하여 섬유성 침전물을 형성하도록 할 수 있다. 이들 응집체는 최종적으로 RBC의 비정상 또는 '낫적혈구화(sickling)'를 유발하여, 세포의 굴곡성의 손실을 생성한다. 낫적혈구화 RBC는 더 이상 모세관 층(capillary bed)으로 짜내어질(squeeze) 수 없고 겸상 적혈구 환자에서 혈관-폐쇄 위기(vaso-occlusive crisis)를 생성할 수 있다. 또한, 낫적혈구화된 RBC는 정상 RBC보다 더 취약하여, 용혈되는 경향이 있고, 궁극적으로는 환자에서 빈혈을 초래한다.
겸상 적혈구 환자의 치료 및 관리는 항생제 치료, 통증 관리 및 급성 사태 동안 수혈을 포함하는 생명 연장 문제에 처해있다. 한가지 시도는 하이드록시우레아의 사용이며, 이는 감마 글로빈의 생산을 증가시킴으로서 이의 효과를 부분적으로 발휘한다. 만성 하이드록시우레아 치료요법의 장기간의 부작용은 여전히 알려져 있지 않으나, 치료는 원치않는 부작용을 제공하고 환자 대 환자 간에 다양한 효능을 가질 수 있다. 겸상 적혈구 질환 치료의 효능에 있어서 증가에도 불구하고, 환자의 기대 수명은 여전히 단지 50대 중반 내지 후반이며 당해 질환의 관련된 질병률은 환자의 삶의 질에 엄청난 영향을 미친다.
지중해빈혈은 또한 헤모글로빈과 관련된 질환이며 전형적으로 글로빈 쇄의 감소된 발현을 포함한다. 이는 유전자의 조절 영역내 돌연변이를 통해 또는 감소된 발현 또는 감소된 수준 또는 작용성 글로빈 단백질을 생성하는 글로빈 암호화 서열내 돌연변이로부터 발생할 수 있다. 알파 지중해빈혈은 주로 서부 아프리카 및 남부 아시아 이남의 사람들과 관련되며, 말라리아 내성을 부여할 수 있다. 베타 지중해빈혈은 주로 지중해 이남, 전형적으로 그리스로부터 터키와 이탈리아의 해안 지역과 관련되어 있다. 경미한 지중해빈혈(thalassemia minor)에서는, β 글로빈 대립형질 중 하나만이 돌연변이를 지닌다. 개인은 소적혈구 빈혈로 고생하며, 검출은 일반적으로 정상보다 더 적은 평균 미립자 용적(<80fL)을 포함한다. 경미한 지중해빈혈을 지닌 대상체의 대립형질은 β+/β 또는 β0/β(여기서, 'β+'는 일부 양의 β 쇄 형성이 발생하도록 하는 대립형질을 말하고, 'β'는 야생형 β 글로빈 대립형질을 말하며, 'β0'는 결실의 일부 형태를 포함하는 β 글로빈을 말한다)이다. 중간의 지중해빈혈(thalassemia intermedia) 대상체는 흔히 정상의 삶을 영위하지만 특히 질병 또는 임신 시기에, 이들의 빈혈의 중증도에 따라서, 가끔의 수혈을 필요로 할 수 있다. 이들 환자의 대립형질은 β+/β+ 또는 βo/β+일 수 있다. 주요 지중해빈혈(thalassemia major)은 대립형질 둘 다가 지중해빈혈 돌연변이를 갖는 경우 발생한다. 이는 심각한 소적혈구 및 혈색소감소성 빈혈이다. 치료되지 않을 경우, 이는 빈혈, 비장 비대증 및 심각한 골 변형을 유발한다. 이는 20세 전에 사망에 이른다. 치료는 주기적인 수혈; 비장비대증의 경우 비장절제술 및 수혈-유발된 철 과부하의 킬레이트화(chelation)로 이루어진다. 적절한 공여자가 확인될 수 있는 경우, 중증 지중해빈혈을 지닌 사람의 치료를 위해 골수 이식이 또한 사용되고 있지만, 당해 과정은 유의적인 위험을 가질 수 있다.
SCD 및 베타 지중해빈혈의 치료를 위해 제안되어 온 한가지 시도는 HbF가 비정상인 성체 헤모글로빈을 기능적으로 교체하도록 하는 것을 목표로 감마 글로빈의 발현을 증가시키는 것이다. 위에서 언급한 바와 같이, 하이드록시우레아를 사용한 SCD 환자의 치료는 감마 글로빈 발현을 증가시키는데 있어서 이의 효과로 인하여 부분적으로 성공적인 것으로 고려된다. 감마 글로빈 재반응성화 활성에 영향을 미치는 것으로 발견된 화합물의 제1 그룹은 세포독성 약물이었다. 약리학적 조작에 의해 감마-글로빈의 새로운 합성(de novo synthesis)을 유발하는 능력은 실험 동물에서 5-아자사이티딘을 사용하여 처음 밝혀졌다(DeSimone (1982) Proc Nat'l Acad Sci USA 79(14):4428-31). 후속적인 연구들은, β-지중해빈혈 및 겸상 백혈구 혈증 질환을 지닌 환자에서 HbF를 증가시키는 5-아자사이티딘의 능력을 확인하였다(Ley, et al., (1982) N. Engl . J. Medicine, 307: 1469-1475, and Ley, et al., (1983) Blood 62: 370-380). 또한, 단쇄 지방산(예를 들면, 부티레이트 및 유도체)은 실험 시스템에서 HbF를 증가시키는 것으로 밝혀졌다(Constantoulakis et al., (1988) Blood 72(6):1961-1967). 또한, HbF의 상승된 양이 성인에서도 지속되는(HPFH 이종접합체에서 10 내지 40%, 참고: Thein et al (2009) Hum. Mol . Genet 18 (R2): R216-R223) '태아 헤모글로빈의 유전적 지속' (HPFH)으로 알려진 상태를 지닌 사람 집단의 구분이 존재한다. 이는 드문 상태이지만, 어떠한 관련된 베타 글로빈 이상의 부재하에서, 심지어, 개인의 헤모글로빈의 100%가 HbF인 경우에도, 어떠한 유의적인 임상 징후와 관련되어 있지 않다. 베타 지중해빈혈을 지닌 개인이 또한 동시 발생하는 HPFH를 갖는 경우, HbF의 발현은 질병의 중증도를 낮출 수 있다. 또한, 겸상 적혈구 질환의 자연적인 과정의 중증도는 환자에 따라 유의적으로 변할 수 있으며, 이러한 가변능은 부분적으로, 중간의 질환을 지닌 일부 환자가 보다 높은 수준의 HbF를 발현한다는 사실로 추적될 수 있다.
HbF의 발현을 증가시키는 한 가지 시도는, 이의 생성물이 감마 글로빈 발현의 조절에 역할을 하는 유전자의 확인을 포함한다. 이러한 한가지 유전자는 림프구 발달에서 이의 역할로 인하여 처음 확인된 BCL11A이다. BCL11A는 감마 글로빈 발현의 발달 단계-특이적인 조절에 관여하는 것으로 고려되는 아연 핑거 단백질(zinc finger protein)을 암호화한다. BCL11A는 성체 적혈구 전구체 세포에서 발현되며 이의 발현의 하향-조절(down-regulation)은 감마 글로빈 발현에 있어서의 증가를 초래한다. 또한, BCL11A mRNA의 스플라이싱(splicing)은 발전적으로 조절되는 것으로 나타난다. 배아 세포에서는, BCL11A-S 및 BCL11A-XS으로 알려진 보다 짧은 BCL11A mRNA 변이체가 주로 발현되지만, 성체 세포에서는, 보다 긴 BCL11A-L 및 BCL11A-XL mRNA 변이체가 주로 발현된다. (참고: Sankaran et al (2008) Science 322 p. 1839). BCL11A 단백질은 베타 글로빈 유전자자리와 상호작용하여 이의 구조를 변경시킴으로써 상이한 발달 단계에서 이의 발현을 변경시킨다. BCL11A 유전자에 대해 표적화된 억제성 RNA의 사용은 제안되어 있지만(참고: 예를 들면, 미국 특허 공보 제20110182867호) 당해 기술은 몇가지 잠재적인 단점을 가지는데, 즉, 완전한 녹다운(knock down)이 달성되지 않을 수 있으며, 이러한 RNA의 전달은 문제가 있을 수 있고 RNA는 일생 동안 다수의 치료를 지속적으로 필요로 하여야 한다.
BCL11A 인핸서 서열의 표적화는 HbF를 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다(참고: 예를 들면, 미국 특허 공보 제20150132269호). 게놈 광범위 연합 연구은 증가된 HbF 수준과 관련된 BCL11A에서의 유전 변이의 세트를 확인하였다. 이들 변이는 단계-특이적이고, 계통-제한된 인핸서 영역으로서 작용하는 BCL11A의 비-암호화 영역에서 발견된 SNP의 수집물이다. 추가의 연구는, 당해 BCL11A 인핸서는 BCL11A 발현을 위해 배아 세포에서 요구되지만, B 세포에서 이의 발현을 위해서는 요구되지 않음을 나타내었다. (참고: Bauer et al, (2013) Science 343:253-257). 인핸서 영역은 BCL11A 유전자의 인트론 2내에서 발견되었으며, 인트론 2 내의 DNAseI 과민증(종종 조절 잠재능과 관련된 크로마틴 상태의 지표)의 3개 영역이 확인되었다. 이들 3개의 영역은 BCL11A의 전사 출발 부위로부터 킬로염기의 거리에 따라 "+62", "+58" 및 "+55"로 확인되었다. 이들 인핸서 영역은 길이가 대략 350(+55); 550(+58); 및 350(+62)개 뉴클레오타이드이다(Bauer 2013, ibid).
따라서, 예를 들면, 겸상 적혈구 질환 및 베타 지중해빈혈과 같은 이상 혈색소증을 치료하기 위한 BCL11A 유전자 발현의 변경을 위한 추가의 방법 및 조성물에 대한 요구가 남아있다.
요약
본 발명은 유전자 치료요법 및 게놈 가공에 사용하기 위한 조성물 및 방법을 기술한다. 구체적으로, 기술된 방법 및 조성물은 BCL11A 유전자, 예를 들면, 하나 이상의 추가의 유전자의 조절인자로서 작용하는 유전자를 불활성화시키는 것(예를 들면, 이의 발현을 완전하게 또는 부분적으로 폐지함에 의해)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 구체적인 세포 계통에서 이의 활성을 약화시키거나 녹 아웃(knock out)시키기 위해 BCL11A 유전자에서 인핸서 작용을 방해하기 위한 방법 및 조성물을 기술한다. 추가로, 본 발명은 BCL11A 인핸서 작용을 방해하기 위한 방법 및 조성물을 제공하며, 여기서 상기 인핸서 서열은 BCL11A 유전자내에 위치하지 않는다. 궁극적으로 이러한 환경에서 BCL11A 유전자의 수득되는 하향-조절은 감마 글로빈의 증가된 발현을 생성한다.
일부 국면에서, 본 발명은 4, 5 또는 6개의 핑거(finger)를 포함하는 아연 핑거 단백질(ZFP)을 포함하는 비-천연적으로 발생하는 아연 핑거 단백질을 포함하며, 각각의 핑거는 표적 소부위(target subsite)를 인식하는 인식 나선 영역을 포함하고, 여기서 상기 인식 나선 영역은 표 1의 단일 열에 나타낸 순서의 서열을 포함한다. 특정의 구현예에서, ZFP는 다음과 같이 지정된 단백질에 대해 표 1에서 나타낸 바와 같은 인식 나선을 포함한다: 51446, 51463, 51484, 51856, 51857 또는 51862(이는 서열 번호 1에 나타낸 표적 부위에 결합한다) 및 51536, 51949, 51990, 51993, 51979, 51982, 52015, 52032(이는 서열 번호: 12에 나타낸 표적 부위에 결합한다). 따라서, 특정의 구현예에서, 다음의 인식 나선 영역을 포함하는, 아연 핑거 단백질이 본원에 제공된다:
(i) F1: STGNLTN(서열 번호: 7);
F2: TSGSLTR(서열 번호: 5);
F3: DQSNLRA(서열 번호: 2); 및
F4: AQCCLFH(서열 번호: 6); 또는
(ii) F1: DQSNLRA(서열 번호: 2);
F2: RPYTLRL(서열 번호: 3);
F3: SRGALKT(서열 번호: 8);
F4: TSGSLTR(서열 번호: 5);
F5: DQSNLRA(서열 번호: 2); 및
F6: AQCCLFH(서열 번호: 6);
(iii) F1: DQSNLRA(서열 번호: 2);
F2: RNFSLTM(서열 번호: 9);
F3: SNGNLRN(서열 번호: 10) 또는 STGNLTN(서열 번호: 7) 또는 SSYNLAN(서열 번호: 11);
F4: TSGSLTR(서열 번호: 5);
F5: DQSNLRA(서열 번호: 2); 및
F6: AQCCLFH(서열 번호: 6); 또는
(iv) F1: RSDHLTQ(서열 번호: 13);
F2: QSGHLAR(서열 번호: 14);
F3: QKGTLGE(서열 번호: 15);
F4: RHRDLSR(서열 번호: 18); 및
F5: RRDNLHS(서열 번호: 17); 또는
(v) F1: RNDHRTT(서열 번호: 19);
F2: QKAHLIR(서열 번호: 20);
F3: QKGTLGE(서열 번호: 15);
F4: RGRDLSR(서열 번호: 21) 또는 LKRTLKR(서열 번호: 25); 및
F5: RRDNLHS(서열 번호: 17); 또는
(vi) F1: RSDHLTQ(서열 번호: 13);
F2: QRAHLTR(서열 번호: 22);
F3: QKGTLGE(서열 번호: 15) 또는 QSGTRNH(서열 번호: 24);
F4: HRNTLVR(서열 번호: 23); 및
F5: RRDNLHS(서열 번호: 17); 또는
(vii) F1: RSDHLTQ(서열 번호: 13);
F2: QKAHLIR(서열 번호: 20);
F3: QKGTLGE(서열 번호: 15) 또는 QSGTRNH(서열 번호: 24);
F4: RGRDLSR(서열 번호: 21); 및
F5: RRDNLHS(서열 번호: 17); 또는
(viii) F1: F1: RSDHLTQ(서열 번호: 13);
F2: QSGHLAR(서열 번호: 14);
F3: QSGTRNH(서열 번호: 24);
F4: QSSDLSR(서열 번호: 16); 및
F5: RRDNLHS(서열 번호: 17).
특정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 아연 핑거 단백질은 작용성 도메인(예를 들면, 전사 활성화 도메인, 전사 억제 도메인(transcriptional repression 도메인), 절단 도메인(cleavage domain)(아연 핑거 뉴클레아제를 형성하기 위해) 등)에 융합된다. 아연 핑거 뉴클레아제는 이량체화 쌍으로 사용되어 당해 쌍의 ZFN에 대한 표적 부위 중 하나 또는 둘 다에서 또는 근처에서 절단하는데, 예를 들면, 표 1의 "좌측 파트너"(예를 들면, 51446, 51463, 51484, 51856, 51857, 또는 51862)는 표 1의 "우측 파트너"와 이량체를 형성하여(예를 들면, 51536, 51949, 51990, 51993, 51979, 51982, 52015, 또는 52032) BCL11A 인핸서 서열을 절단할 수 있다.
다른 국면에서, 본 발명은 게놈 가공의 목적을 위해 사람 줄기 세포 또는 전구체 세포(HSC/PC)에 대한 적어도 하나의 뉴클레아제(예를 들면, BCL11A 인핸서 서열에 결합하는 뉴클레아제)의 전달을 포함한다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제는 4, 5 또는 6개의 핑거를 포함하는 아연 핑거 단백질(ZFP)을 포함하고, 각각의 핑거는 표적 소부위를 인식하는 인식 나선 영역을 포함하고, 여기서 상기 인식 나선 영역은 표 1의 단일 열에 나타난 순서의 서열을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 뉴클레아제(들)은 링커(예를 들면, DNA-결합 도메인과 절단 도메인 사이), 예를 들면, 서열 번호: 26 내지 29 및 미국 특허 공보 제20150132269호에 나타낸 바와 같은 링커를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레아제는 펩타이드로서 전달되는 반면, 다른 것들에서 이는 적어도 하나의 뉴클레아제를 암호화하는 핵산으로서 전달된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레아제가 사용된다. 일부 바람직한 구현에에서, 뉴클레아제를 암호화하는 핵산은 mRNA이고, 일부 예에서, mRNA는 보호된다. 일부 국면에서, mRNA는 화학적으로 변형될 수 있다(참고: 예를 들면, Kormann et al, (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157). 다른 국면에서, mRNA는 ARCA 캡(cap)을 포함한다(참고: 미국 특허 제7,074,596호 및 제8,153,773호). 추가의 구현예에서, mRNA는 변형되지 않은 및 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다(참고: 미국 특허 공보 제2012/0195936호). 바람직한 구현예에서, 뉴클레아제(들)을 암호화하는 핵산은 전기천공(electroporation)을 통해 HSC/PC로 전달된다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 전사 인자의 결합 부위에서 또는 근처에서 절단한다. 일부 국면에서, 전사 인자는 GATA-1이다.
다른 국면에서, 본 발명은 내인성 BCL11A 인핸서 서열이 예를 들면, 세포의 야생형 서열과 비교한 것으로서, 본원에 기술된 바와 같은 뉴클레아제에 의해 유전적으로 변형된 세포 또는 세포주(예를 들면, 표 1에 나타냄)를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 뉴클레아제-변형된 세포 또는 세포주는 야생형 및 다른 변형된(뉴클레아제-매개된) 세포 둘 다로부터 구조 및/또는 작용에 있어 구별가능하다. 유전적으로 변형된 세포 또는 세포주는 변형의 경우 이종이거나 동종일 수 있다. 변형은 삽입(예를 들면, 전이유전자 삽입), 결실 및/또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 삽입, 결실 및/또는 이의 조합은 전사 인자 결합 부위의 파괴를 생성한다. 특정의 구현예에서, 변형은 뉴클레아제(들) 결합 및/또는 분해 분위(들), 예를 들면, 절단 부위(들)의 상부 또는 하부의 1 내지 300개(또는 이들 사이의 어떠한 값)의 염기쌍, 보다 바람직하게는 표 1에 나타낸 결합 및/또는 절단 부위(들)의 한쪽 측면의 1 내지 100개의 염기쌍(또는 이들 사이의 어떠한 값) 및/또는 표 1에 나타낸 절단 부위(들), 심지어 보다 바람직하게는 결합 및/또는 절단 부위(들)의 한쪽 측면에서 1 내지 50개의 염기쌍(또는 이들 사이의 어떠한 값) 내에 존재한다. 변형은 또한 절단내 및/또는 하나 이상의 결합 부위 내 하나 이상의 뉴클레오타이드에 대한 변형을 포함할 수 있다. 특정의 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레아제 표적 부위(들)은 변형되지 않는다. 다른 구현예에서, 뉴클레아제(들)에 대한 적어도 하나의 표적 부위는 변형된다. 특정의 구현예에서, 변형은 예를 들면, 서열 번호: 1 및 서열 번호: 12 중의 어느 것에 나타낸 뉴클레아제 결합 부위에서 또는 근처에서 BCL11A 인핸서의 "+58" 영역에 또는 근처에 존재한다. 어떠한 세포 또는 세포주, 예를 들면, 줄기 세포(CD34+ 조혈 줄기 세포와 같은 조혈 줄기 세포) 또는 적혈 세포(RBC) 전구체 세포도 본원에 기술된 바와 같은 뉴클레아제에 의해 변형될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 뉴클레아제에 의한 변형 후 수득된 세포 또는 세포주, 예를 들면, 뉴클레아제-변형된 세포 또는 세포주로부터 유래된 세포 또는 세포주도 또한 본원에 기술되어 있다. 본원에 기술된 바와 같은 변형된 줄기 세포로부터 유래된 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포가 또한 제공된다(예를 들면, RBC 또는 RBC 전구체 세포). 뉴클레아제-변형된 세포로부터 유래된 세포는 시험관내(in vitro)(배양물) 속에서 증식될 수 있거나 예를 들면, 뉴클레아제-변형된 줄기 세포의 생체외(ex vivo) 투여 후, 살아있는 대상체내에서 분화될 수 있다. 본원에 개시된 유전적으로 변형된 세포 또는 세포주들 중 어느 것도 감마 글로빈의 증가된 발현을 나타낼 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 약제학적 조성물과 같은 조성물도 또한 제공된다.
다른 국면에서, 본 발명은 유전적으로 변형된 세포를 제공하기 위한 공여체 핵산의 표적 세포로의 전달을 포함하며, 여기서 상기 공여체는 세포 내로 통합된다. 상기 공여체는 표 1의 뉴클레아제(들)을 암호화하는 핵산 이전에, 후에, 또는 이와 함께 전달될 수 있다. 공여체 핵산은 세포의 게놈, 예를 들면, 내인성 유전자자리내로 통합될 외인성 서열(전이유전자)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 공여체는 표적화된 절단 부위와 상동성인 영역에 의해 플랭크된(flanked) 완전한 길이의 유전자 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 공여체는 동종 영역을 결여하고 있으며 동종 독립된 메카니즘(homology independent mechanism)(즉, NHEJ)을 통해 표적 유전자자리내로 통합된다. 공여체는 뉴클레아제-유도된 이본쇄 브레이크(break)의 동종-지시된 보수(repair)를 위한 기질로서 사용되는 경우, 내인성 염색체 유전자자리(예를 들면, BCL11A 인핸서 영역)에서 생성될 공여체-특정화된 결실 또는, 달리는 (그 외에도) 생성된 내인성 유전자자리의 신규 대립형질 형태(예를 들면, 전사 인자 결합 부위를 제거하는 점 돌연변이)를 초래한다. 일부 국면에서, 공여체 핵산은 올리고뉴클레오타이드이며, 여기서 통합은 유전자 교정 현상, 또는 표적화된 결실을 초래한다.
다른 국면에서, 뉴클레아제 및/또는 공여체는 바이러스 및/또는 비-바이러스 유전자 전달 방법에 의해 전달된다. 바람직한 구현예에서, 공여체는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 통해 세포로 전달된다. 일부 예에서, AAV는 캡시드 혈청형과 비교하여 이종 혈청형인 LTR을 포함한다.
일부 국면에서, 인핸서의 DNAseI 과감작 영역(hypersensitive region; 예를 들면, BCL11A 인핸서의 +58 영역)은 표 1에 나타낸 바와 같은 하나 이상의 뉴클레아제를 사용하여 제조한다. 이들 결실은 약 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 551개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 따라서, 결실은 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550개의 뉴클레오타이드, 또는 이들 사이의 어떠한 값을 포함한다. 일부 구현예에서, 결실은 하나 이상의 전사 인자에 대한 결합 영역을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 결실은 GATA-1 결합 부위 또는 다른 인자와 함께 GATA-1에 대한 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 표 1의 DNA 결합 도메인은 작용성 도메인에 융합된다. 일부 국면은 유전자의 발현을 조절할 수 있는 도메인과 DNA 결합 도메인의 융합을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 유전자 발현 조절 도메인에 융합된 표 1의 DNA 결합 도메인을 포함하며, 여기서 상기 조절인자는 유전자 발현을 억제한다.
일부 구현예에서, HSC/PC 세포는 본 발명의 뉴클레아제 및/또는 DNA 결합 단백질(즉, 표 1에 나타낸 바와 같은 ZFP)와 접촉된다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제 및/또는 DNA 결합 단백질은 핵산으로서 전달되며 다른 구현예에서, 이들은 단백질로서 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산은 뉴클레아제 및/또는 DNA 결합 단백질을 암호화하는 mRNA이며, 추가의 구현예에서, mRNA는 보호될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 화학적으로 변형될 수 있으며, ARCA 캡을 포함할 수 있고/있거나 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함할 수 있다. 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포를 포함하는, 이들 세포로부터 유래된 세포 또는 세포주가 또한 제공된다.
일부 국면에서, HSC/PC는 생체외에서 본 발명의 뉴클레아제 및/또는 DNA 결합 단백질, 대상체로부터 HSC/PC의 후속적인 분리반출법(apheresis), 또는 수거된 골수로부터의 정제와 접촉된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 뉴클레아제는 BCL11A 인핸서 영역 내에서 변형을 유발하여 야생형 및/또는 다른 변형된(예를 들면, 뉴클레아제-변형된) 세포로부터 구조적으로 및/또는 작용적으로 구별되는 유전적으로 변형된 세포를 생성한다. 추가의 구현예에서, BCL11A 인핸서 영역 변형을 함유하는 HSC/PC는 대상체내로 다시 도입된다. 일부 예에서, BCL11A 인핸서 영역 변형을 함유하는 HSC/PC는 도입 전에 확장된다. 다른 국면에서, 유전적으로 변형된 HSC/PC는 골수 이식체에서 대상체에게 제공되며, 여기서 HSC/PC는 생체내에서 이식되어, 분화하고 성숙한다. 일부 구현예에서, HSC/PC는 G-CSF- 및/또는 플레릭사포르(plerixafor)-유도된 이동(mobilization) 후 대상체로부터 분리되며, 다른 것에서, 세포는 사람 골수 또는 사람 제대(umbilical cord)로부터 분리된다. 일부 국면에서, 대상체는 변형된 HSC/PC를 포함하는 이식체의 도입 전에 온화한 조혈모세포이식 과정(myeloablative procedure)으로 치료되는 반현, 다른 국면에서, 대상체는 활발한 골수 소멸성 조건화 요법(vigorous myeloablative conditioning regimen)으로 치료된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 혈색소병증을 치료하거나 예방하는데 사용된다. 일부 국면에서, 혈색소병증는 베타 지중해빈혈인 반면, 다른 국면에서, 혈색소병증은 겸상 적혈구 질환이다.
일부 구현예에서, HSC/PC는 공여체 분자와 추가로 접촉된다. 일부 구현예에서, 공여체 분자는 바이러스 벡터에 의해 전달된다. 공여체 분자는 작용성 폴리펩타이드(예를 들면, cDNA 또는 이의 단편)을 암호화하는 하나 이상의 서열을, 프로모터의 존재 또는 부재하에 포함할 수 있다. 공여체 분자가 불활성화에 사용되는 경우, 2A 펩타이드, SA 부위, IRES 등을 암호화하는 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는 추가의 서열(암호화 또는 비-암호화 서열)이 포함될 수 있다.
일 국면에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 생체내에서 HSC/PC를 접촉시키는 방법을 포함한다. 뉴클레아제 및/또는 DNA 결합 단백질은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 반응계내에서 HSC/PC로 전달된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 뉴클레아제 및/또는 DNA 결합 단백질은 필요한 대상체에게 투여되는 바이러스 입자를 포함하지만, 다른 것에서, 뉴클레아제 및/또는 DNA 결합 단백질은 나노입자(예를 들면, 리포좀)을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자 및/또는 나노입자는 기관(예를 들면, 골수)으로, 여기서 HSC/PC 잔기로 전달된다.
다른 국면에서, 공여체 핵산을 동종-독립적인 메카니즘(homology-independent mechanism)을 통해 세포의 게놈내로 통합시키는 방법이 본원에 기술되어 있다. 당해 방법은 본원에 기술된 바와 같은 뉴클레아제를 사용하여 세포의 게놈내에서 이본쇄 브레이크(DSB)를 생성하고 공여체 분자를 절단함으로서, 공여체 핵산이 DSB의 부위에서 통합되도록 함을 포함한다. 특정의 구현예에서, 공여체 핵산은 비-상동성 의존적인 방법(예를 들면, NHEJ)을 통해 통합된다. 위에서 나타낸 바와 같이, 생체내 절단 시 공여체 서열은 DSB의 위치에서 세포의 게놈내에 표적화된 방식으로 통합될 수 있다. 공여체 서열은 DSB를 생성하는데 사용된 하나 이상의 뉴클레아제에 대한 하나 이상의 동일한 표적 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 공여체 서열은 통합이 요구되는 내인성 유전자를 절단하는데 사용된 하나 이상의 동일한 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있다. 특정의 구현예에서, 공여체 서열은 DSB를 유도하는데 사용된 뉴클레아제로부터의 상이한 뉴클레아제 표적 부위를 포함한다. 표적 세포의 게놈내 DSB는 어떠한 메카니즘에 의해서도 생성될 수 있다. 특정의 구현예에서, DSB는 목적한 영역내에서 서열에 결합하도록 가공된, 아연 핑거 결합 도메인, 및 절단 도메인 또는 절단 반-도메인(cleavage half-domain)을 포함하는 융합 단백질인, 하나 이상의 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)에 의해 생성된다.
일 국면에서, 공여체는 목적한 유전자에 결합하고/하거나 이의 발현을 조절하는 목적한 조절 단백질(예를 들면, ZFP TF, TALE TF 또는 CRISPR/Cas TF)을 암호화할 수 있다. 일 구현예에서, 조절 단백질은 DNA 서열에 결합하여 다른 조절 인자의 결합을 방지한다. 다른 구현예에서, 조절 단백질의 결합은 표적 DNA의 발현을 조절(즉, 유도 또는 억제)할 수 있다.
일부 구현예에서, 전이유전자 HSC/PC 세포 및/또는 동물은 사람 유전자를 암호화하는 전이유전자를 포함한다. 일부 예에서, 전이유전자 동물은 외인성 전이 유전자에 상응하는 내인성 유전자자리에서 녹 아웃을 포함함으로써, 사람 단백질이 불리시 연구될 수 있는 생체내(in vivo) 시스템의 개발을 허용한다. 이러한 전이유전자는 소 분자 또는 거대 생분자 또는 목적한 사람 단백질과 상호작용하거나 이를 변형시킬 수 있는 다른 실체를 확인하기 위한 스크리닝 목적에 사용될 수 있다. 일부 국면에서, 전이유전자는 줄기 세포(예를 들면, 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 조절 줄기 세포 등) 또는 본원에 기술된 방법들 중 어느 것으로 수득된 동물 배아내 선택된 유전자자리(예를 들면, 세이프-하버((safe-harbor))내로 통합된 후, 배아가 이식됨으로써 살아있는 동물이 태어난다. 이후에 동물은 성 성숙기로 자라서 후손을 생산하게 되며, 여기서 후손 중 적어도 일부는 수정된(edited) 내인성 유전자 서열 또는 통합된 전이유전자를 포함한다.
다른 국면에서, 세포내에서 유전자 발현(예를 들면, BCL11A 및/또는 글로빈 유전자)를 변경시키는 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 세포 내로, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 뉴클레아제(표 1에 나타낸 바와 같음)를 하나 이상의 단백질이 발현되고 유전자의 발현이 변경되는 조건 하에서 도입함을 포함한다. 특정의 구현예에서, 글로빈 유전자(예를 들면, 감마 글로빈 또는 베타 글로빈)의 발현은 변경(예를 들면, 증가)된다. 본원에 기술된 방법들 중 어느 것도 공여체 서열(예를 들면, 외인성 또는 내인성 프로모터의 조절 하에서 전이유전자 또는 이의 단편)을 세포의 게놈내로 통합시킴, 예를 들면, 공여체를 BCL11A 유전자내 뉴클레아제 절단 분위에서 또는 근처에서 공여체를 통합시킴을 추가로 포함할 수 있다. 공여체 서열은 바이러스 벡터를 사용하여, 올리고뉴클레오타이드로서 및/또는 플라스미드 상에서 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자 발현이 변경된 세포는 예를 들면, 적혈 세포(RBC) 전구체 세포 및/또는 조혈 줄기 세포(예를 들면, CD34+ 세포)일 수 있다.
다른 구현예에서, 내인성 BCL11A 인핸서 서열내에 게놈 변형(BCL11A 인핸서 서열의 뉴클레오타이드 서열에 대한 변형)을 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 생산하는 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은: a) 세포를 4, 5, 또는 6개의 아연 핑거 도메인을 포함하는 아연 핑거 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, DNA 또는 mRNA)와 접촉시키는 단계(여기서, 상기 아연 핑거 도메인 각각은 표 1의 단일 열에 나타낸 순서로 인식 나선 영역을 포함한다); b) 상기 세포를 폴리뉴클레오타이드로부터 아연 핑거 단백질을 발현시키는 조건에 적용시키는 단계; 및 c) 내인성 BCL11A 인핸서 서열을 유전적으로 변형된 세포를 생산하기에 충분한 발현된 아연 핑거 단백질로 변형시키는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 세포는 적어도 하나의 사이토킨(예를 들면, 단계 (a)이전)으로 자극된다. 폴리뉴클레오타이드는 형질감염을 통해, 비-바이러스 벡터를 사용하여, 바이러스 벡터를 사용하여, 화학적 수단에 의해 또는 전기장에 대한 노출(예를 들면, 전기천공)에 의한 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 적합한 방법도 사용하여 세포와 접촉시킬 수 있다.
본원에 기술된 방법에 의해 생산된 세포로부터 유래된 세포를 포함하는, 본원에 기술된 게놈성 변형 중의 하나 또는 조합물을 포함하는 세포가 또한 제공된다.
글로빈 유전자 발현시 증가시킬 필요가 있는 환자를 치료하는 방법이 또한 제공되며, 당해 방법은 환자에게 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 제제(유전적으로 변형된 세포, 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드)를 환자내 글로빈 유전자 발현을 증가시키기에 충분한 양으로 투여함을 포함한다. 특정의 구현예에서, 환자는 지중해빈혈 또는 겸상 적혈구 질환을 가진 것으로 알려져 있거나, 가진 것으로 추측되거나, 또는 이것으로 진행될 위험이 있다.
본 발명의 핵산, 단백질 및/또는 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 키트(kit)가 또한 제공된다. 당해 키트는 뉴클레아제(예를 들면, RNA 분자 또는 적합한 발현 벡터 속에 함유된 유전자를 암호화하는 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas 시스템), 또는 뉴클레아제 단백질, 공여체 분자, 적합한 줄기능 변형인자(stemness modifier), 세포, 완충제의 분취량, 및/또는 지시사항(예를 들면, 본 발명의 방법을 수행하기 위한) 등을 포함할 수 있다. 본 발명은 뉴클레아제(예를 들면, 표 1의 단일 열에 나타낸 바와 같음)에 의해 제조된 적어도 하나의 게놈 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 세포(예를 들면, 조혈(CD34+) 줄기 세포 또는 RBC 전구체 세포와 같은 줄기 세포)를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 여기서 게놈 변형은 내인성 BCL11A 인핸서 서열 내에 있으며, 추가로 여기서 게놈 변형은 삽입, 결실 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며 서열 번호: 1 및 서열 번호 12 중 어느 것에서 또는 이들의 근처에서의 변형을 포함한다. 특정의 구현예에서, 세포는 본원에 기술된 바와 같은 줄기 세포로부터 유래된 유전적으로 변형되어 분화된 세포(예를 들면, 조혈 줄기 세포로부터 유래된 RBC 또는 RBC 전구체 세포)이다.
뉴클레아제는 적어도 하나의 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)(예를 들면, 표 1에 나타낸 것) 및/또는 적어도 하나의 TALEN을 포함할 수 있으며 뉴클레아제(들)은 단백질 형태로 및/또는 뉴클레아제(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 세포내로 도입될 수 있다. 특정의 구현예에서, 게놈 변형은 전이유전자를 암호화하는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 통합을 포함하는 삽입을 포함한다. 또한, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
또한, 인식 나선 영역을 포함하는 4, 5 또는 6개의 아연 핑거 도메인을 포함하는 아연 핑거 단백질을 포함하는 DNA-결합 단백질이 제공되며, 여기서 상기 아연 핑거 단백질은 표 1의 단일 열에 나타낸 순서로 인식 나선 영역을 포함한다. 또한, 표 1에 나타낸 표적 부위의 일부(예를 들면, 적어도 4, 5, 6개 이상)의 염기 쌍을 포함하는 서열에 결합하는 다수의 반복체를 포함하는 TALE 단백질이 제공된다. 본원에 기술된 바와 같은 아연 핑거 단백질 또는 TALE 단백질 및 야생형 또는 가공된 절단 도메인 또는 절단 반-도메인을 포함하는 융합 단백질이 본원에 기술된 바와 같은 단백질(ZFP, TALE, ZFN, TALEN)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 제공된다. 본원에 기술된 바와 같은, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 단백질을 포함하는 세포(예를 들면, 조혈(CD34+) 줄기 세포와 같은 분리된 줄기 세포)가 또한 제공된다. 또한, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 단백질, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 세포를 포함하는 키트가 제공된다.
세포(예를 들면, RBC 전구체 세포 및/또는 조혈 줄기 세포) 내에서 글로빈 유전자 발현을 변경시키는 방법이 또한 기술되어 있으며, 당해 방법은 세포 내로, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 뉴클레아제를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 단백질이 발현되고, 글로빈 유전자(예를 들면, 감마 및/또는 베타 글로빈)의 발현이 변경(예를 들면, 증가)되는 조건 하에서 도입시킴을 포함한다. 특정의 구현예에서, 상기 방법은 공여체 서열을 세포의 게놈 내로, 예를 들면, 바이러스 벡터를 사용하여, 올리고뉴클레오타이드로서 또는 플라스미드 상에서 도입시킴을 포함한다. 공여체 서열은 내인성 또는 외인성 프로모터의 조절 하에서 전이유전자를 포함할 수 있다.
또한 내인성 BCL11A 인핸서 서열(예를 들면, 표 1에 나타낸 바와 같은 표적 부위) 내에 게놈 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 생산하는 방법이 제공되며, 당해 방법은: (a) 세포를 4, 5, 또는 6개의 아연 핑거 도메인을 포함하는 아연 핑거 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계(여기서, 각각의 아연 핑거 도메인은 표 1의 단일 열에 나타낸 순서로 인식 나선 영역을 포함한다); (b) 상기 세포를 상기 폴리뉴클레오타이드로부터 융합 단백질을 발현하도록 하는 조건 하에 적용시키는 단계; 및 (c) 상기 내인성 BCL11A 인핸서 서열을 유전적으로 변형된 세포를 생산하기에 충분한 발현된 융합 단백질로 변형시키는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 당해 방법은 세포를 적어도 하나의 사이토킨으로 자극시킴을 추가로 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드(들)은 세포 내로, 예를 들면, 비-바이러스 전달 시스템, 바이러스 전달 시스템, 및/또는 전달 비히클을 사용하여 전달될 수 있으며 세포를 전기장에 적용시킴을 포함할 수 있다.
글로빈 유전자 발현을 증가시킬 필요가 있는 환자(예를 들면, 환자는 지중해빈혈(예를 들면, β-지중해빈혈) 또는 겸상 적혈구 질환을 가진 것으로 알려져 있거나, 가진 것으로 추측되거나, 이들로 발달할 위험이 있다)를 치료하는 방법이 또한 제공되며, 당해 방법은 상기 환자에게 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물(예를 들면, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 세포)을 상기 환자에서 글로빈 유전자 발현을 증가시키기에 충분한 양으로 투여함을 포함한다.
이들 및 다른 국면은 개시내용 전체의 측면에서 당해 분야의 숙련가에게 용이하게 명백할 것이다.
도 1은 나타낸 BCL11a-특이적인 ZFN 쌍으로 수정된 CD34+ 세포로부터 기원한 적혈 세포내에서 사람 감마 글로빈 발현(HBG) 대 사람 베타 글로빈 발현(HBB)의 상대적인 비를 묘사하는 그래프이다.
도 2a 및 2b는 말초 혈액(PB)으로부터 분리된 CD34+ 세포내에서 BCL11a 특이적인 ZFN의 2개의 쌍의 활성을 묘사하는 그래프이다. 세포는 BTX 전기천공 장치를 사용하여 형질감염시켰다. 각각의 조건에 대해 검출된 삽입결실 %(% indel)(검출가능한 NHEJ 활성도의 측정)은 하기 도 2a(0.5 내지 4μg의 mRNA 투입 범위) 및 도 2b(2.0 내지 8.0μg의 mRNA 투입 범위)에 대한 그래프로 나타나 있다.
도 3은 도 2b에 나타낸 수정된 PB CD34+ 세포의 적혈구 분화 후 사람 감마 글로빈(HBG) 대 사람 베타 글로빈(HBB)의 상대적인 비로서 HBG의 발현을 묘사하는 그래프이다. 단일 mRNA 종(여기서, ZFN은 동일한 mRNA 분자 상에 암호화되지만 2a 자가-절단 펩타이드 서열("2a"로서 확인됨)에 의해 분리된다)을 2개의 mRNA의 사용과 비교하며, 여기서 각각의 mRNA는 ZFN 쌍 중 하나(별개의 것에 대해 "sep"로 확인됨)를 암호화한다.
도 4a 및 도 4b는 골수(BM)로부터 분리된 CD34+ 세포내에서 BCL11a 특이적인 ZFN의 2개 쌍의 활성을 묘사하는 그래프이다. 세포는 BTX 전기천공 장치를 사용하여 형질감염시켰다. 각각의 조건에 대해 검출된(검출가능한 NHEJ 활성의 측정) 삽입결실 %는 하기 도 4a(2.0 내지 8.0μg의 mRNA 투입 범위)에 대한 그래프로 나타낸다. 도 4b는 ZFN의 하나의 쌍의 활성을 묘사하며, 여기서 ZFN은 각각의 ZFN을 암호화하는 서열을 분리하는 2a 자가-절단 펩타이드 서열을 지닌 단일의 mRNA 종으로서 또는 2개의 ZFN이 별개의 mRNA 상에 공급되는 경우로서 공급된다.
도 5a 및 5b는 맥스사이트(Maxcyte) 전기천공 장치를 사용하여 PB 기원한 CD34+ 세포 내에서 ZFN 쌍의 활성을 묘사한다. 각각의 조건에 대해 검출된 삽입결실 %(검출가능한 NHEJ 활성의 측정)는 하기 도 5a 및 5b에 대한 그래프로 나타낸다. 도 5a는 2개의 ZFN 쌍들 사이의 비교를 나타내고 도 5b는 ZFN이 각각의 ZFN을 암호화하는 서열을 분리하는 2a 자가-절단 펩타이드 서열을 지닌 단일 mRNA 종으로서 공급되는 경우 또는 2개의 ZFN이 별도의 mRNA에 공급되는 경우에 ZFN 쌍의 활성을 나타낸다.
도 6은 골수 기원한 CD34+ 세포 내에서 A 쌍(SBS51446/51536) 및 B 쌍(SBS51857/51949)의 대규모 활성을 나타내는 그래프를 나타낸다. ZFN 쌍을 암호화하는 mRNA는 단일 mRNA(여기서, ZFN 쌍의 각각의 반을 암호화하는 서열은 2a 자가-절단 서열 서열에 의해 분리된다)로서, 또는 각각의 ZFN을 암호화하는 별개의 mRNA로서 분리된다. 활성은 검출된 삽입결실%로 나타낸다.
도 7은 분화 14일 후 도 6에 나타낸 거대 규모 유전자 수정(gene editing) 후 검출된 HBG 및 HBB 발현의 상대적인 양을 묘사하는 그래프를 나타낸다. 앞서와 같이, 샘플은 ZFN 둘 다를 암호화하는 단일의 mRNA로서, 또는 별개의 mRNA로서 시험하였다. 분화 0일째에 검출된 삽입결실의 양은 하단에 걸쳐 나타내며, 삽입결실 활성이 발현된 HGB 양을 뒤쫓음을 입증한다.
도 8은 상기 기술된 바와 같은 단일 mRNA 또는 별개의 mRNA로서, 쌍 B로 처리된 골수로부터 CD34+ 세포의 대규모 수정시 검출된 삽입결실의 퍼센트를 묘사하는 그래프이다.
도 9a 및 9b는 상기 기술된 바와 같은 단일의 mRNA 또는 별개의 mRNA로서, 쌍 B로 처리한 골수로부터의 CD34+ 세포의 대규모 수정시 검출된 삽입결실의 퍼센트를 묘사하는 그래프이다.
도 10a 및 10b는 쌍 A(도 10a) 및 쌍 B(도 10b)에 대한 오프-표적 분석(off-target analysis)의 결과를 묘사하는 표이다.
도 11a 및 11b는 SB ZFN mRNA으로 처리한 환자 및 야생형(wt) 세포를 사용하여 실험 1(도 11a) 및 실험 2(도 11b)에서 시험관내 분화의 실시간 RT qPCR 분석을 나타내는 그래프이다. 당해 그래프는 감마 글로빈 대 알파 글로빈 mRNA의 상대적인 비를 나타낸다.
도 12a 및 12b는 실험 1(도 12a) 및 실험 2(도 12b)에서 감마 글로빈 대 알파 글로빈의 비를 나타내는 그래프이다. 감마 글로빈 값의 경우, A감마 및 G감마 피크의 값 및, 적용가능한 경우, A감마 T 피크는 증가되었다.
도 13은 분석된 개개 콜로니(colony)에서 대립형질 상태에 따라 그래프화된 감마/베타 유사 단백질 비의 그래프를 나타낸다. 상기 데이타는 유전형 부류(변형되지 않은 대립형질의 경우 "+", 수정된 대립형질의 경우 "-"; 야생형의 경우 "+/+"; 변형된 단일대립형질의 경우 "+/-"; 및 변형된 이중대립형질의 경우 "-/-")으로 분류하였다.
상세한 설명
BCL11A 및/또는 감마 글로빈 발현의 변형 및 헤모글로빈혈증의 치료 및/또는 예방을 위한 게놈 가공용 조성물 및 방법이 본원에 개시되어 있다. 특히, 표 1의 단일 열에 나타낸 바와 같은 인식 나선 영역을 갖는 ZFP를 포함하는 뉴클레아제는 HSC/PC 내에서 효율적으로 달성되며 후속적인 절혈구 생성 동안 상대적인 감마 글로빈 발현에 있어서의 변화를 생성한다. BCL11A 및 감마 글로빈 발현의 이러한 조절은 불충분한 베타 글로빈 발현 또는 베타-글로빈의 돌연변이된 형태의 발현이 존재하는 헤모글로빈혈증(예를 들면, 베타 지중해빈혈, 겸상 적혈구 질환)의 치료에 특히 유용하다. 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하는 경우, 비정상의 베타 글로빈에 의해 유발된 합병증 및 질환 관련 휴유증은 적혈구 전구체 세포내에서 감마 글로빈의 발현을 변경시킴으로써 극복할 수 있다.
개요
본원에 개시된 방법의 실시, 및 또한 조성물의 제조 및 용도는 달리 나타내지 않는 한, 당해 분야의 기술 내에 있는 것으로서, 분자 생물학, 생화학, 크로마틴 구조 및 분석, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합체 DNA 및 관련 분야에서의 통상의 기술을 사용한다. 이들 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들면, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; and METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999를 참고한다.
정의
용어 "핵산," "폴리뉴클레오타이드," 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용되며 선형 또는 환형 구조, 및 일본쇄 또는 이본쇄 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 말한다. 본 개시내용의 목적을 위해서, 이들 용어는 중합체의 길이와 관련하여 제한되는 것으로 고려되어서는 안된다. 당해 용어는 천연 뉴클레오타이드, 및 또한 염기, 당 및/또는 인산염 잔기(예를 들면, 포스포로티오에이트 골격)내에서 변형된 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특수한 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기-쌍화 특이성을 가지며, 즉, A의 유사체는 T와 염기-쌍을 이룰 것이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 천연적으로 존재하는 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에 적용된다.
"결합"은 거대 분자 사이(예를 들면, 단백질과 핵산 사이)의 서열-특이적인, 비-공유결합성 상호작용을 말한다. 전체적으로 상호작용이 서열-특이적인 한, 결합 상호작용의 모든 요소가 서열-특이적(예를 들면, DNA 골격내에서 인산염 잔기와 접촉함)일 필요는 없다. 이러한 상호작용은 일반적으로 10-6　M-1 이하의 해리 상수(Kd)로 특징화된다. "친화성"은 결합의 강도: 보다 낮은 Kd와 관련된 증가된 결합 친화성을 말한다.
"결합 단백질"은 다른 분자에 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은 예를 들면, DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질이 경우에, 이는 자체에 결합(이종이량체, 동종삼량체 등을 형성)할 수 있고/있거나 이는 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 결합 활성의 하나 이상의 유형을 가질 수 있다. 예를 들면, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 갖는다.
"아연 핑거 DNA 결합 단백질"(또는 결합 도메인)은 이의 구조가 아연 이온의 배위를 통해 안정화되어 있는 결합 도메인내 아미노산 서열의 영역인, 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적인 방식으로 DNA에 결합하는, 단백질, 또는 보다 큰 단백질내 도메인이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 흔히 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로서 약술된다.
"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩타이드이다. 반복 도메인은 이의 표적 DNA 서열에 대한 TALE의 결합에 관여된다. 단일 "반복체 단위"(또한 "반복체"로서 언급됨)는 길이가 전형적으로 33 내지 35개 아미노산이며 천연적으로 존재하는 TALE 단백질내에서 다른 TALE 반복체 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다.
아연 핑거 및 TALE 결합 도메인은 예를 들면, 천연적으로 존재하는 아연 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 가공(하나 이상의 아미노산을 변경시킴)을 통해 "가공"되어 예정된 뉴클레오타이드 서열에 결합할 수 있다. 따라서, 가공된 DNA 결합 단백질(아연 핑거 또는 TALE)은 비-천연적으로 존재하는 단백질이다. DNA-결합 단백질을 가공하기 위한 방법의 비-제한적인 예는 설계 및 선택이다. 설계된 DNA 결합 단백질은 이의 설계 조성물이 비 기준으로부터 원칙적으로 생성되는 천연에 존재하지 않는 단백질이다. 설계용 비 기준은 치환 법칙의 적용 및 존재하는 ZFP 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이타의 데이타베이스 저장 정보에서 정보를 가공하기 위한 컴퓨터화된 알고리즘의 적용을 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 제6,534,261호 및 제8,585,526호를 참고한다; 또한 WO　98/53058; WO　98/53059; WO　98/53060; WO　02/016536 및 WO　03/016496을 참고한다.
"선택된" 아연 핑거 단백질 또는 TALE은 이의 생산이 파아지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택과 같은 실험 공정으로부터 주로 생성되는 천연에서 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들면, 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,200,759호; 제8,586,526호; WO　95/19431; WO　96/06166; WO　98/53057; WO　98/54311; WO　00/27878; WO　01/60970, WO　01/88197, WO　02/099084를 참고한다.
"TtAgo"는 유전자 사일런싱(gene silencing)에 관여되는 것으로 고려되는 원핵세포 아르고노트(Argonaute) 단백질이다. TtAgo는 세균 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus)로부터 기원한다. (참고: 예를 들면, Swarts et al, ibid, G. Sheng et al., (2013) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 111, 652). "TtAgo 시스템"은 예를 들면, TtAgo 효소에 의한 절단을 위한 가이드 DNA를 포함하는 필요한 요소 모두이다.
"재조합"은 비-동종 말단 결합(non-homologous end joining: NHEJ) 및 동종 재조합에 의한 공여체 포획을 포함하나, 이에 한정되지 않는 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 유전 정보의 교환 과정을 말한다. 본 개시내용의 목적을 위해, "동종 재조합(HR)"은 예를 들면, 상동성-지시된 보수 메카니즘을 통한 세포 내 이본쇄 브레이크의 보수 동안 일어나는 이러한 변화의 특수한 형태를 말한다. 당해 공정은 뉴클레오타이드 서열 상동성을 필요로 하며, "표적" 분자(즉, 이본쇄 브레이크를 경험하는 것)의 주형 보수에 대한 "공여체" 분자를 사용하며, "비-교차 유전자 전환(non-crossover gene conversion)" 또는 "짧은 트랙트 유전자 전환(short tract gene conversion)"으로서 다양하게 공지되어 있는데, 이는 이것이 공여체로부터 표적으로 유전 정보를 전달하기 때문이다. 어떠한 특수한 이론에 얽메이지 않고, 이러한 전달은 브레이크된 표적과 공여체 사이에 형성하는 이형이중가닥 DNA의 미스매치 수정, 및/또는 "합성-의존성 쇄 어닐링(chain annealing)"을 포함할 수 있으며, 여기서 공여체는 표적, 및/또는 관련된 공정의 일부가 될 유전 정보를 재합성하는데 사용된다. 이러한 특수화된 HR은 흔히 표적 분자의 서열의 변경을 생성함으로써 공여체 폴리뉴클레오타이드의 서열중 일부 또는 모두가 표적 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입되도록 한다.
본 개시내용의 방법에서, 본원에 기술된, 하나 이상의 표적화된 뉴클레아제는 에정된 부위에서 표적서열(예를 들면, 세포 크로마틴) 내에 이본쇄 브레이크(DSB)를 생성한다. DSB는 동종 지시된 보수에 의해 또는 비-동종 지시된 보수 메카니즘에 의해 결실 및/또는 삽입을 생성할 수 있다. 결실은 어떠한 수의 염기쌍도 포함할 수 있다. 유사하게, 삽입은 예를 들면, 브레이크의 영역내에 뉴클레오타이드 서열에 대해 상동성을 임의로 갖는, "공여체" 폴리뉴클레오타이드의 통합을 포함하는 어떠한 수의 염기 쌍도 포함할 수 있다. 공여체 서열은 물리적으로 통합되거나, 달리는, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 동종 재조합을 통해 브레이크의 보수를 위한 주형으로서 사용되어, 공여체 내에서와 같은 뉴클레오타이드 서열의 모두 또는 일부의 세포내 크로마틴으로의 도입을 생성한다. 따라서, 세포내 크로마틴내의 제1 서열은 변경될 수 있고, 특정의 구현예에서, 공여체 폴리뉴클레오타이드 내에 존재하는 서열로 전환될 수 있다. 따라서, 용어 "교체하다" 또는 "교체"의 사용은 하나의 뉴클레오타이드 서열의 다른 것(즉, 정보 의미에서 서열의 교체)를 나타내는 것으로 이해될 수 있으며, 하나의 폴리뉴클레오타이드의 다른 것에 의한 물리적 또는 화학적 교체를 필수적으로 필요로 하지 않는다.
본원에 기술된 방법 중 어느 것에서도, 아연-핑거 단백질 또는 TALEN의 추가의 쌍을 세포내에서 추가의 표적 부위의 추가의 이본쇄 절단을 위해 사용할 수 있다.
본원에 기술된 방법 중 어느 것도 목적한 유전자(들)의 발현을 파괴하는 공여체 서열의 표적화된 통합에 의해 세포내에서 어떠한 크기의 공여체의 삽입 및/또는 하나 이상의 표적 서열의 부분적 또는 완전한 불활성화를 위해 사용될 수 있다. 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 유전자를 지닌 세포주 또한 제공된다.
본원에 기술된 방법들 중 어느 것에서도, 외인성 뉴클레오타이드 서열("공여체 서열" 또는 "이식유전자")는 상동성인 서열을 함유할 수 있으나, 목적한 영역내 게놈 서열과는 동일하지 않으므로, 목적한 영역내에서 동일하지 않은 서열을 삽입하기 위한 동종 재조합을 자극한다. 따라서, 특정 구현예에서, 목적한 영역내 서열과 상동성인 공여체 서열 중 일부는 교체되는 게놈 서열에 대해 약 80 내지 99%(또는 이들 사이의 어떠한 정수) 사이를 나타내는 목적한 영역내 서열에 대해 상동성이다. 다른 구현예에서, 공여체와 게놈 서열 사이의 상동성은 예를 들어, 1개 뉴클레오타이드만이 100개 이상의 연속된 염기 쌍의 공여체와 게놈 서열 사이에서 상이한 경우, 99% 보다 높다. 특정의 경우에, 공여체 서열의 비-상동성 부위는 목적한 영역내 존재하지 않는 서열을 함유할 수 있어서, 새로운 서열이 목적한 영역내로 도입된다. 이들 예에서, 비-상동성 서열은 일반적으로 50 내지 1,000개의 염기쌍(또는 이들 사이의 어떠한 정수 값) 또는 목적한 영역내 서열에 대해 상동성이거나 동일한 1,000개 이상의 염기쌍의 어떠한 수의 서열에 의해 플랭크(flank)된다. 다른 구현예에서, 공여체 서열은 제1 서열에 대해 비-상동성이며, 비-상동성 재조합 메카니즘에 의해 게놈내로 삽입된다.
"절단"은 DNA 분자의 공유결합성 골격의 파괴를 말한다. 절단은 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 일본쇄 절단 및 이본쇄 절단 둘다가 가능하며, 이본쇄 절단은 2개의 명백한 일본쇄 절단 현상의 결과로서 발생할 수 있다. DNA 절단은 평활 말단(blunt end) 또는 스태그된 말단(staggered end)을 생산할 수 있다. 특정의 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 표적화된 이본쇄 DNA 절단에 사용된다.
"절단 반-도메인"은 제2의 폴리펩타이드(동일하거나 상이한)와 함께 절단 활성(바람직하게는 이본쇄 절단 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 서열이다. 용어 "제1 및 제2의 절단 반-도메인;" "+ 및 - 절단 반-도메인" 및 "우측 및 좌측 절단 반-도메인"이 이량체화되는 절단 반-도메인의 쌍을 언급하기 위해 상호교환가능하게 사용된다.
"가공된 절단 반-도메인"은 변형되어 다른 절단 반-도메인(예를 들면, 다른 가공된 절단 반-도메인)과 절대 이종이량체(obligate heterodimer)를 형성하는 절단 반-도메인이다. 또한 이들의 전문이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 공보 2005/0064474, 20070218528, 20080131962 및 20110201055를 참고한다.
용어 "서열"은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 선형, 환형 또는 측쇄형이고 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있는 어떠한 길이의 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 용어 "공여체 서열"은 게놈내로 삽입되는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 공여체 서열은 예를 들면, 길이가 2 내지 100,000,000개 뉴클레오타이드(이들 사이 또는 이들 이상의 어떠한 정수 값), 바람직하게는 길이가 약 100 내지 100,000개 뉴클레오타이드(또는 이들 사이의 어떠한 값), 보다 바람직하게는 길이가 약 2000 내지 20,000개(또는 이들 사이의 어떠한 값)의 뉴클레오타이드 및 심지어 보다 바람직하게는 약 5 내지 15 kb(또는 이들 사이의 어떠한 값) 사이인 어떠한 길이일 수 있다.
"크로마틴"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조이다. 세포 크로마틴은 핵산, 주로 DNA, 및 히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질을 포함하는 단백질을 포함한다. 대부분의 진핵세포성 세포의 크로마틴은 뉴클레오솜(nucleosome)의 형태로 존재하며, 여기서, 뉴클레오솜 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4의 2개 각각을 포함하는 옥타머(octamer)와 연합된 DNA의 대략 150개 염기 쌍을 포함하고; 링커 DNA(유기체에 따라 다양한 길이를 지님)는 뉴클레오솜 코어 사이에 연장된다. 히스톤 H1의 분자는 링커 DNA와 유전적으로 연합된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "크로마틴"은 원핵 및 진핵 세포 둘 다의 세포 핵단백질의 모든 유형을 포함함을 의미한다. 세포 크로마틴은 염색체 및 에피소옴 크로마틴 둘 다를 포함한다.
"염색체"는 세포의 게놈 모두 또는 일부를 포함하는 크로마틴 복합체이다. 세포의 게놈은 흔히 핵형에 의해 특징화되며, 이는 세포의 게놈을 포함하는 모든 염색체의 수집품이다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피소옴"은 복제하는 핵산, 핵단백질 복합체 또는 세포의 염색체 핵형의 일부가 아닌 핵산을 포함하는 다른 구조이다. 에피소옴의 예는 플라스미드 및 특정의 바이러스 게놈을 포함한다.
"접근가능한 영역"은 핵산 속에 존재하는 표적 부위가 표적 부위를 인식하는 외인성 분자에 의해 결합될 수 있는 세포 크로마틴내 부위이다. 어떠한 특수 이론에 얽메임이 없이, 접근가능한 영역은 뉴클레오솜 구조내로 패키지되지 않는 것이다. 접근 가능한 영역의 명백한 구조는 흔히 화학적 및 효소적 프로브, 예를 들면, 뉴클레아제에 대한 이의 민감성으로 검출될 수 있다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합하기에 충분한 조건이 존재하는 한, 결합 분자가 결합할 핵산의 부위를 정의하는 핵산 서열이다.
"외인성" 분자는 일반적으로 세포내에 존재하지 않지만, 하나 이상의 유전, 생화학 또는 다른 방법에 의해 세포내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포내에서의 정상적인 존재"는 세포의 특수한 발달 단계 및 환경 조건과 관련하여 측정된다. 따라서, 예를 들면, 근육의 배아 발달 동안에만 존재하는 분자는 성체 근육 세포에 대하여 외인성 분자이다. 유사하게, 열 쇼크(heat shock)에 의해 도입된 분자는 비-열-쇼크된 세포에 대하여 외인성 분자이다. 외인성 분자는 예를 들면, 오작동하는 외인성 분자의 작용성 버전 또는 정상적으로 작용하는 내인성 분자의 오작동 버젼을 포함할 수 있다.
외인성 분자는 다른 것들 중에서도, 조합적 화학 공정에 의해 생성된 바와 같은 소분자, 또는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 상기 분자의 어떠한 변형된 유도체, 또는 하나 이상의 상기 분자를 포함하는 어떠한 복합체와 같은 거대 분자일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있고, 직쇄, 측쇄 또는 환형일 수 있으며; 어떠한 길이일 수 있다. 핵산은 이본체를 형성할 수 있는 것들, 및 삼본체-형성 핵산을 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 5,176,996 및 5,422,251를 참고한다. 단백질은 DNA-결합 단백질, 전사 인자, 크로마틴 리모델링 인자, 메틸화된 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 리컴비나제, 리가제, 토포이소머라제, 기라제 및 헬리카제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들면, 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산은 감염성 바이러스 게놈, 세포내로 도입된 플라스미드 또는 에피솜, 또는 일반적으로 세포 내에 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자를 세포내로 도입하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 지질-매개된 전달(즉, 중성 및 양성 지질을 포함하는 리포좀), 전기천공, 직접적인 주사, 세포 융합, 입자 충격(particle bombardment), 인산칼슘 동시-침전, DEAE-덱스트란-매개된 전달 및 바이러스 벡터-매개된 동시-침전을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 외인성 분자는 또한 외인성 분자와 동일한 유형의 분자일 수 있지만 세포가 기원하는 것과 상이한 종으로부터 기원할 수 있다. 예를 들면, 사람 핵산 서열은 마우스 또는 햄스터로부터 원래 기원한 세포주내로 도입될 수 있다. 외인성 분자를 식물 세포내로 도입하기 위한 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 원형질체 형질전환, 탄화규소(예를 들면, WHISKERSTM), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환, 지질-매개된 전달(즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는, 리포좀), 전기천공, 직접적인 주사, 세포 융합, 입자 충격(예를 들면, "유전자 총(gene gun)"을 사용함), 인산칼슘 동시-침전, DEAE-덱스트란-매개된 전달 및 바이러스 벡터-매개된 전달을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
대조적으로, "내인성" 분자는 특수한 환경 조건 하의 특수한 발단 단계에서 특수한 세포내에 일반적으로 존재하는 것이다. 예를 들면, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아의 게놈, 원형질체 또는 다른 기관, 또는 천연적으로 발생하는 에피소옴 핵산을 포함할 수 있다. 추가의 내인성 분자는 단백질, 예를 들면, 전사 인자 및 효소를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "외인성 핵산의 생성물"은 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 생성물 둘 다, 예를 들면, 전사 생성물(RNA와 같은 폴리뉴클레오타이드) 및 해독 생성물(폴리펩타이드) 둘 다를 포함한다.
"융합" 분자는 2개 이상의 소단위 분자가 바람직하게는 공유결합으로 연결된 분자이다. 소 단위 분자는 동일한 화학적 유형의 분자일 수 있거나, 상이한 화학적 유형의 분자일 수 있다. 융합 분자의 제1 유형의 예는 융합 단백질(예를 들면, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인과 하나 이상의 활성화 도메인 사이의 융합) 및 융합 핵산(예를 들면, 상기 기술된 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 제2 유형의 융합 분자의 예는 삼본체(triplex)-형성 핵산과 폴리펩타이드 사이의 융합체, 및 마이너 그로브 결합인자(minor groove binder)와 핵산 사이의 융합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
세포내에서 융합 단백질의 발현은 융합 단백질의 세포로의 전달로부터 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 세포로의 전달에 의해 생성될 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 전사되고, 전사체는 해독되어, 융합 단백질을 생성한다. 트랜스-스플라이싱(trans-splicing), 폴리펩타이드 절단 및 폴리펩타이드 연결이 또한 세포 내에서 단백질의 발현에 관여될 수 있다. 세포로 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 전달을 위한 방법은 또한 본 개시내용에 나타나 있다.
본 발명의 개시내용의 목적을 위한 "유전자"는 이러한 조절 서열이 암호화 및/또는 전사된 서열에 대해 근접하게 존재하는지의 여부에 상관없이, 유전자 생성물(상기 참고)을 암호화하는 DNA 영역, 및 또한 유전자 생성물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 터미네이터, 리보소옴 결합 부위 및 내부 리보소옴 도입 부위와 같은 해독 조절 서열, 인핸서, 사일런서(silencer), 인슐레이터(insulator), 경계부 요소(boundary element), 복제 오리진(replication origin), 매트릭스 부착 부위 및 유전자자리 조절 영역을 포함하나, 필수적으로 이에 한정되지 않는다.
"유전자 발현"은 유전자 속에 함유된 정보의 유전자 생성물내로의 전환을 말한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접적인 전사 생성물(예를 들면, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 어떠한 다른 유형의 RNA) 또는 mRNA의 해독에 의해 생산된 단백질일 수 있다. 유전자 생성물은 또한 캡핑(capping), 폴리아데닐화, 메틸화, 및 수정과 같은 공정에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들면, 메틸화, 아세틸화, 포스포릴화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조절(modulation)"은 유전자의 활성에 있어서의 변화를 말한다. 발현의 조절은 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 게놈 수정(예를 들면, 절단, 변경, 불활성화, 무작위 돌연변이)를 사용하여 발현을 조절할 수 있다. 유전자 불활성화는 본원에 기술된 바와 같은 시스템으로서 ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템을 포함하지 않는 세포와 비교하여 유전자 발현에 있어서의 어떠한 감소를 나타낸다. 따라서, 유전자 불활성화는 부분적이거나 완전할 수 있다.
"보호된" mRNA는, mRNA가 mRNA의 안정성 또는 해독을 증가시키는 일부 방식으로 변경된 것이다. 보호의 예는 25% 이하의 사이토딘의 교체 및 우리딘 잔기의 2-티오우리딘(s2U) 및 5-메틸사이티딘(m5C)으로의 교체의 사용을 포함한다. 수득되는 mRNA는 이의 변형되지 않은 대응물과 비교하여 면역원성이 거의 없고 보다 큰 안정성을 나타낸다. (참고:
Figure pct00001
et al. ((2012), Molecular Therapy, Vol. 16, No. 11, pages 1833-1844). 다른 변화는 소위 ARCA 캡(cap)의 첨가를 포함하며, 이는 시험관내 생산된 mRNA의 해독능을 증가시킨다(참고: 미국 특허 US7074596).
"목적한 영역"은 예를 들면, 유전자 내 또는 이와 근접한 유전자 또는 비-암호화 서열과 같은 세포 크로마틴의 어떠한 영역이며, 여기서, 이것은 외인성 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화된 재조합을 위해서일 수 있다. 목적한 영역은 염색체, 에피소옴, 세포소기관 게놈(예를 들면, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 예를 들면, 감염성 바이러스 게놈 속에 존재할 수 있다. 목적한 영역은 게놈의 암호화 영역내, 예를 들면, 리더 서열, 트레일러 서열(trailer sequence) 또는 인트론과 같은 전사된 비-암호화 영역내, 또는 전사되지 않은 영역내에, 암호화 영역의 상부 또는 하부에 존재할 수 있다. 목적한 영역은 길이가 단일 펩타이드 쌍만큼 작거나 2,000개 이하의 뉴클레오타이드 쌍, 또는 뉴클레오타이드 쌍의 어떠한 정수 값일 수 있다.
"진핵" 세포는 진균 세포(예를 들면, 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포 및 사람 세포(예를 들면, T-세포)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "작동적 연결" 및 "작동적으로 연결된"(또는 "작동가능하게 연결된")은 2개 이상의 성분(예를 들면, 서열 요소)의 병렬과 관련하여 상호교환적으로 사용되며, 여기서 상기 성분들은 성분들 둘 다가 정상적으로 작용하여 성분들 중 적어도 하나가 다른 성분들 중 적어도 하나에서 발휘되는 작용을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 배열된다. 예증 방식으로, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은 당해 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자들의 존재 또는 부재하에 대한 반응시 암호화 서열의 전사 수준을 조절하는 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 전사 조절 서열은 일반적으로 암호화 서열과 시스(cis) 방향으로 작동적으로 연결되지만, 이에 직접 근접하게 존재할 필요는 없다. 예를 들면, 인핸서는 이들이 연속적이지 않아도, 암호화 서열에 작동적으로 연결되는 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩타이드와 관련하여, 용어 "작동적으로 연결된"은 성분들 각각이 이것이 이렇게 연결되지 않았던 경우에서와 같이 다른 성분에 대한 연결시 동일한 작용을 수행하는 사실을 말한다. 예를 들면, ZFP, TALE 또는 Cas DNA-결합 도메인이 활성화 도메인에 융합된 융합 펩타이드와 관련하여, ZFP, TALE 또는 Cas DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인은 융합 펩타이드내에서, ZFP, TALE 또는 Cas DNA-결합 도메인 부위가 이의 표적 부위 및/또는 이의 결합 부위에 결합할 수 있으면서, 활성화 도메인이 유전자 발현을 상향조절할 수 있는 경우 작동적인 연결이다. ZFP, TALE 또는 Cas DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드의 경우, ZFP, TALE 또는 Cas DNA-결합 도메인 및 절단 도메인은 융합 폴리펩타이드내에서 ZFP, TALE 또는 Cas DNA-결합 도메인 부위가 이의 표적 부위 및/또는 이의 결합 부위에 결합할 수 있으면서 절단 도메인이 표적 부위의 부근에서 DNA를 절단할 수 있는 경우 작동적으로 연결된 상태이다.
단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 "작용성 단편"은 이의 서열이 완전한 길이의 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일하지 않지만, 여전히 완전한 길이의 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 작용을 보유하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산이다. 작용성 단편은 상응하는 천연 분자보다 더 적거나, 동일한 수의 잔기를 소유할 수 있고/있거나 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 작용(예를 들면, 암호화 작용, 다른 핵산에 하이브리드화하는 능력)을 측정하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 유사하게, 단백질 작용을 측정하는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드의 DNA-결팝 작용은 예를 들면, 필터-결합, 전기영동 이동성 이동(electrophoretic mobility-shift), 또는 면역침전 검정에 의해 측정될 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동으로 분석할 수 있다. (참고: 상기 Ausubel et al.). 다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력은 예를 들면, 둘다 유전적 및 생화학적인, 동시-면역침전, 2개-하이브리드 검정 또는 상보성에 의해 측정할 수 있다.
"벡터"는 표적 세포에 유전자 서열을 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 작제물", "발현 벡터" 및 "유전자 전달 벡터"는 목적한 유전자의 발현을 지시할 수 있고 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 어떠한 핵산 작제물을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝, 및 발현 벡터, 및 통합 벡터를 포함한다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용되며 사람 환자 및 비-사람 영장류와 같은 포유동물, 및 또한 토끼, 개, 고양이, 랫트(rat), 마우스, 및 다른 동물과 같은 실험 동물을 말한다. 따라서, 본원에 사용된 것으로서 용어 "대상체" 또는 "환자"는 본 발명의 줄기 세포가 투여될 수 있는 어떠한 포유동물 환자 또는 대상체를 의미한다. 본 발명의 대상체는 예를 들면, 신경 독소를 포함하는, 하나 이상의 화학 독소에 노출된 것들을 포함한다.
"줄기능(stemness)"은 줄기 세포-유사 방식으로 작용하는 어떠한 세포의 상대 능력, 즉, 어떠한 특수한 줄기 세포가 가질 수 있는 전체-, 다수-, 또는 올리고-효능 및 확장되거나 무한의 자가-재생 정도를 말한다.
뉴클레아제
전이유전자가 표적화된 방식으로 게놈내로 통합되도록 세포의 게놈의 절단을 위해 전이유전자 및 뉴클레아제를 수반하는 공여체 분자의 생체내 절단에 유용한, 조성물, 특히 뉴클레아제가 본원에 기술되어 있다. 특정의 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 천연적으로 발생한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 비-천연적으로 발생, 즉, DNA-결합 도메인 및/또는 절단 도메인 내에서 가공된다. 예를 들면, 천연적으로 존재하는 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 선택된 표적 부위(예를 들면, 동족 결합 부위(cognate binding site)보다 상이한 부위에 결합하도록 가공된 메가뉴클레아제)에 결합하도록 변경될 수 있다. 다른 구현예에서, 뉴클레아제는 이종 DNA-결합 및 절단 도메인(예를 들면, 아연 핑거 뉴클레아제; TAL-효과기 도메인 DNA 결합 단백질; 이종 절단 도메인을 지닌 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인)을 포함한다.
A. DNA-결합 도메인
특정의 구현예에서, 세포의 게놈의 생체내 절단 및/또는 표적화된 절단에 사용된 하나 이상의 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 아연 핑거 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 아연 핑거 단백질은 이것이 선택된 표적 부위에 결합하도록 가공된다는 점에서 비-천연적으로 발생한다. 예를 들면, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem.70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol.19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.10:411-416; 미국 특허 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 공보 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061를 참고하며, 이들 모두는 이들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
가공된 아연 핑거 결합 도메인은 천연적으로 존재하는 아연 핑거 단백질과 비교하여, 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 가공 방법은 합리적인 설계(rational design) 및 다양한 유형의 선택을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 합리적인 설계는 예를 들면, 삼본체(triplet)(또는 사본체(quadruplet) 뉴클레오타이드 서열 및 개개의 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이타베이스를 사용함을 포함하며, 여기서 각각의 삼본체 또는 사본체 뉴클레오타이드 서열은 삼본체 또는 사본체 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연합된다. 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된, 공동-소유의 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261을 참고한다.
파아지 디스플레이(phage display) 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는, 예시적인 선택 방법은 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 및 WO　98/37186; WO　98/53057; WO　00/27878; WO　01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다. 또한, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은 예를 들면, 공동-소유의 WO　02/077227에 기술되어 있다.
또한, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거된 아연 핑거 단백질은 예를 들면, 길이가 5개 이상인 아미노산의 링커를 포함하는 어떠한 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결시킬 수 있다. 또한, 길이가 6개 이상인 아미노산의 예시적인 링커 서열에 대해서는 미국 특허 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참고한다. 본원에 기술된 단백질은 단백질의 개개의 아연 핑거 사이의 적합한 링커의 어떠한 조합도 포함할 수 있다.
표적 부위; ZFP의 선택 및 융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 작제 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 미국 특허 　6,140,081; 5,789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; WO　95/19431; WO　96/06166; WO　98/53057; WO　98/54311; WO　00/27878; WO　01/60970 WO　01/88197; WO　02/099084; WO　98/53058; WO　98/53059; WO　98/53060; WO　02/016536 및 WO　03/016496에 기술되어 있다.
거의 어떠한 링커(스페이서)도 DNA-결합 도메인의 하나 이상의 성분(예를 들면, 아연 핑거)들 사이, 하나 이상의 DNA-결합 도메인들 사이 및/또는 DNA-결합 도메인과 작용성 도메인(예를 들면, 뉴클레아제) 사이에서 사용될 수 있다. 적합한 링커 서열의 비-제한적인 예는 미국 특허 8,772,453; 7,888,121; 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949; 및 미국 공보 20090305419; 20150064789 및 20150132269를 포함한다. 따라서, 본원에 기술된 단백질은 개개의 DNA-결합 성분들 사이 및/또는 DNA-결합 도메인과 본원에 기술된 조성물의 작용성 도메인 사이의 적합한 링커의 어떠한 조합도 포함할 수 있다.
B. 절단 도메인
어떠한 적합한 절단 도메인도 본원에 기술된 바와 같은 DNA-결합 도메인에 작동적으로 연결되어 뉴클레아제를 형성할 수 있다. 절단 도메인은 DNA-결합 도메인, 예를 들면, 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제로부터의 절단 도메인에 대해 이종성일 수 있다. 이종성 절단 도메인은 어떠한 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 기원할 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 호밍 엔도뉴클레아제(homing endonuclease)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; and Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388을 참고한다. DNA를 절단하는 추가의 효소는 공지되어 있다(예를 들면, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코쿠스 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한 Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993를 참고한다). 하나 이상의 이들 효소(또는 이의 작용성 단편)은 절단 도메인 및 절단 반-도메인의 공급원으로부터 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 반-도메인은 상기 설정된 바와 같이, 절단 활성을 위한 이량체화를 필요로 하는 어떠한 뉴클레아제 또는 이의 일부로부터 기원할 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 반-도메인을 포함하는 경우 2개의 융합 단백질이 절단에 요구된다. 또한, 2개의 절단 반-도메인을 포함하는 단일의 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 반-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 이의 작용성 단편)으로부터 기원할 수 있거나, 각각의 절단 반-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제(또는 이의 작용성 단편)으로부터 기원할 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위는 서로에 대해 바람직하게 배치됨으로써, 이들의 각각의 표적 부위에 대한 2개의 융합 단백질의 결합이, 절단 반-도메인이 예를 들면, 이량체화에 의해 작용성 절단 도메인을 형성하도록 하는 서로에 대해 공간적 배향으로 절단 반-도메인을 위치시킨다. 따라서, 특정의 구현예에서, 표적 부위의 근처의 가장자리는 5 내지 8개의 뉴클레오타이드 또는 15 내지 18개의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 그러나, 특정한 정수(integral number)의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍들이 2개의 표적 부위 사이(예를 들면, 2 내지 50개의 뉴클레오타이드 쌍들 이상)에 개입할 수 있다. 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위들 사이에 놓인다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 많은 종에 존재하며 DNA에 대해 서열-특이적인 결합(제한 부위에서), 및 결합 부위에서 또는 당해 부위 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정의 제한 효소(예를 들면, IIS 유형)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하며 별개의 결합 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들면, IIS 유형 효소 Fok　I은 하나의 쇄 상의 이의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오타이드 및 다른 것에서 이의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오타이드에서 DNA의 이본쇄 절단을 촉매한다. 예를 들면, 미국 특허 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 및 Li et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982를 참고한다. 따라서, 일 구현예에서, 융합 단백질은 가공되거나 가공되지 않을 수 있는, 적어도 하나의 IIS 유형 제한 효소 및 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인으로부터의 절단 도메인(또는 절단 반-도메인)을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적인 IIS 유형 제한 효소는 FokI이다. 당해 특수 효소는 이량체로서 활성이다. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575. 따라서, 본 개시내용의 목적을 위해, 개시된 융합 단백질에서 사용된 Fok　I 효소의 부위는 절단 반-도메인으로 고려된다. 따라서, 아연 핑거-Fok　I 융합체를 사용한 세포 서열의 표적화된 이본쇄 절단 및/또는 표적화된 교체를 위해, 각각 FokI 절단 반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 촉매적으로 활성인 절단 도메인을 재구성하는데 사용될 수 있다. 또한, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 Fok　I 절단 반-도메인을 포함하는 단일 폴리펩타이드 분자를 또한 사용할 수 있다. 아연 핑거-Fok　I 융합체를 사용한 표적화된 절단 및 표적화된 서열 변경을 위한 매개변수는 또한 본 개시내용에서 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 반-도메인은 절단 활성을 보유하거나, 다량체화(예를 들면, 이량체화)하여 작용성 절단 도메인을 형성하는 능력을 보유하는 단백질의 어떠한 부위일 수 있다.
예시적인 IIS 유형의 제한 효소는 이의 전문이 본원에 포함된 미국 특허 7,888,121에 기술되어 있다. 추가의 제한 효소는 또한 별도의 결합 및 절단 도메인을 함유하며, 이들은 본 개시내용에 의해 고려된다. 예를 들면, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420을 참고한다.
특정의 구현예에서, 절단 도메인은 예를 들면, 이의 모든 개시내용이 본원에 이의 전문으로서 참고로 포함된, 미국 특허 7,914,796; 8,034,598 및 8,623,618에 기술된 바와 같은, 단독이량체화를 최소화하거나 예방하는 하나 이상의 가공된 절단 반-도메인(또한 이량체화 도메인 돌연변이체로 언급됨)을 포함한다. FokI의 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538번 위치에서의 아미노산 잔기는 FokI 절단 반-도메인의 이량체화에 영향을 미치는 모든 표적이다.
절대 이종이량체(obligate heterodimer)를 형성하는 FokI의 예시적인 가공된 절단 반-도메인은, 제1의 절단 반-도메인이 FokI의 490 및 538번 위치에서의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하고 제2의 절단 반-도메인이 486 및 499번 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함한다.
따라서, 일 구현예에서, 490번에서의 돌연변이는 Glu(E)를 Lys(K)로 교체하고; 538번에서의 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 교체하며; 486번에서의 돌연변이는 Gln(Q)를 Glu(E)로 교체하며; 499번 위치에서의 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 교체한다. 특이적으로, 본원에 기술된 가공된 절단 반-도메인은 하나의 절단 반-도메인에서 490(EK) 및 538(I→K)번 위치를 돌연변이시켜 "E490K:I538K"로 지정된 가공된 절단 반-도메인을 생산하고 486(QE) 및 499(IL)번 위치를 다른 절단 반-도메인으로 돌연변이시켜 "Q486E:I499L"로 지정된 가공된 절단 반-도메인을 형성함으로써 제조하였다. 본원에 기술된 가공된 절단 반-도메인은 절대 이종이량체 돌연변이체이며, 여기서 비정상의 절단이 최소화되거나 페지된다. 예를 들면, 미국 특허 공보 2008/0131962를 참고하며, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 이의 전문이 참고로 포함된다. 특정의 구현예에서, 가공된 절단 반-도메인은 486, 499 및 496번(야생형 FokI에 대해 번호매김)에서의 돌연변이, 예를 들면, 486번 위치에서 야생형 Gln(Q) 잔기를 Glu(E) 잔기로, 499번 위치에서 야생형 Iso(I) 잔기를 Leu(L) 잔기로 및 496번 위치에서 야생형 Asn(N) 잔기를 Asp(D) 또는 Glu(E) 잔기로 교체한 돌연변이(또한 각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인으로 언급됨)를 포함한다. 다른 구현예에서, 가공된 절단 반-도메인은 490, 538 및 537번(야생형 FokI에 대해 번호매김)에서의 돌연변이, 예를 들면, 490번 위치에서 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 538번 위치에서 야생형 Iso(I) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 및 537번 위치에서 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기(또한 각각 "KKK" 및 "KKR" 도메인으로 언급됨)로 교체한 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 가공된 절단 반-도메인은 490 및 537번(야생형 FokI에 대해 번호매김)에서의 돌연변이, 예를 들면, 490번 위치에서 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로 및 537번 위치에서 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기(또한 각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인으로서 언급됨)로 교체한 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 7,914,796; 8,034,598 및 8,623,618을 참고한다. 다른 구현예에서, 가공된 절단 반 도메인은 "샤키(Sharkey)" 및/또는 "사키" 돌연변이를 포함한다(참고: Guo et al, (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107).
본원에 기술된 가공된 절단 반-도메인은 어떠한 적합한 방법을 사용하여, 예를 들면, 미국 특허 공보 7,888,121; 7,914,796; 8,034,598 및 8,623,618에 기술된 바와 같은 야생형 절단 반-도메인(Fok I)의 부위지시된 돌연변이에 의해 제조할 수 있다.
또한, 뉴클레아제는 소위 "스플릿-효소(split-enzyme)" 기술을 사용하여 핵산 표적 부위에서 생체내에서 조립될 수 있다(참고: 예를 들면, 미국 특허 공보 20090068164). 이러한 스플릿 효소의 성분은 별도의 발현 작제물에서 발현될 수 있거나, 하나의 개방 판독 프레임으로 연결될 수 있으며, 여기서 개개의 성분은 예를 들면, 자가-절단 2A 펩타이드 또는 IRES 서열에 의해 분리된다. 성분은 개개의 아연 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.
뉴클레아제는 예를 들면, WO 2009/042163 및 20090068164에 기술된 효모-계 염색체 시스템에서, 사용 전에 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 뉴클레아제의 발현은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터, 예를 들면, 라피노즈 및/또는 갈락토즈의 존재하에서 활성화(탈-억제)되고 글루코즈의 존재하에서 억제되는 갈락토키나제 프로모터의 조절하에 있을 수 있다.
본원에 기술된 뉴클레아제(들)은 표적 부위에서 하나 이상의 이본쇄 및/또는 일본쇄 절단부를 제조할 수 있다. 특정의 구현예에서, 뉴클레아제는 촉매적으로 불활성인 절단 도메인(예를 들면, FokI 및/또는 Cas 단백질)을 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 9,200,266; 8,703,489 및 Guillinger et al. (2014) Nature Biotech. 32(6):577-582를 참고한다. 촉매적으로 불활성인 절단 도메인은 촉매적으로 활성인 도메인과 함께, 니카제로서 작용하여 일본쇄 절단부를 제조한다. 따라서, 2개의 니카제가 함계 사용되어 특이적인 영역에서 이본쇄 절단부를 제조할 수 있다. 추가의 니카제가 당해 분야, 예를 들면, McCaffery et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(2):e11. doi: 10.1093/nar/gkv878. Epub 2015 Oct 19에 또한 공지되어 있다.
표적 부위
위에서 상세히 기술한 바와 같이, DNA 도메인은 선택된 어떠한 서열에 결합하도록 가공될 수 있다. 가공된 DNA-결합 도메인은 천연적으로 존재하는 DNA-결합 도메인과 비교하여 신규의 결합 특이성을 가질 수 있다. 특정의 구현예에서, DNA-결합 도메인은 BCL11A 인핸서 서열내의 서열에 결합하는데, 예를 들면, 표적 부위(전형적으로 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21개 이상의 염기쌍)는 표 1에 나타낸 바와 같이 BCL11A 인핸서 서열(예를 들면, +58)내의 DNAseI 고감작 부위내 서열에 결합하는 DNA-결합 도메인을 포함하는, BCL11A의 엑손 2와 엑손 3 사이에 존재한다. 가공 방법은 예를 들면, 합리적인 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 합리적인 설계는 예를 들면, 삼본체(또는 사본체) 뉴클레오타이드 서열 및 개개의 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이타베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 삼본체 또는 사본체 뉴클레오타이드 서열은 특수한 삼본체 또는 사본체 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연합된다. 예를 들면, 전문이 본원에 참고로 포함된, 공동-소유의 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261을 참고한다. TAL-효과기 도메인의 합리적인 설계가 또한 수행될 수 있다. 예를 들면, 미국 공보 20110301073을 참고한다.
파아지 디스프레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는, DNA-결합 도메인에 적용가능한 예시적인 선택 방법은 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 및 WO　98/37186; WO　98/53057; WO　00/27878; WO　01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다. 또한, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은 예를 들면, 공동-소유의 WO　02/077227에 기술되어 있다.
표적 부위의 선택; 융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 작제를 위한 뉴클레아제 및 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 이의 전문이 본원에 참고로 포함된, 미국 특허원 공보 20050064474 및 20060188987에 상세히 기술되어 있다.
또한, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, DNA-결합 도메인(예를 들면, 다중-핑거된 아연 핑거 단백질) 및/또는 DNA-결합 도메인(들) 및 작용성 도메인(들)의 융합체는 예를 들면, 5개 이상의 아미노산의 링커를 포함하는, 어떠한 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결시킬 수 있다. 미국 특허 8,772,453; 7,888,121(예를 들면, "ZC" 링커); 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949; 미국 공보 20090305419) 및 20150064789. 본원에 기술된 단백질은 단백질의 개개의 DNA-결합 도메인 사이의 적합한 링커의 어떠한 조합도 포함할 수 있다. 또한, 미국 특허 8,586,526를 참고한다.
공여체
특정의 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 BCL11A 인핸서 영역-결합 분자를 사용하는 세포의 게놈내로의 외인성 서열의 뉴클레아제-매개된 표적화된 통합에 관한 것이다. 위에 나타낸 바와 같이, 외인성 서열(또한 "공여체 서열" 또는 "공여체" 또는 "전이유전자"라고 불림)의 삽입은, 예를 들면 특이적인 영역의 결실 및/또는 돌연변이 유전자의 교정 또는 야생형 유전자의 증가된 발현을 위한 것이다. 공여체 서열이 이것이 위치하는 게놈 서열과 전형적으로 동일하지 않다는 것은 매우 명백할 것이다. 공여체 서열은 목적한 위치에서 효율적인 HDR을 허용하기 위해 2개의 상동성 영역에 의해 플랭크된 비-상동성 서열을 함유할 수 있거나 비-상동성 지시된 보수 메카니즘을 통해 통합될 수 있다. 또한, 공여체 서열은 세포 크로마틴에서 목적한 영역에 대해 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 공여체 분자는 세포 크로마틴에 대해 수개의 불연속적인 상동성 영역을 함유할 수 있으며, 예를 들면, 본원에 기술된 뉴클레아제 중의 하나에 의해 유도된 DBS의 보수를 위한 기질로서 사용되는 경우 Bcl11a 인핸서 영역(또는 이의 단편)의 결실을 초래한다. 또한, 목적한 영역내에 일반적으로 존재하지 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열은 공여체 핵산 분자에 존재할 수 있으며 목적한 영역내 서열에 대해 상동성인 영역에 의해 플랭크될 수 있다.
삽입을 위한 폴리뉴클레오타이드는 또한 "외인성" 폴리뉴클레오타이드, "공여체" 폴리뉴클레오타이드 또는 분자 또는 "전이유전자"로서 언급될 수 있다. 공여체 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA, 일본쇄 및/또는 이본쇄일 수 있으며 선형 또는 환형으로 세포내에 도입될 수 있다. 예를 들면 미국 특허 공보 20100047805 및 20110207221을 참고한다. 공여체 서열(들)은 바람직하게는 DNA MC내에 함유될 수 있으며, 이는 환형 또는 선형으로 세포내에 도입될 수 있다. 선형으로 도입되는 경우, 공여체 서열의 말단은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 보호(예를 들면, 엑소뉴클레오라이틱 분해(exonucleolytic degradation)로부터)될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오타이드 잔기를 선형 분자의 3' 말단에 가하고/가하거나 자가-상보성 올리고뉴클레오타이드를 말단의 한쪽 또는 양쪽에 연결시킬 수 있다. 예를 들면, Chang et al. (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889를 참고한다. 붕해로부터 외인성 폴리뉴클레오타이드를 보호하는 추가의 방법은 말단 아미노 그룹(들)의 첨가 및 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 개질된 뉴클레오타이드간 연결의 사용을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이본쇄 형태로 도입되는 경우, 공여체는 하나 이상의 뉴클레아제 표적 부위, 예를 들면, 세포 게놈내로 통합될 전이유전자를 플링크하는 뉴클레아제 표적 부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 공보 20130326645를 참고한다.
폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, 복제 오리진, 프로모터 또는 항생제 내성을 암호화하는 유전자와 같은 추가의 서열을 갖는 벡터 분자의 부분으로서 세포내로 도입될 수 있다. 더욱이, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 네이키드 핵산(naked nucleic acid)으로서, 리포좀 또는 폴록사머와 같은 제제와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결함이 있는 렌티바이러스(IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
특정의 구현예에서, 이본쇄 공여체는 길이가 1kb보다 큰, 예를 들면, 2 내지 200kb, 2 내지 10kb(또는 이들 사이의 어떠한 값)인 서열(예를 들면, 암호화 서열, 또한 전이유전자로 언급됨)을 포함한다. 이본쇄 공여체는 또한 예를 들면, 적어도 하나의 뉴클레아제 표적 부위를 포함한다. 특정의 구현예에서, 공여체는 예를 들면, ZFN 또는 TALEN의 쌍에 대해 적어도 2개의 표적 부위를 포함한다. 전형적으로, 뉴클레아제 표적 부위는 전이유전자의 절단을 위해, 전이유전자 서열의 외부, 예를 들면, 전이유전자 서열에 대해 5' 및/또는 3'에 존재한다. 뉴클레아제 절단 부위(들)은 어떠한 뉴클레아제(들)일 수 있다. 특정의 구현예에서, 이본쇄 공여체 속에 함유된 뉴클레아제 표적 부위(들)은 절단된 공여체가 상동성-독립된 방법을 통해 통합되어 있는 내인성 표적을 절단하는데 사용된 동일한 뉴클레아제(들)에 대한 것이다.
공여체는 일반적으로 삽입됨으로써 이의 발현은 통합 부위에서 내인성 프로모터, 즉, 공여체가 삽입되는 내인성 유전자의 발현을 구동하는 프로모터(예를 들면, 글로빈, AAVS1 등)에 의해 구동된다. 그러나, 공여체가 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들면 구성성 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적인 프로모터를 포함할 수 있음은 명백할 것이다.
공여체 분자는 내인성 유전자내로 삽입됨으로써 내인성 유전자의 모두, 일부가 발현되거나, 또는 발현되지 않도록 할 수 있다. 다른 구현예에서, 전이유전자(예를 들면, 글로빈 암호화 서열의 존재 또는 부재하에)는 어떠한 내인성 유전자자리, 예를 들면 안전한-하버 유전자자리(safe-harbor locus)내로 통합된다. 예를 들면, 미국 특허 공보 20080299580; 20080159996 및 201000218264를 참고한다.
또한, 발현에 필요하지 않다고 해도, 외인성 서열은 또한 전사 또는 해독 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보소옴 도입 부위, 2A 펩타이드 및/또는 폴리아데닐화 시그날을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 공여체 서열에 수반된 전이유전자는 PCR과 같은 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 플라스미드, 세포 또는 다른 공급원으로부터 분리할 수 있다. 사용하기 위한 공여체는 환형 슈퍼코일된(circular supercoiled), 환형 이완된(circular relaxed), 선형 등을 포함하는, 다양한 유형의 위상을 포함할 수 있다. 또한, 이들은 표준 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 공여체는 메틸화될 수 있거나 메틸화를 결여할 수 있다. 공여체는 세균 또는 효모 인공 염색체(BAC 또는 YAC)의 형태일 수 있다.
본원에 기술된 이본쇄 공여체 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 비-천연 염기 및/또는 골격을 포함할 수 있다. 특히, 메틸화된 사이토신을 지닌 공여체 분자의 삽입은 목적한 영역내에서 전사 정지(transcriptional quiescence)의 상태를 달성하기 위해 본원에 기술된 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
외인성(공여체) 폴리뉴클레오타이드는 어떠한 목적한 서열(외인성 서열)을 포함할 수 있다. 예시적인 외인성 서열은 어떠한 폴리펩타이드 암호화 서열(예를 들면, cDNA), 프로모터 서열, 인핸서 서열, 에피토프 태그(epitope tag), 마커 유전자, 절단 효소 인식 부위 및 다양한 유형의 발현 작제물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 마커 유전자는 항생제 내성(예를 들면, 암피실린 내성, 네오마이신 내성, G418 내성, 푸로마이신 내성)을 매개하는 단백질을 암호화하는 서열, 착색된 또는 형광성 또는 발광성 단백질(예를 들면, 녹색 형광성 단백질, 향상된 녹색 형광성 단백질, 적색 형광성 단백질, 루시퍼라제), 및 향상된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질(예를 들면, 디하이드로폴레이트 리덕타제)을 암호화하는 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 에피토프 태그는 예를 들면, FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 어떠한 검출가능한 아미노산 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 외인성 서열(전이유전자)은 항생제, 항원, 효소, 수용체(세포 표면 또는 핵), 호르몬, 림포카인, 사이토킨, 리포터 폴리펩타이드, 성장 인자, 및 상기 중 어느 것의 작용성 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 세포내에서 이의 발현이 요구되는 어떠한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 암호화 서열은 예를 들면, cDNA일 수 있다.
예를 들면, 외인성 서열은 다음의 유전 질환 중의 어느 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 유전 질환을 갖는 대상체에서 결여되거나 작용하지 않는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다: 연골무형성증, 색맹, 산 말타제 결핍증, 아데노신 데아미나제 결핍증(OMIM No.102700), 부신백질이영양증, 아이카르디 증후군(aicardi syndrome), 알파-1 안티프립신 결핍증, 알파-지중해빈혈, 안드로겐 무감성 증후군(androgen insensitivity syndrome), 파퍼트 증후군(apert syndrome), 부정맥유발성우심실이형증(arrhythmogenic right ventricular, dysplasia), 원발성면역부전증후군, 바쓰 증후군(barth syndrome), 베타-지중해빈혈, 블루 러버 블렙 너부스 증후군(blue rubber bleb nevus syndrome), 카나반병(canavan disease), 만성 육아종병(CGD), 묘명 증후군(cri du chat syndrome), 낭성 섬유증, 더컴병(dercum's disease), 외배엽 형성이상(ectodermal dysplasia), 판코니 빈혈(fanconi anemia), 진행성 피브로디스플라시아오시피칸스(fibrodysplasiaossificans progressive), 취약 X 증후군(fragile X syndrome), 갈락토스혈증(galactosemis), 고셰병(Gaucher's disease), 일반화된 강글리오사이드 축적증(generalized gangliosidoses)(예를 들면, GM1), 혈색소증, 베타-글로빈의 6번째 코돈내 헤모글로빈C 돌연변이(HbC), 혈우병, 헌팅턴병(Huntington's disease), 후를러 증후군(Hurler Syndrome), 저인산증, 클라인플레터 증후군(Klinefleter syndrome), 크랩스병(Krabbes Disease), 랑거-기디온증후군(Langer-Giedion Syndrome), 백혈구부착결핍증(LAD, OMIM No. 116920), 백질이영양증, 긴 QT 증후군(long QT syndrome), 마판 증후군(Marfan syndrome), 뫼비우스 증후군(Moebius syndrome), 점액다당류증(MPS), 과슬개증후군(nail patella syndrome), 콩팥기원요붕증(nephrogenic diabetes insipdius), 신경섬유종증, 니만-픽병(Neimann-Pick disease), 불완전 골형성증, 포르피린증, 프래더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome), 조로증, 프로테우스 증후군(Proteus syndrome), 망막아세포종, 레트 증후군(Rett syndrome), 루비스타인-타이비 증후군(Rubinstein-Taybi syndrome), 산필립포증후군(Sanfilippo syndrome), 중증 복합형 면역부전증(SCID), 샤크만 증후군(Shwachman syndrome), 겸상 적혈구 질환(sickle cell anemia), 스미스-마제니스 증후군(Smith-Magenis syndrome), 스티클러 증후군(Stickler syndrome), 테이-삭스병(Tay-Sachs disease), 저혈소판 요골 무형성(Thrombocytopenia Absent Radius: TAR) 증후군, 트레처 콜린스 증후군(Treacher Collins syndrome), 삼염색체, 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 터너 증후군(Turner's syndrome), 요소 회로 질환, 폰 힙펠-린도우병(von Hippel-Landau disease), 바르덴부르크 증후군(Waardenburg syndrome), 윌리암스 증후군(Williams syndrome), 윌슨병(Wilson's disease), 비스코트 올드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), X-연관 림프증식성 질환(X-linked lymphoproliferative syndrome)(XLP, OMIM No. 308240).
표적화된 통합에 의해 치료될 수 있는 추가의 예시적인 질환은 후천성 면역결핍증, 리소좀축적병(lysosomal storage disease)(예를 들면, 고세병, GM1, 파브리병(Fabry disease) 및 테이-삭스 병(Tay-Sachs disease)), 무코폴리사카히도시스(mucopolysaccahidosis)(예를 들면, 헌터병(Hunter's disease), 후를러병), 혈색소병증(예를 들면, 겸상 적혈구 질환, HbC, α-지중해빈혈, β-지중해빈혈) 및 혈우병을 포함한다.
특정의 구현예에서, 외인성 서열은 마커 유전자(상기 기술됨)를 포함함으로써, 표적화된 통합을 겪은 세포의 선택 및 추가의 작용능을 암호화하는 연결된 서열을 선택하도록 할 수 있다. 마커 유전자의 비-제한적인 예는 GFP, 약물 선택 마커(들) 등을 포함한다.
삽입될 수 있는 추가의 유전자 서열은 예를 들면, 돌연변이된 서열을 교체하기 위한 야생형 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 야생형 인자 IX 유전자 서열은 유전자의 내인성 카피가 돌연변이되는 줄기 세포의 게놈내로 삽입될 수 있다. 야생형 카피는 내인성 유전자자리에서 삽입될 수 있거나, 대안적으로 안전한 하버 유전자자리에 대해 표적화될 수 있다.
본 명세서의 교시에 따른 이러한 발현 카세트의 작제는 분자 생물학 분야에 잘 공지된 방법론을 이용한다(참고: 예를 들면, Ausubel 또는 Maniatis). 전이유전자 동물을 생성하기 위한 발현 카세트의 사용 전에, 선택된 조절 성분과 관련된 스트레스-유도인자에 대한 발현 카세트의 반응성은 발현 카세트를 적합한 세포주(예를 들면, 원시 세포(primary cell), 형질전환된 세포, 또는 무한증식 세포주)내로 도입시킴으로써 시험할 수 있다.
또한, 발현에 필요하지 않다고 해도, 외인성 서열은 또한 전사 또는 해독 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보소옴 도입 부위, 2A 펩타이드 및/또는 폴리아데닐화 시그날을 암호화하는 서열일 수 있다. 또한, 목적한 유전자의 조절 요소를 리포터 유전자에 작동적으로 연결시켜 키메라 유전자(예를 들면, 리포터 발현 카세트)를 생성할 수 있다.
비-암호화 핵산 서열의 표적화된 삽입이 또한 달성될 수 있다. 안티센스 RNA, RNAi, shRNA 및 마이크로 RNA(miRNA)를 암호화하는 서열을 또한 표적화된 삽입에 사용할 수 있다.
추가의 구현예에서, 공여체 핵산은 추가의 뉴클레아제 설계를 위한 특이적인 표적 부위인 비-암호화 서열을 포함할 수 있다. 후속적으로, 추가의 뉴클레아제는 원래의 공여체 분자가 절단되어 목적한 다른 공여체 분자의 삽입으로 변형되도록 세포내에서 발현될 수 있다. 이러한 방식으로, 공여체 분자의 반복된 통합이 생성되어 특수한 목적 유전자자리에서 또는 안전한 하버 유전자자리에서 특징 스태킹(trait stacking)을 허용할 수 있다.
전달
본원에 기술된 뉴클레아제(표 1), 이들 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 공여체 폴리뉴클레오타이드 및 본원에 기술된 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드를암호화하는 조성물을 어떠한 적합한 방식으로 어떠한 세포형내에 시험관내 또는 생체외 전달할 수 있다.
적합한 세포는 진핵 세포(예를 들면, 동물) 및 원핵 세포 및/또는 세포주를 포함한다. 이러한 세포 또는 이러한 세포로부터 생성된 세포주의 비-제한적 예는 COS, CHO(예를 들면, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (예를 들면, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), 및 perC6 세포 및 또한 스포도프테라푸기페르다(Spodopterafugiperda)(Sf)와 같은 곤충 세포, 또는 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia) 및 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)와 같은 진균 세포를 포함한다. 특정의 구현예에서, 세포주는 CHO, MDCK 또는 HEK293 세포주이다. 적합한 세포는 또한 예로써, 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포와 같은 줄기 세포를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 뉴클레아제를 전달하는 방법은 예를 들면, 미국 특허 6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824에 기술되어 있으며, 이들 모두의 개시내용은 이들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본원에 기술된 뉴클레아제 및/또는 공여체 작제물은 또한 본원에 기술된, 하나 이상의 ZFN(들)을 암호화하는 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 전달할 수 있다. 플라미스드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노-관련 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 벡터 시스템도 사용할 수 있다. 또한, 이이 전문이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824를 참고한다. 더욱이, 이들 벡터 중 어느 것도 치료가 요구되는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있음이 명백할 것이다. 따라서, 하나 이상의 뉴클레아제 및 공여체 작제물이 세포내로 도입되는 경우, 뉴클레아제 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터(DNA MC(들))에 수반될 수 있다. 다수의 벡터가 사용될 수 있으며, 각각의 벡터는 하나 또는 다수의 뉴클레아제 및/또는 공여체 작제물을 포함할 수 있다. 통상의 바이러스 및 비-바이러스-계 유전자 전달 방법을 사용하여 세포(예를 들면, 포유동물 세포) 및 표적 조직 내에 뉴클레아제 및/또는 공여체 작제물을 암호화하는 핵산을 도입시키는데 사용할 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 또는 RNA 플라스미드, DNA MC, 네이키드 핵산(naked nucleic acid), 및 리포좀 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클로 복합체화된 핵산을 포함한다. 적합한 비-바이러스 벡터는 InCellArt(프랑스)로부터 상업적으로 이용가능한 벡터를 포함하는, 나노탁시스 벡터(nanotaxis vector)를 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이는 세포내로 전달된 후 에피소옴 또는 통합된 게놈을 가진다. 가공된 DNA-결합 단백질 및 이들 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질의 생체내 전달의 고찰을 위해서는, 예를 들면, Rebar (2004) Expert Opinion Invest. Drugs 13(7):829-839; Rossi et al. (2007) Nature Biotech. 25(12):1444-1454 및 또한 Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler 및 Bohm (eds.) (1995); 및 Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)와 같은 일반적인 유전자 전달 참고문헌을 참고한다.
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 전기천공, 지질감염, 미세주사, 바이오리스틱(biolistic), 바이로솜(virosome), 리포좀(liposome), 면역리포좀, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA(naked DNA), 인공 비리온, 및 DNA의 제제-향상된 흡수를 포함한다. 예를 들면 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 사용하는 소노포레이션(sonoporation)을 핵산의 전달을 위해 또한 사용할 수 있다.
추가의 예시적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(독일 콜로인 소재), Maxcyte, Inc.(매릴랜드주 록빌 소재), BTX Molecular Delivery Systems(매사츄세츠주 홀리스톤 소재) 및 Copernicus Therapeutics Inc.(참고: 예를 들면 US6008336)이 제공하는 것들을 포함한다. 지질감염은 예를 들면, 미국 특허 5,049,386; 4,946,787; 및 4,897,355에 기술되어 있으며 지질감염 시약은 상업적으로 시판된다(예를 들면, TransfectamTM 및 LipofectinTM). 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 수용체-인식 지질감염에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024의 것들을 포함한다.
면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포좀을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조는 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다(참고: 예를 들면, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 미국 특허 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787).
추가의 전달 방법은 EnGeneIC 전달 비히클(EDV) 내로 전달될 핵산의 패키징의 사용을 포함한다. 이들 EDV는 이특이적인 항체를 사용하여 표적 조직내로 특이적으로 전달되며, 여기서 항체의 하나의 아암(arm)은 표적 조직에 대해 특이성을 갖고 다른 것은 EDV에 대해 특이성을 갖는다. 항체는 EDV를 표적 세포로 가져온 후 EDV는 세포내이입(endocytosis)을 통해 세포내로 도입된다. 일단 세포내에 도입되면, 내용물이 방출된다(참고: MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).
가공된 ZFP, TALE 및/또는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스계 시스템의 사용은 체내에서 특이적인 세포에 대해 바이러스를 표적화하고 바이러스 페이로드(payload)를 핵으로 트래피킹(trafficking)하기 위한 고도로 발달된 공정의 장점을 취한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접 투여될 수 있거나(생체내) 이들은 시험관내에서 세포를 치료하기 위해 사용될 수 있으며 변형된 세포가 환자에게 투여된다(생체외). ZFP의 전달을 위한 통상의 바이러스계 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련, 박시니아 및 헤르페스 단성 바이러스 벡터(herpes simplex virus vector)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 숙주 게놈내 통합은 흔히 삽입된 전이유전자의 장기간 발현을 생성하는, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-관련 바이러스 유전자 전달 방법을 사용하여 가능하다. 또한, 고 형질도입 효능이 많은 상이한 세포형 및 표적조직에서 관찰되어 왔다.
레트로바이러스의 경향성은 외부 엔벨로브 단백질을 도입하고, 표적 세포의 잠재적인 표적 집단을 확장시킴으로써 변경시킬 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입시키거나 감염시켜 전형적으로 고 바이러스 역가(titer)를 생산하는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 의존한다. 레트로바이러스 벡터는 6 내지 10kb 이하의 외부 서열에 대해 패키징 용량을 갖는 시스-작용성 긴 말단 반복물로 구성된다. 최소의 시스-작용성 LTR이 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이는 이후 치료제를 표적 세포내로 통합시켜 연구적인 전이유전자 발현을 제공하는데 사용된다. 광범위하게 사용된 레트로바이러스 벡터는 쥐 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus: GaLV), 시미안 면역결핍성 바이러스(Simian Immunodeficiency virus: SIV), 사람 면역결핍성 바이러스(HIV), 및 이의 조합을 기반으로 하는 것들을 포함한다(참고: 예를 들면, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol.63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).
일시적인 발현이 바람직한 적용에서, 아데노바이러스계 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스계 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효능을 가질 수 있으며 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터를 사용하여, 고 역가 및 고 수준의 발현을 수득하여 왔다. 이러한 벡터는 비교적 단순한 시스템에서 다량으로 생산될 수 있다. 아데노-관련 바이러스("AAV") 벡터가 또한 예를 들면, 핵산 및 펩타이드의 시험관내 생산시, 및 생체내 및 생체외 유전자 치료요법 과정을 위해, 표적 핵산을 사용하여 세포를 형질도입하는데 사용된다(참고: 예를 들면, West et al., Virology 160:38-47 (1987); U.S. Patent No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). 재조합체 AAV 벡터의 작제는 미국 특허 5,173,414; Tratschin et al., Mol . Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)에 기술되어 있다.
적어도 6개의 바이러스 벡터 시도가 임상 시험에서 유전자 전달에 이용가능하며, 이는 형질도입 제제를 생성하기 위해 헬퍼 세포주 내로 삽입된 유전자에 의한 결손 바이러스 벡터의 상보성을 포함하는 접근법을 이용한다.
pLASN 및 MFG-S는 임상 시험에서 사용되어 온 레트로바이러스 벡터의 예이다(Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN은 유전자 치료요법 시험에서 사용된 제1의 치료학적 벡터였다. (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). 50% 이상의 형질도입 효율이 MFG-S 패키지된 벡터에 대해 관찰되었다. (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).
재조합체 아데노-관련 바이러스 벡터(rAAV)는 결함이 있는 비병원성 파르보바이러스 아데노-관련 제2형 바이러스를 기본으로 하는 촉망되는 대안적 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 전이유전자 발현 카세트를 플랭킹하는 AAV 145bp 역전된 말단 반복물만을 보유하는 플라스미드로부터 기원한다. 형질도입된 세포의 게놈내로의 통합으로 인한 효율적인 유전자 전달 및 안정한 전이유전자 전달은 이러한 벡터 시스템에 대한 주요 특징이다. (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 AAVrh.10을 포함하는 다른 AAV 혈청형 및 어떠한 신규 AAV 혈청형도 또한 본 발명에 따라서 사용할 수 있다.
복제-결손 재조합체 아데노바이러스 벡터(Ad)는 고 역가로 생산될 수 있으며 다수의 상이한 세포형을 용이하게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 전이유전자가 Ad E1a, E1b, 및/또는 E3 유전자를 교체하도록 가공되며; 후속적으로 복제 결함이 있는 벡터는 결실된 유전자 작용을 트랜스로(in trans) 공급하는 사람 293 세포 내에서 증식된다. Ad 벡터는 간, 신장 및 근육에서 발견된 것과 같은 분열하지 않는, 분할된 세포를 포함하는, 생체내 다수의 조직형을 형질감염시킬 수 있다. 통상의 Ad 벡터는 큰 운반능을 갖는다. 임상 시험에서 Ad 벡터의 사용의 예는 근육내 주사를 사용한 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오타이드 치료요법을 수반하였다(Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). 임상 시험에서 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터 사용의 추가의 예는 Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)를 포함한다.
패키징 세포는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는데 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키지하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키지하는 Ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 치료요법에 사용된 바이러스 벡터는 일반적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자내로 패키지하는 생산자 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 숙주(적용가능한 경우)내로 패키징 및 후속적인 통합에 필요한 최소의 바이러스 서열, 발현될 단백질을 암호화하는 발현 카세트에 의해 교체되는 다른 바이러스 서열을 함유한다. 잃어버린 바이러스 작용은 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들면, 유전자 치료요법에 사용된 AAV 벡터는 숙주 게놈내로의 포장 및 통합에 필요한 AAV 게놈으로부터 역전된 말단 반복(ITR) 서열만을 소유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap을 암호화하지만, ITR 서열은 결여한 헬퍼 플라스미드를 함유하는, 세포주내에서 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인하여 충분한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은 예를 들면, 아데노바이러스가 AAV보다 더욱 민감한 열 치료에 의해 감소될 수 있다.
많은 유전자 치료요법 적용에서, 유전자 치료요법 벡터가 고도의 특이성으로 특수한 조직 형에 전달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 벡터는 바이러스의 외부 표면에서 바이러스 외피 단백질과의 융합 단백질로서 리간드를 발현함에 의해 제공된 세포 형에 대해 특이성을 가지도록 변형될 수 있다. 리간드는 목적한 세포형에 존재하는 것으로 공지된 수용체에 대해 친화성을 가지도록 선택된다. 예를 들면, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)는 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus)가 gp70에 융합된 사람 헤레굴린을 발현하도록 변형될 수 있으며, 재조합체 바이러스는 사람 상피 성장 인자 수용체를 발현하는 특정의 사람 유방 암 세포를 감염시킴을 보고하였다. 이러한 원리는 다른 바이러스-표적 세포 쌍에 확장시킬 수 있으며, 여기서 표적 세포는 수용체를 발현하고 바이러스는 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현한다. 예를 들면, 섬유상 파아지(filamentous phage)를 실제로 어떠한 선택된 세포 수용체에 대해 특이적인 결합 친화성을 가지는 항체 단편(예를 들면, FAB 또는 Fv)를 나타내도록 가공할 수 있다. 상기 설명이 주로 바이러스 벡터에 적용되지만, 동일한 원리를 비바이러스 벡터에 적용할 수 있다. 이러한 벡터는 특이적인 표적 세포에 의한 흡수를 용이하게 하는 특이적인 흡수 서열을 함유하도록 가공될 수 있다.
유전자 치료요법 벡터는 전형적으로 하기 기술된 바와 같은, 전신계 투여(예를 들면, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 또는 두개내 주입) 또는 국소 적용에 의해, 개개 환자에게 투여함으로써 생체내에 전달될 수 있다. 또한, 벡터는 개개 환자로부터 외식된(explanted) 세포(예를 들면, 림프구, 골수 흡인물, 조직 생검) 또는 공통의 공여체 조혈 줄기 세포와 같이, 생체외에서 세포에 전달되고, 이어서 일반적으로 벡터가 포함된 세포에 대한 선택 후, 세포를 환자내로 재이식할 수 있다.
뉴클레아제 및/또는 공여체 작제물을 함유하는 벡터(예를 들면, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포좀 등)를 또한 생체내에서 세포의 형질도입을 위해 유기체내로 직접 투여할 수 있다. 또한, 네이키드 DNA를 투여할 수 있다. 투여는 분자를 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하나, 이에 한정되지 않는 혈액 또는 조직 세포와 친밀하게 접촉시켜 도입하는데 일반적으로 사용된 경로 중 어느 것에 의한다. 이러한 핵산의 적합한 투여 방법은 이용가능하며 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있고, 하나 이상의 경로가 특수한 조성물을 투여하는데 사용될 수 있지만, 특수한 경로는 흔히 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 뉴클레아제-암호화 및/또는 이본쇄 공여체)의 도입에 적합한 벡터는 비-통합 렌티바이러스 벡터(IDLV)를 포함한다. 예를 들면, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol.72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222; 미국 특허 공보 2009/0117617를 참고한다.
약제학적으로 허용되는 담체는 투여되는 특수한 조성물에 의해 부분적으로, 및 또한 조성물을 투여하는데 사용된 특수한 방법에 의해 결정된다. 따라서, 하기 기술된 바와 같이, 약제학적 조성물의 광범위한 적합한 제형이 존재한다(참고: 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989).
뉴클레아제-암호화 서열 및 공여체 작제물은 동일하거나 상이한 시스템을 사용하여 전달할 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들면, 뉴클레아제 및 공여체는 동일한 DNA MC에 의해 수반될 수 있다. 또한, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 MC에 의해 운반될 수 있는 반면, 하나 이상의 뉴클레아제는 표준 플라스미드 또는 AAV 벡터에 의해 운반될 수 있다. 또한, 상이한 벡터를 동일하거나 상이한 경로(근육내 주사, 꼬리 정맥 주사, 다른 정맥내 주사, 복강내 투여 및/또는 근육내 주사)에 의해 투여할 수 있다. 이들 벡터는 동시에 또는 어떠한 순차적인 순서로 전달될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 치료학적 단백질을 암호화하는 전이유전자의 삽입에 처리할 수 있는 질환 및 상태의 생체내 또는 생체외 치료를 포함한다. 조성물을 혈청 또는 표적 기관 또는 세포내에서 치료학적 폴리펩타이드의 바람직한 농도를 수득하는데 효과적인 양으로 사람 환자에게 투여한다. 투여는 폴리뉴클레오타이드가 목적한 표적 세포로 전달되는 어떠한 방식으로도 이루어질 수 있다. 예를 들면, 생체내 및 생체외 방법 둘 다가 고려된다. 간문맥내로의 정맥내 주사가 바람직한 투여 방법이다. 다른 생체내 투여 방식은 예를 들면, 간의 엽(lobe) 또는 담즙관 내로의 직접적인 주사 및 간 동맥을 통하는 것을 포함하는, 간에서 먼 정맥내 주사, 간 유조직내로의 직접적인 주사, 간 동맥을 통한 주사, 및/또는 담도계를 통한 역행하는 주사(retrograde injection)를 포함한다. 생체외 투여 방식은 절제된 간세포 또는 간의 다른 세포의 시험관내 형질도입에 이은, 도입되고, 절제된 간세포의 사람 환자의 입구 맥관구조, 간 유조직 또는 담도계로의 역 주입을 포함한다. 예를 들면, Grossman et al., (1994)Nature Genetics, 6:335-341을 참고한다.
투여될 뉴클레아제(들) 및 공여체의 유효량은 환자에 따라 및 목적한 치료학적 폴리펩타이드에 따라 변할 것이다. 따라서, 유효량은 조성물을 투여하는 주치의에 의해 가장 잘 결정되며 적절한 용량은 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 측정된다. 통합 및 발현을 위한 충분한 시간을 허용한 후(예를 들면, 통상적으로 4 내지 15일), 치료학적 폴리펩타이드의 혈청 또는 다른 조직 수준의 분석 및 투여 전 초기 수준에 대한 비교는, 투여되는 양이 옳은 범위내에서 너무 낮은지, 또는 너무 높은지를 측정할 것이다. 초기 및 후속적인 투여에 적합한 요법은 또한 변할 수 있으나, 초기 투여에 이어 필요할 경우 후속적인 투여로 정형화된다. 후속적인 투여는 매일 내지 매년 내지 매 수년의 범위에서, 다양한 간격으로 투여될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 적절한 면역억제 기술이 전달 벡터의 면역억제에 의해 형질도입의 억제 또는 차단을 피하기 위해 추천될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들면, Vilquin et al., (1995) Human Gene Ther., 6:1391-1401을 참고한다.
생체외 및 생체내 투여 둘 다를 위한 제형은 액체 또는 유화된 액체 속의 현탁액을 포함한다. 활성 성분은 흔히 약제학적으로 허용되며 활성 성분와 혼용성인 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제는 예를 들면, 물, 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등, 및 이의 조합물을 포함한다. 또한, 조성물은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제 또는 약제학적 조성물의 효능을 향상시키는 다른 시약과 같은, 소량의 보조 물질을 함유할 수 있다.
세포
내인성 BCL11A 인핸서 서열이 본원에 기술된 뉴클레아제(표 1)에 의해 변형된 세포 및/또는 세포주가 또한 본원에 기술되어 있다. 변형은 예를 들면, 세포의 야생형 서열과 비교될 수 있다. 세포 또는 세포주는 변형을 위해 이종이거나 동종일 수 있다. BCL11A 서열에 대한 변형은 삽입, 결실 및/또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
변형은 바람직하게는 뉴클레아제(들) 결합 및/또는 절단 부위(들)에서 또는 근처에서, 예를 들면, 절단 부위(들)의 상부 또는 하부의 1 내지 300개(또는 이들 사이의 어떠한 값)의 염기쌍, 보다 바람직하게는 결합 및/또는 절단 부위(들)의 한쪽 측면의 1 내지 100개 염기쌍(또는 이들 사이의 어떠한 값), 심지어 보다 바람직하게는 결합 및/또는 절단 부위(들)의 한쪽 측면의 1 내지 50개 염기쌍(또는 이들 사이의 어떠한 값)에서 존재한다. 특정의 구현예에서, 변형은 BCL11A 인핸서의 "+58" 영역에 또는 근처에, 예를 들면, 표 1의 제1 컬럼 중의 어느 것에 나타낸 뉴클레아제 결합 부위에 또는 근처에 존재한다.
어떠한 세포 또는 세포주, 예를 들면 줄기 세포, 예를 들면 배아 세포, 도입된 다능성 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 간엽성 줄기 세포도 변형될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 세포의 다른 비-제한적인 예는 T-세포(예를 들면, CD4+, CD3+, CD8+ 등); 수지 세포; B-세포를 포함한다. 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포를 포함하는 줄기 세포의 후손 또한 제공된다(예를 들면, RBC 또는 RBC 전구체 세포). 변형된 BCL11A 서열을 포함하는 다른 세포주의 비-제한적 예는 COS, CHO(예를 들면, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293(예를 들면, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), 및 perC6 세포 및 또한 스포도프테라푸르기페르다(Sf)와 같은 곤충 세포, 또는 사카로마이세스, 피키아 및 스키조사카로마이세스와 같은 진균 세포를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 세포는 장애의 치료 및/또는 예방, 예를 들면, 생체외 치료요법에 유용하다. 뉴클레아제-변형된 세포는 확장된 후 표준 기술을 사용하여 환자내로 재도입될 수 있다. 예를 들면, Tebas et al (2014) New Eng J Med 370(10):901을 참고한다. 줄기 세포의 경우에, 대상체 내로 주입한 후, 작용성 전이유전자를 발현하는 세포내로의 이들 전구체의 생체내 분화가 또한 발생한다. 본원에 기술된 바와 같은 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 또한, 세포는 환자에게 투여하기 전에 동결보존될 수 있다.
본원에 개시된 어떠한 변형된 세포 또는 세포주도 감마 글로빈의 증가된 발현을 나타낼 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 약제학적 조성물과 같은 조성물이 또한 제공된다.
적용
본원에 개시된 방법 및 조성물은 단백질의 발현을 변형시키거나, 겸상 적혈구 질환 또는 지중해빈혈과 같은 유전 질환에서 발현된 단백질을 암호화하는 비정상 유전자 서열을 교정하기 위한 것이다. 따라서, 방법 및 조성물은 이러한 유전 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 제공된다. 예를 들면, 줄기 세포의 게놈 수정을 사용하여 비정상적인 유전자를 교정하거나, 야생형 유전자를 삽입하거나, 내인성 유전자의 발현을 변화시킬 수 있다. 비-제한적인 예로서, 예를 들면, 적어도 하나의 글로빈(예를 들면, α 및/또는 β 글로빈)을 암호화하는 야생형 유전자를 세포(예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 뉴클레아제를 사용하여 내인성 BCL11a 인핸서 서열내로) 삽입시켜 세포내에서 결손되고/되거나 결여된 글로빈 단백질을 제공함으로써 불완전한 글로빈 발현에 의해 유발된 유전 질환, 예를 들면, 혈색소병증을 치료할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 적절한 공여체의 투여와 함께 또는 투여없이 수행하는 게놈 수정으로 불완전한 내인성 유전자를 수정, 예를 들면, α- 또는 β-헤모글로빈내 점 돌연변이를 교정시켜, 유전자의 발현을 복구하고/하거나 유전 질환, 예를 들면, 겸상 적혈구 질환 및/또는 어떠한 직접적인 또는 간접적인 글로빈 조절 유전자의 녹 아웃 또는 변경(과발현 또는 억제)(예를 들면, γ 글로빈-조절 유전자 BCL11A 또는 BCL11A-조절인자 KLF1의 불활성화)을 치료할 수 있다. 특이적으로, 본 발명의 방법 및 조성물은 헤모글로빈혈증의 치료 또는 예방에 있어서의 용도를 갖는다.
본 발명의 뉴클레아제는 BCL11A의 발현에 필요한 것으로 알려진, BCL11A 인핸서 영역에 대해 표적화되므로, 감마 글로빈 발현의 하향 조절에 대해 표적화된다. 이러한 인핸서 영역의 변형은 증가된 감마 글로빈 발현을 지닌 적혈구를 생성하므로, 겸상 적혈구 질환 또는 베타 지중해빈혈의 치료 또는 예방에 도움이 될 수 있다.
다음의 실시예는 본 개시내용의 예시적인 구현예에 관한 것이며, 여기서 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함한다. 이는 단지 예시의 목적이며 다른 뉴클레아제, 예를 들면, TtAgo 및 CRISPR/Cas 시스템, 가공된 DNA-결합 도메인을 지닌 호밍(homing) 엔도뉴클레아제(메가뉴클레아제) 및/또는 가공된 호밍 엔도뉴클레아제(메가뉴클레아제) DNA-결합 도메인 및 이종 절단 도메인의 천연적으로 발생하는 융합체 및/또는 메가뉴클레아제와 TALE 단백질의 융합체가 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1: 아연 핑거 뉴클레아제의 조립
ZFN을 사람 BCL11A 유전자에 대해 조립하고 Miller et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:778-785에 기술된 바와 같이 CEL1 검정으로 시험하였다. 인핸서 영역의 +58 영역에 대해 특이적인 ZFN을 기술한 바와 같이 제조하였다. 뉴클레아제는 표 1에서 하기 나타낸다:
표 1: +58 BCL11A 인핸서 영역에 대하여 특이적인 ZFN 쌍
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
*51446 및 51463은 링커 서열에 있어서 상이하다.
모든 ZFN을 작용성(절단 활성)에 대해 시험하여 활성임이 밝혀졌다.
실시예 2: 사람 K562 세포 내에서 ZFN의 활성
요약하면, 사람 K562 세포를 10% FBS가 보충된 RPMI 속에서 배양하고 200,000개의 세포를 차선의 농도인 좌측 및 우측 ZFN 파트너를 암호화하는 25ng의 각각의 플라스미드 DNA를 사용하여 Amaxa Nucleofector®에 의해 제조업자의 지시사항에 따라 형질감염시켰다(표 2a). 또한, 실험은 25ng의 좌측 ZFN 및 5ng의 우측 ZFN으로 수행하였다(표 2b). Perez et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26: 808-816 및 Guschin et al. (2010) Methods Mol Biol. 649:247-56)에 기술된 바와 같은 Cel-I 검정(SurveyorTM, Transgenomics)을 사용하여 형질감염 2일 또는 3일 째에 표적 유전자의 ZFN-유도된 변형을 검출하였다. 당해 검정에서, 표적 부위의 PCR-증폭을 서열분석에 의해 삽입 및/또는 결실("삽입결실")의 정량화로 수행하였다. 일루미나 플랫폼(Illumina platform)("miSEQ") 상의 깊은 서열분석을 제조업자의 지시에 따라 사용하여 수정 효능 및 수정-생성된 대립형질의 특성을 측정하였다. 결과를 표 2에 하기 나타내며, 여기서 숫자는 관찰된 NHEJ 활성 퍼센트를 나타낸다.
표 2a: K562 세포내에서 매트릭스 스크리닝(25ng의 각각의 ZFN )
Figure pct00005
표 2b: K562 세포내에서 매트릭스 스크리닝(25ng의 좌측 ZFN , 5ng의 우측 ZFN)
Figure pct00006
또한 ZFN을 DNA 결합 도메인과 뉴클레아제 도메인 사이의 4개의 상이한 링커를 사용하여 작제하였다(참고: 미국 특허 공보 20150064789). 시험한 링커 서열을 하기에 나타내며, 여기서, 서열의 'HTKIH' 부위는 DNA 결합 도메인의 카복시 말단이고 'ELEEK' 부위는 뉴클레아제 도메인의 아미노 말단이다. 밑줄친 부위는 2개의 도메인 사이의 링커 서열이다.
링커 서열
L7a: HTKIH LRGSQLVKSKSEAAAR ELEEK (서열 번호: 31)
L7c5: HTKIH LRGSISRARPLNPHP ELEEK (서열 번호: 32)
L0: HTKIH LRGSISRARPLNPHP　 ELEEK　　(서열 번호: 33)
L8c4: HTKIH LRGSYAPMPPLALASP ELEEK　　(서열 번호: 34)
이들 실험에서, L0 또는 L8c4 링커를 좌측 파트너에서 시험하였고 이와 함께 L7c5 또는 L7a 링커를 우측 파트너에서 시험하였다. ZFN의 조합을 K562 세포내에서 절단 활성에 대해 시험하였고, 결과(NHEJ 활성 퍼센트)를 표 3에서 하기 나타낸다.
표 3: 도메인 링커를 변화시키는 ZFN 활성
Figure pct00007
실시예 3: CD34+ 세포 내에서 ZFN의 활성
본원에 기술된 것으로서 ZFN을 또한 사람 CD34+ 세포 내에서 시험하였다. CD34+ 형질도입을 위해, 2mm 갭 큐베트(gap cuvette)가 장착된 BTX ECM830 장치를 사용하였다. 사람 CD34+ 세포를 비-조직 배양 처리된 플레이트 속에서 1xCC110(Stem Cell Technology)가 들어있는 x-vivo10 배지(Lonza) 내에 성장시켰다. 세포를 계수하고 1200rpm에서 10분 동안 실온으로 원심분리하여 수집하였다. 세포를 실온의 PBS를 사용하여 1 내지 2회 세척하였다. 200,000개의 세포를 각각의 형질감염에 사용하고, 이들을 100μL의 BT발현 용액 속에 재현탁시켰다. CD34+ 실험을 위해, ZFN을 암호화하는 RNA를 DNA대신 사용하였다. RNA를 mMessageMachine T7 Ultra Kit(Ambion)를 사용하여 생성시켰다. 각각의 ZFN을 암호화하는 500ng의 RNA를 형질감염당 가하고 혼합물을 큐베트로 이전하였다. 형질감염 직후, 혼합물을 250V에서 5 msec 동안 전기천공하였다. 예비-가온된 배지를 큐베트에 가하고 배지 및 세포를 48 웰 비-조직 배양액 처리된 플레이트로 이전시킨 후 37℃에서 항온처리하였다.
2 또는 3일 후, 세포를 이후에 Illumina MiSeq를 사용하는 게놈 분석에 적용시켰다. 수정된 대립형질의 퍼센트를 정량화하기 위하여, 목적한 게놈 영역을 표준 일루미나 서열분석 어댑터 서열(standard Illumina sequencing adapter sequence)에 가하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 제2 그룹의 13 라운드의 PCR을 수행하여 바코드 및 브릿지 어댑터 서열을 양쪽 말단에 가하였다. 서열분석을 증폭산물 서열분석을 위한 제조업자의 프로토콜에 따라 Illumina MiSeq에서 수행하였다. MiSeq는 쌍을 이룬-말단 판독물을 생성하며, 이는 표준 정렬 소프트웨어를 사용하여 합치고 어댑터-트림(adapter-trim)하였다. 이후에 판독물을 통상의 스크립트를 사용하여 바코드 서열 쌍을 통해 샘플로 역다중화(demultiplex)하였다. 증폭산물 서열을 이후에 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needlemanand Wunsch(1970). Jour Mol Bio 48 (3): 443-53)의 시행을 통해 참고 서열에 전반적으로 정렬하였다. 정렬내 갭 또는 삽입을 NHEJ 현상의 %로서 계수하고, 처리되지 않은 대조군 샘플 서열과 비교하여 서열-특이적인 배경 비율을 측정하였다. 결과는 표 4에 하기 나타낸다.
표 4: CD34+ 세포 내에서 ZFN 활성
Figure pct00008
증가한 양의 투입 mRNA를 대표적인 쌍의 선택된 세트(1μg의 각각의 ZFN)에 사용하고, 추가량의 절단을 표 5에 나타낸 바와 같이 관찰하였다.
표 5A 및 5B: ZFN 농도가 증가하면 활성이 증가됨
표 5A
Figure pct00009
표 5B
Figure pct00010
상기 형질감염을 mRNA 투입물을 불포화시키지 않는 조건 하에서 주로 수행하여 본 발명자들이 다양한 ZFN 조합물의 활성을 비교하도록 하였다. mRNA의 투입이 포화하거나 거의 포화하는 시점에 수득가능한 변형의 최대 양을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 증가하는 양의 2a 작제물 또는 하나의 mRNA 속의 조합하는 2개의 ZFN을 CD34+ 세포 내로 BTX 전기천공을 사용하여 형질감염시키고, 결과를 하기 표 6에 나타낸다.
표 6: 증가하는 mRNA 투입물을 사용한 Bcl11a 인핸서의 변형
Figure pct00011
표 6의 데이타는 시험한 모든 배합물에 대해 증가하는 mRNA 투입물을 사용한 ZFN 표적 영역의 매우 높은 변형을 나타낸다.
다양한 링커를 포함하는 ZFN을 사용하여 활성을 분석하는 실험 2에서 수행한 실험과 유사하게, 활성에 있어서 링커의 효과를 또한 CD34+ 세포 내에서 시험하였다. 상기와 같이, 다양한 양의 mRNA(각각 500, 1000 또는 2000ng)를 사용하여 이들 실험에서 ZFN을 전달하였다. 표 7은 ZFN 쌍의 활성에 있어서 링커 실체의 효과를 나타낸다.
표 7: CD34+ 세포 내 ZFN 활성에 대한 링커 실체의 효과
Figure pct00012
실시예 4: 수정된 CD34+ 세포 및 헤모글로빈 발현의 분화
상대적인 감마 글로빈 발현에 대한 효과를 시험하기 위해, ZFN 쌍의 대표적인 샘플을 암호화하는 mRNA를 BTX 핵감염에 의해 제조업자의 지시에 따라 CD34+ 세포(건강한 공여체 자원자로부터 수득함)내로 도입하였다. 이후에, 세포를 적혈구로 분화시켰다. 요약하면, CD34+ 세포를 피콜-파크(Ficoll-Paque)(GE Healthcare) 및 CD34+ 마이크로비드(Miltenyi Biotec)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 정제하였다. CD34+ 세포를 BIT 95000(StemCell Technologies)가 들어있는 이스코브 MDM(Iscove's MDM) 속에서 성장 인자의 존재하에 배양하였다. 세포를 3 단계 액체 배양 모델을 사용하여 적혈구 계통으로 분화시켰다. 처음 6일(제1 상) 동안, CD34+ 세포를 SCF(100ng/ml), Flt3-L(100ng/ml), 및 IL-3(20ng/ml)로 확장시켰다. 이후에, 확장된 세포를 사용하여 적혈구 계통(제2 상)으로 Epo(2 U/ml) 및 SCF(50ng/ml)를 사용하여 분화시켰다(참고: Giarratana et al. (2011) Blood118(19):5071-9).
상대적인 감마 글로빈 발현을 분석하기 위하여, ZFN 처리 후 감마 글로빈, 알파 글로빈 및 베타 글로빈을 암호화하는 mRNA의 비를 RT-PCR 분석에 의해 분화 시작 후 14일째에 측정하였다. 분석은 표준 Taqman® 분석을 사용하여 프로토콜에 따라서 및 제조업자(Applied Biosystems)가 공급한 유전자 특이적인 검정을 사용하여 수행하였다. 감마 글로빈(HBG)의 상대적인 비를 알파(HBA) 또는 베타 글로빈(HBB) 발현의 수준으로 표준화하였으며 여기서 비는 대조군 세포내에서 감마/알파 또는 감마/베타 비에 대해 비교하였다.
데이타를 하기 표 8에 나타내며, 플라스미드를 암호화하는 GFP를 사용하여 처리한 세포와 비교시 ZFN-처리된 세포에서 감마 글로빈 발현의 증가가 있음을 입증하였다.
표 8: 수정된 CD34+ 세포 내의 알파 또는 베타 글로빈에 대한 감마 글로빈 발현에 있어서의 변화
Figure pct00013
포화된 mRNA 농도에서 및 근처에서 형질감염시킨 후 상기 기술된 바와 같은 글로빈 발현을 RT-PCR 분석한 CD34+ 세포의 시험관내 적혈구 분화는 GFP mRNA 형질감염된 대조군 샘플과 비교하는 경우 Bcl11a 인핸서를 표적화하는 모든 선택된 ZFN 쌍에 의해 매우 효율적인 감마-글로빈 활성화를 나타낸다(도 1). 데이타는 하기 표 9에 나타낸다.
표 9: 사람 감마 글로빈 발현의 증가된 비
Figure pct00014
실시예 5: BTX 전기천공 장치, 별도의 mRNA 및 단일의 mRNA를 사용한 CD34+ 세포 내에서 ZFN의 활성
ZFN의 2개 쌍의 활성을 사람 말초 혈액으로부터 분리한 유동화된 사람 CD34+ 세포 및 골수로부터 분리한 CD34+ 세포 내에서 시험하였다. 요약하면, CD34+ 세포를 다음과 같이 건강한 공여체로부터 분리하였다. 백혈구성분채집술 수집물은 저속 원심분리 및 상층액 제거에 의해 고갈된 혈소판이었다. 혈소판 고갈에 이어, 세포를 항-CD34 자기 마이크로비드(Miltenyi Biotec, 독일)로 표지하고 Miltenyi CliniMACS Plus Cell Separator System을 사용하여 양성적으로 수집하였다. 선택 후, 양성 분획(농축된 CD34+ HSPC)을 세척하고 배양 배지(즉, 2mM의 L-글루타민, 100ng/mL의 각각의 FMS-유사 타이로신 키나제 3-리간드(Flt-3L), 줄기 세포 인자(SCF), 및 트롬보포이에틴(TPO)이 보충된 X-VIVO 10 배지) 속에서 1 x 106개 세포/mL에서 재현탁시키고, VueLife 배양 백(bag)(Saint-Gobain, 매릴랜드주 가이써르스부르그 소재)에 이전시키고 37℃/5% CO2에서 항온처리하였다. 골수로부터 CD34+ 세포를 정제하기 위해, 수집물을 하이드록시에틸 전분 침강에 의해 적혈 세포(RBC)를 고갈시켰다. RBC 고갈 후, 세포를 항-CD34 자기 마이크로-비드(Miltenyi Biotec, 독일)로 표지하고 Miltenyi CliniMACS Prodigy를 사용하여 양성적으로 선택하였다. 선택 후, 양성 분획(농축된 CD34+ HSPC)을 세척하고 배양 배지(즉, 2mM의 L-글루타민, 100ng/mL의 각각의 FMS-유사 타이로신 키나제 3-리간드(Flt-3L), 줄기 세포 인자(SCF), 및 트롬보포이에틴(TPO)이 보충된 X-VIVO 10 배지) 속에 1 x 106개 세포/mL에서 재현탁시키고, VueLife 배양 백(Saint-Gobain, 매릴랜드주 가이써르스부르크)에 이전시키고 37℃/5% CO2에서 항온처리하였다.
사용된 쌍은 51446/51536(쌍 A) 및 SBS51857/51949(쌍 B)이었다. ZFN을 세포내로 도입된 mRNA로서 시험하였다. 형질감염을 위해, BTX 장치를 사용하였다. 요약하면, 샘플당 200,000개의 세포를 BTXpress 전기천공 용액(BTX) 속에 현탁시키고 RNA와 혼합하였다. 이후에, 혼합물을 4 msec 동안 250 볼트에서 펄스하고 37℃에서 세포를 회수하기 전에 냉 쇼크 조건(30℃에서 밤새)에 적용시켰다. ZFN 활성의 분석을 형질감염 후 2 또는 3일째에 수행하였다. ZFN을 단일 mRNA 종으로서 시험하였으며, 여기서, 2a 자가-절단 펩타이드 서열을 2개의 ZFN 암호화 서열 사이에서 사용하고, 데이타를 도 2에 나타낸다. 또한, 동일한 조건을 사용하여 ZFN 1개 쌍을 시험하였으며, 여기서 mRNA의 제공은 2개의 별개의 종으로서 제공하였으며, 여기서 각각의 mRNA는 단일의 ZFN을 암호화하였다. 하기 표 10a 및 표 10b는 단일의 mRNA 시도 대 2개의 mRNA에 대한 활성 결과(% NHEJ 또는 삽입결실)를 나타낸다(나타낸 데이타는 7회 실험으로부터의 것이다).
표 10a: 단일 대 이중 mRNA 종의 비교(삽입결실 % )
Figure pct00015
표 10b: 단일 대 이중 mRNA 종의 비교(삽입결실 % )
Figure pct00016
본 발명자들은 또한 사람 감마 글로빈 및 사람 베타 글로빈의 발현을 TaqMan®을 사용하여 표준 프로토콜에 따라 시험하였다. 다음에, 결과를 HBB(베타)에 대한 HBG(감마)의 비로 표준화하고, 다시 ZFN:51446/51536(쌍 A) 및 SBS51857/51949(쌍 B)의 2개 쌍을 비교하여, 도 3에 나타낸다. 또한, HBG 및 HBB의 발현을 단일 mRNA로서 ZFN 쌍의 제공을 비교하여 측정하였으며, 여기서 쌍내에 각각의 ZFN을 암호화하는 서열은 2a 자가-절단 펩타이드 서열에 의해, 각각의 ZFN을 암호화하는 mRNA가 별도로 공급되는 조건을 사용하여 분리한다. 데이타는 이들 조건 하에서, B 쌍, SBS51857/51949이 BCL11a 표적을 절단하고 HBG 발현에 있어서의 증가를 유발하는데 있어서 더욱 활성이었음을 입증하였다.
ZFN 쌍을 골수 기원한 CD34+ 세포 속에서 시험하였으며 쌍 둘 다는 다시 활성인 것으로 밝혀졌다(참고: 도 4a). SBS51857/51949 쌍에 대한 활성을 또한 시험하였으며, 여기서 ZFN은 단일의 mRNA 상에 상기 기술된 바와 같이 2a와 함께 또는 2개의 별도의 mRNA로서 공급되었다(도 4b). SBS51857/51949 쌍은 51446/51536 쌍보다 더 높은 활성을 입증하였다.
실시예 7: 특이성 분석
편견이 없는 포획 분석(unbiased capture analysis):
포획 검정은, 뉴클레아제 및 이본체 DNA 공여체의 표적 세포내로의 동시-도입이 NHEJ DNA 보수 경로를 통해 수득되는 게놈 브레이크의 분획내로 공여체의 "포획"을 생성한다는 관찰을 기반으로 한다(Orlando et al, (2010) Nucleic Acids Res. 38(15) e152; Gabriel, R. et al. (2011). Nat Biotechnol. 29: 816-23.). 당해 포획 현상은 구동된 상동성이 아님을 주목한다(실제로 이본쇄 DNA 공여체는 사람 게놈에 대한 어떠한 상동성도 함유하지 않는다). ZFN을 암호화하는 mRNA가 DNA 브레이크내로 포획될 수 없고, 이본쇄 DNA 공여체 만이 포획될 수 있음을 또한 주목한다. 일단 포획되면, 이본쇄 게놈은 절단 현상의 영구적인 태그를 나타낸다. 게놈 DNA의 분리 후, 포획 부위를 공여체로부터 플링킹 게놈 서열내로 프라이머 연장에 이어, 어댑터 연결, PCR, 및 수득되는 공여체-게놈 연결의 서열분석을 통해 확인할 수 있다.
요약하면, 포획 분석 연구를 K562 세포주 내에서 수행하여 공여체 전달, ZFN 발현, 및 DSB 부위내로의 공여체 포획을 최대화하고; 세포를 ZFN-암호화 mRNA 및 올리고뉴클레오타이드 이본쇄 공여체를 사용하여 전기천공하였다. 별도로, BM 및 PB-기원한 CD34+ 세포를 상기 기술한 바와 같이 ZFN-암호화 mRNA를 사용하여 Maxcyte 장치로 전기천공하였다. 사용된 이본쇄 공여체 올리고뉴클레오타이드는 하기 나타낸다(서열 번호: 30 및 31):
Figure pct00017
각각의 쇄의 5' 말단에서 NNNN은 무작위의, 단일 쇄 사량체 오버행(overhang)을 나타내는 반면, 밑줄친 NNNN은 바코드(bar code)로서 제공되어 달리 돌일한 통합 현상 사이를 구별하는 무작위 이본쇄 서열을 나타낸다. 삼본체(triplicate) 샘플은 올리고 및 mRNA의 각각의 조합에 대해 제조되었다. 형질감염 후 7 및 14일째에 게놈 DNA를 분리하고(Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit), 1μg(330000 게놈/복제)를 증폭 프로토콜용 투입물로서 사용하였다. 이후에, 샘플을 필수적으로 기술한 바와 같이 가공하였다(Paruzynski, A. et al. (2010). Nat. Protocols. 5:1379-1395). 증폭산물(amplicon)을 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하고, PCR로 증폭시켜 Illumina 플랫폼에서 정밀한 서열분석을 위한 바코드와 어댑터를 도입하였다. 최종 생성물을 정량화하고, 혼주(pooling)하고 MiSeq 장치(Illumina)에서 쌍을 이룬-말단 150bp 판독물 및 8bp 이중 이중 지수 판독물(dual index reads)을 지닌 v2 300 주기 서열분석 키트를 사용하여 서열분석함으로써 증폭산물의 각각의 말단의 바코드를 검출하였다. 당해 노력은 후보물 오프-표적 유전자자리의 세트를 수득하였으며 이는 이후 BM- 또는 PB-기원한 CD34 세포 내에서 유전자형 분석되었다. 쌍 A(SBS#51446/51536)에 대해 확인된 결과는 도 10a에 나타낸 반면, 쌍 B(SBS#51857/51949)에 대한 결과는 도 10b에 나타낸다. 데이타를 하기 표 11에 추가로 요약한다.
표 11: 골수로부터 쌍 A 및 쌍 B, CD34+에 대한 오프 표적 분석
Figure pct00018
유사한 연구를 PB로부터 기원한 CD34+ 세포에서 수행하여 하기 표 12에 발견한 결과를 요약하였다.
표 12: 말초혈로부터 쌍 A 및 쌍 B, CD34+에 대한 오프 표적 분석
Figure pct00019
실시예 6: Maxcyte 전기천공 장치, 별도의 mRNA 및 단일 mRNA를 사용한 CD34+ 세포내에서의 ZFN의 활성
본 발명자들은 다음에 Maxcyte GT 전기천공 장치를 사용하여 CD34+ 세포 내에서 ZFN 쌍을 사용한 보다 큰 규모의 실험을 수행하였다. 상기 기술된 바와 같이 정상의 공여체로부터 말초 혈액(PB)을 분리한 이동된(mobilized) CD34+ 세포를 다음과 같이 시험하였다: 세포(샘플당 3백만개)를 RT Maxcyte EP 완충액 속에 30 e6개 세포/mL의 최종 농도로 재현탁시켰다. 세포를 mRNA와 혼합하고 제조업자에 의해 명시된 프로그램을 사용하여 전기천공하였다. 세포를 37℃에서 20분 동안 약간 회복되도록 한 후, 희석시키고 세포를 37℃에서 회수하기 전에 냉 쇼크 조건(30℃에서 밤새)에 적용시켰다. 활성을 후에 2 내지 3일간 분석하였다. 실험을 앞서와 같이 A 쌍 및 B 쌍 둘 다를 사용하여 수행하였으며, 여기서 각각의 쌍을 단일의 mRNA에 도입하였다(도 5a). ZFN 쌍 B(SBS51857/51949)를 또한 위에서 기술한 바와 같이 단일의 mRNA 또는 2개의 별개의 mRNA로서 시험하였다(도 5b). 이들 실험에서, B 쌍은 가장 높은 활성을 나타내었다.
골수 기원한 세포의 경우, 성공적인 수정은 보다 많은 mRNA를 필요로 하였지만, 높은 활성이 관찰되었다(참고: 도 6). 세포를 위에서 기술한 바와 같이 HBG 및 HBB 발현에 대해 분석하고 HBG/HBB 비를 0일째에 삽입결실 활성 퍼센트와 비교하였다(도 7). 보다 높은 수준의 HBG 발현과 보다 높은 수준의 삽입결실 활성 사이에 우수한 일치가 존재하였다.
추가의 분석을 Maxcyte 프로토콜을 사용하여 수행하였으며(도 8 및 9) 여기서 삽입결실의 빈도가 각각의 실험에서 항상 동일하지는 않았지만, 상대적인 활성(예를 들면, 별도의 mRNA보다 더 높은 2a SBS51857/51949 작제물)이 각각의 수행에서 관찰되었다.
실시예 7: 마우스에서 수정된 사람 CD34+ 세포의 이식
상술한 바와 같이, CD34+ 사람 세포를 +58 인핸서 특이적인 ZFN을 암호화하는 mRNA로 처리하고 NSG 마우스내로 이식하였다. CD34+ 세포를 건강한 사람 자원자로부터 수득하였다. 일부 경우에, CD34+ 이동 전략을 성분채집(apheresis) 전에 G-CSF(Neupogen®) 또는 G-CSF + 플레릭사포르(Mozobil®)를 사용하여 수행하였다. G-CSF를 제조업자의 지시사항에 따라서 성분채집 전에 4일 동안 매일 투여하고, 플레릭사포르가 사용된 경우, 이를 다시 제조업자의 지시에 따라, 수거 전 마지막 저녁에 투여하였다. 성분채집은 표준 방법으로 수행하였다. CD34+ 세포를 이동된 PBMC 류코팩(leukopak)으로부터 Miltenyi CliniMACs 시스템을 사용하여 표준 방법에 의해서 및 제조업자의 지시에 따라 농축시켰다.
ZFN을 암호화하는 캡핑되고 폴리-아데닐화된 mRNA를 제조업자가 지시한 바와 같이 Ambion mMessage mMachine® T7 울트라 키트를 사용하여 합성한 후, CD34+ 세포 내로 Maxcyte GT 시스템 또는 BTX ECM830 전기천공기를 사용하여 둘 다 제조업자의 지시에 따라 전기천공하였다.
NOD.Cg-Prkdc scid 　 Il2rg tm1Wjl /SzJ 마우스를 사용하여 CD34+ 이식체를 제공하였다. 이식 1일 전(16 내지 24 시간)에, 마우스에게 치사량 이하의 조사(sub lethal irradiation)(300 RAD)에 적용하였다. 상기로부터 ZFN-처리된 CD34+ 세포를 꼬리 정맥 주사를 통해 조사된 마우스내로 이식하며, 여기서 0.5mL의 PBS-0.1%BSA 중 백만개의 세포를 마우스당 제공하였다.
당해 실험을 위해, CD34+ 세포를 46801/47923 쌍을 암호화하는 mRNA로 전기천공하였다. ZFN을 암호화하는 유전자를 2A 자가-절단 펩타이드를 암호화하는 서열로 분리된 단일의 개방 판독 프레임 속에서 클로닝하였다. GFP는 대조군으로 사용하였다. 마우스내로 이식한 후에, 샘플을 이식 4, 8 및 12주 후에 취하여 세포내에서 사람 세포 특이적인 표지의 수준을 관찰하였다.
ZFN-수정된 CD34+ 세포 이식체 및 분화물, 및 이식 수준은 수정되지 않은 대조군과 비교하여 수정된 세포들 사이에서 유사하다.
실시예 8: 환자 기원한 세포에서 ZFN의 활성
ZFN의 활성을 사람 말초 혈액으로부터 분리한 이동된 사람 CD34+ 세포 및 골수로부터 분리된 CD34+ 세포 속에서 시험하였다. 5명의 β 지중해빈혈 대상체(P11, P18, P04, P08 및 P19로 지정됨)로부터의 HSPC를 이동시키고 기술한 바와 같이 정제하였다(Yannaki et al. (2012) Mol Ther 20(1):230). 실험 둘 다에서, 200,000개의 CD34+ 세포를 해동 2일 후 BTX 전기천공기(Holliston, MA, Voltage = 250 V, 펄스 길이 = 5ms)를 사용하여 100μL의 BTX Express 전기천공 용액 속에서 전기천공하였다. 형질감염은 mRNA를 암호화하는 4μg의 녹색 형광 단백질(GFP)(전기천공 효능에 대한, 및 전기천공 자체의 비특이적인 효과에 대해 조절하기 위한, 및 세포내로 mRNA를 도입하는 비특이적인 효과에 대한 대조군으로서), 또는 4μg 및 8μg의 SB 51857-2a-51949 mRNA 중의 하나를 사용하였다.
BTX 전기천공기를 사용하는 소 규모 형질감염에서 이들 SB 51857/51949 mRNA 양은 보다 큰 규모의 MaxCyte 장치 형질감염에 사용된 80 내지 120μg/ml 농도에 대한 동등한 표적 유전자 변형 및 γ-글로빈 활성화를 생성하였다.
전기천공 후, 30℃에서 일시적인 밤샘 배양을 수행하였다. 세포를 추가로 48시간 동안 37℃에서 배양하고, 이때 시험관내 분화를 개시하고 세포 분취량을 DNA 변형의 분석을 위해 수거하였다. 형질감염 후, 세포를 CC 100 사이토킨 칵테일(Stem Cell Technologies, 캐나다 밴쿠버 소재)로 보충된 X Vivo 10 배지(Lonza, 매릴랜드주 워커스빌 소재) 속에서 배양하였다.
BCL11A 유전자 변형을 전기천공 후 72시간째에(이때 시험관내 분화가 시작되었으며, 따라서, 형질감염 3일 후가 분화 0일이었다) 및 적혈구 분화 14일째에 MiSeq 정밀한 서열분석으로 측정하였다. 결과는 표 13에 나타낸다.
본 발명자들이 수득한 환자 기원한 CD34+ 세포 샘플을 사용 전에 2회 동결시켰으며, 따라서 이들 샘플중 일부는 해동시 감소된 생존능 및 세포 성장을 나타내었다. 해동 후 낮은 생존능이 형질감염 후, 특히 형질감염되지 않은 죽은 세포로부터의 DNA가 여전히 존재하는 조기 시점에, 생존능에 있어서 보다 높은 감소 및 보다 낮은 표적 유전자 변형과 일치하여 관찰되었다. 형질감염 후 세포 생존능의 SB-ZFN 형질감염 독립적인 지시인자로서, 표 13은 GFP mRNA로 형질감염된 대조군 샘플에서 각각의 세포 공급원에 대한 세포 생존능을 나타낸다. 표는 실험 1에서 환자 세포 샘플 P18이 당해 실험에서 다른 2개의 샘플의 생존능(71% 및 80%)보다 훨씬 더 낮은 생존능(38%)을 가졌음을 나타내었으며 변형된 ~70% 대립형질과 동일한 변형 수준에 도달하지 않았다. 유사하게 제2의 실험에서 3일째에 환자 세포 샘플 P08은 건강한 세포의 확장 및 생장(outgrowth) 후에도 매우 불량한 생존능(22%) 및 매우 낮은 조기 변형 수준 및 차선의 변형 수준을 나타내었다.
표 13: MiSeq에 의한 BCL11A 유전자 변형 분석
Figure pct00020
이들 데이타는 건강한 공여자 및 β 지중해빈혈을 지닌 지중해빈혈 환자로부터의 G CSF 이동되고, 정제된 HSPC 내로의 SB ZFN mRNA의 전기천공 후 BCL11A 인핸서의 파괴가 임상 샘플에 대해 예측된 범위 내에서 대부분의 샘플에서 발생하였음을 나타낸다. 샘플 중 일부의 낮은 생존능의 결과로서, P18 및 P08에서 인핸서 파괴는 건강한 공여자 자원자로부터의 세포에서 보다 더 낮았으며, 결과적으로 생존능이 낮은 2명의 샘플이 하기 분석에서 빠졌다. 중요하게도, 풍부한 세포 생존능을 나타낸 대상체로부터의 샘플(예를 들면, 샘플 P11 및 P04)은 또한 야생형 세포에서 관찰된 것과 동등한 유전자 변형 수준을 나타내었다.
β 지중해빈혈을 지닌 대상체로부터의 CD34+ HSPC의 적혈구 후대으로부터 분리된 α 및 γ 글로빈 mRNA의 수준은 RT qPCR에 의한 분석시 SB ZFN mRNA를 사용한 처리 후 태아(γ) 글로빈 수준에 있어서의 증가를 나타내었다(도 11). 태아 γ 글로빈 mRNA 수준은, 지중해빈혈 세포가 낮은 β 글로빈 mRNA를 발현하거나 발현하지 않았으므로, α글로빈 mRNA에 대해 정상화됨이 입증된다.
SB ZFN mRNA로 처리한 β 지중해빈혈을 지닌 대상체로부터의 CD34+ HSPC의 적혈구 후손은 태아(γ) 글로빈 mRNA 대 α 글로빈 mRNA의 비에 있어 예상된 증가를 나타내며, 야생형 공여체 세포, 특히 해동후 우수한 새존능을 나타낸 환자 샘플에서 관찰된 것과 유사한 감마-글로빈 대 암파-글로빈 비에 도달하였고 후속적으로 표적 유전자 변형 수준은 야생형 세포에서의 것과 비교 가능하였다.
이후에, 역상 HPLC를 사용하여 BCL11A 적혈구 인핸서가 단백질 수준에서 태아 헤모글로빈을 상승시키는지를 측정하였다.
2개의 실험에 대한 감마 글로빈(A감마 및 G감마 피크의 합)/알파 글로빈 비는, 지중해빈혈 세포 특히 β0/β0 세포에서 처리되지 않은 감마/알파 비가 일반적으로 야생형(wt) 세포에서의 것보다 더 높지만, 태아 글로빈 단백질의 명확한 증가가 건강한 자원자 및 BCL11A 인핸서의 SB ZFN 파괴시 지중해빈혈 환자로부터 기원한 적혈구 세포(RBC)에서 관찰되었음을 나타내었다. 주요한 β 지중해빈혈을 지닌 환자로부터의 세포에서 태아 대 성인 글로빈 비의 분석은, 변형되지 않은 세포내에서 α 글로빈의 사량체화 및 침전이 HPLC 분석가능한 혼주물로부터 이를 제거한다는 사실로 인해 복잡하다.
따라서, 잔류 β글로빈으로 사량체화된 α 글로빈(β+ 지중해빈혈을 지닌 환자) 및 γ글로빈 단독, 또는 γ글로빈으로 사량체화된 α글로빈(β0/β0 세포에서) 단독이 검정에서 나타날 수 있다. 따라서, γ글로빈 단백질 수준이 증가하는 경우, 생산적으로 사량체화된 α글로빈 단백질 수준이 또한 증가할 수 있으며, γ/α글로빈 단백질 비는 γ글로빈 단백질 수준에서의 증가를 과소평가하였다. 야생형 세포에서 실험하기에 유용한 다른 비는 γ글로빈/β 유사 단백질 비였다(후자는 2개의 γ글로빈 단백질 수준과 δ글로빈 및 β글로빈의 합이다). 그러나, 지중해빈혈 환자 세포에서, 특히 β0/β0 세포에서, 당해 비는 일반적으로 ZFN 처리되지 않은 세포에서도 90% 이상이었으며 ZFN 처리 후 γ 글로빈 단백질 수준에 있어서 실질적인 증가도 당해 비를 현저히 증가시키지 않았다.
실시예 9: ZFN 처리된 야생형 CD34+ 세포내에서 태아 글로빈에 대한 변형된 대립형질 분포 및 효과의 분석.
본 발명자들은 또한 2개의 종점과 관련하여 단일 세포에서 SB ZFN으로 처리한 CD34+ 세포로부터 기원한 적혈구 세포를 평가하였다: (1) 개새 세포 사이에 ZFN의 작용에 의해 지정된 BCL11A 적혈구 인핸서 영역의 대립형질의 분포, 및 (2) 태아 글로빈의 수준(γ/β 글로빈 mRNA 비로 측정된 것)에 있어서 개개 대립형질(야생형 및 유전적으로 변형됨)의 분포의 효과. 따라서, SB ZFN HSPC에서 발견된 단일의 CD34+ 세포를 시험관에서 분류하고 분화시켰다. 헤모글로빈화된 세포의 수득되는 단일 세포 기원한 세포를 개별적으로 수거하였다: 각각의 콜로니에 대한 게놈 DNA(gDNA)를 BCL11A 적혈구 인핸서내 SB ZFN 표적 영역에서 서열분석하여 유전자자리가 파괴되었는지, 및 그렇다면, 유전자자리의 어떠한 정밀한 대립형질 형태가 생성되었는지를 측정하였다. 또한, 총 RNA를 동일한 콜로니로부터 분리하고, 이들 개개 콜로니에서 글로빈 발현 수준을 실시간 역 전사 정량적 폴리머라제 쇄 반응(RT qPCR)으로 분석하였다.
방법
단일 세포 연구를 위해, 형질감염된 SB ZFN HSPC 세포를 37℃에서 해동시키고, 실온에서 10mL의 X VIVO에 가하고, 실온에서 450 x g로 5분 동안 회전시켰다. 세포 펠렛을 Flt3L, TPO, 및 SCF(각각 100ng/mL), 페니실린(100 U/mL), 및 스트렙토마이신(100μg/mL)이 보충된 X VIVO 배지 속에서 1 x 106/mL로 재현탁시켰다. 24웰 비 조직 배양-처리된 플레이트 속에서 습윤화된 항온처리기내에서 37℃, 5% CO2로 밤새 배양한 후, 세포를 수집하여, 회전시키고, 0.5% 소 혈청 알부민이 보충된 인산염 완충된 염수(PBS) 속에서 2 x 106/mL로 재현탁시켰다. 세포를 단계 1 적혈구 배양 배지(200μL/웰) 내로 96웰 U 바닥 비-TC 처리된 플레이트 속에서 2개 세포/웰로 FACS Aria III를 사용하여 분류하였다. 단계 1 적혈구 배양 배지는 100U/mL의 페니실린, 100μg/mL의 스트렙토마이신, 5% 사람 AB+ 혈장, 330μg/mL의 사람 홀로 트랜스페린, 20μg/mL의 사람 인슐린, 2U/mL의 헤파린, 3U/mL의 재조합 사람 에리트로포이에틴, 100ng/mL의 SCF, 5ng/mL의 IL 3, 및 1μM/mL의 하이드로코르티손이 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium: IMDM)를 함유하는 글루타막스(Glutamax)로 이루어졌다. 단계 1 적혈구 배양 배지 속에서 37℃, 5% CO2 속에서 배양한지 7일 후에, 웰당 150μL의 배지를 제거하고 100μL의 단계 2 적혈구 배양 배지로 교체하였으며 이는 단계 1 배지와 유사하였으나 IL3 및 하이드로코르티손을 첨가하지 않았다. 배양한지 추가로 4일 후에, 웰당 100μL의 배지를 제거하고 100μL의 단계 3 배지로 교체하였으며, 이는 단계 2 배지와 유사하나 SCF를 포함하지 않는다.
분화 14일 후, 웰당 10μL의 세포 현탁액을 정밀한 서열분석을 위해 수거하였다. 또한, 웰당 100μL의 배지를 제거하고 100μL의 신선한 단계 3 배지로 교체하였다. 나머지 세포를 3일 더 배양하고, 이때 웰당 50μL의 세포 현탁액을 수집하고, 동일한 용적의 NucRed(PBS 0.5% BSA 중 2 방울/mL)로 염색하고, Guava easyCyte에 세포질 및 핵제거율을 열거하였다. 나머지 세포를 회전시키고, PBS로 1회 세척하고, 20μL의 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등급의 물 속에서 분해하였다. 세포 파괴물을 원심분리(10,000 xg, 15분, 4℃)로 제거하였다. 용혈물을 역상 울트라 성능 액체 크로마토그래피(UPLC)에 의해 글로빈 쇄 분석이 준비될 때까지 70℃에서 저장하였다.
유전자 변형 효능을 정밀한 DNA 서열분석으로 평가하였다. 목적한 영역(BCL11A 적혈구 인핸서 영역내 ZFN 함유)은 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 증폭시키고, 변형 수준을 Illumina MiSeq에서 쌍을 이룬 말단 정밀한 서열분석으로 측정한다. Illumina MiSeq 서열분석 플랫폼에 필적하는 라이브러리를 생성하기 위하여, 어댑터, 바코드, 및 유동 세포 결합기(짧은 DNA 서열)을 순차적인 폴리머라제 쇄 반응에서 융합 프라이머의 2개 세트를 사용하여 표적 특이적인 증폭산물에 부착하였다. 다음의 프라이머를 MiSeq Adaptor PCR에 사용하였다(밑줄친 부위는 BCL11A 적혈구 인핸서 특이적인 서열이다): PRJIYLFN f: 5' ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNAGTCCTCTTCTACCCCACC(서열 번호: 35) 및 PRJIYLFN r: 5'GACGTGTGCTCTTCCGATCTCTACTCTTAGACATAACACACC(서열 번호: 36). 적혈구 배양물로부터 기원한 개개의 단일 세포를 수거하고, gDNA를 Illumina 플랫폼에서 정밀한 서열분석을 사용한 유전형 분석을 위해 QuickExtractTM(Epicentre)을 사용하여 추출하였다.
역상 UPLC에 의한 글로빈 쇄 분석을 위해, 5μL의 용혈물을 Waters Acquity UPLC 단백질 BEH C4 컬럼(300A, 1.7microm, 2.1mm X 100mm)에 주사하였다. 용출물을 실온에서 0.2mL/분의 유동 속도로 트리플루오로아세트산 함량이 0.1%인 물 속에서 38% 내지 42.5% 아세토니트릴의 18분 선형 구배를 사용하여 수득하였다. 용출은 220 nm에서 뒤따랐다. 각각의 특이적인 글로빈 쇄의 양을 나타내는, 특이적인 글로빈 쇄, γ, β 또는 α에 대한 면적 퍼센트를 Agilent OpenLAB 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.
결과
당해 연구를 위해, 120 또는 80μg/ml의 SB ZFN을 CD34+ 세포 내로 형질감염시켜 SB ZFN HSPC 세포를 생성시키고, 세포 샘플을 형질감염 후 3일째에 수집하고 정밀한 서열분석에 의해 BCL11A 적혈구 인핸서 영역 파괴의 수준에 대해 분석하였다. 이는 실험 1의 경우 SB ZFN 형질감염된 샘플내에서 대략 67%의 변형된 BCL11A 대립형질 및 실험 2의 경우 58%를 나타내었다(표 14).
이러한 단일 세포 분석을 수행하기 위해, 2개의 상이한 실험(1 및 2)으로부터의 SB ZFN HSPC내의 개개의 세포를 분류하고 96 웰 플레이트에 플레이팅(plating)하고 시험관내에서 적혈구 분화시키고, 개개의 단일 세포 배양물을 고 출력 DNA 서열분석 및 또한 UPLC에 의한 글로빈 발현 분석 각각으로 분석하였다.
단일 세포 배양물에 대한 MiSeq 유전형 결과를 표 14에 요약한다. SB ZFN 처리된 HSPC 세포의 각각의 로트(lot)의 경우, 200 내지 300개 사이의 개개 단일 세포 백혈구 배양물을 분석하였다. 명확한 표현형을 가진 모든 클론(혼합된 클론을 제외하였다. 실험 1의 경우 205개 클론 및 실험 2의 경우 265개 클론) 중에서, 실험 1 및 2 각각에 대해 28 또는 36%는 야생형 크론(+/+)이고, 14 또는 11%는 이종접합체 클론(+/ )이며, 58 또는 52%는 동종접합( / ) 클론이다. SB ZFN 처리된 세포로부터 기원한 단일 세포 적혈구 배양물 속의 대립형질 중에서, 실험 1 및 2 각각에 대해 65% 또는 58%가 BCL11A 적혈구 인핸서 유전자자리에서 파괴되었다. 어떠한 변형된 대립형질을 지닌 모든 단일 세포 적혈구 배양물 중에서, 변형된 세포 클론의 81%(실험 1) 또는 82%(실험 2)는 파괴된 BCL11A 대립형질 둘 다를 가졌다.
표 14: SB ZFN 형질감염된 HSPC로부터 기원한 단일 세포 적혈구 배양물의 유전형
Figure pct00021
상기 데이타는 58 내지 67%의 표적화된 BCL11A 적혈구 인핸서 변형을 지닌 SB ZFN HSPC의 혼주물이 28 내지 36%의 야생형 세포, 11 내지 14%의 단독대립형질 변형을 지닌 세포 및 52 내지 58%의 표적 유전자자리의 이대립 변형을 지닌 세포로 구성되었음을 나타낸다.
명확한 유전형을 지닌 클론 중에서, 152 및 172개 클론(각각 실험 1 및 2)는 NucRed 균주에 의해 측정된 핵 제거율에 의해 나타낸 것으로서, 시험관내에서 적혈구 세포로 성공적으로 분화하였다. 이들 단일 세포 적혈구 배양물을 이후에 역상 UPLC 분석에 적용시켜 글로빈 쇄 발현 수준을 측정하였다. 콜로니는 이들의 적혈구 성숙도에 있어서 상이하였으며; γ/β 글로빈 비에서의 일부 변화가 동일한 BCL11A 적혈구 인핸서 유전형을 지닌 콜로니내에서도 예측되었다. 더욱이, BCL11A 적혈구 인핸서의 파괴된 대립형질의 분획은 잠재적으로 GATA 1 결합 부위를 유지한 결과로서 부분적으로 또는 완전한 작용을 보유할 수 있다(Vierstra et al (2015) Nat Methods. 12(10): 927-30; Canver et al (2015) Nature 527(7577): 192-7).
데이타에서 알 수 있는 바와 같이(도 13), 상기 결과는 BCL11A 적혈구 인핸서 유전자자리에 대한 콜로니의 유전형과 이의 γ/β 글로빈 비 사이에 명확한 상관관계를 나타내었다. 구체적으로, BCL11A의 이대립형질(동종접합성) 변형을 지니는 콜로니는 실험 1 및 2 각각에 대해 35% 및 39%의 정상화된 평균 γ/β 비를 가졌고, 단독대립형질(이종접합) 변형을 지닌 콜로니는 실험 1 및 2 각각에 대해 19% 및 13%의 정상화된 평균 γ/β 비를 가졌으며, 야생형 콜로니는 실험 1 및 2 각각에 대해 14% 및 13%를 가졌다. 웰치 교정(Welch's correction)을 사용한 2개의 테일된 t 시험(two tailed t test)에서, "이종접합 대 야생형" 비교의 P 값은 실험 1 및 2 둘 다에 대해 <0.0001이며; "이종접합 대 동종접합" 비교의 P 값은 실험 1에 대해 <0.0001이고 실험 2에 대해 0.0025이며; "이종접합 대 야생형" 비교의 P 값은 실험 1 및 2 둘 다에 대해 각각 0.02 및 0.0002이다. 하기 그래프(도 13)에서, γ/β 및 γ/α 글로빈 비를 검정한 콜로니 모두에 대해 플롯팅하고, BCL11A 적혈구 인핸서 대립형질의 유전형 부류로 분류하였다.
본원에서 언급된 모든 특허, 특허원 및 공보는 이의 전문이 참고로 본원에 포함된다.
개시내용이 이해의 명확성을 목적으로 하여 예증 및 실시예의 방식으로 일부 상세히 제공하였지만, 다양한 변화 및 변형이 본 개시내용의 취지 또는 영역으로부터 벗어남이 없이 실시될 수 있음이 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 따라서, 앞서의 성멸 및 실시예는 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다.
<110> SANGAMO BIOSCIENCES, INC. <120> NUCLEASE-MEDIATED REGULATION OF GENE EXPRESSION <130> 8328-0132.40 <140> PCT/US2016/032049 <141> 2016-05-12 <150> 62/303,595 <151> 2016-03-04 <150> 62/160,396 <151> 2015-05-12 <160> 38 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 aaagcaactg ttagcttgca ctagacta 28 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Asp Gln Ser Asn Leu Arg Ala 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Arg Pro Tyr Thr Leu Arg Leu 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Ser Gly Tyr Asn Leu Glu Asn 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Gln Ser Gly Thr Arg Asn His 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Leu Lys Arg Thr Leu Lys Arg 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Ser Ser Ser Asn Leu Thr Asn 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Ser Ser Ser Asn Leu Gly Asn 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Ser Arg Ser Ala Leu Arg Val 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Arg Ser Arg Asp Leu Thr Arg 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Phe Arg Gln Thr Arg Ala Arg 1 5 <210> 31 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 His Thr Lys Ile His Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val Lys Ser Lys Ser 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Arg Glu Leu Glu Glu Lys 20 25 <210> 32 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 His Thr Lys Ile His Leu Arg Gly Ser Ile Ser Arg Ala Arg Pro Leu 1 5 10 15 Asn Pro His Pro Glu Leu Glu Glu Lys 20 25 <210> 33 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 His Thr Lys Ile His Leu Arg Gly Ser Ile Ser Arg Ala Arg Pro Leu 1 5 10 15 Asn Pro His Pro Glu Leu Glu Glu Lys 20 25 <210> 34 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 His Thr Lys Ile His Leu Arg Gly Ser Tyr Ala Pro Met Pro Pro Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Glu Lys 20 25 <210> 35 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (21)..(24) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 35 acacgacgct cttccgatct nnnnagtcct cttctacccc acc 43 <210> 36 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 gacgtgtgct cttccgatct ctactcttag acataacaca cc 42 <210> 37 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (68)..(72) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 37 nnnnagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 60 tttagtcnnn nnagtgtgga aaatctctag cag 93 <210> 38 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (26)..(30) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 38 nnnnctgcta gagattttcc acactnnnnn gactaaaagg gtctgaggga tctctagtta 60 ccagagtcac acaacagacg ggcacacact act 93

Claims (25)

  1. 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, F1 내지 F4, F1 내지 F5 또는 F1 내지 F6로 지정된 4, 5, 또는 6개의 핑거(finger)를 포함하며, 각각의 핑거는 표적 소부위를 인식하는 인식 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 단백질(zinc finger protein):
    (i) 하기와 같은 인식 나선 영역(recognition helix region)을 포함하는 단백질:
    F1: STGNLTN(서열 번호: 7);
    F2: TSGSLTR(서열 번호: 5);
    F3: DQSNLRA(서열 번호: 2); 및
    F4: AQCCLFH(서열 번호: 6); 또는
    (ii) 다음과 같은 인식 나열 영역을 포함하는 단백질:
    F1: DQSNLRA(서열 번호: 2);
    F2: RPYTLRL(서열 번호: 3);
    F3: SRGALKT(서열 번호: 8);
    F4: TSGSLTR(서열 번호: 5);
    F5: DQSNLRA(서열 번호: 2); 및
    F6: AQCCLFH(서열 번호: 6);
    (iii) 다음과 같은 인식 나선 영역을 포함하는 단백질:
    F1: DQSNLRA(서열 번호: 2);
    F2: RNFSLTM(서열 번호: 9);
    F3: SNGNLRN(서열 번호: 10) 또는 STGNLTN(서열 번호: 7) 또는 SSYNLAN(서열 번호: 11);
    F4: TSGSLTR(서열 번호: 5);
    F5: DQSNLRA(서열 번호: 2); 및
    F6: AQCCLFH(서열 번호: 6); 또는
    (iv) 다음과 같은 인식 나선 영역을 포함하는 단백질:
    F1: RSDHLTQ(서열 번호: 13);
    F2: QSGHLAR(서열 번호: 14);
    F3: QKGTLGE(서열 번호: 15);
    F4: RHRDLSR(서열 번호: 18); 및
    F5: RRDNLHS(서열 번호: 17); 또는
    (v) 다음과 같은 인식 나선 영역을 포함하는 단백질:
    F1: RNDHRTT(서열 번호: 19);
    F2: QKAHLIR(서열 번호: 20);
    F3: QKGTLGE(서열 번호: 15);
    F4: RGRDLSR(서열 번호: 21) 또는 LKRTLKR(서열 번호: 25); 및
    F5: RRDNLHS(서열 번호: 17); 또는
    (vi) 다음과 같은 인식 나선 영역을 포함하는 단백질:
    F1: RSDHLTQ(서열 번호: 13);
    F2: QRAHLTR(서열 번호: 22);
    F3: QKGTLGE(서열 번호: 15) 또는 QSGTRNH(서열 번호: 24);
    F4: HRNTLVR(서열 번호: 23); 및
    F5: RRDNLHS(서열 번호: 17); 또는
    (vii) 다음과 같은 인식 나선 영역을 포함하는 단백질:
    F1: RSDHLTQ(서열 번호: 13);
    F2: QKAHLIR(서열 번호: 20);
    F3: QKGTLGE(서열 번호: 15) 또는 QSGTRNH(서열 번호: 24);
    F4: RGRDLSR(서열 번호: 21); 및
    F5: RRDNLHS(서열 번호: 17); 또는
    (viii) 다음과 같은 인식 나선 영역을 포함하는 단백질:
    F1: F1: RSDHLTQ(서열 번호: 13);
    F2: QSGHLAR(서열 번호: 14);
    F3: QSGTRNH(서열 번호: 24);
    F4: QSSDLSR(서열 번호: 16); 및
    F5: RRDNLHS(서열 번호: 17).
  2. 청구항 1의 아연 핑거 단백질 및 작용성 도메인을 포함하는, 융합 단백질.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 작용성 도메인이 전사 활성화 도메인, 전사 억제 도메인(transcriptional repression domain), 또는 절단 도메인인, 융합 단백질.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 한 항의 아연 핑거 단백질을 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
  5. 청구항 2 또는 청구항 3의 융합 단백질 또는 청구항 4의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 세포.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 세포가 줄기 세포 또는 전구체 세포인, 세포.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 세포가 사람 세포인, 세포.
  8. 청구항 5 내지 청구항 7 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 게놈이 상기 융합 단백질에 의해 변형된, 세포.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 게놈 변형이 삽입, 결실 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 세포.
  10. 청구항 8 또는 청구항 9에 있어서, 상기 게놈 변형이 상기 BCL11A 인핸서 서열의 +58 영역 내에 있는, 세포.
  11. 청구항 5 내지 청구항 10 중의 어느 한 항의 세포로부터 생산된, 세포 또는 세포주.
  12. 청구항 5 내지 청구항 11 중의 어느 한 항의 세포 또는 세포주로부터 내려온(descended), 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포.
  13. 청구항 5 내지 청구항 12 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 게놈 변형이 없는 세포와 비교하여 감마 및/또는 베타 글로빈의 증가된 발현을 나타내는, 세포.
  14. 청구항 2 또는 청구항 3의 융합 단백질, 청구항 4의 폴리뉴클레오타이드 또는 청구항 5 내지 청구항 13 중의 어느 한 항의 세포를 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 세포내에서 내인성 BCL11a 인핸서 서열을 변형시키는 방법으로서,
    청구항 2 또는 청구항 3의 융합 단백질 또는 청구항 4의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포에 투여함으로써 상기 내인성 BCL11a 인핸서 서열이 변형되도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 외인성 서열을 상기 세포 내로 도입함으로써 상기 외인성 서열이 상기 내인성 BCL11a 인핸서 서열내로 삽입되도록 하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 변형이 결실을 포함하는, 방법.
  18. 대상체에서 글로빈 생산을 증가시키는 방법으로서,
    청구항 5 내지 청구항 13 중의 어느 한 항의 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 대상체가 사람이고 상기 세포가 사람 줄기 세포 또는 사람 전구체 세포인, 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 세포가 골수 이식체 및 세포 이식체(cell engraft)내에 투여되어, 상기 대상체 내에서 분화되고 성숙되는, 방법.
  21. 청구항 18 내지 청구항 20 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 혈색소병증(hemoglobinopathy)을 갖는, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 혈색소병증이 베타-지중해빈혈(beta-thalassemia) 또는 겸상 적혈구(sickle cell) 질환인 방법.
  23. 내인성 BCL11A 인핸서 서열내에서 게놈 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 세포를 생산하는 방법으로서,
    a) 세포를, 절단 도메인을 포함하는, 청구항 2 또는 청구항 3의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계;
    b) 상기 세포를, 상기 폴리뉴클레오타이드로부터의 상기 융합 단백질의 발현을 이끄는 조건에 적용시키는 단계; 및
    c) 상기 내인성 BCL11A 인핸서 서열을, 상기 유전적으로 변형된 세포를 생산하기에 충분한 상기 발현된 융합 단백질로 변형시키는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 세포를 적어도 하나의 사이토킨으로 자극시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  25. 청구항 1 내지 청구항 3 중의 어느 한 항의 단백질, 청구항 4의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 청구항 5 내지 청구항 13 중의 어느 한 항의 세포를 포함하는, 키트(kit).
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