JP2021106611A - ヌクレアーゼ介在性遺伝子発現調節 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年5月12日に出願された米国仮特許出願第62/160,396
号、及び2016年3月4日に出願された米国仮特許出願第62/303,595号の利
益を主張するものであり、それらの開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込
まれる。
である。
子が含まれているが、転写制御因子は2000個より少ないことが明らかになっており、
このことを考えると、遺伝子発現の時間的、発生的及び組織特異的な各種発現のすべてに
おいて遺伝子発現を制御するために多数の因子が相互に作用しているはずであることが明
白になる。遺伝子の発現は、基本転写制御因子と特異的転写制御因子とが極めて複雑に混
ざりあって制御されており、発現は、シス作用性DNAエレメントによっても制御され得
る。これらのDNAエレメントは、DNAの局所エレメント、例えばコアプロモーター及
びその関連転写因子結合部位、ならびに遠位エレメント、例えばエンハンサー、サイレン
サー、インスレーター及び遺伝子座制御領域(LCR)の両エレメントを含む(Mats
on et al(2006)Ann Rev Genome Hum Genet7:
29−50を参照のこと)。
、ヒト免疫グロブリン重鎖座位において見出された。現在では、エンハンサーが多くの遺
伝子の発現において調節的役割を果たしていることが知られており、主に遺伝子発現の時
間的及び空間的パターンを支配すると考えられる。また、エンハンサーは、遺伝子のコア
プロモーターからの距離に依存せず、かつ、プロモーターに対するいかなる特定配列方向
にも依存しない様態で機能することも見出されている。エンハンサーは、コアプロモータ
ー領域の数百キロベース上流または下流に位置し得、イントロン配列内に位置するか、ま
たは遺伝子の3’末端を越えて位置し得る。
のような標的化切断事象を使用して、例えば、標的変異原性誘導、細胞DNA配列の標的
欠失の誘導、及び所定の染色体座における標的組換えの促進が可能である。例えば、参照
によりその開示内容全体が組み込まれる、米国特許第9,255,250号;第9,20
0,266号;第9,045,763号;第9,005,973号;第9,150,84
7号;第8,956,828号;第8,945,868号;第8,703,489号;第
8,586,526号;第6,534,261号;第6,599,692号;第6,50
3,717号;第6,689,558号;第7,067,317号;第7,262,05
4号;第7,888,121号;第7,972,854号;第7,914,796号;第
7,951,925号;第8,110,379号;第8,409,861号;米国特許公
開第20030232410号;第20050208489号;第2005002615
7号;第20050064474号;第20060063231号;第20080159
996号;第201000218264号;第20120017290号;第20110
265198号;第20130137104号;第20130122591号;第201
30177983号;第20130196373号;第20150056705号及び第
20150335708号を参照のこと。
EJ)による切断修復または修復鋳型を用いた修復(相同組換え型修復、すなわちHDR
)によって関心対象の遺伝子ノックアウトまたは配列が挿入され得るように(標的を狙っ
た組込み)、人工的切断系を使用して標的DNA配列内に二本鎖切断(DSB)またはニ
ックを誘導する方法が用いられる。この方法は、ゲノム配列の部位特異的変更をドナーオ
リゴヌクレオチドの使用を介して導入するためにも使用でき、これには、ゲノム領域の特
定の欠失もしくは特定の点変異または局所改変の導入が含まれる(遺伝子修正としても知
られる)。切断は、人工ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)などの特定ヌクレアー
ゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、または特定の切断を先
導する人工crRNA/tracr RNA(「一本鎖ガイドRNA」)を用いるCRI
SPR/Casシステムの使用を介して生じ得る。さらに、アルゴノートシステムに基づ
いた標的化ヌクレアーゼが開発されつつあり(例えば、T.thermophilus由
来のものは「TtAgo」として知られており、Swarts et al(2014)
Nature507(7491):258−261を参照のこと)、これも、ゲノム編集
及び遺伝子治療において使用される可能性があり得る。
te)は、血液の主要細胞成分である。事実、RBCはヒトの細胞の4分の1を占める。
ヒトでは、成熟RBCは細胞核及び他の多くの細胞小器官を欠いており、ヘモグロビンと
いう、組織に酸素を運搬し、組織から二酸化炭素を運び出して肺へ戻り二酸化炭素を除去
させる働きをする金属タンパク質で満たされている。このタンパク質はRBCの乾燥重量
の約97%を構成し、血液の酸素運搬能を約70倍増加させる。ヘモグロビンは、2本の
アルファ(α)様グロビン鎖及び2本のベータ(β)様グロビン鎖及び4つのヘム基を含
むヘテロ四量体である。成人では、α2β2四量体はヘモグロビンA(HbA)または成
人型ヘモグロビンと呼ばれる。典型的に、アルファグロビン鎖及びベータグロビン鎖は約
1:1の比で合成され、この比がヘモグロビン及びRBCの安定化という点で重要である
と考えられる。発生過程の胎児では、母体の血流を介して酸素が胎児の全身に送達される
よう、酸素に対する結合親和性がヘモグロビンAよりも高くなっている胎児ヘモグロビン
(HbF)という異なる形態のヘモグロビンが生成される。胎児グロビンをコードする遺
伝子は2つあり、これらは配列が非常に類似しており、HPG1(Gガンマとも呼ばれる
)及びHPG2(Aガンマ)と呼ばれる。胎児ヘモグロビンタンパク質もまた、2本のα
グロビン鎖を含んでいるが、成人型βグロビン鎖の代わりに2本の胎児ガンマ(γ)グロ
ビン鎖を有している(すなわち、胎児ヘモグロビンはα2γ2となる)。妊娠約30週目
に、胎児におけるガンマグロビン合成は低下し始める一方、ベータグロビンの生成が増加
する。生後約10か月までに、新生児のヘモグロビンはほぼすべてα2β2となるが、一
部のHbFは成人期まで持続する(総ヘモグロビンの約1〜3%)。ガンマグロビンから
ベータグロビンへの生成切り替え制御は極めて複雑であり、主に、ガンマグロビン転写の
下方制御と同時にベータグロビン転写の上方制御が行われている。
ミアなどのヘモグロビン異常症として知られる多数の疾患の原因となり得る。ヘモグロビ
ン異常症の患者の大部分では、ガンマグロビンをコードする遺伝子がそのまま存在してい
るが、発現は、上記のように分娩期に生じる正常な遺伝子抑制のため比較的低い。
はサハラ砂漠以南のアフリカ系の人々である。鎌状赤血球変異のヘテロ接合体の保因者に
とってはマラリア防御に関して利益となるようであることから、この形質が長い年月の間
に積極的に選択されてきた可能性があり、そのため、サハラ砂漠以南のアフリカでは人口
の3分の1が鎌状赤血球形質を有していると推定される。鎌状赤血球症は、6番目のアミ
ノ酸がグルタミン酸からバリンに置換された(DNAレベルでGAGがGTGになる)結
果βグロビン遺伝子が変異することにより生じ、それによって生成されたヘモグロビンは
「ヘモグロビンS」または「HbS」と呼ばれる。低酸素条件下では、酸素非結合型のH
bSの立体構造変化により、EヘリックスとFヘリックスの間のタンパク質上の疎水性パ
ッチが露出される。ヘモグロビンのベータ鎖の6位にある疎水性残基のバリンは疎水性パ
ッチと会合できるので、HbS分子の凝集を引き起こし繊維状の沈降物を形成させる。こ
れらの凝集体がRBCの異常、すなわち「鎌状化」を引き起こし、細胞の柔軟性が失われ
る。鎌状のRBCは、もはや形を変形させて毛細血管床に入り込むことができなくなり、
鎌状赤血球患者に血管閉塞クリーゼを引き起こし得る。さらに、鎌状RBCは正常RBC
よりも脆弱なうえ、溶血しやすく、最終的に患者は貧血になる。
輸血による治療を生涯にわたって行う。1つの方法としてヒドロキシ尿素の使用があり、
ガンマグロビンの産生を増加させることにより部分的にその効果を発揮する。しかし、慢
性的なヒドロキシ尿素療法の長期的副作用は未だ不明であり、治療により望ましくない副
作用がある上、有効性は患者によってばらつきがある。鎌状赤血球治療の有効性が増して
いるにもかかわらず、患者の寿命は未だ50歳半ばから後半にしか届かず、それに関連す
る疾患罹病率が患者の生活の質に与える影響は深刻である。
現低下を伴う。この疾患は、遺伝子の調節領域の変異によって、またはグロビンをコード
する配列の変異から起こり得、機能性グロビンタンパク質の発現低下またはレベル低下を
もたらす。アルファサラセミアは主に西アフリカ系及び南アジア系の人々に関連しており
、マラリア抵抗性をもたらす可能性がある。ベータサラセミアは主に地中海系の人々、典
型的にギリシャからトルコ及びイタリアの沿岸地域の人々に関連している。サラセミアマ
イナーでは、βグロビンアレルのうち1遺伝子のみが変異を有している。個体は小球性貧
血に罹患し、通常、平均赤血球容積が正常値より低いことにより検出される(<80fL
)。サラセミアマイナーに罹患した対象のアレルはβ+/βまたはβ0/βである(ここ
で、「β+」は、いくらかの量のβ鎖を形成させるアレルを指し、「β」は、野生型βグ
ロビンアレルを指し、「β0」は、欠失のいくつかの形態を含むβグロビン変異を指す)
。中間型サラセミアの罹患者は通常の生活を営むことができる場合が多いが、特に病気の
時または妊娠中はときおり輸血を要する場合があり、罹患者の貧血の重症度により異なる
。これらの患者のアレルはβ+/β+またはβo/β+であり得る。サラセミアメジャー
はアレルの両方にサラセミア変異がある場合に生じる。これは重度の小球性低色素性貧血
である。未治療の場合、貧血、脾腫及び重度の骨変形を引き起こす。進行して20歳前に
死亡する。治療は、定期輸血;脾腫の場合は脾摘出術、及び輸血が原因の鉄過剰のキレー
ト化で構成される。重度サラセミア罹患者の治療には、適切なドナーの同定が可能であれ
ば骨髄移植も用いられているが、この手順には相当なリスクがあり得る。
ビンの発現を増加させて、HbFで異常な成人型ヘモグロビンを機能的に置き換えること
である。上述のように、ヒドロキシ尿素を用いるSCD患者の治療は、ガンマグロビンの
発現増加に効果があることから部分的に成功であると考えられている。ガンマグロビン再
活性化作用に影響を与えることが発見された最初の化合物群は細胞障害性薬物であった。
薬理学的に操作してガンマグロビンをデノボ合成させる能力が最初に示されたのは、実験
動物における5−アザシチジンの使用においてであった(DeSimone(1982)
Proc Nat’l Acad Sci USA79(14):4428−31)。そ
の後の研究により、5−アザシチジンのβ−サラセミア患者及び鎌状赤血球症患者におけ
るHbF増加能が確認された(Ley,et al.,(1982)N.Engl.J.
Medicine,307:1469−1475、及びLey,et al.,(198
3)Blood62:370−380)。さらに、短鎖脂肪酸(例えば、酪酸及び誘導体
)はHbFを増加させることが実験系で示されている(Constantoulakis
et al.,(1988)Blood72(6):1961−1967)。また、ヒ
ト集団の一部に「遺伝性高胎児ヘモグロビン血症」(HPFH)として知られる病態を有
する集団があり、高量のHbFが成人期まで持続している(HPFHのヘテロ接合体では
10〜40%(Thein et al(2009)Hum.Mol.Genet18(
R2):R216−R223を参照のこと)。これはまれな病態であるが、関連するベー
タグロビン異常が何ら見られない場合は、個体のヘモグロビンの100%がHbFの場合
であっても有意な臨床症状を伴うことはない。ベータサラセミアに罹患している個体が同
時にHPFHに罹患している場合、HbFの発現により疾患の重症度が軽減され得る。さ
らに、鎌状赤血球症の自然経過の重症度は患者ごとに有意に異なり得、このばらつきを突
き詰めると、一部には、疾患がより軽度な一部の個体では、より高レベルのHbFが発現
しているという事実が原因であり得る。
果たす遺伝子の同定が行われる。そのような遺伝子の1つにBCL11Aがあり、最初は
リンパ球発生において役割を果たすことから同定された。BCL11Aは、ガンマグロビ
ン発現の発生段階特異的な調節に関与すると考えられているジンクフィンガータンパク質
をコードする。BCL11Aは成人赤血球前駆細胞に発現し、その発現が下方制御される
とガンマグロビンの発現が増加する。さらに、BCL11A mRNAのスプライシング
は発生段階的に調節されると考えられる。胚細胞では、BCL11A−S及びBCL11
A−XSとして知られるBCL11A mRNAのより短い変異型が主に発現するのに対
し、成人細胞では、より長いBCL11A−L及びBCL11A−XLのmRNA変異型
が主として発現すると考えられる。Sankaran et al(2008)Scie
nce322 p.1839を参照のこと。BCL11Aタンパク質は、ベータグロビン
遺伝子座と相互作用してそのコンホメーションを改変することにより異なる発生段階で発
現すると考えられる。BCL11A遺伝子を標的とする抑制性RNAの使用が提案されて
いるが(例えば、米国特許公開第20110182867号を参照のこと)、この技術に
はいくつかの潜在的欠点がある。すなわち、完全なノックダウンが達成されない可能性が
あること、そのようなRNAの送達が問題を生じる可能性があること、及びそうしたRN
Aは必ず継続的に存在することから、生涯にわたり複数の治療が必要になるのである。
BCL11Aエンハンサー配列を標的にすることによりHbFを増加させる機構が提供
される。例えば、米国特許公開第20150132269号を参照のこと。ゲノムワイド
関連解析により、HbF高レベルに関連する、BCL11Aでの一組の遺伝子変異型が同
定されている。これらの変異型は、系譜が限定された段階特異的なエンハンサー領域とし
て機能するBCL11Aの非コード領域に見られるSNPの集まりである。さらなる研究
により、このBCL11Aエンハンサーは、BCL11Aが発現するために赤血球細胞に
おいては必要とされるが、B細胞での発現には必要とされないことが明らかになった(B
auer et al,(2013)Science343:253−257を参照のこ
と)。エンハンサー領域はBCL11A遺伝子のイントロン2内で見出され、イントロン
2内に3つのDNAseI高感受性領域(調節能に関連する、クロマチンの状態を示すこ
とが多い)が同定された。これらの3領域は、BCL11Aの転写開始部位からのキロベ
ース単位の距離に従って「+62」、「+58」及び「+55」として同定された。これ
らのエンハンサー領域は、約350(+55)、550(+58)、及び350(+62
)のヌクレオチド長である(Bauer2013、同書)。
したがって、BCL11A遺伝子発現を改変して、例えば鎌状赤血球症及びベータサラ
セミアなどのヘモグロビン異常症を治療するためのさらなる方法及び組成物が必要とされ
ている。
体的には、記載の方法及び組成物は、BCL11A遺伝子、例えば、1つ以上のさらなる
遺伝子の調節因子として作用する遺伝子を不活性化させる(例えば、その発現を完全また
は部分的に消失させる)ことに関する。特に、本発明は、BCL11A遺伝子におけるエ
ンハンサー機能を阻害し、特定の細胞系譜におけるその活性を減弱またはノックアウトさ
せる方法及び組成物を記載する。さらに、本発明は、エンハンサー配列がBCL11A遺
伝子内に位置していないBCL11Aエンハンサー機能を阻害する方法及び組成物を提供
する。こうした状況においてBCL11A遺伝子が下方制御される結果、ガンマグロビン
の発現増加がもたらされる。
ンガータンパク質(ZFP)を含む天然には生じないジンクフィンガータンパク質を含み
、各フィンガーは、標的サブサイトを認識する、表1に一列で示した順序の配列を含む認
識ヘリックス領域を含む。ある実施形態では、ZFPは、51446、51463、51
484、51856、51857または51862(配列番号1で示される標的部位に結
合する)及び51536、51949、51990、51993、51979、5198
2、52015、52032(配列番号12で示される標的部位に結合する)として表さ
れるタンパク質に対する、表1に示す認識ヘリックスを含む。したがって、ある実施形態
では、以下の認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質を提供する。
(i)F1:STGNLTN(配列番号7)、
F2:TSGSLTR(配列番号5)、
F3:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F4:AQCCLFH(配列番号6)、または
(ii)F1:DQSNLRA(配列番号2)、
F2:RPYTLRL(配列番号3)、
F3:SRGALKT(配列番号8)、
F4:TSGSLTR(配列番号5)、
F5:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F6:AQCCLFH(配列番号6)、
(iii)F1:DQSNLRA(配列番号2)、
F2:RNFSLTM(配列番号9)、
F3:SNGNLRN(配列番号10)もしくはSTGNLTN(配列番号7)もしくは
SSYNLAN(配列番号11)、
F4:TSGSLTR(配列番号5)、
F5:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F6:AQCCLFH(配列番号6)、または
(iv)F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QSGHLAR(配列番号14)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)、
F4:RHRDLSR(配列番号18)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(v)F1:RNDHRTT(配列番号19)、
F2:QKAHLIR(配列番号20)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)、
F4:RGRDLSR(配列番号21)もしくはLKRTLKR(配列番号25)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(vi)F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QRAHLTR(配列番号22)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)もしくはQSGTRNH(配列番号24)、
F4:HRNTLVR(配列番号23)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(vii)F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QKAHLIR(配列番号20)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)もしくはQSGTRNH(配列番号24)、
F4:RGRDLSR(配列番号21)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(viii)F1:F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QSGHLAR(配列番号14)、
F3:QSGTRNH(配列番号24)、
F4:QSSDLSR(配列番号16)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)。
(例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、切断ドメイン(ジンクフィンガーヌ
クレアーゼ形成のため)など)と融合させる。ジンクフィンガーヌクレアーゼを二量体化
する対に使用して、ZFNが標的とするその対の一方もしくは両方の部位またはその近傍
で切断してよく、例えば表1の「左のパートナー」(例えば、51446、51463、
51484、51856、51857、または51862)は、表1の「右のパートナー
」(例えば、51536、51949、51990、51993、51979、5198
2、52015、または52032)と二量体を形成してBCL11Aエンハンサー配列
を切断することができる。
例えば、BCL11Aエンハンサー配列に結合するヌクレアーゼ)をヒトの幹細胞または
前駆細胞(HSC/PC)に送達することを含む。ある実施形態では、ヌクレアーゼは、
4つ、5つまたは6つのフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質(ZFP)を含み
、各フィンガーは、標的サブサイトを認識する、表1に一列で示した順序の配列を含む認
識ヘリックス領域を含む。本明細書に記載するヌクレアーゼ(複数可)は、リンカー、例
えば、配列番号26〜29及び米国特許公開第20150132269号に示されるよう
なリンカーを(例えば、DNA結合ドメインと切断ドメインの間に)さらに含んでよい。
クレアーゼを、少なくとも1つのヌクレアーゼをコードする核酸として送達する。いくつ
かの実施形態では、2つ以上のヌクレアーゼを使用する。いくつかの好ましい実施形態で
は、ヌクレアーゼをコードする核酸はmRNAであり、ある場合にはmRNAが保護され
ている。いくつかの態様では、mRNAを化学的に修飾してよい(例えば、Korman
n et al,(2011)Nature Biotechnology29(2):
154−157を参照のこと)。他の態様では、mRNAはARCAキャップを含んでよ
い(米国特許第7,074,596号及び第8,153,773号を参照のこと)。さら
なる実施形態では、mRNAは非修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドとの混合物を含ん
でよい(米国特許公開第2012/0195936号を参照のこと)。好ましい実施形態
では、ヌクレアーゼをコードする核酸(複数可)を、電気穿孔法によりHSC/PCに送
達する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、転写因子の結合部位またはその近傍
で切断する。いくつかの態様では、転写因子はGATA−1である。
1Aエンハンサー配列が本明細書に記載のヌクレアーゼ(例えば、表1に示す)によって
遺伝子改変を受けている細胞または細胞株を含む。本明細書に記載する、ヌクレアーゼに
より改変された細胞または細胞株は、構造及び/または機能において野生型細胞及び他の
改変(ヌクレアーゼ介在性)細胞のいずれとも区別できる。遺伝子が改変された細胞また
は細胞株は、ヘテロ接合体の改変であってもホモ接合体の改変であってもよい。改変には
、挿入(例えば、導入遺伝子挿入)、欠失及び/またはその組み合わせが含まれてよい。
いくつかの好ましい実施形態では、挿入、欠失及び/またはその組み合わせの結果、転写
因子結合部位が破壊される。ある実施形態では、改変は、ヌクレアーゼ(複数可)が結合
及び/または切断する部位(複数可)もしくはその近傍であり、例えば、切断部位(複数
可)から上流または下流へ1〜300塩基対以内(すなわち、その範囲のあらゆる塩基対
数)、より好ましくは、表1に示す結合及び/または切断の部位(複数可)の片側の1〜
100塩基対以内(すなわち、その範囲のあらゆる塩基対数)、よりさらに好ましくは、
結合及び/または切断の部位(複数可)の片側の1〜50塩基対以内(すなわち、その範
囲のあらゆる塩基対数)である。改変には、切断部位及び/または1つ以上の結合部位に
おける1つ以上のヌクレオチドに対する改変が含まれてもよい。ある実施形態では、ヌク
レアーゼ標的部位(複数可)のうち1つまたは複数部位は改変されない。他の実施形態で
は、ヌクレアーゼ(複数可)の標的となる部位のうち少なくとも1つ(複数可)を改変す
る。ある実施形態では、改変はBCL11Aエンハンサーの「+58」領域またはその近
傍であり、例えば、配列番号1及び配列番号12のいずれかで示されるヌクレアーゼ結合
部位またはその近傍である。いかなる細胞または細胞株であっても本明細書に記載のよう
にヌクレアーゼによって改変してよく、例えば、幹細胞(CD34+ 造血幹細胞のよう
な造血幹細胞)または赤血球(RBC)前駆細胞であってよい。また、本明細書に記載の
ようにヌクレアーゼによる改変後に得られる細胞または細胞株、例えば、ヌクレアーゼの
改変を受けた細胞または細胞株に由来する細胞または細胞株についても記載する。本明細
書に記載のような改変幹細胞に由来する部分的または完全に分化した細胞も提供する(例
えば、RBCまたはRBC前駆細胞)。ヌクレアーゼの改変を受けた細胞に由来する細胞
は、インビトロ(培養)で増殖(及び/または分化)させてもよいし、また例えば、ヌク
レアーゼの改変を受けた幹細胞のエキソビボ投与の後に、生きている対象内で分化させて
もよい。本明細書に開示する遺伝子改変細胞または細胞株は、ガンマグロビンの発現増加
を示し得る。本明細書に記載する遺伝子改変細胞を含む医薬組成物などの組成物もまた提
供される。
み込まれている遺伝子改変細胞を得ることを含む。ドナーは、表1のヌクレアーゼ(複数
可)をコードする核酸より前、後、または同時に送達されてよい。ドナー核酸は、細胞の
ゲノム、例えば、内在性遺伝子座に組み込まれるべき外来配列(導入遺伝子)を含んでよ
い。いくつかの実施形態では、ドナーは、標的切断部位と相同性のある領域が隣接してい
る完全長遺伝子またはその断片を含んでよい。いくつかの実施形態では、ドナーは相同領
域を欠き、相同性非依存的機構(すなわちNHEJ)を介して標的遺伝子座に組み込まれ
る。ドナーは任意の核酸配列を含んでよく、例えば、ヌクレアーゼで誘導された二本鎖切
断を相同組換えで修復するための基質として核酸を使用した場合に、ドナー指定による欠
失を、内在性染色体座(例えば、BCL11Aエンハンサー領域)に生じさせるか、また
は(もしくは、さらに)、新規なアレル形態(例えば、転写因子結合部位を排除する点変
異)の内在性遺伝子座を作製させる核酸を含んでよい。いくつかの態様では、ドナー核酸
は、組込みにより遺伝子修正事象、または標的欠失がもたらされるオリゴヌクレオチドで
ある。
子導入法及び/またはウイルスを用いない遺伝子導入法によって送達される。好ましい実
施形態では、アデノ随伴ウイルス(AAV)を介して細胞にドナーを送達する。ある場合
には、AAVは、カプシドの血清型と比較して異なる血清型のLTRを含む。
DNAseI高感受性領域内にある領域(例えば、BCL11Aエンハンサーの+58領
域)を含めた欠失を作製する。これらの欠失は、約1ヌクレオチドから約551ヌクレオ
チドを含み得る。したがって、欠失は、1、5、10、15、20、25、30、40、
50,100,150、200,250,300、350,400,450、500、5
50のヌクレオチド、またはその間のあらゆる数のヌクレオチドを含み得る。いくつかの
実施形態では、欠失は、1つ以上の転写因子に対する結合領域を含む。いくつかの好まし
い実施形態では、欠失は、GATA−1結合部位、または他の因子と組み合わされている
GATA−1に対する結合部位を含む。
いくつかの態様には、DNA結合ドメインと遺伝子発現を調節できるドメインとの融合が
含まれる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、モジュレーターが遺伝子発現を
抑制する遺伝子発現調節ドメインと融合させた、表1のDNA結合領域を含む。
NA結合タンパク質(すなわち、表1に示すZFP)とを接触させる。いくつかの実施形
態では、ヌクレアーゼ及び/またはDNA結合タンパク質を核酸として送達し、他の実施
形態ではそれらをタンパク質として送達する。いくつかの実施形態では、核酸は、ヌクレ
アーゼ及び/またはDNA結合タンパク質をコードするmRNAであり、さらなる実施形
態では、mRNAは保護されてよい。いくつかの実施形態では、mRNAは化学的に修飾
されてよく、mRNAはARCAキャップを含んでよく、かつ/またはmRNAは非修飾
ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの混合物を含んでよい。これらの細胞に由来する細胞ま
たは細胞株もまた提供され、部分的または完全に分化した細胞が含まれる。
た後、HSC/PCと、本発明のヌクレアーゼ及び/またはDNA結合タンパク質とをエ
キソビボで接触させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するヌクレアーゼによ
りBCL11Aエンハンサー領域内に改変が生じ、それにより例えば、構造的及び/また
は機能的に野生型及び/もしくは他の改変型(例えば、ヌクレアーゼの改変を受けた)細
胞とは異なる遺伝子改変細胞が得られる。さらなる実施形態では、BCL11Aエンハン
サー領域の改変を含有しているHSC/PCを再び対象体内に導入する。ある場合には、
BCL11Aエンハンサー領域の改変を含有しているHSC/PCを増殖させてから導入
を行う。他の態様では、遺伝子改変HSC/PCを骨髄移植で対象に与え、その場合、H
SC/PCは生体内で生着し、分化し、成熟する。いくつかの実施形態では、HSC/P
Cは、G−CSF及び/またはプレリキサフォルで誘導した動員後に対象から単離され、
また他の実施形態では、ヒト骨髄またはヒト臍帯からそれらの細胞を単離する。いくつか
の態様では、対象に軽度の骨髄破壊的手技で処置を施してから、改変HSC/PCを含む
移植片を導入し、また他の態様では、強力な骨髄破壊的前処置レジメンで対象を治療する
。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物を使用して異常ヘモグロビン症の治
療または予防を行う。いくつかの態様では、異常ヘモグロビン症はベータサラセミアであ
り、また他の態様では、異常ヘモグロビン症は鎌状赤血球症である。
実施形態では、ドナー分子をウイルスベクターによって送達する。ドナー分子は、プロモ
ーターの有無にかかわらず、機能性ポリペプチドをコードする配列(例えば、cDNAま
たはその断片)を1つ以上含んでよい。不活性化にドナー分子を使用する場合はさらなる
配列(コード配列または非コード配列)が含まれてよく、2Aペプチド、SA部位、IR
ESなどをコードする配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
含む。ヌクレアーゼ及び/またはDNA結合タンパク質を、当技術分野で公知の方法によ
りインサイチュでHSC/PCに送達する。いくつかの実施形態では、本発明のヌクレア
ーゼ及び/またはDNA結合タンパク質は、必要性のある対象に投与されるウイルス粒子
を含み、また他の実施形態では、ヌクレアーゼ及び/またはDNA結合タンパク質は、ナ
ノ粒子(例えば、リポソーム)を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子及び/ま
たはナノ粒子を、HSC/PCが存在している臓器(例えば、骨髄)に送達する。
法を本明細書に記載する。方法は、ドナー核酸がDSB部位で組み込まれるように、細胞
のゲノムに二本鎖切断(DSB)を作製し、本明細書に記載のヌクレアーゼを使用してド
ナー分子を切断することを含む。ある実施形態では、非相同性依存的方法(例えば、NH
EJ)を介してドナー核酸を組込む。上記のように、インビボでの切断時、DSBの位置
で標的を定めて細胞のゲノムにドナー配列が組み込まれ得る。ドナー配列は、DSB作製
に用いられるヌクレアーゼの1つ以上が標的とする同じ標的部位を1つ以上含むことがで
きる。したがって、ドナー配列は、組込みが所望されている内在性遺伝子の切断に使用さ
れるヌクレアーゼと同一のヌクレアーゼの1つ以上によって切断されてよい。ある実施形
態では、ドナー配列には、DSB誘導に使用されるヌクレアーゼとは異なるヌクレアーゼ
の標的部位が含まれる。標的細胞のゲノムのDSBは、どのような機構で作製してもよい
。ある実施形態では、1つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)と、関心対象
領域内の配列に結合するよう人工的に操作された、ジンクフィンガー結合ドメインを含む
融合タンパク質と、切断ドメインまたは切断ハーフドメインとによってDSBを作製する
。
節を行う、関心対象の調節タンパク質(例えば、ZFP TF、TALE TFまたはC
RISPR/Cas TF)をコードしてよい。一実施形態では、調節タンパク質は、D
NA配列に結合して他の調節因子の結合を妨げる。別の実施形態では、調節タンパク質の
結合により、標的DNAの発現を調節(すなわち、誘導または抑制)してよい。
、ヒト遺伝子をコードする導入遺伝子が含まれる。ある場合には、トランスジェニック動
物は、外来導入遺伝子と対応する内在性遺伝子座にノックアウトを含み、これにより、ヒ
トタンパク質を単体で研究できるインビボ系を作製することができる。そのようなトラン
スジェニックモデルは、関心対象のヒトタンパク質と相互作用するかまたはそれを改変す
る、低分子または生体高分子または他の実体を同定するためのスクリーニング用に使用さ
れ得る。いくつかの態様では、導入遺伝子を、幹細胞(例えば、胚性幹細胞、人工多能性
幹細胞、造血幹細胞など)または本明細書に記載する任意の方法により得られる動物胚の
選択遺伝子座(例えば、セーフハーバー座位)に組み込み、その後、生きた動物が出生す
るようその胚を移植する。その後、動物を性成熟まで飼育し、少なくとも出生児の一部が
編集された内在性遺伝子配列または組込み導入遺伝子を含む出生児を得る。
遺伝子)を改変する方法を本明細書で提供し、かかる方法は、本明細書に記載(表1に記
載)する1つ以上のヌクレアーゼを、該1つ以上のタンパク質が発現し、その遺伝子の発
現が改変されるような条件下で上記の細胞内に導入することを含む。ある実施形態では、
グロビン遺伝子(例えば、ガンマグロビンまたはベータグロビン)の発現を改変する(例
えば、増加させる)。本明細書に記載するいずれの方法も、ドナー配列(例えば、外来プ
ロモーターまたは内在性プロモーターの制御下の導入遺伝子またはその断片)を細胞のゲ
ノムに組み込むこと、例えば、ドナーをBCL11A遺伝子のヌクレアーゼ切断部位また
はその近傍に組み込むことをさらに含んでよい。ウイルスベクターをオリゴヌクレオチド
として、かつ/またはプラスミド上で用いて細胞にドナー配列を導入する。遺伝子発現が
改変された細胞は、例えば、赤血球(RBC)前駆細胞及び/または造血幹細胞(例えば
、CD34+細胞)であってよい。
Aエンハンサー配列のヌクレオチド配列に対する改変)を含む遺伝子改変細胞を作製する
方法を本明細書で提供し、かかる方法は、a)各々が、表1に一列で示される順序の認識
ヘリックス領域を含むジンクフィンガードメインを4つ、5つ、または6つ含んでいるジ
ンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド(例えば、DNAまたはmR
NA)と細胞とを接触させ;b)該細胞を、前記ポリヌクレオチドからジンクフィンガー
タンパク質発現が導かれる条件に供し;かつc)遺伝子改変細胞の作製に十分な発現ジン
クフィンガータンパク質を用いて内在性BCL11Aエンハンサー配列を改変する各工程
を含む。ある実施形態では、少なくとも1つのサイトカインで細胞を刺激する(例えば、
工程(a)の前)。ポリヌクレオチドは、任意の好適な方法を使用して細胞と接触させて
よく、これにはトランスフェクションを介した方法、非ウイルスベクターを使用する方法
、ウイルスベクターを使用する方法、化学的手段による方法または電場による方法(例え
ば、電気穿孔法)が含まれるが、これらに限定されるものではない。
、これには、本明細書に記載の方法で作製された細胞に由来する細胞が含まれる。
方法は、本明細書に記載するような製剤(遺伝子改変細胞、タンパク質及び/またはポリ
ヌクレオチド)を患者のグロビン遺伝子発現を増加させるのに十分な量で患者に投与する
ことを含む。ある実施形態では、患者は、サラセミアまたは鎌状赤血球症に罹患している
ことが既知であるか、それに罹患している疑いがあるか、またはその発症リスクがある。
。キットは、ヌクレアーゼをコードする核酸(例えば、好適な発現ベクターに含有されて
いる遺伝子をコードする、RNA分子またはZFN、TALENもしくはCRISPR/
Casシステム)、またはヌクレアーゼタンパク質の一定分量、ドナー分子、好適な幹細
胞性修飾因子、細胞、緩衝剤、及び/または説明書(例えば、本発明の方法実施について
)等を含んでよい。本発明には、限定されることなく、ヌクレアーゼによって作製したゲ
ノム改変(例えば、表1に一列で示されている)を少なくとも1つ含む遺伝子改変細胞(
例えば、造血(CD34+)幹細胞またはRBC前駆細胞のような幹細胞)が含まれ、こ
こで、ゲノム改変は内在性BCL11Aエンハンサー配列内にあり、さらに、ゲノム改変
は、挿入、欠失及びその組み合わせからなる群から選択され、かつ配列番号1及び配列番
号12のいずれかまたはその近傍における改変を含む。ある実施形態では、細胞は、本明
細書に記載する幹細胞に由来する遺伝子改変を行った分化細胞である(例えば、造血幹細
胞またはRBC前駆細胞に由来するRBC)。
、表1に示すような)及び/または少なくとも1つのTALENを含んでよく、ヌクレア
ーゼ(複数可)は、ヌクレアーゼ(複数可)をコードするタンパク質形態で、かつ/また
はポリヌクレオチドとして細胞に導入されてよい。ある実施形態では、ゲノム改変は、導
入遺伝子をコードするドナーポリヌクレオチドの組込みを含む挿入を含む。また、本明細
書に記載する遺伝子改変細胞の1つ以上を含む医薬組成物も提供される。
むジンクフィンガータンパク質を含んだDNA結合タンパク質も提供され、ここで、ジン
クフィンガータンパク質は、表1に一列で示される順序の認識ヘリックス領域を含む。ま
た、表1に示す標的部位の塩基対部分(例えば、少なくとも4つ、5つ、6つまたはそれ
以上)を含む配列に結合する複数の繰返しを含むTALEタンパク質も提供される。本明
細書に記載するジンクフィンガータンパク質またはTALEタンパク質と、野生型または
人工的に操作した切断ドメインもしくは切断ハーフドメインとを含む融合タンパク質もま
た、本明細書に記載するタンパク質(ZFP、TALE、ZFN、TALEN)をコード
するポリヌクレオチドとして提供される。本明細書に記載する1つ以上のポリヌクレオチ
ド及び/またはタンパク質を含む細胞(例えば、造血(CD34+)幹細胞のような単離
幹細胞)もまた提供される。本明細書に記載するタンパク質、ポリヌクレオチド及び/ま
たは細胞を1つ以上含むキットもまた提供される。
を改変する方法もまた記載され、かかる方法は、細胞内に、本明細書に記載する1つ以上
のヌクレアーゼをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上のタンパク質が発
現し、かつグロビン遺伝子の発現(例えば、ガンマ及び/またはベータグロビン)が改変
される(例えば、増加させる)ような条件下で導入することを含む。ある実施形態では、
方法はさらに、例えば、ウイルスベクターをオリゴヌクレオチドとして使用するかまたは
プラスミド上で使用して、細胞のゲノムにドナー配列を組み込むことを含む。ドナー配列
は、内在性または外来性のプロモーターの制御下の導入遺伝子を含んでよい。
ム改変を含む遺伝子改変細胞を作製する方法も提供され、かかる方法は、(a)各々が表
1に一列で示される順序の認識ヘリックス領域を含んでいるジンクフィンガードメインを
4つ、5つ、または6つ含むジンクフィンガーヌクレアーゼを含む融合タンパク質コード
するポリヌクレオチドと細胞とを接触させ;(b)該細胞を、ポリヌクレオチドから融合
タンパク質の発現が導かれる条件に供し;かつ(c)遺伝子改変細胞の作製に十分な発現
融合タンパク質を用いて内在性BCL11Aエンハンサー配列を改変する各工程を含む。
ある実施形態では、方法はさらに、少なくとも1つのサイトカインで細胞を刺激すること
を含む。ポリヌクレオチド(複数可)は、例えば、ウイルスを用いない送達システム、ウ
イルスを用いた送達システム、及び/または送達ビヒクルを使用して、細胞内部に送達さ
れてよく、それには細胞を電場に供することを含んでよい。
β−サラセミア)または鎌状赤血球症などのグロビン異常症に罹患していることが既知で
ある、罹患の疑いがある、または発症リスクがある)を治療する方法もまた提供され、か
かる方法は、本明細書に記載する医薬組成物(例えば、タンパク質、ポリヌクレオチド及
び/または細胞)を、患者のグロビン遺伝子発現を増加させるのに十分な量で患者に投与
することを含む。
操作、ならびにヘモグロビン異常症の治療及び/または予防を行うための組成物及び方法
を開示する。特に、表1に一列で示されている認識ヘリックス領域を有するZFPを含む
ヌクレアーゼは、HSC/PCで効率的に達成され、その後の赤血球新生時に相対的なガ
ンマグロビン発現に変化をもたらす。こうしたBCL11A及びガンマグロビン発現の調
節は、ベータグロビンの発現が不十分であるか、またはベータグロビンの変異型の発現が
あるヘモグロビン異常症(例えば、ベータサラセミア、鎌状赤血球症)の治療に特に有用
である。本発明の方法及び組成物を用いると、赤血球前駆細胞でのガンマグロビン発現を
改変することによって、異常ベータグロビンが原因で生じる合併症及び疾患関連後遺症を
克服することができる。
本明細書に開示する方法、ならびに組成物の調製と使用の実施には、特に明記しない限
り、分子生物学、生化学、クロマチン構造と解析、計算化学、細胞培養、組換えDNA及
び当技術分野の技能の範囲内である関連分野の従来技術が採用される。これらの技術は文
献で十分に説明されている。例えば、Sambrook et al.MOLECULA
R CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edi
tion,Cold Spring Harbor Laboratory Press
,1989及びThird edition,2001;Ausubel et al.
,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、
John Wiley&Sons,New York,1987及び定期更新版;MET
HODS IN ENZYMOLOGYシリーズ,Academic Press,Sa
n Diego;Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND F
UNCTION,Third edition,Academic Press,San
Diego,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.30
4,“Chromatin」(P.M.Wassarman and A.P.Wolf
fe,eds.),Academic Press,San Diego,1999;及
びMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,“C
hromatin Protocols」(P.B.Becker,ed.)Human
a Press,Totowa,1999を参照のこと。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は同じ意味
で使用され、直鎖または環状のコンホメーションをした一本鎖もしくは二本鎖形態にある
、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的の
場合、これらの用語は、ポリマーの長さについて限定するものと解釈されるべきではない
。これらの用語は、天然型ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分及び
/またはリン酸部分(例えば、ホスホロチオエート骨格)が改変されているヌクレオチド
を包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は塩基対合の特異性が同じであり、
すなわち、Aの類似体はTと塩基対合することになる。
れ、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、アミノ酸ポリマーにも適用され、
その場合は、1つ以上のアミノ酸が、対応する天然に生じるアミノ酸の化学的類似体また
は改変による誘導体である。
の間)の相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、結合相互作用
のすべての構成要素が配列特異的(例えば、DNA骨格のリン酸残基との接触)である必
要はない。そのような相互作用は一般に10−6M−1以下の解離定数(Kd)によって
特徴づけられる。「親和性」とは結合強度を指し、高結合親和性と低いKdとは相関する
。
パク質は、例えば、DNA分子(DNA結合タンパク質)、RNA分子(RNA結合タン
パク質)及び/またはタンパク質分子(タンパク質結合タンパク質)に結合することがで
きる。タンパク質結合タンパク質の場合は自身に結合することができ(ホモ二量体、ホモ
三量体などを形成)、かつ/または、異なる1つまたは複数のタンパク質の1つ以上の分
子に結合することができる。結合タンパク質は、1種以上の結合活性を有し得る。例えば
、ジンクフィンガータンパク質には、DNA結合活性、RNA結合活性及びタンパク質結
合活性がある。
配位を介してその構造が安定化されている、結合ドメイン内のアミノ酸配列領域であるジ
ンクフィンガーの1つ以上を介してDNAに配列特異的に結合するタンパク質、またはよ
り大きいタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーDNA結合タンパク質という
用語は、しばしばジンクフィンガータンパク質またはZFPと略称される。
ユニットを1つ以上含むポリペプチドである。繰返しドメインは、TALEがその対応す
る標的DNA配列に結合する際に関与している。単一の「繰返しユニット」(「繰返し」
ともいう)は、典型的に33〜35アミノ酸長であり、天然に生じるTALEタンパク質
内部では、他のTALE繰返し配列との配列相同性を少なくとも一部に示す。
オチド配列に結合させることができ、例えば、天然に生じるジンクフィンガーまたはTA
LEタンパク質の認識ヘリックス領域の人工的な操作(1つ以上のアミノ酸の改変)を介
して可能である。したがって、人工的に操作されたDNA結合タンパク質(ジンクフィン
ガーまたはTALE)は天然には生じないタンパク質である。DNA結合タンパク質を人
工的に操作する方法の非限定的な例は設計及び選択である。設計されたDNA結合タンパ
ク質は、その設計/組成が主に合理的基準から得られる天然には生じないタンパク質であ
る。設計の合理的基準には、置換規則の適用、ならびに既存のZFP及び/またはTAL
Eの設計と結合に関するデータが保存されているデータベース内の情報を処理するコンピ
ュータアルゴリズムが含まれる。例えば、米国特許第6,140,081号;第6,45
3,242号;第6,534,261号及び第8,585,526号を参照のこと。また
、WO98/53058;WO98/53059;WO98/53060;WO02/0
16536及びWO03/016496も参照のこと。
ば、ファージ提示、相互作用トラップまたはハイブリッド選択を行った結果作製される自
然界では見られないタンパク質である。例えば、米国特許第5,789,538号;第5
,925,523号;第6,007,988号;第6,013,453号;第6,200
,759号;第8,586,526号;WO95/19431;WO96/06166;
WO98/53057;WO98/54311;WO00/27878;WO01/60
970 WO01/88197,WO02/099084を参照のこと。
ルゴノートタンパク質である。TtAgoは、細菌Thermus thermophi
lusに由来する。例えば、Swarts et al(同書)、G.Sheng et
al.,(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,
652を参照のこと)。「TtAgoシステム」は、例えば、ガイドDNAなど、TtA
go酵素による切断に必要な全構成要素である。
相同性末端結合(NHEJ)及び相同組換えによるドナーの捕捉を含むが、これに限定さ
れるものではない。本開示の目的の場合、「相同組換え(HR)」とは、そのような情報
交換の特殊な形態を指し、例えば、相同組換え型修復機構を介した細胞の二本鎖切断の修
復中に生じる交換をいう。この過程は、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」
分子を鋳型に使用して「標的」分子(すなわち、二本鎖切断を受けた分子)を修復し、ま
たドナーから標的へと遺伝情報の導入がもたらされることから「非交差型遺伝子変換(n
on−crossover gene conversion)」または「ショートトラ
クト遺伝子変換(short tract gene conversion)」として
さまざまな名称で知られる。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、その
ような導入には、破壊された標的とドナーの間で形成されるヘテロ二重鎖DNAのミスマ
ッチ修正、及び/またはドナーを使用して、標的の一部となるであろう遺伝情報及び/ま
たは関連過程を再合成する「合成依存的鎖アニーリング」を使用することができる。この
ような特殊HRの結果、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌ
クレオチドに組み込まれるような標的分子の配列改変が生じることが多い。
における標的配列(例えば、細胞クロマチン)に二本鎖切断(DSB)が作製される。D
SBは、相同組換え型修復または非相同組換え型修復機構による欠失及び/または挿入を
生じさせてよい。欠失には塩基対がいくつ含まれてもよい。同様に、挿入には、例えば、
任意選択で切断領域のヌクレオチド配列に対して相同性のある、「ドナー」ポリヌクレオ
チドの組込みを含む塩基対がいくつ含まれてもよい。ドナー配列は物理的に組み込んでよ
く、または別法として、ドナーポリヌクレオチドを、相同組換えを介した切断修復用の鋳
型に使用して、ドナーのヌクレオチド配列のすべてまたは一部を細胞クロマチンに導入す
る。したがって、細胞クロマチンの第1の配列は、改変が可能であり、ある実施形態では
、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換可能である。したがって、「置換する」
または「置換」という用語の使用は、1つのヌクレオチド配列を別のヌクレオチド配列で
置換することを表すものと理解することができ(すなわち、情報の意味での配列の置換)
、必ずしもあるポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドで物理的または化学的に置換さ
れる必要はない。
本鎖切断に、ジンクフィンガータンパク質またはTALENのさらなる対を使用すること
ができる。
ー配列を標的を狙って組み込むことにより、大きさを問わないドナーの挿入、及び/また
は細胞内の1つ以上の標的配列の部分的もしくは完全な不活性化を行うために使用するこ
とができる。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株もまた提供される
。
または「導入遺伝子」)は、関心対象領域のゲノム配列に対して相同であるが同一ではな
い配列を含有することができ、それにより、相同組換えが促進され関心対象領域に非同一
配列が挿入される。したがって、ある実施形態では、関心対象領域内の配列に相同なドナ
ー配列部分は、置換されたゲノム配列に対し約80〜99%(またはその範囲のあらゆる
整数)の配列同一性を示す。他の実施形態では、ドナー配列とゲノム配列の相同性は、例
えば、ドナー配列とゲノム配列の100連続塩基対に対し1ヌクレオチドのみが異なる場
合の99%よりも高い。特定の場合では、ドナー配列の非相同部分は、関心対象領域に新
たな配列が導入されるよう、その関心対象領域に存在しない配列を含有することができる
。これらの場合、非相同配列は一般に、関心対象領域内の配列に相同または同一な、50
〜1,000塩基対(またはその範囲の任意の整数値)または1,000より大きい任意
の数の塩基対からなる配列に隣接している。他の実施形態では、ドナー配列は第1の配列
に対して非相同であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入される。
合の酵素による加水分解または化学的加水分解などを含むが、これに限定されるものでは
ない多様な方法によって開始させることができる。一本鎖切断及び二本鎖切断のいずれも
可能であるが、二本鎖切断は、2つの別個の一本鎖切断事象の結果として生じ得る。DN
A切断により平滑末端または突出末端(staggered end)のいずれかが生成
され得る。ある実施形態では、標的とする二本鎖DNAに対し融合ポリペプチドを使用す
る。
共に、切断活性(好ましくは二本鎖切断活性)を有する複合体を形成するポリペプチド配
列である。「第1の切断ハーフドメイン及び第2の切断ハーフドメイン」;「+の切断ハ
ーフドメイン及び−の切断ハーフドメイン」及び「右の切断ハーフドメイン及び左の切断
ハーフドメイン」という用語は同じ意味で使用され、二量体化する切断ハーフドメインの
対を指す。
ハーフドメイン)と偏性ヘテロ二量体(obligate heterodimer)を
形成するよう改変されている切断ハーフドメインである。参照によりその全体が本明細書
に組み込まれる米国特許公開第2005/0064474号、第20070218528
号、第20080131962号及び第20110201055号も参照のこと。
あり得、直鎖、環状または分岐であり得、一本鎖でも二本鎖でもあり得る。用語「ドナー
配列」とは、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、どの長さでも
可能であり、例えば、2〜100,000,000ヌクレオチド長(またはその範囲もし
くはそれより上の任意の整数値)、好ましくは約100〜100,000ヌクレオチド長
(またはその範囲のあらゆる整数)、より好ましくは約2000〜20,000ヌクレオ
チド長(すなわち、その範囲のあらゆる値)、さらにより好ましくは約5〜15kb(す
なわち、その範囲のあらゆる値)であり得る。
核酸、主にDNA、ならびにヒストン及びヒストン以外の染色体のタンパク質などのタン
パク質を含む。真核細胞のクロマチンの大部分はヌクレオソームという形態で存在し、そ
こでは、ヌクレオソームコアは、H2A、H2B、H3及びH4それぞれのヒストンを2
つずつ含む八量体と会合した、約150塩基対のDNAを含み、ヌクレオソームコア同士
の間にリンカーDNA(長さは生物により異なる)が伸びている。ヒストンH1分子は一
般にリンカーDNAと会合している。本開示の目的の場合、用語「クロマチン」は、原核
生物及び真核生物両方の、あらゆる種類の細胞の核タンパク質が包含されるものとする。
細胞クロマチンには、染色体クロマチンもエピソームクロマチンも含まれる。
ノムはその核型によって特徴づけられることが多く、この核型にはその細胞のゲノムを含
む染色体すべてが集められている。細胞のゲノムは1つ以上の染色体を含み得る。
は含まれていない核酸を含む他の構造体である。エピソームの例には、プラスミド及び特
定のウイルスゲノムが含まれる。
が結合できる、細胞クロマチン内の部位である。いかなる特定の理論にも束縛されること
は望まないが、接近可能領域は、ヌクレオソーム構造にパッケージされない領域であると
考えられる。接近可能領域の特徴的な構造はしばしば、化学的プローブ及び酵素を用いた
プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性により検出され得る。
結合することになる核酸の一部を定義する核酸配列である。
の方法によって細胞に導入され得る分子である。「通常は細胞に存在していること」は、
その細胞の特定の発生段階及び環境条件について決定される。したがって、例えば、筋肉
の胚発生過程にしか存在しない分子は、成人筋細胞に対しては外来分子である。同様に、
熱ショックで誘導された分子は、熱ショックを受けていない細胞に対しては外来分子であ
る。外来分子は、例えば、機能不全を起こしている内在性分子の機能するタイプまたは正
常に機能している内在性分子の機能不全を起こしているタイプを含むことができる。
れたもの、または高分子、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リ
ポタンパク質、多糖類、もしくは上記分子の改変による任意の誘導体、または上記分子を
1つ以上含む任意の複合体であり得る。核酸にはDNA及びRNAが含まれ、一本鎖また
は二本鎖であり得、直鎖、分岐または環状であり得、かつ、任意の長さであり得る。核酸
には、二重鎖を形成できるもの、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許
第5,176,996号及び第5,422,251号を参照のこと。タンパク質には、D
NA結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化DNA結合タン
パク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キ
ナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラー
ゼ、ジャイレース及びヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
あり得る。例えば、外来核酸は、細胞に導入された感染性のウイルスゲノム、プラスミド
もしくはエピソーム、または通常は細胞に存在しない染色体を含み得る。細胞に外来分子
を導入する方法は当業者に公知であり、脂質介在性導入法(すなわち、中性脂質及びカチ
オン性脂質などのリポソーム)、電気穿孔法、直接注入、細胞融合、粒子撃込み、リン酸
カルシウム共沈降法、DEAE−デキストランによる誘導型導入法及びウイルスベクター
による導入法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。外来分子はまた、内在
性分子と同じ種類であるが、細胞が由来している種とは異なる種に由来する分子でもあり
得る。例えば、ヒト核酸配列を、元々はマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入
してよい。外来分子を植物細胞に導入する方法は当業者に公知であり、プロトプラスト形
質転換、シリコンカーバイド(例えば、ウイスカー(商標))、Agrobacteri
umによる形質転換、脂質介在性導入法(すなわち、中性脂質及びカチオン性脂質などの
リポソーム)、電気穿孔法、直接注入、細胞融合、粒子撃込み(例えば、「遺伝子銃」を
使用)、リン酸カルシウム共沈降法、DEAE−デキストランによる誘導型導入法及びウ
イルスベクターによる導入法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
胞に通常存在する分子である。例えば、内在性核酸は、染色体、またはミトコンドリア、
葉緑体もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に生じるエピソーム核酸を含み得る
。さらなる内在性分子としては、タンパク質、例えば、転写因子及び酵素を挙げることが
できる。
プチドのいずれの産物も含まれ、例えば、転写産物(RNAなどのポリヌクレオチド)及
び翻訳産物(各種ポリペプチド)が含まれる。
ている分子である。サブユニット分子は、化学的に同じ種類の分子であっても、または化
学的に異なる種類の分子であってもよい。第1の種類の融合分子の例には、融合タンパク
質(例えば、ZFPまたはTALEのDNA結合ドメインと、1つ以上の活性化ドメイン
との融合体)及び融合核酸(例えば、前掲の融合タンパク質をコードする核酸)が挙げら
れるが、これらに限定されるものではない。第2の種類の融合分子の例には、三重鎖形成
核酸とポリペプチドとの融合体、及びマイナーグルーブバインダーと核酸との融合体が挙
げられるが、これらに限定されるものではない。
合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によってもたらされ得、ここ
で、ポリヌクレオチドが転写され、その転写が翻訳されて融合タンパク質が作製される。
トランススプライシング、ポリペプチド切断及びポリペプチドライゲーションもタンパク
質の細胞内発現に使用され得る。細胞にポリヌクレオチド及びポリペプチドを送達する方
法は本開示の他の箇所に記載されている。
照のこと)、ならびに遺伝子産物の生成を調節するすべてのDNA領域が含まれ、そのよ
うな調節配列がコード配列及び/または転写された配列に隣接するか否かは問わない。し
たがって、遺伝子には、プロモーター配列、転写終結因子、リボソーム結合部位及び配列
内リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレータ
ー、境界要素、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが
、必ずしもこれらに限定されるものではない。
。遺伝子産物は、直接の遺伝子転写産物(例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アン
チセンスRNA、リボザイム、構造RNAまたは他の任意の種類のRNA)または、mR
NAの翻訳により生成されたタンパク質であり得る。また遺伝子産物には、キャッピング
、ポリアデニル化、メチル化、及び編集などのプロセスによって改変されたRNA、なら
びに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADPリボース化、ミ
リストイル化、及びグリコシル化によって改変されたタンパク質も含まれる。
遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。ゲノム編集(例えば、切
断、改変、不活性化、ランダム変異)を使用して発現を調節することができる。遺伝子の
不活性化とは、本明細書に記載するZFP、TALEまたはCRISPR/Casシステ
ムを含まない細胞と比べた場合の遺伝子発現の任意の低下を指す。したがって、遺伝子の
不活性化は部分的であっても完全であってもよい。
程度改変されているmRNAである。保護の例には、シチジン残基及びウリジン残基の2
5%を上限に、2−チオウリジン(s2U)及び5−メチルシチジン(m5C)を用いて
置換することが含まれる。得られるmRNAは、対応する非修飾型よりも低い免疫原性及
び高い安定性を示す。(Kariko et al.((2012),Molecula
r Therapy,Vol.16,No.11,pages 1833−1844を参
照のこと)。他の変更としては、いわゆるARCAキャップと呼ばれる付加が挙げられ、
これにより、インビトロで作製されたmRNAの翻訳可能性が高まる(米国特許US70
74596を参照のこと)。
隣接している非コード配列といった、外来分子との結合が望ましい、細胞クロマチンの任
意の領域である。結合は、標的DNA切断及び/または標的組換えが目的であり得る。関
心対象領域は、染色体内、エピソーム内、細胞小器官のゲノム(例えば、ミトコンドリア
のゲノム、葉緑体のゲノム)内、または例えば感染ウイルスゲノム内に存在し得る。関心
対象領域は、遺伝子のコード領域の内部、または例えば、リーダー配列、トレーラー配列
もしくはイントロンといった転写された非コード領域の内部、またはコード領域の上流ま
たは下流の転写されていない領域の内部であり得る。関心対象領域は、単一ヌクレオチド
対ほどの小さな領域もしくは最高2,000ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値
のヌクレオチド対であり得る。
びヒト細胞(例えば、T細胞)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
operatively linked)」(または「機能的に連結された(opera
bly linked)」)という用語は、2つ以上の構成要素(配列要素など)の並置
に関して同じ意味で使用され、その場合、これらの構成要素は、いずれの構成要素も正常
に機能し、かつ、それらの構成要素のうち少なくとも1つが、他の構成要素のうち少なく
とも1つに対する機能発揮を誘導させることができるように並置される。例を挙げると、
プロモーターなどの転写調節配列が、1つ以上の転写調節因子の有無に応答してコード配
列の転写レベルを制御する場合、その転写調節配列は該コード配列に機能的に連結されて
いる。転写調節配列は一般にコード配列とシスで機能的に連結されているが、必ずしもコ
ード配列と直接隣り合っていなくてよい。例えば、エンハンサーは、コード配列に機能的
に連結された転写調節配列であるが、両者は隣接していない。
のように連結されていない場合に考えられる機能と同じ機能を、他の構成要素と連結され
た状態で果たすことを意味し得る。例えば、ZFP、TALEまたはCasのDNA結合
ドメインと活性化ドメインとを融合させた融合ポリペプチドの場合、その融合ポリペプチ
ドにおいて、ZFP、TALEまたはCasというDNA結合ドメイン部分が、その標的
部位及び/またはその結合部位と結合することができ、また活性化ドメインが遺伝子発現
を上方制御することができる場合、該ZFP、TALEまたはCasのDNA結合ドメイ
ンとその活性化ドメインは機能的に連結されている。ZFP、TALEまたはCasのD
NA結合ドメインと切断ドメインとを融合させた融合ポリペプチドの場合、その融合ポリ
ペプチドにおいて、ZFP、TALEまたはCasというDNA結合ドメイン部分が、そ
の標的部位及び/またはその結合部位と結合することができ、また切断ドメインが標的部
位近傍のDNAを切断することができる場合、該ZFP、TALEまたはCasのDNA
結合ドメインと該切断ドメインとは機能的に連結されている。
パク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチド
または核酸と同一の機能を保持しているタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機
能的断片は、対応する天然の分子より多いか、少ないか、または同じ数の残基を有するこ
とができ、かつ/または1つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの置換を含有することが
できる。核酸の機能(例えば、コードする機能、別の核酸とのハイブリダイズ能)を測定
する方法は当技術分野で周知である。同様に、タンパク質の機能を測定する方法は周知で
ある。例えば、ポリペプチドのDNA結合機能は、例えば、フィルター結合アッセイ、電
気泳動移動度シフト解析、または免疫沈降法によって決定することができる。DNA切断
は、ゲル電気泳動によって評価することができる。上記Ausubel et al.を
参照のこと。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共免疫沈降法
、ツーハイブリッド法または相補性(遺伝子相補性及び生化学的相補性の両方)によって
決定することができる。
ー構築体」、「発現ベクター」、及び「遺伝子導入ベクター」とは、関心対象遺伝子の発
現を導くことができ、標的細胞に遺伝子配列を導入することができる任意の核酸構築体を
意味する。したがって、この用語には、クローニング、及び発現ビヒクル、ならびに組み
込みベクターが含まれる。
類といった哺乳類、ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、及び他の動物といっ
た実験動物を指す。したがって、本明細書で使用する「対象」または「患者」という用語
は、本発明の幹細胞が投与され得る任意の哺乳類の患者または対象を意味する。本発明で
の対象には、1種以上の化学的毒素、例えば神経毒素などに曝露された対象が含まれる。
多能性、もしくは寡能性の程度、及び幅広い、または限定されない自己複製といった、個
々の幹細胞どれもが有し得る能力を指す。
本明細書は、導入遺伝子が標的を定めてゲノムに組み込まれるよう、導入遺伝子と、細
胞ゲノムを切断するヌクレアーゼとを担持するドナー分子をインビボで切断するのに有用
な組成物、特にヌクレアーゼについて記載する。ある実施形態では、ヌクレアーゼの1つ
以上は天然に生じるものである。他の実施形態では、ヌクレアーゼの1つ以上は、天然に
は生じない、すなわち、DNA結合ドメイン及び/または切断ドメイン内で人工的に操作
されている。例えば、天然に生じるヌクレアーゼのDNA結合ドメインを、選択標的部位
に結合するよう改変してよい(例えば、対応する結合部位とは異なる部位に結合するよう
人工的に操作されたメガヌクレアーゼ)。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のD
NA結合ドメイン及び切断ドメインを含む(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ;T
ALエフェクタードメインのDNA結合タンパク質;メガヌクレアーゼDNA結合ドメイ
ンと、異種の切断ドメイン)。
ある実施形態では、細胞ゲノムのインビボでの切断及び/または標的化切断に使用され
る1つ以上のヌクレアーゼのDNA結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む
。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、天然には生じないジンクフィンガータン
パク質であり、選択標的部位に結合するよう人工的に操作されたジンクフィンガータンパ
ク質である。例えば、いずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Beer
li et al.(2002)Nature Biotechnol.20:135−
141;Pabo et al.(2001)Ann.Rev.Biochem.70:
313−340;Isalan et al.(2001)Nature Biotec
hnol.19:656−660;Segal et al.(2001)Curr.O
pin.Biotechnol.12:632−637;Choo et al.(20
00)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411−416;米国特許
第6,453,242号;第6,534,261号;第6,599,692号;第6,5
03,717号;第6,689,558号;第7,030,215号;第6,794,1
36号;第7,067,317号;第7,262,054号;第7,070,934号;
第7,361,635号;第7,253,273号;及び米国特許公開第2005/00
64474号;2007/0218528号;2005/0267061号を参照のこと
。
タンパク質と比較して、新規な結合特異性を有し得る。人工的操作方法には、合理的設計
及び各種の選択が挙げられるが、これらに限定されるものではない。合理的設計には、例
えば、3ヌクレオチド(または4ヌクレオチド)の配列及び個々のジンクフィンガーのア
ミノ酸配列を含むデータベースの使用が挙げられ、これにおいて、3ヌクレオチド配列ま
たは4ヌクレオチド配列の各々は、特定の3ヌクレオチド配列または4ヌクレオチド配列
と結合する、ジンクフィンガーの1つ以上のアミノ酸配列に関連している。例えば、参照
によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有米国特許第6,453,242号及び第
6,534,261号を参照のこと。
9,538号;第5,925,523号;第6,007,988号;第6,013,45
3号;第6,410,248号;第6,140,466号;第6,200,759号;及
び第6,242,568号;ならびにWO98/37186;WO98/53057;W
O00/27878;WO01/88197及びGB2,338,237に開示されてい
る。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強作用は、例えば、
共有WO02/077227に記載されている。
及び/またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質を、例えば、5アミノ酸長
以上のリンカーなど、任意の好適リンカー配列を使用して共に連結してよい。6アミノ酸
長以上の例示的リンカー配列については米国特許第6,479,626号;第6,903
,185号;及び第7,153,949号も参照のこと。本明細書に記載するタンパク質
には、そのタンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーのあらゆる組み合わ
せも含まれてよい。
び構築するためのZFP及び方法は当業者に公知であり、米国特許第6,140,081
号;第5,789,538号;第6,453,242号;第6,534,261号;第5
,925,523号;第6,007,988号;第6,013,453号;第6,200
,759号;WO95/19431;WO96/06166;WO98/53057;W
O98/54311;WO00/27878;WO01/60970WO01/8819
7;WO02/099084;WO98/53058;WO98/53059;WO98
/53060;WO02/016536及びWO03/016496に詳述されている。
素(例えば、ジンクフィンガー)の間、1つ以上のDNA結合ドメインの間、及び/また
はDNA結合ドメインと機能性ドメイン(例えば、ヌクレアーゼ)の間に使用してよい。
好適リンカー配列の非限定的な例には、米国特許第8,772,453号;第7,888
,121号;第6,479,626号;第6,903,185号;及び第7,153,9
49号;ならびに米国公開第20090305419号;第20150064789号及
び第20150132269号が挙げられる。したがって、本明細書に記載するタンパク
質には、個々のDNA結合性構成要素間及び/またはDNA結合ドメインと本明細書に記
載する組成物の機能性ドメインとの間の好適なリンカーのあらゆる組み合わせが含まれ得
る。
好適な任意の切断ドメインを、本明細書に記載するDNA結合ドメインに機能的に連結
して、ヌクレアーゼを形成することができる。切断ドメインは、DNA結合ドメイン、例
えばジンクフィンガーDNA結合ドメイン及びヌクレアーゼ由来の切断ドメインにとって
異種であってよい。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレ
アーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼに
は、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これら
に限定されるものではない。例えば、2002−2003 Catalogue,New
England Biolabs,Beverly,MA;及びBelfort et
al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379−3388
を参照のこと。DNAを切断するさらなる酵素が公知である(例えば、S1ヌクレアーゼ
;マングビーンヌクレアーゼ;膵DNaseI;ミクロコッカスヌクレアーゼ;酵母HO
エンドヌクレアーゼ;Linn et al.(eds.)Nucleases,Col
d Spring Harbor Laboratory Press,1993も参照
のこと)。これらの酵素の1つ以上(またはその機能的断片)を切断ドメイン及び切断ハ
ーフドメインの供給源として使用できる。
クレアーゼまたはその部分に由来し得る。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメイン
を含む場合は、切断に2つの融合タンパク質が必要である。別法として、2つの切断ハー
フドメインを含む単一タンパク質を使用できる。かかる2つの切断ハーフドメインは、同
じエンドヌクレアーゼ(またはその機能的断片)に由来し得うるか、または各切断ハーフ
ドメインが異なるエンドヌクレアーゼ(またはその機能的断片)に由来し得る。さらに、
2つの融合タンパク質にとっての標的部位は、かかる2つの融合タンパク質と、各自それ
ぞれの標的部位との結合が、例えば二量体化によって、切断ハーフドメインに機能的切断
ドメインを形成させる、互いに対する空間的配向で切断ハーフドメインを設置するように
、互いに対して配置されるのが好ましい。したがって、ある実施形態では、標的部位の近
端は、5〜8ヌクレオチドまたは15〜18ヌクレオチドによって分離される。しかし、
任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対を2つの標的部位の間に介在させること
ができる(例えば、2〜50ヌクレオチド対またはそれ以上)。一般に、切断の部位は標
的部位と標的部位の間にある。
合(認識部位において)、及び結合部位またはその近傍におけるDNAの切断をすること
ができる。特定の制限酵素(例えば、IIS型)は、認識部位から除かれた部位でDNA
を切断し、分離可能な結合ドメインと切断ドメインを有する。例えば、IIS型酵素であ
るFokIは、一方の鎖上にあるその認識部位から9ヌクレオチドの場所、もう一方の鎖
上のその認識部位から13ヌクレオチドの場所におけるDNAの二本鎖切断を触媒する。
例えば、米国特許第5,356,802号;第5,436,150号及び第5,487,
994号;ならびにLi et al.(1992)Proc.Natl.Acad.S
ci.USA89:4275−4279;Li et al.(1993)Proc.N
atl.Acad.Sci.USA90:2764−2768;Kim et al.(
1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:883−887;K
im et al.(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978−3
1,982を参照のこと。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも
1つのIIS型制限酵素に由来する切断ドメイン(または切断ハーフドメイン)及び1つ
以上のジンクフィンガー結合ドメインを含み、人工的に操作されていても操作されていな
くてもよい。
この特定の酵素は二量体として活性である。Bitinaite et al.(199
8)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570−10,575
。したがって、本開示の目的の場合、開示の融合タンパク質で使用するFokI酵素の部
分は切断ハーフドメインとみなす。したがって、ジンクフィンガー−FokI融合体を使
用する、細胞配列の標的化二本鎖切断及び/または標的化置換では、各々がFokI切断
ハーフドメインを含む2つの融合タンパク質を使用して、触媒的に活性な切断ドメインを
再構成することができる。別法として、ジンクフィンガー結合ドメインと2つのFokI
切断ハーフドメインとを含有している単一ポリペプチド分子を使用することもできる。ジ
ンクフィンガー−FokI融合体を使用する標的化切断及び標的化配列改変のためのパラ
メータは、本開示の他の箇所に記載されている。
体化(例えば、二量体化)して機能的切断ドメインを形成する能力を保持しているタンパ
ク質の任意の部分であり得る。
8,121号に記載されている。さらなる制限酵素もまた、分離可能な結合ドメインと切
断ドメインを含有し、これらは本開示により意図されている。例えば、Roberts
et al.(2003)Nucleic Acids Res.31:418−420
を参照のこと。
つ以上の人工的切断ハーフドメイン(二量体化ドメイン変異体ともいう)を含み、記載は
、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,914,79
6号;第8,034,598号及び第8,623,618号を参照のこと。FokIの4
46位、447位、479位、483位、484位、486位、487位、490位、4
91位、496位、498位、499位、500位、531位、534位、537位、及
び538位のアミノ酸残基はいずれも、FokI切断ハーフドメインの二量体化に影響を
与える標的である。
の切断ハーフドメインがFokIのアミノ酸残基490位及び538位における変異を含
み、第2の切断ハーフドメインがアミノ酸残基486位及び499位における変異を含む
対が含まれる。
置換し、538位における変異はIso(I)をLys(K)に置換し、486位におけ
る変異はGln(Q)をGlu(E)に置換し、499位における変異はIso(I)を
Lys(K)に置換する。具体的には、本明細書に記載する人工的切断ハーフドメインは
、一方の切断ハーフドメインの490位(E→K)及び538(I→K)を変異させて「
E490K:I538K」として表される人工的切断ハーフドメインを作製し、かつ別の
切断ハーフドメインの486位(Q→E)及び499(I→L)を変異させて「Q486
E:I499L」として表される人工的切断ハーフドメインを作製することによって調製
した。本明細書に記載する人工的切断ハーフドメインは、異常な切断を最小限に抑えるか
または消失させる偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、あらゆる目的のためにその開
示内容は全体が参照により組み込まれる米国特許公開第2008/0131962号を参
照のこと。ある実施形態では、人工的切断ハーフドメインは、486位、499位及び4
96位(野生型FokIに対する番号付け)における変異、例えば、486位における野
生型Gln(Q)残基をGlu(E)残基に置換する変異、499位における野生型Is
o(I)残基をLeu(L)残基に置換する変異、及び496位における野生型Asn(
N)残基をAsp(D)またはGlu(E)残基(それぞれ「ELD」及び「ELE」ド
メインともいう)に置換する変異を含む。他の実施形態では、人工的切断ハーフドメイン
は、490位、538位及び537位(野生型FokIに対する番号付け)における変異
、例えば、490位における野生型Glu(E)残基をLys(K)残基に置換する変異
、538位における野生型Iso(I)残基をLys(K)残基に置換する変異、及び5
37位における野生型His(H)残基をLys(K)残基またはArg(R)残基(そ
れぞれ「KKK」及び「KKR」ドメインともいう)に置換する変異を含む。他の実施形
態では、人工的切断ハーフドメインは、490位及び537位(野生型FokIに対する
番号付け)における変異、例えば、490位における野生型Glu(E)残基をLys(
K)残基に置換する変異、537位における野生型のHis(H)残基をLys(K)残
基またはArg(R)残基(それぞれ「KIK」及び「KIR」ドメインともいう)に置
換する変異を含む。例えば、米国特許第7,914,796号;第8,034,598号
及び第8,623,618号を参照のこと。他の実施形態では、人工的切断ハーフドメイ
ンは、「Sharkey」及び/または「Sharkey’」変異を含む(Guo et
al,(2010)J.Mol.Biol.400(1):96−107を参照のこと
)。
ば、米国特許公開第7,888,121号;第7,914,796号;第8,034,5
98号及び第8,623,618号に記載されるように、野生型の切断ハーフドメイン(
FokI)の部位特異的変異誘発によって調製することができる。
酸標的部位においてインビボでヌクレアーゼを構築してよい(例えば、米国特許公開第2
0090068164号を参照のこと)。そのような開裂酵素の構成要素は、別々の発現
構築体のいずれに発現させてもよく、または、個々の構成要素を、例えば自己切断2Aペ
プチドまたはIRES配列によって分離した、1つのオープンリーディングフレーム内に
連結させることができる。構成要素は、個別のジンクフィンガー結合ドメインであっても
、またはメガヌクレアーゼの核酸結合ドメインであってもよい。
記載のように、酵母を用いた染色体系において、活性についての使用前スクリーニングを
行うことができる。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモータ
ーの制御下にあってよく、例として、ラフィノース及び/またはガラクトースの存在下で
活性化(抑制解除)され、グルコース存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーター
がある。
たは一本鎖の切開を作製し得る。ある実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒的に不活性な
切断ドメイン(例えば、FokI及び/またはCasタンパク質)を含む。例えば、米国
特許第9,200,266号;第8,703,489号及びGuillinger et
al.(2014)Nature Biotech.32(6):577−582を参
照のこと。触媒的に不活性な切断ドメインは、触媒的に活性なドメインと組み合わされて
ニッカーゼとして作用して一本鎖切開を作製しよい。したがって、2つのニッカーゼを併
用して特定領域に二本鎖切開を作製することができる。さらなるニッカーゼもまた、当技
術分野で公知であり、例えば、McCaffery et al.(2016)Nucl
eic Acids Res.44(2):e11.doi:10.1093/nar/
gkv878.Epub2015Oct19に記載がある。
上記で詳述されるように、DNAドメインを人工的に操作して、どのような選択配列に
も結合させることができる。人工的に操作されたDNA結合ドメインは、天然に生じるD
NA結合ドメインと比べて新規な結合特異性を有し得る。ある実施形態では、DNA結合
ドメインは、BCL11Aエンハンサー配列内の配列に結合し、例えば、標的部位(典型
的に、塩基対は9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、2
0、21またはそれ以上)はBCL11Aのエキソン2とエキソン3の間にあり、これに
は、表1に示すBCL11Aエンハンサー配列のDNAseI高感受性部位内の配列(例
えば、+58)に結合するDNA結合ドメインが含まれる。人工的操作方法には合理的設
計及び各種の選択が挙げられるが、これらに限定されるものではない。合理的設計には、
例えば、3ヌクレオチド(または4ヌクレオチド)の配列及び個々のジンクフィンガーの
アミノ酸配列を含むデータベースの使用が挙げられ、これにおいて、3ヌクレオチド配列
または4ヌクレオチド配列の各々は、特定の3ヌクレオチド配列または4ヌクレオチド配
列と結合する、ジンクフィンガーの1つ以上のアミノ酸配列に関連している。例えば、参
照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有米国特許第6,453,242号及び
第6,534,261号を参照のこと。TALエフェクタードメインの合理的設計も実施
され得る。例えば、米国公開第20110301073号を参照のこと。
選択方法は、米国特許第5,789,538号;第5,925,523号;第6,007
,988号;第6,013,453号;第6,410,248号;第6,140,466
号;第6,200,759号;及び第6,242,568号;ならびにWO98/371
86;WO98/53057;WO00/27878;WO01/88197及びGB2
,338,237に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結
合特異性の増強作用は、例えば、共有WO02/077227に記載されている。
び構築するためのヌクレアーゼ及び方法は当業者に公知であり、参照によりその全体が本
明細書に組み込まれる米国特許出願公開第20050064474号及び第200601
88987号に詳述されている。
ば、マルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質)及び/またはDNA結合ドメイン
(複数可)と機能性ドメイン(複数可)との融合体を、例えば、5アミノ酸以上のリンカ
ーなど、任意の好適リンカー配列を使用して共に連結してよい。米国特許第8,772,
453号;第7,888,121号(例えば、「ZC」リンカー);第6,479,62
6号;第6,903,185号;及び第7,153,949号;米国公開第200903
05419号)及び第20150064789号。本明細書に記載するタンパク質には、
そのタンパク質の個々のDNA結合ドメイン間の好適なリンカーのあらゆる組み合わせが
含まれてよい。米国特許第8,586,526号も参照のこと。
ある実施形態では、本開示は、本明細書に記載するBCL11Aエンハンサー領域結合
分子を使用して外来配列を細胞のゲノムに組み込む、ヌクレアーゼ介在性の標的化組込み
に関する。上記のように、外来配列(「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝
子」とも呼ばれる)の挿入は、例えば、特定領域の欠損及び/または変異遺伝子の修正ま
たは野生型遺伝子の発現増加のために行う。ドナー配列が、典型的に、それが配置される
ゲノム配列と同一ではないことは容易に明らかとなるであろう。ドナー配列に、相同性の
ある2つの領域が隣接する非相同配列を含有させて、関心対象の位置において効率的なH
DRを行わせることができ、または、非相同組換え型修復機構を介してドナー配列を組み
込むことができる。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン内の関心対象領域に相同では
ない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンに
対して相同性のあるいくつかの不連続領域を含有することができ、例えば、ここに記載の
ヌクレアーゼの1つによって誘導されたDBSの修復用基質として使用した場合に、Bc
l11aエンハンサー領域(またはその断片)の欠損をもたらす。さらに、関心対象領域
に通常存在しない配列を標的化挿入する場合、上記配列をドナー核酸分子に存在させ、関
心対象領域内の配列に対して相同性のある領域を隣接させることができる。
もしくは分子または「導入遺伝子」とも言うことができる。ドナーポリヌクレオチドは、
一本鎖及び/または二本鎖のDNAまたはRNAであり得、直鎖形態または環状形態で細
胞に導入され得る。例えば、米国特許公開第20100047805号及び第20110
207221号を参照のこと。ドナー配列(複数可)は、DNA MC内に含有されるこ
とが好ましく、環状形態または直鎖形態で細胞に導入してよい。直鎖形態で導入する場合
、当業者に公知の方法によってドナー配列の両端を(例えば、エキソヌクレアーゼによる
分解から)保護することができる。例えば、1つ以上のジデオキシヌクレオチド残基を直
鎖型分子の3’末端に付加し、かつ/または自己相補的オリゴヌクレオチドを一端または
両端に連結する。例えば、Chang et al.(1987)Proc.Natl.
Acad.Sci.USA84:4959−4963;Nehls et al.(19
96)Science272:886−889を参照のこと。分解から外来ポリヌクレオ
チドを保護するさらなる方法には、末端アミノ基(複数可)の付加及び、例えば、ホスホ
ロチオエート残基、ホスホルアミダート残基、及びO−メチルリボース残基またはデオキ
シリボース残基のような改変型ヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定
されるものではない。二本鎖形態で導入する場合、ドナーには、1つ以上のヌクレアーゼ
標的部位、例えば、細胞のゲノムに組み込まれるべき導入遺伝子に隣接するヌクレアーゼ
標的部位が含まれてよい。例えば、米国特許公開第20130326645号を参照のこ
と。
遺伝子などのさらなる配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さら
に、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、核酸とリポソームまたはポロキサマー
などの薬剤との複合体として導入することができ、またはウイルス(例えば、アデノウイ
ルス、AAV、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ
欠損型レンチウイルス(IDLV))によって送達することができる。
配列。導入遺伝子ともいう)、例えば、2〜200kb、2〜10kb(またはその範囲
のあらゆる値)の配列(例えば、コード配列。導入遺伝子ともいう)が含まれる。二本鎖
ドナーには、例えば少なくとも1つのヌクレアーゼ標的部位も含まれる。ある実施形態で
は、ドナーには、例えば、ZFN対またはTALEN対のための少なくとも2つの標的部
位が含まれる。典型的に、ヌクレアーゼの標的部位は、導入遺伝子切断について、導入遺
伝子配列の外側、例えば、導入遺伝子配列にとって5’及び/または3’にある。ヌクレ
アーゼ切断部位(複数可)は任意のヌクレアーゼ(複数可)の切断部位であってよい。あ
る実施形態では、二本鎖ドナーに含有されるヌクレアーゼ標的部位(複数可)は、内在性
標的の切断に使用されるヌクレアーゼと同じヌクレアーゼ(複数可)が標的とする部位で
あり、その中に、相同性非依存的方法を介して切断されたドナーが組み込まれる。
ドナーが挿入される内在性遺伝子の発現を誘導するプロモーターによって誘導されるよう
に挿入される(例えば、グロビン、AAVS1など)。しかしながら、ドナーが、プロモ
ーター及び/またはエンハンサー、例えば構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織
特異的プロモーターを含んでよいことは明らかであろう。
在性遺伝子に挿入されてよい。他の実施形態では、導入遺伝子(例えば、グロビンコード
配列を持つかまたは持たないもの)を任意の内在性遺伝子座、例えばセーフハーバー座位
に組み込む。例えば、米国特許公開第20080299580号;第200801599
96号及び第201000218264号を参照のこと。
例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム侵入部位、2
Aペプチドをコードする配列及び/またはポリアデニル化シグナルが含まれてもよい。
公知の標準的技術を使用してプラスミド、細胞または他の供給源から単離されてよい。使
用するドナーは、環状超らせん型、環状弛緩型、直鎖等を含む、トポロジーの種類の変更
を含むことができる。別法として、標準的なオリゴヌクレオチド合成技術を使用して、そ
れらを化学的に合成してよい。さらに、ドナーをメチル化してもメチル化を欠失させても
よい。ドナーは、細菌または酵母の人工染色体の形態(BACまたはYAC)であってよ
い。
基及び/または骨格が含まれてよい。特に、本明細書に記載する方法を使用してメチル化
されたシトシンを有するドナー分子の挿入を実行し、関心対象領域の転写静止状態を達成
してよい。
例示的な外来配列には、任意のポリペプチドコード配列(例えば、cDNA)、プロモー
ター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、標識遺伝子、切断酵素認識部位及び各種
の発現構築体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。標識遺伝子には、抗生
物質耐性(例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、G418耐性、ピューロマイ
シン耐性)を誘導するタンパク質をコードする配列、有色タンパク質または蛍光タンパク
質または発光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤
色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ)及び増強された細胞増殖及び/または遺伝子増幅を
誘導するタンパク質(例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ)をコードする配列が挙げられ
るが、これらに限定されるものではない。エピトープタグには、例えば、FLAG、Hi
s、myc、Tap、HAまたは任意の検出可能なアミノ酸配列のコピーが1つ以上含ま
れる。
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、これには、抗体、抗原、酵素、受容
体(細胞表面または核の)、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペ
プチド、増殖因子、及び上記の任意のものの機能的断片が含まれるが、これらに限定され
るものではない。コード配列は、例えばcDNAであってよい。
いないポリペプチドをコードする配列を含んでよく、そのような疾患には、以下の任意の
遺伝性疾患を含むが、それらに限定されるものではない:軟骨無形成症、色盲、酸性マル
ターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症(OMIM No.102700)、副腎
脳白質ジストロフィー症、アイカルディ症候群、アルファ1アンチトリプシン欠損症、ア
ルファ−サラセミア、アンドロゲン不感性症候群、アペール症候群、不整脈源性右室異形
成、毛細血管拡張性運動失調症、バース症候群、ベータサラセミア、青色ゴム乳首様母斑
症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症(CGD)、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカ
ム病、外胚葉異形成症、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱X症候群、ガ
ラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス(例えばGM1)、血色素症
、ベータグロビンの6番目のコドンにおけるヘモグロビンC変異(HbC)、血友病、ハ
ンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群、クラ
ッベ病、ランガー・ギデオン症候群、白血球接着欠乏症(LAD、OMIM No.11
6920)、異染性白質ジストロフィー、QT延長症候群、マルファン症候群、メビウス
症候群、ムコ多糖症(MPS)、ネイル・パテラ症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニ
ーマン・ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、早老症
、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、
サンフィリッポ症候群、重度複合免疫不全症(SCID)、シュワッハマン症候群、鎌状
赤血球症(鎌状赤血球貧血症)、スミス・マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ
・サックス病、血小板減少‐橈骨欠損(TAR)症候群、トリーチャー・コリンズ症候群
、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォンヒッペル・
リンダウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコッ
ト・アルドリッチ症候群、X連鎖リンパ増殖症候群、(XLP、OMIM No.308
240)。
ソソーム蓄積症(例えば、ゴーシェ病、GM1、ファブリー病及びテイ・サックス病)、
ムコ多糖症(例えば、ハンター病、ハーラー病)、ヘモグロビン異常症(例えば、鎌状赤
血球症、HbC、α−サラセミア、β−サラセミア)及び血友病が挙げられる。
遺伝子(上記)、及びさらなる機能性をコードする連結配列を含むことができる。標識遺
伝子の非限定的な例には、GFP、薬物選択マーカー(複数可)等が挙げられる。
でよい。例えば、野生型の第IX因子遺伝子配列を、該遺伝子の内在性コピーが変異して
いる幹細胞のゲノムに挿入してよい。野生型コピーは、内在性遺伝子座に挿入してもよい
し、または、別の方法でセーフハーバー座位を標的にさせてもよい。
いて周知である方法を利用する(例えば、AusubelまたはManiatisを参照
のこと)。トランスジェニック動物を作製する発現カセットを使用する前に、発現カセッ
トを好適な細胞株(例えば、初代細胞、形質転換細胞、または不死化細胞株)に導入する
ことによって、選択した制御因子と会合したストレス誘導物質に対する発現カセットの反
応性を試験することができる。
えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム侵入部位、2A
ペプチドをコードする配列及び/またはポリアデニル化シグナルであってもよい。さらに
、関心対象遺伝子の制御因子をレポーター遺伝子に機能的に連結してキメラ遺伝子(例え
ば、レポーター発現カセット)を作製することができる。
RNA及びマイクロRNA(miRNA)をコードする配列も標的化挿入に使用され得る
。
である非コード配列を含んでよい。その後、さらなるヌクレアーゼを細胞に発現させて、
関心対象の別のドナー分子の挿入によって本来のドナー分子が切断され改変されるように
してよい。この方法では、ドナー分子の反復組込みが発生し、関心対象の特定の遺伝子座
またはセーフハーバー座位における形質スタッキングを可能にし得る。
本明細書に記載するヌクレアーゼ(表1)、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌ
クレオチド、ドナーポリヌクレオチド及び本明細書に記載するタンパク質及び/またはポ
リヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によってインビボまたはエキソビボで
任意の細胞型に送達され得る。
が挙げられる。そのような細胞から作製される、そのような細胞または細胞株の非限定的
な例には、COS、CHO(例えば、CHO−S、CHO−K1、CHO−DG44、C
HO−DUXB11、CHO−DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI
38、V79、B14AF28−G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0−Ag14
、HeLa、HEK293(例えば、HEK293−F、HEK293−H、HEK29
3−T)、及びperC6細胞ならびにSpodopterafugiperda(Sf
)などの昆虫細胞、またはSaccharomyces、Pichia及びSchizo
saccharomycesなどの真菌細胞が挙げられる。ある実施形態では、細胞株は
CHO、MDCKまたはHEK293の細胞株である。好適な細胞には、あくまでも例示
であるが、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞及び間葉系幹細胞な
どの幹細胞も含まれる。
242号;第6,503,717号;第6,534,261号;第6,599,692号
;第6,607,882号;第6,689,558号;第6,824,978号;第6,
933,113号;第6,979,539号;第7,013,219号;及び第7,16
3,824号に記載されており、これらすべての開示内容は参照によりその全体が本明細
書に組み込まれるものとする。
ZFN(複数可)の1つ以上をコードする配列を含有しているベクターを使用して送達し
てもよい。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ア
デノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター;ヘルペスウイルスベクター及びアデ
ノ随伴ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない任意のベクター系を使用して
よい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第6,534,261号;
第6,607,882号;第6,824,978号;第6,933,113号;第6,9
79,539号;第7,013,219号;及び第7,163,824号も参照のこと。
さらに、これらのベクターのいずれも、治療に必要とされる配列の1つ以上を含んでよい
ことは明らかであろう。したがって、1つ以上のヌクレアーゼ及びドナー構築体を細胞に
導入する場合、ヌクレアーゼ及び/またはドナーポリヌクレオチドは、同じベクター上に
担持されても、または異なるベクター上(DNA MC(複数可))に担持されてもよい
。複数のベクターを使用する場合、各ベクターは、1つまたは複数のヌクレアーゼ及び/
またはドナー構築体をコードする配列を含んでよい。従来のウイルスによる遺伝子導入法
及びウイルスを用いない遺伝子導入法を使用して、ヌクレアーゼ及び/またはドナー構築
体をコードする核酸を細胞(例えば、哺乳類細胞)及び標的組織に導入することができる
。ウイルスを用いないベクターによる送達システムには、DNAまたはRNAプラスミド
、DNA MC、裸の核酸、及びリポソームもしくはポロキサマーなどの送達ビヒクルと
複合体を形成した核酸が挙げられる。好適な非ウイルスベクターにはnanotaxis
ベクターが含まれ、InCellArt(フランス)から市販されているベクターが挙げ
られる。ウイルスベクターによる送達システムには、DNA及びRNAウイルスが挙げら
れ、細胞に送達された後はエピソームゲノムまたは組込みゲノムを有する。人工的に操作
されたDNA結合タンパク質及びこれらの結合タンパク質を含む融合タンパク質のインビ
ボ送達の概説については、例えば、Rebar(2004)Expert Opinio
n Invest.Drugs13(7):829−839;Rossi et al.
(2007)Nature Biotech.25(12):1444−1454ならび
に遺伝子送達全般の参考文献、例えばAnderson,Science256:808
−813(1992);Nabel&Felgner,TIBTECH11:211−2
17(1993);Mitani&Caskey,TIBTECH11:162−166
(1993);Dillon,TIBTECH11:167−175(1993);Mi
ller,Nature357:455−460(1992);Van Brunt,B
iotechnology6(10):1149−1154(1988);Vigne,
Restorative Neurology and Neuroscience8:
35−36(1995);Kremer&Perricaudet,British M
edical Bulletin51(1):31−44(1995);Haddada
et al.,in Current Topics in Microbiolog
y and Immunology Doerfler and Bohm(eds.)
(1995);及びYu et al.,Gene Therapy1:13−26(1
994)を参照のこと。
インジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオ
ンまたは脂質:核酸複合体、裸のDNA、人工ウイルス粒子、及び薬剤で増強させたDN
Aの取込みが挙げられる。例えば、Sonitron2000システム(Rich−Ma
r)を使用する音響穿孔法も核酸の送達に使用することができる。
、ケルン市)、Maxcyte、Inc.(メリーランド州ロックビル)、BTX Mo
lecular Delivery Systems(マサチューセッツ州ホリストン)
及びCopernicus Therapeutics Inc.(例えばUS6008
336を参照のこと)から提供されているものが挙げられる。リポフェクション法は例え
ば、米国特許第5,049,386号;第4,946,787号;及び第4,897,3
55号)に記載されており、リポフェクション試薬が販売されている(例えば、Tran
sfectam(商標)及びLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率
的な受容体認識リポフェクション法に好適なカチオン性脂質及び中性脂質には、Felg
ner、WO91/17424、WO91/16024のものが挙げられる。
酸複合体の調製は当業者に周知である(例えば、Crystal,Science270
:404−410(1995);Blaese et al.,Cancer Gene
Ther.2:291−297(1995);Behr et al.,Biocon
jugate Chem.5:382−389(1994);Remy et al.,
Bioconjugate Chem.5:647−654(1994);Gao et
al.,Gene Therapy2:710−722(1995);Ahmad e
t al.,Cancer Res.52:4817−4820(1992);米国特許
第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,2
61,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,0
85号、第4,837,028号、及び第4,946,787号を参照のこと)。
パッケージングを使用することが含まれる。これらのEDVは、抗体の1本の腕は標的組
織に対する特異性を有し、もう1本の腕はEDVに対する特異性を有する二重特異性抗体
を使用して標的組織に特異的に送達される。抗体はEDVを標的細胞表面まで運び、その
後、EDVがエンドサイトーシスによって細胞内へ運ばれる。一旦細胞内に入った後、内
容物が放出される(MacDiarmid et al(2009)Nature Bi
otechnology27(7):643を参照のこと)。
ードする核酸を送達するための、ウイルスを用いたRNAまたはDNA系の使用では、ウ
イルスに体内の特定の細胞を標的とさせ、ウイルスのペイロードを細胞核に輸送させる高
度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、直接患者に投与することも(イ
ンビボ)、またはウイスルベクターを使用して細胞をインビトロで処理し、その改変細胞
を患者に投与することもできる(エキソビボ)。ZFP送達にウイルスを用いる従来の系
には、遺伝子導入用のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウ
イルス、ワクシニア及び単純ヘルペスウイルスの各ベクターが挙げられるが、これに限定
されるものではない。宿主ゲノムへの組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及び
アデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入法で可能であり、挿入された導入遺伝子の長期発現
がもたらされることが多い。さらに、高い形質導入効率が多くの異なる細胞型及び標的組
織において観察されている。
細胞となり得る標的集団を拡大させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂
細胞に形質導入するかまたは感染させ、典型的には高いウイルス力価を与えるレトロウイ
ルスベクターである。レトロウイルスによる遺伝子導入系の選択は、標的組織に応じて決
まる。レトロウイルスベクターは、シス作用性の長い末端反復配列で構成され、最高6〜
10kbの外来配列パッケージング能力を有する。最小シス作用性LTRは、ベクターの
複製及びパッケージングに十分であり、その後、これらを使用して、標的細胞に治療用遺
伝子を組み込み、導入遺伝子の永久的発現を得る。広く使用されるレトロウイルスベクタ
ーには、マウス白血病ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、
サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、及びその組み合わ
せに基づいたものが含まれる(例えば、Buchscher et al.,J.Vir
ol.66:2731−2739(1992);Johann et al.,J.Vi
rol.66:1635−1640(1992);Sommerfelt et al.
,Virol.176:58−59(1990);Wilson et al.,J.V
irol.63:2374−2378(1989);Miller et al.,J.
Virol.65:2220−2224(1991);PCT/US94/05700)
を参照のこと。
ルスを用いたベクターは、多くの細胞型で非常に高い効率で形質導入することができ、細
胞分裂を必要としない。そのようなベクターでは、高力価及び高レベルの発現が得られて
いる。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に作製可能である。アデノ随伴ウイ
ルス(「AAV」)ベクターも、例えば、核酸及びペプチドのインビトロでの作製、なら
びにインビボ及びエキソビボでの遺伝子治療手技用に、標的核酸を用いて形質導入するた
めに使用される(例えば、West et al.,Virology160:38−4
7(1987);米国特許第4,797,368号;第WO93/24641;Koti
n,Human Gene Therapy5:793−801(1994);Muzy
czka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)を参照のこと。組
換え型AAVベクターの構築は、米国特許第5,173,414号;Tratschin
et al.,Mol.Cell.Biol.5:3251−3260(1985);
Tratschin,et al.,Mol.Cell.Biol.4:2072−20
81(1984);Hermonat&Muzyczka,PNAS81:6466−6
470(1984);及びSamulski et al.,J.Virol.63:0
3822−3828(1989)など多数の刊行物に記載されている。
利用可能であり、それらは、形質導入因子を生成するようヘルパー細胞株に挿入された遺
伝子による欠陥ベクターの補完を行う方法を利用する。
ある(Dunbar et al.,Blood85:3048−305(1995);
Kohn et al.,Nat.Med.1:1017−102(1995);Mal
ech et al.,PNAS94:22 12133−12138(1997))。
遺伝子治療試験で最初に使用された治療用ベクターはPA317/pLASNであった。
(Blaese et al.,Science270:475−480(1995))
。MFG−Sをパッケージングしたベクターで50%以上の形質導入効率が観察されてい
る。(Ellem et al.、Immunol Immunother.44(1)
:10−20(1997);Dranoff et al.,Hum.Gene The
r.1:111−2(1997)。
ウイルスである2型アデノ随伴ウイルスを用いる、有望な代替的遺伝子送達システムであ
る。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接する、AAVの逆向きの145
bp末端反復のみを保持するプラスミドに由来している。形質導入された細胞のゲノムに
組込むことによる効率的な遺伝子導入及び安定な導入遺伝子送達は、このベクターシステ
ムの主要な特徴である。(Wagner et al.,Lancet351:9117
1702−3(1998),Kearns et al.,Gene Ther.9:
748−55(1996))。AAVの他の血清型であるAAV1、AAV2、AAV3
、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及びAAVrh.10
及び任意の新規なAAV血清型も、本発明に従って使用可能である。
る細胞型を容易に感染させることができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、人工
的に操作されるように、導入遺伝子がAd E1a、E1b、及び/またはE3遺伝子を
置き換え;その後、複製欠陥ベクターを、欠失しているトランス性の遺伝子機能を供給す
るヒト293細胞で増殖させる。Adベクターは、肝臓、腎臓及び筋肉に見られる非分裂
の分化細胞など、複数種の組織の形質導入がインビボで可能である。従来のAdベクター
は担持能が大きい。臨床試験においてAdベクターを使用した一例では、筋肉注射による
抗腫瘍免疫化のポリヌクレオチド治療を行った(Sterman et al.,Hum
.Gene Ther.7:1083−9(1998))。臨床試験で遺伝子導入にアデ
ノウイルスベクターを使用したさらなる例には、Rosenecker et al.,
Infection24:1 5−10(1996);Sterman et al.,
Hum.Gene Ther.9:7 1083−1089(1998);Welsh
et al.,Hum.Gene Ther.2:205−18(1995);Alva
rez et al.,Hum.Gene Ther.5:597−613(1997)
;Topf et al.,Gene Ther.5:507−513(1998);S
terman et al.,Hum.Gene Ther.7:1083−1089(
1998)が挙げられる。
成する。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする293細胞、及びレ
トロウイルスをパッケージングするψ2細胞またはPA317細胞が含まれる。遺伝子治
療に使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子に核酸ベクターをパッケージン
グする産生細胞株によって作製される。ベクターは、典型的に、パッケージング及びその
後の宿主への組込みに必要なウイルスの最小配列を含有し(適用可能な場合)、他のウイ
ルス配列は発現させるべきタンパク質をコードする発現カセットにより置換される。欠損
しているウイルスの機能は、パッケージング細胞株によりトランス性で供給される。例え
ば、遺伝子治療に使用されるAAVベクターは典型的に、宿主ゲノムへのパッケージング
及び組込みに必要なAAVゲノム由来の末端逆位反復(ITR)配列のみを有する。ウイ
ルスDNAは、他のAAV遺伝子、すなわちrep及びcapをコードするがITR配列
を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株にパッケージングされる。また、細胞株は、
ヘルパーとしてのアデノウイルスで感染させられる。ヘルパーウイルスは、AAVベクタ
ーの複製及びヘルパープラスミドからのAAV遺伝子発現を促進する。ヘルパープラスミ
ドは、ITR配列欠失のため大量にはパッケージングされない。例えば、AAVよりもア
デノウイルスの方が感受性が高い熱処理によってアデノウイルスによる汚染を減らすこと
ができる。
達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターを改変して、ウイルスの外面に
、ウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させて、所与の細胞
型に対する特異性を有するようにすることができる。リガンドは、関心対象の細胞型に存
在することが知られている受容体に対して親和性を有するよう選択される。例えば、Ha
n et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:9747−9
751(1995)には、モロニーマウス白血病ウイルスを改変して、gp70と融合さ
せたヒトのヘレグリンを発現させることができ、その組換え型ウイルスが、ヒト上皮成長
因子受容体を発現している特定のヒト乳癌細胞を感染させることが報告されている。この
原理は、他のウイルス−標的細胞対まで拡大させることができ、その場合、標的細胞は受
容体を発現し、ウイルスは、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発
現する。例えば、繊維状ファージを人工的に操作して、選択されるほとんどすべての細胞
受容体に対して特異的結合親和性を有する抗体断片(例えば、FABまたはFv)を提示
させることができる。上記は主にウイルスベクターに適用されるが、同原則はウイルス以
外のベクターにも適用できる。そのようなベクターを人工的に操作して、特定の標的細胞
による取り込みを促進する特定の取込み配列を含有させることができる。
投与(例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入)または局所投与によ
ってインビボで送達することができる。別法として、ベクターを、個々の患者から外植し
た細胞(例えば、リンパ球、骨髄穿刺、組織生検)または万能ドナー造血幹細胞などの細
胞にエキソビボで送達し、その後、通常は、ベクターが組み込まれた細胞について選別を
行ってから、当該細胞を患者に再移植することができる。
ロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど)も、インビボで細胞の形質導入を行う生
物に直接投与可能である。別法として、裸のDNAを投与することができる。投与は、血
液または組織細胞との最終的接触に分子を導入するために通常使用される経路のいずれに
よっても行われ、それらとして、注射、注入、局所投与及び電気穿孔法を含むが、これに
限定されるものではない。そのような核酸を投与する好適な方法は利用可能であり、また
当業者に周知であるが、特定の組成物の投与に1つ以上の経路を使用でき、特定の経路に
よって、別の経路よりも速やかで有効な反応が得られ得ることが多い。
は二本鎖のドナー)の導入に好適なベクターには、非組込み型レンチウイルスベクター(
IDLV)が含まれる。例えば、Ory et al.(1996)Proc.Natl
.Acad.Sci.USA93:11382−11388;Dull et al.(
1998)J.Virol.72:8463−8471;Zuffery et al.
(1998)J.Virol.72:9873−9880;Follenzi et a
l.(2000)Nature Genetics25:217−222;米国特許公開
第2009/0117617号を参照のこと。
用される具体的な方法によってある程度決定される。したがって、実に多種多様な好適な
医薬組成物製剤が利用可能であり、以下に記載するとおりである(例えば、Reming
ton’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,1
989を参照のこと)。
達可能なことは明らかとなるであろう。例えば、ヌクレアーゼ及びドナーは、同一のDN
A MCによって運搬され得る。別法として、ドナーポリヌクレオチドをMCによって、
また1つ以上のヌクレアーゼを標準的なプラスミドまたはAAVベクターによって運搬さ
せることができる。さらに、異なるベクターを、同一または異なる経路で投与することが
できる(筋肉注射、尾静脈注射、他の静脈注射、腹腔内投与及び/または筋肉注射)。ベ
クターは、同時または任意の順序で送達することができる。
すい疾患及び病態のインビボまたはエキソビボでの治療が含まれる。組成物は、ヒト患者
に対し、血清中または標的器官もしくは細胞において治療用ポリペプチドの所望濃度を得
るのに有効な量で投与される。投与は、所望の標的細胞にポリヌクレオチドが送達される
任意の手段によって可能である。例えば、インビボ及びエキソビボのいずれの方法も意図
される。門脈への静脈内注射は好ましい投与方法である。他のインビボ投与方法には、例
えば、肝臓または胆管の葉内への直接注射及び肝臓に対して遠位の静脈内注射、例えば、
総肝動脈を介した注射、肝実質への直接注射、総肝動脈を介した注射、及び/または胆樹
を通す逆行性注入が挙げられる。エキソビボでの投与方法には、切除した肝細胞または肝
臓の他の細胞をインビトロで形質導入し、その後、形質導入され、切除した肝細胞を、ヒ
ト患者の門脈管構造、肝実質または胆樹内へ注入して戻す方法が挙げられ、例えば、Gr
ossman et al.,(1994)Nature Genetics,6:33
5−341を参照のこと。
対象の治療用ポリペプチドによって異なる。したがって、有効量は、組成物を投与する医
師により最良に決定され、適切な用量は、当技術分野の当業者により容易に決定され得る
。組込み及び発現に十分な時間をかけた後(例えば、典型的に4〜15日)、治療用ポリ
ペプチドの血清中または他の組織でのレベルの分析、投与前の初期レベルとの比較によっ
て、投与量が低すぎる、適正範囲内である、または高すぎるということが決定される。初
回投与及び後続投与についての好適な計画もさまざまであるが、計画は、初回投与を行い
、その後必要に応じて後続投与することが典型的である。後続投与は、連日から1年に1
回、数年おきに至るまで、さまざまな間隔で投与してよい。当技術分野の当業者には、送
達ベクターが免疫抑制を受けることにより形質導入が阻害または遮断されることを回避す
るため、適切な免疫抑制法が推奨され得、例えば、Vilquin et al.,(1
995)Human Gene Ther.,6:1391−1401を参照されたい。
れる。有効成分はしばしば、薬理学的に許容され、有効成分と適合性のある添加物と混合
される。好適な添加物には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、
エタノールなど、及びその組み合わせが含まれる。さらに、組成物は、少量の助剤、例え
ば、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の有効性を高める他
の試薬を含有してよい。
本明細書には、本明細書に記載するヌクレアーゼ(表1)によって内在性BCL11A
エンハンサー配列が改変される細胞及び/または細胞株も記載される。改変は、例えば、
細胞の野生型配列と比較した場合のものであってよい。細胞または細胞株は、改変には、
ヘテロ接合体またはホモ接合体であってよい。BCL11A配列に対する改変は、挿入、
欠失及び/またはその組み合わせを含んでよい。
可)またはその近傍、例えば、切断部位(複数可)の上流または下流の1〜300(すな
わち、その範囲のあらゆる値)塩基対内、より好ましくは、結合及び/または切断の部位
(複数可)の片側から1〜100塩基対内(すなわち、その範囲のあらゆる値)、よりさ
らに好ましくは、結合及び/または切断の部位(複数可)の両側の1〜50塩基対内(す
なわち、その範囲のあらゆる値)である。ある実施形態では、改変は、BCL11Aエン
ハンサーの「+58」領域またはその近傍、例えば、表1の第1列のいずれかに示される
ヌクレアーゼ結合部位またはその近傍である。
葉系幹細胞など、どの細胞または細胞株でも改変してよい。本明細書に記載する細胞の他
の非限定的例には、T細胞(例えば、CD4+、CD3+、CD8+など)、樹状細胞、
B細胞が挙げられる。部分的または完全な分化細胞など、幹細胞の子の細胞もまた提供さ
れる(例えば、RBCまたはRBC前駆細胞)。改変BCL11A配列が含まれる他の細
胞株の非限定的な例には、COS、CHO(例えば、CHO−S、CHO−K1、CHO
−DG44、CHO−DUXB11、CHO−DUKX、CHOK1SV)、VERO、
MDCK、WI38、V79、B14AF28−G3、BHK、HaK、NS0、SP2
/0−Ag14、HeLa、HEK293(例えば、HEK293−F、HEK293−
H、HEK293−T)、及びperC6細胞、ならびにSpodopterafugi
perda(Sf)などの昆虫細胞、またはSaccharomyces、Pichia
及びSchizosaccharomycesなどの真菌細胞が挙げられる。
/または予防するのに有用である。ヌクレアーゼの改変を受けた細胞は、増殖させて、そ
の後、標準的技術を使用して患者に再導入することができる。例えば、Tebas et
al(2014)New Eng J Med370(10):901を参照のこと。
幹細胞の場合、対象への注入後、これらの前駆細胞から機能性導入遺伝子を発現する細胞
へのインビボでの分化が起こる。本明細書に記載する細胞を含む医薬組成物もまた提供さ
れる。さらに、患者への投与に先立ち、細胞を凍結保存してよい。
を示し得る。本明細書に記載する遺伝子改変細胞を含む医薬組成物などの組成物もまた提
供される
本明細書に開示する方法及び組成物は、タンパク質の発現を改変すること、または鎌状
赤血球症またはサラセミアなどの遺伝性疾患で発現されるタンパク質をコードする異常な
遺伝子配列を修正することを目的とする。したがって、方法及び組成物により、そのよう
な遺伝性疾患の治療及び/または予防が提供される。ゲノム編集(例えば、幹細胞)を使
用して、異常遺伝子の修正、野生型遺伝子の挿入、または内在性遺伝子の発現の変更が可
能である。非限定的な例として、野生型遺伝子、例えば、少なくとも1つのグロビン(例
えば、α及び/またはβグロビン)をコードする遺伝子を細胞に挿入して(例えば、本明
細書に記載する1つ以上のヌクレアーゼを使用して内在性BCL11aエンハンサー配列
に挿入)、細胞で欠損及び/または欠落しているグロビンタンパク質を提供し、これによ
りグロビン発現不良が原因の遺伝性疾患、例えば、異常ヘモグロビン症を治療する。ある
いは、またはさらに、適切なドナー投与の有無にかかわらず、ゲノム編集により、不良な
内在性遺伝子の修正、例えば、α−ヘモグロビンまたはβ−ヘモグロビンにおける点変異
の修正を行って遺伝子の発現を修復すること、及び/または遺伝性疾患、例えば、鎌状赤
血球症を治療すること、及び/または任意の直接もしくは間接的なグロビン調節遺伝子の
ノックアウトもしくは改変(過剰発現または抑制)(例えば、γグロビン調節遺伝子BC
L11AまたはBCL11A調節因子KLF1の不活性化)を行うことができる。具体的
には、本発明の方法及び組成物は、ヘモグロビン異常症の治療または予防に使用される。
Aエンハンサー領域を標的とし、したがって、ガンマグロビン発現が下方制御される。こ
のエンハンサー領域の改変により、赤血球におけるガンマグロビン発現の増加がもたらさ
れ得るため、鎌状赤血球症またはベータサラセミアの治療または予防に有用となり得る。
開示の例示的な実施形態に関する。これは、あくまでも例示を目的とし、また、他のヌク
レアーゼ、例えば、TtAgo及びCRISPR/Casシステム、人工的に操作された
DNA結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ(メガヌクレアーゼ)、なら
びに/または天然に生じるかもしくは人工的に操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ
(メガヌクレアーゼ)のDNA結合ドメインと、異種の切断ドメインとの融合体、ならび
に/またはメガヌクレアーゼとTALEタンパク質との融合体を使用できることは認識さ
れよう。
ヒトBCL11A遺伝子に対してZFNを構築し、Miller et al.(20
07)Nat.Biotechnol.25:778−785に記載のようにCEL1ア
ッセイで試験した。エンハンサー領域の+58領域に対して特異的なZFNを記載のよう
に作製した。ヌクレアーゼを下記表1に示す:
表1:BCL11Aエンハンサー領域の+58に特異的なZFN対
*51446と51463はリンカー配列が異なる
簡単に言うと、ヒトK562細胞を、10%FBSを添加したRPMIで培養し、20
0,000細胞を、左及び右のZFNパートナーをコードするそれぞれのプラスミドDN
Aを最適下限濃度の25ng用いてAmaxa Nucleofector(登録商標)
により製造者の指示書にしたがいトランスフェクションした(表2a)。さらに、左のZ
FN25ng及び右のZFN5ngを用いて実験を実施した(表2b)。Perez e
t al.(2008)Nat.Biotechnol.26:808−816及びGu
schin et al.(2010)Methods Mol Biol.649:2
47−56)に記載のCel−Iアッセイ(Surveyor(商標)、Transge
nomics)を使用してトランスフェクション後2日目または3日目のZFN誘導性の
標的遺伝子改変を検出した。このアッセイでは、標的部位のPCR増幅の後、配列決定に
よって挿入及び/または欠失(「インデル」)の定量を行った。Illuminaプラッ
トフォーム(「miSEQ」)によるディープシークエンシングを製造者の指示書にした
がって使用し、編集効率ならびに編集で作製されたアレルの性質を測定した。結果は下記
表2に示され、数字は観察されたパーセントNHEJ活性を指す:
表2a:K562細胞におけるマトリックスのスクリーニング(各ZFN25ng)
表2b:K562細胞におけるマトリックスのスクリーニング(左のZFN25ng、右
のZFN5ng)
構築した(米国特許公開第20150064789号を参照のこと)。被験リンカー配列
は下記に示され、配列の「HTKIH」部分はDNA結合領域のカルボキシ末端であり、
「ELEEK」部分はヌクレアーゼドメインのアミノ末端である。下線部分は2つのドメ
イン間のリンカー配列である。
右側パートナー上のL0またはL8c4リンカーを試験した。ZFNの組み合わせを、K
562細胞における切断活性について試験し、その結果(パーセントNHEJ活性)を下
記表3に示す。
表3:各種ドメインリンカーとZFN活性
本明細書に記載するZFNもまたヒトCD34+細胞で試験した。CD34+形質導入
では、BTX ECM830装置で2mmギャップのキュベットを使用した。組織培養未
処理プレート内で、1xCC110(Stem cell Technology)を含
むx−vivo10培地(Lonza)でヒトCD34+細胞を増殖させた。細胞を計数
し、室温で10分間1200rpmで遠心分離を行って採取した。細胞を室温のPBSで
1〜2回洗浄した。各トランスフェクションにつき200,000細胞を使用し、それら
を100μLのBTexpress溶液に再懸濁させた。CD34+の実験では、DNA
ではなく、ZFNをコードするRNAを使用した。mMessageMachine T
7 Ultra Kit(Ambion)を使用してRNAを作製した。トランスフェク
ションあたり、各ZFNをコードするRNAを500ng加え、混合物をキュベットに移
した。移した直後、混合物に250Vで5ミリ秒の電気穿孔を行った。予め温めた培地を
キュベットに加え、培地と細胞を合わせて48ウェル組織培養未処理プレートに移し、そ
の後37℃でインキュベートした。
に供した。編集したアレルのパーセントを定量化するため、標準的Illumina配列
決定アダプター配列を付加するプライマーを使用して、関心対象のゲノム領域をPCR増
幅にかけた。第2の群の13回のPCRを実施して両末端にバーコード配列及びブリッジ
アダプター配列を付加した。Illumina MiSeqでアンプリコン配列決定用の
製造者のプロトコルにしたがって配列決定を実施した。MiSeqでペアエンドによる読
取りを生成し、それらを標準的なアラインメントソフトウェアを使用してマージしアダプ
ターのトリミングを行う。その後、カスタムスクリプトを使用してバーコード配列対によ
って試料ごとに読み取りを分離(demultiplex)した。次いで、Needle
man−Wunschアルゴリズムを実装して、アンプリコン配列をリファレンス配列へ
グローバルアラインメントした(Needlemanand Wunsch(1970)
.Jour Mol Bio48(3):443−53)。アラインメントのギャップま
たは挿入を%NHEJ事象として計数し、未処理対照試料の配列と比較して配列特異的な
背景発生率を決定した。結果を下記表4に示す。
表4:CD34+細胞におけるZFN活性
して使用すると、表5に示すようにさらなる量の切開が観察された。
表5A及び5B:高濃度ZFNでもたらされる高活性
表5A
表5B
きるようにmRNAインプットが不飽和の条件下で実施された。mRNAの飽和インプッ
トまたはその近傍の量で得られる改変の最大量を検討するため、我々は、BTX電気穿孔
を使用して、2a構築体または2つのZFNを組み合わせて1つのmRNAにしたものを
増量させてCD34+細胞にトランスフェクションした。結果を下記表6に示す。
表6:mRNAインプット増量に伴うBcl11aエンハンサーの改変
N標的領域が非常に多く改変されることを示している。
に、リンカーが活性に与える効果もCD34+細胞で試験した。上記のように、これらの
実験でZFNを送達するためにmRNA量をさまざまに変えて(それぞれにつき500n
g、1000ngまたは2000ng)使用した。
表7は、リンカー同一性がZFN対の活性に与える効果を示す。
表7:CD34+細胞を用いたリンカー同一性がZFN活性に与える効果
相対的ガンマグロビン発現に対する効果を検討するため、ZFN対の代表的試料をコー
ドするmRNAを、BTX nucleofectionで製造者の指示書にしたがいC
D34+細胞(健常ドナーボランティアから入手)に導入した。その後、細胞を赤血球に
分化させた。簡単に言うと、Ficoll−Paque(GE Healthcare)
及びCD34+マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を製造者の指示にし
たがって使用しCD34+細胞を精製した。増殖因子の存在下で、BIT95000(S
temCell Technologies)を含むIscove’s MDMでCD3
4+細胞を培養した。3ステップ液体培養モデルを使用して細胞を赤血球系列へ分化させ
た。最初の6日間(第1段階)は、SCF(100ng/ml)、Flt3−L(100
ng/ml)、及びIL−3(20ng/ml)を用いてCD34+細胞を増殖させた。
次いで、増殖した細胞は、Epo(2U/ml)及びSCF(50ng/ml)を用いて
、系列決定させ赤血球系列へ向けて分化させた(第2段階)。Giarratana e
t al.(2011)Blood118(19):5071−9を参照のこと。
アルファグロビン及びベータグロビンをコードする各mRNAの比を、分化開始後14日
目にRT−PCR解析によって測定した。製造者(Applied Biosystem
s)から提供されたプロトコルで遺伝子特異的アッセイを使用して、標準のTaqman
(登録商標)解析によって解析を行った。ガンマグロビン(HBG)の相対的レベルを、
アルファグロビン(HBA)またはベータグロビン(HBB)の発現レベルで正規化し、
その比を、対照細胞のガンマ/アルファ比またはガンマ/ベータ比と比較した。
ZFNで処理した細胞でのガンマグロビン発現の増加が見られたことを示している。
表8:編集されたCD34+細胞でのアルファグロビンまたはベータグロビンに対するガ
ンマグロビン発現の変化
D34+細胞をインビトロで赤血球に分化させた後のグロビン発現RT−PCR解析では
、GFPのmRNAをトランスフェクションした対照試料と比較して、Bcl11aエン
ハンサーを標的とする選択ZFN対すべてによる非常に効率的なガンマグロビン活性化が
示されている(図1)。データを下記表9に記載する。
表9:高比率のヒトガンマグロビン発現
+細胞におけるZFN活性
ヒト末梢血から単離された、動員されたヒトCD34+細胞及び骨髄から単離されたC
D34+細胞で2対のZFNの活性を試験した。簡単に言うと、CD34+細胞を以下の
とおり健常ドナーから単離した。白血球除去による採取物は、低速遠心分離及び上清除去
を行って血小板を除去した。血小板除去後、抗CD34磁気マイクロビーズ(Milte
nyi Biotec、ドイツ)で細胞を標識化し、Miltenyi CliniMA
CS Plus Cell Separator Systemを使用して陽性選択を行
った。選択後、陽性画分(濃縮CD34+HSPC)を洗浄し、培地(すなわち、2mM
L−グルタミン、FMS様チロシンキナーゼ3−リガンド(Flt−3L)100ng
/mlずつ、幹細胞因子(SCF)、及びトロンボポチエン(TPO)を添加したX−V
IVO10培地)に1×106細胞/mLで再懸濁させ、VueLife培養バッグ(S
aint−Gobain、Gaithersburg、MD)に移し37℃/5%CO2
でインキュベートした。骨髄由来CD34+細胞の精製では、ヒドロキシエチルデンプン
沈降法で採取物から赤血球(RBC)を除去した。RBC除去後、抗CD34磁気マイク
ロビーズ(Miltenyi Biotec、ドイツ)で細胞を標識化し、Milten
yi CliniMACS Prodigyを使用して陽性選択を行った。選択後、陽性
画分(濃縮CD34+HSPC)を洗浄し、培地(すなわち、2mM L−グルタミン、
FMS様チロシンキナーゼ3−リガンド(Flt−3L)100ng/mlずつ、幹細胞
因子(SCF)、及びトロンボポチエン(TPO)を添加したX−VIVO10培地)に
1×106細胞/mLで再懸濁させ、VueLife培養バッグ(Saint−Goba
in、Gaithersburg、MD)に移し37℃/5%CO2でインキュベートし
た。
B)であった。細胞に導入されたmRNAとしてZFNを試験した。トランスフェクショ
ンには、BTX装置を使用した。簡単に言うと、試料あたり200,000細胞をBTX
press Electroporation溶液(BTX)に懸濁させ、RNAと混合
した。その後、混合物に250ボルトで4ミリ秒間パルスをかけ、コールドショック条件
(30℃で一晩)に供してから、細胞を37℃で回収した。トランスフェクション後2日
または3日目にZFN活性の分析を行った。2つのZFNコード配列間に2a自己切断ペ
プチド配列を使用した単一mRNA種としてZFNを試験した。そのデータは図2に記載
されている。さらに、同一条件を使用して1対のZFNを試験し、その場合、mRNAは
2つの別々の種として提供され、各mRNAが単一ZFNをコードした。下記表10a及
び表10bは、単一mRNAの場合と、2つのmRNAの場合の活性結果(%NHEJま
たはインデル)を示す(記載データはいくつかの実験から得たものである)。
表10a:単一mRNA種と2つのmRNA種の比較(%インデル)
表10b:単一mRNA種と2つのmRNA種の比較(%インデル)
ロビン及びヒトベータグロビンの発現も試験した。その後、結果を、HBB(ベータ)に
対するHBG(ガンマ)の比として正規化した。これは図3に示され、ここでも2対のZ
FN、すなわち、51446/51536(対A)とSBS51857/51949(対
B)を比較している。さらに、単一mRNAとしてのZFN対の提供を比較してHBG及
びHBBの発現も測定し、その場合、その対の各ZFNをコードする配列を2a自己切断
ペプチド配列により分離させ、各ZFNをコードするmRNAを別々に供給するという条
件で行った。データから、これらの条件下では、SBS51857/51949のB対の
方がBCL11a標的の切断及びHBG発現の増加発生において、より活性であったこと
が実証された。
ことがわかった(図4aを参照のこと)。SBS51857/51949対に対する活性
も試験し、ここで、ZFNは上記のように2aを有する単一mRNA上で、または2つの
別々のmRNAとして供給された(図4b)。SBS51857/51949対は、51
446/51536対より高い活性を示した。
不偏捕捉分析
捕捉アッセイは、標的細胞にヌクレアーゼと二重鎖DNAドナーとを共導入することに
より、結果として生じたゲノム切断部位の画分に、NHEJ DNA修復経路を介してド
ナーが「捕捉」されることの観察に基づいている(Orlando et al,(20
10)Nucleic Acids Res.38(15)e152;Gabriel,
R.et al.(2011).Nat Biotechnol.29:816−23.
)。この捕捉事象は相同性で誘導されるものではないことに留意されたい(事実、二重鎖
DNAドナーは、ヒトゲノムに対するいかなる相同性も含有していない)。さらに、ZF
NをコードするmRNAは、DNA切断内に捕捉されることはできず、二重鎖DNAドナ
ーのみができることにも留意されたい。一旦二重鎖ゲノムがトラップされると、切断事象
の永久タグを表す。ゲノムDNA単離後、ドナーから隣接ゲノム配列内へのプライマー伸
長法で捕捉部位を同定し、その後、アダプターライゲーション、PCR、及び得られるド
ナー−ゲノム結合の配列決定を行ってよい。
るため、K562細胞株で捕捉分析試験を行った。細胞には、ZFNをコードするmRN
A及びオリゴヌクレオチド二重鎖ドナーを用いて電気穿孔を行った。別個に、BM及びP
Bに由来するCD34+細胞に上記のようにZFNをコードするmRNAを用いてMax
cyte装置を使用して電気穿孔を行った。使用した二重鎖ドナーオリゴヌクレオチドを
下記に示す(配列番号30及び31):
Nはランダム二重配列を指し、同一組込み事象間で区別するためのバーコードとして使用
した。オリゴとmRNAの組み合わせそれぞれについて三連試料を調製した。トランスフ
ェクション後7日目及び14日目にゲノムDNAを単離し(Qiagen DNeasy
Blood and Tissue Kit)、1μg(330000ゲノム/1連)
を増幅プロトコル用インプットとして使用した。その後、試料を本質的には記載のとおり
処理した(Paruzynski,A.et al.(2010).Nat.Proto
cols.5:1379−1395)。QIAquick PCR Purificat
ion Kit(Qiagen)を使用してアンプリコンを精製し、PCRで増幅させて
、Illuminaプラットフォームでのディープシークエンシング用にバーコード及び
アダプターを導入した。アンプリコンの各末端のバーコードを検出するため、MiSeq
Instrument(Illumina)でv2 300サイクルシークエンシング
キットをペアエンド150bp読み取り及び8bpデュアルインデックス読み取りで使用
し、最終産物の定量、プール及び配列決定を行った。このおかげで、オフターゲット遺伝
子座候補1セットが得られ、その後、これらをBMまたはPBに由来するCD34細胞で
遺伝子型を決定した。対A(SBS番号51446/51536)で同定された結果を図
10aに示し、対B(SBS番号51857/51949)で同定された結果を図10b
に示す。データをさらに下記表11にまとめる。
表11:骨髄由来CD34+、対A及び対Bのオフターゲット分析
CD34+細胞におけるZFNの活性
次に我々は、Maxcyte GT電気穿孔装置を使用してCD34+細胞でZFN対
を用いて、より大規模の実験を行った。上記のように正常ドナー由来の末梢血から単離さ
れた、動員されたCD34+細胞(PB)を以下のとおり試験した:細胞(試料あたり3
00万)をRT Maxcyte EP緩衝液に再懸濁させ最終濃度を30 e6細胞/
mLとした。細胞をmRNAと混合し、製造者指定のプログラムを使用して電気穿孔を行
った。細胞を37℃で20分間、手短に回復させた後、希釈してコールドショック条件(
30℃で一晩)に供してから細胞を37℃で回復させた。2〜3日後に活性を分析した。
対A及びB対の両方を用いて前述のように実験を行い、ここでは、各対を単一mRNA上
に導入した(図5A)。ZFN対B(SBS51857/51949)もまた、単一mR
NAまたは2つの別個のmRNAとして上記のように試験した(図5b)。これらの実験
では、対Bは最も高い活性を示した。
察された(図6を参照のこと)。細胞を上記のようにHBG及びHBBの発現について分
析し、HBG/HBB比を第0日のパーセントインデル活性と比較した(図7)。高レベ
ルのHBG発現と高いインデル活性との間には良好な呼応が見られた。Maxcyteプ
ロトコルを使用してさらなる解析を実施し(図8及び9)、そこでは、各実験でのインデ
ルの頻度は常に同じではなかったが、実施ごとに、相対的活性(例えば、2a SBS5
1857/51949構築体の方が別個mRNAよりも高い)が観察されたことがわかっ
た。
上記のように、CD34+ヒト細胞を、+58エンハンサー特異的ZFNをコードする
mRNAで処理し、その後NSGマウスに生着させる。CD34+細胞は、健常ヒトボラ
ンティアから得る。ある場合には、血液成分分離の前にG−CSF(Neupogen(
登録商標))またはG−CSF+プレリキサフォル(Mozobil(登録商標))を使
用して、CD34+動員戦略を実施した。血液成分分離の前に製造者の指示書にしたがっ
てG−CSFを4日間連日投与する。プレリキサフォルを使用した場合は、やはり製造者
の指示書にしたがって回収前の最終夜に投与した。標準的方法で血液成分分離を実施する
。Miltenyi CliniMACsシステムを標準的方法かつ製造者の指示書にし
たがって使用し、動員されたPBMC leukopakでCD34+細胞を濃縮した。
ットを製造者の指示のとおり使用して、キャップが付加されポリアデニル化した、ZFN
をコードするmRNAを合成し、その後、Maxcyte GTシステムまたは、BTX
ECM830エレクトロポレーターをいずれも製造者の指示書にしたがって使用してC
D34+細胞の電気穿孔を行った。
てCD34+移植を行った。移植前日(16〜24時間前)、マウスを亜致死線量照射(
300RAD)に供する。上記でZFN処理したCD34+細胞を、照射を受けたマウス
に尾静脈注射して移植し、ここで、マウス1匹あたり100万細胞を0.5mL PBS
−0.1%BSAに入れて与えた。
胞に電気穿孔を行う。2A自己切断ペプチドをコードする配列で区切られた単一オープン
リーディングフレームにZFNをコードする遺伝子を共にクローニングする。GFPを対
照として使用した。マウスへの移植後、移植から4週間目、8週間目及び12週間目に試
料を採取し、細胞内のヒト細胞特異的マーキングのレベルを観察する。
対照群と比べると、編集された細胞間では同様であった。
ZFNの活性をヒト末梢血から単離された、動員されたヒトCD34+細胞及び骨髄か
ら単離されたCD34+細胞で試験した。5人のβサラセミア対象から得たHSPC(P
11、P18、P04、P08及びP19とする)を動員し、記載のとおり精製した(Y
annaki et al.(2012)Mol Ther20(1):230)。いず
れの実験でも、解凍後2日目に、BTXエレクトロポレーター(マサチューセッツ州ホリ
ストン、電圧=250V、パルス長=5ms)を使用して、100μLのBTX Exp
ress電気穿孔溶液中で200,000のCD34+細胞に電気穿孔を行った。トラン
スフェクションでは、4μgの緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするmRNA(電
気穿孔効率についての対照として、また、電気穿孔自体の非特異的効果及び細胞へのmR
NA導入の非特異的効果を検査するため)、または4μg及び8μgのSB51857−
2a−51949 mRNAを使用した。
B51857/51949 mRNA量は、MaxCyte装置での大規模トランスフェ
クションで使用した80〜120ug/ml濃度と同等の標的遺伝子改変及びγ−グロビ
ン活性化がもたらされた。
培養すると、インビトロでの分化が開始され、一定分量の細胞を回収してDNA改変の分
析を行った。トランスフェクション後、CC100サイトカインカクテル(Stem C
ell Technologies、バンクーバー、カナダ)が添加されたX Vivo
10培地(Lonza、ウォーカーズビル、MD)で細胞を培養した。
ェクション後d3は分化のd0とした)及び赤血球分化の14日目に、MiSeqディー
プシークエンシングによりBCL11A遺伝子の改変を測定した。結果を表13に示す。
め、これらの一部の試料で、解凍時の生存率及び細胞増殖の低下が示された。解凍後の低
生存率は、トランスフェクション後の生存率の大幅な低下及び低い標的遺伝子改変と一致
し、特に、トランスフェクションされていない死亡細胞から得たDNAが依然として存在
している、初期の時点で観察されている。SB−ZFNトランスフェクションとは独立し
たトランスフェクション後の細胞生存率の指標として、表13は、GFP mRNAでト
ランスフェクションした対照試料中の細胞供給源ごとの細胞生存率を示している。表には
、実験1の患者細胞試料P18は、生存率がこの実験の他の2試料よりも(71%及び8
0%)はるかに低く(38%)、また約70%のアレルが改変された他と同様の改変レベ
ルには及ばなかったことが示されている。同様に、第3日の第2実験では、患者細胞試料
P08は、健常細胞を人工的及び自然に増殖させた後でも、非常に不良な生存率(22%
)及び非常に低い初期改変レベル及び最適下限の改変レベルを示した。
表13:MiSeqによるBCL11A遺伝子改変分析
ND=データなし、WT=野生型
G CSF動員され、精製されたHSPCへSB ZFN mRNAを電気穿孔した後、
大半の試料において、臨床試料に予想される範囲内のBCL11Aエンハンサーの破壊が
生じたことを示す。試料の一部の低生存率の結果、P18及びP08でのエンハンサーの
破壊は健常ドナーボランティア由来の細胞よりも低かったため、これら2つの低生存率試
料は下記解析から外した。重要なことには、確固たる細胞生存率を示した対象由来試料(
例えば、試料P11及びP04)は、野生型細胞で見られた遺伝子改変レベルと同等の遺
伝子改変レベルも示した。
ロビンmRNA及びγグロビンmRNAのレベルは、SB ZFN mRNAで処理後に
RT qPCRで解析したところ、胎児(γ)グロビンレベルの増加を示した(図11)
。胎児γグロビンmRNAレベルは、サラセミア細胞ではβグロビンmRNAの発現が低
いかまたはまったくなかったため、αグロビンmRNAに対して正規化して示されている
。
PCの赤血球後代は、胎児(γ)グロビンmRNAとαグロビンmRNAとの比において
予想通りの増加を見せ、グロビンmRNAとアルファグロビンmRNAとの比は、特に、
解凍後の生存率が良好で、結果として野生型細胞に匹敵する標的遺伝子改変レベルを示し
た患者試料において野生型ドナー細胞と同様の比が示された。
パク質レベルでの胎児ヘモグロビンの上昇が見られるかどうかを測定した。
グロビンの比は、胎児グロビンタンパク質の明確な上昇を示し、健常ボランティア及びサ
ラセミア患者由来の赤血球(RBC)で、BCL11AエンハンサーのSB ZFN破壊
時に観察された。ただし、サラセミア細胞、特にβ0/β0細胞での未処理のガンマ/ア
ルファ比は、通常、野生型の(wt)細胞の場合をはるかに超える。βサラセミアメジャ
ー患者に由来する細胞における胎児グロビンと成人グロビンとの比の分析は、非改変細胞
におけるαグロビンの四量体化及び沈殿によりHPLC分析が可能なプールからαグロビ
ンが除去されてしまうという事実により複雑になる。
場合)及びαグロビンがγグロビンと四量体化したこと、またはαグロビンがγグロビン
と四量体化したこと(β0/β0細胞の場合)しかアッセイで明らかにできない。したが
って、γグロビンタンパク質レベルが上昇する場合、生成的に四量体化したαグロビンタ
ンパク質レベルも上昇し得るので、γ/αグロビンタンパク質比はγグロビンタンパク質
レベルの上昇を過小評価させる。野生型細胞で調べるために有用な別の比は、γグロビン
/β様タンパク質比であった(後者は、2つのγグロビンタンパク質レベルとδグロビン
とβグロビンの和である)。ただし、サラセミア患者細胞、特にβ0/β0細胞では、こ
の比は通常90%超であった、ZFN未処理細胞でも、またZFN処理後のγグロビンタ
ンパク質レベルの実質的な上昇があってもこの比は顕著には上昇しなかった。
ビンに対する効果の分析。
また我々は、SB ZFNで処理したCD34+細胞由来赤血球細胞の評価を、2つの
主要項目に関して単一細胞レベルで行った:(1)個々の細胞間のZFN作用を評価する
ことによるBCL11A赤血球エンハンサー領域のアレルの分布、及び(2)個々のアレ
ル(野生型及び遺伝子改変型)の分布が胎児グロビンレベルに与える効果(γ/βグロビ
ンmRNA比で評価)。したがって、SB ZFN HSPCに見られる単一CD34+
細胞を選別しインビトロで分化させた。得られる単一細胞に由来するヘモグロビン化細胞
コロニーを個別に回収した。各コロニーのゲノムDNA(gDNA)を、BCL11A赤
血球エンハンサーのSB ZFN標的領域において配列決定し、遺伝子座が破壊されてい
るかどうかを決定し、破壊されている場合、作製されている遺伝子座の正確なアレル型を
決定した。さらに、同一のコロニーからトータルRNAを単離し、これらの個々のクロー
ンにおけるグロビン発現レベルをリアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT
qPCR)で分析した。
単一細胞試験では、トランスフェクションしたSB ZFN HSPC細胞を37℃で
解凍し、10mLのX VIVOに室温で加え、450×gにて5分、室温で遠心にかけ
た。細胞ペレットを、Flt3L、TPO、及びSCF(各100ng/mL)、ペニシ
リン(100U/mL)、及びストレプトマイシン(100μg/mL)を添加したX
VIVO培地に1×106/mLで再懸濁させた。24ウェル組織培養未処理プレート内
で37℃、5%CO2にて加湿インキュベーターで一晩培養し、細胞を採取して遠心にか
け、0.5%ウシ血清アルブミンを添加したリン酸緩衝生理食塩液(PBS)に2×10
6/mLで再懸濁させた。96ウェルU字底TC未処理プレートに入れたステップ1の赤
血球培地(200μL/ウェル)内に2細胞/ウェルで細胞を入れ、FACS Aria
IIIを使用して選別した。ステップ1の赤血球培地は、ペニシリン100U/mL、
ストレプトマイシン100μg/mL、5%ヒトAB+血漿、ヒトホロトランスフェリン
330μg/mL、ヒトインスリン20μg/mL、ヘパリン2U/mL、組換え型ヒト
エリスロポエチン3U/mL、SCF100ng/mL、IL3 5ng/mL、及びヒ
ドロコルチゾン1μM/mLを添加した、Glutamax含有イスコフ改変ダルベッコ
培地(IMDM)で構成された。ステップ1赤血球培地で37℃、5%CO2で7日間培
養後、ウェルあたり150μLの培地を除去し、ステップ2赤血球培地100μLと交換
した。この培地は、ステップ1培地と同様であるが、IL3及びヒドロコルチゾンを加え
なかった。さらに4日培養後、ウェルあたり100μLの培地を除去し、ステップ3培地
100μLと交換した。この培地は、ステップ2培地と同様であるが、SCFを含んでい
なかった。
回収した。さらに、ウェルあたり100μLの培地を除去し、100μLの新鮮なステッ
プ3培地と交換した。残存細胞をさらに3日培養し、その時、ウェルあたり50μLの細
胞懸濁液を採取して等容量のNucRed(2滴/1mLのPBS 0.5% BSA)
で染色し、Guava easyCyteで細胞密度及び脱核率について計数した。残存
する細胞を遠心にかけ、PBSで1回洗浄し、20μLの高速液体クロマトグラフィ(H
PLC)グレードの水に溶解させた。細胞残渣を遠心分離(10,000×g、15分、
4℃)によって除去した。準備ができるまで溶血血液を70℃で保存し、逆相超高速液体
クロマトグラフィー(UPLC)に供してグロビン鎖分析を行った。
CL11A赤血球エンハンサー領域内にZFN結合部位を含有)をポリメラーゼ連鎖反応
(PCR)増幅させ、改変レベルをIllumina MiSeqを用いたペアエンドデ
ィープシークエンシングで決定する。Illumina MiSeq配列決定プラットフ
ォームと適合性のあるライブラリーを作製するため、2セットの融合プライマーを連続ポ
リメラーゼ連鎖反応で使用してアダプター、バーコード、及びフローセルバインダー(短
いDNA配列)を標的特異的アンプリコンに結合させた。以下のプライマーをMiSeq
Adaptor PCRに使用する(下線部分は、BCL11A赤血球エンハンサー特
異的配列である):
個々の単一細胞に由来する赤血球培養物を回収し、QuickExtract(商標)(
Epicentre)を使用してgDNAを抽出し、Illuminaプラットフォーム
でのディープシークエンシングを使用する遺伝子型決定分析に供した。
Protein BEH C4カラム(300A、1.7microm、2.1mm×1
00mm)に5μLの溶血血液を注入した。38%〜42.5%アセトニトリル含有水及
びトリフルオロ酢酸係数0.1%の18分の直線勾配を使用し流量0.2mL/分で室温
にて溶出液を得た。溶出液に220nmを照射した。Agilent OpenLABソ
フトウェアを使用して、特定のグロビン鎖それぞれの量を表す、特定グロビン鎖、γ、β
またはαの面積百分率を定量化した。
この試験では、120μg/mlまたは80μg/mlのSB ZFNをCD34+細
胞にトランスフェクションしてSB ZFN HSPC細胞を作製し、トランスフェクシ
ョン後3日目に細胞試料を採取して、ディープシークエンシングによりBCL11A赤血
球エンハンサー領域の破壊レベルについて分析した。これにより、実験1ではSB ZF
Nトランスフェクション試料のBCL11Aアレル約67%が改変され、実験2では58
%が改変されたことが明らかになった(表14)。
N HSPCの個々の細胞を選別して96ウェルプレートに播種し、インビトロで赤血球
に分化させ、個々の単一細胞培養物それぞれを、ハイスループットDNA配列決定ならび
にUPLCによるグロビン発現分析で分析した。
処理HSPC細胞のロットごとに、200〜300の個々の単一細胞赤血球培養物を分析
した。実験1及び実験2それぞれについて、表現型が明らかな全クローン(混合クローン
は除外、実験1では205クローン及び実験2では265クローン)のうち、28%また
は36%は野生型クローン(+/+)、14%または11%はヘテロ接合体クローン(+
/)、及び58%または52%はホモ接合体(/)クローンである。SB ZFN処理細
胞由来の単一細胞赤血球培養物の全アレルのうち、実験1及び2それぞれ、65%または
58%は、BCL11A赤血球エンハンサー遺伝子座で破壊されていた。何らかの改変ア
レルを持つ単一細胞赤血球培養物すべてのうち、改変細胞クローンの81%(実験1)ま
たは82%(実験2)はBCL11Aの両アレルが破壊されていた。
表14:SB ZFNでトランスフェクションしたHSPC由来の単一細胞赤血球培養物
の遺伝子型決定
SB ZFN HSPCは、28〜36%の野生型細胞、11〜14%の単一アレル改変
担持細胞、及び52〜58%の標的遺伝子座両アレル改変担持細胞で構成されていたこと
を示す。
験1及び2)は、NucRed染色で測定した脱核率で示されるようにインビトロで赤血
球細胞に首尾よく分化した。その後、これらの単一細胞赤血球培養物を逆相UPLC分析
に供し、グロビン鎖発現レベルを測定した。各コロニーは、その赤血球成熟の程度が異な
っており、同じBCL11A赤血球エンハンサー遺伝子型を持つコロニー内部であっても
、γ/βグロビン比のある程度のばらつきは予測された。さらに、BCL11A赤血球エ
ンハンサーの破壊されたアレルの一部は、部分的または完全な機能を保持する場合があり
、GATA1結合部位を保持する結果である可能性が高い(Vierstra et a
l(2015)Nat Methods.12(10):927−30;Canver
et al(2015)Nature527(7577):192−7)。
伝子座のコロニーの遺伝子型とそのγ/βグロビン比との間に明らかな相関があることを
示した。具体的には、BCL11Aの両アレル(ホモ接合体)の改変を担持するコロニー
では、実験1及び2の平均正規化γ/β比はそれぞれ35%及び39%であり、単一アレ
ル(ヘテロ接合体の)改変コロニーでは、実験1及び2それぞれの平均正規化γ/β比は
19%及び13%、ならびに野生型コロニーでは実験1及び2はそれぞれ14%及び13
%であった。ウェルチの補正を用いた両側t検定では、「ホモ接合体−対−野生型」比較
のP値は、実験1及び2ともに<0.0001;「ヘテロ接合体−対−ホモ接合体」比較
のP値は実験1が<0.0001、実験2が0.0025;及び「ヘテロ接合体−対−野
生型」比較のP値は実験1及び2ともにそれぞれ0.02及び0.0002である。下記
グラフ(図13)では、γ/β及びγ/αグロビン比を、被験コロニーすべてについてプ
ロットし、BCL11A赤血球エンハンサーのアレルクラスの遺伝子型決定を行って選別
する。
書に組み込まれる。
の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく多様な変更及び修正を行うことが可能であ
ることは当業者には明らかとなろう。したがって、上述の記載内容及び実施例により限定
されると解釈されるべきではない。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
F1からF4、F1からF5またはF1からF6で表される4つ、5つまたは6つのフィンガーを含み、各フィンガーが標的サブサイトを認識する認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質であって、前記タンパク質は、
(i)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:STGNLTN(配列番号7)、
F2:TSGSLTR(配列番号5)、
F3:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F4:AQCCLFH(配列番号6)、または
(ii)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:DQSNLRA(配列番号2)、
F2:RPYTLRL(配列番号3)、
F3:SRGALKT(配列番号8)、
F4:TSGSLTR(配列番号5)、
F5:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F6:AQCCLFH(配列番号6)、
(iii)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:DQSNLRA(配列番号2)、
F2:RNFSLTM(配列番号9)、
F3:SNGNLRN(配列番号10)またはSTGNLTN(配列番号7)またはSSYNLAN(配列番号11)、
F4:TSGSLTR(配列番号5)、
F5:DQSNLRA(配列番号2)、及び
F6:AQCCLFH(配列番号6)、または
(iv)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QSGHLAR(配列番号14)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)、
F4:RHRDLSR(配列番号18)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(v)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:RNDHRTT(配列番号19)、
F2:QKAHLIR(配列番号20)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)、
F4:RGRDLSR(配列番号21)またはLKRTLKR(配列番号25)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(vi)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QRAHLTR(配列番号22)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)またはQSGTRNH(配列番号24)、
F4:HRNTLVR(配列番号23)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(vii)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QKAHLIR(配列番号20)、
F3:QKGTLGE(配列番号15)またはQSGTRNH(配列番号24)、
F4:RGRDLSR(配列番号21)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)、または
(viii)以下の認識ヘリックス領域を含むタンパク質:
F1:RSDHLTQ(配列番号13)、
F2:QSGHLAR(配列番号14)、
F3:QSGTRNH(配列番号24)、
F4:QSSDLSR(配列番号16)、及び
F5:RRDNLHS(配列番号17)
からなる群から選択される、前記ジンクフィンガータンパク質。
(項目2)
項目1に記載のジンクフィンガータンパク質及び機能性ドメインを含む、融合タンパク質。
(項目3)
前記機能性ドメインは、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、または、切断ドメインである、項目2に記載の融合タンパク質。
(項目4)
項目1〜3のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(項目5)
項目2もしくは項目3に記載の融合タンパク質または項目4に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
(項目6)
前記細胞は、幹細胞または前駆細胞である、項目5に記載の細胞。
(項目7)
前記細胞はヒト細胞である、項目6に記載の細胞。
(項目8)
前記細胞のゲノムは融合タンパク質により改変される、項目5〜7のいずれかに記載の細胞。
(項目9)
前記ゲノム改変は、挿入、欠失及びその組み合わせからなる群から選択される、項目8に記載の細胞。
(項目10)
前記ゲノム改変は、BCL11Aエンハンサー配列の+58領域内にある、項目8または9に記載の細胞。
(項目11)
項目5〜10のいずれかに記載の細胞から作製される、細胞または細胞株。
(項目12)
項目5〜11のいずれかに記載の細胞または細胞株に由来する、部分的または完全に分化した細胞。
(項目13)
前記細胞は、ゲノム改変を行わない細胞と比較した場合にガンマ及び/またはベータグロビンの発現増加を示す、項目5〜12のいずれかに記載の細胞。
(項目14)
項目2もしくは項目3に記載の融合タンパク質、項目4に記載のポリヌクレオチド、または項目5〜13のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。
(項目15)
細胞の内在性BCL11aエンハンサー配列を改変する方法であって、前記内在性BCL11aエンハンサー配列が改変されるように、項目2もしくは項目3に記載の融合タンパク質または項目4に記載のポリヌクレオチドを、前記細胞に投与することを含む、前記方法。
(項目16)
前記細胞に外来配列を導入し、前記内在性BCL11aエンハンサー配列に前記外来配列が挿入されるようにすることをさらに含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記改変は欠失を含む、項目15に記載の方法。
(項目18)
対象においてグロビン生成を増加させる方法であって、
前記対象に項目5〜13のいずれかに記載の細胞を投与することを含む、前記方法。
(項目19)
前記対象はヒトであり、前記細胞はヒト幹細胞またはヒト前駆細胞である、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記細胞を骨髄移植で投与し、前記細胞は前記対象内で生着し、分化し、かつ成熟する、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記対象は異常ヘモグロビン症に罹患している、項目18〜20のいずれかに記載の方法。
(項目22)
前記異常ヘモグロビン症はベータサラセミアまたは鎌状赤血球症である、項目21に記載の方法。
(項目23)
内在性BCL11Aエンハンサー配列内にゲノム改変を含む遺伝子改変細胞を作製する方法であって、
a)細胞と、項目2または項目3に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを接触させ、ここで、前記融合タンパク質は切断ドメインを含み、
b)前記ポリヌクレオチドから前記融合タンパク質の発現が導かれる条件に前記細胞を供し、かつ
c)遺伝子改変細胞を作製するために十分な発現融合タンパク質を用いて前記内在性BCL11Aエンハンサー配列を改変する、各工程を含む、前記方法。
(項目24)
前記細胞を少なくとも1つのサイトカインで刺激することをさらに含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
項目1〜3のいずれかに記載のタンパク質、項目4に記載のポリヌクレオチド及び/または項目5〜13のいずれかに記載の細胞を含む、キット。
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- 明細書に記載の発明。
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