KR20210049124A - 조작된 표적 특이적 염기 편집기 - Google Patents

조작된 표적 특이적 염기 편집기 Download PDF

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Abstract

본원에는 DNA 편집 복합체, 특히 표적 DNA 서열 내의 단일 염기쌍을 특이적으로 변경시키는 DNA 편집 복합체뿐만 아니라 이러한 DNA 편집 복합체를 만들고 사용하는 방법이 기재되어 있다.

Description

조작된 표적 특이적 염기 편집기
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 8월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 62/721,903; 2018년 10월 31일에 출원된 미국 가출원 번호 62/753,696; 2019년 3월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 62/817,153; 및 2019년 6월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 62/867,565를 우선권 주장하며, 이들 가출원의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었고 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2019년 8월 20일에 생성된, 상기 ASCII 카피는 8325-0180-S180-PCT_SL.txt로 명명되고 그 크기가 225,507 바이트이다.
기술분야
본 개시내용은 폴리펩티드 및 게놈 공학 분야에 있다.
인공 뉴클레아제, 예컨대 조작된 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), RNA 유도 뉴클레아제로서 지칭되기도 하는 조작된 crRNA/tracr RNA ('단일 가이드 RNA')를 갖는 CRISPR/Cas 시스템, 및/또는 아르고노트(Argonaute) 시스템에 기반한 뉴클레아제가 의학, 생명 공학 및 농업 분야에 혁명을 일으키고 있다. 이들 분자 도구를 사용하면 유기체 내의 게놈을 이전에는 불가능했던 수준으로 유전자 조작 (예를 들어 편집)할 수 있다. 인공 뉴클레아제는 DNA를 절단할 수 있으므로, 이러한 절단 후에 세포는 오류가 발생하기 쉬운 비상동 말단 결합 (NHEJ)에 의해, 또는 절단 부위를 플랭킹하는 영역과의 상동성을 갖는 기질 DNA의 존재하에 상동성 지향 복구 (HDR)를 통해 기질 DNA를 삽입함으로써 그 파손물을 강제로 '치유'한다. 이러한 프로세스 둘 다는 DNA에서의 이중 가닥 파손 (DSB)으로 시작된다.
일부 경우에, 조작된 뉴클레아제는 유전자 편집된 세포의 염색체에서 다수의 DSB의 유도로 인해 발생할 수 있는 원치 않는 결과 (예를 들어, 전위, 반전 및 결실)를 초래할 수 있었다. 예를 들어, 뉴클레아제 처리 후 전위, 반전 및 결실을 포함한 염색체 재배열의 일부 증거가 관찰되었고 (문헌 [Kosicki, et al. (2018) Nat Biotechnol 36:765 및 Shin, et al. (2017) Nat Comm doi:10.1038/ncomms15646]), 보다 최근에는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 아폽토시스로 이어지는 일부 세포에서의 절단 후 p53 경로의 유도에 관한 우려가 있었다 (Ihry, et al. (2018) Nat Med 24:939-946 및 Haapaniemi, et al. (2018) Nat Med 24:927-930). 또한, HDR은 전형적으로, 대부분의 진핵 생물에서 매우 비효율적이므로, 유전자 교정이 어렵다 (Eid, et al. (2018) Biochem J 475:1955-1964).
또한, Cas9 염기 편집기, 예컨대 AID-dCas9, APOBEC-dCas9 (예를 들어 APOBEC3G 또는 APOBEC1), BE2, BE3 및 BE4 (예를 들어, 문헌 [Komor, et al. (2016) Nature 533:420-424; Komor, et al. (2017) Science Advances 3(8), eaao4774; Kim, et al. (2017) Nat Biotechnol 35(4):371-376] 참조)은 특이성 결여를 나타낼 수 있어 (문헌 [Kim, et al. (2019) Nat Biotechnol 10.1038/s41587-019-0050-1; Zuo, et al. (2019) Science DOI:10.1126/science.aav9973] 참조), 생체 내 및 생체 외 치료 적용을 포함한 다양한 목적에 적합하지 않게 만든다.
따라서, 이중 가닥 파손을 유도하지 않고 높은 특이성으로 게놈 (염기) 편집을 수행할 필요성이 대두된다.
본 개시내용은 표적 DNA (예를 들어, 편집된 게놈)에서 이중 가닥 절단을 하지 않고 편집하는 것 (예를 들어, 단일 염기의 편집)을 포함하여, 세포에서 DNA를 선택적으로 편집하는 방법 및 조성물 (예를 들어, 염기 편집기)을 제공한다. 이러한 염기 편집기는 C:G를 T:A로 변화시키는 시토신 염기 편집기 (CBE) 또는 A:T를 G:C로 변화시키는 아데닌 염기 편집기 (ABE)일 수 있다. 더욱이, 이중 가닥 파손이 유도되지 않기 때문에, 내인성 표적 내에 유리 DNA 말단이 없고 전위가 발생하지 않는다. 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기는 유전자 녹아웃을 위해 (예를 들어, 시토신 염기 편집기를 사용하여 정규 코돈을 정지 코돈으로 변화시키는 것 및/또는 시토신 또는 아데닌 염기 편집기를 사용하여 스플라이스 수용자 부위를 돌연변이시키는 것); 유전자의 제어 요소 (예를 들어, 프로모터 영역) 내로 돌연변이를 도입하기 위해 (예를 들어, 돌연변이를 활성화 또는 억제하기 위함); 질환 유발 돌연변이 (예컨대 점 돌연변이)를 교정 (역전)하기 위해; 및/또는 치료 혜택을 발생시키는 돌연변이를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기는 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 형태에서의 염기 편집을 위해 (시험관 내 또는 생체 외 사용을 위한 세포에 또는 대상체에게 생체 내) 제공될 수 있다. 다른 장점들 중에서, 본 발명의 염기 편집기는 (1) 부가의 DNA 결합 도메인/결합 부위의 길이로 인해 특이성을 증가시키고, 감소된 PAM 요구 사항으로 인해 정밀도 또는 표적화 밀도를 증가시킬 수 있고/있거나; (2) 현재 표적화할 수 없는 부위를 표적화할 수 있도록 PAM 제한을 확장 (완화)할 수 있고/있거나; (3) 성능이 저조한 PAM 부위에서 편집 효율성을 증가시킬 수 있고/있거나; (4) 비 ZFP-고정된 시약으로 표적화할 수 있는 표적 부위에서 효율성을 개선시키므로, 더 낮은 용량을 지원할 수 있으며, 이는 또한 더 낮은 오프 타겟(off-target) 활성을 발생시킨다.
따라서, 본원에는 적어도 하나의 기능적 도메인 (예를 들어, DNA 탈안정화 분자, 예컨대 닉카제, 단백질 및/또는 뉴클레오티드) 및 적어도 하나의 DNA 결합 도메인 (예를 들어, 징크 핑거 단백질)을 포함하는 염기 편집 조성물이 기재된다. 특정 실시양태에서, 염기 편집 조성물은 DNA 내의 아데닌 (A) 또는 시티딘 (C) 염기를 편집하며, 여기서 이러한 조성물은 (1) 적어도 하나의 징크 핑거 단백질 (ZFP) DNA 결합 도메인; (2) 적어도 하나의 DNA 탈안정화 분자; 및 (3) 적어도 하나의 아데닌 또는 시토신 데아미나제를 포함하고, 상기 조성물은 DNA 내에 이중 가닥 절단을 만들지 않는다.
임의의 DNA 탈안정화 분자는 Cas9 닉카제, 단일 가이드 RNA (sgRNA)에 작동가능하게 연결된 Cas9 단백질 (예를 들어, dCas), 임의의 RNA 프로그래밍가능한 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 닉카제 (ZFN 닉카제), TALEN 닉카제, 하나 이상의 단백질, 예컨대 표 A에 제시된 것, 및/또는 하나 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 하나 이상의 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA) 및/또는 가교 핵산 (BNA))를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 조합으로 본원에 기재된 조성물에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 염기 편집 조성물은 1개 초과의 DNA 탈안정화 분자, 예를 들어 하나 이상의 단백질 (예를 들어, 표 A, 닉카제 등) 및/또는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 조성물은 ZFN 닉카제 및 하나 이상의 부가의 단백질 및/또는 뉴클레오티드 DNA 탈안정화 분자 (예를 들어, 표 A의 하나 이상의 단백질 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 뉴클레오티드)를 포함한다. 특정 측면에서, 염기 편집 조성물은 Cas9 단백질을 포함하지 않지만, 다른 Cas 단백질 (예를 들어, 비-Cas9 RNA 프로그램가능한 시스템)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 탈안정화 분자는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 닉카제를 포함한다.
염기 편집 조성물의 적어도 하나의 징크 핑거 단백질 (ZFP) DNA 결합 도메인은 염기 편집 조성물의 다른 성분 중 하나 이상, 예를 들어 DNA 탈안정화 분자 중 하나 이상 (예를 들어, Cas9 닉카제, dCas9 등) 및/또는 적어도 하나의 아데닌 또는 시토신 데아미나제에 작동가능하게 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 ZFP DNA 결합 도메인은 아데닌 또는 시토신 데아미나제에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시양태에서, 염기 편집 조성물은 제1 및 제2 ZFP DNA 결합 도메인을 포함하며, 여기서 제1 ZFP DNA 결합 도메인은 Cas9 닉카제에 작동가능하게 연결된다. ZFP DNA 결합 도메인은 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 핑거를 포함할 수 있고, 편집될 표적화된 염기의 어느 한 쪽 (5' 또는 3')에 있는 표적 부위와 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, ZFP는 표적화된 염기의 어느 한 쪽에 있는 1개 내지 100개 (또는 그 사이의 임의의 수) 뉴클레오티드인 표적 부위와 결합한다. 다른 실시양태에서, ZFP는 표적화된 염기의 어느 한 쪽에 있는 1개 내지 50개 (또는 그 사이의 임의의 수) 뉴클레오티드인 표적 부위와 결합한다.
야생형 및/또는 진화된 도메인을 포함한 임의의 아데닌 또는 시토신 데아미나제가 본원에 기재된 조성물에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 아데닌 또는 시토신 데아미나제는 이량체화하여 활성 아데닌 또는 시토신 데아미나제를 형성하는 제1 및 제2 불활성 도메인으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 아데닌 또는 시토신 데아미나제의 제1 불활성 도메인은 Cas9 닉카제에 작동가능하게 연결되고, 아데닌 또는 시토신 데아미나제의 제2 불활성 도메인은 ZFP DNA 결합 도메인에 작동가능하게 연결된다. 또한 추가 실시양태에서, 아데닌 또는 시토신 데아미나제와 ZFP DNA 결합 도메인은 둘 다 Cas9 닉카제에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시양태에서, 염기 편집기는 제1 및 제2 ZFP DNA 결합 도메인을 포함하며, 제1 ZFP는 Cas9 닉카제에 작동가능하게 연결되고 제2 ZFP DNA 결합 도메인은 아데닌 또는 시토신 데아미나제에 작동가능하게 연결된다.
본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 염기 편집 조성물을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 바이러스 (예를 들어, AAV, Ad 등) 및/또는 비-바이러스 (예를 들어, 플라스미드, mRNA 등) 벡터 상에서 운반될 수 있다. 더욱이, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 조성물 및/또는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 세포 집단뿐만 아니라 이러한 세포의 자손이 또한 제공되며, 여기서 세포는 편집된 염기를 포함한다.
또한 본원에 기재된 바와 같은 조성물 및/또는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 사용하여 표적 DNA (예를 들어, DNA 이중 가닥 내인성 유전자 또는 염색체 외 (에피솜) 서열) 내의 염기를 편집하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 (i) 시티딘 염기 ("C")를 우라실 염기 ("U")로 편집하는 단계이며, 임의로 여기서 U는 DNA 복제 동안 티미딘 염기 ("T")로 대체되는 것인 단계; (ii) 아데닌 염기 ("A")를 이노신 ("I")으로 편집하는 단계이며, 임의로 여기서 I는 복제 동안 구아닌 염기 ("G")로 대체되는 것인 단계; 및/또는 (iii) CA 또는 AC 디뉴클레오티드를 UI 또는 IU로 편집하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포에서의 편집이 (i) C:G 염기쌍의 T:A 염기쌍으로의 변화; (ii) C:G 염기쌍의 G:C 염기쌍으로의 변화; (iii) A:T 염기쌍의 G:C 염기쌍으로의 변화; (iv) 정지 코돈의 도입; 및/또는 (v) 스플라이싱 서열의 편집 또는 생성을 발생시킨다. 상기 방법은 엑손 또는 인트론을 포함하여 임의의 질환 돌연변이 (예를 들어, 점 돌연변이)를 교정하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 세포 또는 대상체 내의 염색체 또는 염색체 외 에피솜에서의 DNA가 편집된다. 상기 방법은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.
한 측면에서, 본원에는 DNA 편집 조성물 (예를 들어, 본원에서 염기 편집 복합체로서 지칭되기도 한 염기 편집 조성물)을 포함하는 조성물 및 시스템이 기재된다. DNA 편집 복합체는 적어도 하나의 기능적 도메인 및 DNA 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, DNA 편집 조성물 복합체는 DNA 결합 도메인, 및 또한, 적어도 하나의 DNA 탈안정화 분자, 예컨대 이중 가닥 DNA 내에 단일 가닥 절단을 만드는 닉카제 도메인을 포함하는 융합 분자 (예를 들어, DNA 닉카제)를 포함한다. 다른 실시양태에서, DNA 편집 조성물 (복합체)은 다수의 (2개 이상의) 융합 분자, 예를 들어 제1 DNA 결합 도메인 및 닉카제 도메인을 포함한 닉카제를 포함하는 제1의 촉매적으로 활성인 융합 분자 및 제2 DNA 결합 도메인을 포함하는 제2의 촉매적으로 불활성인 융합 분자, 및 임의로 본원에 기재된 바와 같은 부가의 DNA 결합 도메인 및 하나 이상의 기능적 도메인을 각각 포함하는 하나 이상의 부가의 융합 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 염기 편집기는 도 1a 내지 1d 중 임의의 것에 도시된 바와 같은 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 (및 임의로 부가의 DNA 결합 도메인)의 결합은, 예를 들어 촉매적으로 활성인 융합 분자와 촉매적으로 불활성인 융합 분자가 이량체화될 때 염기 편집을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 임의적 부가의 DNA 결합 도메인은 이중 가닥 DNA와 결합하는 반면, 다른 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 단일 가닥 DNA와 결합한다. 일부 실시양태에서, DNA 닉카제는 ZFN 닉카제, TALEN 닉카제 또는 CRISPR/Cas 닉카제이며, 여기서 적어도 하나의 기능적 (닉카제) 도메인이 DNA 결합 도메인 (예를 들어, ZFP DNA 결합 도메인, TALE DNA 결합 도메인 및 CRISPR/Cas 시스템과 함께 사용하기 위한 sgRNA)에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, DNA 닉카제 (예를 들어, 융합 분자)는 닉카제 도메인과 DNA 결합 도메인 사이에 링커 서열을 포함한다. 닉카제 도메인(들)은 융합 분자의 N- 또는 C-말단 측을 포함하여 DNA 결합 도메인의 어느 한 쪽 (DNA 결합 도메인에 대해 N- 및/또는 C-말단)에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 대형 링커 라이브러리 (> 10e8개 구성원)로부터의 박테리아 선택 시스템으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 링커는 4개 내지 22개 아미노산 잔기의 범위이다. 일부 실시양태에서, 링커는 DNA 결합 도메인에 상대적인 기능적 도메인 (예를 들어 닉카제 도메인)의 특이적 위치 설정 (예를 들어, DNA 결합 도메인의 N- 또는 C-말단 측에 대한 닉카제 도메인의 연결)을 허용한다. 일부 예에서, 링커는 문헌 [Paschon, et al. (2019) Nat Commun. 10:1133]에 개시된 방법을 사용하여 선택된다. 염기 편집기 (또는 그의 성분)를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 구축물)가 또한 제공된다.
본원에 기재된 바와 같은 DNA 편집 복합체는 하나 이상의 아데닌 데아미나제 도메인, 하나 이상의 시티딘 데아미나제, 및/또는 하나 이상의 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 기능적 도메인을 포함한다. 하나 이상의 기능적 도메인은 본원에 기재된 DNA 편집 복합체의 촉매적으로 활성인 융합 분자 및/또는 촉매적으로 불활성인 융합 분자에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시티딘 데아미나제는 아포지질단백질 B mRNA 편집 복합체 1 (APOBEC1) 도메인이다. 일부 실시양태에서, 시티딘 데아미나제는 활성화 유도 데아미나제 (AID)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 아데닌 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 아데닌 데아미나제는 야생형 또는 돌연변이된 (진화된) TadA (tRNA 아데닌 데아미나제)이다 (문헌 [Gaudelli, et al. (2017) Nature 551:464-471] 참조). 일부 실시양태에서, 아데닌 데아미나제는 ABE 7.8, ABE 7.9 또는 ABE 7.10 (Gaudelli, 상기 문헌) 또는 ABEmax (문헌 [Koblan, et al. (2018) Nat Biotechnol. 36(9):843-846])이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 (아데닌 또는 시티딘) 기능적 도메인은 작동가능하게 연결된 징크 핑거 (예를 들어, 분할 효소)를 포함하는 2개의 폴리펩티드로부터 어셈블리되거나 또는 분할 효소의 한 부분에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 ZFP 및 분할 효소의 다른 성분에 작동가능하게 연결된 Cas9 닉카제로부터 어셈블리된다 (예를 들어, 도 1b 참조). 일부 실시양태에서, 데아미나제의 어셈블리는 작동가능하게 연결된 징크 핑거를 DNA 표적과 결합시킴으로써 구동되어, 폴리펩티드가 어셈블리를 허용하도록 위치하게 한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 (UGI)를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 염기 편집기는 CRISPR 시스템으로부터 유래된 DNA 풀림 (DNA 탈안정화로서 지칭되기도 함) 시스템, 예를 들어 Cas9 (예를 들어, 자연적으로 발생하는 및/또는 조작된 Cas9) 단백질 (예를 들어, 닉카제) 또는 비-Cas9 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 염기 편집기는 징크 핑거 단백질 DNA 결합 도메인을 추가로 포함하는 Cas9 염기 편집기이며, 이러한 ZFP는 Cas9 단백질 (예를 들어, 야생형 또는 조작된 닉카제)의 임의의 성분에 임의의 방향으로 작동가능하게 연결될 수 있고, 예를 들어, 염기 편집기는 Cas9 단백질, Cas9 닉카제의 sgRNA 또는 데아미나제 (야생형 또는 조작된 (진화된) ABE 또는 CBE)에 작동가능하게 연결된 ZFP (ZFP 앵커)를 포함한다. 특정 실시양태에서, ZFP는 염기 편집기의 Cas9 도메인에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, 염기 편집기는 도 3의 Cas9 염기 편집기에 제시된 바와 같은 성분을 포함한다.
또 다른 측면에서, 염기 편집기는 Cas9 단백질로부터 유래된 DNA 풀림 (DNA 탈안정화) 요소를 포함하지 않는다 ("Cas9 무함유"로서 지칭되기도 함). 특정 실시양태에서, 본 발명의 Cas9 무함유 염기 편집기는 ZFP-데아미나제 융합 단백질 및 ZFN 닉카제, 및 임의로 하나 이상의 DNA 탈안정화 인자를 포함한다. 특정 실시양태에서, DNA 탈안정화 인자는 단백질 (예를 들어, 표 A에 나타낸 바와 같음) 또는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 하나 이상의 PNA, LNA 및/또는 BNA)이다. 하나 이상의 비-Cas9 DNA 탈안정화 (풀림) 인자(들) (예를 들어, 표 A의 단백질, LNA, PNA, BNA 등)는 염기 편집기의 임의의 성분, 예를 들어 ZFP-데아미나제 융합 단백질의 어느 한 성분 및/또는 ZFN 닉카제의 성분 중 임의의 것에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 하나 이상의 단백질 및 하나 이상의 뉴클레오티드 DNA 탈안정화 (풀림) 인자를 포함한다. 또한 추가 실시양태에서, 본원에 기재된 Cas9 무함유 염기 편집기는 CRISPR 시스템으로부터 유래된 하나 이상의 단백질을 포함하며, 이러한 단백질은 Cas9가 아니지만 DNA 탈안정화 (풀림) 특성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 염기 편집기는 표적 부위에서 염기 편집기에 대한 단일 가닥 DNA 기질을 제공하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 하나 이상의 DNA 올리고뉴클레오티드, RNA 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA) 및/또는 가교 핵산 (BNA)을 포함한다. 이는, 예를 들어 이중 나선 침입, 삼중체 침입 또는 테일 클램프(tail-clamp)에 의해 용이하게 할 수 있다 (Quijano, et al. (2017) Yale J. Biol and Med. 90:583-598; Pellestor and Paulasova (2004) European J. Human Genetics 12:694-700; Schleifman, et al. (2011) Chem & Bio. 18:1189-1198). 염기 편집기의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 구조는 DNA 및/또는 RNA 및/또는 PNA 및/또는 LNA 및/또는 BNA 염기의 길이, 수 및 위치; 포스포로티오에이트 결합; 표적 서열 조성에 따른 이들 올리고뉴클레오티드의 다른 통상적인 변형에 있어서 다양할 것이다.
특정 실시양태에서, 염기 편집기는 하나 이상의 PNA, 예를 들어, 미니PEG 치환과 증강된 결합, 증가된 용해도 및 개선된 전달을 위한 감마 위치를 함유하는 감마 PNA를 포함한다 (Bahal, et al. (2014) Current Gene Ther. 14(5):331-342). 특정 실시양태에서, PNA는 하나 이상의 O (이는 8-아미노-2,6-디옥사옥탄산 링커를 나타낸다) 및/또는 하나 이상의 시토신 (C) 또는 슈도이소시토신 잔기를 포함한다. 임의로, 하나 이상의 리신 (Lys) 잔기가 PNA 내에, 예를 들어 PNA 서열의 N- 및/또는 C-말단 상에 포함된다. 특정 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 Lys 잔기가 PNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에 포함된다. 특정 실시양태에서, 둘 이상의 PNA가 염기 편집기에 사용되며, 예를 들어 서로에 대해 동일하거나 반대 방향으로 사용된다. 특정 실시양태에서, PNA는 하기 구조의 하나 이상의 PNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 도 8b 내지 8e에 도시된 바와 같은 하나 이상의 PNA를 포함한다:
Figure pct00001
(여기서, O는 8-아미노-2,6-디옥사옥탄산 링커를 나타내고, C는 시토신을 나타낸다). PNA 서열의 N- 및/또는 C-말단 상의 Lys 잔기는 임의적이고, 슈도이소시토신이 시토신을 대체할 수 있다.
다른 실시양태에서 염기 편집기는 하나 이상의 LNA를 포함한다. LNA는 성능 개선을 위해 스태킹 링커 및 2'-글리실아미노-LNA를 포함할 수 있다 (Geny, et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(5):2007-2019). 특정 실시양태에서, LNA는 임의로 하나 이상의 LNA 잔기 및/또는 DNA 잔기 사이에 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 다른 실시양태에서, LNA는 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 콜레스테롤-TEG를 포함한다. 특정 실시양태에서, 염기 편집기는 하기 구조의 하나 이상의 LNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 도 8f 또는 8g에 도시된 바와 같은 하나 이상의 LNA를 포함한다:
Figure pct00002
(여기서, LNA 뉴클레오티드는 대문자로 표시되고; DNA 뉴클레오티드는 소문자로 표시되고; "*"는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; Chol-TEG는 세포로의 증가된 흡수를 위한 3' 콜레스테롤-TEG를 나타낸다).
본원에 기재된 염기 편집 조성물의 성분은 임의의 조합 (하나 이상의 닉카제 도메인, 하나 이상의 DNA 결합 도메인, 하나 이상의 기능적 도메인 등)으로 포함될 수 있으며, 이들 성분은 서로에 대해 임의의 순서로 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, UGI, 시티딘 및/또는 아데닌 데아미나제는 촉매적으로 불활성인 융합 분자의 DNA 결합 도메인의 N-말단 및/또는 DNA 편집 복합체의 촉매적으로 활성인 융합 분자의 닉카제 도메인에 대해 N-말단이다. 일부 실시양태에서, 시티딘 및/또는 아데닌 데아미나제 및/또는 UGI는 촉매적으로 불활성인 융합 분자의 DNA 결합 도메인의 C-말단 및/또는 촉매적으로 활성인 융합 분자의 닉카제 도메인에 대해 C-말단이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 UGI, 시티딘 및/또는 아데닌 데아미나제(들)는 (촉매적으로 활성인 도메인 내의) DNA 결합 도메인과 닉카제 도메인(들) 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, 융합 분자는 시티딘 데아미나제 및 아데닌 데아미나제 도메인 또는 UGI를 포함하며, 여기서 UGI, 시티딘 및 아데닌 데아미나제는 DNA 결합 도메인, 서로 및/또는 닉카제 도메인과 관련하여 임의의 방식으로 위치한다 (예를 들어, 둘 다 임의의 순서로 촉매적으로 불활성인 융합 분자의 DNA 결합 도메인에 대한 N-말단; 둘 다 임의의 순서로 촉매적으로 불활성인 융합 분자의 DNA 결합 도메인에 대한 C-말단; 하나는 촉매적으로 불활성인 융합 분자의 DNA 결합 도메인에 대한 N-말단이고, 하나는 촉매적으로 불활성인 융합 분자의 DNA 결합 도메인에 대한 C-말단, 촉매적으로 활성인 융합 분자의 닉카제 도메인 및/또는 DNA 결합 도메인에 대한 N-말단, 촉매적으로 활성인 융합 분자의 닉카제 도메인 및/또는 DNA 결합 도메인에 대한 C-말단이며; 하나는 촉매적으로 활성인 융합 분자의 닉카제 도메인 및/또는 DNA 결합 도메인에 대한 C-말단이고, 하나는 촉매적으로 활성인 융합 분자의 닉카제 도메인 및/또는 DNA 결합 도메인에 대한 N-말단, 촉매적으로 활성인 융합 분자의 닉카제 도메인과 DNA 결합 도메인 사이 등이다). 염기 편집 조성물의 하나 이상의 융합 분자의 입체 배치의 비-제한적인 예는 첨부된 도면 및 실시예에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, UGI, 시티딘 및/또는 아데닌 데아미나제 도메인은 관련 기술분야에 공지된 링커를 사용하여 DNA 편집 복합체의 다른 구성원에 연결된다. 염기 편집기 또는 그의 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다.
또한 추가 측면에서, DNA 편집 복합체는 적어도 하나의 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 (예를 들어 UGI) 도메인을 포함하는 하나 이상의 기능적 도메인을 포함한다. UGI 도메인(들)은 DNA 편집 복합체가 작동할 수 있도록 임의의 방식으로 DNA 편집 복합체 내로 혼입된다. 일부 실시양태에서, 염기 편집 복합체는 박테리오파지 Gam 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집 복합체는 데아미나제, 닉카제, UGI 및/또는 GAM 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집 복합체의 성분은 하나, 둘 또는 그 초과의 융합 단백질을 코딩하는 하나, 둘 또는 그 초과의 유전자 발현 구축물에 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 도메인(들)은 상기 기재되고 관련 기술분야에 공지된 링커를 사용하여 복합체의 다른 구성원에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 복합체의 다른 구성원에 연결하는데 사용되며, 여기서 링커는 문헌 [Paschon, et al. (2019) Nat Commun. 10:1133]에 개시된 방법을 사용하여 확인된다.
일부 실시양태에서, DNA 편집 (염기 편집) 복합체는 이중 가닥 DNA 나선을 개방하는 데 도움을 주는 분자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 분자는 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 효소는 헬리카제 (예를 들어, RecQ 헬리카제 (WRN, BLM, RecQL4 및 RecQ5 (문헌 [Mo, et al. (2018) Cancer Lett. 413:1-10] 참조), DNA2 (문헌 [Jia, et al. (2017) DNA Repair (Amst). 59:9-19]) 및 임의의 다른 진핵 헬리카제, 예를 들어, FANCJ, XPD, XPB, RTEL1, 및 PIF1 (문헌 [Brosh (2013) Nat Rev Canc 13(8):542-558]))이다. 일부 실시양태에서, 효소는 박테리아 및/또는 바이러스 헬리카제이다. 예시적인 바이러스 헬리카제는 미오비리다에(Myoviridae) 과의 바이러스에 의해 코딩된 것 (예를 들어 gp41, Dda, UvsW, Gene α, 및 Ban); 포도비리다에(Podoviridae) 과의 바이러스에 의해 코딩된 것 (예를 들어 4B); 시포비리다에(Siphoviridae), 바쿨로비리다에(Baculoviridae), 헤르페스비리다에(Herpesviridae), 폴리오마비리다에(Polyomaviridae), 파필로마비리다에(Papillomaviridae) 및 폭스비리다에(Poxviridae) 과의 바이러스에 의해 코딩된 것 (예를 들어, G40P, p143, UL5, UL9, Tag, E1, NPH-I, NPH-II, A18R, 및 VETF), 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 바이러스 헬리카제를 포함한다 (예를 들어 문헌 [Frick and Lam (2006) Curr Pharm Des 12(11):1315-1338] 참조). 일부 실시양태에서, 헬리카제 효소는 박테리아 효소이다. 예시적인 박테리아 헬리카제는 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) SF4 DnaB-유사 헬리카제, 또는 박테리아, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 및 에이치. 파일로리(H. pylori)에서 박테리아 RecBCD 복합체의 일부인 RecB 및 RecD 헬리카제를 포함한다 (Shadrick, et al. (2013) J. Biomol Screen 18(7):761-781). 일부 실시양태에서, 다량체성 헬리카제의 조작된 또는 진화된 변이체가 사용되며, 이는 단량체성 헬리카제 활성을 발생시킨다 (예를 들어, 문헌 [Brendza, et al. (2005) PNAS 102(29):10076-70081] 참조). 일부 실시양태에서, 상기 분자는 CRISPR/Cas 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas 복합체는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 복합체는 그의 뉴클레아제 도메인에 있어서 촉매적으로 결함이 있는 Cas 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 복합체는 그의 뉴클레아제 도메인 중 하나에서 촉매적으로 결함이 있는 Cas 효소 (예를 들어 닉카제)를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 효소는 그의 PAM 인식에 있어서 결함이 있다 (Anders, et al. (2014) Nature 513(7519):569-573). 일부 실시양태에서, Cas 효소는 천연 PAM 서열과 비교 시 완화된 (확장된) PAM 요구 사항을 갖는다 (예를 들어, 문헌 [Nishimasu, et al. (2018) Science 361:1259-1262] 참조). 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 Cas 염기 편집기는 SpCas9의 NGG PAM 서열과 비교 시 완화된 (확장된) PAM 요구 사항을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 분자는 나선 탈안정화 특성을 가지고 있다. 예시적인 나선 탈안정화 분자는 단순 포진 바이러스 유형 I (문헌 [Boehmer and Lehman (1993) J Virol 67(2):711-715]), 푸랄파(Puralpha) (문헌 [Darbinian, et al. (2001) J Cell Biochem 80(4):589-95]) 및 송아지 흉선 DNA 나선 탈안정화 단백질 (문헌 [Kohwi-Shigematsu, et al. (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75(10):4689-93])로부터의 ICP8을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자는 전사 및/또는 D 루프 형성/안정화에 관여한다. 이러한 클래스의 예시적인 분자는 Rad51, Rad52, RPA1, RPA2 및 RPA3, Exo1, BLM, 및 HMGB1 및 HMGB2를 포함한다. 활용될 수 있는 다른 단백질은 소 ROA1 및 이. 콜라이 RecA 또는 이. 콜라이 rad51을 포함한다. DNA 나선 탈안정화제로서 작용할 수 있는 다른 단백질 도메인은 Cas9로부터의 RecI 및 Rec II 도메인 또는 그 자체로의 RecII 도메인뿐만 아니라 Cas9로부터의 임의의 다른 나선 탈안정화 영역을 포함한다. 본원에 기재된 염기 편집기에서 사용하기 적합한 단백질 도메인의 다른 비-제한적인 예는 표 A에 제시되어 있다.
일부 실시양태에서, 분자는 올리고뉴클레오티드, PNA, LNA, BNA 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 핵산이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표적화된 편집 근처 영역과의 상동성을 갖는 DNA이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표적화된 편집 근처 영역과의 상동성을 갖는 RNA이다. 일부 실시양태에서, RNA는 변형된다. 일부 실시양태에서, 융합 분자는 이러한 융합 분자의 하나 이상의 도메인 사이에 아미노산 링커 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 DNA 나선을 개방하는 데 도움을 주기 위해 사용되는 분자(들)는 상기 기재된 링커를 사용하여 DNA 편집 복합체의 다른 구성원에 연결된다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 DNA 나선을 개방하는 데 도움을 주기 위해 사용되는 분자(들)는 DNA 편집 복합체의 다른 구성원에 연결되고, 이는 공지된 방법을 사용하여 확인된다.
특정 실시양태에서, 핵산은 PNA, 예를 들어 하나 이상의 O (이는 8-아미노-2,6-디옥사옥탄산 링커를 나타낸다) 및/또는 하나 이상의 시토신 (C) 또는 슈도이소시토신 잔기를 포함하는 PNA를 포함한다. 임의로, 하나 이상의 리신 (Lys) 잔기가 PNA 내에, 예를 들어 PNA 서열의 N- 및/또는 C-말단 상에 포함된다. 특정 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 Lys 잔기가 PNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에 포함된다. 특정 실시양태에서, 둘 이상의 PNA가 염기 편집기에 사용되며, 예를 들어 서로에 대해 동일하거나 반대 방향으로 사용된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 PNA는 하기를 포함한다:
Figure pct00003
(여기서, O는 8-아미노-2,6-디옥사옥탄산 링커를 나타내고, C는 시토신을 나타낸다). PNA 서열의 N- 및/또는 C-말단 상의 Lys 잔기는 임의적이고, 슈도이소시토신이 시토신을 대체할 수 있다 (또한 도 8b 내지 8e 참조).
다른 실시양태에서 염기 편집기는 하나 이상의 LNA를 포함한다. LNA는 성능 개선을 위해 스태킹 링커 및 2'-글리실아미노-LNA를 포함할 수 있다 (Geny, et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(5):2007-2019). 특정 실시양태에서, LNA는 임의로 하나 이상의 LNA 잔기 및/또는 DNA 잔기 사이에 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 다른 실시양태에서, LNA는 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 콜레스테롤-TEG를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 LNA는 하기를 포함한다:
Figure pct00004
(여기서, LNA 뉴클레오티드는 대문자로 표시되고; DNA 뉴클레오티드는 소문자로 표시되고; "*"는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; "Chol-TEG"는 세포로의 증가된 흡수를 위한 3' 콜레스테롤-TEG를 나타낸다) (또한, 도 8f 및 8g 참조).
이들 분자는 모두 본원에 기재된 염기 편집 시스템 내로 혼입될 수 있으며, 편집 효율성을 증가시키거나, 오프 타겟 염기 편집을 감소시키거나, 염기 편집 창을 조정하거나 또는 표적화된 유형의 핵산 염기를 변경하도록 작용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 기능적 도메인은 단일 융합 분자에 포함된다. 또 다른 한편으론, 다수의 기능적 도메인을 포함하는 DNA 편집 복합체는 임의의 방식으로 별도의 융합 분자로 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 융합 분자는 DNA 결합 도메인, 시티딘 및/또는 아데닌 데아미나제 및 UGI를 포함하는 반면, 제2 융합 분자는 닉카제 또는 절반-닉카제 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나의 융합 분자는 데아미나제 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인에 융합된 촉매적으로 불활성인 (데드) FokI 도메인을 포함하고, 제2 융합 단백질은 절반 FokI 닉카제 단백질, DNA 결합 도메인 및 UGI 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나의 융합 단백질은 UGI 도메인에 융합된 데아미나제 도메인에 융합된 촉매적으로 불활성인 (데드) FokI 도메인을 포함하는 반면, 제2 융합 분자는 기능적 닉카제 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 하나 이상의 융합 단백질은 작동가능한 융합 분자 내의 도메인에 임의의 순서로 융합된다. 일부 실시양태에서, 닉카제 도메인은 Cas 닉카제 도메인이고, 일부 실시양태에서, 닉카제 도메인은 TALEN 닉카제 도메인이다. 일부 실시양태에서, 기능적 도메인 중 하나 이상은 상기 기재된 링커를 사용하여 복합체의 하나 이상의 다른 구성원에 연결된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 기능적 도메인은 문헌 [Paschon, et al. (2019) Nat Commun. 10:1133]에 개시된 방법을 사용하여 확인된 링커를 사용하여 복합체의 하나 이상의 다른 구성원에 연결된다.
본원에 기재된 염기 편집기(들)는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터 (AAV, Ad 등), 비-바이러스 벡터 (플라스미드, mRNA 등) 또는 그의 조합 상에서 운반될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나의 폴리뉴클레오티드는 염기 편집기의 모든 성분을 포함하는 반면, 다른 실시양태에서, 염기 편집기의 성분은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 분할 효소 및/또는 ZFP를 운반하는 별도의 폴리뉴클레오티드)에 의해 운반된다.
또 다른 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 DNA 편집 복합체를 사용하여 DNA 분자를 편집 (예를 들어, 유전자 편집)하는 방법이 기재된다. 이와 같이 기재된 방법은 DNA 분자가 편집되도록 하나 이상의 DNA 편집 복합체를 세포에 도입하는 것을 포함한다. 세포는 단리될 수 있거나 또는 (예를 들어, 대상체에게 정맥내 또는 다른 투여를 통해) 살아있는 대상체 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 분자는 세포 내의 염색체 또는 염색체 외 에피솜이다. 일부 실시양태에서, 염색체 또는 염색체 외 에피솜은 본원에 개시된 융합 단백질에 의해 우라실 염기 ("U")로 탈아미노화되는 시티딘 염기 ("C")를 포함한다. 일부 실시양태에서, U는 DNA 복제 동안 티미딘 염기 ("T")로 대체된다. 일부 실시양태에서, 염색체 또는 염색체 외 에피솜은 본원에 개시된 융합 단백질에 의해 이노신 ("I") 염기로 탈아미노화되는 아데닌 염기 ("A")를 포함한다. 일부 실시양태에서, I는 복제 동안 구아닌 염기 ("G")로 대체된다. 일부 실시양태에서, 염색체 또는 염색체 외 에피솜은 CA 또는 AC 디뉴클레오티드가 UI 또는 IU 디뉴클레오티드로 탈아미노화되도록 본원에 개시된 데아미나제에 의해 탈아미노화되는 아데닌 및 시티딘 염기를 포함한다 (예시적인 시스템에 관해서는 도 1 참조).
일부 실시양태에서, 닉카제 도메인은 FokI DNA 절단 도메인으로부터 유래된다 (미국 특허 번호 5,436,150; 8,703,489; 9,200,266; 및 9,631,186 참조). 일부 실시양태에서, FokI 닉카제는 모 FokI 닉카제와 비교 시 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이는 절단 도메인의 전하를 변화시키는 돌연변이, 예를 들어 양으로 하전된 잔기의 비-양으로 하전된 잔기로의 돌연변이 [예를 들어, K 및 R 잔기의 돌연변이 (예를 들어, S로 돌연변이됨); N 잔기의 돌연변이 (예를 들어, D로 돌연변이됨), 및 Q 잔기의 돌연변이 (예를 들어, E로 돌연변이됨)]; 분자 모델링에 기초하여 DNA 백본에 근접한 것으로 예측되고 FokI 상동체에서의 변이를 나타내는 잔기로의 돌연변이; 및/또는 다른 잔기에서의 돌연변이를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,623,618 및 문헌 [Guo, et al. (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107]). 닉카제는 ZFN 닉카제, TALEN 닉카제 및 CRISPR/Cas 시스템, 예컨대 Cas 닉카제일 수 있다.
일부 실시양태에서, 염기 편집기는 FokI 또는 FokI 동족체로부터 유래되는 절단 도메인을 포함하는 DNA 결합 도메인 (예를 들어, 조작된 닉카제 도메인)을 포함하고, 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 야생형 완전한 길이의 FokI를 기준으로 하여 넘버링된 아미노산 잔기 416, 418, 422, 447, 448, 476, 479, 481 및/또는 525 중 하나 이상, 또는 FokI 동족체 내의 상응하는 잔기에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, FokI로부터 유래된 절단 절반 도메인은 387, 393, 394, 398, 400, 416, 418, 422, 427, 434, 439, 441, 442, 444, 446, 448, 472, 473, 476, 478, 479, 480, 481, 487, 495, 497, 506, 516, 523, 525, 527, 529, 534, 559, 569, 570, 및/또는 571 중 하나 이상을 포함하여, 아미노산 잔기 414-426, 443-450, 467-488, 501-502, 및/또는 521-531 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 상응하는 위치에서 FokI에 상동인 자연 제한 효소에서 발견되는 잔기에 대한 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 치환, 예를 들어 야생형 잔기를 임의의 상이한 아미노산, 예를 들어 알라닌 (A), 시스테인 (C), 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 히스티딘 (H), 페닐알라닌 (F), 글리신 (G), 아스파라긴 (N), 세린 (S) 또는 트레오닌 (T)으로 치환하는 것이다. 일부 실시양태에서, FokI 뉴클레아제 도메인은 416, 418, 422, 476, 447, 479, 481 및/또는 525 (야생형인 서열식별번호: 5를 기준으로 하여 넘버링됨) 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함한다. 뉴클레아제 도메인은 또한, ELD, KKR, ELE, KKS를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 위치 418, 432, 441, 448, 476, 481, 483, 486, 487, 490, 496, 499, 523, 527, 537, 538 및 559에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,623,618 참조). 일부 실시양태에서, 절단 도메인은 잔기 419, 420, 425, 446, 447, 470, 471, 472, 475, 478, 480, 492, 500, 502, 521, 523, 526, 530, 536, 540, 545, 573 및/또는 574 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 변이체 절단 도메인은 뉴클레아제 이량체화에 관여한 잔기에 대한 돌연변이 (이량체화 도메인 돌연변이), 및 예를 들어, 인산염 접촉에 참여할 수 있는 아미노산 잔기에서, 이량체화 도메인을 벗어난 아미노산 위치에서의 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 돌연변이와 조합하는 하나 이상의 부가의 돌연변이; 예를 들어, 인산염 접촉 잔기에 대한 돌연변이: 예를 들어 이량체화 돌연변이체 (예컨대 ELD, KKR, ELE, KKS 등)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 위치 416, 418, 422, 447, 448, 476, 479, 481 및/또는 525에서의 돌연변이는 양으로 하전된 아미노산을 비하전되거나 또는 음으로 하전된 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 위치 446, 472 및/또는 478 (및 임의로, 예를 들어 이량체화 또는 촉매 도메인 내의 부가의 잔기)에서의 돌연변이가 만들어진다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 I479Q 및/또는 Q481A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 절단 절반 도메인은 본원에 기재된 돌연변이 이외에, 이량체화 도메인에서의 돌연변이, 예를 들어, 아미노산 잔기 490, 537, 538, 499, 496 및 486에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 융합 단백질을 제공하며, 여기서 조작된 절단 절반-도메인은 본원에 기재된 하나 이상의 돌연변이 이외에, 위치 486에서의 야생형 Gln (Q) 잔기가 Glu (E) 잔기로 대체되고, 위치 499에서의 야생형 Ile (I) 잔기가 Leu (L) 잔기로 대체되며, 위치 496에서의 야생형 Asn (N) 잔기가 Asp (D) 또는 Glu (E) 잔기로 대체되는 ("ELD"또는 "ELE") 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 닉카제 절반 도메인은 야생형 FokI 또는 FokI 동족체 절단 절반 도메인으로부터 유래되고, 아미노산 잔기 416, 418, 422, 447, 448, 476, 479, 481 또는 525에서의 하나 이상의 돌연변이 이외에, 야생형 FokI (서열식별번호: 5)를 기준으로 하여 넘버링된 아미노산 잔기 490, 538 및 537에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 융합 단백질을 제공하며, 여기서 조작된 닉카제 절반-도메인은 본원에 기재된 하나 이상의 돌연변이 이외에, 위치 490에서의 야생형 Glu (E) 잔기가 Lys (K) 잔기로 대체되고, 위치 538에서의 야생형 Ile (I) 잔기가 Lys (K) 잔기로 대체되며, 위치 537에서의 야생형 His (H) 잔기가 Lys (K) 잔기 또는 Arg (R) 잔기로 대체되는 ("KKK" 또는 "KKR") (본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 8,962,281 참조) 폴리펩티드를 포함한다 (미국 특허 공개 번호 2018/0087072 참조).
일부 실시양태에서, DNA 결합 도메인 및 조작된 FokI 또는 그의 동족체, 및 인공 뉴클레아제를 생산하는 본원에 기재된 바와 같은 절단 절반-도메인을 포함하는 융합 분자가 제공된다. 일부 실시양태에서, 융합 분자의 DNA 결합 도메인은 징크 핑거 결합 도메인 (예를 들어, 조작된 징크 핑거 결합 도메인, ZFP)이다. 일부 실시양태에서, 징크 핑거 중 하나 이상은 상기 문헌 ([Paschon, et al.] 참조)에 개시된 방법을 사용하여 확인된 링커를 사용하여 함께 연결된다. 일부 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 TALE DNA 결합 도메인 (TALE)이다. 일부 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 DNA 결합 분자 (예를 들어 가이드 RNA) 및 촉매적으로 불활성인 Cas 또는 Cpf1 (Cas12a로서 공지되기도 함) 단백질 (예를 들어 dCas9 또는 dCpf1)을 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 촉매적으로 불활성인 Cas (dCas) 단백질에 융합된 ZFP를 포함한다. 일부 실시양태에서, ZFP-dCas 융합 단백질은 PAM 특이성을 변경시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, ZFP-dCas 단백질은 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 PAM 인식에 의존적이지 않다. 일부 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 dCas 단백질에 융합된 TALE를 포함한다. 일부 실시양태에서, TALE-dCas 융합 단백질은 PAM 특이성을 변경시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, TALE-dCas 단백질은 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 PAM 인식에 의존적이지 않다. 상기 실시양태 중 임의의 것에서, DNA 결합 도메인 (예를 들어, ZFP, TALE 또는 가이드 RNA 및 Cas 시스템)을 조작된 FokI 또는 그의 동족체에 연결시키기 위해 사용되는 링커는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 확인된다 (예를 들어, 문헌 [Paschon, et al. (2019) Nat Commun. 10:1133] 참조).
일부 실시양태에서, DNA 편집 복합체는 이중 가닥 DNA 내의 특이적 DNA 염기를 편집한다. 일부 실시양태에서, 편집은 세포 내의 DNA 분자에서 만들어진다. 일부 실시양태에서, DNA는 세포의 염색체 내에 있다. 일부 실시양태에서, 편집은 C:G 염기쌍에서 T:A 염기쌍으로의 변화를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 편집은 C:G 염기쌍에서 G:C 염기쌍으로의 변화를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 편집은 A:T 염기쌍에서 G:C 염기쌍으로의 변화를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 편집은 엑손에서 이루어진다. 일부 실시양태에서, 편집은 정지 코돈 (예를 들어 TAA, TAG, TGA)의 도입을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 염기 편집은 표적화된 유전자의 유전자 발현의 녹아웃을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 편집은 스플라이싱 서열 (예를 들어, 5' 컨센서스 서열이 G T A/G A/C/T G T/G/A/C A/G/T/C (T/C/G/A)3 (서열식별번호: 73)이고, 3' 컨센서스 서열이 (T/C)10 T/C/A/G C/T A G (서열식별번호: 74)인 U2 스플라이스 서열; 및 5' 컨센서스 서열이 G/A T A T C T T/C이고, 3' 컨센서스 서열이 (T/G/A/G)2 T/A/C/G (T/C/A/G)2 C/T A G/C인 U12 스플라이스 서열)을 코딩하는 서열에서 이루어진다 (문헌 [Turunen, et al. (2013) Wiley Interdiscip Rev RNA. 4(1):61-76] 참조). 일부 실시양태에서, 새로운 스플라이싱 서열이 생성된다. 일부 실시양태에서, 스플라이싱 서열은 더 이상 스플라이싱 서열로서 기능하지 않도록 변경된다. 일부 실시양태에서, 스플라이싱 서열의 변경은 엑손 스키핑을 유발한다. 일부 실시양태에서, 희귀 코돈이 생성되도록 서열이 변경된다. 일부 실시양태에서, 염기 편집은 질환과 연관된 유전자가 교정되도록 DNA 서열에서 점 돌연변이의 교정을 유발한다. 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 염기 편집의 비-제한적인 예는 V617F 버전이 더 이상 발현되지 않도록 하는 JAK2의 편집 (그에 의해, 비제어된 혈액 세포 생산을 발생시키는 상기 유전자의 활성화가 감소된다); 다른 암 유전자, 예컨대 BCR/ABL을 녹아웃 또는 억제하기 위한 염기 편집; A1AT의 염기 편집 등을 포함한다. 치료될 수 있는 예시적인 질환은 겸상 적혈구병, 혈우병, 낭포성 섬유증, 페닐케톤뇨증, 테이 삭스병(Tay-Sachs), 색맹, 파브리병(Fabry disease), 프리드라이히(Friedreich) 운동실조, 전립선암, 및 다른 많은 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 염기 편집 복합체는 RNA 분자 상에서 작용한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 RNA 특이적 데아미나제, 예컨대 ADAR2 (RNA 유형 2 상에서 작용하는 아데노신 데아미나제)를 활용한다 (문헌 [Cox, et al. (2017) Science 358(6366):1019-1027] 참조).
또한 본원에는 조성물 중 임의의 것 (염기 편집 조성물 및/또는 이들 조성물을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드)을 포함하는 세포뿐만 아니라 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 변형시킨 이들 세포의 자손인 세포가 개시된다. 일부 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포 또는 진핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 염기 편집기 복합체 및 염기 편집기 복합체 유도된 DNA 또는 RNA 변형을 포함한다. 변형된 세포 및 이러한 변형된 세포로부터 유래된 임의의 세포가 본 개시내용의 염기 편집기 복합체를 반드시는 아니지만 일시적 그 이상으로 포함하지만, 이러한 염기 편집기 복합체에 의해 매개되는 게놈 변형은 남아 있다.
또한 또 다른 측면에서, 관심 영역에서 세포 염색질의 표적화된 편집을 위한 방법; 감염을 치료하는 방법; 및/또는 질환을 치료하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 이들 방법은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내 또는 그의 조합으로 실시될 수 있다. 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집 복합체 (예를 들어 융합 폴리펩티드 및 임의로, 하나 이상의 융합 폴리펩티드(들)가 본원에 개시된 바와 같은 조작된 닉카제를 포함하는 임의의 관련 핵산)를 발현함으로써 세포 내의 미리 결정된 관심 영역에서 세포 염색질을 편집하는 것을 수반한다. 특정 실시양태에서, 온 타겟(on-target) 부위의 표적화된 편집은 세포의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%에서 발견된다.
본원에 개시된 바와 같은 염기 편집 복합체는 관심 영역에서 세포 염색질의 표적화된 편집을 위한 방법에 사용될 수 있다. 세포는 배양된 세포, 세포주, 유기체 내의 세포, 세포 및/또는 그 자손이 처리 후 유기체로 되돌아가는 경우 처리를 위해 유기체로부터 제거된 세포, 및 유기체로부터 제거되고, 본 발명의 융합 분자를 사용하여 변형된 다음, 치료 방법 (세포 요법)에서 유기체로 되돌아 가는 세포를 포함한다. 세포 염색질에서의 관심 영역은, 예를 들어, 게놈 서열 또는 그의 일부분일 수 있다.
융합 분자는, 예를 들어, 이러한 융합 분자를 폴리펩티드로서 세포에 전달하거나, 또는 융합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 전달함으로써 세포에서 발현될 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 DNA인 경우, 전사되고 번역되어 융합 분자를 생성한다. 추가로, 폴리뉴클레오티드가 융합 분자를 코딩하는 mRNA인 경우, 이러한 mRNA가 세포로 전달된 후, mRNA는 번역되어 융합 분자를 생성한다.
본 발명의 다른 측면에서는 염기 편집 특이성을 증가시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 오프 타겟 편집 활성을 감소시킴으로써 전반적인 온 타겟 편집 특이성을 증가시키기 위한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 염기 편집과 연관된 삽입-결실 [인델(indel)] 형성을 감소시키기 위한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 조작된 염기 편집 복합체의 조작된 닉카제 성분 (ZFN 닉카제를 형성하는 닉카제 파트너, 예를 들어 촉매적으로 불활성인 ZFN 파트너 및 촉매적으로 활성인 ZFN 파트너)이 세포와 접촉하는 데 사용되며, 여기서 상기 복합체의 각각의 닉카제 파트너는 다른 파트너와 일 대 일이 아닌 비율로 제공된다. 일부 실시양태에서, 두 파트너의 비율은 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8, 1:9, 1:10 또는 1:20 비율, 또는 그 사이의 임의의 값으로 제공된다. 다른 실시양태에서, 두 파트너의 비율은 1:30 초과이다. 일부 측면에서, 각각의 파트너는 mRNA로서 세포에 전달되거나 또는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터로 전달되며, 여기서 각각의 파트너를 코딩하는 mRNA 또는 벡터의 상이한 수량이 전달된다. 추가 실시양태에서, 뉴클레아제 복합체의 각각의 파트너는 단일 바이러스 또는 비-바이러스 벡터 상에 포함될 수 있지만, 하나의 파트너가 다른 파트너보다 더 높거나 더 낮은 값으로 발현되도록 의도적으로 발현되어, 궁극적으로 일 대 일이 아닌 절단 절반 도메인의 비율로 세포에 전달된다. 일부 실시양태에서, 각각의 절단 절반 도메인은 상이한 발현 효율성을 갖는 상이한 프로모터를 사용하여 발현된다. 일부 실시양태에서, 2개의 절단 도메인은 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 사용하여 세포로 전달되며, 여기서 둘 다는 동일한 오픈 리딩 프레임으로부터 발현되지만, 두 파트너를 코딩하는 유전자는 특정 서열 (예를 들어 자기 절단 2A 서열 또는 IRES)에 의해 분리되어, 3' 파트너가 더 낮은 비율로 발현되므로, 두 파트너의 비율이 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8, 1:9, 1:10 또는 1:20 비율 또는 그 사이의 임의의 값이 된다. 다른 실시양태에서, 두 파트너는 1:1과 상이하도록 선택되는 비율로 전개된다.
또 다른 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 염기 편집기를 사용하여 생산된 세포 집단이 기재된다. 특정 실시양태에서, 세포의 5% 내지 20% 초과 (또는 그 사이의 임의의 값), 바람직하게 20% 초과, 보다 더 바람직하게 50% 초과, 보다 더 바람직하게 80% 내지 100%가, 표적화된 염기에 대한 변형을 포함한다 (예를 들어, 이는 염기 편집된 세포이다). 또한 추가 실시양태에서, 편집된 세포는 오프 타겟 편집 (게놈의 어느 곳에서나 의도하지 않은 편집) 및/또는 방관자 (매우 근접한 편집 이벤트, 예를 들어 의도된 표적 염기의 어느 한 쪽에 있는, 예를 들어 Cas9의 프로토스페이서 영역 내에 있는 1 내지 20개 (또는 그 사이의 임의의 값) 뉴클레오티드) 돌연변이를 거의 또는 전혀 나타내지 않는다. 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집된 세포의 단리된 집단은 대상체에서 질환의 생체 외 치료에 사용될 수 있고/있거나 생체 외 치료로서 사용하기 전에 생체 외에서 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 추가 라운드의 염기 편집을 통해) 추가로 조작될 수 있다. 또한, 염기 편집은 생체 내 시행되어, 생체 내에서 질환 관련 돌연변이를 교정한 후 대상체에서 질환 또는 병태가 치료되도록 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 닉카제 파트너는 부가의 활성 도메인에 융합된다. 일부 실시양태에서, 부가의 도메인은 하나 이상의 데아미나제 (예를 들어 A 특이적 또는 C 특이적), UGI 도메인, 헬리카제, 및 GAM 도메인으로부터 선택된 하나 이상의 예시적인 도메인을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집 복합체, 또는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 염기 편집 복합체 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들); 보조 시약; 및 임의로 지침 및 적합한 용기를 포함하는 키트가 기재된다.
이들 측면 및 다른 측면은 전체로서의 개시내용에 비추어 통상의 기술자에게 쉽게 명백할 것이다.
도 1a 내지 1d는 예시적인 DNA 편집 시스템 및 복합체를 묘사하는 개략도이다. 도 1a는 DNA 결합 도메인 (예를 들어, ZFP, TALE, sgRNA)을 포함하는 하나의 촉매적으로 불활성인 ("X"로서 표시됨) 융합 분자 및 DNA 결합 도메인 (예를 들어, ZFP, TALE, sgRNA)을 또한 포함하는 하나의 촉매적으로 활성인 닉카제 융합 분자 (가위로서 표시됨)를 포함하는 시스템을 도시한다. 촉매적으로 활성인 융합 분자와 촉매적으로 불활성인 융합 분자는 DNA 결합 도메인이 각각의 표적 부위와 결합하면 이량체화되고, 결합 후 표적 DNA를 편집한다 (예를 들어, 염기 편집). 도 1a는 또한 2개의 UGI 도메인을 포함하는 복합체를 도시한다. 도 1b는 염기 편집을 위한 추가의 예시적인 Cas9 및 Cas9 무함유 시스템을 도시한다. 상단 패널은 임의의 아데노신 또는 시토신 데아미나제 도메인의 성분의 이량체화를 통해 기능하는 염기 편집기를 도시한다. 도 1b의 하단 패널은 본원에 기재된 바와 같은 ABE 및 CBE 염기 편집기의 다양한 실시양태를 도시한다. 도 1c는 임의로 ZFP 앵커에 연결된 Cas9 DNA 탈안정화 분자 (예를 들어, sgRNA에 작동가능하게 연결된 dCas9를 포함하는 RNA 프로그램가능한 시스템); ZFP-데아미나제 융합 단백질; 및 ZFN 닉카제를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기의 또 다른 실시양태를 도시한다. 특정 실시양태에서, ZFN 닉카제는 존재하지 않으며 DNA 탈안정화 분자는 임의의 RNA 프로그램가능한 분자를 포함한다. 본 도식은 ZFP-데아미나제 융합 단백질로부터 Cas9 닉카제의 반대 쪽에 있는 ZFN 닉카제를 도시하지만, ZFN 닉카제와 ZFP-데아미나제 둘 다는 Cas9 닉카제에 대해 3' 또는 5'일 수 있다는 것이 분명할 것이다. 도 1d는 추가의 Cas9 무함유 (비-Cas9로서 지칭되기도 함) 염기 편집 시스템을 도시한다. 삼각형은 닉킹이 발생하는 위치를 나타내고 "PNA"는 펩티드 핵산을 지칭하며; "LNA"는 잠금 핵산을 지칭하고 "BNA"는 가교 핵산을 지칭한다. 이들 염기 편집기에서의 뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 올리고뉴클레오티드, RNA 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA) 및/또는 가교 핵산 (BNA))는 표적 부위에서 염기 편집기를 위한 단일 가닥 DNA 기질을 제공할 수 있다.
도 2는 예시적인 아데닌 염기 편집기에 의해 표적화된 DNA를 도시하는 개략도이다. 본 도면은 야생형 mRNA 프로토스페이서 및 PAM이 상단에 정렬된 A1AT Z 돌연변이 근처의 DNA 서열을 도시한다 (서열식별번호: 78). 프로토스페이서의 오른쪽에는 몇 가지 상이한 ZFP의 DNA 표적이 도시된다. 도시된 바와 같이, PAM 서열을 필요로 하는 ABE의 경우, 염기 편집을 위한 표적 (염기 편집 창으로서 지칭되기도 함)은 전형적으로 PAM 서열로부터의 13 내지 16개 뉴클레오티드이며, 그 크기가 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 초과의 뉴클레오티드일 수 있다 (본 도면에는 4개 뉴클레오티드의 염기 편집 창이 도시된다) (서열식별번호: 77).
도 3a 및 3b는 예시적인 ZFP 염기 편집기를 묘사하는 개략도이다. 도 3a는 예시적인 ZFP 아데닌 염기 편집기를 도시한다. 상단 패널은 표시된 성분이 있는 예시적인 편집기를 도시한다. 중간 패널은 2개의 이. 콜라이 tRNA 특이적 아데노신 데아미나제 (tadA)를 사용하는 예시적인 ABE를 도시하며, 여기서 하나는 야생형 서열이고 다른 하나는 진화된 서열이다 (Gaudelli, et al. (2017) Nature 551(7681):464-471). TadA 도메인은 도시된 링커 (서열식별번호: 2)를 사용하여 서로 부착되고 SPCas9 서열에 부착된다. 사용된 SpCas9는 공지된 완화된 PAM 요구 사항을 갖는 VRVRFRR 변이체이다 (문헌 [Nishimasu, et al. (2018) Science 361:1259-1262] 참조). 이어서 Cas9 서열은 ZFP DNA 결합 도메인에 연결되며, 여기서 사용된 링커 (서열식별번호: 3)는 2개의 NLS 서열과 3개의 HA 태그를 포함할 수 있다. Cas9VR은 Cas9NG로서 지칭되기도 한다. 도 3b는 본원에 기재된 바와 같은 예시적인 Cas9 및 Cas9 무함유 염기 편집기를 도시한다. 하기 약어가 사용된다: "TadA"는 야생형 아데닌 데아미나제 도메인을 지칭하고; TadA*는 진화된 (조작된) 아데닌 데아미나제 도메인을 지칭하며; "7.8" "7.9" "7.10" 및 "MAX"는 문헌 [Gaudelli, et al. (2017) Nature 551(7681):464-471) 및 Koblan, et al. (2018) Nat Biotechnol. 36(9):843-846]에 기재된 바와 같은 진화된 (조작된) 아데닌 데아미나제 도메인을 지칭하고; "SpCas9 [PAMs: NGG]"는 문헌 [Jinek, et al. (2012) Science 337(6096):816-21]에 기재된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 Cas9를 지칭하며; "SpXCas9-3.7 [PAMs: NGN, GAA & GAT]"은 문헌 [Hu, et al. (2018) Nature 556(7699):57-63]에 기재된 바와 같은 광범위한 PAM 적합성을 갖는 SpCas9 변이체를 지칭하고; "SpCas9-NG [PAMs: NGN; 시험관 내 NAN]"는 문헌 [Nishimasu, et al. (2018) Science 361(6408):1259-1262]에 기재된 바와 같은 완화된 PAM 요구 사항을 갖는 SpCas9 변이체를 지칭하며; "ScCas9 [PAMs: TGT, …]"는 문헌 [Chatterjee, et al. (2018) Sci Adv 4(10):eaau0766. doi: 10.1126/sciadv.aau0766]에 기재된 바와 같은 최소한의 PAM 특이성을 갖는 SpCas9 오르소로그(ortholog)를 지칭하며; "NO CAS9"는 이러한 도메인이 존재하지 않는다는 것을 의미하고 (Cas9 무함유 염기 편집기); "5F ZFP"는 5개 핑거 ZFP를 지칭하며; "6F ZFP"는 6개 핑거 ZFP를 지칭하고; ">6F ZFP"는 6개 초과의 핑거를 갖는 ZFP를 지칭하며; "ZFP RQ" 및 "(…)"는 문헌 [Miller, et al. (2019) Nature Biotechnology 37(8):945-952]에 기재된 바와 같은 변형된 ZFP를 지칭한다.
도 4는 아데닌 염기 편집기에 의해 표적화를 위해 분석되는 편집 창 (서열식별번호: 4) 내에 있는 아데닌 염기를 묘사하는 개략도이다.
도 5a 내지 5f는 예시적인 시티딘 염기 편집기 구축물을 묘사하는 개략도이다. 도 5a 및 5b는 C 뉴클레오티드를 U로 탈아미노화할 수 있는 APOBEC1 (도 5a) 또는 AID (도 5b) 시티딘 효소를 코딩하는 서열에 추가로 연결된, ZFP DNA 결합 도메인에 연결된 2개의 UGI 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 염기 편집기 구축물을 도시한다. 도 5c 및 5d는 도 5a 및 5b의 구축물의 UGI 도메인이 결여된 2개의 시티딘 염기 편집기 구축물을 도시한다. 도 5e 및 5f는 FokI 닉카제를 코딩하는 서열을 활용하는 2개의 구축물을 도시한다. 이들 구축물은 시티딘 염기 편집기를 코딩하는 서열이 ZFP DNA 결합 도메인에 연결된 다음 FokI 촉매적으로 불활성인 뉴클레아제 도메인에 연결되는 한 쌍으로서 사용될 수 있다. 제2 구축물 (도 5f)은 촉매적으로 활성인 FokI 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열에 연결되는 ZFP DNA 결합 도메인에 연결된 2개의 UGI 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 이러한 쌍은 활성 염기 편집기를 만들기 위해 임의의 방식으로 구축될 수 있으며, 여기서 활성 및 불활성 FokI 도메인은 두 파트너 구축물 중 하나에 있을 수 있고, UGI 서열 및 시티딘 염기 편집기 서열은 어느 한 파트너에 있을 수 있다.
도 6a 및 6b는 2개의 예시적인 아데닌 염기 편집기를 도시한다. 도 6a는 ZFP DNA 결합 도메인에 연결된 2개의 TadA 도메인, 즉 1개의 야생형 도메인과 1개의 진화된 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 구축물을 도시한다. 도 6b에 도시된 바와 같이, 일부 변이에서 구축물은 촉매적으로 불활성인 FokI 도메인을 추가로 포함한다.
도 7a 내지 7c는 JAK2 V617F 표적의 염기 편집을 예시한다. 도 7a는 왼쪽에 야생형 DNA 이중 가닥 서열 (서열식별번호: 30)을 도시하며, 코딩된 발린 (V)이 상단에 표시된다. 중간 서열은 돌연변이된 DNA 이중 가닥 서열 (서열식별번호: 31)을 나타내며, 돌연변이체 페닐알라닌 (F)이 상단에 표시된다. 오른쪽에는 2가지 가능한 염기 편집된 결과 (서열식별번호: 32 및 33)가 도시되며, 여기서 편집된 뉴클레오티드는 상단에 세린 (S) 또는 프롤린 (P)에 대한 변화와 함께 볼드체로 표시된다. 도 7b는 JAK2 V617F 돌연변이를 둘러싼 DNA 서열 (서열식별번호: 34)을 도시하며, 2개의 가장 가까운 PAM 부위가 표시된다. 도 7b는 서열식별번호: 79로서의 단백질 서열을 개시한다. 도 7c는 V617F 돌연변이가 없는 K562 세포에서 표시된 염기 편집기를 사용한 예시적인 결과를 도시한다. 염기 편집 창 내의 다른 A:T 쌍은 시험된 염기 편집기의 활성을 평가하기 위해 사용되었다. ABEmax-Cas9NG는 ABEmax에 융합된 Cas9NG 닉카제를 나타낸다. ABEmax-Cas9는 7개의 상이한 ZFP (ZFP 2, ZFP 4, ZFP 6 및 ZFP 7로 제시됨)로 고정되었다. 도 7c는 왼쪽에 3개의 상이한 PAM 부위 (AAT, TAA, AAA; 도 7b 참조)에 대한 결과를 도시한다. 여기에서, ABEmax 발현 구축물 둘 다뿐만 아니라 상응하는 sgRNA가 플라스미드 DNA (각각 600 ng)로서 공급되었다. ZFP 고정된 ABEmax-Cas9NG 구축물은 3개의 PAM 부위 모두에 대해 증가된 효율성을 보여준다 (AAT 및 AAA PAM 부위의 경우 대략 2배이고, TAA PAM 부위의 경우 대략 12배이다). AAT 및 TAA PAM 부위에 대한 염기 편집기는 또한, 더 높은 용량 (800 ng 플라스미드 DNA)에서 시험되었으며 유사한 결과를 보여준다. ZFP 6은 AAT PAM 부위에 대해 대략 2.5배 더 높은 활성을 발생시키고, ZFP 2는 TAA PAM 부위에 대해 대략 17배 더 높은 활성을 발생시킨다.
도 8a 내지 8g는 뉴클레오티드 (예를 들어, 도 1d에 도시된 바와 같은 표적 부위에서 염기 편집기에 대한 단일 가닥 DNA 기질을 제공하기 위해 사용되는 DNA 올리고뉴클레오티드, RNA 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA) 및/또는 가교 핵산 (BNA))를 포함하는 예시적인 염기 편집기를 도시하는 개략도이다. 도 8a는 염기 편집기의 뉴클레오티드 함유 단일 가닥 기질과 접촉하기 이전 (왼쪽) 및 이후 (오른쪽) 편집될 표적화된 염기 ("X")를 묘사한다. 도 8b는 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기에 사용하기 위한 예시적인 PNA (PNA#1)를 도시하며, PNA는 하기 구조를 갖는다: N-Lys-Lys-Lys-NNNNNNNNNN-OOO-NNNNNNNNNN-Lys-Lys-Lys-C. 도 8c는 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기에 사용하기 위한 예시적인 PNA (PNA#2)를 도시하며, PNA는 하기 구조를 갖는다: N-Lys-Lys-Lys-NNNNNNNNNN-OOO-NNNNNNNNNNNNNNN-Lys-Lys-Lys-C. 도 8d는 염기 편집기가 2개의 PNA (서로에 대해 반대 방향으로 구조 N-Lys-Lys-Lys-NNNNNNNNNN-OOO-NNNNNNNNNN-Lys-Lys-Lys-C를 갖는 PNA #3 및 구조 N-Lys-Lys-Lys-NNNNNNNNNN-OOO-NNNNNNNNNN-Lys-Lys-Lys-C를 갖는 PNA #4)를 포함하는 예시적인 실시양태를 도시한다. 도 8e는 PNA가 구조 N-Lys-Lys-Lys-NNNNNNNNNNNNNNN-Lys-Lys-Lys-C (PNA #5)를 포함하는 예시적인 실시양태를 도시한다. 도 8b 내지 8e에서, O는 8-아미노-2,6-디옥사옥탄산 링커를 나타내고, C는 시토신을 나타낸다. PNA 서열의 N- 및/또는 C-말단 상의 Lys 잔기는 임의적이고, 슈도이소시토신이 시토신을 대체할 수 있다. 도 8f 및 8g는 LNA를 포함하는 염기 편집기의 예시적인 실시양태를 도시한다. 도 8f는 예시적인 LNA (LNA#1) (서열식별번호: 80)를 도시한다. 예시적인 LNA#1 서열은
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를 포함한다. 도 8g는 염기 편집기가 서로에 대해 반대 방향으로 도시된 2개의 LNA (LNA#2: 5'-NnNnNnNnNntctctNnNnNnNnNn-3' (서열식별번호: 71) 및 LNA#3: 5'-NnNnNnNnNntctctNnNnNnNnNn-3' (서열식별번호: 72))를 포함하는 예시적인 실시양태를 도시한다. 도 8f 및 8g에서, LNA 뉴클레오티드는 대문자로 표시되고; DNA 뉴클레오티드는 소문자로 표시되고; "*"는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; "Chol-TEG"는 세포로의 증가된 흡수를 위한 3' 콜레스테롤-TEG를 나타낸다.
인공 뉴클레아제, 예컨대 조작된 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), RNA 유도 뉴클레아제로서 지칭되기도 하는 조작된 crRNA/tracr RNA ('단일 가이드 RNA')를 갖는 CRISPR/Cas 시스템, 및/또는 아르고노트 시스템에 기반한 뉴클레아제가 의학, 생명 공학 및 농업 분야에 혁명을 일으키고 있다. 이들 분자 도구를 사용하면 유기체 내의 게놈을 이전에는 불가능했던 수준으로 유전자 조작 (예를 들어 편집)할 수 있다. 인공 뉴클레아제는 DNA를 절단할 수 있으므로, 이러한 절단 후에 세포는 오류가 발생하기 쉬운 비상동 말단 결합 (NHEJ)에 의해, 또는 절단 부위를 플랭킹하는 영역과의 상동성을 갖는 기질 DNA의 존재하에 상동성 지향 복구 (HDR)를 통해 기질 DNA를 삽입함으로써 그 파손물을 강제로 '치유'한다. 이러한 프로세스 둘 다는 DNA에서의 이중 가닥 파손 (DSB)으로 시작된다.
본원에는 유전자 변형을 위해 이중 가닥 절단을 사용하지 않는 염기 편집을위한 조성물 (시스템) 및 방법이 기재되어 있다. 염기 편집은 본질적으로, DNA 가닥에서 특이적 염기의 정체를 변경하는 것, 및 편집된 염기의 복구를 피하기 위해 DNA 복구 기구의 조작과 함께 DNA 염기의 관련 부위 특이적 변형에 의존한다. 이는 일반적으로, 단일 가닥 DNA의 영역이 존재하도록 DNA 이중 나선을 개방하는 시스템을 사용함으로써 달성된다. 다음으로, 염기 자체는 뉴클레오시드 구조를 변화시키는 염기 변형 효소, 예컨대 데아미나제에 의해 작용된다. 예를 들어, 활성화 유도 데아미나제 (AID) 및 아포지질단백질 B mRNA 편집 효소 촉매 폴리펩티드-유사 패밀리 단백질 (APOBEC)은 항체 다양화 및 레트로바이러스에 대항한 선천 면역에 중요한 시티딘 데아미나제이다. 이들 효소는 DNA에서 시티딘 (C)을 우라실 (U)로 전환시킨다. 우라실 복구 전에 DNA 복제가 발생하면, 복제 기구는 우라실을 티민 (T)으로서 처리하여, C:G에서 T:A로의 염기쌍 전환이 발생하므로 (문헌 [Yang, et al. (2016) Nat Commun doi 10.1038/ncomms13330]), 시스템은 C에서 T로의 점 돌연변이를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기 중 임의의 것은 유전자 녹아웃 (예를 들어, 정규 코돈 대신 정지 코돈을 생산하기 위한 염기의 변경; 스플라이스 수용자 부위에서의 염기의 변경); 유전자 발현을 활성화 또는 억제하기 위해 유전자의 제어 (프로모터) 영역에 돌연변이를 도입하는 것; 및/또는 점 돌연변이를 역전시킴으로써 질환 유발 돌연변이를 교정하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 용도를 위한 표적화된 염기 편집에 사용될 수 있다. 염기 편집기 및/또는 염기 편집기에 의해 만들어진 표적화된 변화를 포함하는 (그러나 더 이상 염기 편집기 자체를 포함하지 않음) 세포 및 세포주가 또한 제공된다.
본 발명의 염기 편집기는 현재 사용되고 있는 염기 편집기와 비교 시 예기치 못하게도 우수한 편집 효율성 및/또는 특이성을 제공한다.
총론
본원에 개시된 조성물의 제조 및 사용뿐만 아니라 방법의 실행은 달리 지시되지 않는 한, 분자 생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 분야의 기술 내에 있는 바와 같은 관련 분야에서의 통상적인 기술을 이용한다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 및 Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 및 periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999] 참조).
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호 교환가능하게 사용되며 선형 또는 원형 입체 형태 및 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 이들 용어는 중합체의 길이에 대해 제한하는 것으로서 해석되서는 안된다. 상기 용어는 자연 뉴클레오티드의 공지된 유사체뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 인산염 모이어티 (예를 들어, 포스포로티오에이트 백본)에서 변형되는 뉴클레오티드를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특별한 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기쌍 형성 특이성을 갖는데, 즉 A의 유사체는 T와 염기쌍을 이룰 것이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환가능하게 사용된다. 이러한 용어는 또한, 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에 적용된다.
"결합"은 거대 분자 간의 (예를 들어, 단백질과 핵산 간의)의 서열 특이적, 비-공유 상호작용을 지칭한다. 전체로서의 상호작용이 서열 특이적인 한은, 결합 상호작용의 모든 성분이 서열 특이적 (예를 들어, DNA 백본 내의 인산염 잔기와의 접촉)일 필요는 없다. 이러한 상호작용은 일반적으로 10-6 M-1 이하의 해리 상수 (Kd)를 특징으로 한다. "친화도"는 결합 강도를 지칭한다: 증가된 결합 친화도는 더 낮은 Kd와 상관이 있다. "비-특이적 결합"은 온 타겟 서열에 의존적이지 않은 임의의 관심 분자 (예를 들어 조작된 뉴클레아제)와 거대 분자 (예를 들어 DNA) 간에 발생하는 비-공유 상호작용을 지칭한다.
"결합 단백질"은 또 다른 분자와 비공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어, DNA 분자 (DNA 결합 단백질), RNA 분자 (RNA 결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질 결합 단백질)와 결합할 수 있다. 단백질 결합 단백질의 경우, 자체 결합할 수 있고/있거나 (동종 이량체, 동종 삼량체 등을 형성하기 위함) 상이한 단백질(들)의 하나 이상의 분자와 결합할 수 있다. 결합 단백질은 한 가지 초과 유형의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 징크 핑거 단백질은 DNA 결합, RNA 결합 및 단백질 결합 활성을 가지고 있다. RNA 유도 뉴클레아제 시스템의 경우, RNA 가이드는 뉴클레아제 성분 (Cas9 또는 Cfp1)에 대해 이종이며 둘 다 조작될 수 있다.
"DNA 결합 분자"는 DNA와 결합할 수 있는 분자이다. 이러한 DNA 결합 분자는 폴리펩티드, 단백질의 도메인, 더 큰 단백질 내의 도메인 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA인 반면, 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 일부 실시양태에서, DNA 결합 분자는 뉴클레아제의 단백질 도메인 (예를 들어, FokI 도메인)인 반면, 다른 실시양태에서 DNA 결합 분자는 RNA 유도 뉴클레아제 (예를 들어 Cas9 또는 Cpf1)의 가이드 RNA 성분이다. DNA 결합 분자는, 예를 들어 하나 이상의 징크 핑거를 통해 또는 징크 핑거 단백질 (ZFP)의 하나 이상의 ZFP 인식 나선 영역 또는 TALE의 RVD와의 상호작용을 통해 서열 특이적 방식으로 DNA와 결합하는 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인을 포함할 수 있다. DNA 결합 분자는 또한, CRISPR/Cas 시스템의 단일 가이드 RNA (sgRNA) 및/또는 Ttago 시스템의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 용어 징크 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로서 약칭된다.
"징크 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 징크 이온의 배위를 통해 그의 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역인 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA와 결합하는 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 징크 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로서 약칭된다.
"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩티드이다. 반복 도메인은 TALE와 그의 동족 표적 DNA 서열의 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위" ("반복부"로서 지칭되기도 함)는 전형적으로 그 길이가 33개 내지 35개 아미노산이며, 자연적으로 발생하는 TALE 단백질 내에서 다른 TALE 반복 서열과의 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다 (예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 8,586,526 참조).
DNA 결합 도메인은, 예를 들어 자연적으로 발생하는 징크 핑거 단백질의 인식 나선 영역의 조작 (하나 이상의 아미노산의 변경)을 통해 또는 DNA 결합에 관여한 아미노산 ("반복 가변 2잔기" 또는 RVD 영역)의 조작에 의해, 미리 결정된 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 "조작"될 수 있다. 따라서, 조작된 징크 핑거 단백질 또는 TALE 단백질은 비-자연적으로 발생하는 단백질이다. 징크 핑거 단백질 및 TALE를 조작하는 방법의 비-제한적인 예는 설계 및 선택이다. 설계된 단백질은 그의 설계/조성이 주로 합리적 기준으로부터 비롯되는, 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계에 대한 합리적 기준은 기존 ZFP 또는 TALE 설계의 정보와 결합 데이터를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 대체 규칙 및 컴퓨터 알고리즘의 적용을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,586,526; 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261 참조; 또한 국제 특허 공개 번호 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536; 및 WO 03/016496 참조).
"선택된" 징크 핑거 단백질, TALE 단백질 또는 CRISPR/Cas 시스템은 그의 생산이 주로 실증적 프로세스, 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩, 합리적 설계 또는 하이브리드 선택으로부터 비롯되는, 자연에서는 발견되지 않는 것이다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 및 6,200,759; 및 국제 특허 공개 번호 WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; 및 WO 02/099084 참조).
"TtAgo"는 유전자 침묵에 관여하는 것으로 생각되는 원핵 아르고노트 단백질이다. TtAgo는 박테리아 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus)로부터 유래된다 (예를 들어, 문헌 [Swarts, et al. (2014) Nature 507(7491):258-261; Swarts, et al. (2012) PLoS One 7(4):e35888; G. Sheng, et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652] 참조). "TtAgo 시스템"은, 예를 들어 TtAgo 효소에 의한 절단을 위한 가이드 DNA를 포함한 필요한 모든 성분이다.
"절단"은 DNA 분자의 공유 백본의 파손을 지칭한다. 절단은 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일 가닥 절단과 이중 가닥 절단 둘 다가 가능하며, 이중 가닥 절단은 2개의 별개의 단일 가닥 절단 이벤트의 결과로서 발생할 수 있다. DNA 절단은 평활 말단 또는 엇갈린 말단의 생산을 발생시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 표적화된 이중 가닥 DNA 절단에 사용된다.
"절단 절반-도메인"은 제2 폴리펩티드 (동일하거나 상이함)와 연계해서, 절단 활성 (바람직하게 이중 가닥 절단 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열이다. 용어 "제1 및 제2 절단 절반-도메인"; "+ 및 - 절단 절반-도메인" 및 "오른쪽 및 왼쪽 절단 절반-도메인"은 이량체화되는 절단 절반-도메인 쌍을 지칭하기 위해 상호 교환가능하게 사용된다. 용어 "절단 도메인"은 용어 "절단 절반-도메인"과 상호 교환가능하게 사용된다. 용어 "FokI 절단 도메인"은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 FokI 서열뿐만 아니라 임의의 FokI 동족체를 포함한다.
"조작된 절단 절반-도메인"은 또 다른 절단 절반-도메인 (예를 들어, 또 다른 조작된 절단 절반-도메인)과 함께 절대적인 이종 이량체를 형성하도록 변형된 절단 절반-도메인이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "편집"은 동일한 위치에서 초기 (예를 들어, 야생형) 염기와 비교 시 뉴클레오티드 염기가 변형되는 프로세스를 지칭한다. 염기 편집 (예를 들어, 표적화된 점 돌연변이)은 편집된 DNA로부터 전사되는 임의의 mRNA에서의 변화를 반드시 재현할 것이다. 아데닌 및 시티딘 데아미나제는 각각의 뉴클레오티드 표적으로부터 아미노 기를 제거하여, 각각 이노신 및 우리딘으로 전환시킨다. DNA 복구 또는 복제 동안, 이노신은 폴리머라제 효소에 의해 구아닌으로서 인식되고 우리딘은 티민으로서 인식되어, 편집된 이중 가닥 DNA에서 A:T 염기쌍이 G:C 염기쌍으로 전환되거나 또는 C:G 염기쌍이 T:A 염기쌍으로 전환된다. "염기 편집 창"은 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기에 의해 편집되어야 하는 임의의 염기를 지칭하며, 전형적으로 표적 DNA에 대한 염기 편집 시스템의 적어도 하나의 성분의 결합 후 접근가능한 영역 내에 있는, 편집 시스템의 임의의 성분으로부터 임의의 거리일 수 있다. PAM 서열을 필요로 하는 염기 편집기 (예를 들어, Cas9 함유 편집기)는 전형적으로 PAM 서열로부터 13개 내지 16개 이상의 뉴클레오티드일 수 있는 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 염기 편집 창을 갖는다. 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기는 유전자 녹아웃 (예를 들어, 정규 코돈 대신 정지 코돈을 생산하기 위한 염기의 변경; 스플라이스 수용자 부위에서의 염기의 변경); 유전자 발현을 활성화 또는 억제하기 위해 유전자의 제어 (프로모터) 영역에 돌연변이를 도입하는 것; 및/또는 점 돌연변이를 역전시킴으로써 질환 유발 돌연변이를 교정하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 용도를 위한 표적화된 염기 편집에 사용될 수 있다. 염기 편집기 및/또는 염기 편집기에 의해 만들어진 표적화된 변화를 포함하는 (그러나 더 이상 염기 편집기 자체를 포함하지 않음) 세포주가 또한 제공된다.
용어 "서열"은 DNA 또는 RNA일 수 있고; 선형, 원형 또는 분지형일 수 있으며 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 임의의 길이의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "트랜스진(transgene)"은 게놈에 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 트랜스진은 임의의 길이, 예를 들어 2개 내지 100,000,000개 뉴클레오티드 길이 (또는 그 사이 또는 그 이상의 임의의 정수 값), 바람직하게 약 100개 내지 100,000개 뉴클레오티드 길이 (또는 그 사이의 임의의 정수), 보다 바람직하게 약 2000개 내지 20,000개 뉴클레오티드 길이 (또는 그 사이의 임의의 값), 보다 더 바람직하게 약 5 내지 15 kb (또는 그 사이의 임의의 값)일 수 있다.
"염색체"는 세포의 게놈의 전부 또는 일부분을 포함하는 염색질 복합체이다. 세포의 게놈은 종종, 세포의 게놈을 포함하는 모든 염색체의 모음인 그의 핵형으로서 특징지을 수 있다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피솜"은 복제 핵산, 핵단백질 복합체 또는 세포의 염색체 핵형의 일부가 아닌 핵산을 포함하는 다른 구조이다. 에피솜의 예는 플라스미드, 미니서클 및 특정 바이러스 게놈을 포함한다. 본원에 기재된 간 특이적 구축물은 에피솜으로 유지될 수 있거나, 또는 또 다른 한편으론, 세포에 안정적으로 통합될 수 있다.
"외인성" 분자는 정상적으로는 세포에 존재하지 않지만 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 다른 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포에서의 정상적인 존재"는 세포의 특별한 발달 단계 및 환경 조건과 관련하여 결정된다. 따라서, 예를 들어, 근육의 배아 발달 동안에만 존재하는 분자는 성체 근육 세포에 대한 외인성 분자이다. 유사하게, 열 충격에 의해 유도된 분자는 열 충격을 받지 않은 세포에 대한 외인성 분자이다. 외인성 분자는, 예를 들어, 기능 장애 내인성 분자의 기능 버전 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 기능 장애 버전을 포함할 수 있다.
외인성 분자는 무엇보다도, 작은 분자, 예컨대 조합 화학 프로세스에 의해 생성되는 것, 또는 거대 분자, 예컨대 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 폴리사카라이드, 상기 분자의 임의의 변형된 유도체, 또는 상기 분자 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있고; 선형, 분지형 또는 원형일 수 있으며; 임의의 길이의 것일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함한다. 핵산은 이중 나선을 형성할 수 있는 것뿐만 아니라 삼중체 형성 핵산을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,176,996 및 5,422,251 참조). 단백질은 DNA 결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화된 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 라이가제, 데유비퀴티나제, 인테그라제, 리콤비나제, 라이가제, 토포이소머라제, 자이라제 및 헬리카제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들어 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염 바이러스 게놈, 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 에피솜, 또는 세포에 정상적으로 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 세포 내로 외인성 분자를 도입하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 지질 매개 전달 (즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함한 리포좀), 전기천공, 직접 주사, 세포 융합, 입자 충격, 인산칼슘 공동 침전, DEAE-덱스트란 매개 전달 및 바이러스 벡터 매개 전달을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 외인성 분자는 또한 내인성 분자와 동일한 유형의 분자일 수 있지만, 세포가 유래되는 것과는 상이한 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 인간 핵산 서열은 원래 마우스 또는 햄스터로부터 유래된 세포주 내로 도입될 수 있다. 외인성 분자를 식물 세포 내로 도입하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 원형질체 형질전환, 탄화 규소 (예를 들어, WHISKERS™), 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 형질전환, 지질 매개 전달 (즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함한 리포좀), 전기천공, 직접 주사, 세포 융합, 입자 충격 (예를 들어, "유전자 총"을 사용함), 인산칼슘 공동 침전, DEAE-덱스트란 매개 전달 및 바이러스 벡터 매개 전달을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
대조적으로, "내인성" 분자는 특별한 환경 조건 하의 특별한 발달 단계에서 특별한 세포에 정상적으로 존재하는 분자이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아의 게놈, 엽록체 또는 다른 소기관, 또는 자연적으로 발생하는 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 부가의 내인성 분자는 단백질, 예를 들어, 전사 인자 및 효소를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "외인성 핵산의 산물"은 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 산물, 예를 들어 전사 산물 (폴리뉴클레오티드, 예컨대 RNA) 및 번역 산물 (폴리펩티드)을 모두 포함한다.
"융합" 분자는 2개 이상의 서브유닛 분자가 바람직하게 공유적으로 연결되는 분자이다. 서브유닛 분자는 동일한 화학적 유형의 분자일 수 있거나 또는 상이한 화학적 유형의 분자일 수 있다. 융합 분자의 예는 융합 단백질 (예를 들어, 단백질 DNA 결합 도메인과 절단 도메인 간의 융합물), 절단 도메인과 작동적으로 연합된 폴리뉴클레오티드 DNA 결합 도메인 (예를 들어, sgRNA) 간의 융합물, 및 융합 핵산 (예를 들어, 융합 단백질을 코딩하는 핵산)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
세포에서의 융합 단백질의 발현은 융합 단백질을 세포로 전달하거나 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 전달함으로써 발생할 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오티드가 전사되고 전사체가 번역되어 융합 단백질을 생성한다. 트랜스-스플라이싱, 폴리펩티드 절단 및 폴리펩티드 라이게이션은 또한 세포에서 단백질의 발현에 관여할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 세포로 전달하는 방법은 본 개시내용의 다른 곳에서 제시된다.
"분할 효소"는 2개 이상의 불활성 폴리펩티드 쇄로 분할된 후 작동가능한 효소로 재어셈블리된 효소이다. 분할 효소를 활성 단백질로 어셈블리하는 것은 종종 근접성에 의해 구동되며, 여기서 각각의 불활성 폴리펩티드 쇄는, 불활성 쇄를 물리적으로 결합할 수 있는 다른 분자에 융합되어 이들을 어셈블리할 수 있으므로, 단편화의 엔트로피 비용을 극복할 수 있다. 융합된 분자는 서로 상호작용하는 다른 단백질일 수 있거나, 또는 서로 상호작용하거나 또는 공통 리간드와 상호작용하는 임의의 유형의 분자일 수 있으므로, 그러한 상호작용이 분할 효소를 구성하는 폴리펩티드의 어셈블리를 야기한다 (예를 들어, 문헌 [Shekhawat and Ghosh (2011) Curr Opin Chem Biol 15(6):789-797] 참조).
본 개시내용의 목적을 위한 "유전자"는 유전자 산물을 코딩하는 DNA 영역 (하기 참조) 뿐만 아니라 이러한 조절 서열이 코딩 및/또는 전사된 서열에 인접하는지의 여부에 관계없이 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결인자, 번역 조절 서열, 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서, 침묵인자, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 기원, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역을 포함하나, 반드시 이에 제한되지는 않는다.
"유전자 발현"은 특정 유전자에 함유된 정보를 유전자 산물로 전환하는 것을 지칭한다. 유전자 산물은 유전자의 직접 전사 산물 (예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조적 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생산된 단백질일 수 있다. 유전자 산물은 또한, 프로세스, 예컨대 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집에 의해 변형되는 RNA, 및 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조정"은 유전자의 활성에 있어서의 변화를 지칭한다. 발현의 조정은 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 게놈 편집 (예를 들어, 절단, 변경, 불활성화, 무작위 돌연변이)을 사용하여 발현을 조정할 수 있다. 유전자 불활성화는 본원에 기재된 바와 같은 ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템을 포함하지 않는 세포와 비교 시 유전자 발현에 있어서의 임의의 감소를 지칭한다. 따라서, 유전자 불활성화는 부분적이거나 완전할 수 있다.
"관심 영역"은 세포 염색질의 임의의 영역, 예컨대 예를 들어, 외인성 분자와 결합하는 것이 바람직한 유전자 또는 유전자 내부 또는 유전자에 인접한 비-코딩 서열이다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화된 재조합의 목적을 위한 것일 수 있다. 관심 영역은, 예를 들어, 염색체, 에피솜, 소기관 게놈 (예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체) 또는 감염 바이러스 게놈에 존재할 수 있다. 관심 영역은 유전자의 코딩 영역 내에, 전사된 비-코딩 영역 내에, 예컨대 예를 들어, 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론, 또는 코딩 영역의 상류 또는 하류에 있는 비-전사된 영역 내에 있을 수 있다. 관심 영역은 단일 뉴클레오티드 쌍 또는 2,000개 이하의 뉴클레오티드 쌍 길이, 또는 임의의 정수 값의 뉴클레오티드 쌍만큼 작을 수 있다.
"진핵" 세포는 진균 세포 (예컨대 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유 동물 세포, 및 줄기 세포 (다능성 및 다분화능)를 포함한 인간 세포 (예를 들어, T-세포)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "작동적 연결" 및 "작동적으로 연결된" (또는 "작동가능하게 연결된")은 둘 이상의 성분 (예컨대 서열 요소)의 병치와 관련하여 상호 교환가능하게 사용되며, 여기서 상기 성분은 두 성분이 정상적으로 기능하도록 배열되고, 이들 성분 중 적어도 하나가 다른 성분 중 적어도 하나에 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용한다. 예로서, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 코딩 서열의 전사 수준을 제어하는 경우, 이러한 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터가 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 전사 조절 서열은 일반적으로, 코딩 서열과 시스로 작동적으로 연결되지만, 바로 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 인접하지 않더라도 코딩 서열에 작동적으로 연결되는 전사 조절 서열이다.
단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 그의 서열이 완전한 길이의 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일하지 않지만 완전한 길이의 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산이다. 기능적 단편은 상응하는 천연 분자보다 더 많이, 더 적게 또는 동일한 수의 잔기를 보유할 수 있고/있거나 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환을 함유할 수 있다. 핵산 또는 단백질의 기능을 결정하는 방법 (예를 들어, 코딩 기능, 또 다른 핵산과 혼성화할 수 있는 능력, 효소 활성 검정)은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
폴리뉴클레오티드 "벡터" 또는 "구축물"은 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 구축물", "발현 벡터", "발현 구축물", "발현 카세트" 및 "유전자 전달 벡터"는 관심 유전자의 발현을 지시할 수 있고 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 구축물을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝 및 발현 비히클뿐만 아니라 통합 벡터를 포함한다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 상호 교환가능하게 사용되며 포유 동물, 예컨대 인간 환자 및 비-인간 영장류뿐만 아니라 실험 동물, 예컨대 토끼, 개, 고양이, 래트, 마우스 및 다른 동물을 지칭한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체" 또는 "환자"는 본 발명의 발현 카세트가 투여될 수 있는 임의의 포유 동물 환자 또는 대상체를 의미한다. 본 발명의 대상체는 장애가 있는 대상체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는 것" 및 "치료"는 증상의 중증도 및/또는 빈도에 있어서의 감소, 증상 및/또는 근본 원인의 제거, 증상 및/또는 그의 근본 원인의 발생 예방, 및 손상의 개선 또는 교정을 지칭한다. 암, 일원성 질환 및 이식편 대 숙주 질환은 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 병태의 비-제한적인 예이다.
"염색질"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조이다. 세포 염색질은 핵산, 주로 DNA, 및 히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질을 포함한 단백질을 포함한다. 대부분의 진핵 세포 염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하며, 여기서 뉴클레오솜 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4 중 각각 2개를 포함하는 옥타머와 연합된 대략 150개 염기쌍의 DNA를 포함하고; 링커 DNA (유기체에 따라 가변적 길이)는 뉴클레오솜 코어 사이에서 연장된다. 히스톤 H1 분자는 일반적으로, 링커 DNA와 연합된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "염색질"은 원핵과 진핵 둘 다의 모든 유형의 세포 핵단백질을 포괄하는 것을 의미한다. 세포 염색질은 염색체 및 에피솜 염색질 둘 다를 포함한다.
"접근가능한 영역"은 핵산에 존재하는 표적 부위가 표적 부위를 인식하는 외인성 분자에 의해 결합될 수 있는 세포 염색질 내의 부위이다. 임의의 특별한 이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 접근가능한 영역은 뉴클레오솜 구조로 패키징되지 않은 영역인 것으로 여겨진다. 접근가능한 영역의 뚜렷한 구조는 화학적 및 효소적 프로브, 예를 들어, 뉴클레아제에 대한 그의 감도에 의해 종종 검출될 수 있다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위한 충분한 조건이 존재하는 경우 결합 분자가 결합할 핵산의 일부분을 규정하는 핵산 서열이다. 예를 들어, 서열 5'-GAATTC-3'은 Eco RI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위이다. "의도된" 또는 "온 타겟" 서열은 결합 분자가 결합하고자 하는 서열이고, "의도하지 않은" 또는 "오프 타겟" 서열은 의도된 표적이 아닌 결합 분자에 의해 결합된 임의의 서열을 포함한다.
용어 "DNA 탈안정화 분자" 및 "DNA 풀림 분자"는 염기 편집기에 의해 표적화된 염기의 접근성 (예를 들어, 노출에 의해)을 증가시키는 것을 도와주는 임의의 분자 (예를 들어, 단백질, 뉴클레오티드, 작은 분자 등)를 지칭하기 위해 상호 교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 닉카제, 올리고뉴클레오티드 (LNA, PNA, BNA 등), RNA 프로그램가능한 시스템 (예를 들어, sgRNA에 작동가능하게 연결된 Cas 단백질), 및 다른 단백질 (예를 들어, 표 A)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
염기 편집기
본원에 기재된 염기 편집 조성물 (시스템)은 이중 가닥 파손을 유도하지 않고 개별 DNA 염기쌍의 정체를 직접 변화시킬 수 있다. 따라서, 염기 편집기는 표적 세포에 대한 DNA 복구 경로 선호도에 의존하지 않는다. 더욱이, 표적 DNA에는 이중 가닥 파손이 없기 때문에, 유리 DNA 말단이 없으므로, 전위가 없다.
본원에 기재된 염기 편집기는 C:G 쌍을 T:A 쌍으로 변화시키는 시토신 염기 편집기 (CBE), 또는 A:T 쌍을 G:C 쌍으로 변화시키는 아데닌 염기 편집기 (ABE)일 수 있다. 이들 염기 편집기는, 예를 들어 정규 코돈을 정지 코돈으로 전환 (예를 들어, 시토신 염기 편집기를 사용함)시키고/시키거나 시토신 또는 아데닌 염기 편집기를 사용하여 스플라이스 수용자 부위를 돌연변이시킴으로써 불활성화 (유전자 녹아웃)에 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기는 유전자의 발현을 활성화 또는 억제하기 위해 유전자의 제어 (예를 들어, 프로모터 영역)를 변경하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 염기 편집은 돌연변이, 특히 질환 유발 돌연변이를 교정하는 데 사용될 수 있다.
제1 APOBEC-dCas9 염기 편집기의 개발에 이어, 우라실 DNA 글리코실라제 (UGI)가 부가된, BE2라고 하는 제2 염기 편집기가 개발되었다. 염기 절제 복구는 G:U 미스매치에 대한 세포의 1차 반응이며 우라실 N-글리코실라제 (UNG)에 의한 우라실의 절제에 의해 시작된다. 편집된 G:U 중간체를 UNG에 의한 절제로부터 보호하기 위한 일환으로, 83-아미노산 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI)를, 촉매적으로 데드 Cas9 (dCas9)의 C 말단에 직접 부가하여 효율성을 증가시켰다 (Komor, et al. (2017) Science Advances 3(8):eaao4774). 염기 편집기의 초기 버전에서는, 전형적으로 데드 Cas9를 사용하여, 편집된 염기 반대편에 있는 뉴클레오티드 염기의 최종 전환을 수행하기 위해 DNA 복제 기구를 사용하도록 하였다. 또한, Cas 닉카제는 편집된 염기를 포함하는 가닥의 반대편 가닥에 닉을 생성하는 데 사용되었다. 닉의 생성은 DNA 복구 기구를 끌어들여, 닉의 하류 영역이 절제되고 편집된 가닥을 주형으로서 사용하여 대체되도록 한다. 시티딘 염기 편집기 BE3는 닉카제인 Cas, Cas9 D10A를 사용하여 효율성을 또한 증가시켰다 (Kim, et al. (2017) Nat Biotechnol 35(4):371-376). 또한 또 다른 변이체에서, BE4 시스템은 훨씬 더 높은 효율성을 위해 복합체의 N- 및 C-말단 단부 둘 다에서 2개의 UGI 도메인을 사용한다. 또 다른 시티딘 데아미나제 시스템은 닉카제 Cas9와 조합하여 활성화 유도 시티딘 데아미나제 (AID)에 의존한다 ("표적-AID").
염기 편집기가 DNA와 상호작용할 때, Cas 기반 편집기는 상호작용할 PAM 서열을 필요로 하며, 활성을 위한 창 (염기 편집 창)은 전형적으로 PAM 서열의 5'말단으로부터 13 내지 16개 염기이다 (또한 도 2 참조). 상기 기재된 상이한 편집 시스템의 활성 창은 다양하다. 표적-AID 시스템은 PAM 서열로부터 더 멀리 떨어진염기를 편집하는 반면, BE4 시스템은 PAM에 더 가까운 염기를 편집한다. 염기 편집기는 또한, Cpf1 CRISPR 시스템을 기반으로 구축되었다 (상기 문헌 [Eid, et al.]). 또한, 염기 편집기의 BE4 입체 배치는 에스. 피오게네스(S. pyogenes) 및 에스. 아우레우스(S. aureus) 유래 CRISPR 시스템 둘 다를 사용하여 개발되었다 (각각 BE4 및 SaBE4). 따라서, Cas9 염기 편집 시스템은 표적 부위로부터 적절한 간격을 두고 있는 PAM 서열의 가용성에 의해 제한 (거리가 염기 편집기의 효율성 및/또는 특이성에 상당한 영향을 미칠 수 있기 때문이다)되고/되거나 염기 편집 창으로부터의 PAM 서열의 거리 (도 2에 도시된 바와 같이, 표적 염기 (예를 들어, A)와 NGG PAM의 5' 단부 사이의 13 내지 16개 염기)에 의해 제한된다.
따라서, 본 발명 이전에, Cas9 염기 편집기는 게놈 전반에서의 오프 타겟 효과뿐만 아니라 방관자 효과 (표적화된 염기 근처에서 의도하지 않은 편집)를 유도하는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Zuo, et al. (2019) Science 364(6437):289-292; Jin, et al. (2019) Science 364(6437):292-295; Gruenewald, et al. (2019) Nature 569(7756):433-437] 참조).
부가의 염기 편집기 입체 배치는 박테리오파지 뮤로부터의 GAM 단백질의 사용을 포함하였다. 일부 경우에, 일부 유형의 염기 편집의 결과로서 인델 (삽입 및 결실)이 관찰되었다. 일부 염기 편집기는 U 반대편 가닥을 닉킹하기 때문에, UNG에 의한 글리코시드 결합의 절단에 이어, 그 결과로 생성된 아퓨린 또는 아피리미딘 부위의 AP 리아제에 의한 프로세싱이 이중 가닥 DNA 파손 (DSB)을 발생시켜, 잠재적으로 인델 형성을 발생시킬 수 있다. 박테리오파지 뮤의 Gam 단백질은 DSB의 말단과 결합하고 분해로부터 보호하므로, DSB의 유리 말단과 결합하는 Gam을 사용하면, 염기 편집의 프로세스 동안 인델 형성을 감소시킬 수 있다 (Komor, et al. (2016) Nature 533:420-424; Komor, et al. (2017) Science Advances 3(8)). 시티딘 데아미나제 편집기 이외에, 아데닌 염기를 이노신으로 전환시키는 합성 아데노신 데아미나제를 사용하는 염기 편집기가 개발되었다 (아데닌 염기 편집기: "ABE"; 문헌 [Gaudelli, et al. (2017) Nature 551(7681):464-471] 참조). 이노신은 시티딘과 염기쌍을 형성하고, 이후 구아닌으로 교정되어 A가 G로 전환되거나, 또는 A:T가 G:C로 전환될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기는 DNA의 단일 가닥 영역 내에 있는 표적화된 염기를 노출시키기 위해 DNA 나선을 "개방"하는 분자를 추가로 포함할 수 있다. 이를 달성할 수 있는 것으로 통상적으로 공지된 분자는 DNA 헬리카제, 나선 탈안정화 분자 및 박테리아 DnaA 단백질, 단일 가닥 DNA 결합 단백질, 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 염기 편집기는 편집을 위해 표적화된 염기를 노출하기 위해 DNA 나선의 풀림 (개방)을 도와주는 단백질 도메인을 포함한다. 적합한 단백질의 비-제한적인 예가 표 A에 제시된다.
<표 A>
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특정 실시양태에서, 염기 편집기 (예를 들어, Cas 무함유 염기 편집기)는 하나 이상의 DNA 올리고뉴클레오티드, 하나 이상의 RNA 올리고뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 펩티드 핵산 (PNA), 하나 이상의 잠금 핵산 (LNA) 및/또는 하나 이상의 가교 핵산 (BNA)을 포함한 하나 이상의 합성 올리고뉴클레오티드를 포함한다 (예를 들어, 도 1d 참조). 예를 들어, PNA에 관해서는 문헌 [Nielsen, et al. (1991) Science 254:1497-1500 및 Bahal, et al. (2014) Curr Gene Ther. 14(5):331-342]을 참조하고; LNA에 관해서는 문헌 [Moreno, et al. (2013) Nucleic Acid Res. 41(5):3257-3273 및 Geny, et al. (2016) Nucleic Acid Res. 44(5):2007-2019]을 참조하며; BNA에 관해서는 문헌 [Rahman, et al. (2007) Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 26(10-12):1625-1628]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 Cas9 무함유 염기 편집기는 ZFP-데아미나제 융합 단백질 및 ZFN 닉카제, 및 임의로 하나 이상의 DNA 탈안정화 인자를 포함한다. 특정 실시양태에서, DNA 탈안정화 인자는 단백질 (예를 들어, 표 A에 제시된 바와 같음) 또는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, LNA, PNA 또는 BNA)이다. 다른 실시양태에서, Cas9 무함유 염기 편집기는 임의의 Cas9 등가물, 예컨대 Cas12a (완전한 길이의 또는 말단절단된 Cas12 단백질 포함)를 포함한, DNA 탈안정화 (풀림) 특성을 가진 비-Cas9 CRISPR 단백질을 포함한다. 다른 실시양태에서, Cas9 무함유 염기 편집기는 CRISPR 시스템으로부터의 임의의 요소를 포함하지 않는다. 하나 이상의 비-Cas9 DNA 탈안정화 (풀림) 인자(들) (예를 들어, 표 A의 단백질, LNA, PNA, BNA 등)는 염기 편집기의 임의의 성분, 예를 들어 ZFP-데아미나제 융합 단백질의 한 성분 및/또는 ZFN 닉카제의 성분 중 임의의 것에 작동가능하게 연결될 수 있다.
특정 실시양태에서, 염기 편집기는 표적 부위에서 염기 편집기에 대한 단일 가닥 DNA 기질을 제공하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 하나 이상의 DNA 올리고뉴클레오티드, RNA 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA) 및/또는 가교 핵산 (BNA)을 포함한다. 이는, 예를 들어 이중 나선 침입, 삼중체 침입 또는 테일 클램프에 의해 용이하게 할 수 있다 (Quijano, et al. (2017) Yale J. Biol and Med. 90:583-598; Pellestor and Paulasova (2004) European J. Human Genetics 12:694-700; Schleifman, et al. (2011) Chem & Bio. 18:1189-1198). 염기 편집기의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 구조는 DNA 및/또는 RNA 및/또는 PNA 및/또는 LNA 및/또는 BNA 염기의 길이, 수 및 위치; 포스포로티오에이트 결합; 표적 서열 조성에 따른 이들 올리고뉴클레오티드의 다른 통상적인 변형에 있어서 다양할 것이다.
특정 실시양태에서, 염기 편집기는 하나 이상의 PNA, 예를 들어, 미니PEG 치환과 증강된 결합, 증가된 용해도 및 개선된 전달을 위한 감마 위치를 함유하는 감마 PNA를 포함한다 (Bahal, et al. (2014) Current Gene Ther. 14(5):331-342). 특정 실시양태에서, PNA는 하나 이상의 O (이는 8-아미노-2,6-디옥사옥탄산 링커를 나타낸다) 및/또는 하나 이상의 시토신 (C) 또는 슈도이소시토신 잔기를 포함한다. 임의로, 하나 이상의 리신 (Lys) 잔기가 PNA 내에, 예를 들어 PNA 서열의 N- 및/또는 C-말단 상에 포함된다. 특정 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 Lys 잔기가 PNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에 포함된다. 특정 실시양태에서, 둘 이상의 PNA가 염기 편집기에 사용되며, 예를 들어 서로에 대해 동일하거나 반대 방향으로 사용된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 PNA는 하기 구조를 갖는다:
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(여기서, O는 8-아미노-2,6-디옥사옥탄산 링커를 나타내고, C는 시토신을 나타낸다). PNA 서열의 N- 및/또는 C-말단 상의 Lys 잔기는 임의적이고, 슈도이소시토신이 시토신을 대체할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 PNA는 도 8b 내지 8e에 도시된 바와 같은 하나 이상의 PNA를 포함한다.
다른 실시양태에서 염기 편집기는 하나 이상의 LNA를 포함한다. LNA는 성능 개선을 위해 스태킹 링커 및 2'-글리실아미노-LNA를 포함할 수 있다 (Geny, et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(5):2007-2019). 특정 실시양태에서, LNA는 임의로 하나 이상의 LNA 잔기 및/또는 DNA 잔기 사이에 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 다른 실시양태에서, LNA는 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 콜레스테롤-TEG를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 LNA는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00018
(여기서, LNA 뉴클레오티드는 대문자로 표시되고; DNA 뉴클레오티드는 소문자로 표시되고; "*"는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; "Chol-TEG"는 세포로의 증가된 흡수를 위한 3' 콜레스테롤-TEG를 나타낸다) (예를 들어, 문헌 [Bijsterbosch, et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:2717-2725; Bijsterbosch, et al. (2002) J. Pharmacol. Exp. Ther. 302:619-626; Manoharan (2002) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 12:103-28; M. Manoharan (2004) Curr Opin Chem Biol. 8:570-9] 참조). 특정 실시양태에서, 염기 편집기는 도 8f 또는 도 8g에 도시된 바와 같은 하나 이상의 LNA를 포함한다.
하나 이상의 DNA 탈안정화 인자는 염기 편집기 (예를 들어, ABE 및/또는 CBE) 및/또는 닉카제와 독립적으로 및/또는 함께 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 탈안정화 인자(들)는 임의의 방향 (예를 들어, N- 및/또는 C-말단)으로 ZFP 및/또는 ZFN 닉카제에 융합된다. DNA 탈안정화 인자(들)는 염기 편집기 표적 부위의 1 kb 창 내에서 결합할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에는 염기 편집기 (예를 들어, Cas9 아데닌 또는 시토신 염기 편집기) 및 염기 편집기 근처의 표적 부위 (RANGE)와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 부가의 DNA 결합 도메인 (예를 들어, ZFP, TALE, 부가의 sgRNA)을 포함하는 염기 편집 시스템이 기재된다. 특정 실시양태에서, Cas9 함유 염기 편집 시스템은 Cas9 닉카제 및 다른 성분과 관련하여 Cas9 닉카제를 고정하고/하거나 염기 편집기의 하나 이상의 성분을 위치시키는 역할을 함으로써, 염기 편집의 특이성 및/또는 효율성을 증가시키는 하나 이상의 DNA 결합 분자 (예를 들어, ZFP)를 포함한다. 하나 이상의 DNA 결합 분자 (예를 들어, ZFP 앵커(들))는 전형적으로, 염기 편집기 (예를 들어, Cas9 또는 Cas9 무함유 염기 편집기) 및/또는 표적화된 염기의 1 내지 50개 (또는 그 사이의 임의의 값) 뉴클레오티드 내의 표적 부위와 결합한다. DNA 결합 분자는 염기 편집기 및/또는 표적화된 염기에 대한 5' 및/또는 3'와 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 Cas9 염기 편집기는 2개 이상의 ZFP 도메인, 예를 들어 데아미나제 도메인 또는 그의 성분에 작동가능하게 연결된 ZFP 도메인 및 ZFP 앵커 도메인을 포함한다 (예를 들어, 도 1b 참조). 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 DNA 결합 도메인은, 임의로 염기 편집기에 의해 결합된 것과 동일하거나 상이한 가닥 상에서, 염기 편집기의 표적 부위 5'와 결합한다. 예를 들어, 하나 이상의 부가의 ZFP 앵커가 사용되고 시스템의 염기 편집기의 표적 부위 5'와 염기 편집기에 의해 결합된 것과 동일한 가닥 상에서 특이적으로 결합하는 예시적인 실시양태에 관해서는, 도 1b, 오른쪽 하단 도식; 도 3; 및 도 7a를 참조한다. 하나 이상의 ZFP 앵커를 포함하면 염기 편집기의 효율성 및/또는 특이성이 증가할 수 있으며, 예를 들어 일부 경우에는, ZFP 앵커를 포함하지 않는 염기 편집기와 비교 시 2배 내지 5배 (또는 그 사이의 임의의 값), 10배 내지 100배 (또는 그 사이의 임의의 값) 또는 100배 초과한다.
다른 실시양태에서, 본원에는 (1) Cas9 닉카제 (예를 들어, 아데노신 데아미나제의 촉매적으로 불활성인 단량체를 포함함); (2) Cas9 닉카제에 대한 표적 부위 5' 또는 3'와 특이적으로 결합하는 앵커 DNA 결합 도메인 (예를 들어, ZFP); 및 (3) 아데노신 데아미나제의 촉매적으로 불활성인 단량체 및 Cas9 닉카제에 대한 표적 부위 5' 또는 3'와 결합하는 DNA 결합 도메인 (예를 들어, ZFP)을 포함하는 비-Cas9 닉카제 (예를 들어, ZFP-닉카제)를 포함하는 염기 편집 시스템이 기재된다. Cas9 닉카제 및 비-Cas9 닉카제 (예를 들어, ZFN 닉카제)의 A 데아미나제 단량체의 이량체화 시 이량체화되어 기능적 데아미나제가 형성된다. 앵커 DNA 결합 도메인 및 비-Cas9 닉카제는 표적의 동일하거나 상이한 가닥 및/또는 Cas9 닉카제의 동일하거나 (5' 또는 3') 상이한 (5'에 하나 및 3'에 하나) 쪽에서 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 앵커 DNA 결합 도메인 및 비-Cas9 닉카제는 Cas9 닉카제의 반대 쪽에 있는 반대 가닥과 결합한다 (예를 들어, 도 1b, 상단 도식 참조).
다른 실시양태에서, 본원에는 (1) Cas9 닉카제; (2) Cas9 닉카제에 대한 표적 부위 5' 또는 3'와 특이적으로 결합하는 임의적 앵커 DNA 결합 도메인 (예를 들어, ZFP); 및 (3) A 또는 C 데아미나제를 포함하는 비-Cas9 닉카제 (예를 들어, ZFP-닉카제)를 포함하는 염기 편집 시스템이 기재된다. 앵커 DNA 결합 도메인 및 비-Cas9 닉카제는 표적의 동일하거나 상이한 가닥 및/또는 Cas9 닉카제의 동일하거나 (5' 또는 3') 상이한 (5'에 하나 및 3'에 하나) 쪽에서 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 앵커 DNA 결합 도메인 및 비-Cas9 닉카제 염기 편집기는 Cas9 닉카제의 반대 쪽에 있는 반대 가닥과 결합한다 (예를 들어, 도 1b, 하단 중간 도식 참조).
다른 실시양태에서, 본원에는 (1) sgRNA에 작동가능하게 연결된 Cas9 단백질 (예를 들어, dCas9); (2) Cas9 닉카제에 대한 표적 부위 5' 또는 3'와 특이적으로 결합하는 임의적 앵커 DNA 결합 도메인 (예를 들어, ZFP 앵커); (3) A 또는 C 데아미나제에 작동가능하게 연결된 ZFP를 포함하는 융합 단백질이며, 여기서 융합 단백질은 Cas9 단백질에 대해 3' 또는 5'인 융합 단백질; 및 (4) Cas9 단백질 및/또는 ZFP의 3' 또는 5'와 결합하는 ZFN 닉카제를 포함하는 염기 편집 시스템이 기재된다. 앵커 DNA 결합 도메인 및 비-Cas9 단백질은 표적의 동일하거나 상이한 가닥 및/또는 Cas9 단백질의 동일하거나 (5' 또는 3') 상이한 (5'에 하나 및 3'에 하나) 쪽에서 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, ZFP-데아미나제 융합 단백질의 ZFP 및 임의적 앵커 ZFP는 반대 가닥과 결합한다 (예를 들어, 도 1c 참조). 추가 실시양태에서, 염기 편집기는 ZFN 닉카제를 포함하지 않는다.
본원에 기재된 Cas9 염기 편집기는 sgRNA를 포함하는 염기 편집기에 대해 이용가능한 PAM 서열을 확장 (완화)하는 것을 포함하여, 효율적이고 표적화된 염기 편집에 사용될 수 있는 PAM 서열의 관점에서 놀랍고도 예상치 못한 이점을 제공한다.
또한 본원에는 Cas9 염기 편집기를 포함하지 않는 (예를 들어, Cas9 닉카제 또는 Cas9 단백질이 결여되는) 염기 편집기 (ABE 또는 CBE)가 기재된다 (예를 들어, 도 1a 내지 도 1d 참조).
특정 실시양태에서, 염기 편집기는 (1) 비-Cas9 닉카제, 예를 들어 한 쌍의 ZFN (뉴클레아제 도메인에 작동가능하게 연결된 ZFP)을 포함하는 ZFN 닉카제이며, 여기서 상기 쌍의 뉴클레아제 도메인 중 하나가 촉매적으로 불활성인 것인 ZFN 닉카제 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,703,489; 9,200,266; 9,631,186; 및 10,113,207 참조); 및 (2) A 또는 C 데아미나제에 작동가능하게 연결된 ZFP를 포함하는 ZFP 염기 편집기를 포함한다 (예를 들어, 도 1b, 하단 왼쪽 도식 참조).
다른 실시양태에서, 염기 편집기는 임의의 RNA 프로그램가능한 분자를 포함하는 DNA 탈안정화 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, DNA 탈안정화 분자는 Cas9 단백질 (예를 들어, dCas9) 및 sgRNA를 포함하는 RNA 프로그램가능한 분자를 포함한다. 다른 실시양태에서, RNA 프로그램가능한 분자는 Cas9 단백질 (예를 들어, Cpf1 (Cas12a로서 공지되기도 함), C2c1, C2c2 (Cas13a로서 공지되기도 함), C2c3, Cas1, Cas2, Cas4, CasX 및 CasY); 및 아데노신 또는 시토신 데아미나제가 아니다. 임의로, 염기 편집기는 적어도 하나의 ZFP DNA 결합 도메인 (예를 들어, 아데노신 또는 시토신 데아미나제에 작동가능하게 연결된 ZFP DNA 결합 도메인; DNA 탈안정화 분자의 어느 한 쪽에 있는 ZFP 앵커; 및/또는 ZFN 닉카제의 임의의 조합)을 추가로 포함한다.
다른 실시양태에서, Cas9 무함유 염기 편집기는 ZFN 닉카제, 및 ABE 또는 CBE (예를 들어, ZFP에 작동가능하게 연결됨) 및 표적 염기에 접근할 수 있게 하는 (예를 들어, DNA를 풀리게 하는) 하나 이상의 DNA 탈안정화 분자를 포함한다 (예를 들어, 도 1d 참조). DNA 탈안정화 (풀림) 분자의 비-제한적인 예는 표 A에 제시된 바와 같은 단백질 도메인과, 도 8에 도시된 바와 같은 LNA 및/또는 PNA를 포함한 핵산을 포함한다. ZFN 닉카제는 촉매적으로 활성이고/이거나 촉매적으로 불활성인 FokI 도메인에서의 하나 이상의 돌연변이 및/또는 ZFP 백본에 대한 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2018/0087072 참조). 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기는 Cas9 무함유일 수 있지만 비-Cas9 CRISPR 단백질을 포함할 수 있다.
Cas9 무함유 (예를 들어, ZFP) 염기 편집기 중 임의의 것은, 예를 들어 DNA의 추가 풀림이 표적의 접근성을 증가시킴으로써 염기 편집기 기능을 증대시키는 경우에, 하나 이상의 부가의 DNA 탈안정화 인자 (예를 들어, DNA 헬리카제, 나선 탈안정화 분자 및 박테리아 DnaA 단백질, 단일 가닥 DNA 결합 단백질, 올리고뉴클레오티드 등)를 추가로 포함(또는 동원)할 수 있다. 하나 이상의 DNA 탈안정화 인자는 닉카제 및/또는 A 또는 C 데아미나제 함유 분자와 연합될 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 탈안정화 인자 (예를 들어, DNA 올리고)는 도 1d에 도시된 바와 같이 ZFN 닉카제와 연합된다.
다른 실시양태에서, 본원에는 (1) 적어도 하나의 DNA 탈안정화 분자 (예를 들어, 비-Cas9 단백질); (2) DNA 탈안정화 분자에 대한 표적 부위 5' 또는 3'와 특이적으로 결합하는 임의적 DNA 결합 도메인 (예를 들어, ZFN 앵커); 및 (3) A 또는 C 데아미나제에 작동가능하게 연결된 ZFP를 포함하는 융합 단백질이며, 여기서 융합 단백질은 DNA 탈안정화 분자에 대해 3' 또는 5'인 것인 융합 단백질을 포함하는 염기 편집 시스템이 기재된다.
Cas9 무함유 염기 편집기는 Cas9 염기 편집기에 비해, 하기를 포함하나 그에 제한되지는 않는 몇 가지 놀랍고 예상치 못한 이점을 제공한다: (i) 본 발명자들은 99% 이상의 절단 효율로 ZFN을 구축할 수 있기 때문에 Cas9 의존적 오프 타겟 효과가 없고 (오프 타겟 효과가 없음); (ii) ZFP가 본질적으로 인간 게놈 내의 임의의 서열을 표적으로 할 수 있으므로 PAM 제한을 제거하고; (iii) 현재의 Cas9 염기 편집기에 널리 퍼진 (예를 들어, 표적 창 내에서의) 방관자 돌연변이를 감소 및/또는 제거하고/하거나; (iv) 감소된 구축물 크기로 인해 AAV 전달 (생체 내에서 기능적인 것으로 공지됨)을 촉진시킨다.
따라서, cas9 무함유 염기 편집기는 통상적인 Cas9 염기 편집기에 비해, 하기를 포함하나 그에 제한되지는 않는 상당한 이점을 제공한다: 표적 특이성; 다양성; 방관자 돌연변이의 제어 또는 제거; 및 전달의 용이성. 표적 특이성의 관점에서, Cas9 무함유 ZFP 염기 편집기는 오프 타겟 효과가 거의 또는 전혀 없이 편집 시 99% 효율적으로 설계될 수 있는 반면, Cas9 염기 편집기는 더 높은 비율의 오프 타겟 효과를 나타낸다. 유사하게, 비-Cas9 ZFP 염기 편집기는 Cas9 염기 편집기의 경우에 관찰될 수 있는 바와 같은 방관자 돌연변이를 제어 (감소)하거나 제거한다. 더욱이, 비-Cas9 ZFP 염기 편집기의 표적 부위의 선택은 PAM 요구 사항에 의해 제한되는 반면, Cas9 무함유 ZFP 염기 편집기는 본질적으로 임의의 표적 서열을 표적으로 할 수 있다. 또한, 비-Cas9 염기 편집기의 감소된 구축물 크기로 인해, AAV 벡터를 사용하여 전달할 수 있으므로, 치료적 (생체 내) 용도를 크게 확장할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 염기 편집기 (염기 편집 시스템)는 (1) 염기 편집 창 및/또는 (2) 염기 편집 창과 PAM 서열 개재의 5' 단부 사이의 염기 내에서 변화될 단일 염기 (표적 염기)를 포함한다 (또한 도 2 참조). DNA 편집 창이 개방되면, 다른 비-표적 염기 (아데닌 및/또는 시토신)가 염기 편집기에 의한 잠재적인 변형을 위해 열려 있다. 이는 표적이 PAM 서열의 5' 단부로부터 떨어져 있는 13 내지 16개의 뉴클레오티드일 수 있지만, 이들 개재 뉴클레오티드 및/또는 염기 편집 창에 존재하는 표적화된 염기 (예를 들어, 아데닌 또는 시토신)도 또한 변경될 수 있다는 것을 의미한다. "방관자" 돌연변이로서 지칭되기도 하는 이러한 비-표적화된 돌연변이는 염기 편집 프로세스에서 바람직하지 않을 수 있다. 일부 상황에서는, 편집 창에서 표적화될 염기 (아데닌 염기 편집기의 경우 아데닌 또는 시티딘 염기 편집기의 경우 시티딘)를 포함하지 않는 PAM 서열을 선택함으로써 방관자 돌연변이를 피할 수 있다. 또 다른 한편으론, 및/또는 PAM 서열의 선택 이외에, 본 발명은 ZFN 닉카제 기능적 도메인과 쌍을 이룬 ZFP 앵커를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집기를 사용하고, PAM 요구 사항을 제거하며, 사용자가 편집기를 임의의 최적의 위치에 배치할 수 있음으로써 방관자 돌연변이를 감소 또는 제거한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 다양한 융합 단백질을 포함하는 복합체 (시스템)이 개시된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 DNA에 대한 융합 단백질의 결합 특이성을 증가시키기 위해 대체 DNA 결합 도메인에 융합될 수 있다 (문헌 [Bolukbashi, et al. (2015) Nat Methods 12(12):1150-1156] 참조). 예를 들어, ZFP, TtAgo 및 TALE DNA 결합 도메인이 dCas에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, dCas는 PAM 특이성을 변경시키는 돌연변이 (문헌 [Gao, et al. (2017) Nature Biotechnology 35:789-792; Virginijus Siksnys (2016) Mol Cell 61:793] 참조) 또는 PAM 인식에 대한 요구 사항을 변경시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집기는 Cas 뉴클레아제가 결여된다.
이러한 접근법의 잠재적인 표적은 많다. 치료될 수 있는 예시적인 질환에 관여한 유전자의 질환 편집의 치료 및/또는 예방을 위한 염기 편집의 비-제한적인 예는 겸상 적혈구병, 혈우병, 낭포성 섬유증, 페닐케톤뇨증, 테이 삭스병, 색맹, 파브리병, 프리드라이히 운동실조, 전립선암 및 다른 많은 것을 포함한다.
따라서, 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집 시스템은 임의의 질환 관련 유전자의 발현을 변경하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 유전자는 암, 예를 들어 JAK2 V617F 돌연변이와 연관된다. 이러한 돌연변이는 골수 증식성 신생물의 확장에 있어 중요한 역할을 한다. JAK2는 전사 인자의 STAT 패밀리의 인산화를 통해 막 결합된 수용체로부터 시토카인 및 성장 인자 신호를 변환시킨다. V617F 돌연변이는 구성적 티로신 인산화 활성을 유도하고 시토카인 과민성 (문헌 [James, et al. (2005) Nature 434:1144-1148]) 및 시토카인의 부재 하에 세포가 증식하도록 구동시킬 수 있는 능력을 촉진한다 (Zhao, et al. (2005) J. Biol Chem 280 (24):22788-22792). 일부 JAK2 V617F 장애 (예를 들어, 원발성 골수 섬유증)의 경우, 유일한 치료법은 조혈 세포 이식이지만, 현재의 접근법은 종종 질환 재발 및 이식편 대 숙주 질환과 연관이 있다 (Byrne, et al. (2018) Ther Avd Hematol 9(9):251-259). 돌연변이를 제거하기 위해 대상체의 조혈 줄기 세포/전구 세포 (HSC/PC)를 편집하면, 이들 질환을 성공적으로 치료할 수 있다.
특정 실시양태에서, 염기는 알파-1 항트립신 (SERPINA 유전자좌 내)을 표적으로 한다. A1AT 단백질에서 상염색체 열성 결핍을 유발시키는 유전자좌에서의 돌연변이는 간 및 폐 질환 둘 다와 연관이 있다. 북유럽 혈통의 사람들에게 가장 흔한 결핍 대립 유전자 중 하나인 PiZ 돌연변이는 A1AT 단백질의 약 10 내지 20%만 생산되도록 한다. 이러한 돌연변이는 엑손 5에서의 단일 돌연변이에 의해 야기되어, 아미노산 위치 342에서의 리신이 글루타민으로 치환되며, 여기서 DNA 내의 위치 1096에 있는 G는 돌연변이된 유전자 서열에서의 A이다 (문헌 [Fregonese and Stolk (2008) Orphanet J Rare Dis 3:16]에서 검토됨).
DNA 결합 분자/도메인
본원에는 임의의 관심 유전자 또는 유전자좌에서의 표적 부위와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 DNA 결합 분자/도메인을 포함하는 조성물이 기재된다. 징크 핑거 DNA 결합 도메인, TALE DNA 결합 도메인, CRISPR/Cas 뉴클레아제의 DNA 결합 부분 (가이드 또는 sgRNA), 및/또는 메가뉴클레아제로부터의 DNA 결합 도메인을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 DNA 결합 분자/도메인이 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 염기 편집기는 징크 핑거 단백질 DNA 결합 도메인을 포함한다. 바람직하게, 징크 핑거 단백질은 선택한 표적 부위와 결합하도록 조작된다는 점에서 비-자연적으로 발생한다 (예를 들어, 문헌 [Beerli, et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo, et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan, et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal, et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo, et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416]; 미국 특허 번호 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 및 7,253,273; 및 미국 특허 공개 번호 2005/0064474; 2007/0218528; 및 2005/0267061 참조; 모두는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다). 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 미국 특허 공개 번호 2012/0060230 (그 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 징크 핑거 단백질을 포함한다.
조작된 징크 핑거 결합 도메인은 자연적으로 발생하는 징크 핑거 단백질과 비교하여 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계와 다양한 유형의 선택을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어, 삼중항 (또는 사중항) 뉴클레오티드 서열 및 개별 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 삼중항 또는 사중항 뉴클레오티드 서열은 특별한 삼중항 또는 사중항 서열과 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연합된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,453,242 및 6,534,261 참조; 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다).
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함한 예시적인 선택 방법이 미국 특허 번호 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 뿐만 아니라 국제 특허 공개 번호 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; 및 WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다. 또한, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증강이, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,794,136에 기재되었다.
또한, 이들 및 다른 참고 문헌에 개시된 바와 같이, 징크 핑거 도메인 및/또는 다수 핑거의 징크 핑거 단백질은, 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함한 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 관해서는 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 이러한 단백질의 개별 징크 핑거 사이에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증강이, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,794,136에 기재되었다.
표적 부위의 선택; ZFP 및 융합 단백질 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구축을 위한 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 미국 특허 번호 6,140,081; 5,789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 및 6,200,759; 및 국제 특허 공개 번호 WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536; 및 WO 03/016496에 상세하게 기재되어 있다.
또한, 이들 및 다른 참고 문헌에 개시된 바와 같이, 징크 핑거 도메인 및/또는 다수 핑거의 징크 핑거 단백질은, 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함한 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 관해서는 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 이러한 단백질의 개별 징크 핑거 사이에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
통상적으로, ZFP는 적어도 3개의 핑거를 포함한다. 특정의 ZFP는 4개, 5개, 6개 또는 그 초과의 핑거를 포함한다. 3개의 핑거를 포함하는 ZFP는 전형적으로, 9개 또는 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식하고; 4개의 핑거를 포함하는 ZFP는 전형적으로, 12개 내지 14개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식하는 반면; 6개의 핑거를 갖는 ZFP는 18개 내지 21개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 부위를 인식할 수 있다. ZFP는 또한 하나 이상의 조절 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있으며, 이러한 도메인은 전사 활성화 또는 억제 도메인일 수 있다.
일부 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 인식 서열, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII가 공지되어 있다 (또한 미국 특허 번호 5,420,032; 미국 특허 번호 6,833,252; 문헌 [Belfort, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon, et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble, et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast, et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs catalogue] 참조). 또한, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA 결합 특이성은 비-자연 표적 부위와 결합하도록 조작될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Chevalier, et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth, et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques, et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 번호 2007/0117128 참조).
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 돌연변이체 절단 도메인과 함께 사용되는 징크 핑거 단백질은, 예를 들어 위치 -14, -9 및/또는 -5 중 하나 이상에서 백본 영역 (예를 들어, -1 내지 6으로 넘버링된 7-아미노산 인식 나선 영역의 외부 영역)에 대한 하나 이상의 돌연변이 (치환, 결실 및/또는 삽입)를 포함한다. 하나 이상의 이들 위치에서 야생형 잔기는 결실될 수 있고, 임의의 아미노산 잔기로 대체될 수 있고/있거나 하나 이상의 부가의 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 위치 -5에서의 Arg (R)는 Tyr (Y), Asp (N), Glu (E), Leu (L), Gln (Q) 또는 Ala (A)로 변화된다. 다른 실시양태에서, 위치 (-9)에서의 Arg (R)는 Ser (S), Asp (N) 또는 Glu (E)로 대체된다. 추가 실시양태에서, 위치 (-14)에서의 Arg (R)는 Ser (S) 또는 Gln (Q)으로 대체된다. 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 징크 핑거 DNA 결합 도메인 내에 돌연변이를 포함할 수 있으며, 여기서 (-5), (-9) 및/또는 (-14) 위치에서의 아미노산이 임의의 조합으로 상기 열거된 아미노산 중 임의의 것으로 변화된다.
다른 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 식물 병원균 크산토모나스(Xanthomonas) (문헌 [Boch, et al. (2009) Science 326:1509-1512 및 Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501] 참조) 및 랄스토니아(Ralstonia) (문헌 [Heuer, et al. (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(13):4379-4384]; 미국 특허 공개 번호 2011/0301073 및 2011/0145940 참조)로부터 유래된 것과 유사한 전사 활성화제 유사 (TAL) 이펙터 (TALE)로부터의 조작된 도메인을 포함한다. 크산토모나스 속의 식물 병원성 박테리아는 중요한 작물에서 많은 질병을 일으키는 것으로 공지되어 있다. 크산토모나스의 병원성은 식물 세포에 25개 초과의 상이한 이펙터 단백질을 주입하는 보존된 유형 III 분비 (T3S) 시스템에 의존한다. 이러한 주입된 단백질 중에는 식물 전사 활성화제를 모방하고 식물 전사체를 조작하는 전사 활성화제 유사 이펙터 (TALE)가 있다 (문헌 [Kay, et al. (2007) Science 318:648-651] 참조). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인과 전사 활성화 도메인을 함유한다. 가장 널리 특징 규명된 TALE 중 하나는 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 베시카토리아(Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다 (문헌 [Bonas, et al. (1989) Mol Gen Genet 218:127-136] 및 국제 특허 공개 번호 WO 2010/079430 참조). TALE는 탠덤 반복부의 중앙 집중식 도메인을 함유하며, 각각의 반복부는 대략 34개의 아미노산을 함유하며, 이는 이들 단백질의 DNA 결합 특이성에 중요하다. 또한, 그들은 핵 국재화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다 (검토를 위해, 문헌 [Schornack S., et al. (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272] 참조). 또한, 식물 병원성 박테리아인 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에서, 알. 솔라나세아룸(R. solanacearum) 생물변이형 1 균주 GMI1000 및 생물변이형 4 균주 RS1000에서 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리와 상동인, brg11 및 hpx17로 지명된 2개의 유전자가 발견되었다 (문헌 [Heuer, et al. (2007) Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384] 참조). 이들 유전자는 뉴클레오티드 서열이 서로 98.9% 동일하지만, hpx17의 반복 도메인에서 1,575개 염기쌍이 결실된다는 점에서 상이하다. 그러나, 두 유전자 산물은 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다.
이들 TAL 이펙터의 특이성은 탠덤 반복부에서 발견되는 서열에 의존한다. 반복된 서열은 대략 102개의 염기쌍을 포함하고 반복부는 전형적으로 서로 91 내지 100% 상동이다 (상기 문헌 [Bonas, et al.]). 반복부의 다형성은 통상적으로, 위치 12 및 13에 위치하며, 위치 12 및 13에서의 초가변 2잔기 (반복 가변 2잔기 또는 RVD 영역)의 정체와 TAL 이펙터의 표적 서열에 있는 연속되는 뉴클레오티드의 정체 간에 일 대 일 일치가 있는 것처럼 여겨진다 (문헌 [Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501 및 Boch, et al. (2009) Science 326:1509-1512] 참조). 실험적으로, 이러한 TAL 이펙터의 DNA 인식을 위한 자연 코드는 위치 12 및 13에서의 HD 서열 (반복 가변 2잔기 또는 RVD)이 시토신 (C)과 결합하고, NG가 T와 결합하고, NI가 A, C, G 또는 T와 결합하고, NN이 A 또는 G와 결합하며, ING가 T와 결합하도록 결정되었다. 이러한 DNA 결합 반복부는 새로운 서열과 상호작용할 수 있고 식물 세포에서 비-내인성 리포터 유전자의 발현을 활성화할 수 있는 인공 전사 인자를 만들기 위해, 반복부의 새로운 조합과 수를 갖는 단백질로 어셈블리되었다 (상기 문헌 [Boch, et al.]). 조작된 TAL 단백질은 FokI 절단 절반 도메인에 연결되어, 비정형 RVD를 갖는 TALEN을 포함한 TAL 이펙터 도메인 뉴클레아제 융합 (TALEN)을 산출하였다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,586,526 참조).
일부 실시양태에서, TALEN은 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI) 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, TALE-뉴클레아제는 메가 TAL이다. 이들 메가 TAL 뉴클레아제는 TALE DNA 결합 도메인 및 메가뉴클레아제 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 메가뉴클레아제 절단 도메인은 단량체로서 활성이며 활성을 위해 이량체화를 필요로 하지 않는다 (문헌 [Boissel et al. (2013) Nucl Acid Res: 1-13, doi: 10.1093/nar/gkt1224] 참조).
또한 추가 실시양태에서, 뉴클레아제는 컴팩트 TALEN을 포함한다. 이들은 TALE DNA 결합 도메인을 TevI 뉴클레아제 도메인에 연결하는 단일 쇄 융합 단백질이다. 융합 단백질은 TevI 뉴클레아제 도메인과 관련하여 TALE DNA 결합 도메인이 위치하는 곳에 따라, TALE 영역에 의해 국한된 닉카제로서 작용할 수 있거나 또는 이중 가닥 파손을 생성할 수 있다 (문헌 [Beurdeley, et al. (2013) Nat Comm: 1-8 DOI:10.1038/ncomms2782] 참조). 또한, 뉴클레아제 도메인은 또한 DNA 결합 기능성을 나타낼 수 있다. 임의의 TALEN은 부가의 TALEN (예를 들어, 하나 이상의 메가-TALE가 있는 하나 이상의 TALEN (cTALEN 또는 FokI-TALEN))과 조합하여 사용될 수 있다.
또한, 이들 및 다른 참고 문헌에 개시된 바와 같이, 징크 핑거 도메인 및/또는 다수 핑거의 징크 핑거 단백질 또는 TALE는, 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함한 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 관해서는 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 이러한 단백질의 개별 징크 핑거 사이에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증강이, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,794,136에 기재되었다.
특정 실시양태에서, 염기 편집기는 DNA와 결합하는 단일 가이드 RNA (sgRNA) DNA 결합 분자를 포함한 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 일부인 DNA 결합 도메인을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,697,359 및 미국 특허 공개 번호 2015/0056705 및 2015/0159172 참조). 상기 시스템의 RNA 성분을 코딩하는 CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부) 유전자좌와, 단백질을 코딩하는 cas (CRISPR 관련) 유전자좌 (문헌 [Jansen, et al. (2002) Mol. Microbiol. 43:1565-1575; Makarova, et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:482-496; Makarova, et al. (2006) Biol. Direct 1:7; Haft, et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1:e60])가 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 유전자 서열을 구성한다. 미생물 숙주에서 CRISPR 유전자좌는 CRISPR 매개 핵산 절단의 특이성을 프로그래밍할 수 있는 비-코딩 RNA 요소뿐만 아니라 CRISPR 관련 (Cas) 유전자의 조합을 함유한다.
일부 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 TtAgo 시스템의 일부이다 (문헌 [Swarts, et al. (2014) Nature 507(7491):258-261; Swarts, et al. (2012) PLoS One 7(4):e35888; Sheng, et al., 상기 문헌] 참조). 진핵 생물에서, 유전자 침묵은 아르고노트 (Ago) 패밀리의 단백질에 의해 매개된다. 이러한 패러다임에서, Ago는 작은 (19-31 nt) RNA와 결합된다. 이러한 단백질-RNA 침묵 복합체는 작은 RNA와 표적 간의 왓슨 크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성을 통해 표적 RNA를 인식하고, 표적 RNA를 엔도뉴클레아제로 절단한다 (Vogel (2014) Science 344:972-973). 대조적으로, 원핵 Ago 단백질은 작은 단일 가닥 DNA 단편과 결합하며 외래 (종종 바이러스) DNA를 검출하고 이를 제거하는 기능을 하는 것으로 예상된다 (Yuan, et al. (2005) Mol. Cell 19:405; Olovnikov, et al. (2013) Mol. Cell 51, 594; Swarts, et al. (2014) Nature 507(7491):258-261; Swarts, et al. (2012) PLoS One 7(4):e35888). 예시적인 원핵 Ago 단백질은 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 및 써무스 써모필루스로부터의 것을 포함한다.
가장 널리 특징 규명된 원핵 Ago 단백질 중 하나는 티. 써모필루스(T. thermophilus)로부터의 것이다 (TtAgo; 문헌 [Swarts, et al. (2014) Nature 507(7491):258-261; Swarts, et al. (2012) PLoS One 7(4):e35888]). TtAgo는 5' 인산염 기가 있는 15 nt 또는 13-25 nt 단일 가닥 DNA 단편과 연합된다. TtAgo에 의해 결합된 이러한 "가이드 DNA"는 단백질-DNA 복합체가 DNA의 제3자 분자에 있는 왓슨 크릭 상보적 DNA 서열과 결합하도록 지시하는 역할을 한다. 일단 이들 가이드 DNA에서의 서열 정보가 표적 DNA를 확인시켜 줄 수 있으면, TtAgo-가이드 DNA 복합체가 표적 DNA를 절단한다. 이러한 메커니즘은 또한, 그의 표적 DNA와 결합되는 동안 TtAgo-가이드 DNA 복합체의 구조에 의해 뒷받침된다 (상기 문헌 [G. Sheng, et al.]). 로도박터 스파에로이데스로부터의 Ago (RsAgo)는 유사한 특성을 가지고 있다 (상기 문헌 [Olovnikov, et al.]).
임의의 DNA 서열의 외인성 가이드 DNA를 TtAgo 단백질 상에 부하할 수 있다 (Swarts, et al. (2014) Nature 507(7491):258-261; Swarts, et al. (2012) PLoS One 7(4):e35888). TtAgo 절단의 특이성은 가이드 DNA에 의해 지시되기 때문에, 외인성 조사자 지정 가이드 DNA와 형성된 TtAgo-DNA 복합체는 따라서, TtAgo 표적 DNA 절단이 상보적 조사자 지정 표적 DNA를 향하게 할 것이다. 이러한 방식으로, DNA에서 표적화된 이중 가닥 파손을 생성할 수 있다. TtAgo-가이드 DNA 시스템 (또는 다른 유기체로부터의 오르소로고스 Ago-가이드 DNA 시스템)을 사용하면, 세포 내에서 게놈 DNA의 표적화된 절단이 가능하다. 이러한 절단은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 포유 동물 게놈 DNA의 절단을 위해, 포유 동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 TtAgo 코돈 버전을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 추가로, TtAgo 단백질이 세포 침투 펩티드에 융합되는 시험관 내에서 형성된 TtAgo-DNA 복합체로 세포를 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 돌연변이 유발을 통해 변경된 TtAgo 단백질 버전을 사용하여 37℃에서의 개선된 활성을 갖는 것이 바람직 할 수 있다. Ago-RNA 매개 DNA 절단은 유전자 녹아웃, 표적화된 유전자 부가, 유전자 교정, DNA 파손의 이용을 위해 관련 기술분야에서의 기술 표준을 사용하는 표적화된 유전자 결실을 포함한 결과 전체에 영향을 미치는 데 사용될 수 있었다.
따라서, 임의의 DNA 결합 분자/도메인을 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 염기 편집기는 sgRNA DNA 결합 도메인 (예를 들어, Cas9 닉카제의 일부로서) 및 임의로 하나 이상의 ZFP DNA 결합 도메인 ("ZFP 앵커로서 지칭됨)을 포함하는 Cas9 염기 편집기이며, ZFP(들)는 염기 편집 효율성 및/또는 특이성을 증가시킬 수 있다. ZFP 앵커를 포함한 Cas9 염기 편집기의 비-제한적인 예는 도 1b 및 도 3에 도시되어 있다.
융합 분자
본원에 기재된 DNA 편집 복합체는 본원에 기재된 바와 같은 DNA 결합 도메인 (예를 들어, ZFP 또는 TALE, CRISPR/Cas 성분, 예컨대 단일 가이드 RNA)을 포함하는 하나 이상의 융합 분자를 포함할 수 있고, 이종 (기능적) 도메인 (또는 그의 기능적 단편)이 또한 제공된다.
통상의 도메인은, 예를 들어, 전사 인자 도메인 (활성화제, 억제인자, 공동 활성화제, 공동 억제인자), 침묵인자, 종양 유전자 (예를 들어, myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos 패밀리 구성원 등); DNA 복구 효소 및 그의 관련 인자 및 변형인자; 헬리카제, 이중 가닥 DNA 결합 단백질, DNA 재배열 효소 및 그의 관련 인자 및 변형인자; 염색질 관련 단백질 및 그의 변형인자 (예를 들어 키나제, 아세틸라제 및 데아세틸라제); 및 DNA 변형 효소 (예를 들어, 메틸트랜스퍼라제, 토포이소머라제, 헬리카제, 라이가제, 키나제, 포스파타제, 데아미나제, 폴리머라제, 엔도뉴클레아제) 및 그의 관련 인자 및 변형인자를 포함한다. 미국 특허 공개 번호 2005/0064474; 2006/0188987; 및 2007/0218528은 DNA 결합 도메인과 뉴클레아제 절단 도메인의 융합에 관한 세부 사항에 대해 설명하며, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
융합 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 클로닝 및 생화학적 접합 방법에 의해 구축된다. 융합 분자는 DNA 결합 도메인 및 기능적 도메인 (예를 들어, 헬리카제 및/또는 데아미나제 및/또는 GUI 및/또는 GAM)을 포함한다. 융합 분자는 또한 임의로, 핵 국재화 신호 (예컨대 예를 들어, SV40 배지 T-항원으로부터의 것) 및 에피토프 태그 (예컨대 예를 들어, FLAG 및 혈구 응집소)를 포함한다. 융합 단백질 (및 이를 코딩하는 핵산)은 번역 리딩 프레임이 융합물의 성분 사이에서 보존되도록 설계된다.
한편으로는 기능적 도메인 (또는 그의 기능적 단편)의 폴리펩티드 성분과 다른 한편으로는 비-단백질 DNA 결합 도메인 (예를 들어, 항생제, 삽입제, 작은 홈 결합제, 핵산) 간의 융합물이, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 생화학적 접합 방법에 의해 구축된다 (예를 들어, 문헌 [Pierce Chemical Company (Rockford, IL) Catalogue] 참조). 작은 홈 결합제와 폴리펩티드 간의 융합물을 제조하는 방법 및 조성물이 문헌 [Mapp, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935]에 기재되었다. 더욱이, CRISPR/Cas 시스템의 단일 가이드 RNA는 기능적 도메인과 연합하여 활성 전사 조절인자 및 뉴클레아제를 형성한다.
특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인에 대한 표적 부위는 세포 염색질의 접근가능한 영역에 존재한다. 접근가능한 영역은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,217,509 및 7,923,542에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 표적 부위가 세포 염색질의 접근가능한 영역에 존재하지 않는 경우, 미국 특허 번호 7,785,792 및 8,071,370에 기재된 바와 같이 하나 이상의 접근가능한 영역이 생성될 수 있다. 부가의 실시양태에서, 융합 분자의 DNA 결합 도메인은 그의 표적 부위가 접근가능한 영역에 있는지의 여부에 관계없이 세포 염색질과 결합할 수 있다. 예를 들어, 이러한 DNA 결합 도메인은 링커 DNA 및/또는 뉴클레오솜 DNA와 결합할 수 있다. 이러한 유형의 "선구자" DNA 결합 도메인의 예는 특정 스테로이드 수용체와 간세포 핵 인자 3 (HNF3)에서 발견된다 (Cordingley, et al. (1987) Cell 48:261-270; Pina, et al. (1990) Cell 60:719-731; 및 Cirillo, et al. (1998) EMBO J. 17:244-254).
융합 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 제약상 허용되는 담체와 제형화될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985]; 및 미국 특허 번호 6,453,242 및 6,534,261 참조).
융합 분자의 기능적 성분(들)/도메인(들)은 일단 융합 분자가 그의 DNA 결합 도메인을 통해 표적 서열과 결합하면, 유전자의 서열에 영향을 미칠 수 있는 다양한 상이한 성분 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 기능적 성분은 다양한 데아미나제, UGI, GAM, 헬리카제 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 기능적 도메인은 하나 이상의 시티딘 데아미나제 (예를 들어, 아포지질단백질 B mRNA 편집 복합체 1 (APOBEC1) 도메인 및/또는 활성화 유도 데아미나제 (AID))를 포함한다. 다른 실시양태에서, 기능적 도메인은 하나 이상의 아데닌 데아미나제 (예를 들어, 돌연변이된 TadA (tRNA 아데닌 데아미나제 (문헌 [Gaudelli, et al. (2017) Nature 551:464-471] 참조))를 포함한다. 또한 추가 실시양태에서, 기능적 도메인은 적어도 하나의 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 (예를 들어 UGI) 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집 복합체는 데아미나제, 닉카제, UGI 및/또는 GAM 단백질을 포함한다. 기능적 도메인(들)은 DNA 결합 도메인 (및/또는 촉매적으로 활성인 융합 분자에 포함될 때 닉카제)와 관련하여 N-말단 (다수의 기능적 도메인이 존재하는 경우 임의의 순서로), C-말단 (다수의 기능적 도메인이 존재하는 경우 임의의 순서로) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 방식으로 위치될 수 있다.
일부 실시양태에서, DNA 편집 (염기 편집) 복합체는 이중 가닥 DNA 나선을 개방하거나 또는 탈안정화하는 데 도움을 주는 분자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 분자는 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 효소는 헬리카제 (예를 들어, RecQ 헬리카제 (WRN, BLM, RecQL4 및 RecQ5 (문헌 [Mo, et al. (2018) Cancer Lett. 413:1-10] 참조), DNA2 (문헌 [Jia, et al. (2017) DNA Repair (Amst). 59:9-19]) 및 임의의 다른 진핵 헬리카제, 예를 들어, FANCJ, XPD, XPB, RTEL1, 및 PIF1 (문헌 [Brosh (2013) Nat Rev Canc 13(8):542-558]))이다. 일부 실시양태에서, 효소는 박테리아 및/또는 바이러스 헬리카제이다. 예시적인 바이러스 헬리카제는 미오비리다에 과의 바이러스에 의해 코딩된 것 (예를 들어 gp41, Dda, UvsW, Gene α, 및 Ban); 포도비리다에 과의 바이러스에 의해 코딩된 것 (예를 들어 4B); 시포비리다에, 바쿨로비리다에, 헤르페스비리다에, 폴리오마비리다에, 파필로마비리다에 및 폭스비리다에 과의 바이러스에 의해 코딩된 것 (예를 들어, G40P, p143, UL5, UL9, Tag, E1, NPH-I, NPH-II, A18R, 및 VETF), 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 바이러스 헬리카제를 포함한다 (예를 들어 문헌 [Frick and Lam (2006) Curr Pharm Des 12(11):1315-1338] 참조). 일부 실시양태에서, 헬리카제 효소는 박테리아 효소이다. 예시적인 박테리아 헬리카제는 피. 아에루기노사 SF4 DnaB-유사 헬리카제, 또는 박테리아, 예컨대 이. 콜라이 및 에이치. 파일로리에서 박테리아 RecBCD 복합체의 일부인 RecB 및 RecD 헬리카제를 포함한다 (Shadrick, et al. (2013) J. Biomol Screen 18(7):761-781). 일부 실시양태에서, 상기 분자는 CRISPR/Cas 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas 복합체는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 뉴클레아제 도메인 중 하나에서 촉매적으로 결함이 있는 Cas 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 효소는 그의 PAM 인식에 있어서 결함이 있다 (Anders, et al. (2014) Nature 513(7519):569-573). 일부 실시양태에서, 상기 분자는 나선 탈안정화 특성을 갖는다. 예시적인 나선 탈안정화 분자는 단순 포진 바이러스 유형 I (문헌 [Boehmer and Lehman (1993) J Virol 67(2):711-715]), 푸랄파 (문헌 [Darbinian, et al. (2001) J Cell Biochem 80(4):589-95]) 및 송아지 흉선 DNA 나선 탈안정화 단백질 (문헌 [Kohwi-Shigematsu, et al. (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75(10):4689-93])로부터의 ICP8을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 분자는 핵산이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표적화된 편집 근처 영역과의 상동성을 갖는 DNA이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표적화된 편집 근처 영역과의 상동성을 갖는 RNA이다. 일부 실시양태에서, RNA는 변형된다. 일부 실시양태에서, 융합 분자는 이러한 융합 분자의 하나 이상의 도메인 사이에 아미노산 링커 서열을 포함한다.
본원에 기재된 DNA 편집 복합체는 본원에 기재된 바와 같은 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 융합 분자를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 편집 복합체는 2개의 융합 분자: DNA 결합 도메인 및 닉카제 도메인을 포함하는 촉매적으로 활성인 닉카제 (촉매적으로 활성)인 제1 융합 분자 및 DNA 결합 도메인 및 하나 이상의 기능적 도메인 (시티딘 데아미나제, 아데닌 데아미나제, 및/또는 UGI 등)을 포함하는 제2의 촉매적으로 불활성인 융합 분자를 포함한다. 전형적으로, 융합 분자는 2개의 DNA 결합 도메인이 표적 부위와 결합하여 2개의 융합 분자가 이량체화되어 DNA 편집을 수행한다는 점에서 "파트너"이다. 다른 실시양태에서, DNA 편집 복합체는 3개 이상의 융합 분자: DNA 결합 도메인 및 닉카제 도메인을 포함하는 촉매적으로 활성인 닉카제인 제1 융합 분자; DNA 결합 도메인을 포함하는 제2의 촉매적으로 불활성인 융합 분자 (예를 들어, 제1 융합 분자와 파트너이고 이량체화된다); 및 본원에 기재된 바와 같은 DNA 결합 도메인 및 하나 이상의 기능적 도메인을 포함하는 제3 융합 분자를 포함한다.
닉카제 도메인
특정 실시양태에서, 융합 단백질은 DNA 결합 도메인 및 절단 (뉴클레아제) 도메인, 바람직하게 닉카제 도메인을 포함한다. 따라서, 유전자 편집은 뉴클레아제, 예를 들어 조작된 닉카제를 사용하여 달성될 수 있다. 조작된 뉴클레아제 기술은 자연적으로 발생하는 DNA 결합 단백질의 조작을 기반으로 한다. 예를 들어, 맞춤형 DNA 결합 특이성을 갖는 귀소 엔도뉴클레아제를 조작하는 것이 기재되었다 (Chames, et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(20):e178; Arnould, et al. (2006) J. Mol. Biol. 355:443-458). 또한, ZFP를 조작하는 것이 또한 기재되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,979,539; 6,933,113; 7,163,824; 및 7,013,219 참조).
또한, ZFP 및/또는 TALE는 뉴클레아제 도메인에 융합되어 ZFN 및 TALEN을 생성하였으며, 이는 그의 조작된 (ZFP 또는 TALE) DNA 결합 도메인을 통해 의도된 핵산 표적을 인식할 수 있고 DNA가 뉴클레아제 활성을 통해 DNA 결합 부위 근처를 절단할 수 있게 하는 기능적 실체이다 (예를 들어, 문헌 [Kim, et al. (1996) Proc Nat'l Acad Sci USA 93(3):1156-1160] 참조). 보다 최근에는, 이러한 뉴클레아제가 다양한 유기체에서 게놈 변형을 위해 사용되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,255,250; 9,200,266; 9,045,763; 9,005,973; 8,956,828; 8,945,868; 8,703,489; 8,586,526; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,067,317; 7,262,054; 7,888,121; 7,972,854; 7,914,796; 7,951,925; 8,110,379; 8,409,861; 미국 특허 공개 번호 2003/0232410; 2005/0208489; 2005/0026157; 2005/0064474; 2006/0063231; 2008/0159996; 2010/00218264; 2012/0017290; 2011/0265198; 2013/0137104; 2013/0122591; 2013/0177983; 2013/0177960; 및 2015/0056705 참조).
따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 광범위하게 적용가능하고 임의의 관심 뉴클레아제를 수반할 수 있다. 뉴클레아제의 비-제한적인 예는 메가뉴클레아제, TALEN 및 징크 핑거 뉴클레아제를 포함한다. 뉴클레아제는 이종 DNA 결합 및 절단 도메인을 포함할 수 있거나 (예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제; 이종 절단 도메인을 갖는 메가뉴클레아제 DNA 결합 도메인), 또는 또 다른 한편으론, 자연적으로 발생하는 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 선택된 표적 부위와 결합하도록 변경될 수 있다 (예를 들어, 동족 결합 부위와 상이한 부위와 결합하도록 조작된 메가뉴클레아제).
본원에 기재된 뉴클레아제 중 임의의 것에서, 뉴클레아제는 TALEN으로서 지칭되기도 한, 조작된 TALE DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 메가뉴클레아제 도메인)을 포함할 수 있다. 사용자가 선택한 표적 서열과의 강력한 부위 특이적 상호작용을 위해 이들 TALEN 단백질을 조작하는 방법 및 조성물이 공개되었다 (미국 특허 번호 8,586,526 참조). 일부 실시양태에서, TALEN은 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI) 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, TALE-뉴클레아제는 메가 TAL이다. 이들 메가 TAL 뉴클레아제는 TALE DNA 결합 도메인 및 메가뉴클레아제 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 메가뉴클레아제 절단 도메인은 단량체로서 활성이며 활성을 위해 이량체화를 필요로 하지 않는다 (문헌 [Boissel, et al. (2013) Nucl Acid Res 1-13, doi:10.1093/nar/gkt1224] 참조). 또한, 뉴클레아제 도메인은 또한, DNA 결합 기능성을 나타낼 수 있다.
또한 추가 실시양태에서, 뉴클레아제는 컴팩트 TALEN (cTALEN)을 포함한다. 이들은 TALE DNA 결합 도메인을 TevI 뉴클레아제 도메인에 연결하는 단일 쇄 융합 단백질이다. 융합 단백질은 TevI 뉴클레아제 도메인과 관련하여 TALE DNA 결합 도메인이 위치하는 곳에 따라, TALE 영역에 의해 국한된 닉카제로서 작용할 수 있거나 또는 이중 가닥 파손을 생성할 수 있다 (문헌 [Beurdeley, et al. (2013) Nat Comm: 1-8 DOI:10.1038/ncomms2782] 참조). 임의의 TALEN은 부가의 TALEN (예를 들어, 하나 이상의 메가-TAL이 있는 하나 이상의 TALEN (cTALEN 또는 FokI-TALEN)) 또는 다른 DNA 절단 효소와 조합하여 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 메가뉴클레아제 (귀소 엔도뉴클레아제) 또는 절단 활성을 나타내는 그의 일부분을 포함한다. 자연적으로 발생하는 메가뉴클레아제는 15 내지 40개의 염기쌍 절단 부위를 인식하고, 통상적으로 4가지 패밀리: LAGLIDADG 패밀리 (서열식별번호: 75로서 개시된 "LAGLIDADG"), GIY-YIG 패밀리, His-Cyst 박스 패밀리 및 HNH 패밀리로 분류된다. 예시적인 귀소 엔도뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII를 포함한다. 그들의 인식 서열은 공지되어 있다 (또한 미국 특허 번호 5,420,032; 미국 특허 번호 6,833,252; 문헌 [Belfort, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon, et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble, et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast, et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs catalogue] 참조).
자연적으로 발생하는 메가뉴클레아제, 주로 LAGLIDADG 패밀리 (서열식별번호: 75로서 개시된 "LAGLIDADG")로부터의 DNA 결합 도메인은 식물, 효모, 드로소필라(Drosophila), 포유 동물 세포 및 마우스에서 부위 특이적 게놈 변형을 촉진하는 데 사용되었지만, 이러한 접근법은 메가뉴클레아제 인식 서열을 보존하는 상동 유전자의 변형으로 제한되었거나 (문헌 [Monet, et al. (1999) Biochem. Biophysics. Res. Common 255:88-93) 또는 인식 서열이 도입된 미리 조작된 게놈으로 제한되었다 (Route, et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:8096-106; Chilton, et al. (2003) Plant Physiology 133:956-65; Puchta, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5055-60; Rong, et al. (2002) Genes Dev. 16:1568-81; Gouble, et al. (2006) J. Gene Med. 8(5):616-622). 따라서, 메가뉴클레아제를 조작하여 의학적으로 또는 생명공학적으로 관련된 부위에서 새로운 결합 특이성을 나타내려는 시도가 있었다 (Porteus, et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:967-73; Sussman, et al. (2004) J. Mol. Biol. 342:31-41; Epinat, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-62; Chevalier, et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth, et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques, et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; 미국 특허 공개 번호 2007/0117128; 2006/0206949; 2006/0153826; 2006/0078552; 및 2004/0002092). 또한, 메가뉴클레아제로부터의 자연적으로 발생하는 또는 조작된 DNA 결합 도메인은 이종 뉴클레아제 (예를 들어, FokI)로부터의 절단 도메인과 작동가능하게 연결될 수 있고/있거나 메가뉴클레아제로부터의 절단 도메인은 이종 DNA 결합 도메인 (예를 들어, ZFP 또는 TALE)과 작동가능하게 연결될 수 있다.
다른 실시양태에서, 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 TALE DNA 결합 도메인-뉴클레아제 융합 (TALEN)이다. ZFN 및 TALEN은 선택되는 유전자 내의 표적 부위와 결합하도록 조작된 DNA 결합 도메인 (징크 핑거 단백질 또는 TALE DNA 결합 도메인) 및 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 제한 및/또는 메가뉴클레아제로부터의 것)을 포함한다.
상기 상세히 기재된 바와 같이, 징크 핑거 결합 도메인 및 TALE DNA 결합 도메인은 선택되는 서열과 결합하도록 조작될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Beerli, et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo, et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan, et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal, et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo, et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416] 참조). 조작된 징크 핑거 결합 도메인 또는 TALE 단백질은 자연적으로 발생하는 단백질과 비교해서 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계와 다양한 유형의 선택을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어, 삼중항 (또는 사중항) 뉴클레오티드 서열 및 개별 징크 핑거 또는 TALE 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 삼중항 또는 사중항 뉴클레오티드 서열은 특별한 삼중항 또는 사중항 서열과 결합하는 징크 핑거 또는 TALE 반복 단위의 하나 이상의 아미노산 서열과 연합된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,453,242 및 6,534,261 참조; 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다).
표적 부위의 선택; 및 융합 단백질 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구축을 위한 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 미국 특허 번호 7,888,121 및 8,409,861 (그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 상세히 기재되어 있다.
또한, 이들 및 다른 참고 문헌에 개시된 바와 같이, 징크 핑거 도메인, TALE 및/또는 다수 핑거의 징크 핑거 단백질은, 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함한 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 예를 들어, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 관해서는 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 이러한 단백질의 개별 징크 핑거 사이에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다 (또한 미국 특허 번호 8,772,453 참조).
따라서, 뉴클레아제, 예컨대 ZFN, TALEN 및/또는 메가뉴클레아제는 임의의 DNA 결합 도메인 및 임의의 뉴클레아제 (절단) 도메인 (절단 도메인, 절단 절반-도메인)을 포함할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 절단 도메인은 DNA 결합 도메인, 예를 들어 징크 핑거 또는 TAL-이펙터 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제 DNA 결합 도메인으로부터의 절단 도메인 및 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인에 대해 이종일 수 있다. 이종 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 문헌 [2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388] 참조). DNA를 절단하는 부가의 효소가 공지되어 있다 (예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코쿠스 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한 문헌 [Linn, et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993] 참조). 이들 효소 (또는 그의 기능적 단편) 중 하나 이상은 절단 도메인 및 절단 절반-도메인의 공급원으로 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 절반-도메인은 절단 활성을 위해 이량체화를 필요로 하는, 상기에 제시된 바와 같이 임의의 뉴클레아제 또는 그의 일부분으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반-도메인을 포함하는 경우에는, 절단을 위해 2개의 융합 단백질이 필요하다. 또 다른 한편으론, 2개의 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 절반-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있거나, 또는 각각의 절단 절반-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위는 바람직하게, 서로에 대해 배치되어, 2개의 융합 단백질이 그들 각각의 표적 부위와 결합하면 절단 절반-도메인이 서로 공간적 방향으로 배치되어, 절단 절반-도메인이, 예를 들어, 이량체화에 의해 기능적 절단 도메인을 형성할 수 있도록 한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 표적 부위의 가까운 가장자리는 5 내지 10개 뉴클레오티드 또는 15 내지 18개 뉴클레오티드만큼 분리된다. 그러나, 임의의 정수의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍은 두 표적 부위 사이에 개입할 수 있다 (예를 들어, 2개 내지 50개 뉴클레오티드 쌍 또는 그 초과). 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 있다.
제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 많은 종에 존재하며 DNA (인식 부위에서)와 서열 특이적으로 결합할 수 있으며, 결합 부위에서 또는 그 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소 (예를 들어, 유형 IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하고, 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 가지고 있다. 예를 들어, 유형 IIS 효소 FokI는 한 가닥에 있는 그의 인식 부위로부터의 9개 뉴클레오티드에서, 및 다른 가닥에 있는 그의 인식 부위로부터의 13개 뉴클레오티드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,356,802; 5,436,150; 및 5,487,994; 뿐만 아니라 문헌 [Li, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim, et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim, et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982] 참조). 따라서, 한 실시양태에서, 융합 단백질은 조작될 수 있거나 조작되지 않을 수 있는, 적어도 하나의 유형 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인) 및 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인을 포함한다.
그의 절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리될 수 있는 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특별한 효소는 이량체로서 활성이다 (Bitinaite, et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575). 따라서, 본 개시내용의 목적을 위해, 개시된 융합 단백질에 사용되는 FokI 효소의 일부분이 절단 절반-도메인으로 간주된다. 따라서, 징크 핑거-FokI 융합물을 사용한 세포 서열의 표적화된 이중 가닥 절단 및/또는 표적화된 대체를 위해, 각각 FokI 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용하여 촉매적으로 활성인 절단 도메인을 재구성할 수 있다. 또 다른 한편으론, 징크 핑거 결합 도메인 및 2개의 FokI 절단 절반-도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드 분자가 또한 사용될 수 있다. 징크 핑거-FokI 융합물을 사용한 표적화된 절단 및 표적화된 서열 변경을 위한 파라미터는 본 개시내용의 다른 곳에서 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 절반-도메인은 절단 활성을 보유하거나 또는 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 다량체화 (예를 들어, 이량체화)할 수 있는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
예시적인 유형 IIS 제한 효소는 국제 특허 공개 번호 WO 07/014275 (그 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 부가의 제한 효소는 또한 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 함유하고, 이들은 본 개시내용에 의해 고려된다 (예를 들어, 문헌 [Roberts, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420] 참조).
특정 실시양태에서, 절단 도메인은 FokI 절단 도메인이다. 완전한 길이의 FokI 서열은 하기에 제시된다. 절단 도메인은 이탤릭체와 밑줄로 표시되어 있으며 (완전한 길이의 단백질의 위치 384 내지 579), 여기서 홀로(holo) 단백질 서열이 하기에 기재되어 있다 (서열식별번호: 5):
Figure pct00019
FokI로부터 유래된 절단 절반 도메인은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 아미노산 잔기 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 (상이한 잔기에 대한 야생형 아미노산 잔기의) 치환, (하나 이상의 아미노산 잔기의) 삽입 및/또는 (하나 이상의 아미노산 잔기의) 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 잔기 414-426, 443-450, 467-488, 501-502, 및/또는 521-531 (서열식별번호: 5를 기준으로 하여 넘버링됨) 중 하나 이상이 돌연변이되는데, 이는 이들 잔기가 문헌 [Miller, et al. (2007) Nat Biotechnol 25:778-784]에 기재된 그의 표적 부위와 결합된 ZFN의 분자 모델에서 DNA 백본에 가깝게 위치하기 때문이다. 특정 실시양태에서, 위치 416, 422, 447, 448, 및/또는 525에서의 하나 이상의 잔기가 돌연변이된다. 특정 실시양태에서, 돌연변이는 야생형 잔기를 임의의 상이한 잔기, 예를 들어 알라닌 (A) 잔기, 시스테인 (C) 잔기, 아스파르트산 (D) 잔기, 글루탐산 (E) 잔기, 히스티딘 (H) 잔기, 페닐알라닌 (F) 잔기, 글리신 (G) 잔기, 아스파라긴 (N) 잔기, 세린 (S) 잔기 또는 트레오닌 (T) 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 위치 416, 418, 422, 446, 448, 476, 479, 480, 481, 및/또는 525 중의 하나 이상에서의 야생형 잔기가 임의의 다른 잔기로 대체되며, 이는 R416D, R416E, S418E, S418D, R422H, S446D, K448A, N476D, I479Q, I479T, G480D, Q481A, Q481E, K525S, K525A, N527D, R416E+R422H, R416D+R422H, R416E+K448A, R416D+R422H, K448A+I479Q, K448A+Q481A. K448A+K525A를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 절단 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,914,796; 8,034,598; 및 8,623,618; 및 미국 특허 공개 번호 2011/0201055 (이들 모두의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 바와 같이, 동종이량체화를 최소화하거나 또는 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 절반-도메인 (이량체화 도메인 돌연변이체로서 지칭되기도 함)을 포함한다. FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538 (서열식별번호: 5를 기준으로 하여 넘버링됨)에서의 아미노산 잔기는 FokI 절단 절반-도메인의 이량체화에 영향을 미치는 모든 표적이다. 돌연변이는 FokI에 상동인 자연 제한 효소에서 발견되는 잔기에 대한 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 위치 416, 422, 447, 448 및/또는 525 (서열식별번호: 5를 기준으로 하여 넘버링됨)에서의 돌연변이는 양으로 하전된 아미노산을 비하전되거나 또는 음으로 하전된 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조작된 절단 절반 도메인은 하나 이상의 아미노산 잔기 416, 422, 447, 448, 또는 525에서의 돌연변이 이외에, 아미노산 잔기 499, 496 및 486에서의 돌연변이를 포함한다 (모두 서열식별번호: 5를 기준으로 하여 넘버링됨).
임의의 닉카제 도메인이 본원에 기재된 DNA 편집 복합체에 사용될 수 있다. 닉카제는 뉴클레아제가 완전한 이중 가닥 파손을 만들 수 없도록 하지만, 대신 이중 가닥 DNA의 "닉킹"인 부분 절단을 발생시키는 촉매 도메인에서의 돌연변이를 포함한다. 표적을 닉킹하기 위해 2개 이상의 절단 도메인이 필요한 실시양태에서, 전형적으로 절단 도메인 (예를 들어, 절단 절반-도메인) 중 적어도 하나는 그의 촉매 도메인에 대한 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 이는 뉴클레아제를 불활성으로 만든다 (예를 들어, 촉매적으로 불활성인 절반 도메인). 닉카제를 생산하기 위한 촉매적으로 불활성인 절단 도메인은 돌연변이된 FokI 및/또는 dCas 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,522,936; 9,631,186; 9,200,266; 및 8,703,489 및 문헌 [Guillinger, et al. (2014) Nature Biotech. 32(6):577-582; Cho, et al. (2014) Genome Res. 24(1):132-141] 참조). 이들 촉매적으로 불활성인 절단 도메인은 촉매적으로 활성인 도메인과 조합하여 닉카제로서 작용하여, 단일 가닥 절단을 만들 수 있다. 부가의 닉카제가 또한 관련 기술분야, 예를 들어, 문헌 [McCaffery, et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(2):e11. doi:10.1093/nar/gkv878. Epub 2015 Oct 19]에 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 닉카제는 촉매적으로 불활성인 FokI 절단 도메인을 포함하는 뉴클레아제 닉카제, 예를 들어 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 닉카제 또는 TAL-이펙터 도메인 (TALEN) 닉카제를 포함한다. FokI의 촉매 도메인에서 돌연변이될 수 있는 아미노산의 비-제한적인 예는 아미노산 잔기 450, 467 및/또는 469 (야생형을 기준으로 하여 결정된 바와 같음)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 점 돌연변이는 절단 절반-도메인의 촉매 활성을 불활성화하기 위해 절대적인 이종 이량체의 한 구성원의 촉매 도메인에서 만들어진다. 예를 들어, 위치 450은 D에서 N으로 돌연변이될 수 있고, 위치 467은 D에서 A로 돌연변이될 수 있으며; 위치 469는 K에서 A로 돌연변이될 수 있다. 다른 아미노산은 이들 또는 다른 위치에서 치환될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,522,936; 9,631,186; 8,703,489 및 9,200,266 및 문헌 [Guillinger, et al. (2014) Nature Biotech. 32(6):577-582; Cho, et al. (2014) Genome Res. 24(1):132-141] 참조). 촉매적으로 불활성인 절단 도메인은 촉매적으로 활성인 도메인과 조합하여 닉카제로서 작용하여, 단일 가닥 절단을 만들 수 있다. 부가의 닉카제가 또한 관련 기술분야, 예를 들어, 문헌 [McCaffery, et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(2):e11. doi:10.1093/nar/gkv878. Epub 2015 Oct 19]에 공지되어 있다. 임의의 뉴클레아제 (예를 들어, ZFN 또는 TALEN 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제)는 이중 가닥 절단을 만드는 뉴클레아제 내의 절단 도메인 대신 단일 가닥 절단을 만드는 절단 도메인을 사용함으로써 닉카제가 될 수 있다.
FokI 도메인은 또한 하나 이상의 부가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,914,796; 8,034,598; 8,961,281; 및 8,623,618; 미국 특허 공개 번호 2008/0131962 및 2012/0040398에 기재된 바와 같은 절대적인 이종 이량체를 형성하는 FokI의 조작된 절단 절반-도메인을 포함한다. 따라서, 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 융합 단백질을 제공하며, 여기서 조작된 절단 절반-도메인은 위치 416, 422, 447, 448, 또는 525 (서열식별번호: 5를 기준으로 하여 넘버링됨)에서의 하나 이상의 돌연변이 이외에, 위치 486에서의 야생형 Gln (Q) 잔기가 Glu (E) 잔기로 대체되고, 위치 499에서의 야생형 Ile (I) 잔기가 Leu (L) 잔기로 대체되고, 위치 496에서의 야생형 Asn (N) 잔기가 Asp (D) 또는 Glu (E) 잔기로 대체되는 ("ELD"또는 "ELE") 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조작된 절단 절반 도메인은 야생형 FokI 절단 절반 도메인으로부터 유래되고, 아미노산 잔기 416, 422, 447, 448, 또는 525에서의 하나 이상의 돌연변이 이외에, 야생형 FokI (서열식별번호: 5)를 기준으로 하여 넘버링된 아미노산 잔기 490, 538 및 537에서의 돌연변이를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 융합 단백질을 제공하며, 여기서 조작된 절단 절반-도메인은 위치 416, 422, 447, 448, 또는 525에서의 하나 이상의 돌연변이 이외에, 위치 490에서의 야생형 Glu (E) 잔기가 Lys (K) 잔기로 대체되고, 위치 538에서의 야생형 Ile (I) 잔기가 Lys (K) 잔기로 대체되며, 위치 537에서의 야생형 His (H) 잔기가 Lys (K) 잔기 또는 Arg (R) 잔기로 대체되는 ("KKK" 또는 "KKR") 폴리펩티드를 포함한다 (본원에 참조로 포함되는 U.S. 8,962,281 참조) (예를 들어, 미국 특허 번호 7,914,796; 8,034,598; 및 8,623,618 참조; 그의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 참조로 포함된다). 다른 실시양태에서, 조작된 절단 절반 도메인은 "샤키(Sharkey)" 및/또는 "샤키 돌연변이"를 포함한다 (문헌 [Guo, et al. (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107] 참조).
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 닉카제는 야생형 FokI 절단 절반 도메인으로부터 유래된 조작된 절단 절반 도메인을 포함하고, 아미노산 잔기 416, 422, 447, 448, 또는 525에서의 하나 이상의 돌연변이 이외에, 야생형 FokI 또는 FokI 동족체를 기준으로 하여 넘버링된 아미노산 잔기 490, 및 538에서의 돌연변이를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 융합 단백질을 제공하며, 여기서 조작된 절단 절반-도메인은 위치 416, 422, 447, 448, 또는 525에서의 하나 이상의 돌연변이 이외에, 위치 490에서의 야생형 Glu (E) 잔기가 Lys (K) 잔기로 대체되고, 위치 538에서의 야생형 Ile (I) 잔기가 Lys (K) 잔기로 대체되는 ("KK") 폴리펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 설명은 융합 단백질을 제공하며, 여기서 조작된 절단 절반-도메인은 위치 416, 422, 447, 448, 또는 525에서의 하나 이상의 돌연변이 이외에, 위치 486에서의 야생형 Gln (Q) 잔기가 Glu (E) 잔기로 대체되고, 위치 499에서의 야생형 Ile (I) 잔기가 Leu (L) 잔기로 대체되는 ("EL") 폴리펩티드를 포함한다 (본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,034,598 참조).
일부 측면에서, 본 설명은 융합 단백질을 제공하며, 여기서 조작된 절단 절반-도메인은 FokI 촉매 도메인 내의 위치 387, 393, 394, 398, 400, 402, 416, 422, 427, 434, 439, 441, 447, 448, 469, 487, 495, 497, 506, 516, 525, 529, 534, 559, 569, 570, 571 중 하나 이상에서의 야생형 아미노산 잔기가 돌연변이되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 야생형 아미노산을 양으로 하전된 잔기에서 중성 잔기 또는 음으로 하전된 잔기로 변경시킨다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, 기재된 돌연변이체는 또한, 하나 이상의 부가의 돌연변이를 포함하는 FokI 도메인에서 만들어질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이들 부가의 돌연변이는 이량체화 도메인 내에, 예를 들어 위치 418, 432, 441, 481, 483, 486, 487, 490, 496, 499, 523, 527, 537, 538 및/또는 559에 있다. 돌연변이의 비-제한적인 예는 위치 393, 394, 398, 416, 421, 422, 442, 444, 472, 473, 478, 480, 525 또는 530에서의 임의의 절단 도메인 (예를 들어, FokI 또는 FokI의 동족체)의 야생형 잔기를 임의의 아미노산 잔기로 돌연변이 (예를 들어, 치환)시킨 것 (예를 들어, K393X, K394X, R398X, R416S, D421X, R422X, K444X, S472X, G473X, S472, P478X, G480X, K525X, 및 A530X, 여기서 제1 잔기는 야생형을 나타내고, X는 야생형 잔기를 대체하는 임의의 아미노산을 지칭한다)을 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 E, D, H, A, K, S, T, D 또는 N이다. 다른 예시적인 돌연변이는 S418E, S418D, S446D, K448A, I479Q, I479T, Q481A, Q481N, Q481E, A530E 및/또는 A530K를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 완전한 길이의 FokI 야생형 절단 도메인 및 그의 동족체를 기준으로 하여 넘버링된다. 특정 실시양태에서, 조합은 416과 422, 위치 416에서의 돌연변이와 K448A, K448A와 I479Q, K448A와 Q481A 및/또는 K448A와 위치 525에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 위치 416에서의 야생형 잔기는 Glu (E) 잔기로 대체될 수 있고 (R416E), 위치 422에서의 야생형 잔기는 His (H) 잔기로 대체되며 (R422H), 위치 525에서의 야생형 잔기는 Ala (A) 잔기로 대체된다. 본원에 기재된 바와 같은 절단 도메인은 위치 432, 441, 483, 486, 487, 490, 496, 499, 527, 537, 538 및/또는 559에서, 예를 들어 이량체화 도메인 돌연변이체 (예를 들어, ELD, KKR) 및/또는 닉카제 돌연변이체 (촉매 도메인에 대한 돌연변이)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 부가의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 돌연변이를 갖는 절단 절반-도메인은 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 이종 이량체를 형성한다.
뉴클레아제는 소위 "분할 효소" 기술을 사용하여 핵산 표적 부위에서 생체 내 어셈블리될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2009/0068164 참조). 이러한 분할 효소의 성분은 별도의 발현 구축물 상에서 발현될 수 있거나, 또는 예를 들어, 자기 절단 2A 펩티드 또는 IRES 서열에 의해 개별 성분이 분리되는 하나의 오픈 리딩 프레임에서 연결될 수 있다. 성분은 개별 징크 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.
뉴클레아제 (예를 들어, ZFN 및/또는 TALEN)는, 예를 들어 미국 특허 번호 8,563,314에 기재된 바와 같이 효모 기반 염색체 시스템에서 사용 전에 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
ZFN 또는 TALEN 닉카제 이외에 또는 그 대신, DNA 편집 복합체는 CRISPR/Cas 닉카제를 포함할 수 있다. CRISPR/Cas 닉카제의 비-제한적인 예가 미국 특허 번호 9,840,713; 9,770,489; 9,567,604; 8,932,814; 8,889,356; 8,697,359; 8,771,945; 8,795,965; 8,865,406; 8,871,445; 8,889,356; 8,895,308; 8.906,616; 8,932,814; 8,945,839; 8,945,839; 8,999,641; 10,000,772 등에 기재되어 있다.
상기 시스템의 RNA 성분을 코딩하는 CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부) 유전자좌와, 단백질을 코딩하는 Cas (CRISPR 관련) 유전자좌 (문헌 [Jansen, et al. (2002) Mol. Microbiol. 43:1565-1575; Makarova, et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:482-496; Makarova, et al. (2006) Biol. Direct 1:7; Haft, et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1:e60])가 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 유전자 서열을 구성한다. 미생물 숙주에서 CRISPR 유전자좌는 CRISPR 매개 핵산 절단의 특이성을 프로그래밍할 수 있는 비-코딩 RNA 요소뿐만 아니라 CRISPR 관련 (Cas) 유전자의 조합을 함유한다.
유형 II CRISPR은 가장 널리 특징 규명된 시스템 중 하나이며 4가지 순차적 단계로 표적화된 DNA 이중 가닥 파손을 수행한다. 첫째, 2개의 비-코딩 RNA인 프리-crRNA 어레이와 tracrRNA가 CRISPR 유전자좌로부터 전사된다. 둘째, tracrRNA는 프리-crRNA의 반복 영역과 혼성화하고, 프리-crRNA를 개별 스페이서 서열을 함유하는 성숙한 crRNA로 프로세싱하는 것을 매개한다. 셋째, 성숙한 crRNA:tracrRNA 복합체는 표적 인식에 대한 부가의 요구 사항인, crRNA 상의 스페이서와 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 옆에 있는 표적 DNA 상의 프로토스페이서 간의 왓슨 크릭 염기쌍 형성을 통해 Cas9를 표적 DNA로 유도한다. 마지막으로, Cas9는 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에서 이중 가닥 파손을 생성한다. CRISPR/Cas 시스템의 활성은 하기 3가지 단계를 포함한다: (i) '적응'이라는 프로세스에서 향후 공격을 방지하기 위해 외래 DNA 서열을 CRISPR 어레이에 삽입하는 단계, (ii) 관련 단백질의 발현뿐만 아니라 어레이의 발현 및 프로세싱 단계에 이어 (iii) 외래 핵산에 대한 RNA 매개 간섭 단계. 따라서, 박테리아 세포에서는, 소위 'Cas' 단백질 중 몇 가지가 CRISPR/Cas 시스템의 자연적 기능과 관련되어 있으며 기능, 예컨대 외래 DNA의 삽입 등에서 역할을 한다.
초기에는, Cas가 가이드 RNA의 리보스-인산염 백본과 광범위하게 접촉하여, 초기 DNA 질문에 필요한 10-nt RNA 시드 서열을 미리 배열한다. 미리 배열된 시드 서열 이외에, 5'-NGG-3' PAM 인식을 담당하고 가이드가 결여된 apo 구조에서 무질서한 Cas 단백질 R1333 및 R1335의 PAM 상호작용 부위는 표적 DNA와의 접촉 전에 사전 배치되며, 이는 sgRNA 부하를 통해 Cas가 DNA 인식 적격 구조를 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 일단 Cas가 그의 가이드 RNA와 결합하면, 복합체는 상보적인 표적 DNA 부위를 검색할 준비가 된다. 표적 검색 및 인식에는 표적 DNA 내의 20-nt 스페이서 서열과 프로토스페이서 간의 상보적 염기쌍 형성뿐만 아니라 표적 부위에 인접한 보존된 PAM 서열의 존재 모두가 필요하다. PAM 서열은 자기 서열과 비-자기 서열 간을 구별하는 데 중요하다. 단일 분자 실험은 잠재적인 가이드 RNA 상보성을 위해 플랭킹 DNA를 조사하기 전에 적당한 PAM 서열을 프로빙함으로써 Cas가 표적 DNA 검색 프로세스를 시작한다는 것을 입증해 주었다. 표적 인식은 적절한 PAM 서열을 함유하지 않는 DNA로부터 Cas가 신속하게 해리되는 3차원 충돌을 통해 발생하며, 체류 시간은 적당한 PAM이 존재할 때 가이드 RNA와 인접 DNA 간의 상보성에 따라 달라진다. 일단 Cas가 적절한 PAM이 있는 표적 부위를 찾으면, 이는 PAM 인접 핵 형성 부위에서 국소 DNA 용융을 촉발시킨 다음, RNA 가닥 침입을 촉발시켜 RNA-DNA 혼성체 및 PAM 근위 말단에서 PAM 원위 말단으로 변위된 DNA 가닥 (R-루프라고 함)을 형성한다. PAM 이중 나선은 보존된 HNH를 함유하는 뉴클레아제 (NUC) 로브인 알파 나선 인식 (REC) 로브와 분할 RuvC 뉴클레아제 도메인 사이의 양으로 하전된 홈에 자리 잡고 있으며, PAM 함유 비-표적 가닥은 주로 C-말단 도메인 (CTD)에 있다. N으로 표시되는 PAM 서열 내의 제1 염기는 그의 대응물과 염기쌍을 유지하지만 Cas와 상호작용하지 않는다. 보존된 PAM GG 디뉴클레오티드는 CTD의 β-헤어핀에 위치하는 2개의 아르기닌 잔기 (R1333 및 R1335)와 염기 특이적 수소 결합 상호작용에 의해 주요 홈에서 직접 판독된다. GG 디뉴클레오티드와의 염기 특이적 접촉 이외에, Cas의 CTD는 PAM 함유 비-표적 DNA 가닥의 데옥시리보스-인산염 백본과 수많은 수소 결합 상호작용을 한다. 그러나, Cas와 PAM에 상보적인 표적 가닥 뉴클레오티드 간에는 직접적인 접촉이 관찰되지 않았다 (Jiang and Doudna (2017) Annual Review of Biophysics 46:505-529). 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 개시된 Cas는 PAM과 무관하다. 일부 실시양태에서, 상기 개시된 바와 같은 위치 R1333 및 R1335는 PAM 인식을 변경시키는 돌연변이를 포함한다 (Anders, et al. (2014) Nature 513(7519):569-573).
일부 실시양태에서, CRISPR-Cpf1 시스템이 사용된다. 프란시셀라 종( Francisella spp.)에서 확인된 CRISPR-Cpf1 시스템은 인간 세포에서 강력한 DNA 간섭을 매개하는 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템이다. 기능적으로 보존되어 있지만, Cpf1 및 Cas9는 가이드 RNA 및 기질 특이성을 포함한 많은 측면에서 상이하다 (문헌 [Fagerlund, et al. (2015) Genom Bio 16:251] 참조). Cas9와 Cpf1 단백질 간의 주요 차이점은 Cpf1은 tracrRNA를 활용하지 않으므로 crRNA만 필요하다는 것이다. FnCpf1 crRNA는 42-44개 뉴클레오티드 길이 (19개 뉴클레오티드 반복부 및 23-25개 뉴클레오티드 스페이서)이며, 2차 구조를 유지하는 서열 변화를 허용하는 단일 스템-루프를 함유한다. 또한, Cpf1 crRNA는 Cas9에 의해 요구되는 약 100개 뉴클레오티드 조작된 sgRNA보다 상당히 더 짧으며, FnCpfl에 대한 PAM 요구 사항은 변위된 가닥에 있는 5'-TTN-3' 및 5'-CTA-3'이다. Cas9와 Cpf1 둘 다가 표적 DNA에서 이중 가닥 파손을 만들긴 하지만, Cas9는 그의 RuvC 유사 및 HNH 유사 도메인을 사용하여 가이드 RNA의 시드 서열 내에서 평활 말단 절단을 만드는 반면, Cpf1은 RuvC 유사 도메인을 사용하여 시드의 외부에 엇갈린 절단을 생산한다. Cpf1은 중요한 시드 영역으로부터 멀리 떨어져 엇갈린 절단을 하기 때문에, NHEJ는 표적 부위를 방해하지 않을 것이므로, 원하는 HDR 재결합 이벤트가 발생할 때까지 Cpf1이 동일한 부위를 계속 절단할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서, 용어 "Cas"는 Cas9 단백질과 Cfp1 단백질 둘 다를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은, "CRISPR/Cas 시스템"은 뉴클레아제, 닉카제 및/또는 전사 인자 시스템을 모두 포함한, CRISPR/Cas 및/또는 CRISPR/Cfp1 시스템 둘 다를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 다른 Cas 단백질이 사용될 수 있다. 일부 예시적인 Cas 단백질은 Cas9, Cpf1 (Cas12a로서 공지되기도 함), C2c1, C2c2 (Cas13a로서 공지되기도 함), C2c3, Cas1, Cas2, Cas4, CasX 및 CasY를 포함하고; 그의 조작된 및 자연 변이체 (문헌 [Burstein, et al. (2017) Nature 542:237-241]), 예를 들어 HF1/spCas9 (문헌 [Kleinstiver, et al. (2016) Nature 529:490-495; Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm Genome 28(7):247-261]); 분할 Cas9 시스템 (문헌 [Zetsche, et al. (2015) Nat Biotechnol 33(2):139-142]), 인테인-익스테인 시스템을 기반으로 하는 트랜스 스플라이스된 Cas9 (문헌 [Troung, et al. (2015) Nucl Acid Res 43(13):6450-8]); 미니-SaCas9 (문헌 [Ma, et al. (2018) ACS Synth Biol 7(4):978-985])를 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서, 용어 "Cas"는 자연 및 조작된 모든 Cas 변이체 단백질을 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같은, "CRISPR/Cas 시스템"은 뉴클레아제, 닉카제 및/또는 전사 인자 시스템 모두를 포함한 임의의 CRISPR/Cas 시스템을 지칭한다.
특정 실시양태에서, Cas 단백질은 자연적으로 발생하는 Cas 단백질의 "기능적 유도체"일 수 있다. 천연 서열 폴리펩티드의 "기능적 유도체"는 천연 서열 폴리펩티드와 공통되는 정성적 생물학적 특성을 갖는 화합물이다. "기능적 유도체"는 천연 서열의 단편 및 천연 서열 폴리펩티드 및 그의 단편의 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 단 이들은 상응하는 천연 서열 폴리펩티드와 공통적인 생물학적 활성을 갖는다. 본원에서 고려되는 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수 분해할 수 있는 기능적 유도체의 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체, 공유 변형물 및 그의 융합물, 예컨대 유도체 Cas 단백질을 모두 포괄한다. Cas 폴리펩티드 또는 그의 단편의 적합한 유도체는 Cas 단백질 또는 그의 단편의 돌연변이체, 융합물, 공유 변형물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. Cas 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 Cas 단백질뿐만 아니라 Cas 단백질 또는 그의 단편의 유도체는 세포로부터 수득될 수 있거나 또는 화학적으로 합성될 수 있거나 또는 이들 두 절차의 조합에 의해 합성될 수 있다. 세포는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하는 세포이거나, 또는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하고 더 높은 발현 수준에서 내인성 Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작되거나 또는 외인성으로 도입된 핵산으로부터 Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작되는 세포일 수 있으며, 상기 핵산은 내인성 Cas와 동일하거나 상이한 Cas를 코딩한다. 일부 경우에는, 세포가 Cas 단백질을 자연적으로 생산하지 않고 Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 AAV 벡터를 통한 전달을 위한 작은 Cas9 오르소로그이다 (Ran, et al. (2015) Nature 510:186).
전달
본원에 기재된 DNA 편집 복합체 (또는 그의 성분 분자)는, 예를 들어 단백질 및/또는 mRNA 성분의 주입에 의한 것을 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 표적 세포로 전달될 수 있다. 전달은 단리된 세포 (이는 결국, 생체 외 세포 요법을 위해 살아있는 대상체에게 투여될 수 있다) 또는 임의의 적합한 수단을 통해 살아있는 대상체에게 이루어질 수 있다. 유전자 편집 분자를 세포 및 대상체에게 전달하는 것은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
적합한 세포는 진핵 및 원핵 세포 및/또는 세포주를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 세포 또는 이러한 세포로부터 생성된 세포주의 비-제한적인 예는 T-세포, COS, CHO (예를 들어, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (예를 들어, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), 및 perC6 세포뿐만 아니라 곤충 세포, 예컨대 스포도프테라 푸기페르다(Spodoptera fugiperda) (Sf), 또는 진균 세포, 예컨대 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia) 및 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포주는 CHO-K1, MDCK 또는 HEK293 세포주이다. 적합한 세포는 또한, 줄기 세포, 예컨대 예로서, 배아 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포 (iPS 세포), 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 단백질 전달 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824 (이들 모두의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있다.
본원에 기재된 바와 같은 DNA 편집 복합체는 또한 하나 이상의 성분 (예를 들어, 융합 분자)을 코딩하는 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 부가적으로, 부가의 핵산 (예를 들어, 공여자)이 또한 이러한 벡터를 통해 전달될 수 있다. 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노 관련 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 벡터 시스템이 사용될 수 있다 (또한 미국 특허 번호 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824 참조) (그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다). 더욱이, 이들 벡터 중 임의의 것이 하나 이상의 DNA 결합 단백질 코딩 서열 및/또는 부가의 핵산을 적절하게 포함할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 DNA 결합 단백질이 세포 및 적절하게 부가의 DNA에 도입될 때, 이들은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 상에서 운반될 수 있다. 다수의 벡터가 사용되는 경우, 각각의 벡터는 원하는 대로 하나 또는 다수의 DNA 결합 단백질을 코딩하는 서열 및 부가의 핵산을 포함할 수 있다. 통상적인 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법은 세포 (예를 들어, 포유 동물 세포) 및 표적 조직에서 조작된 DNA 결합 단백질을 코딩하는 핵산을 도입하고 원하는 대로 부가의 뉴클레오티드 서열을 공동 도입하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 또한 핵산 (예를 들어, DNA 결합 단백질 및/또는 공여자를 코딩함)을 시험관 내 세포에 투여하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산은 생체 내 또는 생체 외 유전자 요법 용도를 위해 투여된다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 있는 그대로의 핵산, 및 전달 비히클, 예컨대 리포솜 또는 폴록사머와 복합체 형성된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이러한 바이러스는 세포로 전달된 후 에피솜 또는 통합된 게놈을 가지고 있다. 유전자 요법 절차의 검토를 위해, 문헌 [Anderson (1992) Science 256:808-813; Nabel & Felgner (1993) TIBTECH 11:211-217; Mitani & Caskey (1993) TIBTECH 11:162-166; Dillon (1993) TIBTECH 11:167-175; Miller (1992) Nature 357:455-460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10):1149-1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36; Kremer & Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1):31-44; Haddada, et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Boehm (eds.) (1995); 및 Yu, et al. (1994) Gene Therapy 1:13-26]을 참조한다.
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 전기천공, 리포펙션, 미세 주입, 바이오리 스틱스, 비로좀, 리포좀, 면역 리포좀, 폴리양이온 또는 지질:핵산 접합체, 있는 그대로의 DNA, mRNA, 인공 비리온 및 DNA의 작용제 증강 흡수를 포함한다. 예를 들어, 소니트론(Sonitron) 2000 시스템 [리치-마르(Rich-Mar)]을 사용한 소노포레이션이 또한 핵산의 전달에 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산이 mRNA로서 전달된다. 번역 효율성 및/또는 mRNA 안정성을 증가시키기 위해 캡핑된 mRNA를 사용하는 것이 또한 바람직하다. 특히 바람직한 것은 ARCA (항-역전 캡 유사체) 캡 또는 그의 변이체이다 (본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 7,074,596 및 8,153,773 참조).
부가의 예시적인 핵산 전달 시스템은 아맥사 바이오시스템즈 (Amaxa Biosystems; 독일 쾰른), 맥스사이트, 인크. (Maxcyte, Inc.; 미국 메릴랜드주 록빌), BTX 분자 전달 시스템 (BTX Molecular Delivery Systems; 미국 매사추세츠주 홀리스턴) 및 코페르니쿠스 테라퓨틱스 인크.(Copernicus Therapeutics Inc.)에 의해 제공된 것을 포함한다 (예를 들어 미국 특허 번호 6,008,336 참조). 리포펙션은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,049,386; 4,946,787; 및 4,897,355에 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다 [예를 들어, 트랜스펙탐(Transfectam™), 리포펙틴(Lipofectin™), 및 리포펙타민(Lipofectamine™) RNAiMAX]. 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체 인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 펠그너(Felgner), 국제 특허 공개 번호 WO 91/17424 및 WO 91/16024의 것을 포함한다. 전달은 세포 (생체 외 투여) 또는 표적 조직 (생체 내 투여)에 대한 것일 수 있다.
표적화된 리포좀을 포함한 지질:핵산 복합체, 예컨대 면역 지질 복합체의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Crystal (1995) Science 270:404-410; Blaese, et al. (1995) Cancer Gene Ther. 2:291-297; Behr, et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:382-389; Remy, et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:647-654; Gao, et al. (1995) Gene Therapy 2:710-722; Ahmad, et al. (1992) Cancer Res. 52:4817-4820]; 미국 특허 번호 4,186,183; 4,217,344; 4,235,871; 4,261,975; 4,485,054; 4,501,728; 4,774,085; 4,837,028; 및 4,946,787 참조).
부가의 전달 방법은 엔제네익(EnGeneIC) 전달 비히클 (EDV)에 전달될 핵산을 패키징하는 것의 사용을 포함한다. 이들 EDV는 항체의 하나의 아암(arm)이 표적 조직에 대한 특이성을 가지며 다른 아암이 EDV에 대한 특이성을 갖는 이중 특이적 항체를 사용하여 표적 조직에 특이적으로 전달된다. 항체는 EDV를 표적 세포 표면으로 가져오고, 이어서 EDV는 세포내 이입에 의해 세포로 이동된다. 일단 세포에 들어가면, 그 내용물이 방출된다 (문헌 [MacDiarmid, et al. (2009) Nature Biotechnology 27(7):643] 참조).
원하는 대로 조작된 DNA 결합 단백질 및/또는 공여자 (예를 들어 CAR 또는 ACTR)를 코딩하는 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 바이러스를 신체의 특이적 세포로 표적화하고 바이러스 페이로드를 핵으로 트래피킹하는 데에 고도로 진화된 프로세스를 활용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접 투여될 수 있거나 (생체 내) 또는 세포를 시험관 내에서 처리하는 데 사용될 수 있으며 변형된 세포는 환자에게 투여된다 (생체 외). 핵산의 전달을 위한 통상적인 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련, 백시니아 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 숙주 게놈에서의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 관련 바이러스 유전자 전달 방법으로 가능하며, 종종 삽입된 트랜스진의 장기간 발현을 발생시킨다. 부가적으로, 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 높은 형질도입 효율이 관찰되었다.
레트로바이러스의 지향성은 외래 외피 단백질을 혼입함으로써 변경될 수 있으며, 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장할 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입하거나 감염시킬 수 있고 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생산할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 따라 다르다. 레트로바이러스 벡터는 6 내지 10 kb 이하의 외래 서열에 대한 패키징 용량을 가진 시스-작용성 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소 시스-작용성 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이는 치료 유전자를 표적 세포에 통합하여 영구적인 트랜스진 발현을 제공하는 데 사용된다. 광범위하게 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스 (MuLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GaLV), 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 및 그의 조합을 기반으로 하는 벡터를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Buchscher, et al. (1992) J. Virol. 66:2731-2739; Johann, et al. (1992) J. Virol. 66:1635-1640; Sommerfelt, et al. (1990) Virol. 176:58-59; Wilson, et al. (1989) J. Virol. 63:2374-2378; Miller, et al. (1991) J. Virol. 65:2220-2224]; 국제 특허 공개 번호 WO 94/26877 참조).
일시적 발현이 선호되는 적용에서는, 아데노바이러스 기반 시스템을 사용할 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율이 가능하며 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터를 이용하여, 높은 역가 및 높은 수준의 발현이 수득되었다. 이러한 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 아데노 관련 바이러스 ("AAV") 벡터는 또한, 예를 들어, 핵산 및 펩티드의 시험관 내 생산에서, 및 생체 내 및 생체 외 유전자 요법 절차를 위해, 표적 핵산으로 세포를 형질도입하는 데 사용된다 (예를 들어, 문헌 [West, et al. (1987) Virology 160:38-47]; 미국 특허 번호 4,797,368; 국제 특허 공개 번호 WO 93/24641; 문헌 [Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invest. 94:1351] 참조). 재조합 AAV 벡터의 구축은 미국 특허 번호 5,173,414; 문헌 [Tratschin, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260; Tratschin, et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Hermonat & Muzyczka (1984) PNAS USA 81:6466-6470; 및 Samulski, et al. (1989) J. Virol. 63:03822-3828]을 포함한 수많은 공보에 기재되어 있다.
적어도 6개의 바이러스 벡터 접근법이 현재 임상 시험에서 유전자 전달을 위해 이용가능하며, 이는 형질도입제를 생성하기 위해 헬퍼 세포주에 삽입된 유전자에 의한 결함 벡터의 상보성을 수반하는 접근법을 활용한다.
pLASN 및 MFG-S는 임상 시험에 사용된 레트로바이러스 벡터의 예이다 (Dunbar, et al. (1995) Blood 85:3048-305; Kohn, et al. (1995) Nat. Med. 1:1017-102; Malech, et al. (1997) PNAS USA 94(22):12133-12138). PA317/pLASN이 유전자 요법 시험에 사용된 첫 번째 치료용 벡터였다 (Blaese, et al. (1995) Science 270:475-480). MFG-S 패키지 벡터에 대해 50% 이상의 형질도입 효율이 관찰되었다 (Ellem, et al. (1997) Immunol Immunother. 44(1):10-20; Dranoff, et al. (1997) Hum. Gene Ther. 1:111-2).
재조합 아데노 관련 바이러스 벡터 (rAAV)는 결함이 있고 비병원성인 파보바이러스 아데노 관련 유형 2 바이러스를 기반으로 하는 유망한 대체 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 트랜스진 발현 카세트를 플랭킹하는 AAV 145 bp 역위 말단 반복부만을 보유하는 플라스미드로부터 유래된다. 형질도입된 세포의 게놈으로의 통합으로 인한 효율적인 유전자 전달과 안정적인 트랜스진 전달이, 이러한 벡터 시스템에 대한 주요 특징이다 (Wagner, et al. (1998) Lancet 351(9117):1702-3, Kearns, et al. (1996) Gene Ther. 9:748-55). AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV8.2, AAV9 및 AAVrh10을 포함한 다른 AAV 혈청형 및 위형화된 AAV, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6이 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 복제 결핍성 재조합 아데노바이러스 벡터 (Ad)는 높은 역가로 생산될 수 있으며 많은 상이한 세포 유형을 쉽게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 트랜스진이 Ad E1a, E1b 및/또는 E3 유전자를 대체하도록 조작되며; 이어서 복제 결함 벡터는 트랜스에서 결실된 유전자 기능을 공급하는 인간 293 세포에서 증식될 수 있다. Ad 벡터는 분열되지 않은 분화된 세포, 예컨대 간, 신장 및 근육에서 발견되는 것을 포함하여, 생체 내에서 여러 유형의 조직을 형질도입할 수 있다. 기존의 Ad 벡터는 큰 운반 능력을 가지고 있다. 임상 시험에서 Ad 벡터 사용의 예는 근육내 주사를 통한 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오티드 요법을 수반하였다 (Sterman et al. (1998) Hum. Gene Ther. 7:1083-1089). 임상 시험에서 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터의 사용의 부가의 예는 하기 문헌을 포함한다 (Rosenecker, et al. (1996) Infection 24(1):5-10; Sterman, et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9(7):1083-1089; Welsh, et al. (1995) Hum. Gene Ther. 2:205-218; Alvarez, et al. (1997) Hum. Gene Ther. 5:597-613; Topf, et al. (1998) Gene Ther. 5:507-513; Sterman, et al. (1998) Hum. Gene Ther. 7:1083-1089).
패키징 세포는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는 데 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키징하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터는 통상적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자로 패키징하는 생산자 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주로의 후속 통합에 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하고 (적용가능한 경우), 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 코딩하는 발현 카세트로 대체된다. 누락된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 게놈으로의 통합에 필요한 AAV 게놈으로부터의 역위 말단 반복부 (ITR) 서열만을 보유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap을 코딩하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만 ITR 서열이 결여된 세포주에 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스에 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 상당한 양으로 패키징되지 않는다. 예를 들어, 아데노바이러스가 AAV보다 더 감수성인 열처리를 통해 아데노바이러스에 의한 오염을 감소시킬 수 있다.
많은 유전자 요법 적용에서, 유전자 요법 벡터는 특별한 조직 유형에 대해 높은 정도의 특이성으로 전달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스의 외부 표면 상의 바이러스 코트 단백질과의 융합 단백질로서 리간드를 발현함으로써 주어진 세포 유형에 대한 특이성을 갖도록 바이러스 벡터를 변형시킬 수 있다. 리간드는 관심 세포 유형에 존재하는 것으로 공지된 수용체에 대한 친화성을 갖도록 선택된다. 예를 들어, 문헌 [Han, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751]에는 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스가 gp70에 융합된 인간 헤레굴린을 발현하도록 변형될 수 있으며, 재조합 바이러스가 인간 표피 성장 인자 수용체를 발현하는 특정 인간 유방암 세포를 감염시킨다고 보고되었다. 이러한 원리는 다른 바이러스-표적 세포 쌍으로 확장될 수 있는데, 여기서 표적 세포는 수용체를 발현하고 바이러스는 세포 표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현한다. 예를 들어, 사상 파지(filamentous phage)는 사실상 임의의 선택된 세포 수용체에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 항체 단편 (예를 들어, FAB 또는 Fv)을 표시하도록 조작될 수 있다. 상기 설명이 주로 바이러스 벡터에 적용되긴 하지만, 동일한 원리가 비-바이러스 벡터에도 적용될 수 있다. 이러한 벡터는 특이적 표적 세포에 의한 흡수를 선호하는 특이적 흡수 서열을 함유하도록 조작될 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템에 대한 전달 방법은 상기 기재된 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 동물 모델에서, 시험관 내 전사된 Cas 코딩 mRNA 또는 재조합 Cas 단백질은 유리 바늘을 사용하여 게놈 편집된 동물에게 직접 1-세포 단계 배아에 주입될 수 있다. Cas를 발현하고 시험관 내 세포에서 RNA를 가이드하기 위해, 전형적으로 이를 코딩하는 플라스미드를 리포펙션 또는 전기천공을 통해 세포로 형질감염시킨다. 또한 재조합 Cas 단백질은 시험관 내 전사된 가이드 RNA와 복합체를 형성할 수 있으며, 여기서 Cas-가이드 RNA 리보핵단백질이 관심 세포에 의해 흡수된다 (Kim, et al. (2014) Genome Res 24(6):1012). 치료 목적으로, Cas 및 가이드 RNA는 바이러스 기술과 비-바이러스 기술의 조합에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas를 코딩하는 mRNA는 나노 입자 전달을 통해 전달될 수 있는 반면, 가이드 RNA 및 임의의 원하는 트랜스진 또는 복구 주형은 AAV를 통해 전달된다 (Yin, et al. (2016) Nat Biotechnol 34(3):328).
유전자 요법 벡터는 전형적으로 하기 기재되는 바와 같이, 전신 투여 (예를 들어, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하 또는 두개 내 주입) 또는 국소 적용에 의해 개별 환자 (대상체)에게 투여함으로써 생체 내 전달될 수 있다. 또 다른 한편으론, 벡터는 생체 외 세포, 예컨대 개별 환자로부터 체외 이식된 세포 (예를 들어, 림프구, 골수 흡인물, 조직 생검) 또는 범용 공여자 조혈 줄기 세포에 전달될 수 있으며, 이어서 통상적으로 벡터를 혼입시킨 세포에 대한 선별 후에, 환자에게 세포를 다시 체내 이식할 수 있다.
진단, 연구, 이식 또는 유전자 요법을 위한 생체 외 세포 형질감염 (예를 들어, 숙주 유기체에 형질감염된 세포의 재주입을 통함)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 대상 유기체로부터 단리되고, DNA 결합 단백질 핵산 (유전자 또는 cDNA)으로 형질감염되고, 대상 유기체 (예를 들어, 환자)로 다시 주입된다. 생체 외 형질감염에 적합한 다양한 세포 유형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Freshney, et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)] 및 환자로부터 세포를 단리하고 배양하는 방법의 논의에 대해 상기 문헌에 인용된 참고 문헌 참조).
한 실시양태에서, 줄기 세포는 세포 형질감염 및 유전자 요법을 위한 생체 외 절차에 사용된다. 줄기 세포를 사용하는 이점은 시험관 내에서 다른 세포 유형으로 분화될 수 있거나, 또는 골수에 생착될 포유 동물 (예컨대, 세포의 공여자)에 도입될 수 있다는 것이다. 시토카인, 예컨대 GM-CSF, IFN-γ 및 TNF-α를 사용하여 시험관 내에서 CD34+ 세포를 임상적으로 중요한 면역 세포 유형으로 분화시키는 방법이 공지되어 있다 (문헌 [Inaba, et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1693-1702] 참조).
줄기 세포는 공지된 방법을 사용하여 형질도입 및 분화를 위해 단리된다. 예를 들어, 줄기 세포는 원치 않는 세포와 결합하는 항체, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ (T 세포), CD45+ (panB 세포), GR-1 (과립구), 및 Iad (분화된 항원 제시 세포)로 골수 세포를 패닝함으로써 골수 세포로부터 단리된다 (문헌 [Inaba, et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1693-1702] 참조).
변형된 줄기 세포가 또한 일부 실시양태에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 아폽토시스에 대해 내성이 있는 신경 줄기 세포가 치료 조성물로서 사용될 수 있으며, 여기서 줄기 세포는 또한 본 발명의 ZFP TF를 함유한다. 아폽토시스에 대한 내성은, 예를 들어, 줄기 세포에서 BAX 또는 BAK 특이적 ZFN (미국 특허 번호 8,597,912 참조)을 사용하여 BAX 및/또는 BAK를 녹아웃시키거나, 또는 예를 들어 카스파제-6 특이적 ZFN을 다시 사용하여, 카스파제에서 붕괴된 것들에 의해 발생할 수 있다.
치료용 DNA 결합 단백질 (또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산)을 함유하는 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포좀 등)는 생체 내에서 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수도 있다. 또 다른 한편으론, 있는 그대로의 DNA를 투여할 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함 하나 이에 제한되지는 않는, 혈액 또는 조직 세포와의 궁극적인 접촉에 분자를 도입하기 위해 정상적으로 사용되는 경로 중 임의의 것에 의해 이루어진다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법이 이용가능하고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 특별한 조성물을 투여하기 위해 한 가지 초과의 경로가 사용될 수 있지만, 특별한 경로는 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
조혈 줄기 세포에 DNA를 도입하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,928,638에 개시되어 있다. 조혈 줄기 세포, 예를 들어, CD34+ 세포로의 트랜스진의 도입에 유용한 벡터는 아데노바이러스 유형 35를 포함한다.
트랜스진을 면역 세포 (예를 들어, T 세포)로 도입하는 데 적합한 벡터는 비-통합 렌티바이러스 벡터를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Ory, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull, et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery, et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi, et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222] 참조).
제약상 허용되는 담체는 부분적으로, 투여되는 특별한 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하는 데 사용되는 특별한 방법에 의해 결정된다. 따라서, 하기에 기재되는 바와 같이, 이용가능한 제약 조성물의 광범위한 적합한 제형이 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989] 참조).
상기 언급된 바와 같이, 개시된 방법 및 조성물은 원핵 세포, 진균 세포, 고세균 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 척추 동물 세포, 포유 동물 세포, 및 T-세포 및 임의의 유형의 줄기 세포를 포함한 인간 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 유형의 세포에서 사용될 수 있다. 단백질 발현에 적합한 세포주는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, COS, CHO (예를 들어, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (예를 들어, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), perC6, 곤충 세포, 예컨대 스포도프테라 푸기페르다 (Sf), 및 진균 세포, 예컨대 사카로마이세스, 피치아 및 쉬조사카로마이세스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 세포주의 자손, 변이체 및 유도체가 또한 사용될 수 있다.
적용
질환의 치료 및 예방에 조작된 DNA 염기 편집기 복합체를 사용하면 의학 분야에 있어서 상당한 발전이 제공된다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 원하는 표적 부위가 편집의 주요 장소가 되도록 보장하기 위해 이러한 신규 도구의 특이성을 증가시키는 역할을 한다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에 의해 치료 및/또는 예방될 수 있는 예시적인 유전 질환은 연골 무형성증, 완전 색맹, 산성 말타제 결핍, 아데노신 데아미나제 결핍 (OMIM 번호 102700), 부신 백질 형성 장애증, 에카르디 증후군, 알파-1 항트립신 결핍, 알파-지중해 빈혈, 안드로겐 불감성 증후군, 아페르(apert) 증후군, 부정맥유발성 우심실 이형성증, 모세혈관 확장성 운동 실조증, 바르트(barth) 증후군, 베타-지중해 빈혈, 청색 고무 수포 모반 증후군, 캐너번(canavan)병, 만성 육아종성 질환 (CGD), 고양이 울음 증후군, 낭포성 섬유증, 더컴(dercum)병, 외배엽 형성 이상, 판코니 빈혈, 진행성 골화성 섬유이형성증, 취약 X 증후군, 갈락토스혈증, 고셔(Gaucher)병, 전신성 강글리오시드증 (예를 들어, GM1), 혈색소 침착증, 베타-글로빈의 6번째 코돈에서의 헤모글로빈 C 돌연변이 (HbC), 혈우병, 헌팅턴병, 후를러(Hurler) 증후군, 저인산증, 클라인펠터(Klinefelter) 증후군, 크라베(Krabbes)병, 랑거-기디온(Langer-Giedion) 증후군, 백혈구 유착 결핍 (LAD, OMIM 번호 116920), 백질 이영양증, 긴 QT 증후군, 마르판 증후군, 뫼비우스 증후군, 점액 다당류증 (MPS), 손발톱 슬개골 증후군, 신성 요붕증, 신경 섬유종증, 니만-피크(Niemann-Pick)병, 불완전 골형성증, 페닐케톤뇨증 (PKU), 포르피린증, 프라더-윌리(Prader-Willi) 증후군, 조로증, 프로테우스(Proteus) 증후군, 망막 모세포종, 레트(Rett) 증후군, 루빈스타인-타이비(Rubinstein-Taybi) 증후군, 산필리포(Sanfilippo) 증후군, 중증 복합 면역 결핍증 (SCID), 슈와크만(Shwachman) 증후군, 겸상 적혈구병 (겸상 적혈구 빈혈), 스미스 마제니스(Smith-Magenis) 증후군, 스티클러(Stickler) 증후군, 테이 삭스병, 저혈소판 요골 무형성 (TAR) 증후군, 트리처 콜린스(Treacher Collins) 증후군, 삼염색체증, 결절성 경화증, 터너(Turner) 증후군, 요소 회로 장애, 폰 히펠 란다우(von Hippel-Landau)병, 바르덴부르크(Waardenburg) 증후군, 윌리암스(Williams) 증후군, 윌슨(Wilson)병, 비스코트-알드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군, X 연관 림프 증식성 증후군 (XLP, OMIM 번호 308240)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
표적화된 DNA 염기 편집에 의해 치료될 수 있는 부가의 예시적인 질환은 후천성 면역 결핍증, 리소좀 저장 질환 (예를 들어, 고셔병, GM1, 파브리병 및 테이 삭스병), 점액 다당류증 (예를 들어, 헌터병, 후를러병), 혈색소병증 (예를 들어, 겸상 적혈구병, HbC, α-지중해 빈혈, β-지중해 빈혈) 및 혈우병을 포함한다.
이러한 방법은 또한 숙주에서 감염 (바이러스성 또는 박테리아성)을 치료 (예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 수용체의 발현을 차단함으로써, 숙주 유기체에서의 감염 및/또는 확산을 예방함으로써 이루어진다)를 허용하여 유전 질환을 치료할 수 있다.
표적화된 염기 편집은 또한 숙주에서 바이러스성 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 부가적으로, 바이러스에 대한 수용체를 코딩하는 유전자의 표적화된 절단은 이러한 수용체의 발현을 차단함으로써, 숙주 유기체에서의 바이러스성 감염 및/또는 바이러스성 확산을 방지하는 데 사용될 수 있다. 바이러스 수용체 (예를 들어, HIV에 대한 CCR5 및 CXCR4 수용체)를 코딩하는 유전자의 표적화된 돌연변이 유발은 수용체가 바이러스와 결합할 수 없도록 만들어, 그에 의해 새로운 감염을 예방하고 기존 감염의 확산을 차단하는 데 사용될 수 있다 (미국 특허 공개 번호 2008/015996 참조). 표적화될 수 있는 바이러스 또는 바이러스 수용체의 비-제한적인 예는 단순 포진 바이러스 (HSV), 예컨대 HSV-1 및 HSV-2, 수두 대상 포진 바이러스 (VZV), 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 및 시토메갈로바이러스 (CMV), HHV6 및 HHV7을 포함한다. 바이러스의 간염 패밀리는 A형 간염 바이러스 (HAV), B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), 델타 간염 바이러스 (HDV), E형 간염 바이러스 (HEV) 및 G형 간염 바이러스 (HGV)를 포함한다. 피코르나비리다에(Picornaviridae) (예를 들어, 폴리오바이러스 등); 칼리시비리다에(Caliciviridae); 토가비리다에(Togaviridae) (예를 들어, 풍진 바이러스, 뎅기 바이러스 등); 플라비비리다에(Flaviviridae); 코로나비리다에(Coronaviridae); 레오비리다에(Reoviridae); 비르나비리다에(Birnaviridae); 라보도비리다에(Rhabodoviridae) (예를 들어, 광견병 바이러스 등); 필로비리다에(Filoviridae); 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae) (예를 들어, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 등); 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae) (예를 들어, 인플루엔자 바이러스 유형 A, B 및 C 등); 분야비리다에(Bunyaviridae); 아레나비리다에(Arenaviridae); 레트로비리다에(Retroviridae); 렌티바이러스 (예를 들어, HTLV-I; HTLV-II; HIV-1 (HTLV-III, LAV, ARV, hTLR 등으로서 공지되기도 함) HIV-II); 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인플루엔자 바이러스 및 진드기 매개 뇌염 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 바이러스 또는 그의 수용체가 표적화될 수 있다. 이들 및 다른 바이러스의 설명에 관해서는, 예를 들어 문헌 [Virology, 3rd Edition (W. K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2nd Edition (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds. 1991)]을 참조한다. 예를 들어, HIV에 대한 수용체는 CCR-5 및 CXCR-4를 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 유전자 변형, 유전자 교정 및 유전자 붕괴에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 또한 하기를 발생시키는 편집을 포함하나 그에 제한되지는 않는 줄기 세포 기반 요법에 적용될 수 있다: 체세포 돌연변이의 교정; 우성 음성 대립 유전자의 붕괴; 병원체가 세포로 유입되거나 생산적으로 감염되는 데 필요한 유전자의 붕괴; 예를 들어, 기능적 조직의 분화 또는 형성을 촉진하기 위해 유전자 활성을 편집하고/하거나 기능적 조직의 분화 또는 형성을 촉진하기 위해 유전자 활성을 방해함으로써 증강된 조직 조작; 예를 들어, 분화를 차단하는 유전자를 편집함으로써 분화를 차단 또는 유도하여 줄기 세포가 특이적 계통 경로로 분화되는 것을 촉진시키는 것. 이러한 절차를 위한 세포 유형은 T 세포, B 세포, 조혈 줄기 세포 및 배아 줄기 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 부가적으로, 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC)가 사용될 수 있으며, 이는 환자 자신의 체세포로부터 생성될 수도 있다. 따라서, 이들 줄기 세포 또는 그의 유도체 (분화된 세포 유형 또는 조직)는 그의 기원이나 조직 적합성에 관계 없이 임의의 사람에게 잠재적으로 생착될 수 있었다.
상기 조성물 및 방법은 또한 체세포 요법에 사용될 수 있으며, 이에 의해 생물학적 특성을 증강시키기 위해 변형된 세포의 스톡을 생산할 수 있다. 이러한 세포는 세포의 공여자 공급원 및 수용자에 대한 조직 적합성에 관계 없이 다양한 환자에게 주입될 수 있다.
치료적 적용 이외에, 본원에 기재된 DNA 편집 복합체는 작물 조작, 세포주 조작 및 질환 모델의 구축에 사용될 수 있다. 절대적인 이종 이량체 절단 절반 도메인은 뉴클레아제 특성을 개선하기 위한 직접적인 수단을 제공한다.
본원에 기재된 조작된 DNA 편집 복합체는 한 번에 다수의 표적에서 동시 절단을 필요로 하는 유전자 변형 프로토콜에서도 사용될 수 있다. 2개의 표적에서의 편집은 2개의 DNA 편집 복합체의 세포 발현을 필요로 하며, 이는 다른 복합체에서의 절단 도메인과 상호작용 (이량체화)하지 않는 각각의 복합체 내의 절단 도메인을 포함하는 닉카제를 사용하여 달성되는 것이 바람직하다.
실시예
실시예 1: ZFP의 제조
문헌 [Urnov, et al. (2005) Nature 435(7042):646-651, Perez, et al. (2008) Nature Biotechnology 26(7): 808-816], 및 국제 특허 공개 번호 WO 2016/183298 및 WO 2017/106528에 본질적으로 기재된 바와 같이, 특이적 표적 부위를 표적으로 하는 ZFP가 설계되고 플라스미드 벡터 내로 혼입된다. 미국 특허 번호 8,586,526 및 9,873,894에 기재된 바와 같이, 특이적 부위에 대한 TALE 및 sgRNA가 또한 개발된다.
염기 편집을 위한 한 가지 예시적인 표적은 알파-1 항트립신 (A1AT)을 코딩하는 SERPINA 유전자좌이다. A1AT 단백질에서 상염색체 열성 결핍을 유발시키는 유전자좌에서의 돌연변이는 간 및 폐 질환 둘 다와 연관이 있다. 북유럽 혈통의 사람들에게 가장 흔한 결핍 대립 유전자 중 하나인 PiZ 돌연변이는 A1AT 단백질의 약 10-20%만 생산되도록 한다. 이러한 돌연변이는 엑손 5에서의 단일 돌연변이에 의해 야기되어, 아미노산 위치 342에서의 리신이 글루타민으로 치환되며, 여기서 DNA 내의 위치 1096에 있는 G가 돌연변이된 유전자 서열에서의 A이다 (문헌 [Fregonese and Stolk (2008) Orphanet J Rare Dis 3:16]에서 검토됨).
또 다른 예시적인 표적은 JAK2 V617F 돌연변이이다. V617F를 편집하여 또 다른 돌연변이를 형성하면, JAK2를 덜 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, V617L, V617P 및 V617S 돌연변이는 V617F보다 덜 활성화되는 것으로 나타났다 (Dusa, et al. (2008) J Biol Chem 283(19):12941-12948).
따라서, A1AT에서의 돌연변이 근처 영역을 표적으로 하는 몇 가지 징크 핑거 단백질 (ZFP)이 만들어졌다 (도 2 참조). ZFP의 설계는 하기 표 1A (A1AT) 및 표 1B (JAK2)에 제시되어 있다.
<표 1A>
Figure pct00020
<표 1B>
Figure pct00021
몇 가지 상이한 조합을 포함하는 염기 편집기는 표준 프로토콜을 사용하여 구축된다. 상이한 조합은 하나 이상의 데아미나제, 헬리카제, 선택된 DNA 결합 도메인 (ZFP, TALE, sgRNA), dCas, 닉카제 (ZFN, TALEN, CRISPR/Cas) 복합체, UGI, GAM 등을 포함하는 편집기를 포함한다. 상기 조합은 순차적으로 융합된 선택된 도메인을 포함하는 복합체를 포함하거나, 또는 상기 조합이 별도의 융합 단백질로서 공급된다. 임의의 링커가 도메인 사이에 사용된다.
조합은 세포로의 형질감염을 위해 또는 시험관 내 mRNA의 생산에 사용하기 위해 발현 구축물로 어셈블리된다. 이어서, 이들 mRNA는 관련 기술분야에 공지된 방법 (예를 들어, 전기천공)에 의해 세포에 도입될 수 있다. 표적화된 돌연변이가 없는 세포가 대조군으로서 사용된다.
실시예 2: 아데닌 염기 편집기
아데닌 염기 편집기는 분자의 C-말단 측에 있는 돌연변이된 A1AT PiZ 돌연변이를 표적으로 한 ZFP DNA 결합 도메인에 연결된, PAM 요구 사항이 완화된 Cas9 변이체 (SpCas9VRVRFRR_D10A; 문헌 [Nishimasu, et al. (2018) Science 361:1259-1262] 또는 xCas9; 문헌 [Hu, et al. (2018) Nature 556:57-63] 참조)를 사용하여 구축되었다. 인접한 DNA 영역과 결합하도록 설계된 일련의 ZFP DNA 결합 도메인 (실시예 1 참조)을 염기 편집기에 혼입하였다 (도 2 및 7 참조). ZFP는 3개의 HA 펩티드와 2개의 뉴클레아제 국재화 서열 (NLS)을 포함하는 링커를 사용하여 Cas9에 부착되었다. 링커의 서열은 하기와 같다: GTGGPKKKRKVYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGSYPYDVPDYAGSAAPAAKKKKLDFESE (서열식별번호: 3) (문헌 [Bolukbasi, et al. (2015) Nat Methods 12(12):1150-1156] 참조). 이어서, Cas9는 N 말단 측에 있는 2개의 이. 콜라이 TadA 아데닌 데아미나제 ("ecTadA"; 문헌 [Kim, et al. (2006) Biochemistry 45:6407-6416])에 연결되었다. 이러한 구축물에서, TadA 단백질 중 하나는 야생형 단백질이었고 다른 하나는 진화된 버전이었다 (Gaudelli, et al. (2017) Nature 551:464). 세린-글리신이 풍부한 링커는 Cas9와 TadA 서브유닛 사이에 2회 사용되었고, 하기 서열을 포함하였다: SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 2). 아데닌 염기 편집기 (ABE)의 개략도가 도 3a에 도시되어 있다. 일부 경우에는, 다른 유형의 아데닌 데아미나제가 사용된다. 예를 들어, 일부 구축물에서, ABE7.10 데아미나제 또는 ABEmax 아데닌 데아미나제 (문헌 [Koblan, et al. (2018) Nat Biotechnol. 36(9):843-846])가 사용된다.
JAK2 V617F 돌연변이를 표적으로 하기 위해, 돌연변이 부위 근처의 JAK2 유전자를 표적으로 하는 Cas9NG 아데닌 염기 편집기는 돌연변이 부위의 상류에 위치한 TAA 또는 AAT 또는 AAA PAM 부위를 사용하여 만들어진다 (도 7a 내지 7c 참조). ZFP DNA 결합 도메인은 상기 기재된 바와 같은 염기 편집기에 융합되고, HSC/PC를 편집하는 데 사용된다. ZFP 서열에 표 1B에 제시된다. 임의의 링커가 핑거 사이 및/또는 ZFP와 염기 편집기 사이에 사용될 수 있다.
그 결과는 표적 유전자좌에서의 성공적인 편집을 보여준다. 도 7a는 아미노산 서열에서 세린 (S) 또는 프롤린 (P)으로의 변화를 야기시키는 염기 편집을 도시한다. 이들 변이체 둘 다는 페닐알라닌 돌연변이체 (F)보다 덜 활성화되는 것으로 나타났다 (문헌 [Dusa, et al. (2008) J Biol Chem 283(19):12941-8] 참조).
세포 (예를 들어, K562 세포)는 염기 편집기를 포함하는 발현 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터)로 형질감염되거나, 또는 세포는 상기 기재된 바와 같은 염기 편집기를 코딩하는 mRNA를 사용하여 전기천공된다. 형질감염된 세포를 수거하고 게놈 DNA를 단리한다. 온 타겟 관심 게놈 영역 및 오프 타겟 관심 게놈 영역은 관련 기술분야의 표준 방법에 따라 PCR 증폭에 의해 증폭된다. 서열은 염기 편집 및 인델의 존재에 대해 평가된다.
아데닌 염기 편집기 (ABE)는 K562 세포 상에서 상기 기재된 바와 같이 A1AT 유전자좌에서 시험되었으며, 여기서 200,000개 세포 당 염기 편집기를 코딩하는 800 ng의 플라스미드 DNA가 사용되었다. 실험은 또한 Z가 없는 K562 세포에서 수행되었으며 질환 유발 돌연변이에 매우 근접한 A 뉴클레오티드가 활성 측정을 위한 프록시로서 사용되었다. 아맥사(Amaxa) 장치를 사용한 형질감염 (제조업체의 프로토콜에 따름) 후 72시간에, 세포를 수거하고 Miseq 분석 [일루미나(Illumina)]을 수행하여, 발생했을 수 있는 임의의 편집을 분석하였다. 도 4는 복합체의 편집 창 내에서 표적화될 수 있는 A 염기를 예시하며, 여기서 이들 위치에 G가 존재하는 것은 A 염기 편집이 발생했다는 것을 나타낼 것이다.
변이체 ZFP 도메인을 포함하는 각각의 구축물의 3가지 상이한 클론이 시험되었다. 그 결과가 하기 표 2에 제시되어 있다 (용어 "Cas9VRVRFRR", "Cas9VR" 및 "Cas9NG"는 상호 교환가능하게 사용되는 것에 주목해야 한다):
<표 2>
A1AT 유전자좌에서의 아데닌 염기 편집
Figure pct00022
Figure pct00023
"sgRNA_단독"으로 표지된 행은 가이드 RNA만을 포함하는 행이고, "ABE_Cas9VR_D10A"는 ZFP DNA 결합 도메인이 결여된 복합체이다. 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 위치 A5에서의 아데닌의 표적화된 편집은 ZFP 도메인이 결여된 편집 복합체와 비교 시 ZFP DNA 결합 도메인의 일부 존재 하에 증가되었다. ZFP가 없는 천연 ABE-Cas9 융합 구축물은 약 0.5% 염기 편집을 발생시킨 반면, ABE-Cas9-ZFP 융합 구축물은 이러한 데이터 세트에서 적어도 7배 더 높은 염기 편집 효율성을 보여주었다.
이들 실험에서는, ABEmax 또는 ABE7.10 아데닌 데아미나제에 연결된 xCas 또는 Cas9NG 단백질을 사용하여 연구를 수행하였다. 사용된 가이드 RNA는 TGT PAM 또는 AGT PAM이다. 결과는 ZFP DNA 결합 도메인 (ZFP 앵커)이 결여된 염기 편집기와 비교 시 5배 내지 10배 이상의 염기 편집 효율성을 보여주었다.
ABE 7.9 및 ABE 7.8의 사용을 포함하여 대체 버전의 아데닌 데아미나제를 사용하여 추가 실험을 수행하였으며, 거의 동등한 수준의 결과를 보여주었다.
JAK2 V617F 돌연변이체의 염기 편집을 위해, V617F 돌연변이가 없는 K562 세포에서 수행된 실험을 포함하여 실험 조건은 상기 기재된 바와 동일하였지만, 질환 유발 돌연변이에 매우 근접한 A 뉴클레오티드가 활성 측정을 위한 프록시로서 사용되었다. 표적화된 PAM 서열 도 7b에 도시되어 있다. ABEmax에 연결된 xCas 또는 Cas9NG 단백질의 다양한 조합을 사용하여 연구를 수행하였다 (예를 들어, 도 3b 참조).
결과는 ZFP 앵커의 존재가 AAT 및 TAA PAM 서열에서의 활동을 보여주는 것을 포함하여, 편집을 개선하고 PAM 요구 사항을 완화하였다는 것을 보여주었다. 특히, TAA PAM 서열을 사용하는 염기 편집기는 ZFP 도메인 없이 이러한 부위에서 불활성이다. 예를 들어, 도 7c에 도시된 바와 같은 예시적인 결과를 참조한다.
부가의 질환 관련 점 돌연변이에 대해 부가의 실험이 수행되고, ZFP 앵커 도메인의 존재하에 더 높은 염기 편집 특이성 및/또는 활성이 달성된다. 더욱이, 편집될 표적화된 염기에 따라, NAN (예를 들어, TAA), AAT, NGG (TGG), NGT (예를 들어, TGT 또는 AGT)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 PAM 서열이 사용될 수 있다.
실시예 3: 시티딘 염기 편집기
C 뉴클레오티드를 U로 전환시키기 위한 시티딘 염기 편집기는 아포지질단백질 B mRNA 편집 효소, 촉매 폴리펩티드 유사 (APOBEC) 단백질을 사용하여 구축된다 (Yang, et al. (2017) J Genet Genomics 44(9):423-437). 특히, 시티딘 염기 편집기는 시티딘 데아미나제, 예컨대 아포지질단백질 B mRNA 편집 효소, 촉매 폴리펩티드 1 또는 APOBEC-1을 사용하여 만들어진다. AICDA 유전자에 의해 코딩된, AICDA 및 AID로서 공지되기도 한 활성화 유도 시티딘 데아미나제가 또한 본원에 기재된 바와 같은 시티딘 데아미나제 염기 편집기에 포함될 수 있다.
U:G 이종 이중 나선 DNA에 대한 세포 복구 반응은 DNA로부터의 U의 제거를 촉매하고 U:G 쌍에서 C:G 쌍으로의 역전과 함께 염기 절제 복구를 시작하는 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG)의 활성을 유발하여, 염기 편집의 효율성을 저하시키는 것으로 생각된다. 따라서, 시티딘 염기 편집기는 내인성 UDG 활성을 차단하기 위해 편집기에 융합된 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI)를 가질 수 있다 (Komor, et al. (2016) Nature 533(7603):420-424). 시티딘 염기 편집기는 APOBEC1 또는 B 세포 특이적 활성화 유도 시티딘 데아미나제 (AID) 효소에 연결된 ZFP DNA 결합 도메인을 사용하여 구축된다 (Kescu and Adli (2016) Nat Methods 13(12):983). 시티딘 염기 편집기는 DNA 결합 도메인, 예컨대 ZFP에 부착된다.
일부 실시양태에서, 편집기는 UGI 이량체를 추가로 포함한다 (도 5a 내지 5f 참조). UGI 이량체는 링커, 예컨대 L0 (LRGS, 서열식별번호: 76) 또는 N7a (SGTPHEVGVYTL, 서열식별번호: 28; 미국 특허 공개 번호 2017/0218349 참조)를 사용하여 ZFP DNA 결합 도메인에 부착된다. AID 또는 APOBEC1은 링커, 예컨대 L0 또는 서열, 예컨대 SGGGLGST (서열식별번호: 29; 문헌 [Yang, et al. (2016) Nat Commun DOI:10.1038/ncomms13330])를 통해 ZFP에 부착된다.
시티딘 염기 편집기는 또한 UGI 도메인 없이 구축된다. 일부 편집기는 하나의 파트너가 촉매적으로 불활성인 FokI 닉카제 도메인에 연결된 ZFP에 연결된 시티딘 편집기를 포함하는 쌍으로서 사용되도록 구축된다. 제2 파트너는 활성 FokI 도메인을 포함하여, 2개의 FokI 절반 도메인이 쌍을 형성하여 닉을 생성하는 데 작용할 수 있다. 시티딘 편집기 도메인은 UGI 이량체 어셈블리처럼 어느 한 절반에 있을 수 있다.
실시예 4: 부가의 염기 편집기
부가의 ABE 및/또는 CBE를 구축하고 시험한다.
특히, 실험은 (1) 임의로 ZFP 앵커에 작동가능하게 연결된 Cas9 닉카제; 및 (2) ABE 도메인 (예를 들어, 진화된 ABE 도메인)에 작동가능하게 연결된 ZFP를 포함하는 아데닌 염기 편집기를 사용하여 수행된다 (예를 들어, 도 1b, 하단 중간 패널 참조).
결과는 이들 염기 편집기가 질환 관련 돌연변이의 표적화된 편집에 효과적이라는 것을 보여주었다.
또한, 실험은 (1) 임의로 ZFP 앵커에 작동가능하게 연결된, 단일 가이드 RNA에 작동가능하게 연결된 dCas9 단백질; (2) ABE 도메인 (예를 들어, 진화된 ABE 도메인)에 작동가능하게 연결된 ZFP; 및 (3) ZFN 닉카제를 포함하는 ABE 염기 편집기를 사용하여 수행된다 (예를 들어, 도 1c 참조).
결과는 ZFN 닉카제를 포함한 염기 편집기가 dCas9 염기 편집기와 비교 시 염기 편집 효율성을 증가시킨 것으로 나타났다.
실시예 5: Cas9 무함유 염기 편집기
Cas9 무함유 염기 편집기를 또한 구축하고 평가한다. 구축물은 상기 기재된 바와 같이 사용되는 2개의 TadA 도메인이 있는 염기 편집기를 포함하며, 임의로 여기서 하나는 야생형이고 다른 하나는 진화된 것이며, 이들은 ZFP DNA 결합 도메인에 연결될 수 있다. 이러한 어셈블리는 단독으로 사용되거나, 또는 촉매적으로 불활성인 FokI 닉카제 도메인에 연결될 수 있다. 활성 FokI 도메인을 포함하는 또 다른 벡터와 조합하여 사용되는 경우, 아데닌 염기 편집기는 염기 편집의 교정을 방지하는 닉킹 활성을 갖는다. 만들어진 다른 비-Cas 염기 편집기가 도 1d에 도시되어 있다.
DNA 탈안정화 또는 풀림 인자를 포함하는 비-Cas 염기 편집기가 상기 구축되고 시험된다. DNA 탈안정화 인자는 ZFP 및/또는 ZFN 닉카제의 N-말단 또는 C-말단에 융합되거나 (도 1d 참조) 또는 ZFP 및/또는 닉카제와 독립적으로 도입된다.
특히, 도 1d에 도시된 바와 같은 염기 편집기가 생성된다. 이들 염기 편집기는 ZFP-데아미나제 융합 단백질 및 ZFN 닉카제를 포함한다. 또한, 이들 편집기는 그의 3' 단부 또는 5' 단부에 의해 ZFN 닉카제의 ZFP에 임의로 연결된 DNA 탈안정화 인자를 포함한다.
특히, 표 A에 제시된 바와 같이 하나 이상의 단백질 DNA 탈안정화 인자 [예를 들어, 헬리카제; DSB 복구 동안 D-루프 형성에 관여하는 인자 (예를 들어 Rad51, Rad52, RPA1, RPA2, RPA3 등); 및/또는 하나 이상의 CRISPR 단백질 (예를 들어, 비-Cas9 단백질)을 수반하거나 수반하지 않는 나선 탈안정화 단백질 (예를 들어 ICP8, 푸랄파 또는 송아지 흉선 DNA 나선 탈안정화 단백질)]를 포함하는 염기 편집기가 구축된다.
또 다른 한편으론, 또는 DNA 탈안정화 단백질 이외에, 하나 이상의 펩티드 핵산 (PNA); 잠금 핵산 (LNA) 및/또는 가교 핵산 (BNA)을 포함하는 염기 편집기가 구축된다. 특히, 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 염기 편집기가 구축되고 시험된다. PNA 및/또는 LNA를 포함하는 염기 편집기가 본원에 기재된 바와 같이 구축된다 (또한, 도 1d 및 도 8 참조).
결과에 따르면 Cas9 무함유 염기 편집기는 그의 표적 부위를 편집한다.
본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용은 이해의 명료함을 위해 예시 및 예로서 일부 상세하게 제공되었지만, 본 개시내용의 요지 또는 범위를 벗어나지 않고서도 다양한 변화 및 변형이 실시될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 전술한 설명 및 예는 제한적인 것으로 해석되서는 안된다.
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Glu Met Met Glu Leu Thr Ala Arg Ala Leu Glu Arg Gly Asn 1100 1105 1110 Gly Glu Trp Ser Thr Asp Ala Ala Leu Glu Val Ala His Glu Ala 1115 1120 1125 Glu Ala Leu Val Ser Gln Leu Gly Asn Ala Gly Glu Val Phe Asn 1130 1135 1140 Phe Gly Asp Phe Gly Cys Glu Asp Asp Asn Ala Thr Pro Phe Gly 1145 1150 1155 Gly Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Phe Ala Gly Arg Lys Arg Ala 1160 1165 1170 Phe His Gly Asp Asp Pro Phe Gly Glu Gly Pro Pro Asp Lys Lys 1175 1180 1185 Gly Asp Leu Thr Leu Asp Met Leu 1190 1195 <210> 65 <211> 843 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 65 Met Thr Asp Val Glu Gly Tyr Gln Pro Lys Ser Lys Gly Lys Ile Phe 1 5 10 15 Pro Asp Met Gly Glu Ser Phe Phe Ser Ser Asp Glu Asp Ser Pro Ala 20 25 30 Thr Asp Ala Glu Ile Asp Glu Asn Tyr Asp Asp Asn Arg Glu Thr Ser 35 40 45 Glu Gly Arg Gly Glu Arg Asp Thr Gly Ala Met Val Thr Gly Leu Lys 50 55 60 Lys Pro Arg Lys Lys Thr Lys Ser Ser Arg His Thr Ala Ala Asp Ser 65 70 75 80 Ser Met Asn Gln Met Asp Ala Lys Asp Lys Ala Leu Leu Gln Asp Thr 85 90 95 Asn Ser Asp Ile Pro Ala Asp Phe Val Pro Asp Ser Val Ser Gly Met 100 105 110 Phe Arg Ser His Asp Phe Ser Tyr Leu Arg Leu Arg Pro Asp His Ala 115 120 125 Ser Arg Pro Leu Trp Ile Ser Pro Ser Asp Gly Arg Ile Ile Leu Glu 130 135 140 Ser Phe Ser Pro Leu Ala Glu Gln Ala Gln Asp Phe Leu Val Thr Ile 145 150 155 160 Ala Glu Pro Ile Ser Arg Pro Ser His Ile His Glu Tyr Lys Ile Thr 165 170 175 Ala Tyr Ser Leu Tyr Ala Ala Val Ser Val Gly Leu Glu Thr Asp Asp 180 185 190 Ile Ile Ser Val Leu Asp Arg Leu Ser Lys Val Pro Val Ala Glu Ser 195 200 205 Ile Ile Asn Phe Ile Lys Gly Ala Thr Ile Ser Tyr Gly Lys Val Lys 210 215 220 Leu Val Ile Lys His Asn Arg Tyr Phe Val Glu Thr Thr Gln Ala Asp 225 230 235 240 Ile Leu Gln Met Leu Leu Asn Asp Ser Val Ile Gly Pro Leu Arg Ile 245 250 255 Asp Ser Asp His Gln Val Gln Pro Pro Glu Asp Val Leu Gln Gln Gln 260 265 270 Leu Gln Gln Thr Ala Gly Lys Pro Ala Thr Asn Val Asn Pro Asn Asp 275 280 285 Val Glu Ala Val Phe Ser Ala Val Ile Gly Gly Asp Asn Glu Arg Glu 290 295 300 Glu 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Arg Gln Ala Phe Leu Val Asp Gln Gly Tyr Ala Phe Lys Val Ile 725 730 735 Thr His Leu His Gly Met Glu Asn Ile Pro Asn Leu Ala Tyr Ala Ser 740 745 750 Pro Arg Glu Arg Arg Glu Leu Leu Gln Glu Val Leu Leu Lys Asn Glu 755 760 765 Glu Ala Ala Gly Ile Glu Val Gly Asp Asp Ala Asp Asn Ser Val Gly 770 775 780 Arg Gly Ser Asn Gly His Lys Arg Phe Lys Ser Lys Ala Val Arg Gly 785 790 795 800 Glu Gly Ser Leu Ser Gly Leu Ala Gly Gly Glu Asp Met Ala Tyr Met 805 810 815 Glu Tyr Ser Thr Asn Lys Asn Lys Glu Leu Lys Glu His His Pro Leu 820 825 830 Ile Arg Lys Met Tyr Tyr Lys Asn Leu Lys Lys 835 840 <210> 66 <211> 778 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 66 Met Lys Phe Tyr Ile Asp Asp Leu Pro Val Leu Phe Pro Tyr Pro Lys 1 5 10 15 Ile Tyr Pro Glu Gln Tyr Asn Tyr Met Cys Asp Ile Lys Lys Thr Leu 20 25 30 Asp Val Gly Gly Asn Ser Ile Leu Glu Met Pro Ser Gly Thr Gly Lys 35 40 45 Thr Val Ser Leu Leu Ser Leu Thr Ile Ala Tyr Gln Met His Tyr Pro 50 55 60 Glu His Arg Lys Ile Ile Tyr Cys Ser Arg Thr Met Ser 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Lys 275 280 285 Leu Val Gln Gly Leu His Ser Ala Asp Ile Leu Thr Asp Gln Glu Glu 290 295 300 Pro Phe Val Glu Thr Pro Val Leu Pro Gln Asp Leu Leu Thr Glu Ala 305 310 315 320 Ile Pro Gly Asn Ile Arg Arg Ala Glu His Phe Val Ser Phe Leu Lys 325 330 335 Arg Leu Ile Glu Tyr Leu Lys Thr Arg Met Lys Val Leu His Val Ile 340 345 350 Ser Glu Thr Pro Lys Ser Phe Leu Gln His Leu Lys Gln Leu Thr Phe 355 360 365 Ile Glu Arg Lys Pro Leu Arg Phe Cys Ser Glu Arg Leu Ser Leu Leu 370 375 380 Val Arg Thr Leu Glu Val Thr Glu Val Glu Asp Phe Thr Ala Leu Lys 385 390 395 400 Asp Ile Ala Thr Phe Ala Thr Leu Ile Ser Thr Tyr Glu Glu Gly Phe 405 410 415 Leu Leu Ile Ile Glu Pro Tyr Glu Ile Glu Asn Ala Ala Val Pro Asn 420 425 430 Pro Ile Met Arg Phe Thr Cys Leu Asp Ala Ser Ile Ala Ile Lys Pro 435 440 445 Val Phe Glu Arg Phe Ser Ser Val Ile Ile Thr Ser Gly Thr Ile Ser 450 455 460 Pro Leu Asp Met Tyr Pro Arg Met Leu Asn Phe Lys Thr Val Leu Gln 465 470 475 480 Lys Ser Tyr Ala Met Thr Leu Ala Lys Lys Ser Phe Leu Pro Met Ile 485 490 495 Ile Thr Lys Gly Ser Asp Gln Val Ala Ile Ser Ser Arg Phe Glu Ile 500 505 510 Arg Asn Asp Pro Ser Ile Val Arg Asn Tyr Gly Ser Met Leu Val Glu 515 520 525 Phe Ala Lys Ile Thr Pro Asp Gly Met Val Val Phe Phe Pro Ser Tyr 530 535 540 Leu Tyr Met Glu Ser Ile Val Ser Met Trp Gln Thr Met Gly Ile Leu 545 550 555 560 Asp Glu Val Trp Lys His Lys Leu Ile Leu Val Glu Thr Pro Asp Ala 565 570 575 Gln Glu Thr Ser Leu Ala Leu Glu Thr Tyr Arg Lys Ala Cys Ser Asn 580 585 590 Gly Arg Gly Ala Ile Leu Leu Ser Val Ala Arg Gly Lys Val Ser Glu 595 600 605 Gly Ile Asp Phe Asp His Gln Tyr Gly Arg Thr Val Leu Met Ile Gly 610 615 620 Ile Pro Phe Gln Tyr Thr Glu Ser Arg Ile Leu Lys Ala Arg Leu Glu 625 630 635 640 Phe Met Arg Glu Asn Tyr Arg Ile Arg Glu Asn Asp Phe Leu Ser Phe 645 650 655 Asp Ala Met Arg His Ala Ala Gln Cys Leu Gly Arg Val Leu Arg Gly 660 665 670 Lys Asp Asp Tyr Gly Val Met Val Leu Ala Asp Arg Arg Phe Ser Arg 675 680 685 Lys Arg Ser Gln Leu Pro Lys Trp Ile Ala Gln Gly Leu Ser Asp Ala 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Asp Ile Leu Arg 115 120 125 Val <210> 68 <211> 625 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 68 Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu 1 5 10 15 Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu 20 25 30 Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys 35 40 45 Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala 50 55 60 Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp 65 70 75 80 Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val 85 90 95 Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly 100 105 110 Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg 115 120 125 Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu 130 135 140 Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys 145 150 155 160 Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp 165 170 175 Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln 180 185 190 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Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro 405 410 415 Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr 420 425 430 Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser 435 440 445 Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg 450 455 460 Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu 465 470 475 480 Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala 485 490 495 Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp 500 505 510 Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu 515 520 525 Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys 530 535 540 Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg 545 550 555 560 Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly 565 570 575 Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser 580 585 590 Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser 595 600 605 Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly 610 615 620 Asp 625 <210> 69 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(15) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (21)..(49) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 69 nnnnnnnnnn nnnnntctct nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 49 <210> 70 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(15) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (21)..(49) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 70 nnnnnnnnnn nnnnntctct nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 49 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(10) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (16)..(25) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 71 nnnnnnnnnn tctctnnnnn nnnnn 25 <210> 72 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(10) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (16)..(25) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 72 nnnnnnnnnn tctctnnnnn nnnnn 25 <210> 73 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (6)..(10) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 73 gtrhgnnnnn 10 <210> 74 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 74 yyyyyyyyyy nyag 14 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: 'LAGLIDADG' family motif peptide <400> 75 Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly 1 5 <210> 76 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Leu Arg Gly Ser 1 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (8)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 77 nnnaaaannn nnnnnnnnnn ngg 23 <210> 78 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 gtgctgacca tcgacgagaa agggactgaa gctgctgggg ccatgttttt agaggccat 59 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 79 Leu Asn Tyr Gly Val Cys Phe Cys Gly 1 5 <210> 80 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(15) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (21)..(49) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 80 nnnnnnnnnn nnnnntctct nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 49 <210> 81 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 caaatgcttg tgagaaagct tgctca 26 <210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Gln Ser Ser Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Leu Lys Trp Asn Leu Arg Thr 1 5 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Arg Ser Asp Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 85 Trp Gln Ser Ser Leu Ile Val 1 5 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Gln Ser Gly Asn Arg Thr Thr 1 5 <210> 87 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 atgcttgtga gaaagcttgc tcatca 26 <210> 88 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 cttgtgagaa agcttgctca tcatac 26 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Thr Asn Gln Asn Arg Ile Thr 1 5 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 90 Arg Ser Ala Asn Leu Thr Arg 1 5 <210> 91 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 gtgagaaagc ttgctcatca tacttg 26 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Ala His Gly Ala Arg Trp Asn 1 5

Claims (31)

  1. 적어도 하나의 징크 핑거 단백질 (ZFP) DNA 결합 도메인;
    적어도 하나의 DNA 탈안정화 분자; 및
    적어도 하나의 아데닌 또는 시토신 데아미나제
    를 포함하는, DNA 내의 아데닌 (A) 또는 시티딘 (C) 염기를 편집하기 위한 조성물이며, 여기서 조성물은 DNA 내에 이중 가닥 절단을 만들지 않는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, DNA 탈안정화 분자가 Cas9 닉카제, 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA)에 작동가능하게 연결된 Cas9 단백질인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, Cas9 단백질을 포함하지 않는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 탈안정화 분자가 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 닉카제인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 ZFP DNA 결합 도메인이 Cas9 닉카제 또는 불활성화된 Cas9 단백질 (dCas9)에 작동가능하게 연결되는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 ZFP DNA 결합 도메인을 포함하며, 여기서 제1 ZFP DNA 결합 도메인이 Cas9 닉카제에 작동가능하게 연결되는 것인 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 아데닌 또는 시토신 데아미나제가, 이량체화되어 활성 아데닌 또는 시토신 데아미나제를 형성하는 제1 및 제2 불활성 도메인으로 구성되는 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 아데닌 또는 시토신 데아미나제의 제1 불활성 도메인이 Cas9 닉카제에 작동가능하게 연결되고 아데닌 또는 시토신 데아미나제의 제2 불활성 도메인이 제2 ZFP DNA 결합 도메인에 작동가능하게 연결되는 것인 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 아데닌 또는 시토신 데아미나제 및 ZFP DNA 결합 도메인이 Cas9 닉카제에 작동가능하게 연결되는 것인 조성물.
  10. 제2항에 있어서, 제1 및 제2 ZFP DNA 도메인, Cas9 닉카제에 작동가능하게 연결된 제1 ZFP 및 아데닌 또는 시토신 데아미나제에 작동가능하게 연결된 제2 ZFP DNA 결합 도메인을 포함하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 ZFP DNA 결합 도메인이 아데닌 또는 시토신 데아미나제에 작동가능하게 연결되는 것인 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, ZFN 닉카제를 추가로 포함하는 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 탈안정화 인자가 적어도 하나의 단백질 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.
  14. 제13항에 있어서, DNA 탈안정화 인자가 단백질을 포함하는 것인 조성물.
  15. 제14항에 있어서, DNA 탈안정화 인자가 Cas 단백질 및/또는 표 A에 제시된 바와 같은 단백질을 포함하는 것인 조성물.
  16. 제13항에 있어서, DNA 탈안정화 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 펩티드 핵산 (PNA); 잠금 핵산 (LNA) 및/또는 가교 핵산 (BNA)을 포함하는 것인 조성물.
  18. 제17항에 있어서, PNA가
    Figure pct00024
    를 포함하며, 여기서 O가 8-아미노-2,6-디옥사옥탄산 링커를 나타내고; C가 시토신을 나타내며 Lys 잔기가 임의적인 것인 조성물.
  19. 제17항에 있어서, LNA가
    Figure pct00025
    을 포함하며, 여기서 LNA 뉴클레오티드가 대문자로 표시되고; DNA 뉴클레오티드가 소문자로 표시되고; "*"가 포스포로티오에이트 결합을 나타내는 것인 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 조성물을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 조성물 또는 제20항에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포, 또는 편집된 염기를 포함하는 세포의 자손.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제20항의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 세포에 제공하는 것을 포함하는, 세포 내의 표적 DNA에서의 염기를 편집하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 편집이
    (i) 시티딘 염기 ("C")를 우라실 염기 ("U")로 편집하는 것이며, 임의로 여기서 U는 DNA 복제 동안 티미딘 염기 ("T")로 대체되는 것;
    (ii) 아데닌 염기 ("A")를 이노신 ("I")으로 편집하는 것이며, 임의로 여기서 I는 복제 동안 구아닌 염기 ("G")로 대체되는 것; 및/또는
    (iii) CA 또는 AC 디뉴클레오티드를 UI 또는 IU로 편집하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 세포에서의 편집이
    (i) C:G 염기쌍의 T:A 염기쌍으로의 변화;
    (ii) C:G 염기쌍의 G:C 염기쌍으로의 변화;
    (iii) A:T 염기쌍의 G:C 염기쌍으로의 변화;
    (iv) 정지 코돈의 도입; 및/또는
    (v) 스플라이싱 서열의 편집 또는 생성
    을 발생시키는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 편집이 질환 돌연변이를 교정하는 것인 방법.
  26. 제22항에 있어서, 엑손이 편집되는 것인 방법.
  27. 제20항의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 표적 DNA에서의 염기를 편집하는 데 사용하기 위한 키트.
  28. 단리된 세포 또는 대상체에서 표적 DNA 분자를 편집하기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 조성물 또는 제20항의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 용도이며, 임의로 여기서 세포 또는 대상체 내의 염색체 또는 염색체 외 에피솜에서의 DNA가 편집되는 것인 용도.
  29. 제28항에 있어서, 편집이
    (iv) 시티딘 염기 ("C")를 우라실 염기 ("U")로 편집하는 것이며, 임의로 여기서 U는 DNA 복제 동안 티미딘 염기 ("T")로 대체되는 것;
    (v) 아데닌 염기 ("A")를 이노신 ("I")으로 편집하는 것이며, 임의로 여기서 I는 복제 동안 구아닌 염기 ("G")로 대체되는 것; 및/또는
    (vi) CA 또는 AC 디뉴클레오티드를 UI 또는 IU로 편집하는 것
    을 포함하는 것인 용도.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 세포 또는 대상체에서의 편집이
    (vi) C:G 염기쌍의 T:A 염기쌍으로의 변화;
    (vii) C:G 염기쌍의 G:C 염기쌍으로의 변화;
    (viii) A:T 염기쌍의 G:C 염기쌍으로의 변화;
    (ix) 정지 코돈의 도입; 및/또는
    (x) 스플라이싱 서열의 편집 또는 생성
    을 발생시키는 것인 용도.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 엑손이 편집되는 것인 용도.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024063538A1 (ko) * 2022-09-21 2024-03-28 기초과학연구원 식물세포 소기관 dna의 염기 교정

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210049124A (ko) 2018-08-23 2021-05-04 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 조작된 표적 특이적 염기 편집기
JP7059965B2 (ja) * 2019-02-21 2022-04-26 株式会社豊田中央研究所 エピゲノム状態を制御する融合タンパク質及びその利用
WO2021155166A1 (en) * 2020-01-31 2021-08-05 University Of Massachusetts A cas9-pdbd base editor platform with improved targeting range and specificity
CN111518794B (zh) * 2020-04-13 2023-05-16 中山大学 基于激活诱导性胞苷脱氨酶的诱导突变蛋白的制备和用途
CN111690720B (zh) * 2020-06-16 2021-06-15 山东舜丰生物科技有限公司 利用修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法
CA3187135A1 (en) * 2020-06-30 2022-01-06 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions, systems, and methods for base diversification
US20230340486A1 (en) * 2020-07-27 2023-10-26 The Children’S Hospital Of Philadelphia In utero and postnatal gene editing and therapy for treatment of monogenic diseases, including mucopolysaccharidosis type 1h and other disorders
JP2023542705A (ja) * 2020-09-25 2023-10-11 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 核酸塩基編集のためのジンクフィンガー融合タンパク質
EP4232005A1 (en) * 2020-10-23 2023-08-30 STRM.Bio Incorporated Compositions and methods related to megakaryocyte-derived extracellular vesicles for treating myeloproliferative neoplasms
AU2021394998A1 (en) * 2020-12-11 2023-06-29 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing involving deamination
WO2022240846A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Sqz Biotechnologies Company Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof
WO2023049926A2 (en) * 2021-09-27 2023-03-30 Vor Biopharma Inc. Fusion polypeptides for genetic editing and methods of use thereof
WO2023070122A1 (en) * 2021-10-23 2023-04-27 Strm.Bio Incorporated Gene editing to treat myeloproliferative neoplasms
WO2023122722A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel zinc finger fusion proteins for nucleobase editing
CN116497002A (zh) * 2022-01-19 2023-07-28 中国科学院动物研究所 工程化的CasX核酸酶、效应蛋白及其用途
KR20230139064A (ko) * 2022-03-25 2023-10-05 기초과학연구원 식물세포 소기관 dna의 아데닌을 구아닌으로 염기 교정
WO2024065721A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 Peking University Methods of determining genome-wide dna binding protein binding sites by footprinting with double stranded dna deaminase

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
WO1995019431A1 (en) 1994-01-18 1995-07-20 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6242568B1 (en) 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
JP4118327B2 (ja) 1994-08-20 2008-07-16 ゲンダック・リミテッド Ｄｎａ認識のための結合タンパク質におけるまたはそれに関連する改良
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5928638A (en) 1996-06-17 1999-07-27 Systemix, Inc. Methods for gene transfer
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
GB2338237B (en) 1997-02-18 2001-02-28 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
DE69942334D1 (de) 1998-03-02 2010-06-17 Massachusetts Inst Technology Poly-zinkfinger-proteine mit verbesserten linkern
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
DE60023936T2 (de) 1999-12-06 2006-05-24 Sangamo Biosciences Inc., Richmond Methoden zur verwendung von randomisierten zinkfingerprotein-bibliotheken zur identifizierung von genfunktionen
AU2001250774B2 (en) 2000-02-08 2005-01-27 Sangamo Biosciences, Inc. Cells expressing zinc finger proteins for drug discovery
US20020061512A1 (en) 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
US7923542B2 (en) 2000-04-28 2011-04-12 Sangamo Biosciences, Inc. Libraries of regulatory sequences, methods of making and using same
US7217509B2 (en) 2000-04-28 2007-05-15 Sangamo Biosciences, Inc. Databases of regulatory sequences; methods of making and using same
DE60126483T2 (de) 2000-04-28 2007-12-06 Sangamo BioSciences, Inc., Richmond Gezielte Modifikation der Chromatinstruktur
US20030044787A1 (en) 2000-05-16 2003-03-06 Joung J. Keith Methods and compositions for interaction trap assays
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
US7067317B2 (en) 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
GB0108491D0 (en) 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
EP1421177A4 (en) 2001-08-20 2006-06-07 Scripps Research Inst ZINC FINGER FASTENING DOMAINS FOR CNN
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
CA2474486C (en) 2002-01-23 2013-05-14 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
EP2368982A3 (en) 2002-03-21 2011-10-12 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
EP2806025B1 (en) 2002-09-05 2019-04-03 California Institute of Technology Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7253273B2 (en) 2004-04-08 2007-08-07 Sangamo Biosciences, Inc. Treatment of neuropathic pain with zinc finger proteins
DE602005011943D1 (de) 2004-04-08 2009-02-05 Sangamo Biosciences Inc Zusammensetzungen zur behandlung von neuropathischen und neurodegenerativen erkrankungen
US20080131962A1 (en) 2006-05-25 2008-06-05 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered cleavage half-domains
KR20070060115A (ko) 2004-09-16 2007-06-12 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 단백질 생산을 위한 조성물 및 방법
MX2007013757A (es) * 2005-05-05 2008-01-24 Univ Arizona Reagrupacion permitida de secuencia (seer)-met odo de novedad para visualizar secuencias de adn especificas.
GB0607063D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Cellcentric Ltd Compositions and methods for epigenetic modification of nucleic acid sequences in vivo
JP5551432B2 (ja) 2006-05-25 2014-07-16 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 遺伝子不活性化のための方法と組成物
WO2008133938A2 (en) 2007-04-26 2008-11-06 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into the ppp1r12c locus
US8563314B2 (en) 2007-09-27 2013-10-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
EP2281050B1 (en) 2008-04-14 2014-04-02 Sangamo BioSciences, Inc. Linear donor constructs for targeted integration
EP2297318B1 (en) 2008-05-28 2018-05-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
EP2294191B1 (en) 2008-06-10 2016-09-28 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for generation of bax- and bak-deficient cell lines
CN102159722B (zh) 2008-08-22 2014-09-03 桑格摩生物科学股份有限公司 用于靶向单链切割和靶向整合的方法和组合物
JP5681114B2 (ja) 2008-12-04 2015-03-04 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用したラットのゲノム編集
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
PL2510096T5 (pl) 2009-12-10 2018-06-29 Regents Of The University Of Minnesota Modyfikacja DNA zależna od efektora TAL
JP6137596B2 (ja) 2010-02-08 2017-05-31 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 遺伝子操作された切断ハーフドメイン
WO2011100058A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
KR101880536B1 (ko) 2010-04-26 2018-07-23 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하는 로사 좌위의 게놈 편집
HUE048072T2 (hu) 2010-05-03 2020-05-28 Sangamo Therapeutics Inc Készítmények cinkujj-modulok összekapcsolására
AU2011256838B2 (en) 2010-05-17 2014-10-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel DNA-binding proteins and uses thereof
CA2993567C (en) 2010-07-21 2022-06-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of a t-cell receptor gene
JP6185916B2 (ja) 2011-09-21 2017-08-23 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 導入遺伝子発現を制御するための方法および組成物
EP2771457B1 (en) 2011-10-27 2017-11-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of the hprt locus
LT2800811T (lt) 2012-05-25 2017-09-11 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirti tikslinės dnr modifikavimui, panaudojant adresuotą rnr, ir transkripcijos moduliavimui, panaudojant adresuotą rnr
JP2016500254A (ja) 2012-12-05 2016-01-12 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 代謝疾患の調節のための方法および組成物
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
EP3825401A1 (en) 2012-12-12 2021-05-26 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
KR20150105634A (ko) 2012-12-12 2015-09-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 개선된 시스템, 방법 및 효소 조성물의 유전자 조작 및 최적화
PT2784162E (pt) 2012-12-12 2015-08-27 Broad Inst Inc Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências
PL2931898T3 (pl) 2012-12-12 2016-09-30 Le Cong Projektowanie i optymalizacja systemów, sposoby i kompozycje do manipulacji sekwencją z domenami funkcjonalnymi
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014144592A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The General Hospital Corporation Using truncated guide rnas (tru-grnas) to increase specificity for rna-guided genome editing
WO2014186585A2 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
US10081661B2 (en) 2013-12-09 2018-09-25 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for genome engineering
EP3099801B1 (en) 2014-01-31 2020-03-18 Factor Bioscience Inc. Synthetic rna for use in the treatment of dystrophic epidermolysis bullosa
CA2947941C (en) 2014-03-05 2021-02-23 National University Corporation Kobe University Genome sequence modification method for specifically converting nucleic acid bases of targeted dna sequence, and molecular complex for use in same
WO2015164748A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered transcription activator like effector (tale) proteins
EP3167071B1 (en) 2014-07-09 2020-10-07 Gen9, Inc. Compositions and methods for site-directed dna nicking and cleaving
US10190106B2 (en) 2014-12-22 2019-01-29 Univesity Of Massachusetts Cas9-DNA targeting unit chimeras
JP6873917B2 (ja) 2015-05-12 2021-05-19 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヌクレアーゼ介在性遺伝子発現調節
WO2017070633A2 (en) * 2015-10-23 2017-04-27 President And Fellows Of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
JP6928604B2 (ja) * 2015-11-04 2021-09-01 フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド 万能性細胞のゲノム改変
KR102061438B1 (ko) * 2015-11-27 2019-12-31 고쿠리츠다이가쿠호진 고베다이가쿠 표적화 dna 서열 중의 핵산 염기가 특이적으로 전환되어 있는 단자엽식물 게놈 서열을 전환시키는 방법, 및 그것에 사용되는 분자 복합체
CA3008413A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of the t cell receptor
JP7012650B2 (ja) 2016-02-02 2022-01-28 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｄｎａ結合ドメインと切断ドメインとを連結するための組成物
CN109983124B (zh) * 2016-06-02 2022-09-16 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 使用可编程dna结合蛋白增强靶向基因组修饰
WO2018039438A1 (en) * 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
JP7272948B2 (ja) 2016-08-24 2023-05-12 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 操作された標的特異的ヌクレアーゼ
JP2019531763A (ja) 2016-09-07 2019-11-07 フラッグシップ パイオニアリング， インコーポレイテッド 遺伝子発現をモジュレートするための方法および組成物
CN110337446A (zh) * 2016-12-21 2019-10-15 佛罗里达大学研究基金会 过继细胞疗法中ccr2+造血干细胞介导的t细胞激活
KR20230125856A (ko) * 2016-12-23 2023-08-29 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Pcsk9의 유전자 편집
WO2018119359A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11326157B2 (en) 2017-05-25 2022-05-10 The General Hospital Corporation Base editors with improved precision and specificity
KR20210049124A (ko) 2018-08-23 2021-05-04 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 조작된 표적 특이적 염기 편집기
EP4097124A1 (en) 2020-01-28 2022-12-07 The Broad Institute Inc. Base editors, compositions, and methods for modifying the mitochondrial genome
CA3207102A1 (en) 2021-01-12 2022-07-21 March Therapeutics, Inc. Context-dependent, double-stranded dna-specific deaminases and uses thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024063538A1 (ko) * 2022-09-21 2024-03-28 기초과학연구원 식물세포 소기관 dna의 염기 교정

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