JP2019500043A - 異常ヘモグロビン症の治療用組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2015年12月28日に出願された米国仮特許出願第62/271,968号明細書、および2016年6月8日に出願された米国仮特許出願第62/347,484号明細書に対する優先権を主張する。これらの出願の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
(a)配列番号6601;
(b)配列番号6602;
(c)配列番号6603;
(d)配列番号6604;または
(e)1、2、3、4、5、6または7個のウラシル(U)ヌクレオチド、例えば4個のウラシルヌクレオチドを3’末端にさらに含む上記(a)〜(d)のいずれかを含むgRNA分子を提供する。実施形態において、標的化ドメインと(a)〜(e)のいずれかの配列との間に介在ヌクレオチドはない。
(a)BCL11a遺伝子に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から独立して選択されるか;
(b)+58 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から独立して選択されるか;
(c)+62 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から独立して選択されるか;
(d)+55 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から独立して選択されるか;または
(e)HPFH領域に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から独立して選択される。
(a)第1のgRNA分子はBCL11a遺伝子に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子は+58 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(b)第1のgRNA分子はBCL11a遺伝子に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子は+62 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(c)第1のgRNA分子はBCL11a遺伝子に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子は+55 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(d)第1のgRNA分子はBCL11a遺伝子に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子はHPFH領域に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(e)第1のgRNA分子は+58 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子は+62 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(f)第1のgRNA分子は+58 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子は+55 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(g)第1のgRNA分子は+58 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子はHPFH領域に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(h)第1のgRNA分子は+62 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子は+55 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(i)第1のgRNA分子は+62 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子はHPFH領域に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(j)第1のgRNA分子は+55 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子はHPFH領域に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択される。
(a)HPFH領域に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択される第1のgRNA分子を含み、かつ第2のgRNA分子が、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むか;または
(b)BCL11aエンハンサー、例えば、+58 BCL11aエンハンサー、+55 BCL11aエンハンサーまたは+62 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択される第1のgRNA分子を含み、かつ第2のgRNA分子が、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
1)前述のgRNA分子の態様および実施形態のいずれかの1つ以上のgRNA分子、およびCas9分子(例えば、本明細書に記載されるとおりの);
2)前述のgRNA分子の態様および実施形態のいずれかの1つ以上のgRNA分子、およびCas9分子(例えば、本明細書に記載されるとおりの)をコードする核酸;
3)前述のgRNA分子の態様および実施形態のいずれかの1つ以上のgRNA分子をコードする核酸、およびCas9分子(例えば、本明細書に記載されるとおりの);
4)前述のgRNA分子の態様および実施形態の1つ以上のgRNA分子をコードする核酸、およびCas9分子(例えば、本明細書に記載されるとおりの)をコードする核酸;または
5)上記1)〜4)のいずれか、および鋳型核酸(例えば、本明細書に記載されるとおりの);
6)上記1)〜4)のいずれか、および鋳型核酸(例えば、本明細書に記載されるとおりの)をコードする配列を含む核酸;
7)本明細書に記載されるとおりの(例えば、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの)組成物;または
8)前述のベクターの態様および実施形態のいずれかのベクター
と接触させることを含む方法を提供する。
(a)細胞の集団を提供するステップと;
(b)エキソビボで幹細胞増殖剤の存在下で前記細胞を増殖させるステップと;
(c)第1のgRNA分子(例えば、本明細書に記載されるとおりの第1のgRNA分子、例えば、前述のgRNA分子の態様および実施形態のいずれかの第1のgRNA分子)、第1のgRNA分子をコードする核酸分子、または組成物(例えば、本明細書に記載されるとおりの組成物、例えば、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物)を前記細胞に導入するステップと
を含み、これによりステップ(c)に供されていない同じ細胞型と比べて前記細胞におけるヘモグロビン、例えば胎児ヘモグロビンの発現が増加する方法を提供する。
(a)gRNA分子の実施形態4のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;
(b)gRNA分子の実施形態5のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;
c)gRNA分子の実施形態6のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(d)gRNA分子の実施形態7のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(e)gRNA分子の実施形態41〜56のいずれかのgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である。
(a)gRNA分子の実施形態10のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(b)gRNA分子の実施形態11のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である。
(a)gRNA分子の実施形態13のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(b)gRNA分子の実施形態14のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である。
(a)gRNA分子の実施形態16のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;
(b)gRNA分子の実施形態17のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;
(c)gRNA分子の実施形態18のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(d)gRNA分子の実施形態57〜68のいずれかのgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である。
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態4のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態5のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態6のgRNA分子から選択されるか、(d)gRNA分子の実施形態7のgRNA分子から選択されるか、または(e)gRNA分子の実施形態41〜56のいずれかのgRNA分子から選択され;および
(2)第2のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態10のgRNA分子から選択されるか、または(b)gRNA分子の実施形態11のgRNA分子から選択される。
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態4のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態5のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態6のgRNA分子から選択されるか、(d)gRNA分子の実施形態7のgRNA分子から選択されるか、または(e)gRNA分子の実施形態41〜56のいずれかのgRNA分子から選択され;および
(2)第2のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態13のgRNA分子から選択され、(b)gRNA分子の実施形態14のgRNA分子から選択される。
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態4のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態5のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態6のgRNA分子から選択されるか、(d)gRNA分子の実施形態7のgRNA分子から選択されるか、または(e)gRNA分子の実施形態41〜56のいずれかのgRNA分子から選択され;および
(2)第2のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態16のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態17のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態18のgRNA分子から選択されるか、または(d)gRNA分子の実施形態57〜68のいずれかのgRNA分子から選択される。
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態10のgRNA分子から選択されるか、または(b)gRNA分子の実施形態11のgRNA分子から選択され;および
(2)第2のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態13のgRNA分子から選択され、(b)gRNA分子の実施形態14のgRNA分子から選択される。
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態10のgRNA分子から選択されるか、または(b)gRNA分子の実施形態11のgRNA分子から選択され;および
(2)第2のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態16のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態17のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態18のgRNA分子から選択されるか、または(d)gRNA分子の実施形態57〜68のいずれかのgRNA分子から選択される。
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態13のgRNA分子から選択され、(b)gRNA分子の実施形態14のgRNA分子から選択され;および
(2)第2のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態16のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態17のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態18のgRNA分子から選択されるか、または(d)gRNA分子の実施形態57〜68のいずれかのgRNA分子から選択される。
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態16のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態17のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態18のgRNA分子から選択されるか、または(d)gRNA分子の実施形態57〜68のいずれかのgRNA分子から選択され;および(2)第2のgRNA分子は、βグロビン遺伝子の標的配列と相補的な標的化ドメインを含むか;または
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態4のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態5のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態6のgRNA分子から選択されるか、(d)gRNA分子の実施形態7のgRNA分子から選択されるか、(e)gRNA分子の実施形態41〜56のいずれかのgRNA分子から選択されるか、(f)gRNA分子の実施形態10のgRNA分子から選択されるか、(g)gRNA分子の実施形態11のgRNA分子から選択されるか、(h)gRNA分子の実施形態13のgRNA分子から選択されるか、または(i)gRNA分子の実施形態14のgRNA分子から選択され;および(2)第2のgRNA分子は、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
用語「CRISPRシステム」、「Casシステム」または「CRISPR/Casシステム」は、一緒になって標的配列でRNAガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子による核酸の修飾を誘導し達成するのに必要かつ十分なRNAガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子とgRNA分子とを含む分子の組を指す。一実施形態において、CRISPRシステムは、gRNAとCasタンパク質、例えばCas9タンパク質とを含む。Cas9または修飾Cas9分子を含むかかるシステムは、本明細書では「Cas9システム」または「CRISPR/Cas9システム」と称される。一例において、gRNA分子とCas分子とは複合体化してリボ核タンパク質(RNP)複合体を形成し得る。
アイソフォーム2:Q9H165−2
アイソフォーム3:Q9H165−3
アイソフォーム4:Q9H165−4
アイソフォーム5:Q9H165−5
アイソフォーム6:Q9H165−6
gRNA分子は、以下にさらに詳しく記載するとおり幾つものドメインを有し得るが、しかしながら、gRNA分子は、典型的には、少なくともcrRNAドメイン(標的化ドメインを含む)とtracrとを含む。CRISPRシステムの一成分として使用される本発明のgRNA分子は、標的部位にまたはその近傍にあるDNAの修飾(例えば、配列の修飾)に有用である。かかる修飾には、例えば標的部位を含む遺伝子の機能性産物の発現の低下または消失をもたらす欠失および/または挿入が含まれる。これらの使用およびさらなる使用について、以下にさらに詳しく説明する。
[標的化ドメイン]−[crRNAフラッグポール領域]−[任意選択の第1のフラッグポール伸長部]−[ループ]−[任意選択の第1のtracr伸長部]−[tracrフラッグポール領域]−[tracrヌクレアーゼ結合ドメイン]。
ポリヌクレオチド1(crRNA):[標的化ドメイン]−[crRNAフラッグポール領域]−[任意選択の第1のフラッグポール伸長部]−[任意選択の第2のフラッグポール伸長部]
ポリヌクレオチド2(tracr):[任意選択の第1のtracr伸長部]−[tracrフラッグポール領域]−[tracrヌクレアーゼ結合ドメイン]。
を含み、好ましくは配列番号6584を含むgRNA分子に使用される。
を含み、好ましくは配列番号6585を含むgRNA分子に使用される。
1)標的化ドメイン:
標的化ドメインの選択に関する指針については、例えば、Fu Y el al.NAT BIOTECHNOL 2014(doi:10.1038/nbt.2808)およびSternberg SH el al.NATURE 2014(doi:10.1038/naturel3011)を参照することができる。
フラッグポールは、crRNAおよびtracrの両方からの一部分を含む。crRNAフラッグポール領域はtracrの一部分に相補的であり、ある実施形態では、少なくとも一部の生理条件下、例えば通常の生理条件下で二重鎖化した領域を形成するのに十分なtracrの一部分との相補性を有する。ある実施形態において、crRNAフラッグポール領域は5〜30ヌクレオチド長である。ある実施形態において、crRNAフラッグポール領域は5〜25ヌクレオチド長である。crRNAフラッグポール領域は、細菌CRISPRアレイからのリピート配列の天然に存在する一部分と相同性を共有するかまたはそれに由来し得る。ある実施形態において、これは本明細書に開示されるcrRNAフラッグポール領域、例えば化膿レンサ球菌(S.pyogenes)またはS.サーモフィルス(S.thermophilus)crRNAフラッグポール領域と少なくとも50%の相同性を有する。
第1のtracr伸長部を含むtracrが使用されるとき、crRNAは第1のフラッグポール伸長部を含み得る。一般に任意の第1のフラッグポール伸長部および第1のtracr伸長部を用いることができ、但しそれらは相補的であるものとする。実施形態において、第1のフラッグポール伸長部および第1のtracr伸長部は、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれを超える相補ヌクレオチドからなる。
ループは、sgRNAのcrRNAフラッグポール領域(または存在する場合には任意選択で第1のフラッグポール伸長部)をtracr(または存在する場合には任意選択で第1のtracr伸長部)と連結する役割を果たす。ループはcrRNAフラッグポール領域とtracrとを共有結合的または非共有結合的に連結し得る。ある実施形態において、この連結は共有結合性である。ある実施形態において、ループはcrRNAフラッグポール領域とtracrとを共有結合的にカップリングする。ある実施形態において、ループは第1のフラッグポール伸長部と第1のtracr伸長部とを共有結合的にカップリングする。ある実施形態において、ループは、crRNAフラッグポール領域と、crRNAフラッグポール領域にハイブリダイズするtracrのドメインとの間に介在する共有結合であるか、またはそれを含む。典型的には、ループは1ヌクレオチド以上、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、dgRNAは、crRNAフラッグポール領域、または存在する場合には第1のフラッグポール伸長部の3’側に、本明細書において第2のフラッグポール伸長部と称される追加的な配列を含み得る。ある実施形態において、第2のフラッグポール伸長部は、2〜10、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、または2〜4ヌクレオチド長である。ある実施形態において、第2のフラッグポール伸長部は、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド長であるかまたはそれを超える。ある実施形態において、第2のフラッグポール伸長部は配列番号6587を含む。
tracrは、ヌクレアーゼ、例えばCas9の結合に必要な核酸配列である。理論によって拘束されるものではないが、各Cas9種が特定のtracr配列に関連付けられると考えられる。tracr配列はsgRNAおよびdgRNAの両方のシステムで利用される。ある実施形態において、tracrは、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)tracrからの配列を含むかまたはそれに由来する。一部の態様において、tracrは、crRNAのフラッグポール部分にハイブリダイズする一部分、例えば、少なくともある生理条件下で二重鎖化した領域を形成するのに十分なcrRNAフラッグポール領域との相補性を有する一部分(ときに本明細書においてtracrフラッグポール領域またはcrRNAフラッグポール領域と相補的なtracrドメインと称されることもある)を有する。実施形態において、crRNAフラッグポール領域とハイブリダイズするtracrのドメインは、crRNAフラッグポール領域の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドを含む。一部の態様において、crRNAフラッグポール領域の相補ヌクレオチドとハイブリダイズするtracrヌクレオチドは連続している。一部の態様において、crRNAフラッグポール領域の相補ヌクレオチドとハイブリダイズするtracrヌクレオチドは不連続であり、例えば、crRNAフラッグポール領域のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドによって分離された2つ以上のハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様において、crRNAフラッグポール領域にハイブリダイズするtracrの一部分は、5’から3’に、UAGCAAGUUAAAA(配列番号6597)を含む。一部の態様において、crRNAフラッグポール領域にハイブリダイズするtracrの一部分は、5’から3’に、UAGCAAGUUUAAA(配列番号6598)を含む。実施形態において、crRNAフラッグポール領域とハイブリダイズする配列は、ヌクレアーゼ、例えばCas分子、例えばCas9分子をさらに結合するtracrの配列の5’側のtracr上に配置される。
UAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号6599)
を含む。一部の態様において、Cas9分子をさらに結合するドメインは、5’から3’に、
UAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(配列番号6600)
を含む。
crRNA:
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAU*mG*mC*mU
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する);および
tracr:
(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
crRNA:
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAU*mG*mC*mU
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する);および
tracr:
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
crRNA:
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する);および
tracr:
(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
crRNA:
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する);および
tracr:
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、および*はホスホロチオエート結合を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
crRNA:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG
(式中、Nは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する);および
tracr:
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、および*はホスホロチオエート結合を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
gRNAが第1のフラッグポール伸長部を含む場合、tracrは第1のtracr伸長部を含み得る。第1のtracr伸長部は、第1のフラッグポール伸長部のヌクレオチドと相補的、例えば、80%、85%、90%、95%または99%、例えば完全に相補的なヌクレオチドを含み得る。一部の態様において、第1のフラッグポール伸長部の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする第1のtracr伸長部ヌクレオチドは連続している。一部の態様において、第1のフラッグポール伸長部の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする第1のtracr伸長部ヌクレオチドは不連続であり、例えば、第1のフラッグポール伸長部のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドによって分離された2つ以上のハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様において、第1のtracr伸長部は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれを超えるヌクレオチドを含む。一部の態様において、第1のtracr伸長部は配列番号6591を含む。一部の態様において第1のtracr伸長部は、配列番号6591と少なくとも80%、85%、90%、95%または99%の相同性である核酸を含む。
e)3’末端に少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のウラシル(U)ヌクレオチド、例えば、1、2、3、4、5、6、または7個のウラシル(U)ヌクレオチドをさらに含む上記a)〜d)のいずれか;
f)3’末端に少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のアデニン(A)ヌクレオチド、例えば、1、2、3、4、5、6、または7個のアデニン(A)ヌクレオチドをさらに含む上記a)〜d)のいずれか;または
g)5’末端(例えば、5’側端、例えば、標的化ドメインの5’側)に、少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のアデニン(A)ヌクレオチド、例えば、1、2、3、4、5、6、または7個のアデニン(A)ヌクレオチドをさらに含む上記a)〜f)のいずれか。実施形態において、上記a)〜g)のいずれかは、標的化ドメインのすぐ3’側に配置される。
を含む、例えばそれからなる。
[標的化ドメイン]−
を含む、例えばそれからなる。
5’から3’に、好ましくは標的化ドメインのすぐ3’側に配置された以下を含むcrRNA:
a) GUUUUAGAGCUA(配列番号6584);
b) GUUUAAGAGCUA(配列番号6585);
c) GUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号6605);
d) GUUUAAGAGCUAUGCUG(配列番号6606);
e) GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号6607);
f) GUUUAAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号6608);または
g) GUUUUAGAGCUAUGCU (配列番号7806):
および5’から3’に以下を含むtracr:
k)3’末端に少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のウラシル(U)ヌクレオチド、例えば、1、2、3、4、5、6、または7個のウラシル(U)ヌクレオチドをさらに含む上記a)〜j)のいずれか;
l)3’末端に少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のアデニン(A)ヌクレオチド、例えば、1、2、3、4、5、6、または7個のアデニン(A)ヌクレオチドをさらに含む上記a)〜j)のいずれか;または
m)5’末端に(例えば、5’側端に)少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のアデニン(A)ヌクレオチド、例えば、1、2、3、4、5、6、または7個のアデニン(A)ヌクレオチドをさらに含む上記a)〜l)のいずれか。
を含む、例えばそれからなるtracrとを含む、例えばそれからなる。
を含む、例えばそれからなるtracrとを含む、例えばそれからなる。
を含む、例えばそれからなるtracrとを含む、例えばそれからなる。
を含む、例えばそれからなるtracrとを含む、例えばそれからなる。
を含む、例えばそれからなるtracrとを含む、例えばそれからなる。
以下の表に、本発明の様々な態様、例えば、グロビン遺伝子、例えば胎児ヘモグロビン遺伝子またはヘモグロビンβ遺伝子の発現の改変に用いられるgRNA分子の標的化ドメインを提供する。
子は、それぞれ配列番号99および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号99を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配
列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号1
589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番
号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
NA分子は、それぞれ配列番号248および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号248および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号248および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号248および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号185を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRN
A分子は、それぞれ配列番号250および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号250を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
NA分子は、それぞれ配列番号310および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号310および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号310および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号289を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
A分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1656を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1
609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列
番号1677および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
gRNAの設計方法が、標的配列の選択、設計および検証方法を含め、本明細書に記載される。例示的標的化ドメインも本明細書に提供される。本明細書で考察される標的化ドメインは、本明細書に記載されるgRNAに組み込むことができる。
Cas9分子
好ましい実施形態において、Cas分子はCas9分子である。本明細書に記載される方法および組成物では、様々な種のCas9分子を使用することができる。化膿レンサ球菌(S.pyogenes)Cas9分子が本明細書における開示の多くの主題であるが、本明細書に挙げる他の種のCas9タンパク質のCas9分子、それに由来するCas9分子、またはそれをベースとするCas9分子も同様に使用することができる。換言すれば、他のCas9分子、例えば、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)および/または髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)Cas9分子が、本明細書に記載されるシステム、方法および組成物で用いられ得る。さらなるCas9種としては、アシドボラクス・アベナエ(Acidovorax avenae)、アクチノバチルス・プルロニューモニエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)、アクチノバチルス・サクシノゲネス(Actinobacillus succinogenes)、アクチノバチルス・スイス(Actinobacillus suis)、アクチノミセス属種(Actinomyces sp.)、アリサイクリフィルス・デニトリフィカンス(Alicycliphilus denitrificans)、アミノモナス・パウシボランス(Aminomonas paucivorans)、セレウス菌(Bacillus cereus)、バチルス・スミシイ(Bacillus smithii)、バチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス属種(Bacteroides sp.)、ブラストピレルラ・マリナ(Blastopirellula marina)、ブラディリゾビウム属種(Bradyrhizobium sp.)、ブレビバチルス・ラテロスポラス(Brevibacillus laterosporus)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラド(Campylobacter lad)、カンジダツス・プニセイスピリルム(Candidatus Puniceispirillum)、クロストリジウム・セルロリティカム(Clostridium cellulolyticum)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、コリネバクテリウム・アクコレンス(Corynebacterium accolens)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria)、コリネバクテリウム・マツルショッティイ(Corynebacterium matruchotii)、ディノロセオバクター・シバエ(Dinoroseobacter shibae)、ユーバクテリウム・ドリクム(Eubacterium dolichum)、ガンマプロテオバクテリア(gamma proteobacterium)、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス(Gluconacetobacter diazotrophicus)、パラインフルエンザ菌(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・スプトルム(Haemophilus sputorum)、ヘリコバクター・カナデンシス(Helicobacter canadensis)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ムステラエ(Helicobacter mustelae)、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytropus)、キンゲラ・キンゲ(Kingella kingae)、ラクトバチルス・クリスパタス(Lactobacillus crispatus)、リステリア・イバノビイ(Listeria ivanovii)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリア科(Listeriaceae)細菌、メチロシスティス属種(Methylocystis sp.)、メチロサイナス・トリコスポリウム(Methylosinus trichosporium)、モビルンカス・ムリエリス(Mobiluncus mulieris)、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)、黄色球菌(Neisseria flavescens)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)、ナイセリア属種(Neisseria sp.)、ナイセリア・ワズワーシイ(Neisseria wadsworthii)、ニトロソモナス属種(Nitrosomonas sp.)、パルビバクラム・ラバメンチボランス(Parvibaculum lavamentivorans)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ファスコラルクトバクテリウム・スクシナツテンス(Phascolarctobacterium succinatutens)、ラルストニア・シジジイ(Ralstonia syzygii)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、ロドブラム属種(Rhodovulum sp.)、シモンシエラ・ムエレリ(Simonsiella muelleri)、スフィンゴモナス属種(Sphingomonas sp.)、スポロラクトバチルス・ビネエ(Sporolactobacillus vineae)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、ストレプトコッカス属種(Streptococcus sp.)、サブドリグラヌルム属種(Subdoligranulum sp.)、ティストレラ・モビリス(Tistrella mobilis)、トレポネーマ属種(Treponema sp.)、またはベルミネフォロバクター・エイセニエ(Verminephrobacter eiseniae)が挙げられる。
と60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の相同性を有するアミノ酸配列を含み、それと比較したときに1%、2%、5%、10%、15%、20%、30%、または40%以下のアミノ酸残基が異なるか、それと1、2、5、10または20アミノ酸以上100、80、70、60、50、40または30アミノ酸以下異なるか、またはそれと同一である。
天然に存在するCas9分子は、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性(例えば、エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活性);ヘリカーゼ活性;gRNA分子と機能的に関連する能力;および核酸上の部位を標的化する(またはそこに局在化する)能力(例えば、PAM認識および特異性)を含め、幾つもの特性を有する。ある実施形態において、Cas9分子はこれらの特性の全てまたは一部を含み得る。典型的な実施形態において、Cas9分子はgRNA分子と相互作用し、gRNA分子と協力して核酸の部位に局在化する能力を有する。他の活性、例えば、PAM特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活性はCas9分子でより広く異なり得る。
天然に存在するCas9分子は、特異的PAM配列、例えば、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、黄色ブドウ球菌(S.aureus)および髄膜炎菌(N.meningitidis)について上記に記載したPAM認識配列を認識することができる。
ある実施形態において、Cas9分子は、天然に存在するCas9分子と異なる、例えば、最も近い相同性を有する天然に存在するCas9分子と異なる切断特性を含む。例えば、Cas9分子は、天然に存在するCas9分子、例えば化膿レンサ球菌(S.pyogenes)のCas9分子と以下のとおり異なり得る:例えば天然に存在するCas9分子(例えば、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)のCas9分子)と比較したときに二本鎖切断の切断(エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活性)を調整する、例えば低下または増加させるその能力;例えば天然に存在するCas9分子(例えば、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)のCas9分子)と比較したときに核酸の一本鎖、例えば核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖の切断(ニッカーゼ活性)を調整する、例えば低下または増加させるその能力;または核酸分子、例えば二本鎖または一本鎖核酸分子を切断する能力を除去し得る。
ある実施形態において、活性Cas9分子は、以下の活性の1つ以上を含む:N末端RuvC様ドメインに関連する切断活性;HNH様ドメインに関連する切断活性;HNHドメインに関連する切断活性およびN末端RuvC様ドメインに関連する切断活性。
ある実施形態において、改変Cas9分子は、核酸分子を(二本鎖核酸分子または一本鎖核酸分子のいずれも)切断しない、または核酸分子を著しく低い効率で、例えば、本明細書に記載されるアッセイによって例えば計測したときに参照Cas9分子の切断活性の20、10、5、1または0.1%未満の効率で切断する不活性Cas9分子である。参照Cas9分子は、天然に存在する非修飾Cas9分子、例えば、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、黄色ブドウ球菌(S.aureus)または髄膜炎菌(N.meningitidis)のCas9分子など、天然に存在するCas9分子であり得る。ある実施形態において、参照Cas9分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然に存在するCas9分子である。ある実施形態において、不活性Cas9分子は、実質的なN末端RuvC様ドメインに関連する切断活性およびHNH様ドメインに関連する切断活性を欠いている。
実施形態において、Cas9分子、例えば化膿レンサ球菌(S.pyogenes)のCas9は、さらなる活性を付与する1つ以上のアミノ酸配列をさらに含み得る。
Cas9分子、例えば活性Cas9分子または不活性Cas9分子をコードする核酸が本明細書に提供される。
候補Cas9分子、候補gRNA分子、候補Cas9分子/gRNA分子複合体は、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり評価することができる。例えば、Cas9分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価する例示的方法が、例えば、Jinek el al.,SCIENCE 2012;337(6096):816−821に記載されている。
用語「鋳型核酸」または「ドナー鋳型」は、本明細書で使用されるとき、本発明のCRISPRシステムによって修飾、例えば切断された標的配列にまたはその近傍に挿入される核酸を指す。ある実施形態において、標的配列のまたはその近傍の核酸配列が、典型的には1つまたは複数の切断部位にまたはその近傍に鋳型核酸の配列の一部または全てを有するように修飾される。ある実施形態において、鋳型核酸は一本鎖である。代替的実施形態において、鋳型核酸は二本鎖である。ある実施形態において、鋳型核酸はDNA、例えば二本鎖DNAである。代替的実施形態において、鋳型核酸は一本鎖DNAである。
本明細書に記載されるとおり、ヌクレアーゼ誘導相同組換え修復(HDR)または相同的組換え(HR)を用いて標的配列を改変し、およびゲノムの突然変異を修正(例えば、修復または編集)することができる。理論によって拘束されることを望むものではないが、標的配列の改変は、ドナー鋳型または鋳型核酸に基づく修復によって起こると考えられる。例えば、ドナー鋳型または鋳型核酸が標的配列の改変をもたらす。プラスミドドナーまたは線状二本鎖鋳型を相同的組換えの鋳型として使用し得ることが企図される。さらに、一本鎖ドナー鋳型を標的配列とドナー鋳型との間の代替的相同組換え修復方法(例えば、一本鎖アニーリング)による標的配列の改変の鋳型として使用し得ることが企図される。ドナー鋳型によって達成される標的配列の改変は、Cas9分子による切断に依存し得る。Cas9による切断には、二本鎖切断、1つの一本鎖切断、または2つの一本鎖切断が含まれ得る。
ある実施形態において、HNH様ドメインに関連する切断活性とRuvC様ドメイン、例えばN末端RuvC様ドメインに関連する切断活性とを有するCas9分子、例えば野生型Cas9によって二本鎖切断が達成される。かかる実施形態には単一のgRNAのみが必要である。
他の実施形態において、ニッカーゼ活性、例えばHNH様ドメインに関連する切断活性またはN末端RuvC様ドメインに関連する切断活性を有するCas9分子によって2つの一本鎖切断、すなわちニックが達成される。かかる実施形態には、各一本鎖切断の配置につき1つずつ、2つのgRNAが必要である。ある実施形態において、ニッカーゼ活性を有するCas9分子は、gRNAがハイブリダイズする鎖を切断し、gRNAがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖は切断しない。ある実施形態において、ニッカーゼ活性を有するCas9分子は、gRNAがハイブリダイズする鎖を切断せず、むしろgRNAがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖を切断する。
鎖の一方における二本鎖切断点または一本鎖切断点は、修正が起こるように標的位置に十分に近くなければならない。ある実施形態において、距離は50、100、200、300、350または400ヌクレオチド以下である。理論によって拘束されることを望むものではないが、切断点は、末端リセクション間に切断点がエキソヌクレアーゼ媒介性の除去を受ける領域内にあるように、標的位置に十分に近くなければならないと考えられる。ドナー配列は末端リセクション領域内の配列の修正にのみ用いられ得ることに伴い、標的位置と切断点との間の距離が離れ過ぎている場合、末端リセクションに突然変異が含まれないこともあり、したがって修正されないこともある。
相同性アームは、例えばリセクションされた一本鎖オーバーハングがドナー鋳型内の相補領域を見付けることを可能にするため、少なくとも末端リセクションが起こり得る領域のところまで延在しなければならない。全長は、プラスミドサイズまたはウイルスパッケージング限界などのパラメータによって制限され得る。ある実施形態において、相同性アームは反復エレメント、例えばALUリピート、LINEリピートまでは延在しない。鋳型は同じまたは異なる長さの2つの相同性アームを有し得る。
ポジティブ制御エレメントの活性の低下;
ポジティブ制御エレメントの活性の増加;
ネガティブ制御エレメントの活性の低下;
ネガティブ制御エレメントの活性の増加;
遺伝子の発現の低下;
遺伝子の発現の増加;
障害または疾患に対する抵抗性の増加;
ウイルス侵入に対する抵抗性の増加;
突然変異の修正または望ましくないアミノ酸残基の改変;
遺伝子産物の生物学的特性の付与、増加、消失または低下、例えば、酵素の酵素活性の増加、または遺伝子産物が別の分子と相互作用する能力の増加。
標的配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12ヌクレオチドまたはそれを超える配列の変化。
[5’相同性アーム]−[挿入配列]−[3’相同性アーム]。
本明細書に記載されるとおり、ヌクレアーゼ誘導性非相同末端結合(NHEJ)を用いて遺伝子特異的ノックアウトを標的化することができる。ヌクレアーゼ誘導性NHEJを用いてまた、目的の遺伝子の配列を除去する(例えば、欠失させる)こともできる。
NHEJ媒介性インデルを誘導する目的でgRNAおよびCas9ヌクレアーゼが二本鎖切断を作成する実施形態において、gRNA、例えば単分子(またはキメラ)またはモジュラーgRNA分子は、標的位置のヌクレオチドにごく接近して1つの二本鎖切断を置くように構成される。ある実施形態において、切断部位は標的位置から0〜500bp(例えば、標的位置から500、400、300、200、100、50、40、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1bp未満)離れている。
理論によって拘束されることを意図するものではないが、意外にも、本明細書では、連続核酸上でごく近接して位置する2つの標的配列を(例えば、各々がそのそれぞれの標的配列にまたはその近傍に一本鎖または二本鎖切断を誘導する2つのgRNA分子/Cas9分子複合体によって)標的化すると、2つの標的配列間に位置する核酸配列(または核酸配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%)の切り出し(例えば、欠失)が誘導されることが示されている。一部の態様において、本開示は、連続核酸、例えば染色体、例えばそのイントロン、エクソンおよび調節エレメントを含めた遺伝子または遺伝子座上でごく近接した標的配列を標的化する標的化ドメインを含む2つ以上のgRNA分子の使用を提供する。この使用は、例えば、2つ以上のgRNA分子を1つ以上のCas9分子と共に(または2つ以上のgRNA分子および/または1つ以上のCas9分子をコードする核酸を)細胞に導入することにより得る。
さらに、意外にも、本明細書では、gRNA分子および前記gRNA分子を含むCRISPRシステムが、同じ細胞型、送達方法およびcrRNA/tracr成分を使用すると複数の実験にわたって同様または同一のインデルパターンを生じることが示されている。理論によって拘束されるものではないが、ある種のインデルパターンが他よりも有利であり得ると考えられる。例えば、「フレームシフト突然変異」(例えば、1塩基対または2塩基対の挿入または欠失、またはn/3(式中、n=挿入または欠失におけるヌクレオチドの数)が整数でない場合の任意の挿入または欠失)をもたらす挿入および/または欠失を主に含むインデルが、機能タンパク質の発現を低下または消失させるのに有益であり得る。同様に、「大規模欠失」(10、11、12、13、14、15、20、25、または30ヌクレオチドより多い欠失)を主に含むインデルも、例えば、同様に機能タンパク質の発現に向上した効果を及ぼし得るプロモーター結合部位などの重要な調節配列の除去に有益であり得る。所与のgRNA/CRISPRシステムによって誘導されるインデルパターンは、意外にも、本明細書に記載されるとおり、細胞型にわたって一貫して再現されることが分かっているが、所与の細胞においてgRNA/CRISPRシステムの導入時にいずれかの単一のインデル構造が必ず生じるわけではない。
成分、例えばCas9分子またはgRNA分子、または両方は、種々の形態で送達、製剤化、または投与することができる。非限定的な例として、gRNA分子およびCas9分子は、(1つ以上の組成物に)製剤化し、ゲノム編集イベントが所望される細胞に直接送達または投与することができる。あるいは、1つ以上の成分、例えばCas9分子またはgRNA分子、または両方をコードする核酸を(1つ以上の組成物に)製剤化して送達または投与することもできる。一態様において、gRNA分子は、gRNA分子をコードするDNAとして提供され、およびCas9分子は、Cas9分子をコードするDNAとして提供される。一実施形態において、gRNA分子とCas9分子とは別個の核酸分子上にコードされる。一実施形態において、gRNA分子とCas9分子とは同じ核酸分子上にコードされる。一態様において、gRNA分子はRNAとして提供され、およびCas9分子は、Cas9分子をコードするDNAとして提供される。一実施形態において、gRNA分子は、例えば本明細書に記載されるとおりの、1つ以上の修飾を伴い提供される。一態様において、gRNA分子はRNAとして提供され、およびCas9分子は、Cas9分子をコードするmRNAとして提供される。一態様において、gRNA分子はRNAとして提供され、およびCas9分子はタンパク質として提供される。一実施形態において、gRNAおよびCas9分子はリボ核タンパク質複合体(RNP)として提供される。一態様において、gRNA分子は、gRNA分子をコードするDNAとして提供され、およびCas9分子はタンパク質として提供される。
Cas9分子および/またはgRNA分子をコードするDNAは、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり対象に投与し、または細胞に送達することができる。例えば、Cas9コードDNAおよび/またはgRNAコードDNAは、例えば、ベクター(例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター)、非ベクターベースの方法(例えば、ネイキッドDNAまたはDNA複合体を使用して)、またはこれらの組み合わせによって送達することができる。
Cas9分子(例えば、活性Cas9分子、不活性Cas9分子または不活性Cas9融合タンパク質)および/またはgRNA分子をコードするRNAは、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり、細胞、例えば本明細書に記載される標的細胞に送達することができる。例えば、Cas9コードRNAおよび/またはgRNAコードRNAは、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、またはこれらの組み合わせによって送達することができる。
Cas9分子(例えば、活性Cas9分子、不活性Cas9分子または不活性Cas9融合タンパク質)は、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり細胞に送達することができる。例えば、Cas9タンパク質分子は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、セルスクイージングまたはアブレーション(例えば、ナノニードルによる)またはこれらの組み合わせによって送達することができる。送達は、gRNAをコードするDNAによるか、またはgRNAにより、例えばgRNAとCas9タンパク質とをリボ核タンパク質複合体(RNP)に予め複合体化することによって達成し得る。
1.Cas9分子およびtracrを溶液中に高濃度(例えば、細胞に送達される最終RNP濃度よりも高い濃度)で提供し、これらの2つの成分を平衡化させる;
2.crRNA分子を提供し、成分を平衡化させる(それによりRNPの高濃度溶液を形成する);
3.RNP溶液を所望の濃度に希釈する;
4.前記所望の濃度の前記RNPを標的細胞に例えばエレクトロポレーションによって送達する。
Casシステムの成分、例えばCas9分子成分およびgRNA分子成分を別々に送達する、より詳細には成分を異なる様式で送達すると、例えば組織特異性および安全性が改善されるため、パフォーマンスを増進させることができる。
本明細書に記載されるCas9システム、例えば、1つ以上のgRNA分子および1つ以上のCas9分子は、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患の治療に有用である。用語「〜を治療する」、「治療された」、「治療している」、および「治療」には、cas9システム、例えば1つ以上のgRNA分子および1つ以上のcas9分子を細胞に投与することにより、疾患の症状、合併症、または生化学的徴候を予防し、またはその発生を遅延させること、疾患、病態、または障害の症状を軽減し、またはそのさらなる発症を阻止または阻害することが含まれる。治療には、本発明のgRNA分子(または2つ以上のgRNA分子)の導入により、または本明細書に記載されるとおりのCRISPRシステムの導入により、または本明細書に記載される前記細胞の調製方法のいずれかによって修飾された1つ以上の細胞、例えばHSPC(例えば、その集団)の投与により、疾患の症状、合併症、または生化学的徴候を予防し、またはその発生を遅延させること、疾患、病態、または障害の症状を軽減し、またはそのさらなる発症を阻止または阻害することも含まれ得る。治療は予防的であってもよく(それにより疾患を予防し、またはその発生を遅延させるか、またはその臨床的もしくは準臨床的症状の発現を予防する)、または疾患発現後の症状の療法的抑制または軽減であってもよい。治療は、本明細書に記載される療法的手段によって計測することができる。したがって、本発明の「治療」方法には、細胞へのcas9システム(例えば、1つ以上のgRNA分子および1つ以上のCas9分子)の導入によって改変された細胞を対象に投与することにより、疾患または病態の1つ以上の症状を治癒し、その重症度を低減し、またはそれを改善すること、かかる治療がない場合の予想を超えて対象の健康または生存を延ばすことも含まれる。例えば、「治療」には、対象の疾患症状の少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれを超える軽減が含まれる。
異常ヘモグロビン症には、赤血球細胞(RBC)の産生低下および/または破壊増加(溶血)がある遺伝的原因の幾つもの貧血症が含まれる。それらには、酸素濃度を維持する能力の低下が付随する異常ヘモグロビンの産生をもたらす遺伝的欠陥も含まれる。かかる障害の中には、正常なβ−グロビンを十分な量で産生できないことが関係するものもあれば、正常なβ−グロビンを全く産生できないことが関係するものもある。β−グロビンタンパク質に関連するこれらの障害は、一般にβヘモグロビン異常症と称される。例えば、β−サラセミアは、β−グロビン遺伝子の発現の部分的または完全な欠損がHbA欠損または欠如につながることによって起こる。鎌状赤血球貧血は、β−グロビン構造遺伝子の点突然変異が異常な(鎌状の)ヘモグロビン(HbS)の産生につながることによって起こる。HbSは、特に脱酸素化条件下で重合し易い。HbS RBCは正常RBCと比べて脆弱で溶血を起こし易く、最終的に貧血につながる。
鎌状赤血球症は、ヘモグロビンに影響を及ぼす一群の障害である。この障害を持つ人は異型ヘモグロビン分子(ヘモグロビンS)を有し、これによって赤血球細胞が歪んで鎌状、または三日月形の形状になり得る。この障害に特有の特徴としては、低赤血球細胞数(貧血症)、反復感染、および周期性疼痛発作が挙げられる。
βサラセミアは、ヘモグロビンの産生が低下する血液障害である。βサラセミアの人では、低レベルのヘモグロビンが体の多くの箇所の酸素欠乏につながる。罹患者はまた、赤血球細胞の不足も有し(貧血)、そのため青白い皮膚、脱力感、疲労、およびより重篤な合併症を生じ得る。βサラセミアの人は血液凝固異常を発症するリスクが高い。
別の態様において、本発明は治療方法を提供する。態様において、本発明のgRNA分子、CRISPRシステムおよび/または細胞を使用して、それを必要としている患者が治療される。態様において、患者は哺乳動物、例えばヒトである。態様において、患者は異常ヘモグロビン症を有する。実施形態において、患者は鎌状赤血球症を有する。実施形態において、患者はβサラセミアを有する。
a)哺乳動物からHSPC(例えば、CD34+細胞)の集団を提供する、例えば採取または単離するステップ;
b)前記細胞をエキソビボで、例えば細胞培養培地中に、任意選択で少なくとも1つの幹細胞増殖剤を含む組成物の有効量の存在下で提供するステップであって、それにより前記HSPC(例えば、CD34+細胞)の集団を未処理の集団よりも高い程度に増殖させるステップ;
c)HSPC(例えば、CD34+細胞)の集団を、有効量の、本明細書に記載される標的化ドメイン、例えば、表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、または表9に記載される標的化ドメインを含む少なくとも1つのgRNA分子、または前記gRNA分子をコードする核酸と、例えば本明細書に記載される少なくとも1つのcas9分子、または前記cas9分子をコードする核酸とを含む組成物、例えば本明細書に記載されるとおりの1つ以上のRNPに、例えば、本明細書に記載されるCRISPRシステムに接触させるステップ;
d)集団の細胞の少なくとも一部(例えば、集団のHSPC、例えばCD34+細胞の少なくとも一部)に少なくとも1つの修飾を生じさせるステップであって、それにより、例えば、前記HSPCが赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化したとき、例えばステップc)により接触させていない細胞と比べて胎児ヘモグロビン発現が増加するステップ;および
f)前記修飾HSPC(例えば、CD34+細胞)を含む細胞の集団を哺乳動物に戻すステップ
を含む。
a)例えば哺乳動物の骨髄から、哺乳動物のHSPC(例えば、CD34+細胞)の集団を提供する、例えば採取または単離するステップ;
b)ステップa)の細胞の集団からCD34+細胞を単離するステップ;
c)前記CD34+細胞をエキソビボで提供し、および前記細胞を例えば細胞培養培地中、少なくとも1つの幹細胞増殖剤、例えば化合物4、例えば約0.5〜約0.75マイクロモル濃度の化合物4を含む組成物の有効量の存在下で培養するステップであって、それにより前記CD34+細胞の集団を未処理の集団よりも高い程度に増殖させるステップ;
d)CD34+細胞の集団の細胞に、有効量の、例えば本明細書に記載されるとおりのCas9分子と、例えば本明細書に記載されるとおりのgRNA分子とを含む組成物を導入するステップであって、例えば、任意選択でCas9分子およびgRNA分子は、例えば本明細書に記載されるとおりのRNPの形態であり、および任意選択で前記導入は、前記細胞への前記RNPの、例えば本明細書に記載されるとおりのエレクトロポレーションによる導入である、ステップ;
e)集団の細胞の少なくとも一部(例えば、集団のHSPC、例えばCD34+細胞の少なくとも一部)に少なくとも1つの遺伝子修飾を生じさせるステップであって、それにより、ステップd)で導入されたgRNAの標的化ドメインと相補的なゲノム部位にまたはその近傍に、例えば本明細書に記載されるとおりのインデルを作り出すステップ;
f)任意選択で、加えて、前記導入後に、例えば細胞培養培地中、少なくとも1つの幹細胞増殖剤、例えば化合物4、例えば約0.5〜約0.75マイクロモル濃度の化合物4を含む組成物の有効量の存在下で前記細胞を培養するステップであって、それにより細胞が少なくとも2倍、例えば少なくとも4倍、例えば少なくとも5倍に増殖するステップ;
g)前記細胞を凍結保存するステップ;および
h)細胞を哺乳動物に戻すステップであって、哺乳動物に戻される細胞が、1)赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力を維持しており、2)赤血球細胞に分化したとき、例えばステップe)のgRNAによって修飾されていない細胞と比べて高いレベルの胎児ヘモグロビンを産生する、例えば、1細胞当たり少なくとも6ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する細胞を含む、ステップ
を含む。
本開示は、本明細書に記載されるgRNA分子で修飾された、または修飾されることになる細胞、例えばHSPC、例えば造血幹細胞、例えばCD34+細胞の培養方法を提供する。
理論によって拘束されるものではないが、特定の標的配列において所与のgRNA分子によって作り出されるインデルのパターンは、細胞内の活性DNA修復機構(例えば、非相同末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合等)の各々の産物であると考えられる。理論によって拘束されるものではないが、編集しようとする細胞を、所望のインデルを生じないDNA修復経路の阻害剤と接触させることにより、特に有利なインデルを選択または富化し得ると考えられる。したがって、本発明のgRNA分子、CRISPRシステム、方法および他の態様は、かかる阻害剤と組み合わせて実施し得る。かかる阻害剤の例としては、例えば、国際公開第2014/130955号パンフレット(この内容は、参照により全体として本明細書に援用される)に記載されるものが挙げられる。実施形態において、阻害剤はDNAPKc阻害剤、例えばNU7441である。
一態様において本発明は、本明細書に記載されるgRNA分子で修飾された、または修飾されることになる細胞、例えばHSPC、例えばCD34+細胞を、薬剤で処理されていない細胞と比べて増殖速度の増加、増殖レベルの増加、または生着の増加をもたらす1つ以上の薬剤と共に培養することに関する。かかる薬剤は、本明細書では幹細胞増殖剤と称される。
化合物1:
である。
化合物2:
である。
化合物3:
である。
化合物4:
である。
本開示は、本明細書に記載されるgRNA分子、または本明細書に記載されるgRNA分子で修飾された細胞(例えば、造血幹細胞、例えばCD34+細胞)を1つ以上の他の治療モダリティおよび/または薬剤と併用した使用を企図する。したがって、本明細書に記載されるgRNA分子またはgRNA分子で修飾された細胞の使用に加えて、異常ヘモグロビン症を治療するための1つ以上の「標準」療法も対象に投与し得る。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは核酸、例えば、特にgRNAに存在し、しかし他の形態のRNA、例えば、mRNA、RNAi、またはsiRNAにも存在し得る。本明細書に記載されるとおり「ヌクレオシド」は、五炭糖分子(ペントースまたはリボース)またはその誘導体、および有機塩基、プリンまたはピリミジンまたはその誘導体を含有する化合物として定義される。本明細書に記載されるとおり、「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドとして定義される。
(i)非連結リン酸酸素の一方または両方、および/またはリン酸ジエステル骨格連結における連結リン酸酸素の1つ以上の改変、例えば置換;
(ii)リボース糖の構成要素、例えばリボース糖上の2’ヒドロキシルの改変、例えば置換;
(iii)「デホスホ」リンカーによるリン酸部分のホールセール置換;
(iv)非カノニカル核酸塩基によるものを含めた、天然に存在する核酸塩基の修飾または置換;
(v)リボース−リン酸骨格の置換または修飾;
(vi)オリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置換、または部分、キャップもしくはリンカーのコンジュゲーション;および
(vii)糖の修飾または置換。
本明細書で使用されるとき、「アルキル」とは、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素基を指すことが意図される。例示的なアルキル基としては、メチル(Me)、エチル(Et)、プロピル(例えば、n−プロピルおよびイソプロピル)、ブチル(例えば、n−ブチル、イソブチル、t−ブチル)、ペンチル(例えば、n−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル)などが挙げられる。アルキル基は、1〜約20、2〜約20、1〜約12、1〜約8、1〜約6、1〜約4、または1〜約3個の炭素原子を含有し得る。
リン酸基
一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドのリン酸基が、酸素の1つ以上を異なる置換基に置換することによって修飾されてもよい。さらに、修飾ヌクレオチド、例えば修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるとおりの修飾リン酸による非修飾リン酸部分のホールセール置換を含み得る。一部の実施形態において、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカーまたは非対称電荷分布の荷電リンカーのいずれかをもたらす改変を含み得る。
リン酸基は非リン含有連結基によって置換することができる。一部の実施形態において、荷電リン酸基が中性部分によって置換されてもよい。
核酸を模倣することのできる足場も構築することができ、ここで、リン酸リンカーおよびリボース糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートに置換される。一部の実施形態において、核酸塩基はサロゲート骨格によってテザー係留することができる。例としては、限定なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジンおよびペプチド核酸(PNA)ヌクレオシドサロゲートを挙げることができる。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖基に1つ以上の修飾を含み得る。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)が幾つもの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基によって修飾または置換されてもよい。一部の実施形態において、2’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルが脱プロトン化して2’−アルコキシドイオンを形成することがもはやできないため、核酸の安定性を増進し得る。2’−アルコキシドは、リンカーリン原子に対する分子内求核攻撃による分解を触媒し得る。
修飾核酸に組み込むことのできる本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、限定はされないが、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、およびウラシル(U)が挙げられる。これらの核酸塩基を修飾し、または完全に置換して、修飾核酸に組み込むことのできる修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供することができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジン類似体から独立して選択することができる。一部の実施形態において、核酸塩基は、例えば、塩基の天然に存在するおよび合成の誘導体を含み得る。
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、プソイドウリジン(ψ)、ピリジン−4−オンリボヌクレオシド、5−アザ−ウリジン、6−アザ−ウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオ−ウリジン(s2U)、4−チオ−ウリジン(s4U)、4−チオ−プソイドウリジン、2−チオ−プソイドウリジン、5−ヒドロキシ−ウリジン(ho5U)、5−アミノアリル−ウリジン、5−ハロ−ウリジン(例えば、5−ヨード−ウリジンまたは5−ブロモ−ウリジン)、3−メチル−ウリジン(m3U)、5−メトキシ−ウリジン(mo5U)、ウリジン5−オキシ酢酸(cmo5U)、ウリジン5−オキシ酢酸メチルエステル(mcmo5U)、5−カルボキシメチル−ウリジン(cm5U)、1−カルボキシメチル−プソイドウリジン、5−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン(chm5U)、5−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル(mchm5U)、5−メトキシカルボニルメチル−ウリジン(mcm5U)、5−メトキシカルボニルメチル−2−チオ−ウリジン(mcm5s2U)、5−アミノメチル−2−チオ−ウリジン(nm5s2U)、5−メチルアミノメチル−ウリジン(mnm5U)、5−メチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン(mnm5s2U)、5−メチルアミノメチル−2−セレノ−ウリジン(mnm5se2U)、5−カルバモイルメチル−ウリジン(ncm5U)、5−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン(cmnm5U)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン(cmnm5s2U)、5−プロピニル−ウリジン、1−プロピニル−プソイドウリジン、5−タウリノメチル−ウリジン(tcm5U)、1−タウリノメチル−プソイドウリジン、5−タウリノメチル−2−チオ−ウリジン(trn5s2U)、1−タウリノメチル−4−チオ−プソイドウリジン、5−メチル−ウリジン(m5U、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有する)、1−メチル−プソイドウリジン(m1ψ)、5−メチル−2−チオ−ウリジン(m5s2U)、1−メチル−4−チオ−プソイドウリジン(m1s4ψ)、4−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、3−メチル−プソイドウリジン(m3ψ)、2−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン(D)、ジヒドロプソイドウリジン、5,6−ジヒドロウリジン、5−メチル−ジヒドロウリジン(m5D)、2−チオ−ジヒドロウリジン、2−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、2−メトキシ−ウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−プソイドウリジン、4−メトキシ−2−チオ−プソイドウリジン、N1−メチル−プソイドウリジン、3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピルプソイドウリジン、5−(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(inm5U)、5−(イソペンテニルアミノメチル]))−2−チオ−ウリジン(inm5s2U)、a−チオ−ウリジン、2’−0−メチル−ウリジン(Um)、5,2’−0−ジメチル−ウリジン(m5Um)、2’−0−メチル−プソイドウリジン(ψm)、2−チオ−2’−0−メチル−ウリジン(s2Um)、5−メトキシカルボニルメチル−2’−0−メチル−ウリジン(mcm5Um)、5−カルバモイルメチル−2’−0−メチル−ウリジン(ncm5Um)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2’−0−メチル−ウリジン(cmnm5Um)、3,2’−0−ジメチル−ウリジン(m3Um)、5−(イソペンテニルアミノメチル)−2’−0−メチル−ウリジン(inm5Um)、1−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、2’−F−ara−ウリジン、2’−F−ウリジン、2’−OH−ara−ウリジン、5−(2−カルボメトキシビニル)ウリジン、5−[3−(1−E−プロペニルアミノ)ウリジン、ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン類、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、5−アザ−シチジン、6−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、3−メチル−シチジン(m3C)、N4−アセチル−シチジン(act)、5−ホルミル−シチジン(f5C)、N4−メチル−シチジン(m4C)、5−メチル−シチジン(m5C)、5−ハロ−シチジン(例えば、5−ヨード−シチジン)、5−ヒドロキシメチル−シチジン(hm5C)、1−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、2−チオ−シチジン(s2C)、2−チオ−5−メチル−シチジン、4−チオ−プソイドイソシチジン、4−チオ−1−メチル−プソイドイソシチジン、4−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドイソシチジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、5−アザ−ゼブラリン、5−メチル−ゼブラリン、5−アザ−2−チオ−ゼブラリン、2−チオ−ゼブラリン、2−メトキシ−シチジン、2−メトキシ−5−メチル−シチジン、4−メトキシ−プソイドイソシチジン、4−メトキシ−1−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン(k2C)、a−チオ−シチジン、2’−0−メチル−シチジン(Cm)、5,2’−0−ジメチル−シチジン(m5Cm)、N4−アセチル−2’−0−メチル−シチジン(ac4Cm)、N4,2’−0−ジメチル−シチジン(m4Cm)、5−ホルミル−2’−0−メチル−シチジン(f5Cm)、N4,N4,2’−0−トリメチル−シチジン(m4 2Cm)、1−チオ−シチジン、2’−F−ara−シチジン、2’−F−シチジン、および2’−OH−ara−シチジンが挙げられる。
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、2−アミノ−プリン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノ−6−ハロ−プリン(例えば、2−アミノ−6−クロロ−プリン)、6−ハロ−プリン(例えば、6−クロロ−プリン)、2−アミノ−6−メチル−プリン、8−アジド−アデノシン、7−デアザ−アデニン、7−デアザ−8−アザ−アデニン、7−デアザ−2−アミノ−プリン、7−デアザ−8−アザ−2−アミノ−プリン、7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2,6−ジアミノプリン、1−メチル−アデノシン(m1A)、2−メチル−アデニン(m2A)、N6−メチル−アデノシン(m6A)、2−メチルチオ−N6−メチル−アデノシン(ms2m6A)、N6−イソペンテニル−アデノシン(i6A)、2−メチルチオ−N6−イソペンテニル−アデノシン(ms2i6A)、N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(io6A)、2−メチルチオ−N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(ms2io6A)、N6−グリシニルカルバモイル−アデノシン(g6A)、N6−スレオニルカルバモイル−アデノシン(t6A)、N6−メチル−N6−スレオニルカルバモイル−アデノシン(m6t6A)、2−メチルチオ−N6−スレオニルカルバモイル−アデノシン(ms2g6A)、N6,N6−ジメチル−アデノシン(m6 2A)、N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン(hn6A)、2−メチルチオ−N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン(ms2hn6A)、N6−アセチル−アデノシン(ac6A)、7−メチル−アデニン、2−メチルチオ−アデニン、2−メトキシ−アデニン、a−チオ−アデノシン、2’−0−メチル−アデノシン(Am)、N6,2’−0−ジメチル−アデノシン(m6Am)、N6−メチル−2’−デオキシアデノシン、N6,N6,2’−0−トリメチル−アデノシン(m6 2Am)、l,2’−0−ジメチル−アデノシン(m’Am)、2’−0−リボシルアデノシン(リン酸)(Ar(p))、2−アミノ−N6−メチル−プリン、1−チオ−アデノシン、8−アジド−アデノシン、2’−F−ara−アデノシン、2’−F−アデノシン、2’−OH−ara−アデノシン、およびN6−(19−アミノ−ペンタオキサノナデシル)−アデノシンが挙げられる。
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、イノシン(I)、1−メチル−イノシン(m’l)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、4−デメチル−ワイオシン(imG−14)、イソワイオシン(imG2)、ワイブトシン(yW)、ペルオキシワイブトシン(o2yW)、ヒドロキシワイブトシン(OHyW)、不完全修飾型ヒドロキシワイブトシン(OHyW*)、7−デアザ−グアノシン、キューオシン(Q)、エポキシキューオシン(oQ)、ガラクトシル−キューオシン(galQ)、マンノシル−キューオシン(manQ)、7−シアノ−7−デアザ−グアノシン(preQ0)、7−アミノメチル−7−デアザ−グアノシン(preQi)、アーケオシン(G+)、7−デアザ−8−アザ−グアノシン、6−チオ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−8−アザ−グアノシン、7−メチル−グアノシン(m7G)、6−チオ−7−メチル−グアノシン、7−メチル−イノシン、6−メトキシ−グアノシン、1−メチル−グアノシン(m1G)、N2−メチル−グアノシン(m2G)、N2,N2−ジメチル−グアノシン(m2 2G)、N2,7−ジメチル−グアノシン(m2,7G)、N2,N2,7−ジメチル−グアノシン(m2,2,7G)、8−オキソ−グアノシン、7−メチル−8−オキソ−グアノシン、1−メト チオ−グアノシン、N2−メチル−6−チオ−グアノシン、N2,N2−ジメチル−6−チオ−グアノシン、a−チオ−グアノシン、2’−0−メチル−グアノシン(Gm)、N2−メチル−2’−0−メチル−グアノシン(m2Gm)、N2,N2−ジメチル−2’−0−メチル−グアノシン(m2 2Gm)、1−メチル−2’−0−メチル−グアノシン(m1Gm)、N2,7−ジメチル−2’−0−メチル−グアノシン(m2,7Gm)、2’−0−メチル−イノシン(Im)、l,2’−0−ジメチル−イノシン(m1Im)、06−フェニル−2’−デオキシイノシン、2’−0−リボシルグアノシン(ホスフェート)(Gr(p))、1−チオ−グアノシン、06−メチル])−グアノシン、06−メチル−2’−デオキシグアノシン、2’−F−ara−グアノシン、および2’−F−グアノシンが挙げられる。
一部の実施形態において、修飾核酸は修飾gRNAであり得る。一部の実施形態において、gRNAは3’末端で修飾されてもよい。この実施形態において、gRNAは3’末端Uリボースで修飾されてもよい。例えば、Uリボースの2つの末端ヒドロキシル基をアルデヒド基に酸化し、同時にリボース環を開環すると、修飾ヌクレオシド(Uは非修飾または修飾ウリジンであってよい)を得ることができる。
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるgRNA分子、例えば本明細書に記載されるとおりの複数のgRNA分子、または本明細書に記載される1つ以上のgRNA分子で修飾された1つ以上の細胞を含む細胞(例えば、細胞の集団、例えば、造血幹細胞の、例えばCD34+細胞の集団)を、1つ以上の薬学的または生理学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。かかる組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液;グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン類、マンニトールなどの炭水化物;タンパク質;ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸;抗酸化剤;EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);および保存剤を含み得る。本発明の組成物は、一態様では、静脈内投与用に製剤化される。
本発明は、本発明のgRNA分子、または前記gRNA分子をコードする核酸を含む細胞にも関する。
送達タイミング
ある実施形態において、本明細書に記載されるCasシステムの成分、例えばCas9分子成分および/またはgRNA分子成分以外の1つ以上の核酸分子(例えば、DNA分子)が送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Casシステムの成分の1つ以上が送達されるのと同時に送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Casシステムの成分の1つ以上が送達される前またはその後(例えば、約30分、1時間、2時間、3時間、6時間、9時間、12時間、1日、2日、3日、1週、2週間、または4週間未満)に送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Casシステムの成分の1つ以上、例えば、Cas9分子成分および/またはgRNA分子成分が送達されるのと異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達することができる。例えば、核酸分子はウイルスベクター、例えば組込み欠損レンチウイルスによって送達することができ、かつCas9分子成分および/またはgRNA分子成分はエレクトロポレーションによって送達することができ、これにより例えば、核酸(例えば、DNA)によって引き起こされる毒性を低減することができる。ある実施形態において、核酸分子は治療用タンパク質、例えば、本明細書に記載されるタンパク質をコードする。ある実施形態において、核酸分子はRNA分子、例えば、本明細書に記載されるRNA分子をコードする。
Casシステムの成分、例えばCas9分子成分およびgRNA分子成分を別々に送達する、より詳細には成分を異なる様式で送達すると、例えば組織特異性および安全性が改善されるため、パフォーマンスを増進させることができる。ある実施形態において、Cas9分子およびgRNA分子は、異なる様式により、または本明細書においてときに差次的様式と称されるとおり送達される。異なる様式または差次的様式とは、本明細書で使用されるとき、対象成分分子、例えば、Cas9分子、gRNA分子、鋳型核酸、またはペイロードに異なる薬力学的または薬物動態学的特性を付与する送達様式を指す。例えば、送達様式は、例えば、選択されたコンパートメント、組織、または臓器に異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間分布をもたらし得る。
ガイド選択および設計
目的の領域内にあるPAMを同定するため、インシリコでヒト参照ゲノムおよびユーザー定義による目的のゲノム領域(例えば、遺伝子、遺伝子のエクソン、非コード調節領域等)を使用して初期ガイド選択を実施した。同定されたPAMの各々について分析を実施し、統計が報告された。例えば、本明細書に記載されるとおり、効率および有効性を決定するための幾つもの方法に基づきgRNA分子をさらに選択し、順位付けした。
crRNA:[標的化ドメイン]−[配列番号6607]
tracr(trRNA):配列番号6660
[標的化ドメイン]−[配列番号6601]−UUUU
[標的化ドメイン]−[配列番号6604]−UUUU
標的特異的crRNAの一次スクリーニングには、Cas9GFPを発現するHEK293細胞(HEK−293_Cas9GFP)のトランスフェクションを用いた。この例では、例えば本明細書に記載されるとおりのインシリコオフターゲット検出を含む定義された基準を用いて一次スクリーニング用に標的特異的crRNAを設計し、選択した。選択されたcrRNAを化学的に合成し、96ウェルフォーマットで送達した。HEK−293−Cas9GFP細胞に標的crRNAをストックtrRNAと1:1比でトランスフェクトした。トランスフェクションは、製造者のプロトコル(Lipofectamine 2000、Life Technologies)に従いリポフェクション技術を用いて媒介した。リポフェクション後24時間でトランスフェクト細胞を溶解させて、ライセート中でT7E1アッセイおよび/または次世代シーケンシング(NGS;以下)によって編集(例えば、切断)を検出した。
T7E1アッセイを用いて、Cas9によるDNA切断後の非相同末端結合(NHEJ)によって作り出された挿入、欠失および置換などのゲノムDNAの突然変異イベントを検出した(Cho et al.,「Cas9 RNA誘導型エンドヌクレアーゼによるヒト細胞の標的ゲノムエンジニアリング(Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA−guided endonuclease)」.Nature Biotechnology.2013;31,230−232を参照されたい)。
ゲノムにおける標的位置の編集(例えば、切断)効率を決定するため、ディープシーケンシングを利用して、非相同末端結合によって導入された挿入および欠失の存在を同定した。
Cas9タンパク質にcrRNAおよびtrRNAを加えると活性Cas9 リボ核タンパク質複合体(RNP)が形成され、これはcrRNAによって指定される標的領域への結合および標的ゲノムDNAの特異的切断を媒介する。trRNAおよびcrRNAをCas9に負荷することによってこの複合体を形成した。これはCas9にコンホメーション変化を引き起こし、Cas9によるdsDNAへの結合および切断が可能になるものと考えられる。
CD34+ HSCにCas9 RNPを送達した。
CD34+ HSCは、フローサイトメトリーまたはインビトロコロニー形成アッセイなど、既知の技法を用いて幹細胞表現型に関してアッセイし得る。例として、製造者のプロトコルを用いたMethocult H4034 Optimumキット(StemCell Technologies)を使用するインビトロコロニー形成アッセイ(CFC)により、細胞をアッセイした。簡潔に言えば、1〜1.25ml methocultに≦100μl容積中の500〜2000個のCD34+細胞を加える。この混合物を4〜5秒間激しくボルテックスして完全に混合し、次に室温に少なくとも5分間放置した。シリンジを使用して1〜1.25mlのMethoCult+細胞を35mmディッシュまたは6ウェルプレートのウェルに移した。12〜14日後に製造者のプロトコルに従いコロニーの数および形態を評価した。
HSCは、機能的には、その自己複製能力により、および多系統分化について定義される。この機能性はインビボでのみ評価することができる。ヒトHSC機能を決定する際のゴールドスタンダードは、一連の突然変異によって重度免疫不全となり、したがってヒト細胞のレシピエントとしての役割を果たすことができるNOD−SCIDγマウス(NSG)への異種移植によるものである。編集後のHSCがNSGマウスに移植され、誘導された編集がHSC機能に影響しないことを検証し得る。毎月の末梢血分析を用いてヒトキメラ状態および系統発達を評価し、20週後の二次移植を用いて機能性HSCの存在を確立し得る。
T7E1(「T7」)および/またはNGSによってアッセイしたときの、本明細書に記載されるgRNA分子(例えば、上記に記載されるとおりのdgRNA分子)を用いたHEK293_Cas9GFP細胞における編集の結果は、図1(+58 BCL11aエンハンサー領域に対するgRNA分子)および図2(+62 BCL11aエンハンサー領域に対するgRNA分子)、ならびに以下の表に指示されるとおり要約される。CD34+ HSPCにおける平均編集率は、例えば、以下の表10(+58 BCL11aエンハンサー領域に対するgRNA分子)、表11(+62 BCL11aエンハンサー領域に対するgRNA分子)、表12B(+55 BCL11aエンハンサー領域に対するgRNA分子)、および表13(フランス型HPFH領域に対するgRNA分子)に報告される。T7E1アッセイ結果を報告する場合、「2」は高効率切断を示し、「1」は低効率切断を示し、および「0」は切断がないことを示す。一般に、T7E1結果は、NGSによってアッセイされる定量的切断と相関する。上位15個のgRNA(CD34+細胞における最も高い%編集率によって順位付けしたとき)を図11(+58 BCL11aエンハンサー領域)および図12(+62 BCL11aエンハンサー領域)に示す。
BCL11aの+58または+62赤血球系エンハンサー領域内のゲノムDNAに特異的な標的化ドメインを含有する合成sgRNA分子を注文した。図5は、sgEH1〜sgEH9と命名した、sgRNAによって標的化されるゲノムDNAを示す。
sgEH1標的化ドメイン(CR00276):AUCACAUAUAGGCACCUAUC(配列番号212)
sgEH2標的化ドメイン(CR00275):CACAGUAGCUGGUACCUGAU(配列番号211)
sgEH8標的化ドメイン(CR00273):CAGGUACCAGCUACUGUGUU(配列番号209)
sgEH9(CR00277)標的化ドメイン:UGAUAGGUGCCUAUAUGUGA(配列番号213)
G7(g7とも称される)標的化ドメイン:GUGCCAGAUGAACUUCCCAU(例えば、配列番号1191の3’20nt)
G8(g8とも称される)標的化ドメイン:CACAAACGGAAACAAUGCAA(例えば、配列番号1186の3’20nt)
上記のG7およびg8は、近接部位のゲノムDNAを標的とする(PAM配列はBCL11a遺伝子内で互いから50ヌクレオチド以内にある)。2つの近接部位を同時に標的化する効果を調べるため、G7の標的化ドメインを有するgRNAを含むRNPならびにG8の標的化ドメインを有するgRNAを含むRNPでCD34+細胞をトランスフェクトした。切断効率およびインデルパターンをNGSによって評価した。図10に示すとおり、主要なインデルは、2つのgRNA結合部位間のヌクレオチドの欠失である。これらの結果は、近接して結合する複数の、例えば2つのガイドを使用して、それらの2つの結合部位間にあるDNAの切り出しを達成し得ることを実証している。
CD34+初代造血幹細胞でBCL11a遺伝子座におけるゲノム編集を実証した。簡潔に言えば、製造者の指示に従い免疫選択(Miltenyi)を用いて成人ドナー由来のG−CSF動員末梢血(AllCells)からCD34+細胞を単離した。細胞ゲーティングは図3に示す。細胞をアリコートに分けて凍結保存した。解凍した細胞を2×105/mlでSFEM(StemCell Technologies)+1×抗生物質/抗真菌薬+各50ng/mlのサイトカイン(TPO、FLT3L、IL6およびSCF)+500nM化合物4に播種し、加湿インキュベーターにおいて37℃、5%CO2で5日間培養した。5日後の細胞濃度は1×106/mlであった。
を含む)からなるプレインキュベートしたRNP複合体を2×105細胞に加え、製造者のプロトコルに従いNeonシステム(Lifetechnologies)でパルスパラメータ:1600V、20ms、1パルスを用いてエレクトロポレートした。デュプリケートのエレクトロポレーションを実施した。RNP複合体の非存在下でモックエレクトロポレーションも実施した。エレクトロポレーション後、細胞を1ml培地に播種して一晩回復させた。
方法:
ヒトCD34+細胞培養。ヒト骨髄CD34+細胞をAllCells(カタログ番号:ABM017F)またはLonza(カタログ番号:2M−101C)のいずれかから購入し、50ng/mLのトロンボポエチン(Tpo、Peprotech;カタログ番号300−18)、50ng/mLのヒトFlt3リガンド(Flt−3L、Peprotech;カタログ番号300−19)、50ng/mLのヒト幹細胞因子(SCF、Peprotech;カタログ番号300−07)、ヒトインターロイキン−6(IL−6、Peprotech;カタログ番号200−06)、1%L−グルタミン;2%ペニシリン/ストレプトマイシン、および化合物4(0.75μM)を補足したStemSpan SFEM(StemCell Technologies;カタログ番号09650)を用いて2〜3日間増殖させた。2〜3日間増殖させた後、培養物をAllCellsから購入した出発細胞数と比べて2倍〜3倍およびLonzaからのと比べて1倍〜1.5倍に増殖させた。本明細書に記載されるとおりのCRISPR/Casシステムの導入前および導入後の両方を含め、全てのCD34+増殖ステップについてこれらの培養条件を用いた。
理論によって拘束されるものではないが、HSCのBCL11A赤血球系エンハンサーを標的化して遺伝子破壊すると、赤血球系細胞系統におけるBCL11Aの発現が選択的に下方制御され、γ−グロビン発現の抑制が解除されて、HbFタンパク質の含有量が高い赤血球細胞であるF−細胞の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
方法:
ヒトCD34+細胞培養。製造業者の説明書に従って免疫選択(Miltenyi)を用いて成人ドナーのG−CSF動員末梢血(AllCells)からヒトCD34+細胞を単離し、各50ng/mLのトロンボポイエチン(Tpo)、Flt3リガンド(Flt3L、Life Technologies、カタログ番号PHC9413)、ヒト幹細胞因子(SCF、Life Technologies、カタログ番号PHC2113)、およびヒトインターロイキン−6(IL−6、Life Technologies、カタログ番号PHC0063)、さらには1×抗生物質/抗真菌剤(Gibco、カタログ番号10378−016)および500nMの化合物4が追加されたStemSpan SFEM(StemCell Technologies、カタログ番号09650)を用いて3日間増殖させた。
理論によって拘束されるものではないが、BCL11A赤血球系エンハンサー領域の標的遺伝子破壊は、γ−グロビン発現の抑制を解除することにより、上昇したHbFタンパク質を含有する赤血球の産生を可能にするであろうと考えられる(胎児ヘモグロビンを発現する細胞、例えば、上昇したレベルの胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、本明細書では「F細胞」ということがある。実施形態では、1細胞当たり少なくとも6ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する場合、細胞はF細胞と見なされる)。上昇したHbFは、脱酸素条件下で赤血球の鎌状化を予防するため、βサラセミア患者およびSCD患者の両方に治療効果/治癒効果があるであろう。また、エキソビボ増殖を向上させて、送達される遺伝子改変HSCの用量を増加させるために、SCD患者のエキソビボゲノム編集HSCを用いた自己造血幹細胞移植(HSCT)と、幹細胞増殖促進技術、例えば、アリール炭化水素レセプター(AHR)阻害剤、例えば、国際公開第2010/059401号パンフレット(その内容は、その全体が参照により組み込まれる)に記載のもの、例えば化合物4とが組み合わされた。
BCL11aエンハンサーの+58領域を標的とするgRNAの包括的スクリーニングによる%編集率の結果に基づき、さらなる研究および最適化に8つのgRNA標的化ドメインを選択した。gRNA分子に対する修飾が%編集率、赤血球系分化、および胎児ヘモグロビン発現に及ぼす効果を試験するため、BCL11aエンハンサー領域の+58領域内にある部位を標的とする種々のバージョンの8つのgRNA分子を設計した。CR00309、CR00311、CR00312、CR00316、CR01125、CR01126、CR01127、およびCR01128の標的化ドメインを含む以下のバージョンのgRNAを作製した。
dgRNA(標的化ドメインの配列以外の全配列は実施例1に記載されるとおり):
1.非修飾crRNAおよび非修飾tracr(「非修飾」または「Unmod」)
2.非修飾crRNAおよび非修飾tracr、但し、指示される標的化ドメインの5’−18ntのみを含む(完全な20ntでない)(「18nt」)
3.ホスホロチオエート結合で修飾されたcrRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt、および非修飾tracr(「PS」)
4.crRNAの5’末端および3’末端の両方に追加的な逆位脱塩基残基、および非修飾tracr(「Invd」)
5.ホスホロチオエート結合および2’−Oメチル基で修飾されたcrRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt、および非修飾tracr(「OMePS」)
6.2’−フルオロ基で修飾されたcrRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt、および非修飾tracr(「F」)
7.ホスホロチオエート結合および2’−フルオロ基で修飾されたcrRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt、および非修飾tracr(「F−PS」)
1.非修飾sgRNA(「非修飾」または「Unmod」)
2.指示される標的化ドメインの5’−18ntのみからなる標的化ドメイン(完全な20ntでない)(「18nt」)
3.ホスホロチオエート結合で修飾されたsgRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt(「PS」)
4.sgRNAの5’末端および3’末端の両方に追加的な逆位脱塩基残基(「Invd」)
5.ホスホロチオエート結合および2’−Oメチル基で修飾されたsgRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt(「OMePS」)
6.2’−フルオロ基で修飾されたsgRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt(「F」)
7.ホスホロチオエート結合および2’−フルオロ基で修飾されたsgRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt(「F−PS」)
方法:
ヒトCD34+細胞培養。製造者の指示に従い免疫選択(Miltenyi)を用いて成人ドナー由来のG−CSF動員末梢血(AllCells)からヒトCD34+細胞を単離し、各50ng/mLのトロンボポエチン(Tpo)、Flt3リガンド(Flt−3L、Life Technologies、カタログ番号PHC9413)、ヒト幹細胞因子(SCF、Life Technologies、カタログ番号PHC2113)およびヒトインターロイキン−6(IL−6、Life Technologies、カタログ番号PHC0063)、ならびに1×抗生物質/抗真菌薬(Gibco、カタログ番号10378−016)および500nM化合物4を補足したStemSpan SFEM(StemCell Technologies;カタログ番号09650)を用いて4〜6日間増殖させた。この実施例全体を通じて(そのサブ実施例を含め)、プロトコルがその細胞を「増殖させた」と指示する場合、この培地を使用した。この培地は本実施例では(そのサブ実施例を含め)「幹細胞増殖培地」、または「増殖培地」とも称される。
理論によって拘束されるものではないが、HPFH領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いHbFタンパク質を含有する赤血球細胞(胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「F−細胞」と称されることもある)の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
方法:方法は、以下の点を除いて実施例4にあるとおりである。
Cas9およびガイドRNAリボ核タンパク質(RNP)複合体のアセンブリ、HSPCの調製、およびHSPCへのRNPのエレクトロポレーション。遠心によって収集したHSPCをP3初代細胞溶液(Lonza カタログ番号PBP3−00675)に2.5×106/mLの細胞密度で再懸濁した。RNPを20μLの細胞と上下にピペッティングすることにより混合し、室温で2分間インキュベートした。4D−Nucleofector(Lonza)でコードCM−137を用いてRNP/細胞混合物(20μL)をエレクトロポレートした。
理論によって拘束されるものではないが、HPFH領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いHbFタンパク質を含有する赤血球細胞(胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「F−細胞」と称されることもある)の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
方法:方法は、以下の点を除いて実施例4にあるとおりである。
理論によって拘束されるものではないが、HPFH領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いHbFタンパク質を含有する赤血球細胞(胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「F−細胞」と称されることもある)の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
方法:方法は、以下の点を除いて実施例4にあるとおりである。
理論によって拘束されるものではないが、HPFH領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いHbFタンパク質を含有する赤血球細胞(胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「F−細胞」と称されることもある)の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
方法:方法は、以下の点を除いてサブ実施例4.1にあるとおりである。
理論によって拘束されるものではないが、HPFHまたはBCL11A赤血球系エンハンサー領域を標的化して遺伝子破壊すると、γ−グロビン発現の抑制が解除されて、高いHbFタンパク質を含有する赤血球細胞(胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「F−細胞」と称されることもある)の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
方法:方法は、以下の点を除いて実施例4にあるとおりである。
理論によって拘束されるものではないが、HPFHまたはBCL11A赤血球系エンハンサー領域を標的化して遺伝子破壊すると、γ−グロビン発現の抑制が解除されて、高いHbFタンパク質を含有する赤血球細胞(胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「F−細胞」と称されることもある)の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
方法:方法は、以下の点を除いて実施例4にあるとおりである。
理論によって拘束されるものではないが、HPFH領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いHbFタンパク質を含有する赤血球細胞(胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「F−細胞」と称されることもある)の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
初代ヒトCD34+ HSPCに、HPFH領域内の異なる部位に対する2つの異なるgRNA分子を含有するRNPをエレクトロポレートした。各RNPに、上記に記載したとおりのdgRNA分子を使用した。簡潔に言えば、フランス型HPFH領域内の第1の部位を標的とするdgRNAを含むRNPと、フランス型HPFH領域内の第2の部位を標的とするdgRNAを含むRNPとを以下の比で組み合わせて、CD34+ HSPCにエレクトロポレートした:0.5×第1のdgRNA RNP+0.5×第2のdgRNA RNP;1.0×g2 dgRNA(「g2」=BCL11a遺伝子のコード配列を標的とする、CR000088の標的化ドメインを含む陽性対照);RNPなし(「対照」)。上記に記載されるプロトコルを用いて細胞を上記に記載したとおり培養し、赤血球に分化させた(図17を参照されたい)。胎児ヘモグロビン発現を評価した。結果は図27および表25に示す。理論によって拘束されるものではないが、2つの標的配列に対するgRNA分子を含むRNPを同時に導入すると、その領域内に含まれる任意の調節配列またはコード配列を含め、2つの切断部位間のDNA(例えば、2つの切断部位間にある全てまたはほとんどのDNA)の欠失(すなわち、切り出し)が起こることになると考えられる。これらの結果は、HPFH領域内の2つの別個の領域を標的とするRNPをエレクトロポレーションによってCD34+ HSPCに同時に送達して、赤血球に分化した編集済み細胞に胎児ヘモグロビン発現を誘導できたことを示している。
オリゴ挿入に基づくアッセイ(例えば、Tsai et al.,Nature Biotechnology.33,187−197;2015を参照されたい)を用いて、BCL11aエンハンサーを標的とするCas9によって切断される潜在的オフターゲットゲノム部位を決定した。BCL11aエンハンサーを標的とする合計28個のガイド(指示される標的化ドメインを含むデュアルガイドRNA)およびHPFH領域を標的とする10個のgRNAを上記に記載されるCas9発現HEK293細胞でスクリーニングした。結果は図33(BCL11aエンハンサー)および図49(HPFH)にプロットする。BCL11aエンハンサーを標的とするgRNAに関して、このアッセイで一部のガイドの潜在的オフターゲット部位が同定されたが、しかしながら標的ディープシーケンシングを用いて、それらの潜在的な部位が本当にCas9によって切断されるオフターゲット部位かどうかを決定した。潜在的オフターゲット部位に隣接するプライマーを用いて単離ゲノムDNAを増幅し、アンプリコンをシーケンシングした。潜在的オフターゲット部位がCas9によって切断された場合、その部位にインデルが検出されるはずである。ガイドRNAの少なくとも3つ:CR000311、CR000312、CR001128について、これらの潜在的オフターゲット部位に関する後続研究からは、潜在的オフターゲット部位にインデルは検出されなかった。BCL11aエンハンサーを標的とするgRNAに関しては、少なくともgRNA、CR001137、CR001212、およびCR001221について、このアッセイでいかなる潜在的オフターゲット部位も同定されなかった。標的ディープシーケンシングを実施して、他のgRNA分子について同定された潜在的オフターゲット部位が本当にCas9によって切断されるオフターゲット部位かどうかを決定することになる。
CD34+造血幹細胞における評価
本発明者らは、初代ヒト造血幹細胞(HSC)におけるβ−2−ミクログロブリン(B2M)遺伝子のノックアウト効率を計測することにより、14個の精製化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SPyCas9)タンパク質を評価した。これらのタンパク質は3群に分けた:第1群は、選択性が向上したSPyCas9変異体からなった(Slaymaker et al.2015,Science 351:84(e1.0、e1.1およびK855A);Kleinstiver et al.2016,Nature 529:490(HF))。第2群は、数および/または位置が異なるSV40核移行シグナル(NLS)および切断可能なTEV部位を伴うまたは伴わない6×ヒスチジン(His6)または8×ヒスチジン(His8)タグを含む野生型SPyCas9、および2つのシステイン置換(C80L、C574E)(構造研究用にCas9を安定化させることが報告されている(Nishimasu et al.2014,Cell 156:935))を有するSPyCas9タンパク質からなった。第3群は、異なるプロセスによって作製した同じ組換えSPyCas9からなった(図60)。B2MノックアウトはFACSおよび次世代シーケンシング(NGS)によって決定した。
材料
1.Neonエレクトロポレーション機器(Invitrogen、MPK5000)
2.Neonエレクトロポレーションキット(Invitrogen、MPK1025)
3.crRNA(GGCCACGGAGCGAGACAUCUの標的化ドメイン配列、B2M遺伝子中の配列と相補的、配列番号6607と融合)
4.tracrRNA(配列番号6660)
5.Cas9保存緩衝液:20mMトリス−Cl、pH8.0、200mM KCl、10mM MgCl2
6.骨髄由来CD34+ HSC(Lonza、2M−101C)
7.細胞培養培地(Stemcell Technologies、StemSpam SFEM II、StemSpam CC−100含有)
8.FACS洗浄緩衝液:PBS中2%FCS
9.FACSブロック緩衝液:PBS1mL当たり、0.5ugマウスIgG、150ug Fcブロック、20μL FCSを添加
10.Chelex懸濁液:H2O中10%Chelex 100(bioRad、カタログ番号142−1253)
11.抗B2M抗体:Biolegend、カタログ番号316304
Lonzaの推奨に従い細胞を解凍して成長させ、2〜3日おきに培地を加える。5日目、細胞を200×gで15分間ペレット化し、PBSで1回洗浄し、細胞をNEONキットのT−緩衝液に2×104/μLで再懸濁し、氷上に置く。Cas9タンパク質をCas9保存緩衝液で5mg/mlに希釈する。crRNAおよびtracrRNAをH2Oで100μMに再構成する。各0.8μLのCAS9タンパク質、crRNAおよびtracrRNAを0.6μLのCas9保存緩衝液と混合することによりリボ核タンパク質(RNP)複合体を作製し、室温で10分間インキュベートする。7μLのHSCをRNP複合体と2分間混合し、10μL全てをNeonピペットティップに移し、1700v、20msおよび1パルスでエレクトロポレートする。エレクトロポレーション後直ちに、37℃、5%CO2で予めキャリブレーションした1ml培地が入った24ウェルプレートのウェルに細胞を移す。エレクトロポレーション後72時間でFACSおよびNGS分析のため細胞を回収する。
実験およびドナーのばらつきを正規化するため、本発明者らは、2つのSV40 NLSが野生型SPyCas9に隣接し、かつタンパク質のC末端のHis6タグを含む元の設計であるiProt105026に対する各タンパク質の相対活性をグラフ化した(図34)。統計的分析は、参照Cas9タンパク質iProt105026と比較して、iProt106331、iProt106518、iProt106520およびiProt106521のHSCにおけるB2Mのノックアウトに有意な差はないが、試験した他の変異体(PID426303、iProt106519、iProt106522、iProt106545、iProt106658、iProt106745、iProt106746、iProt106747、iProt106884)はHSCにおけるB2Mのノックアウトに参照iProt105026と比べて大きい有意差があることを示している。本発明者らは、His6タグをC末端からN末端に動かしても(iProt106520)、タンパク質の活性に影響が及ばないことを見出した(図34)。NLSがタンパク質のC末端に配置された場合に限り、活性を維持するのに1つのNLSで十分であった(iProt106521対iProt106522、図34)。プロセス1から精製したタンパク質は、一貫してプロセス2および3よりも高いノックアウト効率を有した(iProt106331対iProt106545およびPID426303、図34)。一般に、既報告の向上した選択性を有するSPyCas9変異体は、野生型SPyCas9ほど活性でなかった(iProt106745、iProt106746およびiProt106747、図34)。興味深いことに、iProt106884は標的化部位を切断しなかった。これは、この変異体が哺乳動物細胞における論理的な標的化部位の最大20%を切断できなかったというKleinstiver et alによる報告と一致する(Kleinstiver et al.2016,Nature 529:490)。最後に、2つのシステイン置換を含むCas9変異体(iProt106518)は高レベルの酵素活性を維持した(図34)。
遺伝子編集前の細胞の増殖
ヒト骨髄CD34+細胞をAllCells(カタログ番号:ABM017F)またはLonza(カタログ番号:2M−101C)のいずれかから購入し、50ng/mLのトロンボポエチン(Tpo、Peprotech;カタログ番号300−18)、50ng/mLのヒトFlt3リガンド(Flt−3L、Peprotech;カタログ番号300−19)、50ng/mLのヒト幹細胞因子(SCF、Peprotech;カタログ番号300−07)、ヒトインターロイキン−6(IL−6、Peprotech;カタログ番号200−06)、1%L−グルタミン;2%ペニシリン/ストレプトマイシン、および化合物4(0.75μM)を補足したStemSpan SFEM(StemCell Technologies;カタログ番号09650)を使用して2〜3日間増殖させた。
Cas9−ガイドRNAリボ核タンパク質複合体(RNP)はエレクトロポレーションの直前に調製した。デュアルガイドRNAを用いるRNPの形成については、初めに各3μgのcrRNA(2.24μL中)およびtracrRNA(1.25μL中)を別個のチューブにおいて95℃で2分間変性させて、次に室温に冷却した。Cas9タンパク質の調製のため、7.3μgのCas9タンパク質(1.21μL中)を0.52μLの5×CCE緩衝液(20mM HEPES、100mM KCL、5mM MgCL2、5%グリセロールおよび新たに添加した1mM DTT)と混合した。初めにTracrRNAをCas9調製物と混合し、37℃で5分間インキュベートした。次にCrRNAをTracrRNA/CAS9複合体に加え、37℃で5分間インキュベートした。200×gで15分間遠心することによりHSPCを収集し、Neonエレクトロポレーションキット(Invitrogen;カタログ番号:MPK1096)に付属するT緩衝液に2×107/mLの細胞密度で再懸濁した。RNPを12μLの細胞と上下に3回穏やかにピペッティングすることによって混合した。シングルガイドRNA(sgRNA)およびCas9複合体の調製には、2.25μg sgRNA(1.5μL中)を2.25μg Cas9タンパク質(3μL中)と混合し、室温で5分間インキュベートした。次にsgRNA/Cas9複合体を10.5μLの2×107/mL細胞と上下に数回穏やかにピペッティングすることにより混合し、室温で2分間インキュベートした。RNP/細胞混合物(10μL)をNeonエレクトロポレーションプローブに移した。Neonトランスフェクションシステム(Invitrogen;MPK5000S)で1700ボルト/20ミリ秒および1パルスを用いてエレクトロポレーションを実施した。
エレクトロポレーション後、上記に記載したとおりの成長因子、サイトカインおよび化合物4を補足した0.5mLの予め温めたStemSpan SFEM培地に細胞を移し、37℃で3日間培養した。エレクトロポレーション前3日間およびエレクトロポレーション後7日間の合計10日間の細胞増殖の後、総細胞数は出発細胞数と比べて2〜7倍増加した(図35)。
エレクトロポレーションの48時間後、編集済みおよび未編集HSPCからゲノムDNAを調製した。10mMトリス−HCL、pH8.0;0.05%SDSおよび25μg/mLの新たに添加したプロテアーゼK中に細胞を溶解させ、37℃で1時間インキュベートした後、85℃で15分間さらにインキュベートしてプロテアーゼKを不活性化した。
HSPCの編集効率を決定するため、T7E1アッセイを実施した。Phusion Hot Start II High−Fidelityキット(Thermo Scientific;カタログ番号:F−549L)を以下のサイクル条件で用いてPCRを実施した:98℃で30秒;98℃で5秒、68℃で20分、72℃で30秒を35サイクル;72℃で5分。以下のプライマーを使用した:フォワードプライマー:5’−AGCTCCAAACTCTCAAACCACAGGG−3’およびリバースプライマー:5’−TACAATTTTGGGAGTCCACACGGCA−3’。以下の条件を用いてPCR産物を変性させてリアニーリングした:95℃で5分、−2℃/sで95〜85℃、−0.1℃/sで85〜25℃、4℃で保持。アニーリング後、10μLの上記のPCR産物に1μLのミスマッチ高感受性T7 E1ヌクレアーゼ(NEB、カタログ番号M0302L)を加え、37℃で15分間さらにインキュベートしてヘテロ二重鎖を消化し、得られたDNA断片をアガロースゲル(2%)電気泳動によって分析した。編集効率はImageJソフトウェア(http://rsb.info.nih.gov/ij/)を用いて定量化した。
編集効率ならびに挿入および欠失(インデル)のパターンをより正確に決定するため、PCR産物を次世代シーケンシング(NGS)に供した。Titanium Taq PCRキット(Clontech Laboratories;カタログ番号:639210)を以下のサイクル条件で使用してPCRをデュプリケートで実施した:98℃で5分;95℃で15秒、68℃で15秒、72℃で1分を30サイクル;72℃で7分。以下のプライマーを使用した:フォワードプライマー:5’−AGCTCCAAACTCTCAAACCACAGGG−3’およびリバースプライマー:5’−TACAATTTTGGGAGTCCACACGGCA−3’。PCR産物を2%アガロースゲル電気泳動によって分析し、ディープシーケンシングにかけた。
細胞をフローサイトメトリーに供して幹細胞・前駆細胞(HSPC)サブ集団における編集効率を特徴付けた。ゲノム編集前(培養下48時間)およびゲノム編集後(培養下10日;ゲノム編集後3日)における、CD34+細胞、CD34+CD90+細胞、CD34+CD90+CD45RA−細胞、およびCD34+CD90+CD45RA−CD49f+細胞を含むHSPCサブセットの頻度を細胞培養物のサンプリングアリコートから決定した(図36、図37、図38)。細胞を抗CD34(BD Biosciences、カタログ番号555824)、抗CD38(BD Biosciences、カタログ番号560677)、抗CD90(BD Biosciences、カタログ番号555596)、抗CD45RA(BD Biosciences、カタログ番号563963)、抗CD49f(BD Biosciences、カタログ番号562582)と共に、0.5%BSA、2mM EDTA pH7.4を補足したPBSを含有する改良FACS緩衝液中、暗所下4℃で30分間インキュベートした。細胞生存率は7AADによって決定した。細胞を改良FACS緩衝液で洗浄し、Fortessa(BD Biosciences)で多色FACS分析を実施した。フローサイトメトリー結果はFlowjoソフトウェアを使用して分析した。化合物4(単独)の存在下で成長させたゲノム編集済み細胞は、CD34+、CD34+CD90+、CD34+CD90+CD45RA−、およびCD34+CD90+CD45RA−CD49f+サブセットを含め、評価した全てのHSPCサブセットについて検出可能なレベルを呈したことから、ゲノム編集後に化合物4(単独)の存在下で細胞培養物中に長期HSC集団が存在し続けることが示される(図38)。
HSPC培養およびCRISPR/Cas9ゲノム編集
RNP作成および細胞操作方法は、以下を除いて実施例4にあるとおりである。ヒトCD34+細胞培養。ヒトCD34+細胞は、成人ドナー由来のG−CSF動員末梢血(AllCells、カタログ番号mPB025−Reg.E)から製造者の指示に従い免疫選択(Miltenyi)を用いて単離するか、または骨髄(Hemacare Corporation、カタログ番号BM34C−3)から誘導するかのいずれかであった。CD34+細胞を解凍し、RNP送達前に2日間または5日間増殖させた。RNP送達後、以下のとおり、細胞を増殖培地でさらに13日間培養するか、または赤血球系分化培地で7日または11日間培養した。培養0〜7日目の間、EDMには、1μMヒドロコルチゾン(Sigma H8672)、100ng/mLヒトSCF(Life Technologies、カタログ番号PHC2113)、および5ng/mLヒトIL−3(Peprotech #10779−598)をさらに補足した。培養7〜11日目の間、EDMには100ng/mLのヒトSCFのみを補足した。培養期間の終わりに、ゲノムDNA調製および分析用に細胞を回収した。
製造者の推奨に従いDNeasy血液および組織キット(Qiagen、カタログ番号69506)を使用してRNP処理済みおよび未処理HSPCからゲノムDNAを単離した。
BCL11+58領域gRNA、CR00309、CR00311、CR00312、CR00316、CR001125、CR001126、CR001127、およびCR001128、およびHPFH領域gRNA、CR001028、CR001030、CR001137、CR001221、CR003035、およびCR003085の潜在的オフターゲット遺伝子座を以下のとおり同定した。各gRNAについて、BFASTシーケンスアライナー(バージョン0.6.4f、Homer et al,PLoS One,2009,4(11),e7767,PMID:19907642)を使用して、最大5ヌクレオチドまでのミスマッチを許容する標準パラメータを用いて、20ヌクレオチドgRNAプロトスペーサー配列をヒトゲノム参照配列(build GRCh38)とアラインメントした。Cas9カノニカル5’−NGG−3’PAM配列に隣接して5’側にある部位のみを含むように同定された遺伝子座をフィルタリングした(すなわち5’−オフターゲット遺伝子座−PAM−3’)。BEDToolsスクリプト(バージョン2.11.2、Quinlan and Hall,Bioinformatics,2010 26(6):841−2,PMID:20110278)を用いて、5ヌクレオチドミスマッチを有する部位をRefSeq遺伝子アノテーションに対して、エクソンとしてアノテートされた遺伝子座のみを含むようにさらにフィルタリングした(Pruitt et al,Nucleic Acids Res.,2014 42(Database issue):D756−63,PMID:24259432)。BCL11+58領域およびHPFH領域gRNAについて同定された潜在的オフターゲット遺伝子座のカウントを、それぞれ表1および表2に示す。
Primer3(バージョン2.3.6、Untergasser et al,Nucleic Acids Res.,2012 40(15):e115,PMID:22730293)を使用して、アンプリコンの中心にgRNAプロトスペーサー配列が位置する約160〜300塩基対長のアンプリコンサイズ範囲を目標とするデフォルトパラメータを用いて、BCL11+58領域gRNA(CR00309、CR00311、CR00312、CR00316、CR001125、CR001126、CR001127、およびCR001128)およびHPFH領域gRNA(CR001028、CR001030、CR001137、CR001221、CR003035、およびCR003085)について同定された潜在的オフターゲット遺伝子座(およびオンターゲット遺伝子座)を標的とするPCRアンプリコンを設計した。gRNA CR001127については、PCRプライマーは0〜4ヌクレオチドミスマッチを含む部位のみを設計し、RefSeqエクソン内に5ヌクレオチドミスマッチを含む部位のプライマーは設計しなかった。得られたPCRプライマー対およびアンプリコン配列は、ヒトゲノム参照配列(build GRCh38)に対して配列をBLAST検索(バージョン2.2.19、Altschul et al,J Mol Biol.,1990,215(3):403−10,PMID:2231712)することによりユニークさを調べた。2つ以上のアンプリコン配列をもたらすプライマー対は破棄し、設計し直した。表3および表5は、それぞれBCL11+58領域およびHPFH領域gRNAについて設計した成功するPCRプライマー対のカウントを示す。
製造者の推奨を用いてQuant−iT PicoGreen dsDNAキット(Thermo Fisher、カタログ番号P7581)を使用して、RNP処理済み(gRNA当たり2レプリケート)、および未処理(gRNA当たり1レプリケート)のHSPC試料からのゲノムDNAを定量化した。各試料について、二連続PCR反応を用いて、個々のオフターゲット遺伝子座(およびオンターゲット遺伝子座)を標的とするIlluminaシーケンシングライブラリを作成した。最初のPCRでは、ユニバーサルなIlluminaシーケンシング適合配列をテール付加した標的特異的PCRプライマー(上記で設計した)を使用して標的遺伝子座を増幅した。2回目のPCRでは、シーケンシング時の多重化を可能にするサンプルバーコードを含め、追加的なIlluminaシーケンシング適合配列を最初のPCRアンプリコンに加えた。PCR1は10μLの最終容積で実施し、各反応には、3〜6ngのgDNA(約500〜1000細胞相当)、0.25μMの最終濃度のPCR1プライマー対(Integrated DNA Technologies)および1×最終濃度のQ5 Hot Start Master Mix(New England BioLabs、カタログ番号102500−140)が含まれた。PCR1左プライマーは、配列5’−TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG−3’で5’テールが付加され(すなわち5’−テール−標的特異的左プライマー−3’)、および右プライマーは、配列5’−GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG−3’で5’テールが付加された(すなわち5’−テール−標的特異的右プライマー−3’)。PCR1は、サーモサイクラーで以下のサイクル条件を用いて実施した:98℃で1分を1サイクル;98℃で10秒、63℃で20秒、および72℃で30秒を25サイクル;72℃で2分を1サイクル。次にヌクレアーゼフリー水(Ambion、カタログ番号AM9932)を使用してPCR1を100に対して1で希釈し、PCR2への入力として使用した。PCR2は10μLの最終容積で実施し、各反応には、2μLの希釈したPCR1産物、0.5μMの最終濃度のPCR2プライマー対(Integrated DNA Technologies)および1×最終濃度のQ5 Hot Start Master Mix(New England BioLabs、カタログ番号102500−140)が含まれた。使用したPCR2左プライマー配列は5’−AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNTCGTCGGCAGCGTC−3’であり、使用したPCR2右プライマー配列は5’−CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTCTCGTGGGCTCGG−3’であった(式中、NNNNNNNNは、標準Illuminaシーケンシングプロセスの一部としてサンプル多重化に使用した8ヌクレオチドバーコード配列を意味する)。PCR2は、サーモサイクラーで以下のサイクル条件を用いて実施した:72℃で3分を1サイクル;98℃で2分を1サイクル;98℃で10秒、63℃で30秒、および72℃で2分を15サイクル。ここで、実行可能となったIlluminaシーケンシングライブラリであるPCR2アンプリコンを、製造者の推奨に従いAgencourt AMPure XPビーズ(Beckman Coulter、カタログ番号A63882)を使用してクリーンアップした。次に、Power SYBRグリーンPCRマスターミックス(Life Technologies、カタログ番号4367660)およびIlluminaシーケンシングライブラリ末端に特異的なプライマー(フォワードプライマー配列5’−CAAGCAGAAGACGGCATACGA−3’およびリバースプライマー配列5’−AATGATACGGCGACCACCGAGA−3’)を使用した標準的なqPCR定量化方法を用いて、クリーンなIlluminaシーケンシングライブラリを定量化した。次にIlluminaシーケンシングライブラリを等モルでプールし、製造者の推奨に従いMiSeq試薬キットv3(Illumina、カタログ番号MS−102−3003)を使用してMiSeq機器(Illumina、カタログ番号SY−410−1003)で300塩基ペアエンドリードによってIlluminaシーケンシングに供した。少なくとも1つの処理済みレプリケートについて各遺伝子座につき最低1000倍の配列カバレッジが生成された。処理済みおよび未処理の試料のPCR、クリーンアップ、プールおよびシーケンシングは別個に実施して、処理済み試料と未処理試料との間のクロスコンタミネーションまたはそれから生成されるPCRアンプリコンのいかなる可能性も回避した。
デフォルトパラメータを用いて、Illumina MiSeq分析ソフトウェア(MiSeqレポーター、バージョン2.6.2、Illumina)を使用してアンプリコン特異的FASTQシーケンシングデータファイルを作成した(Cock et al,Nucleic Acids Res.2010,38(6):1767−71,PMID:20015970)。次に、標準Perlスクリプトラッパーを用いて一体に結合した一連のパブリックドメインソフトウェアパッケージからなる内部開発の変異体分析パイプラインでFASTQファイルを処理した。使用したワークフローは5段階に分けられた。
BCL11+58領域およびHPFH領域gRNAのオンターゲット部位は、処理済みサンプルにおいて意図したCas9切断部位でロバストな編集を示し、インデル頻度は全てのgRNAについて88%より高かった。表3および表5は、少なくとも1つのバイオロジカルレプリケートで特徴付けられたオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はPCRプライマー設計またはPCR増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。
gRNA CR00309:gRNA CR00309のオンターゲット部位は意図したCas9切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約92%であった。表31は、特徴付けられたオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はPCRプライマー設計またはPCR増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、両方の処理済みレプリケートにおいて、提案されるCas9切断部位の周囲100bpウィンドウに4つのオフターゲット部位が同定された。部位1は約18%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて
を有し、およびエクソン1から約2.3kb離れた、11番染色体上の塩基対位置22,195,800〜22,195,819におけるアノクタミン5遺伝子(ANO5)のイントロン1に位置する。部位2は約18%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて
を有し、および12番染色体上の塩基対位置3,311,901〜3,311,926における遺伝子間領域に位置する。部位3は約80%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて
を有し、および1番染色体上の塩基対位置236,065,415〜236,065,434におけるGenBank(Clark et al.,Nucleic Acids Res.2016 Jan 4;44(Database issue):D67−D72,PMID:26590407)転写物(BC012501 RefSeqでアノテーションなし)に位置する。部位4は約2%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて
を有し、および1番染色体上の塩基対位置33,412,659〜33,412,678におけるポリホメオティック2タンパク質(RefSeqでアノテーションなし)と呼ばれるGenBankアノテーション付き転写物のイントロン1に位置する。
を有し、および最も近いGenBank転写物(RefSeqでアノテーションなし)から約9.5kb離れた、4番染色体上の塩基対位置35,881,815〜35,881,834における遺伝子間領域に位置する。第2の部位は約1.7%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて4つのミスマッチ
を有し、およびエクソン6から約2.7kb離れた、6番染色体上の塩基対位置16,519,907〜16,519,926におけるアタキシン1遺伝子(ATXN1)のイントロン6に位置する。
GUIDE−seq(Tsai et al,Nat Biotechnol.2015,33(2):187−97,PMID:25513782)によって同定された潜在的オフターゲットヒットをRNP処理済みおよび未処理HSPCにおいて上記にインシリコで定義された部位に関して記載した標的シーケンシング方法を用いて特徴付けた。gRNA CR00312、CR00316、CR001125、CR001126、CR001127およびCR001128について、GUIDE−seq潜在的ヒットが同定された。gRNA CR00311およびCR001128について、潜在的ヒットは同定されなかった。標的シーケンシングを用いて潜在的ヒットをHSPCで調べたとき、gRNA CR00312、CR001125およびCR001127について処理済みHSPCでは潜在的ヒットのいずれもバリデートされなかった。gRNA CR001126について1つの潜在的ヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法(in silico directed method)によってATXN1のイントロン6に同定されたのと同じ部位(6番染色体:16,519,907〜16,519,926塩基対)であった。gRNA CR00309およびCR00316の潜在的ヒットのバリデーションはなおも進行中である。
gRNA CR001028:gRNA CR0001028のオンターゲット部位は意図したCas9切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約91%であった。表32は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はPCRプライマー設計またはPCR増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、これまでに、両方の処理済みレプリケートにおいて、提案されるCas9切断部位の周囲100bpウィンドウに2つのオフターゲット部位が同定された。部位1は約2.8%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて2つのミスマッチ
を有し、および4番染色体上の塩基対位置58,169,308〜58,169,327に位置する非コードRNA(LF330410、RefSeqでアノテーションなし)のイントロン2に位置する。部位2は約3.5%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて3つのミスマッチ
を有し、およびエクソン2から約1.3kbの、6番染色体上の塩基対位置26,366,733〜26,366,752に位置するブチロフィリンサブファミリー3メンバーA2遺伝子(BTN3A2)のイントロン1に位置する。
を有し、およびX染色体上の塩基対位置24,503,476〜24,503,495に位置するピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ3遺伝子(PDK3)のエクソン4に位置する。
を有し、および2番染色体上の塩基対位置66,281,781〜66,281,800における遺伝子間領域に位置し、最も近い転写物(JD432564、RefSeqでアノテーションなし)から約7.1kbである。部位2は約2.5%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて3つのミスマッチ
を有し、および10番染色体上の塩基対位置42,997,289〜42,997,308における遺伝子間領域に位置し、マイクロRNA5100(MIR5100)から約0.3kbである。
を有し、および2番染色体上の塩基対位置171,872,630〜171,872,649に位置する溶質輸送体ファミリー25メンバー12遺伝子(SLC25A12)のイントロン2に位置し、エクソン3から約3.8kbである。
GUIDE−seq(Tsai et al,Nat Biotechnol.2015,33(2):187−97,PMID:25513782)を用いて同定された潜在的オフターゲットヒットをRNP処理済みおよび未処理のHSPCにおいてインシリコ部位に関して記載したのと同じ方法を用いて調べた。gRNA CR001028、CR001030、CR003035およびCR003085についてGUIDE−seq潜在的オフターゲットヒットが(現在までのところ)同定された。gRNA CR001137およびCR001221については現在までにヒットは同定されていない。HSPCにおいてgRNA CR001028について1つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によって4番染色体上の塩基対位置58,169,308〜58,169,327に同定されたのと同じ部位であった。HSPCにおいてgRNA CR001030について1つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によってPDK3遺伝子のエクソン4に同定されたのと同じ部位であった。HSPCにおいてgRNA CR003035について1つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によって2番染色体上の塩基対位置66,281,781〜66,281,800における遺伝子間領域に同定されたのと同じ部位であった。HSPCにおいてgRNA CR003085について1つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によって2番染色体上の塩基対位置171,872,630〜171,872,649に同定されたのと同じ部位であった。
gRNAオンターゲット部位を標的とするPCRアンプリコンを製造者の推奨に従いAgencourt AMPure XPビーズ(Beckman Coulter、カタログ番号A63882)を使用してクリーンアップした。製造者の推奨を用いてQuant−iT PicoGreen dsDNAキット(Thermo Fisher、カタログ番号P7581)を使用して試料を定量化した。製造者の推奨に従いNextera DNAライブラリ調製キット(Illumina、カタログ番号 FC−121−1031)を使用してアンプリコンをIlluminaシーケンシングライブラリに転換した。得られたシーケンシングライブラリをAMPureビーズでクリーンアップし、qPCRで定量化し、プールし、およびオフターゲット分析の節に記載されるとおり、Illumina MiSeq機器で150塩基(Illumina、カタログ番号MS−102−2002)または250塩基(Illumina、カタログ番号MS−102−2003)のペアエンドリードを用いてシーケンシングした。各ライブラリにつき最低1000倍のシーケンシングカバレッジが生じ、一連のインハウススクリプトを用いて変異体をコールした。簡単に言えば、ストリングベースの配列検索を用いてgRNA配列の中央にある80〜100塩基対ウィンドウにわたるシーケンシングリードを同定し、アンプリコン配列と比較し、配列の違いでビニングして、変異体頻度を計算した。加えて、Illumina MiSeqレポーターソフトウェア(Illuminaバージョン2.6.1)を使用してシーケンシングリードをアンプリコン配列とアラインメントし、得られたリードアラインメントをIntegrative Genome Viewer(IGVバージョン2.3、Robinson et al,Nat Biotechnol.2011,9(1):24−6,PMID:21221095)を用いて調べた。
RNP希釈アッセイによる遺伝子編集に最適なRNP濃度の決定
Cas9(iProt:106331)およびガイドリボヌクレオチド複合体(RNP)濃縮物の段階希釈液を用いて遺伝子編集を実施した(表33)。使用した様々なgRNA、そのフォーマット、およびこのアッセイで適用した修飾を表34に挙げる。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が参照によって援用されることが具体的かつ個別的に指示されたものとして参照により全体として本明細書に援用される。矛盾が生じる場合、本明細書における任意の定義を含め、本願が優先する。
当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、またはルーチンに過ぎない実験を用いて確認することができるであろう。本発明は具体的な態様を参照して開示されているが、本発明の他の態様および変形形態が当業者によって本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、かかる態様および均等な変形形態の全てを含むものと解釈されることが意図される。
本願は、2015年12月28日に出願された米国仮特許出願第62/271,968号明細書、および2016年6月8日に出願された米国仮特許出願第62/347,484号明細書に対する優先権を主張する。これらの出願の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
本願は、ASCII形式で電子的に提出された、参照により全体として本明細書に援用される配列表を含む。2017年1月26日に作成された前記ASCII複製物は、名称がPAT057179−WO−PCT_SL.txtであり、サイズが1,115,217バイトである。
(a)配列番号6601;
(b)配列番号6602;
(c)配列番号6603;
(d)配列番号6604;または
(e)1、2、3、4、5、6または7個のウラシル(U)ヌクレオチド、例えば4個のウラシルヌクレオチドを3’末端にさらに含む上記(a)〜(d)のいずれかを含むgRNA分子を提供する。実施形態において、標的化ドメインと(a)〜(e)のいずれかの配列との間に介在ヌクレオチドはない。
(a)BCL11a遺伝子に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から独立して選択されるか;
(b)+58 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から独立して選択されるか;
(c)+62 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から独立して選択されるか;
(d)+55 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から独立して選択されるか;または
(e)HPFH領域に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から独立して選択される。
(a)第1のgRNA分子はBCL11a遺伝子に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子は+58 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(b)第1のgRNA分子はBCL11a遺伝子に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子は+62 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(c)第1のgRNA分子はBCL11a遺伝子に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子は+55 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(d)第1のgRNA分子はBCL11a遺伝子に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子はHPFH領域に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(e)第1のgRNA分子は+58 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子は+62 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(f)第1のgRNA分子は+58 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子は+55 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(g)第1のgRNA分子は+58 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子はHPFH領域に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(h)第1のgRNA分子は+62 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子は+55 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(i)第1のgRNA分子は+62 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子はHPFH領域に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され;
(j)第1のgRNA分子は+55 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択され、かつ第2のgRNA分子はHPFH領域に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択される。
(a)HPFH領域に対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択される第1のgRNA分子を含み、かつ第2のgRNA分子が、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むか;または
(b)BCL11aエンハンサー、例えば、+58 BCL11aエンハンサー、+55 BCL11aエンハンサーまたは+62 BCL11aエンハンサーに対する本明細書(例えば、上記)に記載のgRNA分子から選択される第1のgRNA分子を含み、かつ第2のgRNA分子が、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
1)前述のgRNA分子の態様および実施形態のいずれかの1つ以上のgRNA分子、およびCas9分子(例えば、本明細書に記載されるとおりの);
2)前述のgRNA分子の態様および実施形態のいずれかの1つ以上のgRNA分子、およびCas9分子(例えば、本明細書に記載されるとおりの)をコードする核酸;
3)前述のgRNA分子の態様および実施形態のいずれかの1つ以上のgRNA分子をコードする核酸、およびCas9分子(例えば、本明細書に記載されるとおりの);
4)前述のgRNA分子の態様および実施形態の1つ以上のgRNA分子をコードする核酸、およびCas9分子(例えば、本明細書に記載されるとおりの)をコードする核酸;または
5)上記1)〜4)のいずれか、および鋳型核酸(例えば、本明細書に記載されるとおりの);
6)上記1)〜4)のいずれか、および鋳型核酸(例えば、本明細書に記載されるとおりの)をコードする配列を含む核酸;
7)本明細書に記載されるとおりの(例えば、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの)組成物;または
8)前述のベクターの態様および実施形態のいずれかのベクター
と接触させることを含む方法を提供する。
(a)細胞の集団を提供するステップと;
(b)エキソビボで幹細胞増殖剤の存在下で前記細胞を増殖させるステップと;
(c)第1のgRNA分子(例えば、本明細書に記載されるとおりの第1のgRNA分子、例えば、前述のgRNA分子の態様および実施形態のいずれかの第1のgRNA分子)、第1のgRNA分子をコードする核酸分子、または組成物(例えば、本明細書に記載されるとおりの組成物、例えば、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物)を前記細胞に導入するステップと
を含み、これによりステップ(c)に供されていない同じ細胞型と比べて前記細胞におけるヘモグロビン、例えば胎児ヘモグロビンの発現が増加する方法を提供する。
(a)gRNA分子の実施形態4のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;
(b)gRNA分子の実施形態5のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;
c)gRNA分子の実施形態6のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(d)gRNA分子の実施形態7のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(e)gRNA分子の実施形態41〜56のいずれかのgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である。
(a)gRNA分子の実施形態10のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(b)gRNA分子の実施形態11のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である。
(a)gRNA分子の実施形態13のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(b)gRNA分子の実施形態14のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である。
(a)gRNA分子の実施形態16のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;
(b)gRNA分子の実施形態17のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;
(c)gRNA分子の実施形態18のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(d)gRNA分子の実施形態57〜68のいずれかのgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である。
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態4のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態5のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態6のgRNA分子から選択されるか、(d)gRNA分子の実施形態7のgRNA分子から選択されるか、または(e)gRNA分子の実施形態41〜56のいずれかのgRNA分子から選択され;および
(2)第2のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態10のgRNA分子から選択されるか、または(b)gRNA分子の実施形態11のgRNA分子から選択される。
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態4のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態5のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態6のgRNA分子から選択されるか、(d)gRNA分子の実施形態7のgRNA分子から選択されるか、または(e)gRNA分子の実施形態41〜56のいずれかのgRNA分子から選択され;および
(2)第2のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態13のgRNA分子から選択され、(b)gRNA分子の実施形態14のgRNA分子から選択される。
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態4のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態5のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態6のgRNA分子から選択されるか、(d)gRNA分子の実施形態7のgRNA分子から選択されるか、または(e)gRNA分子の実施形態41〜56のいずれかのgRNA分子から選択され;および
(2)第2のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態16のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態17のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態18のgRNA分子から選択されるか、または(d)gRNA分子の実施形態57〜68のいずれかのgRNA分子から選択される。
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態10のgRNA分子から選択されるか、または(b)gRNA分子の実施形態11のgRNA分子から選択され;および
(2)第2のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態13のgRNA分子から選択され、(b)gRNA分子の実施形態14のgRNA分子から選択される。
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態10のgRNA分子から選択されるか、または(b)gRNA分子の実施形態11のgRNA分子から選択され;および
(2)第2のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態16のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態17のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態18のgRNA分子から選択されるか、または(d)gRNA分子の実施形態57〜68のいずれかのgRNA分子から選択される。
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態13のgRNA分子から選択され、(b)gRNA分子の実施形態14のgRNA分子から選択され;および
(2)第2のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態16のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態17のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態18のgRNA分子から選択されるか、または(d)gRNA分子の実施形態57〜68のいずれかのgRNA分子から選択される。
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態16のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態17のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態18のgRNA分子から選択されるか、または(d)gRNA分子の実施形態57〜68のいずれかのgRNA分子から選択され;および(2)第2のgRNA分子は、βグロビン遺伝子の標的配列と相補的な標的化ドメインを含むか;または
(1)第1のgRNA分子は、(a)gRNA分子の実施形態4のgRNA分子から選択されるか、(b)gRNA分子の実施形態5のgRNA分子から選択されるか、(c)gRNA分子の実施形態6のgRNA分子から選択されるか、(d)gRNA分子の実施形態7のgRNA分子から選択されるか、(e)gRNA分子の実施形態41〜56のいずれかのgRNA分子から選択されるか、(f)gRNA分子の実施形態10のgRNA分子から選択されるか、(g)gRNA分子の実施形態11のgRNA分子から選択されるか、(h)gRNA分子の実施形態13のgRNA分子から選択されるか、または(i)gRNA分子の実施形態14のgRNA分子から選択され;および(2)第2のgRNA分子は、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
用語「CRISPRシステム」、「Casシステム」または「CRISPR/Casシステム」は、一緒になって標的配列でRNAガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子による核酸の修飾を誘導し達成するのに必要かつ十分なRNAガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子とgRNA分子とを含む分子の組を指す。一実施形態において、CRISPRシステムは、gRNAとCasタンパク質、例えばCas9タンパク質とを含む。Cas9または修飾Cas9分子を含むかかるシステムは、本明細書では「Cas9システム」または「CRISPR/Cas9システム」と称される。一例において、gRNA分子とCas分子とは複合体化してリボ核タンパク質(RNP)複合体を形成し得る。
アイソフォーム2:Q9H165−2
アイソフォーム3:Q9H165−3
アイソフォーム4:Q9H165−4
アイソフォーム5:Q9H165−5
アイソフォーム6:Q9H165−6
gRNA分子は、以下にさらに詳しく記載するとおり幾つものドメインを有し得るが、しかしながら、gRNA分子は、典型的には、少なくともcrRNAドメイン(標的化ドメインを含む)とtracrとを含む。CRISPRシステムの一成分として使用される本発明のgRNA分子は、標的部位にまたはその近傍にあるDNAの修飾(例えば、配列の修飾)に有用である。かかる修飾には、例えば標的部位を含む遺伝子の機能性産物の発現の低下または消失をもたらす欠失および/または挿入が含まれる。これらの使用およびさらなる使用について、以下にさらに詳しく説明する。
[標的化ドメイン]−[crRNAフラッグポール領域]−[任意選択の第1のフラッグポール伸長部]−[ループ]−[任意選択の第1のtracr伸長部]−[tracrフラッグポール領域]−[tracrヌクレアーゼ結合ドメイン]。
ポリヌクレオチド1(crRNA):[標的化ドメイン]−[crRNAフラッグポール領域]−[任意選択の第1のフラッグポール伸長部]−[任意選択の第2のフラッグポール伸長部]
ポリヌクレオチド2(tracr):[任意選択の第1のtracr伸長部]−[tracrフラッグポール領域]−[tracrヌクレアーゼ結合ドメイン]。
を含み、好ましくは配列番号6584を含むgRNA分子に使用される。
を含み、好ましくは配列番号6585を含むgRNA分子に使用される。
1)標的化ドメイン:
標的化ドメインの選択に関する指針については、例えば、Fu Y el al.NAT BIOTECHNOL 2014(doi:10.1038/nbt.2808)およびSternberg SH el al.NATURE 2014(doi:10.1038/naturel3011)を参照することができる。
フラッグポールは、crRNAおよびtracrの両方からの一部分を含む。crRNAフラッグポール領域はtracrの一部分に相補的であり、ある実施形態では、少なくとも一部の生理条件下、例えば通常の生理条件下で二重鎖化した領域を形成するのに十分なtracrの一部分との相補性を有する。ある実施形態において、crRNAフラッグポール領域は5〜30ヌクレオチド長である。ある実施形態において、crRNAフラッグポール領域は5〜25ヌクレオチド長である。crRNAフラッグポール領域は、細菌CRISPRアレイからのリピート配列の天然に存在する一部分と相同性を共有するかまたはそれに由来し得る。ある実施形態において、これは本明細書に開示されるcrRNAフラッグポール領域、例えば化膿レンサ球菌(S.pyogenes)またはS.サーモフィルス(S.thermophilus)crRNAフラッグポール領域と少なくとも50%の相同性を有する。
第1のtracr伸長部を含むtracrが使用されるとき、crRNAは第1のフラッグポール伸長部を含み得る。一般に任意の第1のフラッグポール伸長部および第1のtracr伸長部を用いることができ、但しそれらは相補的であるものとする。実施形態において、第1のフラッグポール伸長部および第1のtracr伸長部は、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれを超える相補ヌクレオチドからなる。
ループは、sgRNAのcrRNAフラッグポール領域(または存在する場合には任意選択で第1のフラッグポール伸長部)をtracr(または存在する場合には任意選択で第1のtracr伸長部)と連結する役割を果たす。ループはcrRNAフラッグポール領域とtracrとを共有結合的または非共有結合的に連結し得る。ある実施形態において、この連結は共有結合性である。ある実施形態において、ループはcrRNAフラッグポール領域とtracrとを共有結合的にカップリングする。ある実施形態において、ループは第1のフラッグポール伸長部と第1のtracr伸長部とを共有結合的にカップリングする。ある実施形態において、ループは、crRNAフラッグポール領域と、crRNAフラッグポール領域にハイブリダイズするtracrのドメインとの間に介在する共有結合であるか、またはそれを含む。典型的には、ループは1ヌクレオチド以上、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、dgRNAは、crRNAフラッグポール領域、または存在する場合には第1のフラッグポール伸長部の3’側に、本明細書において第2のフラッグポール伸長部と称される追加的な配列を含み得る。ある実施形態において、第2のフラッグポール伸長部は、2〜10、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、または2〜4ヌクレオチド長である。ある実施形態において、第2のフラッグポール伸長部は、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド長であるかまたはそれを超える。ある実施形態において、第2のフラッグポール伸長部は配列番号6587を含む。
tracrは、ヌクレアーゼ、例えばCas9の結合に必要な核酸配列である。理論によって拘束されるものではないが、各Cas9種が特定のtracr配列に関連付けられると考えられる。tracr配列はsgRNAおよびdgRNAの両方のシステムで利用される。ある実施形態において、tracrは、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)tracrからの配列を含むかまたはそれに由来する。一部の態様において、tracrは、crRNAのフラッグポール部分にハイブリダイズする一部分、例えば、少なくともある生理条件下で二重鎖化した領域を形成するのに十分なcrRNAフラッグポール領域との相補性を有する一部分(ときに本明細書においてtracrフラッグポール領域またはcrRNAフラッグポール領域と相補的なtracrドメインと称されることもある)を有する。実施形態において、crRNAフラッグポール領域とハイブリダイズするtracrのドメインは、crRNAフラッグポール領域の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドを含む。一部の態様において、crRNAフラッグポール領域の相補ヌクレオチドとハイブリダイズするtracrヌクレオチドは連続している。一部の態様において、crRNAフラッグポール領域の相補ヌクレオチドとハイブリダイズするtracrヌクレオチドは不連続であり、例えば、crRNAフラッグポール領域のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドによって分離された2つ以上のハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様において、crRNAフラッグポール領域にハイブリダイズするtracrの一部分は、5’から3’に、UAGCAAGUUAAAA(配列番号6597)を含む。一部の態様において、crRNAフラッグポール領域にハイブリダイズするtracrの一部分は、5’から3’に、UAGCAAGUUUAAA(配列番号6598)を含む。実施形態において、crRNAフラッグポール領域とハイブリダイズする配列は、ヌクレアーゼ、例えばCas分子、例えばCas9分子をさらに結合するtracrの配列の5’側のtracr上に配置される。
UAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(配列番号6599)
を含む。一部の態様において、Cas9分子をさらに結合するドメインは、5’から3’に、
UAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(配列番号6600)
を含む。
crRNA:
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAU*mG*mC*mU(配列番号2008)
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する);および
tracr:
(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
crRNA:
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAU*mG*mC*mU(配列番号2009)
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する);および
tracr:
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
crRNA:
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(配列番号2010)
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する);および
tracr:
(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
crRNA:
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(配列番号2011)
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する);および
tracr:
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、および*はホスホロチオエート結合を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
crRNA:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号2012)
(式中、Nは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する);および
tracr:
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、および*はホスホロチオエート結合を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
(式中、mは2’O−メチル修飾を有する塩基を示し、*はホスホロチオエート結合を示し、およびNは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す)(任意選択で5’末端および/または3’末端に逆位脱塩基残基を有する)。
gRNAが第1のフラッグポール伸長部を含む場合、tracrは第1のtracr伸長部を含み得る。第1のtracr伸長部は、第1のフラッグポール伸長部のヌクレオチドと相補的、例えば、80%、85%、90%、95%または99%、例えば完全に相補的なヌクレオチドを含み得る。一部の態様において、第1のフラッグポール伸長部の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする第1のtracr伸長部ヌクレオチドは連続している。一部の態様において、第1のフラッグポール伸長部の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする第1のtracr伸長部ヌクレオチドは不連続であり、例えば、第1のフラッグポール伸長部のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドによって分離された2つ以上のハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様において、第1のtracr伸長部は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれを超えるヌクレオチドを含む。一部の態様において、第1のtracr伸長部は配列番号6591を含む。一部の態様において第1のtracr伸長部は、配列番号6591と少なくとも80%、85%、90%、95%または99%の相同性である核酸を含む。
e)3’末端に少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のウラシル(U)ヌクレオチド、例えば、1、2、3、4、5、6、または7個のウラシル(U)ヌクレオチドをさらに含む上記a)〜d)のいずれか;
f)3’末端に少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のアデニン(A)ヌクレオチド、例えば、1、2、3、4、5、6、または7個のアデニン(A)ヌクレオチドをさらに含む上記a)〜d)のいずれか;または
g)5’末端(例えば、5’側端、例えば、標的化ドメインの5’側)に、少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のアデニン(A)ヌクレオチド、例えば、1、2、3、4、5、6、または7個のアデニン(A)ヌクレオチドをさらに含む上記a)〜f)のいずれか。実施形態において、上記a)〜g)のいずれかは、標的化ドメインのすぐ3’側に配置される。
を含む、例えばそれからなる。
[標的化ドメイン]−
を含む、例えばそれからなる。
5’から3’に、好ましくは標的化ドメインのすぐ3’側に配置された以下を含むcrRNA:
a) GUUUUAGAGCUA(配列番号6584);
b) GUUUAAGAGCUA(配列番号6585);
c) GUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号6605);
d) GUUUAAGAGCUAUGCUG(配列番号6606);
e) GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号6607);
f) GUUUAAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号6608);または
g) GUUUUAGAGCUAUGCU (配列番号7806):
および5’から3’に以下を含むtracr:
k)3’末端に少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のウラシル(U)ヌクレオチド、例えば、1、2、3、4、5、6、または7個のウラシル(U)ヌクレオチドをさらに含む上記a)〜j)のいずれか;
l)3’末端に少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のアデニン(A)ヌクレオチド、例えば、1、2、3、4、5、6、または7個のアデニン(A)ヌクレオチドをさらに含む上記a)〜j)のいずれか;または
m)5’末端に(例えば、5’側端に)少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のアデニン(A)ヌクレオチド、例えば、1、2、3、4、5、6、または7個のアデニン(A)ヌクレオチドをさらに含む上記a)〜l)のいずれか。
を含む、例えばそれからなるtracrとを含む、例えばそれからなる。
を含む、例えばそれからなるtracrとを含む、例えばそれからなる。
を含む、例えばそれからなるtracrとを含む、例えばそれからなる。
を含む、例えばそれからなるtracrとを含む、例えばそれからなる。
を含む、例えばそれからなるtracrとを含む、例えばそれからなる。
以下の表に、本発明の様々な態様、例えば、グロビン遺伝子、例えば胎児ヘモグロビン遺伝子またはヘモグロビンβ遺伝子の発現の改変に用いられるgRNA分子の標的化ドメインを提供する。
子は、それぞれ配列番号99および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号99および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号112および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号98および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1580および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号99を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号106および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1503および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1589および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配
列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号160および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1537および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号159および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号101および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号1
589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号162および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号104および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号138および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1536および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番
号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1539および配列番号1585を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号165を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号113を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号99を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号112を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号98を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号1580を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号106を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号1503を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号1589を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号160を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号1537を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号159を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号101を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号162を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号104を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号138を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号1536を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1585および配列番号1539を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
NA分子は、それぞれ配列番号248および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号248および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号248および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号248および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号247および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号245および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号185を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号249および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号244および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号199および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号251および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRN
A分子は、それぞれ配列番号250および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号250および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号334および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号185および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号250を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号186および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号336および配列番号337を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号246を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号248を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号247を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号245を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号249を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号244を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号199を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号251を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号250を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号334を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号185を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号186を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号337および配列番号336を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
NA分子は、それぞれ配列番号310および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号310および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号310および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号319および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号298および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号322および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号311および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号289を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号315および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号290および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号317および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号309および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号289および配列番号281を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号312を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号313を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号294を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号310を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号319を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号298を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号322を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号311を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号315を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号290を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号317を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号309を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号281および配列番号289を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
A分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1609および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1621および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1617および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1654および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1631および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1620および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1637および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1656を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1612および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1656および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1619および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1675および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1
609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1645および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1598および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1599および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1663および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列
番号1677および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1677および配列番号1626を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1638を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1647を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1609を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1621を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1617を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1654を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1631を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1620を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1637を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1612を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1656を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1619を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1675を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1645を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1598を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1599を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1663を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、それぞれ配列番号1626および配列番号1677を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
gRNAの設計方法が、標的配列の選択、設計および検証方法を含め、本明細書に記載される。例示的標的化ドメインも本明細書に提供される。本明細書で考察される標的化ドメインは、本明細書に記載されるgRNAに組み込むことができる。
Cas9分子
好ましい実施形態において、Cas分子はCas9分子である。本明細書に記載される方法および組成物では、様々な種のCas9分子を使用することができる。化膿レンサ球菌(S.pyogenes)Cas9分子が本明細書における開示の多くの主題であるが、本明細書に挙げる他の種のCas9タンパク質のCas9分子、それに由来するCas9分子、またはそれをベースとするCas9分子も同様に使用することができる。換言すれば、他のCas9分子、例えば、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)および/または髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)Cas9分子が、本明細書に記載されるシステム、方法および組成物で用いられ得る。さらなるCas9種としては、アシドボラクス・アベナエ(Acidovorax avenae)、アクチノバチルス・プルロニューモニエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)、アクチノバチルス・サクシノゲネス(Actinobacillus succinogenes)、アクチノバチルス・スイス(Actinobacillus suis)、アクチノミセス属種(Actinomyces sp.)、アリサイクリフィルス・デニトリフィカンス(Alicycliphilus denitrificans)、アミノモナス・パウシボランス(Aminomonas paucivorans)、セレウス菌(Bacillus cereus)、バチルス・スミシイ(Bacillus smithii)、バチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス属種(Bacteroides sp.)、ブラストピレルラ・マリナ(Blastopirellula marina)、ブラディリゾビウム属種(Bradyrhizobium sp.)、ブレビバチルス・ラテロスポラス(Brevibacillus laterosporus)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラド(Campylobacter lad)、カンジダツス・プニセイスピリルム(Candidatus Puniceispirillum)、クロストリジウム・セルロリティカム(Clostridium cellulolyticum)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、コリネバクテリウム・アクコレンス(Corynebacterium accolens)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria)、コリネバクテリウム・マツルショッティイ(Corynebacterium matruchotii)、ディノロセオバクター・シバエ(Dinoroseobacter shibae)、ユーバクテリウム・ドリクム(Eubacterium dolichum)、ガンマプロテオバクテリア(gamma proteobacterium)、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス(Gluconacetobacter diazotrophicus)、パラインフルエンザ菌(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・スプトルム(Haemophilus sputorum)、ヘリコバクター・カナデンシス(Helicobacter canadensis)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ムステラエ(Helicobacter mustelae)、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytropus)、キンゲラ・キンゲ(Kingella kingae)、ラクトバチルス・クリスパタス(Lactobacillus crispatus)、リステリア・イバノビイ(Listeria ivanovii)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリア科(Listeriaceae)細菌、メチロシスティス属種(Methylocystis sp.)、メチロサイナス・トリコスポリウム(Methylosinus trichosporium)、モビルンカス・ムリエリス(Mobiluncus mulieris)、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)、黄色球菌(Neisseria flavescens)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)、ナイセリア属種(Neisseria sp.)、ナイセリア・ワズワーシイ(Neisseria wadsworthii)、ニトロソモナス属種(Nitrosomonas sp.)、パルビバクラム・ラバメンチボランス(Parvibaculum lavamentivorans)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ファスコラルクトバクテリウム・スクシナツテンス(Phascolarctobacterium succinatutens)、ラルストニア・シジジイ(Ralstonia syzygii)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、ロドブラム属種(Rhodovulum sp.)、シモンシエラ・ムエレリ(Simonsiella muelleri)、スフィンゴモナス属種(Sphingomonas sp.)、スポロラクトバチルス・ビネエ(Sporolactobacillus vineae)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、ストレプトコッカス属種(Streptococcus sp.)、サブドリグラヌルム属種(Subdoligranulum sp.)、ティストレラ・モビリス(Tistrella mobilis)、トレポネーマ属種(Treponema sp.)、またはベルミネフォロバクター・エイセニエ(Verminephrobacter eiseniae)が挙げられる。
と60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の相同性を有するアミノ酸配列を含み、それと比較したときに1%、2%、5%、10%、15%、20%、30%、または40%以下のアミノ酸残基が異なるか、それと1、2、5、10または20アミノ酸以上100、80、70、60、50、40または30アミノ酸以下異なるか、またはそれと同一である。
天然に存在するCas9分子は、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性(例えば、エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活性);ヘリカーゼ活性;gRNA分子と機能的に関連する能力;および核酸上の部位を標的化する(またはそこに局在化する)能力(例えば、PAM認識および特異性)を含め、幾つもの特性を有する。ある実施形態において、Cas9分子はこれらの特性の全てまたは一部を含み得る。典型的な実施形態において、Cas9分子はgRNA分子と相互作用し、gRNA分子と協力して核酸の部位に局在化する能力を有する。他の活性、例えば、PAM特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活性はCas9分子でより広く異なり得る。
天然に存在するCas9分子は、特異的PAM配列、例えば、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、黄色ブドウ球菌(S.aureus)および髄膜炎菌(N.meningitidis)について上記に記載したPAM認識配列を認識することができる。
ある実施形態において、Cas9分子は、天然に存在するCas9分子と異なる、例えば、最も近い相同性を有する天然に存在するCas9分子と異なる切断特性を含む。例えば、Cas9分子は、天然に存在するCas9分子、例えば化膿レンサ球菌(S.pyogenes)のCas9分子と以下のとおり異なり得る:例えば天然に存在するCas9分子(例えば、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)のCas9分子)と比較したときに二本鎖切断の切断(エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活性)を調整する、例えば低下または増加させるその能力;例えば天然に存在するCas9分子(例えば、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)のCas9分子)と比較したときに核酸の一本鎖、例えば核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖の切断(ニッカーゼ活性)を調整する、例えば低下または増加させるその能力;または核酸分子、例えば二本鎖または一本鎖核酸分子を切断する能力を除去し得る。
ある実施形態において、活性Cas9分子は、以下の活性の1つ以上を含む:N末端RuvC様ドメインに関連する切断活性;HNH様ドメインに関連する切断活性;HNHドメインに関連する切断活性およびN末端RuvC様ドメインに関連する切断活性。
ある実施形態において、改変Cas9分子は、核酸分子を(二本鎖核酸分子または一本鎖核酸分子のいずれも)切断しない、または核酸分子を著しく低い効率で、例えば、本明細書に記載されるアッセイによって例えば計測したときに参照Cas9分子の切断活性の20、10、5、1または0.1%未満の効率で切断する不活性Cas9分子である。参照Cas9分子は、天然に存在する非修飾Cas9分子、例えば、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、黄色ブドウ球菌(S.aureus)または髄膜炎菌(N.meningitidis)のCas9分子など、天然に存在するCas9分子であり得る。ある実施形態において、参照Cas9分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然に存在するCas9分子である。ある実施形態において、不活性Cas9分子は、実質的なN末端RuvC様ドメインに関連する切断活性およびHNH様ドメインに関連する切断活性を欠いている。
実施形態において、Cas9分子、例えば化膿レンサ球菌(S.pyogenes)のCas9は、さらなる活性を付与する1つ以上のアミノ酸配列をさらに含み得る。
Cas9分子、例えば活性Cas9分子または不活性Cas9分子をコードする核酸が本明細書に提供される。
候補Cas9分子、候補gRNA分子、候補Cas9分子/gRNA分子複合体は、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり評価することができる。例えば、Cas9分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価する例示的方法が、例えば、Jinek el al.,SCIENCE 2012;337(6096):816−821に記載されている。
用語「鋳型核酸」または「ドナー鋳型」は、本明細書で使用されるとき、本発明のCRISPRシステムによって修飾、例えば切断された標的配列にまたはその近傍に挿入される核酸を指す。ある実施形態において、標的配列のまたはその近傍の核酸配列が、典型的には1つまたは複数の切断部位にまたはその近傍に鋳型核酸の配列の一部または全てを有するように修飾される。ある実施形態において、鋳型核酸は一本鎖である。代替的実施形態において、鋳型核酸は二本鎖である。ある実施形態において、鋳型核酸はDNA、例えば二本鎖DNAである。代替的実施形態において、鋳型核酸は一本鎖DNAである。
本明細書に記載されるとおり、ヌクレアーゼ誘導相同組換え修復(HDR)または相同的組換え(HR)を用いて標的配列を改変し、およびゲノムの突然変異を修正(例えば、修復または編集)することができる。理論によって拘束されることを望むものではないが、標的配列の改変は、ドナー鋳型または鋳型核酸に基づく修復によって起こると考えられる。例えば、ドナー鋳型または鋳型核酸が標的配列の改変をもたらす。プラスミドドナーまたは線状二本鎖鋳型を相同的組換えの鋳型として使用し得ることが企図される。さらに、一本鎖ドナー鋳型を標的配列とドナー鋳型との間の代替的相同組換え修復方法(例えば、一本鎖アニーリング)による標的配列の改変の鋳型として使用し得ることが企図される。ドナー鋳型によって達成される標的配列の改変は、Cas9分子による切断に依存し得る。Cas9による切断には、二本鎖切断、1つの一本鎖切断、または2つの一本鎖切断が含まれ得る。
ある実施形態において、HNH様ドメインに関連する切断活性とRuvC様ドメイン、例えばN末端RuvC様ドメインに関連する切断活性とを有するCas9分子、例えば野生型Cas9によって二本鎖切断が達成される。かかる実施形態には単一のgRNAのみが必要である。
他の実施形態において、ニッカーゼ活性、例えばHNH様ドメインに関連する切断活性またはN末端RuvC様ドメインに関連する切断活性を有するCas9分子によって2つの一本鎖切断、すなわちニックが達成される。かかる実施形態には、各一本鎖切断の配置につき1つずつ、2つのgRNAが必要である。ある実施形態において、ニッカーゼ活性を有するCas9分子は、gRNAがハイブリダイズする鎖を切断し、gRNAがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖は切断しない。ある実施形態において、ニッカーゼ活性を有するCas9分子は、gRNAがハイブリダイズする鎖を切断せず、むしろgRNAがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖を切断する。
鎖の一方における二本鎖切断点または一本鎖切断点は、修正が起こるように標的位置に十分に近くなければならない。ある実施形態において、距離は50、100、200、300、350または400ヌクレオチド以下である。理論によって拘束されることを望むものではないが、切断点は、末端リセクション間に切断点がエキソヌクレアーゼ媒介性の除去を受ける領域内にあるように、標的位置に十分に近くなければならないと考えられる。ドナー配列は末端リセクション領域内の配列の修正にのみ用いられ得ることに伴い、標的位置と切断点との間の距離が離れ過ぎている場合、末端リセクションに突然変異が含まれないこともあり、したがって修正されないこともある。
相同性アームは、例えばリセクションされた一本鎖オーバーハングがドナー鋳型内の相補領域を見付けることを可能にするため、少なくとも末端リセクションが起こり得る領域のところまで延在しなければならない。全長は、プラスミドサイズまたはウイルスパッケージング限界などのパラメータによって制限され得る。ある実施形態において、相同性アームは反復エレメント、例えばALUリピート、LINEリピートまでは延在しない。鋳型は同じまたは異なる長さの2つの相同性アームを有し得る。
ポジティブ制御エレメントの活性の低下;
ポジティブ制御エレメントの活性の増加;
ネガティブ制御エレメントの活性の低下;
ネガティブ制御エレメントの活性の増加;
遺伝子の発現の低下;
遺伝子の発現の増加;
障害または疾患に対する抵抗性の増加;
ウイルス侵入に対する抵抗性の増加;
突然変異の修正または望ましくないアミノ酸残基の改変;
遺伝子産物の生物学的特性の付与、増加、消失または低下、例えば、酵素の酵素活性の増加、または遺伝子産物が別の分子と相互作用する能力の増加。
標的配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12ヌクレオチドまたはそれを超える配列の変化。
[5’相同性アーム]−[挿入配列]−[3’相同性アーム]。
本明細書に記載されるとおり、ヌクレアーゼ誘導性非相同末端結合(NHEJ)を用いて遺伝子特異的ノックアウトを標的化することができる。ヌクレアーゼ誘導性NHEJを用いてまた、目的の遺伝子の配列を除去する(例えば、欠失させる)こともできる。
NHEJ媒介性インデルを誘導する目的でgRNAおよびCas9ヌクレアーゼが二本鎖切断を作成する実施形態において、gRNA、例えば単分子(またはキメラ)またはモジュラーgRNA分子は、標的位置のヌクレオチドにごく接近して1つの二本鎖切断を置くように構成される。ある実施形態において、切断部位は標的位置から0〜500bp(例えば、標的位置から500、400、300、200、100、50、40、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1bp未満)離れている。
理論によって拘束されることを意図するものではないが、意外にも、本明細書では、連続核酸上でごく近接して位置する2つの標的配列を(例えば、各々がそのそれぞれの標的配列にまたはその近傍に一本鎖または二本鎖切断を誘導する2つのgRNA分子/Cas9分子複合体によって)標的化すると、2つの標的配列間に位置する核酸配列(または核酸配列の少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%)の切り出し(例えば、欠失)が誘導されることが示されている。一部の態様において、本開示は、連続核酸、例えば染色体、例えばそのイントロン、エクソンおよび調節エレメントを含めた遺伝子または遺伝子座上でごく近接した標的配列を標的化する標的化ドメインを含む2つ以上のgRNA分子の使用を提供する。この使用は、例えば、2つ以上のgRNA分子を1つ以上のCas9分子と共に(または2つ以上のgRNA分子および/または1つ以上のCas9分子をコードする核酸を)細胞に導入することにより得る。
さらに、意外にも、本明細書では、gRNA分子および前記gRNA分子を含むCRISPRシステムが、同じ細胞型、送達方法およびcrRNA/tracr成分を使用すると複数の実験にわたって同様または同一のインデルパターンを生じることが示されている。理論によって拘束されるものではないが、ある種のインデルパターンが他よりも有利であり得ると考えられる。例えば、「フレームシフト突然変異」(例えば、1塩基対または2塩基対の挿入または欠失、またはn/3(式中、n=挿入または欠失におけるヌクレオチドの数)が整数でない場合の任意の挿入または欠失)をもたらす挿入および/または欠失を主に含むインデルが、機能タンパク質の発現を低下または消失させるのに有益であり得る。同様に、「大規模欠失」(10、11、12、13、14、15、20、25、または30ヌクレオチドより多い欠失)を主に含むインデルも、例えば、同様に機能タンパク質の発現に向上した効果を及ぼし得るプロモーター結合部位などの重要な調節配列の除去に有益であり得る。所与のgRNA/CRISPRシステムによって誘導されるインデルパターンは、意外にも、本明細書に記載されるとおり、細胞型にわたって一貫して再現されることが分かっているが、所与の細胞においてgRNA/CRISPRシステムの導入時にいずれかの単一のインデル構造が必ず生じるわけではない。
成分、例えばCas9分子またはgRNA分子、または両方は、種々の形態で送達、製剤化、または投与することができる。非限定的な例として、gRNA分子およびCas9分子は、(1つ以上の組成物に)製剤化し、ゲノム編集イベントが所望される細胞に直接送達または投与することができる。あるいは、1つ以上の成分、例えばCas9分子またはgRNA分子、または両方をコードする核酸を(1つ以上の組成物に)製剤化して送達または投与することもできる。一態様において、gRNA分子は、gRNA分子をコードするDNAとして提供され、およびCas9分子は、Cas9分子をコードするDNAとして提供される。一実施形態において、gRNA分子とCas9分子とは別個の核酸分子上にコードされる。一実施形態において、gRNA分子とCas9分子とは同じ核酸分子上にコードされる。一態様において、gRNA分子はRNAとして提供され、およびCas9分子は、Cas9分子をコードするDNAとして提供される。一実施形態において、gRNA分子は、例えば本明細書に記載されるとおりの、1つ以上の修飾を伴い提供される。一態様において、gRNA分子はRNAとして提供され、およびCas9分子は、Cas9分子をコードするmRNAとして提供される。一態様において、gRNA分子はRNAとして提供され、およびCas9分子はタンパク質として提供される。一実施形態において、gRNAおよびCas9分子はリボ核タンパク質複合体(RNP)として提供される。一態様において、gRNA分子は、gRNA分子をコードするDNAとして提供され、およびCas9分子はタンパク質として提供される。
Cas9分子および/またはgRNA分子をコードするDNAは、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり対象に投与し、または細胞に送達することができる。例えば、Cas9コードDNAおよび/またはgRNAコードDNAは、例えば、ベクター(例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター)、非ベクターベースの方法(例えば、ネイキッドDNAまたはDNA複合体を使用して)、またはこれらの組み合わせによって送達することができる。
Cas9分子(例えば、活性Cas9分子、不活性Cas9分子または不活性Cas9融合タンパク質)および/またはgRNA分子をコードするRNAは、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり、細胞、例えば本明細書に記載される標的細胞に送達することができる。例えば、Cas9コードRNAおよび/またはgRNAコードRNAは、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、またはこれらの組み合わせによって送達することができる。
Cas9分子(例えば、活性Cas9分子、不活性Cas9分子または不活性Cas9融合タンパク質)は、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり細胞に送達することができる。例えば、Cas9タンパク質分子は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、セルスクイージングまたはアブレーション(例えば、ナノニードルによる)またはこれらの組み合わせによって送達することができる。送達は、gRNAをコードするDNAによるか、またはgRNAにより、例えばgRNAとCas9タンパク質とをリボ核タンパク質複合体(RNP)に予め複合体化することによって達成し得る。
1.Cas9分子およびtracrを溶液中に高濃度(例えば、細胞に送達される最終RNP濃度よりも高い濃度)で提供し、これらの2つの成分を平衡化させる;
2.crRNA分子を提供し、成分を平衡化させる(それによりRNPの高濃度溶液を形成する);
3.RNP溶液を所望の濃度に希釈する;
4.前記所望の濃度の前記RNPを標的細胞に例えばエレクトロポレーションによって送達する。
Casシステムの成分、例えばCas9分子成分およびgRNA分子成分を別々に送達する、より詳細には成分を異なる様式で送達すると、例えば組織特異性および安全性が改善されるため、パフォーマンスを増進させることができる。
本明細書に記載されるCas9システム、例えば、1つ以上のgRNA分子および1つ以上のCas9分子は、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患の治療に有用である。用語「〜を治療する」、「治療された」、「治療している」、および「治療」には、cas9システム、例えば1つ以上のgRNA分子および1つ以上のcas9分子を細胞に投与することにより、疾患の症状、合併症、または生化学的徴候を予防し、またはその発生を遅延させること、疾患、病態、または障害の症状を軽減し、またはそのさらなる発症を阻止または阻害することが含まれる。治療には、本発明のgRNA分子(または2つ以上のgRNA分子)の導入により、または本明細書に記載されるとおりのCRISPRシステムの導入により、または本明細書に記載される前記細胞の調製方法のいずれかによって修飾された1つ以上の細胞、例えばHSPC(例えば、その集団)の投与により、疾患の症状、合併症、または生化学的徴候を予防し、またはその発生を遅延させること、疾患、病態、または障害の症状を軽減し、またはそのさらなる発症を阻止または阻害することも含まれ得る。治療は予防的であってもよく(それにより疾患を予防し、またはその発生を遅延させるか、またはその臨床的もしくは準臨床的症状の発現を予防する)、または疾患発現後の症状の療法的抑制または軽減であってもよい。治療は、本明細書に記載される療法的手段によって計測することができる。したがって、本発明の「治療」方法には、細胞へのcas9システム(例えば、1つ以上のgRNA分子および1つ以上のCas9分子)の導入によって改変された細胞を対象に投与することにより、疾患または病態の1つ以上の症状を治癒し、その重症度を低減し、またはそれを改善すること、かかる治療がない場合の予想を超えて対象の健康または生存を延ばすことも含まれる。例えば、「治療」には、対象の疾患症状の少なくとも5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれを超える軽減が含まれる。
異常ヘモグロビン症には、赤血球細胞(RBC)の産生低下および/または破壊増加(溶血)がある遺伝的原因の幾つもの貧血症が含まれる。それらには、酸素濃度を維持する能力の低下が付随する異常ヘモグロビンの産生をもたらす遺伝的欠陥も含まれる。かかる障害の中には、正常なβ−グロビンを十分な量で産生できないことが関係するものもあれば、正常なβ−グロビンを全く産生できないことが関係するものもある。β−グロビンタンパク質に関連するこれらの障害は、一般にβヘモグロビン異常症と称される。例えば、β−サラセミアは、β−グロビン遺伝子の発現の部分的または完全な欠損がHbA欠損または欠如につながることによって起こる。鎌状赤血球貧血は、β−グロビン構造遺伝子の点突然変異が異常な(鎌状の)ヘモグロビン(HbS)の産生につながることによって起こる。HbSは、特に脱酸素化条件下で重合し易い。HbS RBCは正常RBCと比べて脆弱で溶血を起こし易く、最終的に貧血につながる。
鎌状赤血球症は、ヘモグロビンに影響を及ぼす一群の障害である。この障害を持つ人は異型ヘモグロビン分子(ヘモグロビンS)を有し、これによって赤血球細胞が歪んで鎌状、または三日月形の形状になり得る。この障害に特有の特徴としては、低赤血球細胞数(貧血症)、反復感染、および周期性疼痛発作が挙げられる。
βサラセミアは、ヘモグロビンの産生が低下する血液障害である。βサラセミアの人では、低レベルのヘモグロビンが体の多くの箇所の酸素欠乏につながる。罹患者はまた、赤血球細胞の不足も有し(貧血)、そのため青白い皮膚、脱力感、疲労、およびより重篤な合併症を生じ得る。βサラセミアの人は血液凝固異常を発症するリスクが高い。
別の態様において、本発明は治療方法を提供する。態様において、本発明のgRNA分子、CRISPRシステムおよび/または細胞を使用して、それを必要としている患者が治療される。態様において、患者は哺乳動物、例えばヒトである。態様において、患者は異常ヘモグロビン症を有する。実施形態において、患者は鎌状赤血球症を有する。実施形態において、患者はβサラセミアを有する。
a)哺乳動物からHSPC(例えば、CD34+細胞)の集団を提供する、例えば採取または単離するステップ;
b)前記細胞をエキソビボで、例えば細胞培養培地中に、任意選択で少なくとも1つの幹細胞増殖剤を含む組成物の有効量の存在下で提供するステップであって、それにより前記HSPC(例えば、CD34+細胞)の集団を未処理の集団よりも高い程度に増殖させるステップ;
c)HSPC(例えば、CD34+細胞)の集団を、有効量の、本明細書に記載される標的化ドメイン、例えば、表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、または表9に記載される標的化ドメインを含む少なくとも1つのgRNA分子、または前記gRNA分子をコードする核酸と、例えば本明細書に記載される少なくとも1つのcas9分子、または前記cas9分子をコードする核酸とを含む組成物、例えば本明細書に記載されるとおりの1つ以上のRNPに、例えば、本明細書に記載されるCRISPRシステムに接触させるステップ;
d)集団の細胞の少なくとも一部(例えば、集団のHSPC、例えばCD34+細胞の少なくとも一部)に少なくとも1つの修飾を生じさせるステップであって、それにより、例えば、前記HSPCが赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化したとき、例えばステップc)により接触させていない細胞と比べて胎児ヘモグロビン発現が増加するステップ;および
f)前記修飾HSPC(例えば、CD34+細胞)を含む細胞の集団を哺乳動物に戻すステップ
を含む。
a)例えば哺乳動物の骨髄から、哺乳動物のHSPC(例えば、CD34+細胞)の集団を提供する、例えば採取または単離するステップ;
b)ステップa)の細胞の集団からCD34+細胞を単離するステップ;
c)前記CD34+細胞をエキソビボで提供し、および前記細胞を例えば細胞培養培地中、少なくとも1つの幹細胞増殖剤、例えば化合物4、例えば約0.5〜約0.75マイクロモル濃度の化合物4を含む組成物の有効量の存在下で培養するステップであって、それにより前記CD34+細胞の集団を未処理の集団よりも高い程度に増殖させるステップ;
d)CD34+細胞の集団の細胞に、有効量の、例えば本明細書に記載されるとおりのCas9分子と、例えば本明細書に記載されるとおりのgRNA分子とを含む組成物を導入するステップであって、例えば、任意選択でCas9分子およびgRNA分子は、例えば本明細書に記載されるとおりのRNPの形態であり、および任意選択で前記導入は、前記細胞への前記RNPの、例えば本明細書に記載されるとおりのエレクトロポレーションによる導入である、ステップ;
e)集団の細胞の少なくとも一部(例えば、集団のHSPC、例えばCD34+細胞の少なくとも一部)に少なくとも1つの遺伝子修飾を生じさせるステップであって、それにより、ステップd)で導入されたgRNAの標的化ドメインと相補的なゲノム部位にまたはその近傍に、例えば本明細書に記載されるとおりのインデルを作り出すステップ;
f)任意選択で、加えて、前記導入後に、例えば細胞培養培地中、少なくとも1つの幹細胞増殖剤、例えば化合物4、例えば約0.5〜約0.75マイクロモル濃度の化合物4を含む組成物の有効量の存在下で前記細胞を培養するステップであって、それにより細胞が少なくとも2倍、例えば少なくとも4倍、例えば少なくとも5倍に増殖するステップ;
g)前記細胞を凍結保存するステップ;および
h)細胞を哺乳動物に戻すステップであって、哺乳動物に戻される細胞が、1)赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力を維持しており、2)赤血球細胞に分化したとき、例えばステップe)のgRNAによって修飾されていない細胞と比べて高いレベルの胎児ヘモグロビンを産生する、例えば、1細胞当たり少なくとも6ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する細胞を含む、ステップ
を含む。
本開示は、本明細書に記載されるgRNA分子で修飾された、または修飾されることになる細胞、例えばHSPC、例えば造血幹細胞、例えばCD34+細胞の培養方法を提供する。
理論によって拘束されるものではないが、特定の標的配列において所与のgRNA分子によって作り出されるインデルのパターンは、細胞内の活性DNA修復機構(例えば、非相同末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合等)の各々の産物であると考えられる。理論によって拘束されるものではないが、編集しようとする細胞を、所望のインデルを生じないDNA修復経路の阻害剤と接触させることにより、特に有利なインデルを選択または富化し得ると考えられる。したがって、本発明のgRNA分子、CRISPRシステム、方法および他の態様は、かかる阻害剤と組み合わせて実施し得る。かかる阻害剤の例としては、例えば、国際公開第2014/130955号パンフレット(この内容は、参照により全体として本明細書に援用される)に記載されるものが挙げられる。実施形態において、阻害剤はDNAPKc阻害剤、例えばNU7441である。
一態様において本発明は、本明細書に記載されるgRNA分子で修飾された、または修飾されることになる細胞、例えばHSPC、例えばCD34+細胞を、薬剤で処理されていない細胞と比べて増殖速度の増加、増殖レベルの増加、または生着の増加をもたらす1つ以上の薬剤と共に培養することに関する。かかる薬剤は、本明細書では幹細胞増殖剤と称される。
化合物1:
である。
化合物2:
である。
化合物3:
である。
化合物4:
である。
本開示は、本明細書に記載されるgRNA分子、または本明細書に記載されるgRNA分子で修飾された細胞(例えば、造血幹細胞、例えばCD34+細胞)を1つ以上の他の治療モダリティおよび/または薬剤と併用した使用を企図する。したがって、本明細書に記載されるgRNA分子またはgRNA分子で修飾された細胞の使用に加えて、異常ヘモグロビン症を治療するための1つ以上の「標準」療法も対象に投与し得る。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは核酸、例えば、特にgRNAに存在し、しかし他の形態のRNA、例えば、mRNA、RNAi、またはsiRNAにも存在し得る。本明細書に記載されるとおり「ヌクレオシド」は、五炭糖分子(ペントースまたはリボース)またはその誘導体、および有機塩基、プリンまたはピリミジンまたはその誘導体を含有する化合物として定義される。本明細書に記載されるとおり、「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドとして定義される。
(i)非連結リン酸酸素の一方または両方、および/またはリン酸ジエステル骨格連結における連結リン酸酸素の1つ以上の改変、例えば置換;
(ii)リボース糖の構成要素、例えばリボース糖上の2’ヒドロキシルの改変、例えば置換;
(iii)「デホスホ」リンカーによるリン酸部分のホールセール置換;
(iv)非カノニカル核酸塩基によるものを含めた、天然に存在する核酸塩基の修飾または置換;
(v)リボース−リン酸骨格の置換または修飾;
(vi)オリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置換、または部分、キャップもしくはリンカーのコンジュゲーション;および
(vii)糖の修飾または置換。
本明細書で使用されるとき、「アルキル」とは、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素基を指すことが意図される。例示的なアルキル基としては、メチル(Me)、エチル(Et)、プロピル(例えば、n−プロピルおよびイソプロピル)、ブチル(例えば、n−ブチル、イソブチル、t−ブチル)、ペンチル(例えば、n−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル)などが挙げられる。アルキル基は、1〜約20、2〜約20、1〜約12、1〜約8、1〜約6、1〜約4、または1〜約3個の炭素原子を含有し得る。
リン酸基
一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドのリン酸基が、酸素の1つ以上を異なる置換基に置換することによって修飾されてもよい。さらに、修飾ヌクレオチド、例えば修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるとおりの修飾リン酸による非修飾リン酸部分のホールセール置換を含み得る。一部の実施形態において、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカーまたは非対称電荷分布の荷電リンカーのいずれかをもたらす改変を含み得る。
リン酸基は非リン含有連結基によって置換することができる。一部の実施形態において、荷電リン酸基が中性部分によって置換されてもよい。
核酸を模倣することのできる足場も構築することができ、ここで、リン酸リンカーおよびリボース糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートに置換される。一部の実施形態において、核酸塩基はサロゲート骨格によってテザー係留することができる。例としては、限定なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジンおよびペプチド核酸(PNA)ヌクレオシドサロゲートを挙げることができる。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖基に1つ以上の修飾を含み得る。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)が幾つもの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基によって修飾または置換されてもよい。一部の実施形態において、2’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルが脱プロトン化して2’−アルコキシドイオンを形成することがもはやできないため、核酸の安定性を増進し得る。2’−アルコキシドは、リンカーリン原子に対する分子内求核攻撃による分解を触媒し得る。
修飾核酸に組み込むことのできる本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、限定はされないが、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、およびウラシル(U)が挙げられる。これらの核酸塩基を修飾し、または完全に置換して、修飾核酸に組み込むことのできる修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供することができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジン類似体から独立して選択することができる。一部の実施形態において、核酸塩基は、例えば、塩基の天然に存在するおよび合成の誘導体を含み得る。
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、プソイドウリジン(ψ)、ピリジン−4−オンリボヌクレオシド、5−アザ−ウリジン、6−アザ−ウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオ−ウリジン(s2U)、4−チオ−ウリジン(s4U)、4−チオ−プソイドウリジン、2−チオ−プソイドウリジン、5−ヒドロキシ−ウリジン(ho5U)、5−アミノアリル−ウリジン、5−ハロ−ウリジン(例えば、5−ヨード−ウリジンまたは5−ブロモ−ウリジン)、3−メチル−ウリジン(m3U)、5−メトキシ−ウリジン(mo5U)、ウリジン5−オキシ酢酸(cmo5U)、ウリジン5−オキシ酢酸メチルエステル(mcmo5U)、5−カルボキシメチル−ウリジン(cm5U)、1−カルボキシメチル−プソイドウリジン、5−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン(chm5U)、5−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル(mchm5U)、5−メトキシカルボニルメチル−ウリジン(mcm5U)、5−メトキシカルボニルメチル−2−チオ−ウリジン(mcm5s2U)、5−アミノメチル−2−チオ−ウリジン(nm5s2U)、5−メチルアミノメチル−ウリジン(mnm5U)、5−メチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン(mnm5s2U)、5−メチルアミノメチル−2−セレノ−ウリジン(mnm5se2U)、5−カルバモイルメチル−ウリジン(ncm5U)、5−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン(cmnm5U)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン(cmnm5s2U)、5−プロピニル−ウリジン、1−プロピニル−プソイドウリジン、5−タウリノメチル−ウリジン(tcm5U)、1−タウリノメチル−プソイドウリジン、5−タウリノメチル−2−チオ−ウリジン(trn5s2U)、1−タウリノメチル−4−チオ−プソイドウリジン、5−メチル−ウリジン(m5U、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有する)、1−メチル−プソイドウリジン(m1ψ)、5−メチル−2−チオ−ウリジン(m5s2U)、1−メチル−4−チオ−プソイドウリジン(m1s4ψ)、4−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、3−メチル−プソイドウリジン(m3ψ)、2−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン(D)、ジヒドロプソイドウリジン、5,6−ジヒドロウリジン、5−メチル−ジヒドロウリジン(m5D)、2−チオ−ジヒドロウリジン、2−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、2−メトキシ−ウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−プソイドウリジン、4−メトキシ−2−チオ−プソイドウリジン、N1−メチル−プソイドウリジン、3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピルプソイドウリジン、5−(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(inm5U)、5−(イソペンテニルアミノメチル]))−2−チオ−ウリジン(inm5s2U)、a−チオ−ウリジン、2’−0−メチル−ウリジン(Urn)、5,2’−0−ジメチル−ウリジン(m5Um)、2’−0−メチル−プソイドウリジン(ψm)、2−チオ−2’−0−メチル−ウリジン(s2Um)、5−メトキシカルボニルメチル−2’−0−メチル−ウリジン(mcm5Um)、5−カルバモイルメチル−2’−0−メチル−ウリジン(ncm5Um)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2’−0−メチル−ウリジン(cmnm5Um)、3,2’−0−ジメチル−ウリジン(m3Um)、5−(イソペンテニルアミノメチル)−2’−0−メチル−ウリジン(inm5Um)、1−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、2’−F−ara−ウリジン、2’−F−ウリジン、2’−OH−ara−ウリジン、5−(2−カルボメトキシビニル)ウリジン、5−[3−(1−E−プロペニルアミノ)ウリジン、ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン類、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、5−アザ−シチジン、6−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、3−メチル−シチジン(m3C)、N4−アセチル−シチジン(act)、5−ホルミル−シチジン(f5C)、N4−メチル−シチジン(m4C)、5−メチル−シチジン(m5C)、5−ハロ−シチジン(例えば、5−ヨード−シチジン)、5−ヒドロキシメチル−シチジン(hm5C)、1−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、2−チオ−シチジン(s2C)、2−チオ−5−メチル−シチジン、4−チオ−プソイドイソシチジン、4−チオ−1−メチル−プソイドイソシチジン、4−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドイソシチジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、5−アザ−ゼブラリン、5−メチル−ゼブラリン、5−アザ−2−チオ−ゼブラリン、2−チオ−ゼブラリン、2−メトキシ−シチジン、2−メトキシ−5−メチル−シチジン、4−メトキシ−プソイドイソシチジン、4−メトキシ−1−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン(k2C)、a−チオ−シチジン、2’−0−メチル−シチジン(Cm)、5,2’−0−ジメチル−シチジン(m5Cm)、N4−アセチル−2’−0−メチル−シチジン(ac4Cm)、N4,2’−0−ジメチル−シチジン(m4Cm)、5−ホルミル−2’−0−メチル−シチジン(f5Cm)、N4,N4,2’−0−トリメチル−シチジン(m4 2Cm)、1−チオ−シチジン、2’−F−ara−シチジン、2’−F−シチジン、および2’−OH−ara−シチジンが挙げられる。
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、2−アミノ−プリン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノ−6−ハロ−プリン(例えば、2−アミノ−6−クロロ−プリン)、6−ハロ−プリン(例えば、6−クロロ−プリン)、2−アミノ−6−メチル−プリン、8−アジド−アデノシン、7−デアザ−アデニン、7−デアザ−8−アザ−アデニン、7−デアザ−2−アミノ−プリン、7−デアザ−8−アザ−2−アミノ−プリン、7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2,6−ジアミノプリン、1−メチル−アデノシン(m1A)、2−メチル−アデニン(m2A)、N6−メチル−アデノシン(m6A)、2−メチルチオ−N6−メチル−アデノシン(ms2m6A)、N6−イソペンテニル−アデノシン(i6A)、2−メチルチオ−N6−イソペンテニル−アデノシン(ms2i6A)、N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(io6A)、2−メチルチオ−N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(ms2io6A)、N6−グリシニルカルバモイル−アデノシン(g6A)、N6−スレオニルカルバモイル−アデノシン(t6A)、N6−メチル−N6−スレオニルカルバモイル−アデノシン(m6t6A)、2−メチルチオ−N6−スレオニルカルバモイル−アデノシン(ms2g6A)、N6,N6−ジメチル−アデノシン(m6 2A)、N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン(hn6A)、2−メチルチオ−N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン(ms2hn6A)、N6−アセチル−アデノシン(ac6A)、7−メチル−アデニン、2−メチルチオ−アデニン、2−メトキシ−アデニン、a−チオ−アデノシン、2’−0−メチル−アデノシン(Am)、N6,2’−0−ジメチル−アデノシン(m6Am)、N6−メチル−2’−デオキシアデノシン、N6,N6,2’−0−トリメチル−アデノシン(m6 2Am)、l,2’−0−ジメチル−アデノシン(m’Am)、2’−0−リボシルアデノシン(リン酸)(Ar(p))、2−アミノ−N6−メチル−プリン、1−チオ−アデノシン、8−アジド−アデノシン、2’−F−ara−アデノシン、2’−F−アデノシン、2’−OH−ara−アデノシン、およびN6−(19−アミノ−ペンタオキサノナデシル)−アデノシンが挙げられる。
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、イノシン(I)、1−メチル−イノシン(m’l)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、4−デメチル−ワイオシン(imG−14)、イソワイオシン(imG2)、ワイブトシン(yW)、ペルオキシワイブトシン(o2yW)、ヒドロキシワイブトシン(OHyW)、不完全修飾型ヒドロキシワイブトシン(OHyW*)、7−デアザ−グアノシン、キューオシン(Q)、エポキシキューオシン(oQ)、ガラクトシル−キューオシン(galQ)、マンノシル−キューオシン(manQ)、7−シアノ−7−デアザ−グアノシン(preQ0)、7−アミノメチル−7−デアザ−グアノシン(preQi)、アーケオシン(G+)、7−デアザ−8−アザ−グアノシン、6−チオ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−8−アザ−グアノシン、7−メチル−グアノシン(m7G)、6−チオ−7−メチル−グアノシン、7−メチル−イノシン、6−メトキシ−グアノシン、1−メチル−グアノシン(m1G)、N2−メチル−グアノシン(m2G)、N2,N2−ジメチル−グアノシン(m2 2G)、N2,7−ジメチル−グアノシン(m2,7G)、N2,N2,7−ジメチル−グアノシン(m2,2,7G)、8−オキソ−グアノシン、7−メチル−8−オキソ−グアノシン、1−メト チオ−グアノシン、N2−メチル−6−チオ−グアノシン、N2,N2−ジメチル−6−チオ−グアノシン、a−チオ−グアノシン、2’−0−メチル−グアノシン(Gm)、N2−メチル−2’−0−メチル−グアノシン(m2Gm)、N2,N2−ジメチル−2’−0−メチル−グアノシン(m2 2Gm)、1−メチル−2’−0−メチル−グアノシン(m1Gm)、N2,7−ジメチル−2’−0−メチル−グアノシン(m2,7Gm)、2’−0−メチル−イノシン(Im)、l,2’−0−ジメチル−イノシン(m1Im)、06−フェニル−2’−デオキシイノシン、2’−0−リボシルグアノシン(ホスフェート)(Gr(p))、1−チオ−グアノシン、06−メチル])−グアノシン、06−メチル−2’−デオキシグアノシン、2’−F−ara−グアノシン、および2’−F−グアノシンが挙げられる。
一部の実施形態において、修飾核酸は修飾gRNAであり得る。一部の実施形態において、gRNAは3’末端で修飾されてもよい。この実施形態において、gRNAは3’末端Uリボースで修飾されてもよい。例えば、Uリボースの2つの末端ヒドロキシル基をアルデヒド基に酸化し、同時にリボース環を開環すると、修飾ヌクレオシド(Uは非修飾または修飾ウリジンであってよい)を得ることができる。
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるgRNA分子、例えば本明細書に記載されるとおりの複数のgRNA分子、または本明細書に記載される1つ以上のgRNA分子で修飾された1つ以上の細胞を含む細胞(例えば、細胞の集団、例えば、造血幹細胞の、例えばCD34+細胞の集団)を、1つ以上の薬学的または生理学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。かかる組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液;グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン類、マンニトールなどの炭水化物;タンパク質;ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸;抗酸化剤;EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);および保存剤を含み得る。本発明の組成物は、一態様では、静脈内投与用に製剤化される。
本発明は、本発明のgRNA分子、または前記gRNA分子をコードする核酸を含む細胞にも関する。
送達タイミング
ある実施形態において、本明細書に記載されるCasシステムの成分、例えばCas9分子成分および/またはgRNA分子成分以外の1つ以上の核酸分子(例えば、DNA分子)が送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Casシステムの成分の1つ以上が送達されるのと同時に送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Casシステムの成分の1つ以上が送達される前またはその後(例えば、約30分、1時間、2時間、3時間、6時間、9時間、12時間、1日、2日、3日、1週、2週間、または4週間未満)に送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Casシステムの成分の1つ以上、例えば、Cas9分子成分および/またはgRNA分子成分が送達されるのと異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達することができる。例えば、核酸分子はウイルスベクター、例えば組込み欠損レンチウイルスによって送達することができ、かつCas9分子成分および/またはgRNA分子成分はエレクトロポレーションによって送達することができ、これにより例えば、核酸(例えば、DNA)によって引き起こされる毒性を低減することができる。ある実施形態において、核酸分子は治療用タンパク質、例えば、本明細書に記載されるタンパク質をコードする。ある実施形態において、核酸分子はRNA分子、例えば、本明細書に記載されるRNA分子をコードする。
Casシステムの成分、例えばCas9分子成分およびgRNA分子成分を別々に送達する、より詳細には成分を異なる様式で送達すると、例えば組織特異性および安全性が改善されるため、パフォーマンスを増進させることができる。ある実施形態において、Cas9分子およびgRNA分子は、異なる様式により、または本明細書においてときに差次的様式と称されるとおり送達される。異なる様式または差次的様式とは、本明細書で使用されるとき、対象成分分子、例えば、Cas9分子、gRNA分子、鋳型核酸、またはペイロードに異なる薬力学的または薬物動態学的特性を付与する送達様式を指す。例えば、送達様式は、例えば、選択されたコンパートメント、組織、または臓器に異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間分布をもたらし得る。
ガイド選択および設計
目的の領域内にあるPAMを同定するため、インシリコでヒト参照ゲノムおよびユーザー定義による目的のゲノム領域(例えば、遺伝子、遺伝子のエクソン、非コード調節領域等)を使用して初期ガイド選択を実施した。同定されたPAMの各々について分析を実施し、統計が報告された。例えば、本明細書に記載されるとおり、効率および有効性を決定するための幾つもの方法に基づきgRNA分子をさらに選択し、順位付けした。
crRNA:[標的化ドメイン]−[配列番号6607]
tracr(trRNA):配列番号6660
[標的化ドメイン]−[配列番号6601]−UUUU
[標的化ドメイン]−[配列番号6604]−UUUU
標的特異的crRNAの一次スクリーニングには、Cas9GFPを発現するHEK293細胞(HEK−293_Cas9GFP)のトランスフェクションを用いた。この例では、例えば本明細書に記載されるとおりのインシリコオフターゲット検出を含む定義された基準を用いて一次スクリーニング用に標的特異的crRNAを設計し、選択した。選択されたcrRNAを化学的に合成し、96ウェルフォーマットで送達した。HEK−293−Cas9GFP細胞に標的crRNAをストックtrRNAと1:1比でトランスフェクトした。トランスフェクションは、製造者のプロトコル(Lipofectamine 2000、Life Technologies)に従いリポフェクション技術を用いて媒介した。リポフェクション後24時間でトランスフェクト細胞を溶解させて、ライセート中でT7E1アッセイおよび/または次世代シーケンシング(NGS;以下)によって編集(例えば、切断)を検出した。
T7E1アッセイを用いて、Cas9によるDNA切断後の非相同末端結合(NHEJ)によって作り出された挿入、欠失および置換などのゲノムDNAの突然変異イベントを検出した(Cho et al.,「Cas9 RNA誘導型エンドヌクレアーゼによるヒト細胞の標的ゲノムエンジニアリング(Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA−guided endonuclease)」.Nature Biotechnology.2013;31,230−232を参照されたい)。
ゲノムにおける標的位置の編集(例えば、切断)効率を決定するため、ディープシーケンシングを利用して、非相同末端結合によって導入された挿入および欠失の存在を同定した。
Cas9タンパク質にcrRNAおよびtrRNAを加えると活性Cas9 リボ核タンパク質複合体(RNP)が形成され、これはcrRNAによって指定される標的領域への結合および標的ゲノムDNAの特異的切断を媒介する。trRNAおよびcrRNAをCas9に負荷することによってこの複合体を形成した。これはCas9にコンホメーション変化を引き起こし、Cas9によるdsDNAへの結合および切断が可能になるものと考えられる。
CD34+ HSCにCas9 RNPを送達した。
CD34+ HSCは、フローサイトメトリーまたはインビトロコロニー形成アッセイなど、既知の技法を用いて幹細胞表現型に関してアッセイし得る。例として、製造者のプロトコルを用いたMethocult H4034 Optimumキット(StemCell Technologies)を使用するインビトロコロニー形成アッセイ(CFC)により、細胞をアッセイした。簡潔に言えば、1〜1.25ml methocultに≦100ul容積中の500〜2000個のCD34+細胞を加える。この混合物を4〜5秒間激しくボルテックスして完全に混合し、次に室温に少なくとも5分間放置した。シリンジを使用して1〜1.25mlのMethoCult+細胞を35mmディッシュまたは6ウェルプレートのウェルに移した。12〜14日後に製造者のプロトコルに従いコロニーの数および形態を評価した。
HSCは、機能的には、その自己複製能力により、および多系統分化について定義される。この機能性はインビボでのみ評価することができる。ヒトHSC機能を決定する際のゴールドスタンダードは、一連の突然変異によって重度免疫不全となり、したがってヒト細胞のレシピエントとしての役割を果たすことができるNOD−SCIDγマウス(NSG)への異種移植によるものである。編集後のHSCがNSGマウスに移植され、誘導された編集がHSC機能に影響しないことを検証し得る。毎月の末梢血分析を用いてヒトキメラ状態および系統発達を評価し、20週後の二次移植を用いて機能性HSCの存在を確立し得る。
T7E1(「T7」)および/またはNGSによってアッセイしたときの、本明細書に記載されるgRNA分子(例えば、上記に記載されるとおりのdgRNA分子)を用いたHEK293_Cas9GFP細胞における編集の結果は、図1(+58 BCL11aエンハンサー領域に対するgRNA分子)および図2(+62 BCL11aエンハンサー領域に対するgRNA分子)、ならびに以下の表に指示されるとおり要約される。CD34+ HSPCにおける平均編集率は、例えば、以下の表10(+58 BCL11aエンハンサー領域に対するgRNA分子)、表11(+62 BCL11aエンハンサー領域に対するgRNA分子)、表12B(+55 BCL11aエンハンサー領域に対するgRNA分子)、および表13(フランス型HPFH領域に対するgRNA分子)に報告される。T7E1アッセイ結果を報告する場合、「2」は高効率切断を示し、「1」は低効率切断を示し、および「0」は切断がないことを示す。一般に、T7E1結果は、NGSによってアッセイされる定量的切断と相関する。上位15個のgRNA(CD34+細胞における最も高い%編集率によって順位付けしたとき)を図11(+58 BCL11aエンハンサー領域)および図12(+62 BCL11aエンハンサー領域)に示す。
BCL11aの+58または+62赤血球系エンハンサー領域内のゲノムDNAに特異的な標的化ドメインを含有する合成sgRNA分子を注文した。図5は、sgEH1〜sgEH9と命名した、sgRNAによって標的化されるゲノムDNAを示す。
sgEH1標的化ドメイン(CR00276):AUCACAUAUAGGCACCUAUC(配列番号212)
sgEH2標的化ドメイン(CR00275):CACAGUAGCUGGUACCUGAU(配列番号211)
sgEH8標的化ドメイン(CR00273):CAGGUACCAGCUACUGUGUU(配列番号209)
sgEH9(CR00277)標的化ドメイン:UGAUAGGUGCCUAUAUGUGA(配列番号213)
G7(g7とも称される)標的化ドメイン:GUGCCAGAUGAACUUCCCAU(配列番号2016)(例えば、配列番号1191の3’20nt)
G8(g8とも称される)標的化ドメイン:CACAAACGGAAACAAUGCAA(配列番号2017)(例えば、配列番号1186の3’20nt)
上記のG7およびg8は、近接部位のゲノムDNAを標的とする(PAM配列はBCL11a遺伝子内で互いから50ヌクレオチド以内にある)。2つの近接部位を同時に標的化する効果を調べるため、G7の標的化ドメインを有するgRNAを含むRNPならびにG8の標的化ドメインを有するgRNAを含むRNPでCD34+細胞をトランスフェクトした。切断効率およびインデルパターンをNGSによって評価した。図10に示すとおり、主要なインデルは、2つのgRNA結合部位間のヌクレオチドの欠失である。これらの結果は、近接して結合する複数の、例えば2つのガイドを使用して、それらの2つの結合部位間にあるDNAの切り出しを達成し得ることを実証している。
CD34+初代造血幹細胞でBCL11a遺伝子座におけるゲノム編集を実証した。簡潔に言えば、製造者の指示に従い免疫選択(Miltenyi)を用いて成人ドナー由来のG−CSF動員末梢血(AllCells)からCD34+細胞を単離した。細胞ゲーティングは図3に示す。細胞をアリコートに分けて凍結保存した。解凍した細胞を2×105/mlでSFEM(StemCell Technologies)+1×抗生物質/抗真菌薬+各50ng/mlのサイトカイン(TPO、FLT3L、IL6およびSCF)+500nM化合物4に播種し、加湿インキュベーターにおいて37℃、5%CO2で5日間培養した。5日後の細胞濃度は1×106/mlであった。
を含む)からなるプレインキュベートしたRNP複合体を2×105細胞に加え、製造者のプロトコルに従いNeonシステム(Lifetechnologies)でパルスパラメータ:1600V、20ms、1パルスを用いてエレクトロポレートした。デュプリケートのエレクトロポレーションを実施した。RNP複合体の非存在下でモックエレクトロポレーションも実施した。エレクトロポレーション後、細胞を1ml培地に播種して一晩回復させた。
方法:
ヒトCD34+細胞培養。ヒト骨髄CD34+細胞をAllCells(カタログ番号:ABM017F)またはLonza(カタログ番号:2M−101C)のいずれかから購入し、50ng/mLのトロンボポエチン(Tpo、Peprotech;カタログ番号300−18)、50ng/mLのヒトFlt3リガンド(Flt−3L、Peprotech;カタログ番号300−19)、50ng/mLのヒト幹細胞因子(SCF、Peprotech;カタログ番号300−07)、ヒトインターロイキン−6(IL−6、Peprotech;カタログ番号200−06)、1%L−グルタミン;2%ペニシリン/ストレプトマイシン、および化合物4(0.75μM)を補足したStemSpan SFEM(StemCell Technologies;カタログ番号09650)を用いて2〜3日間増殖させた。2〜3日間増殖させた後、培養物をAllCellsから購入した出発細胞数と比べて2倍〜3倍およびLonzaからのと比べて1倍〜1.5倍に増殖させた。本明細書に記載されるとおりのCRISPR/Casシステムの導入前および導入後の両方を含め、全てのCD34+増殖ステップについてこれらの培養条件を用いた。
理論によって拘束されるものではないが、HSCのBCL11A赤血球系エンハンサーを標的化して遺伝子破壊すると、赤血球系細胞系統におけるBCL11Aの発現が選択的に下方制御され、γ−グロビン発現の抑制が解除されて、HbFタンパク質の含有量が高い赤血球細胞であるF−細胞の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
方法:
ヒトCD34+細胞培養。製造業者の説明書に従って免疫選択(Miltenyi)を用いて成人ドナーのG−CSF動員末梢血(AllCells)からヒトCD34+細胞を単離し、各50ng/mLのトロンボポイエチン(Tpo)、Flt3リガンド(Flt3L、Life Technologies、カタログ番号PHC9413)、ヒト幹細胞因子(SCF、Life Technologies、カタログ番号PHC2113)、およびヒトインターロイキン−6(IL−6、Life Technologies、カタログ番号PHC0063)、さらには1×抗生物質/抗真菌剤(Gibco、カタログ番号10378−016)および500nMの化合物4が追加されたStemSpan SFEM(StemCell Technologies、カタログ番号09650)を用いて3日間増殖させた。
理論によって拘束されるものではないが、BCL11A赤血球系エンハンサー領域の標的遺伝子破壊は、γ−グロビン発現の抑制を解除することにより、上昇したHbFタンパク質を含有する赤血球の産生を可能にするであろうと考えられる(胎児ヘモグロビンを発現する細胞、例えば、上昇したレベルの胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、本明細書では「F細胞」ということがある。実施形態では、1細胞当たり少なくとも6ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する場合、細胞はF細胞と見なされる)。上昇したHbFは、脱酸素条件下で赤血球の鎌状化を予防するため、βサラセミア患者およびSCD患者の両方に治療効果/治癒効果があるであろう。また、エキソビボ増殖を向上させて、送達される遺伝子改変HSCの用量を増加させるために、SCD患者のエキソビボゲノム編集HSCを用いた自己造血幹細胞移植(HSCT)と、幹細胞増殖促進技術、例えば、アリール炭化水素レセプター(AHR)阻害剤、例えば、国際公開第2010/059401号パンフレット(その内容は、その全体が参照により組み込まれる)に記載のもの、例えば化合物4とが組み合わされた。
BCL11aエンハンサーの+58領域を標的とするgRNAの包括的スクリーニングによる%編集率の結果に基づき、さらなる研究および最適化に8つのgRNA標的化ドメインを選択した。gRNA分子に対する修飾が%編集率、赤血球系分化、および胎児ヘモグロビン発現に及ぼす効果を試験するため、BCL11aエンハンサー領域の+58領域内にある部位を標的とする種々のバージョンの8つのgRNA分子を設計した。CR00309、CR00311、CR00312、CR00316、CR01125、CR01126、CR01127、およびCR01128の標的化ドメインを含む以下のバージョンのgRNAを作製した。
dgRNA(標的化ドメインの配列以外の全配列は実施例1に記載されるとおり):
1.非修飾crRNAおよび非修飾tracr(「非修飾」または「Unmod」)
2.非修飾crRNAおよび非修飾tracr、但し、指示される標的化ドメインの5’−18ntのみを含む(完全な20ntでない)(「18nt」)
3.ホスホロチオエート結合で修飾されたcrRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt、および非修飾tracr(「PS」)
4.crRNAの5’末端および3’末端の両方に追加的な逆位脱塩基残基、および非修飾tracr(「Invd」)
5.ホスホロチオエート結合および2’−Oメチル基で修飾されたcrRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt、および非修飾tracr(「OMePS」)
6.2’−フルオロ基で修飾されたcrRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt、および非修飾tracr(「F」)
7.ホスホロチオエート結合および2’−フルオロ基で修飾されたcrRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt、および非修飾tracr(「F−PS」)
1.非修飾sgRNA(「非修飾」または「Unmod」)
2.指示される標的化ドメインの5’−18ntのみからなる標的化ドメイン(完全な20ntでない)(「18nt」)
3.ホスホロチオエート結合で修飾されたsgRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt(「PS」)
4.sgRNAの5’末端および3’末端の両方に追加的な逆位脱塩基残基(「Invd」)
5.ホスホロチオエート結合および2’−Oメチル基で修飾されたsgRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt(「OMePS」)
6.2’−フルオロ基で修飾されたsgRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt(「F」)
7.ホスホロチオエート結合および2’−フルオロ基で修飾されたsgRNAの3個の3’ntおよび3個の5’nt(「F−PS」)
方法:
ヒトCD34+細胞培養。製造者の指示に従い免疫選択(Miltenyi)を用いて成人ドナー由来のG−CSF動員末梢血(AllCells)からヒトCD34+細胞を単離し、各50ng/mLのトロンボポエチン(Tpo)、Flt3リガンド(Flt−3L、Life Technologies、カタログ番号PHC9413)、ヒト幹細胞因子(SCF、Life Technologies、カタログ番号PHC2113)およびヒトインターロイキン−6(IL−6、Life Technologies、カタログ番号PHC0063)、ならびに1×抗生物質/抗真菌薬(Gibco、カタログ番号10378−016)および500nM化合物4を補足したStemSpan SFEM(StemCell Technologies;カタログ番号09650)を用いて4〜6日間増殖させた。この実施例全体を通じて(そのサブ実施例を含め)、プロトコルがその細胞を「増殖させた」と指示する場合、この培地を使用した。この培地は本実施例では(そのサブ実施例を含め)「幹細胞増殖培地」、または「増殖培地」とも称される。
理論によって拘束されるものではないが、HPFH領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いHbFタンパク質を含有する赤血球細胞(胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「F−細胞」と称されることもある)の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
方法:方法は、以下の点を除いて実施例4にあるとおりである。
Cas9およびガイドRNAリボ核タンパク質(RNP)複合体のアセンブリ、HSPCの調製、およびHSPCへのRNPのエレクトロポレーション。遠心によって収集したHSPCをP3初代細胞溶液(Lonza カタログ番号PBP3−00675)に2.5×106/mLの細胞密度で再懸濁した。RNPを20μLの細胞と上下にピペッティングすることにより混合し、室温で2分間インキュベートした。4D−Nucleofector(Lonza)でコードCM−137を用いてRNP/細胞混合物(20μL)をエレクトロポレートした。
理論によって拘束されるものではないが、HPFH領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いHbFタンパク質を含有する赤血球細胞(胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「F−細胞」と称されることもある)の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
方法:方法は、以下の点を除いて実施例4にあるとおりである。
理論によって拘束されるものではないが、HPFH領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いHbFタンパク質を含有する赤血球細胞(胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「F−細胞」と称されることもある)の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
方法:方法は、以下の点を除いて実施例4にあるとおりである。
理論によって拘束されるものではないが、HPFH領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いHbFタンパク質を含有する赤血球細胞(胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「F−細胞」と称されることもある)の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
方法:方法は、以下の点を除いてサブ実施例4.1にあるとおりである。
理論によって拘束されるものではないが、HPFHまたはBCL11A赤血球系エンハンサー領域を標的化して遺伝子破壊すると、γ−グロビン発現の抑制が解除されて、高いHbFタンパク質を含有する赤血球細胞(胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「F−細胞」と称されることもある)の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
方法:方法は、以下の点を除いて実施例4にあるとおりである。
理論によって拘束されるものではないが、HPFHまたはBCL11A赤血球系エンハンサー領域を標的化して遺伝子破壊すると、γ−グロビン発現の抑制が解除されて、高いHbFタンパク質を含有する赤血球細胞(胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「F−細胞」と称されることもある)の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
方法:方法は、以下の点を除いて実施例4にあるとおりである。
理論によって拘束されるものではないが、HPFH領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いHbFタンパク質を含有する赤血球細胞(胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「F−細胞」と称されることもある)の産生が可能になると考えられる。高いHbFは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびSCDの両方の患者に治療効果/治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したSCD患者由来のHSCによる自家造血幹細胞移植(HSCT)はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体(AHR)阻害剤、例えば国際公開第2010/059401号パンフレット(この内容は全体として参照により援用される)に記載されるとおりのもの、例えば化合物4と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾HSCの送達用量が増加した。
初代ヒトCD34+ HSPCに、HPFH領域内の異なる部位に対する2つの異なるgRNA分子を含有するRNPをエレクトロポレートした。各RNPに、上記に記載したとおりのdgRNA分子を使用した。簡潔に言えば、フランス型HPFH領域内の第1の部位を標的とするdgRNAを含むRNPと、フランス型HPFH領域内の第2の部位を標的とするdgRNAを含むRNPとを以下の比で組み合わせて、CD34+ HSPCにエレクトロポレートした:0.5×第1のdgRNA RNP+0.5×第2のdgRNA RNP;1.0×g2 dgRNA(「g2」=BCL11a遺伝子のコード配列を標的とする、CR000088の標的化ドメインを含む陽性対照);RNPなし(「対照」)。上記に記載されるプロトコルを用いて細胞を上記に記載したとおり培養し、赤血球に分化させた(図17を参照されたい)。胎児ヘモグロビン発現を評価した。結果は図27および表25に示す。理論によって拘束されるものではないが、2つの標的配列に対するgRNA分子を含むRNPを同時に導入すると、その領域内に含まれる任意の調節配列またはコード配列を含め、2つの切断部位間のDNA(例えば、2つの切断部位間にある全てまたはほとんどのDNA)の欠失(すなわち、切り出し)が起こることになると考えられる。これらの結果は、HPFH領域内の2つの別個の領域を標的とするRNPをエレクトロポレーションによってCD34+ HSPCに同時に送達して、赤血球に分化した編集済み細胞に胎児ヘモグロビン発現を誘導できたことを示している。
オリゴ挿入に基づくアッセイ(例えば、Tsai et al.,Nature Biotechnology.33,187−197;2015を参照されたい)を用いて、BCL11aエンハンサーを標的とするCas9によって切断される潜在的オフターゲットゲノム部位を決定した。BCL11aエンハンサーを標的とする合計28個のガイド(指示される標的化ドメインを含むデュアルガイドRNA)およびHPFH領域を標的とする10個のgRNAを上記に記載されるCas9発現HEK293細胞でスクリーニングした。結果は図33(BCL11aエンハンサー)および図49(HPFH)にプロットする。BCL11aエンハンサーを標的とするgRNAに関して、このアッセイで一部のガイドの潜在的オフターゲット部位が同定されたが、しかしながら標的ディープシーケンシングを用いて、それらの潜在的な部位が本当にCas9によって切断されるオフターゲット部位かどうかを決定した。潜在的オフターゲット部位に隣接するプライマーを用いて単離ゲノムDNAを増幅し、アンプリコンをシーケンシングした。潜在的オフターゲット部位がCas9によって切断された場合、その部位にインデルが検出されるはずである。ガイドRNAの少なくとも3つ:CR000311、CR000312、CR001128について、これらの潜在的オフターゲット部位に関する後続研究からは、潜在的オフターゲット部位にインデルは検出されなかった。BCL11aエンハンサーを標的とするgRNAに関しては、少なくともgRNA、CR001137、CR001212、およびCR001221について、このアッセイでいかなる潜在的オフターゲット部位も同定されなかった。標的ディープシーケンシングを実施して、他のgRNA分子について同定された潜在的オフターゲット部位が本当にCas9によって切断されるオフターゲット部位かどうかを決定することになる。
CD34+造血幹細胞における評価
本発明者らは、初代ヒト造血幹細胞(HSC)におけるβ−2−ミクログロブリン(B2M)遺伝子のノックアウト効率を計測することにより、14個の精製化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SPyCas9)タンパク質を評価した。これらのタンパク質は3群に分けた:第1群は、選択性が向上したSPyCas9変異体からなった(Slaymaker et al.2015,Science 351:84(e1.0、e1.1およびK855A);Kleinstiver et al.2016,Nature 529:490(HF))。第2群は、数および/または位置が異なるSV40核移行シグナル(NLS)および切断可能なTEV部位を伴うまたは伴わない6×ヒスチジン(His6)または8×ヒスチジン(His8)タグ(それぞれ配列番号2969および2970)を含む野生型SPyCas9、および2つのシステイン置換(C80L、C574E)(構造研究用にCas9を安定化させることが報告されている(Nishimasu et al.2014,Cell 156:935))を有するSPyCas9タンパク質からなった。第3群は、異なるプロセスによって作製した同じ組換えSPyCas9からなった(図60)。B2MノックアウトはFACSおよび次世代シーケンシング(NGS)によって決定した。
材料
1.Neonエレクトロポレーション機器(Invitrogen、MPK5000)
2.Neonエレクトロポレーションキット(Invitrogen、MPK1025)
3.crRNA(GGCCACGGAGCGAGACAUCU(配列番号2811)の標的化ドメイン配列、B2M遺伝子中の配列と相補的、配列番号6607と融合)
4.tracrRNA(配列番号6660)
5.Cas9保存緩衝液:20mMトリス−Cl、pH8.0、200mM KCl、10mM MgCl2
6.骨髄由来CD34+ HSC(Lonza、2M−101C)
7.細胞培養培地(Stemcell Technologies、StemSpam SFEM II、StemSpam CC−100含有)
8.FACS洗浄緩衝液:PBS中2%FCS
9.FACSブロック緩衝液:PBS1mL当たり、0.5ugマウスIgG、150ug Fcブロック、20μL FCSを添加
10.Chelex懸濁液:H2O中10%Chelex 100(bioRad、カタログ番号142−1253)
11.抗B2M抗体:Biolegend、カタログ番号316304
Lonzaの推奨に従い細胞を解凍して成長させ、2〜3日おきに培地を加える。5日目、細胞を200×gで15分間ペレット化し、PBSで1回洗浄し、細胞をNEONキットのT−緩衝液に2×104/μLで再懸濁し、氷上に置く。Cas9タンパク質をCas9保存緩衝液で5mg/mlに希釈する。crRNAおよびtracrRNAをH2Oで100μMに再構成する。各0.8μLのCAS9タンパク質、crRNAおよびtracrRNAを0.6μLのCas9保存緩衝液と混合することによりリボ核タンパク質(RNP)複合体を作製し、室温で10分間インキュベートする。7μLのHSCをRNP複合体と2分間混合し、10μL全てをNeonピペットティップに移し、1700v、20msおよび1パルスでエレクトロポレートする。エレクトロポレーション後直ちに、37℃、5%CO2で予めキャリブレーションした1ml培地が入った24ウェルプレートのウェルに細胞を移す。エレクトロポレーション後72時間でFACSおよびNGS分析のため細胞を回収する。
実験およびドナーのばらつきを正規化するため、本発明者らは、2つのSV40 NLSが野生型SPyCas9に隣接し、かつタンパク質のC末端のHis6タグ(配列番号2969)を含む元の設計であるiProt105026に対する各タンパク質の相対活性をグラフ化した(図34)。統計的分析は、参照Cas9タンパク質iProt105026と比較して、iProt106331、iProt106518、iProt106520およびiProt106521のHSCにおけるB2Mのノックアウトに有意な差はないが、試験した他の変異体(PID426303、iProt106519、iProt106522、iProt106545、iProt106658、iProt106745、iProt106746、iProt106747、iProt106884)はHSCにおけるB2Mのノックアウトに参照iProt105026と比べて大きい有意差があることを示している。本発明者らは、His6タグ(配列番号2969)をC末端からN末端に動かしても(iProt106520)、タンパク質の活性に影響が及ばないことを見出した(図34)。NLSがタンパク質のC末端に配置された場合に限り、活性を維持するのに1つのNLSで十分であった(iProt106521対iProt106522、図34)。プロセス1から精製したタンパク質は、一貫してプロセス2および3よりも高いノックアウト効率を有した(iProt106331対iProt106545およびPID426303、図34)。一般に、既報告の向上した選択性を有するSPyCas9変異体は、野生型SPyCas9ほど活性でなかった(iProt106745、iProt106746およびiProt106747、図34)。興味深いことに、iProt106884は標的化部位を切断しなかった。これは、この変異体が哺乳動物細胞における論理的な標的化部位の最大20%を切断できなかったというKleinstiver et alによる報告と一致する(Kleinstiver et al.2016,Nature 529:490)。最後に、2つのシステイン置換を含むCas9変異体(iProt106518)は高レベルの酵素活性を維持した(図34)。
遺伝子編集前の細胞の増殖
ヒト骨髄CD34+細胞をAllCells(カタログ番号:ABM017F)またはLonza(カタログ番号:2M−101C)のいずれかから購入し、50ng/mLのトロンボポエチン(Tpo、Peprotech;カタログ番号300−18)、50ng/mLのヒトFlt3リガンド(Flt−3L、Peprotech;カタログ番号300−19)、50ng/mLのヒト幹細胞因子(SCF、Peprotech;カタログ番号300−07)、ヒトインターロイキン−6(IL−6、Peprotech;カタログ番号200−06)、1%L−グルタミン;2%ペニシリン/ストレプトマイシン、および化合物4(0.75μM)を補足したStemSpan SFEM(StemCell Technologies;カタログ番号09650)を使用して2〜3日間増殖させた。
Cas9−ガイドRNAリボ核タンパク質複合体(RNP)はエレクトロポレーションの直前に調製した。デュアルガイドRNAを用いるRNPの形成については、初めに各3μgのcrRNA(2.24μL中)およびtracrRNA(1.25μL中)を別個のチューブにおいて95℃で2分間変性させて、次に室温に冷却した。Cas9タンパク質の調製のため、7.3μgのCas9タンパク質(1.21μL中)を0.52μLの5×CCE緩衝液(20mM HEPES、100mM KCL、5mM MgCL2、5%グリセロールおよび新たに添加した1mM DTT)と混合した。初めにTracrRNAをCas9調製物と混合し、37℃で5分間インキュベートした。次にCrRNAをTracrRNA/CAS9複合体に加え、37℃で5分間インキュベートした。200×gで15分間遠心することによりHSPCを収集し、Neonエレクトロポレーションキット(Invitrogen;カタログ番号:MPK1096)に付属するT緩衝液に2×107/mLの細胞密度で再懸濁した。RNPを12μLの細胞と上下に3回穏やかにピペッティングすることによって混合した。シングルガイドRNA(sgRNA)およびCas9複合体の調製には、2.25μg sgRNA(1.5μL中)を2.25μg Cas9タンパク質(3μL中)と混合し、室温で5分間インキュベートした。次にsgRNA/Cas9複合体を10.5μLの2×107/mL細胞と上下に数回穏やかにピペッティングすることにより混合し、室温で2分間インキュベートした。RNP/細胞混合物(10μL)をNeonエレクトロポレーションプローブに移した。Neonトランスフェクションシステム(Invitrogen;MPK5000S)で1700ボルト/20ミリ秒および1パルスを用いてエレクトロポレーションを実施した。
エレクトロポレーション後、上記に記載したとおりの成長因子、サイトカインおよび化合物4を補足した0.5mLの予め温めたStemSpan SFEM培地に細胞を移し、37℃で3日間培養した。エレクトロポレーション前3日間およびエレクトロポレーション後7日間の合計10日間の細胞増殖の後、総細胞数は出発細胞数と比べて2〜7倍増加した(図35)。
エレクトロポレーションの48時間後、編集済みおよび未編集HSPCからゲノムDNAを調製した。10mMトリス−HCL、pH8.0;0.05%SDSおよび25μg/mLの新たに添加したプロテアーゼK中に細胞を溶解させ、37℃で1時間インキュベートした後、85℃で15分間さらにインキュベートしてプロテアーゼKを不活性化した。
HSPCの編集効率を決定するため、T7E1アッセイを実施した。Phusion Hot Start II High−Fidelityキット(Thermo Scientific;カタログ番号:F−549L)を以下のサイクル条件で用いてPCRを実施した:98℃で30秒;98℃で5秒、68℃で20分、72℃で30秒を35サイクル;72℃で5分。以下のプライマーを使用した:フォワードプライマー:5’−AGCTCCAAACTCTCAAACCACAGGG−3’(配列番号2814)およびリバースプライマー:5’−TACAATTTTGGGAGTCCACACGGCA−3’(配列番号2815)。以下の条件を用いてPCR産物を変性させてリアニーリングした:95℃で5分、−2℃/sで95〜85℃、−0.1℃/sで85〜25℃、4℃で保持。アニーリング後、10μLの上記のPCR産物に1μLのミスマッチ高感受性T7 E1ヌクレアーゼ(NEB、カタログ番号M0302L)を加え、37℃で15分間さらにインキュベートしてヘテロ二重鎖を消化し、得られたDNA断片をアガロースゲル(2%)電気泳動によって分析した。編集効率はImageJソフトウェア(http://rsb.info.nih.gov/ij/)を用いて定量化した。
編集効率ならびに挿入および欠失(インデル)のパターンをより正確に決定するため、PCR産物を次世代シーケンシング(NGS)に供した。Titanium Taq PCRキット(Clontech Laboratories;カタログ番号:639210)を以下のサイクル条件で使用してPCRをデュプリケートで実施した:98℃で5分;95℃で15秒、68℃で15秒、72℃で1分を30サイクル;72℃で7分。以下のプライマーを使用した:フォワードプライマー:5’−AGCTCCAAACTCTCAAACCACAGGG−3’(配列番号2816)およびリバースプライマー:5’−TACAATTTTGGGAGTCCACACGGCA−3’(配列番号2817)。PCR産物を2%アガロースゲル電気泳動によって分析し、ディープシーケンシングにかけた。
細胞をフローサイトメトリーに供して幹細胞・前駆細胞(HSPC)サブ集団における編集効率を特徴付けた。ゲノム編集前(培養下48時間)およびゲノム編集後(培養下10日;ゲノム編集後3日)における、CD34+細胞、CD34+CD90+細胞、CD34+CD90+CD45RA−細胞、およびCD34+CD90+CD45RA−CD49f+細胞を含むHSPCサブセットの頻度を細胞培養物のサンプリングアリコートから決定した(図36、図37、図38)。細胞を抗CD34(BD Biosciences、カタログ番号555824)、抗CD38(BD Biosciences、カタログ番号560677)、抗CD90(BD Biosciences、カタログ番号555596)、抗CD45RA(BD Biosciences、カタログ番号563963)、抗CD49f(BD Biosciences、カタログ番号562582)と共に、0.5%BSA、2mM EDTA pH7.4を補足したPBSを含有する改良FACS緩衝液中、暗所下4℃で30分間インキュベートした。細胞生存率は7AADによって決定した。細胞を改良FACS緩衝液で洗浄し、Fortessa(BD Biosciences)で多色FACS分析を実施した。フローサイトメトリー結果はFlowjoソフトウェアを使用して分析した。化合物4(単独)の存在下で成長させたゲノム編集済み細胞は、CD34+、CD34+CD90+、CD34+CD90+CD45RA−、およびCD34+CD90+CD45RA−CD49f+サブセットを含め、評価した全てのHSPCサブセットについて検出可能なレベルを呈したことから、ゲノム編集後に化合物4(単独)の存在下で細胞培養物中に長期HSC集団が存在し続けることが示される(図38)。
HSPC培養およびCRISPR/Cas9ゲノム編集
RNP作成および細胞操作方法は、以下を除いて実施例4にあるとおりである。ヒトCD34+細胞培養。ヒトCD34+細胞は、成人ドナー由来のG−CSF動員末梢血(AllCells、カタログ番号mPB025−Reg.E)から製造者の指示に従い免疫選択(Miltenyi)を用いて単離するか、または骨髄(Hemacare Corporation、カタログ番号BM34C−3)から誘導するかのいずれかであった。CD34+細胞を解凍し、RNP送達前に2日間または5日間増殖させた。RNP送達後、以下のとおり、細胞を増殖培地でさらに13日間培養するか、または赤血球系分化培地で7日または11日間培養した。培養0〜7日目の間、EDMには、1μMヒドロコルチゾン(Sigma H8672)、100ng/mLヒトSCF(Life Technologies、カタログ番号PHC2113)、および5ng/mLヒトIL−3(Peprotech #10779−598)をさらに補足した。培養7〜11日目の間、EDMには100ng/mLのヒトSCFのみを補足した。培養期間の終わりに、ゲノムDNA調製および分析用に細胞を回収した。
製造者の推奨に従いDNeasy血液および組織キット(Qiagen、カタログ番号69506)を使用してRNP処理済みおよび未処理HSPCからゲノムDNAを単離した。
BCL11+58領域gRNA、CR00309、CR00311、CR00312、CR00316、CR001125、CR001126、CR001127、およびCR001128、およびHPFH領域gRNA、CR001028、CR001030、CR001137、CR001221、CR003035、およびCR003085の潜在的オフターゲット遺伝子座を以下のとおり同定した。各gRNAについて、BFASTシーケンスアライナー(バージョン0.6.4f、Homer et al,PLoS One,2009,4(11),e7767,PMID:19907642)を使用して、最大5ヌクレオチドまでのミスマッチを許容する標準パラメータを用いて、20ヌクレオチドgRNAプロトスペーサー配列をヒトゲノム参照配列(build GRCh38)とアラインメントした。Cas9カノニカル5’−NGG−3’PAM配列に隣接して5’側にある部位のみを含むように同定された遺伝子座をフィルタリングした(すなわち5’−オフターゲット遺伝子座−PAM−3’)。BEDToolsスクリプト(バージョン2.11.2、Quinlan and Hall,Bioinformatics,2010 26(6):841−2,PMID:20110278)を用いて、5ヌクレオチドミスマッチを有する部位をRefSeq遺伝子アノテーションに対して、エクソンとしてアノテートされた遺伝子座のみを含むようにさらにフィルタリングした(Pruitt et al,Nucleic Acids Res.,2014 42(Database issue):D756−63,PMID:24259432)。BCL11+58領域およびHPFH領域gRNAについて同定された潜在的オフターゲット遺伝子座のカウントを、それぞれ表1および表2に示す。
Primer3(バージョン2.3.6、Untergasser et al,Nucleic Acids Res.,2012 40(15):e115,PMID:22730293)を使用して、アンプリコンの中心にgRNAプロトスペーサー配列が位置する約160〜300塩基対長のアンプリコンサイズ範囲を目標とするデフォルトパラメータを用いて、BCL11+58領域gRNA(CR00309、CR00311、CR00312、CR00316、CR001125、CR001126、CR001127、およびCR001128)およびHPFH領域gRNA(CR001028、CR001030、CR001137、CR001221、CR003035、およびCR003085)について同定された潜在的オフターゲット遺伝子座(およびオンターゲット遺伝子座)を標的とするPCRアンプリコンを設計した。gRNA CR001127については、PCRプライマーは0〜4ヌクレオチドミスマッチを含む部位のみを設計し、RefSeqエクソン内に5ヌクレオチドミスマッチを含む部位のプライマーは設計しなかった。得られたPCRプライマー対およびアンプリコン配列は、ヒトゲノム参照配列(build GRCh38)に対して配列をBLAST検索(バージョン2.2.19、Altschul et al,J Mol Biol.,1990,215(3):403−10,PMID:2231712)することによりユニークさを調べた。2つ以上のアンプリコン配列をもたらすプライマー対は破棄し、設計し直した。表3および表5は、それぞれBCL11+58領域およびHPFH領域gRNAについて設計した成功するPCRプライマー対のカウントを示す。
製造者の推奨を用いてQuant−iT PicoGreen dsDNAキット(Thermo Fisher、カタログ番号P7581)を使用して、RNP処理済み(gRNA当たり2レプリケート)、および未処理(gRNA当たり1レプリケート)のHSPC試料からのゲノムDNAを定量化した。各試料について、二連続PCR反応を用いて、個々のオフターゲット遺伝子座(およびオンターゲット遺伝子座)を標的とするIlluminaシーケンシングライブラリを作成した。最初のPCRでは、ユニバーサルなIlluminaシーケンシング適合配列をテール付加した標的特異的PCRプライマー(上記で設計した)を使用して標的遺伝子座を増幅した。2回目のPCRでは、シーケンシング時の多重化を可能にするサンプルバーコードを含め、追加的なIlluminaシーケンシング適合配列を最初のPCRアンプリコンに加えた。PCR1は10μLの最終容積で実施し、各反応には、3〜6ngのgDNA(約500〜1000細胞相当)、0.25μMの最終濃度のPCR1プライマー対(Integrated DNA Technologies)および1×最終濃度のQ5 Hot Start Master Mix(New England BioLabs、カタログ番号102500−140)が含まれた。PCR1左プライマーは、配列5’−TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG−3’(配列番号2819)で5’テールが付加され(すなわち5’−テール−標的特異的左プライマー−3’)、および右プライマーは、配列5’−GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG−3’(配列番号2820)で5’テールが付加された(すなわち5’−テール−標的特異的右プライマー−3’)。PCR1は、サーモサイクラーで以下のサイクル条件を用いて実施した:98℃で1分を1サイクル;98℃で10秒、63℃で20秒、および72℃で30秒を25サイクル;72℃で2分を1サイクル。次にヌクレアーゼフリー水(Ambion、カタログ番号AM9932)を使用してPCR1を100に対して1で希釈し、PCR2への入力として使用した。PCR2は10μLの最終容積で実施し、各反応には、2μLの希釈したPCR1産物、0.5μMの最終濃度のPCR2プライマー対(Integrated DNA Technologies)および1×最終濃度のQ5 Hot Start Master Mix(New England BioLabs、カタログ番号102500−140)が含まれた。使用したPCR2左プライマー配列は5’−AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNTCGTCGGCAGCGTC−3’(配列番号2821)であり、使用したPCR2右プライマー配列は5’−CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTCTCGTGGGCTCGG−3’(配列番号2822)であった(式中、NNNNNNNNは、標準Illuminaシーケンシングプロセスの一部としてサンプル多重化に使用した8ヌクレオチドバーコード配列を意味する)。PCR2は、サーモサイクラーで以下のサイクル条件を用いて実施した:72℃で3分を1サイクル;98℃で2分を1サイクル;98℃で10秒、63℃で30秒、および72℃で2分を15サイクル。ここで、実行可能となったIlluminaシーケンシングライブラリであるPCR2アンプリコンを、製造者の推奨に従いAgencourt AMPure XPビーズ(Beckman Coulter、カタログ番号A63882)を使用してクリーンアップした。次に、Power SYBRグリーンPCRマスターミックス(Life Technologies、カタログ番号4367660)およびIlluminaシーケンシングライブラリ末端に特異的なプライマー(フォワードプライマー配列5’−CAAGCAGAAGACGGCATACGA−3’(配列番号2823)およびリバースプライマー配列5’−AATGATACGGCGACCACCGAGA−3’(配列番号2824))を使用した標準的なqPCR定量化方法を用いて、クリーンなIlluminaシーケンシングライブラリを定量化した。次にIlluminaシーケンシングライブラリを等モルでプールし、製造者の推奨に従いMiSeq試薬キットv3(Illumina、カタログ番号MS−102−3003)を使用してMiSeq機器(Illumina、カタログ番号SY−410−1003)で300塩基ペアエンドリードによってIlluminaシーケンシングに供した。少なくとも1つの処理済みレプリケートについて各遺伝子座につき最低1000倍の配列カバレッジが生成された。処理済みおよび未処理の試料のPCR、クリーンアップ、プールおよびシーケンシングは別個に実施して、処理済み試料と未処理試料との間のクロスコンタミネーションまたはそれから生成されるPCRアンプリコンのいかなる可能性も回避した。
デフォルトパラメータを用いて、Illumina MiSeq分析ソフトウェア(MiSeqレポーター、バージョン2.6.2、Illumina)を使用してアンプリコン特異的FASTQシーケンシングデータファイルを作成した(Cock et al,Nucleic Acids Res.2010,38(6):1767−71,PMID:20015970)。次に、標準Perlスクリプトラッパーを用いて一体に結合した一連のパブリックドメインソフトウェアパッケージからなる内部開発の変異体分析パイプラインでFASTQファイルを処理した。使用したワークフローは5段階に分けられた。
BCL11+58領域およびHPFH領域gRNAのオンターゲット部位は、処理済みサンプルにおいて意図したCas9切断部位でロバストな編集を示し、インデル頻度は全てのgRNAについて88%より高かった。表3および表5は、少なくとも1つのバイオロジカルレプリケートで特徴付けられたオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はPCRプライマー設計またはPCR増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。
gRNA CR00309:gRNA CR00309のオンターゲット部位は意図したCas9切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約92%であった。表31は、特徴付けられたオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はPCRプライマー設計またはPCR増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、両方の処理済みレプリケートにおいて、提案されるCas9切断部位の周囲100bpウィンドウに4つのオフターゲット部位が同定された。部位1は約18%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて
を有し、およびエクソン1から約2.3kb離れた、11番染色体上の塩基対位置22,195,800〜22,195,819におけるアノクタミン5遺伝子(ANO5)のイントロン1に位置する。部位2は約18%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて
を有し、および12番染色体上の塩基対位置3,311,901〜3,311,926における遺伝子間領域に位置する。部位3は約80%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて
を有し、および1番染色体上の塩基対位置236,065,415〜236,065,434におけるGenBank(Clark et al.,Nucleic Acids Res.2016 Jan 4;44(Database issue):D67−D72,PMID:26590407)転写物(BC012501 RefSeqでアノテーションなし)に位置する。部位4は約2%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて
を有し、および1番染色体上の塩基対位置33,412,659〜33,412,678におけるポリホメオティック2タンパク質(RefSeqでアノテーションなし)と呼ばれるGenBankアノテーション付き転写物のイントロン1に位置する。
を有し、および最も近いGenBank転写物(RefSeqでアノテーションなし)から約9.5kb離れた、4番染色体上の塩基対位置35,881,815〜35,881,834における遺伝子間領域に位置する。第2の部位は約1.7%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて4つのミスマッチ
を有し、およびエクソン6から約2.7kb離れた、6番染色体上の塩基対位置16,519,907〜16,519,926におけるアタキシン1遺伝子(ATXN1)のイントロン6に位置する。
GUIDE−seq(Tsai et al,Nat Biotechnol.2015,33(2):187−97,PMID:25513782)によって同定された潜在的オフターゲットヒットをRNP処理済みおよび未処理HSPCにおいて上記にインシリコで定義された部位に関して記載した標的シーケンシング方法を用いて特徴付けた。gRNA CR00312、CR00316、CR001125、CR001126、CR001127およびCR001128について、GUIDE−seq潜在的ヒットが同定された。gRNA CR00311およびCR001128について、潜在的ヒットは同定されなかった。標的シーケンシングを用いて潜在的ヒットをHSPCで調べたとき、gRNA CR00312、CR001125およびCR001127について処理済みHSPCでは潜在的ヒットのいずれもバリデートされなかった。gRNA CR001126について1つの潜在的ヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法(in silico directed method)によってATXN1のイントロン6に同定されたのと同じ部位(6番染色体:16,519,907〜16,519,926塩基対)であった。gRNA CR00309およびCR00316の潜在的ヒットのバリデーションはなおも進行中である。
gRNA CR001028:gRNA CR0001028のオンターゲット部位は意図したCas9切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約91%であった。表32は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はPCRプライマー設計またはPCR増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、これまでに、両方の処理済みレプリケートにおいて、提案されるCas9切断部位の周囲100bpウィンドウに2つのオフターゲット部位が同定された。部位1は約2.8%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて2つのミスマッチ
を有し、および4番染色体上の塩基対位置58,169,308〜58,169,327に位置する非コードRNA(LF330410、RefSeqでアノテーションなし)のイントロン2に位置する。部位2は約3.5%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて3つのミスマッチ
を有し、およびエクソン2から約1.3kbの、6番染色体上の塩基対位置26,366,733〜26,366,752に位置するブチロフィリンサブファミリー3メンバーA2遺伝子(BTN3A2)のイントロン1に位置する。
を有し、およびX染色体上の塩基対位置24,503,476〜24,503,495に位置するピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ3遺伝子(PDK3)のエクソン4に位置する。
を有し、および2番染色体上の塩基対位置66,281,781〜66,281,800における遺伝子間領域に位置し、最も近い転写物(JD432564、RefSeqでアノテーションなし)から約7.1kbである。部位2は約2.5%の平均インデル頻度を有し、オンターゲットgRNAプロトスペーサー配列と比べて3つのミスマッチ
を有し、および10番染色体上の塩基対位置42,997,289〜42,997,308における遺伝子間領域に位置し、マイクロRNA5100(MIR5100)から約0.3kbである。
を有し、および2番染色体上の塩基対位置171,872,630〜171,872,649に位置する溶質輸送体ファミリー25メンバー12遺伝子(SLC25A12)のイントロン2に位置し、エクソン3から約3.8kbである。
GUIDE−seq(Tsai et al,Nat Biotechnol.2015,33(2):187−97,PMID:25513782)を用いて同定された潜在的オフターゲットヒットをRNP処理済みおよび未処理のHSPCにおいてインシリコ部位に関して記載したのと同じ方法を用いて調べた。gRNA CR001028、CR001030、CR003035およびCR003085についてGUIDE−seq潜在的オフターゲットヒットが(現在までのところ)同定された。gRNA CR001137およびCR001221については現在までにヒットは同定されていない。HSPCにおいてgRNA CR001028について1つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によって4番染色体上の塩基対位置58,169,308〜58,169,327に同定されたのと同じ部位であった。HSPCにおいてgRNA CR001030について1つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によってPDK3遺伝子のエクソン4に同定されたのと同じ部位であった。HSPCにおいてgRNA CR003035について1つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によって2番染色体上の塩基対位置66,281,781〜66,281,800における遺伝子間領域に同定されたのと同じ部位であった。HSPCにおいてgRNA CR003085について1つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によって2番染色体上の塩基対位置171,872,630〜171,872,649に同定されたのと同じ部位であった。
gRNAオンターゲット部位を標的とするPCRアンプリコンを製造者の推奨に従いAgencourt AMPure XPビーズ(Beckman Coulter、カタログ番号A63882)を使用してクリーンアップした。製造者の推奨を用いてQuant−iT PicoGreen dsDNAキット(Thermo Fisher、カタログ番号P7581)を使用して試料を定量化した。製造者の推奨に従いNextera DNAライブラリ調製キット(Illumina、カタログ番号 FC−121−1031)を使用してアンプリコンをIlluminaシーケンシングライブラリに転換した。得られたシーケンシングライブラリをAMPureビーズでクリーンアップし、qPCRで定量化し、プールし、およびオフターゲット分析の節に記載されるとおり、Illumina MiSeq機器で150塩基(Illumina、カタログ番号MS−102−2002)または250塩基(Illumina、カタログ番号MS−102−2003)のペアエンドリードを用いてシーケンシングした。各ライブラリにつき最低1000倍のシーケンシングカバレッジが生じ、一連のインハウススクリプトを用いて変異体をコールした。簡単に言えば、ストリングベースの配列検索を用いてgRNA配列の中央にある80〜100塩基対ウィンドウにわたるシーケンシングリードを同定し、アンプリコン配列と比較し、配列の違いでビニングして、変異体頻度を計算した。加えて、Illumina MiSeqレポーターソフトウェア(Illuminaバージョン2.6.1)を使用してシーケンシングリードをアンプリコン配列とアラインメントし、得られたリードアラインメントをIntegrative Genome Viewer(IGVバージョン2.3、Robinson et al,Nat Biotechnol.2011,9(1):24−6,PMID:21221095)を用いて調べた。
RNP希釈アッセイによる遺伝子編集に最適なRNP濃度の決定
Cas9(iProt:106331)およびガイドリボヌクレオチド複合体(RNP)濃縮物の段階希釈液を用いて遺伝子編集を実施した(表33)。使用した様々なgRNA、そのフォーマット、およびこのアッセイで適用した修飾を表34に挙げる。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が参照によって援用されることが具体的かつ個別的に指示されたものとして参照により全体として本明細書に援用される。矛盾が生じる場合、本明細書における任意の定義を含め、本願が優先する。
当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、またはルーチンに過ぎない実験を用いて確認することができるであろう。本発明は具体的な態様を参照して開示されているが、本発明の他の態様および変形形態が当業者によって本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、かかる態様および均等な変形形態の全てを含むものと解釈されることが意図される。
Claims (230)
- tracrとcrRNAとを含むgRNA分子であって、前記crRNAは、BCL11A遺伝子(例えば、ヒトBCL11a遺伝子)、BCL11aエンハンサー(例えば、ヒトBCL11aエンハンサー)、またはHFPH領域(例えば、ヒトHPFH領域)の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む、gRNA分子。
- 前記標的配列は、前記BCL11A遺伝子のものであり、かつ前記標的化ドメインは、配列番号1〜配列番号85または配列番号400〜配列番号1231のいずれか1つを含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。
- 前記標的配列は、BCL11aエンハンサーのものであり、かつ前記標的化ドメインは、配列番号1232〜配列番号1499のいずれか1つを含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。
- 前記標的配列は、BCL11aエンハンサーのものであり、かつ前記標的化ドメインは、配列番号182〜配列番号277または配列番号334〜配列番号341のいずれか1つを含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、配列番号341、配列番号246、配列番号248、配列番号247、配列番号245、配列番号249、配列番号244、配列番号199、配列番号251、配列番号250、配列番号334、配列番号185、配列番号186、配列番号336、または配列番号337のいずれか1つを含む、例えばそれからなる、請求項4に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、配列番号247、配列番号248、配列番号335、配列番号336、配列番号337、または配列番号338のいずれか1つを含む、例えばそれからなる、請求項4に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、配列番号248または配列番号338のいずれか1つを含む、例えばそれからなる、請求項4に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、配列番号248を含む、例えばそれからなる、請求項4に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、配列番号338を含む、例えばそれからなる、請求項4に記載のgRNA分子。
- 前記標的配列は、BCL11aエンハンサーのものであり、かつ標的化ドメインは、配列番号278〜配列番号333のいずれか1つを含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、配列番号318、配列番号312、配列番号313、配列番号294、配列番号310、配列番号319、配列番号298、配列番号322、配列番号311、配列番号315、配列番号290、配列番号317、配列番号309、配列番号289、または配列番号281のいずれか1つを含む、例えばそれからなる、請求項10に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、配列番号318を含む、例えばそれからなる、請求項10に記載のgRNA分子。
- 前記標的配列は、BCL11aエンハンサーのものであり、かつ前記標的化ドメインは、配列番号1596〜配列番号1691のいずれか1つを含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、配列番号1683、配列番号1638、配列番号1647、配列番号1609、配列番号1621、配列番号1617、配列番号1654、配列番号1631、配列番号1620、配列番号1637、配列番号1612、配列番号1656、配列番号1619、配列番号1675、配列番号1645、配列番号1598、配列番号1599、配列番号1663、配列番号1677、または配列番号1626のいずれか1つを含む、例えばそれからなる、請求項13に記載のgRNA分子。
- 前記標的配列は、HFPH領域(例えば、フランス型HPFH領域)のものであり、かつ前記標的化ドメインは、配列番号86〜配列番号181、配列番号1500〜配列番号1595、または配列番号1692〜配列番号1761のいずれか1つを含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、配列番号100、配列番号165、配列番号113、配列番号99、配列番号112、配列番号98、配列番号1580、配列番号106、配列番号1503、配列番号1589、配列番号160、配列番号1537、配列番号159、配列番号101、配列番号162、配列番号104、配列番号138、配列番号1536、配列番号1539、配列番号1585のいずれか1つを含む、例えばそれからなる、請求項15に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、配列番号98、配列番号100、配列番号1505、配列番号1589、配列番号1700、または配列番号1750のいずれか1つを含む、例えばそれからなる、請求項15に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、配列番号100、配列番号165、または配列番号113のいずれか1つを含む、例えばそれからなる、請求項15に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか1つの17、18、19、20、21、22、23、または24個の連続する核酸を含む、例えばそれからなる、請求項2〜18のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか1つの17、18、19、20、21、22、23、または24個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の3’末端に配置された17、18、19、20、21、22、23、または24個の連続する核酸である、請求項16に記載のgRNA分子。
- 前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか1つの17、18、19、20、21、22、23、または24個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の5’末端に配置された17、18、19、20、21、22、23、または24個の連続する核酸である、請求項16に記載のgRNA分子。
- 前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか1つの17、18、19、20、21、22、23、または24個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の5’核酸または3’核酸のいずれも含まない、請求項16に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインは、前記記載される標的化ドメイン配列からなる、請求項2〜22のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記crRNAの一部分と前記tracrの一部分とは、ハイブリダイズして、配列番号6584または6585を含むフラッグポールを形成する、請求項1〜23のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記フラッグポールは、前記フラッグポールの前記crRNA部分の3’側に位置する第1のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第1のフラッグポール伸長部は、配列番号6586を含む、請求項24に記載のgRNA分子。
- 前記フラッグポールは、前記フラッグポールの前記crRNA部分の3’側に位置する第2のフラッグポール伸長部および存在する場合には前記第1のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第2のフラッグポール伸長部は、配列番号6587を含む、請求項24または25に記載のgRNA分子。
- 前記tracrは、配列番号6660または配列番号6661を含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記tracrは、配列番号7812を含み、任意選択で3’末端に追加の1、2、3、4、5、6、または7個のウラシル(U)ヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記crRNAは、5’から3’に、[標的化ドメイン]−:
a)配列番号6584;
b)配列番号6585;
c)配列番号6605;
d)配列番号6606;
e)配列番号6607;
f)配列番号6608;または
g)配列番号7806
を含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載のgRNA分子。 - 前記tracrは、5’から3’に、
a)配列番号6589;
b)配列番号6590;
c)配列番号6609;
d)配列番号6610;
e)配列番号6660;
f)配列番号6661;
g)配列番号7812;
h)配列番号7807;
i)(配列番号7808;
j)配列番号7809;
k)3’末端に少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のウラシル(U)ヌクレオチド、例えば1、2、3、4、5、6、または7個のウラシル(U)ヌクレオチドをさらに含む前記a)〜j)のいずれか;
l)3’末端に少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のアデニン(A)ヌクレオチド、例えば1、2、3、4、5、6、または7個のアデニン(A)ヌクレオチドをさらに含む前記a)〜k)のいずれか;または
m)5’末端に(例えば、5’側端に)少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のアデニン(A)ヌクレオチド、例えば1、2、3、4、5、6、または7個のアデニン(A)ヌクレオチドをさらに含む前記a)〜l)のいずれか
を含む、請求項1〜23または29のいずれか一項に記載のgRNA分子。 - 前記標的化ドメインと前記tracrとは、別個の核酸分子に配置され、前記標的化ドメインを含む前記核酸分子は配列番号6607を含み、配列番号6607は任意選択で前記標的化ドメインのすぐ3’側に配置され、および前記tracrを含む前記核酸分子は、配列番号6660を含む、例えばそれからなる、請求項1〜23のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記フラッグポールの前記crRNA部分は、配列番号6607または配列番号6608を含む、請求項27または28に記載のgRNA分子。
- 前記tracrは、配列番号6589または6590と、任意選択で、第1のフラッグポール伸長部が存在する場合、配列番号6589または6590の5’側に配置された第1のtracr伸長部とを含み、前記第1のtracr伸長部は、配列番号6591を含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインと前記tracrとは、別個の核酸分子に配置される、請求項1〜33のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインと前記tracrとは、単一の核酸分子に配置され、前記tracrは、前記標的化ドメインの3’側に配置される、請求項1〜33のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記標的化ドメインの3’側かつ前記tracrの5’側に配置されたループをさらに含む、請求項35に記載のgRNA分子。
- 前記ループは、配列番号6588を含む、請求項36に記載のgRNA分子。
- 5’から3’に、[標的化ドメイン]−:
(a)配列番号6601;
(b)配列番号6602;
(c)配列番号6603;
(d)配列番号6604;
(e)配列番号7811;または
(f)3’末端に1、2、3、4、5、6または7個のウラシル(U)ヌクレオチドをさらに含む前記(a)〜(e)のいずれか
を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載のgRNA分子。 - 前記標的化ドメインと前記tracrとは、単一の核酸分子に配置され、前記核酸分子は、前記標的化ドメインと配列番号7811とを含み、例えばそれからなり、配列番号7811は任意選択で前記標的化ドメインのすぐ3’側に配置される、請求項1〜40のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記gRNA分子を含む前記核酸分子の1つまたは任意選択で2つ以上は、
a)前記1つまたは複数の核酸分子の3’末端における1つ以上、例えば3つのホスホロチオエート修飾;
b)前記1つまたは複数の核酸分子の5’末端における1つ以上、例えば3つのホスホロチオエート修飾;
c)前記1つまたは複数の核酸分子の前記3’末端における1つ以上、例えば3つの2’−O−メチル修飾;
d)前記1つまたは複数の核酸分子の前記5’末端における1つ以上、例えば3つの2’−O−メチル修飾;
e)前記1つまたは複数の核酸分子の末端から4番目、末端から3番目、および末端から2番目の3’残基の各々における2’O−メチル修飾;
f)前記1つまたは複数の核酸分子の末端から4番目、末端から3番目、および末端から2番目の5’残基の各々における2’O−メチル修飾;または
f)これらの任意の組み合わせ
を含む、請求項1〜39のいずれか一項に記載のgRNA分子。 - 配列:
(a)配列番号342;
(b)配列番号343;または
(c)配列番号1762
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - (a)配列番号344を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;
(b)配列番号344を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr;
(c)配列番号345を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;または
(d)配列番号345を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - 配列:
(a)配列番号347;
(b)配列番号348;または
(c)配列番号1763
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - (a)配列番号349を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;
(b)配列番号349を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr;
(c)配列番号350を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;または
(d)配列番号350を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - 配列:
(a)配列番号351;
(b)配列番号352;または
(c)配列番号1764
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - (a)配列番号353を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;
(b)配列番号353を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr;
(c)配列番号354を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;または
(d)配列番号354を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - 配列:
(a)配列番号355;
(b)配列番号356;または
(c)配列番号1765
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - (a)配列番号357を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;
(b)配列番号357を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr;
(c)配列番号358を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;または
(d)配列番号358を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - 配列:
(a)配列番号359;
(b)配列番号360;または
(c)配列番号1766
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - (a)配列番号361を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;
(b)配列番号361を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr;
(c)配列番号362を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;または
(d)配列番号362を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - 配列:
(a)配列番号363;
(b)配列番号364;または
(c)配列番号1767
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - (a)配列番号365を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;
(b)配列番号365を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr;
(c)配列番号366を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;または
(d)配列番号366を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - 配列:
(a)配列番号367;
(b)配列番号368;または
(c)配列番号1768
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - (a)配列番号369を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;
(b)配列番号369を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr;
(c)配列番号370を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;または
(d)配列番号370を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - 配列:
(a)配列番号371;
(b)配列番号372;または
(c)配列番号1769
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - (a)配列番号373を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;
(b)配列番号373を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr;
(c)配列番号374を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;または
(d)配列番号374を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - 配列:
(a)配列番号375;
(b)配列番号376;または
(c)配列番号1770
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - (a)配列番号377を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;
(b)配列番号377を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr;
(c)配列番号378を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;または
(d)配列番号378を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - 配列:
(a)配列番号379;
(b)配列番号380;または
(c)配列番号1771
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - (a)配列番号381を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;
(b)配列番号381を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr;
(c)配列番号382を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;または
(d)配列番号382を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - 配列:
(a)配列番号383;
(b)配列番号384;または
(c)配列番号1772
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - (a)配列番号385を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;
(b)配列番号385を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr;
(c)配列番号386を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;または
(d)配列番号386を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - 配列:
(a)配列番号387;
(b)配列番号388;または
(c)配列番号1773
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - (a)配列番号389を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;
(b)配列番号389を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr;
(c)配列番号390を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;または
(d)配列番号390を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - 配列:
(a)配列番号391;
(b)配列番号392;または
(c)配列番号1774
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - (a)配列番号393を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;
(b)配列番号393を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr;
(c)配列番号394を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;または
(d)配列番号394を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - 配列:
(a)配列番号395;
(b)配列番号396;または
(c)配列番号1775
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - (a)配列番号397を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;
(b)配列番号397を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr;
(c)配列番号398を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号6660を含む、例えばそれからなるtracr;または
(d)配列番号398を含む、例えばそれからなるcrRNA、および配列番号346を含む、例えばそれからなるtracr
を含む、例えばそれからなる、請求項1に記載のgRNA分子。 - 前記gRNA分子を含むCRISPRシステム(例えば、本明細書に記載されるとおりのRNP)が細胞に導入されると、インデルは、前記gRNA分子の前記標的化ドメインと相補的な前記標的配列にまたはその近傍に形成される、請求項1〜68のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記インデルは、GATA−1またはTAL−1結合部位のヌクレオチドを含まない、請求項69に記載のgRNA分子。
- 前記gRNA分子を含むCRISPRシステム(例えば、本明細書に記載されるとおりのRNP)が細胞の集団に導入されると、インデルは、前記集団の細胞の少なくとも約40%、例えば少なくとも約50%、例えば少なくとも約60%、例えば少なくとも約70%、例えば少なくとも約80%、例えば少なくとも約90%、例えば少なくとも約95%、例えば少なくとも約96%、例えば少なくとも約97%、例えば少なくとも約98%、例えば少なくとも約99%において、前記gRNA分子の前記標的化ドメインと相補的な前記標的配列にまたはその近傍に形成される、請求項1〜70のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記gRNA分子を含むCRISPRシステム(例えば、本明細書に記載されるとおりのRNP)が細胞の集団に導入されると、GATA−1またはTAL−1結合部位のヌクレオチドを含まないインデルは、前記集団の細胞の少なくとも約20%、例えば少なくとも約30%、例えば少なくとも約35%、例えば少なくとも約40%、例えば少なくとも約45%、例えば少なくとも約50%、例えば少なくとも約55%、例えば少なくとも約60%、例えば少なくとも約65%、例えば少なくとも約70%、例えば少なくとも約75%、例えば少なくとも約80%、例えば少なくとも約85%、例えば少なくとも約90%、例えば少なくとも約95%、例えば少なくとも約99%において、前記gRNA分子の前記標的化ドメインと相補的な前記標的配列にまたはその近傍に形成される、請求項1〜68のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記インデルは、前記集団の細胞の少なくとも約30%、例えば少なくとも約40%、例えば少なくとも約50%、例えば少なくとも約60%、例えば少なくとも約70%、例えば少なくとも約80%、例えば少なくとも約90%、例えば少なくとも約95%、例えば少なくとも約96%、例えば少なくとも約97%、例えば少なくとも約98%、例えば少なくとも約99%において、図25、表15、表26、表27または表37のいずれかに挙げられるインデルである、請求項71または72に記載のgRNA分子。
- 前記細胞の集団中において最も高頻度で検出される3つのインデルは、図25、表15、表26、表27または表37のいずれかに挙げられる任意のgRNA分子に関連するインデルを含む、請求項71〜73のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記インデルは、次世代シーケンシング(NGS)によって計測されるとおりである、請求項69〜74のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記gRNA分子を含むCRISPRシステム(例えば、本明細書に記載されるとおりのRNP)が細胞に導入されると、胎児ヘモグロビンの発現は、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において増加する、請求項1〜75のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 胎児ヘモグロビンの発現は、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において少なくとも約20%、例えば少なくとも約30%、例えば少なくとも約40%、例えば少なくとも約50%、例えば少なくとも約60%、例えば少なくとも約70%、例えば少なくとも約80%、例えば少なくとも約90%、例えば少なくとも約95%、例えば少なくとも約96%、例えば少なくとも約97%、例えば少なくとも約98%、例えば少なくとも約99%増加する、請求項76に記載のgRNA分子。
- 前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫は、1細胞当たり少なくとも約6ピコグラム(例えば、少なくとも約7ピコグラム、少なくとも約8ピコグラム、少なくとも約9ピコグラム、少なくとも約10ピコグラム、または約8〜約9ピコグラム、または約9〜約10ピコグラム)の胎児ヘモグロビンを産生する、請求項76または77に記載のgRNA分子。
- 前記gRNA分子を含むCRISPRシステム(例えば、本明細書に記載されるとおりのRNP)が細胞に導入されると、オフターゲットインデル、例えば次世代シーケンシングおよび/またはヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、前記細胞において形成されない、請求項1〜78のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記gRNA分子を含むCRISPRシステム(例えば、本明細書に記載されるとおりのRNP)が細胞の集団に導入されると、オフターゲットインデル、例えば次世代シーケンシングおよび/またはヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、前記細胞の集団の細胞の約5%超、例えば約1%超、例えば約0.1%超、例えば約0.01%超において検出されない、請求項1〜78のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記細胞は、哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞であり、例えばヒト細胞である(または細胞の集団はそれを含む)、請求項69〜80のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記細胞は、HSPCである(または細胞の集団はそれを含む)、請求項81に記載のgRNA分子。
- 前記HSPCは、CD34+である、請求項82に記載のgRNA分子。
- 前記HSPCは、CD34+CD90+である、請求項83に記載のgRNA分子。
- 前記細胞は、前記細胞が投与される患者にとって自己由来である、請求項69〜84のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 前記細胞は、前記細胞が投与される患者にとって同種異系由来である、請求項69〜84のいずれか一項に記載のgRNA分子。
- 1)請求項1〜86のいずれか一項に記載の1つ以上のgRNA分子(第1のgRNA分子を含む)、およびCas9分子;
2)請求項1〜86のいずれか一項に記載の1つ以上のgRNA分子(第1のgRNA分子を含む)、およびCas9分子をコードする核酸;
3)請求項1〜86のいずれか一項に記載の1つ以上のgRNA分子(第1のgRNA分子を含む)をコードする核酸、およびCas9分子;
4)請求項1〜86のいずれか一項に記載の1つ以上のgRNA分子(第1のgRNA分子を含む)をコードする核酸、およびCas9分子をコードする核酸;または
5)前記1)〜4)のいずれか、および鋳型核酸;または
6)前記1)〜4)のいずれか、および鋳型核酸をコードする配列を含む核酸
を含む組成物。 - Cas9分子をさらに含む、請求項1〜86のいずれか一項に記載の第1のgRNA分子を含む組成物。
- 前記Cas9分子は、活性または不活性化膿レンサ球菌(s.pyogenes)Cas9である、請求項87または88に記載の組成物。
- 前記Cas9分子は、配列番号6611を含む、請求項87〜89のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記Cas9分子は、
(a)配列番号7821;
(b)配列番号7822;
(c)配列番号7823;
(d)配列番号7824;
(e)配列番号7825;
(f)配列番号7826;
(g)配列番号7827;
(h)配列番号7828;
(i)配列番号7829;
(j)配列番号7830;または
(k)配列番号7831
を含む、例えばそれからなる、請求項87〜89のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記第1のgRNA分子およびCas9分子は、リボ核タンパク質複合体(RNP)に存在する、請求項88〜91のいずれか一項に記載の組成物。
- 第2のgRNA分子;第2のgRNA分子および第3のgRNA分子;または第2のgRNA分子、任意選択で第3のgRNA分子、および任意選択で第4のgRNA分子をさらに含み、前記第2のgRNA分子、前記任意選択の第3のgRNA分子、および前記任意選択の第4のgRNA分子は、請求項1〜68のいずれか一項に記載のgRNA分子であり、前記組成物の各gRNA分子は、異なる標的配列と相補的である、請求項87〜92のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1のgRNA分子、前記第2のgRNA分子、前記任意選択の第3のgRNA分子、および前記任意選択の第4のgRNA分子の2つ以上は、同じ遺伝子または領域内の標的配列と相補的である、請求項93に記載の組成物。
- 前記第1のgRNA分子、前記第2のgRNA分子、前記任意選択の第3のgRNA分子、および前記任意選択の第4のgRNA分子は、20000ヌクレオチド以下、10000ヌクレオチド以下、6000以下、5000ヌクレオチド以下、4000以下、1000ヌクレオチド以下、500ヌクレオチド以下、400ヌクレオチド以下、300ヌクレオチド以下、200ヌクレオチド以下、100ヌクレオチド以下、90ヌクレオチド以下、80ヌクレオチド以下、70ヌクレオチド以下、60ヌクレオチド以下、50ヌクレオチド以下、40ヌクレオチド以下、30ヌクレオチド以下、20ヌクレオチド以下または10ヌクレオチド以下離れた標的配列と相補的である、請求項93または94に記載の組成物。
- 前記第1のgRNA分子、前記第2のgRNA分子、前記任意選択の第3のgRNA分子、および前記任意選択の第4のgRNA分子の2つ以上は、異なる遺伝子または領域内の標的配列と相補的である、請求項93に記載の組成物。
- 第1のgRNA分子と第2のgRNA分子とを含み、前記第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、
(a)請求項4に記載のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;
(b)請求項5に記載のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;
c)請求項6に記載のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(d)請求項7に記載のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(e)請求項41〜56のいずれか一項に記載のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である、請求項94または95に記載の組成物。 - 第1のgRNA分子と第2のgRNA分子とを含み、前記第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、
(a)請求項10に記載のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(b)請求項11に記載のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である、請求項94または95に記載の組成物。 - 第1のgRNA分子と第2のgRNA分子とを含み、前記第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、
(a)請求項13に記載のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(b)請求項14に記載のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である、請求項94または95に記載の組成物。 - 第1のgRNA分子と第2のgRNA分子とを含み、前記第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、
(a)請求項16に記載のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;
(b)請求項17に記載のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;
(c)請求項18に記載のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか;または
(d)請求項57〜68のいずれか一項に記載のgRNA分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である、請求項94〜96のいずれか一項に記載の組成物。 - 第1のgRNA分子と第2のgRNA分子とを含み、
(1)前記第1のgRNA分子は、(a)請求項4に記載のgRNA分子から選択されるか、(b)請求項5に記載のgRNA分子から選択されるか、(c)請求項6に記載のgRNA分子から選択されるか、(d)請求項7に記載のgRNA分子から選択されるか、または(e)請求項41〜56のいずれか一項に記載のgRNA分子から選択され;および
(2)前記第2のgRNA分子は、(a)請求項10に記載のgRNA分子から選択されるか、または(b)請求項11に記載のgRNA分子から選択される、請求項94〜96のいずれか一項に記載の組成物。 - 第1のgRNA分子と第2のgRNA分子とを含み、
(1)前記第1のgRNA分子は、(a)請求項4に記載のgRNA分子から選択されるか、(b)請求項5に記載のgRNA分子から選択されるか、(c)請求項6に記載のgRNA分子から選択されるか、(d)請求項7に記載のgRNA分子から選択されるか、または(e)請求項41〜56のいずれか一項に記載のgRNA分子から選択され;および
(2)前記第2のgRNA分子は、(a)請求項13に記載のgRNA分子から選択され、(b)請求項14に記載のgRNA分子から選択される、請求項94〜96のいずれか一項に記載の組成物。 - 第1のgRNA分子と第2のgRNA分子とを含み、
(1)前記第1のgRNA分子は、(a)請求項4に記載のgRNA分子から選択されるか、(b)請求項5に記載のgRNA分子から選択されるか、(c)請求項6に記載のgRNA分子から選択されるか、(d)請求項7に記載のgRNA分子から選択されるか、または(e)請求項41〜56のいずれか一項に記載のgRNA分子から選択され;および
(2)前記第2のgRNA分子は、(a)請求項16に記載のgRNA分子から選択されるか、(b)請求項17に記載のgRNA分子から選択されるか、(c)請求項18に記載のgRNA分子から選択されるか、または(d)請求項57〜68のいずれか一項に記載のgRNA分子から選択される、請求項94〜96のいずれか一項に記載の組成物。 - 第1のgRNA分子と第2のgRNA分子とを含み、
(1)前記第1のgRNA分子は、(a)請求項10に記載のgRNA分子から選択されるか、または(b)請求項11に記載のgRNA分子から選択され;および
(2)前記第2のgRNA分子は、(a)請求項13に記載のgRNA分子から選択され、(b)請求項14に記載のgRNA分子から選択される、請求項94〜96のいずれか一項に記載の組成物。 - 第1のgRNA分子と第2のgRNA分子とを含み、
(1)前記第1のgRNA分子は、(a)請求項10に記載のgRNA分子から選択されるか、または(b)請求項11に記載のgRNA分子から選択され;および
(2)前記第2のgRNA分子は、(a)請求項16に記載のgRNA分子から選択されるか、(b)請求項17に記載のgRNA分子から選択されるか、(c)請求項18に記載のgRNA分子から選択されるか、または(d)請求項57〜68のいずれか一項に記載のgRNA分子から選択される、請求項94〜96のいずれか一項に記載の組成物。 - 第1のgRNA分子と第2のgRNA分子とを含み、
(1)前記第1のgRNA分子は、(a)請求項13に記載のgRNA分子から選択され、(b)請求項14に記載のgRNA分子から選択され;および
(2)前記第2のgRNA分子は、(a)請求項16に記載のgRNA分子から選択されるか、(b)請求項17に記載のgRNA分子から選択されるか、(c)請求項18に記載のgRNA分子から選択されるか、または(d)請求項57〜68のいずれか一項に記載のgRNA分子から選択される、請求項94〜96のいずれか一項に記載の組成物。 - 第1のgRNA分子と第2のgRNA分子とを含み、
(1)前記第1のgRNA分子は、(a)請求項16に記載のgRNA分子から選択されるか、(b)請求項17に記載のgRNA分子から選択されるか、(c)請求項18に記載のgRNA分子から選択されるか、または(d)請求項57〜68のいずれか一項に記載のgRNA分子から選択され;および(2)前記第2のgRNA分子は、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むか、または
(1)前記第1のgRNA分子は、(a)請求項4に記載のgRNA分子から選択されるか、(b)請求項5に記載のgRNA分子から選択されるか、(c)請求項6に記載のgRNA分子から選択されるか、(d)請求項7に記載のgRNA分子から選択されるか、(e)請求項41〜56のいずれか一項に記載のgRNA分子から選択されるか、(f)請求項10に記載のgRNA分子から選択されるか、(g)請求項11に記載のgRNA分子から選択されるか、(h)請求項13に記載のgRNA分子から選択されるか、または(i)請求項14に記載のgRNA分子から選択され;および(2)前記第2のgRNA分子は、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む、請求項96に記載の組成物。 - 前記第1のgRNA分子および前記第2のgRNA分子は、請求項41〜68のいずれか一項に記載のgRNA分子から独立して選択される、請求項94〜96のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物の前記gRNA分子成分に関して、第1のgRNA分子と第2のgRNA分子とからなる、請求項87〜108のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記gRNA分子の各々は、本明細書に記載されるCas9分子、例えば請求項90または91に記載のCas9分子と共にリボ核タンパク質複合体(RNP)中にある、請求項87〜109のいずれか一項に記載の組成物。
- 鋳型核酸を含み、前記鋳型核酸は、前記第1のgRNA分子の前記標的配列にまたはその近傍にあるヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む、請求項87〜110のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記鋳型核酸は、
(a)ヒトβグロビン、例えば突然変異G16D、E22AおよびT87Qの1つ以上を含むヒトβグロビン、もしくはその断片;または
(b)ヒトγグロビン、もしくはその断片
をコードする核酸を含む、請求項111に記載の組成物。 - エレクトロポレーションに好適な媒体中に製剤化される、請求項87〜112のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記gRNA分子の各々は、本明細書に記載されるCas9分子と共にRNP中にあり、前記RNPの各々は、約10μM未満、例えば約3μM未満、例えば約1μM未満、例えば約0.5μM未満、例えば約0.3μM未満、例えば約0.1μM未満の濃度である、請求項87〜113のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1〜68のいずれか一項に記載の1つ以上のgRNA分子をコードする核酸配列。
- 前記核酸は、前記1つ以上のgRNA分子をコードする前記配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項115に記載の核酸配列。
- 前記プロモーターは、RNAポリメラーゼIIまたはRNAポリメラーゼIIIによって認識されるプロモーターである、請求項116に記載の核酸配列。
- 前記プロモーターは、U6プロモーターまたはHIプロモーターである、請求項117に記載の核酸配列。
- 前記核酸は、Cas9分子をさらにコードする、請求項115〜118のいずれか一項に記載の核酸配列。
- 前記Cas9分子は、配列番号6611、配列番号7821、配列番号7822、配列番号7823、配列番号7824、配列番号7825、配列番号7826、配列番号7827、配列番号7828、配列番号7829、配列番号7830、または配列番号7831のいずれかを含む、請求項119に記載の核酸配列。
- 前記核酸は、Cas9分子をコードする前記配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項119または120に記載の核酸配列。
- 前記プロモーターは、EF−1プロモーター、CMV IE遺伝子プロモーター、EF−1αプロモーター、ユビキチンCプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターである、請求項121に記載の核酸配列。
- 請求項115〜122のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
- 前記ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、およびRNAベクターからなる群から選択される、請求項123に記載のベクター。
- 細胞(例えば、細胞の集団)を前記細胞内の標的配列でまたはその近傍で改変する(例えば、核酸の構造(例えば、配列)を改変する)方法であって、前記細胞(例えば、細胞の集団)を、
1)請求項1〜68のいずれか一項に記載の1つ以上のgRNA分子、およびCas9分子;
2)請求項1〜68のいずれか一項に記載の1つ以上のgRNA分子、およびCas9分子をコードする核酸;
3)請求項1〜68のいずれか一項に記載の1つ以上のgRNA分子をコードする核酸、およびCas9分子;
4)請求項1〜68のいずれか一項に記載の1つ以上のgRNA分子をコードする核酸、およびCas9分子をコードする核酸;
5)前記1)〜4)のいずれか、および鋳型核酸;
6)前記1)〜4)のいずれか、および鋳型核酸をコードする配列を含む核酸;
7)請求項87〜114のいずれか一項に記載の組成物;または
8)請求項123または124に記載のベクター
と接触させる(例えば、それに導入する)ステップを含む方法。 - 前記gRNA分子または前記gRNA分子をコードする核酸と、前記Cas9分子または前記Cas9分子をコードする核酸とは、単一の組成物に製剤化される、請求項125に記載の方法。
- 前記gRNA分子または前記gRNA分子をコードする核酸と、前記Cas9分子または前記Cas9分子をコードする核酸とは、2つ以上の組成物に製剤化される、請求項125に記載の方法。
- 前記2つ以上の組成物は、同時にまたは逐次的に送達される、請求項127に記載の方法。
- 前記細胞は、動物細胞である、請求項125〜128のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞である、請求項125〜128のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、造血幹細胞・前駆細胞(HSPC)(例えば、HSPCの集団)である、請求項130に記載の方法。
- 前記細胞は、CD34+細胞である、請求項125〜131のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、CD34+CD90+細胞である、請求項125〜132のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、CD34+細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物中に配置される、請求項125〜133のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞(例えば、細胞の集団)は、骨髄、動員末梢血または臍帯血から単離されている、請求項125〜134のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、前記細胞が投与される患者にとって自己由来または同種異系由来である、請求項125〜135のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変は、前記1つ以上のgRNA分子の前記標的化ドメインと相補的なゲノムDNA配列にまたはその近傍にインデルをもたらす、請求項125〜136のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インデルは、図25、表15、表26、表27または表37に示されるインデルである、請求項137に記載の方法。
- 前記インデルは、約40ヌクレオチド未満、例えば30ヌクレオチド未満、例えば20ヌクレオチド未満、例えば10ヌクレオチド未満の挿入または欠失である、請求項137または138に記載の方法。
- 前記インデルは、単一のヌクレオチド欠失である、請求項139に記載の方法。
- 細胞の集団をもたらし、前記集団の細胞の少なくとも約50%、例えば少なくとも約60%、例えば少なくとも約70%、例えば少なくとも約80%、例えば少なくとも約90%(例えば、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%)は、改変されている、例えばインデルを含む、請求項137〜140のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変は、赤血球系統の分化細胞(例えば、赤血球細胞)への分化能を有する細胞(例えば、細胞の集団)をもたらし、前記分化細胞は、胎児ヘモグロビンの増加したレベル、例えば非改変細胞(例えば、細胞の集団)と比べて胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈する、請求項125〜141のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団(例えば、赤血球細胞の集団)への分化能を有する細胞の集団をもたらし、前記分化細胞の集団は、F細胞の増加した割合、例えば非改変細胞の集団と比べてF細胞の増加した割合(例えば、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、または少なくとも約40%高い)を有する、請求項125〜142のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞(例えば、赤血球細胞)への分化能を有する細胞をもたらし、前記分化細胞は、1細胞当たり少なくとも約6ピコグラム(例えば、少なくとも約7ピコグラム、少なくとも約8ピコグラム、少なくとも約9ピコグラム、少なくとも約10ピコグラム、または約8〜約9ピコグラム、または約9〜約10ピコグラム)の胎児ヘモグロビンを産生する、請求項125〜142のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項125〜144のいずれか一項に記載の方法によって改変された細胞。
- 請求項125〜144のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能な細胞。
- 請求項1〜68のいずれか一項に記載の第1のgRNA分子、または請求項87〜114のいずれか一項に記載の組成物、請求項115〜122のいずれか一項に記載の核酸、または請求項123もしくは124に記載のベクターを含む細胞。
- Cas9分子を含む、請求項147に記載の細胞。
- 前記Cas9分子は、配列番号6611、配列番号7821、配列番号7822、配列番号7823、配列番号7824、配列番号7825、配列番号7826、配列番号7827、配列番号7828、配列番号7829、配列番号7830、または配列番号7831のいずれかを含む、請求項148に記載の細胞。
- 請求項1〜68のいずれか一項に記載の第2のgRNA分子、または請求項1〜68のいずれか一項に記載の第2のgRNA分子をコードする核酸を含むか、それを含んでいたか、またはそれを含むことになり、前記第1のgRNA分子および第2のgRNA分子は、同一でない標的化ドメインを含む、請求項145〜149のいずれか一項に記載の細胞。
- 胎児ヘモグロビンの発現は、gRNA分子を含むように修飾されていない同じ細胞型の細胞またはその子孫と比べて前記細胞またはその子孫(例えば、その赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫)において増加する、請求項145〜150のいずれか一項に記載の細胞。
- 分化細胞、例えば赤血球系統の細胞(例えば、赤血球細胞)への分化能を有し、前記分化細胞は、胎児ヘモグロの増加したレベル、例えばgRNA分子を含むように修飾されていない同じタイプの細胞と比べて胎児ヘモグロの増加したレベルを呈する、請求項145〜150のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記分化細胞(例えば、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞)は、少なくとも約6ピコグラム(例えば、少なくとも約7ピコグラム、少なくとも約8ピコグラム、少なくとも約9ピコグラム、少なくとも約10ピコグラム、または約8〜約9ピコグラム、または約9〜約10ピコグラム)の胎児ヘモグロビンを、例えばgRNA分子を含むように修飾されていない同じタイプの細胞と比べて、産生する、請求項152に記載の細胞。
- 幹細胞増殖剤と接触されていた、請求項145〜153のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記幹細胞増殖剤は、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、またはこれらの組み合わせ(例えば、化合物1および化合物4)である、請求項154に記載の細胞。
- 前記幹細胞増殖剤は、化合物4である、請求項155に記載の細胞。
- 請求項1〜68のいずれか一項に記載のgRNA分子の前記標的化ドメインと相補的なゲノムDNA配列にまたはその近傍にインデルを含む細胞、例えば請求項145〜156のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記インデルは、図25、表15、表26、表27または表37に示されるインデルである、請求項157に記載の細胞。
- 前記インデルは、約40ヌクレオチド未満、例えば30ヌクレオチド未満、例えば20ヌクレオチド未満、例えば10ヌクレオチド未満の挿入または欠失である、請求項157または158に記載の細胞。
- 前記インデルは、単一のヌクレオチド欠失である、請求項157〜159のいずれか一項に記載の細胞。
- 動物細胞である、請求項145〜160のいずれか一項に記載の細胞。
- 哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞である、請求項161に記載の細胞。
- 造血幹細胞・前駆細胞(HSPC)(例えば、HSPCの集団)である、請求項145〜162のいずれか一項に記載の細胞。
- CD34+細胞である、請求項145〜163のいずれか一項に記載の細胞。
- CD34+CD90+細胞である、請求項164に記載の細胞。
- 前記細胞(例えば、細胞の集団)は、骨髄、動員末梢血または臍帯血から単離されている、請求項145〜165のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が投与される患者にとって自己由来である、請求項145〜166のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が投与される患者にとって同種異系由来である、請求項145〜166のいずれか一項に記載の細胞。
- 請求項145〜168のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞の集団。
- 前記集団の細胞の少なくとも約50%、例えば少なくとも約60%、例えば少なくとも約70%、例えば少なくとも約80%、例えば少なくとも約90%(例えば、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%)は、請求項145〜168のいずれか一項に記載の細胞である、請求項169に記載の細胞の集団。
- 分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団(例えば、赤血球細胞の集団)への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、F細胞の増加した割合、例えば同じタイプの修飾されていない細胞の集団と比べてF細胞の増加した割合(例えば、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、または少なくとも約40%高い)を有する、請求項169または170に記載の細胞の集団。
- 前記分化細胞の集団のF細胞は、1細胞当たり平均で少なくとも約6ピコグラム(例えば、少なくとも約7ピコグラム、少なくとも約8ピコグラム、少なくとも約9ピコグラム、少なくとも約10ピコグラム、または約8〜約9ピコグラム、または約9〜約10ピコグラム)の胎児ヘモグロビンを産生する、請求項171に記載の細胞の集団。
- 1)少なくとも1e6のCD34+細胞/前記細胞が投与される前記患者の体重kg、
2)少なくとも2e6のCD34+細胞/前記細胞が投与される前記患者の体重kg、
3)少なくとも3e6のCD34+細胞/前記細胞が投与される前記患者の体重kg、
4)少なくとも4e6のCD34+細胞/前記細胞が投与される前記患者の体重kg、または
5)2e6〜10e6のCD34+細胞/前記細胞が投与される前記患者の体重kg
を含む、請求項169〜172のいずれか一項に記載の細胞の集団。 - 前記集団の細胞の少なくとも約40%、例えば少なくとも約50%(例えば、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%)は、CD34+細胞である、請求項169〜173のいずれか一項に記載の細胞の集団。
- 前記集団の細胞の少なくとも約10%、例えば少なくとも約15%、例えば少なくとも約20%、例えば少なくとも約30%は、CD34+CD90+細胞である、請求項174に記載の細胞の集団。
- 骨髄に由来する、請求項169〜175のいずれか一項に記載の細胞の集団。
- 哺乳動物細胞、例えばヒト細胞を含む、例えばそれからなる、請求項169〜176のいずれか一項に記載の細胞の集団。
- 前記細胞の集団が投与される患者に対して自己由来である、請求項169〜177のいずれか一項に記載の細胞の集団。
- 前記細胞の集団が投与される患者に対して同種異系由来である、請求項169〜177のいずれか一項に記載の細胞の集団。
- 請求項145〜168のいずれか一項に記載の細胞または請求項169〜179のいずれか一項に記載の細胞の集団を含む組成物。
- 薬学的に許容可能な媒体、例えば凍結保存に好適である薬学的に許容可能な媒体を含む、請求項180に記載の組成物。
- 異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、請求項145〜168のいずれか一項に記載の細胞、請求項169〜179のいずれか一項に記載の細胞の集団、または請求項180もしくは181に記載の組成物を患者に投与するステップを含む方法。
- 哺乳動物における胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、請求項145〜168のいずれか一項に記載の細胞、請求項169〜179のいずれか一項に記載の細胞の集団、または請求項180もしくは181に記載の組成物を患者に投与するステップを含む方法。
- 前記異常ヘモグロビン症は、β−サラセミアまたは鎌状赤血球症である、請求項182に記載の方法。
- 細胞(例えば、細胞の集団)を調製する方法であって、
(a)細胞(例えば、細胞の集団)(例えば、HSPC(例えば、HSPCの集団))を提供するステップ;
(b)幹細胞増殖剤を含む細胞培養培地中で前記細胞(例えば、前記細胞の集団)をエキソビボで培養するステップ;および
(c)請求項1〜68のいずれか一項に記載の第1のgRNA分子、請求項1〜68のいずれか一項に記載の第1のgRNA分子をコードする核酸分子、請求項87〜114のいずれか一項に記載の組成物、請求項115〜122のいずれか一項に記載の核酸、または請求項123もしくは124に記載のベクターを前記細胞に導入するステップ
を含む方法。 - 前記ステップ(c)の導入の後、前記細胞(例えば、細胞の集団)は、分化細胞(例えば、分化細胞の集団)、例えば赤血球系統の細胞(例えば、赤血球系統の細胞の集団)、例えば赤血球細胞(例えば、赤血球細胞の集団)への分化能を有し、前記分化細胞(例えば、分化細胞の集団)は、増加した胎児ヘモグロビン、例えばステップ(c)に供されていない同じ細胞と比べて増加した胎児ヘモグロビンを産生する、請求項185に記載の方法。
- 前記幹細胞増殖剤は、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4またはこれらの組み合わせ(例えば、化合物1および化合物4)である、請求項185または186に記載の方法。
- 前記幹細胞増殖剤は、化合物4である、請求項187に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、トロンボポエチン(Tpo)、Flt3リガンド(Flt−3L)、およびヒト幹細胞因子(SCF)を含む、請求項185〜188のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−6(IL−6)をさらに含む、請求項189に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、トロンボポエチン(Tpo)、Flt3リガンド(Flt−3L)、およびヒト幹細胞因子(SCF)をそれぞれ約10ng/mL〜約1000ng/mLの範囲の濃度で含む、請求項189または190に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、トロンボポエチン(Tpo)、Flt3リガンド(Flt−3L)、およびヒト幹細胞因子(SCF)をそれぞれ約50ng/mLの濃度、例えば50ng/mLの濃度で含む、請求項191に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−6(IL−6)を約10ng/mL〜約1000ng/mLの範囲の濃度で含む、請求項190〜192のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−6(IL−6)を約50ng/mLの濃度、例えば50ng/mLの濃度で含む、請求項193に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約1nM〜約1mMの範囲の濃度で含む、請求項185〜194のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約1μM〜約100μMの範囲の濃度で含む、請求項195に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約50μM〜約75μMの範囲の濃度で含む、請求項196に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約50μMの濃度、例えば50μMの濃度で含む、請求項197に記載の方法。
- 前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約75μMの濃度、例えば75μMの濃度で含む、請求項197に記載の方法。
- 前記ステップ(b)の培養は、前記ステップ(c)の導入の前の培養期間を含む、請求項185〜199のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(c)の導入の前の前記培養期間は、少なくとも12時間、例えば約1日〜約3日の期間であり、例えば約1日〜約2日の期間であり、例えば約2日の期間である、請求項200に記載の方法。
- 前記ステップ(b)の培養は、前記ステップ(c)の導入の後の培養期間を含む、請求項185〜201のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(c)の導入の後の前記培養期間は、少なくとも12時間、例えば約1日〜約10日の期間であり、例えば約1日〜約5日の期間であり、例えば約2日〜約4日の期間であり、例えば約2日の期間であり、または約3日の期間であり、または約4日の期間である、請求項202に記載の方法。
- 前記細胞の集団は、少なくとも4倍、例えば少なくとも5倍、例えば少なくとも10倍、例えばステップ(b)によって培養されていない細胞と比べて、増殖する、請求項185〜203のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(c)の導入は、エレクトロポレーションを含む、請求項185〜204のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エレクトロポレーションは、1〜5パルス、例えば1パルスを含み、各パルスは、700ボルト〜2000ボルトの範囲のパルス電圧であり、かつ10ms〜100msの範囲のパルス持続時間を有する、請求項205に記載の方法。
- 前記エレクトロポレーションは、1パルスを含む、請求項206に記載の方法。
- 前記パルス電圧は、1500〜1900ボルトの範囲、例えば1700ボルトである、請求項206または207に記載の方法。
- 前記パルス持続時間は、10ms〜40msの範囲、例えば20msである、請求項206〜208のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)で提供される前記細胞(例えば、細胞の集団)は、ヒト細胞(例えば、ヒト細胞の集団)である、請求項185〜209のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)で提供される前記細胞(例えば、細胞の集団)は、骨髄、末梢血(例えば、動員末梢血)または臍帯血から単離されたものである、請求項210に記載の方法。
- ステップ(a)で提供される前記細胞(例えば、細胞の集団)は、骨髄から単離されたものである、例えば異常ヘモグロビン症に罹患している患者の骨髄から単離されたものである、請求項211に記載の方法。
- ステップ(a)で提供される前記細胞の集団は、CD34+細胞に関して富化されたものである、請求項185〜212のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(c)の導入の後、前記細胞(例えば、細胞の集団)は、凍結保存される、請求項185〜213のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(c)の導入の後、前記細胞(例えば、細胞の集団)は、前記第1のgRNA分子の前記標的化ドメインと相補的なゲノムDNA配列にまたはその近傍にインデルを含む、請求項185〜214のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インデルは、図25、表15、表26、表27または表37に示されるインデルである、請求項132に記載の方法。
- 前記ステップ(c)の導入の後、前記細胞の集団の細胞の少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%または少なくとも約99%は、前記第1のgRNA分子の前記標的化ドメインと相補的なゲノムDNA配列にまたはその近傍にインデルを含む、請求項185〜216のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の集団の細胞の各々における前記インデルは、図25、表15、表26、表27または表37に示されるインデルである、請求項217に記載の方法。
- 請求項185〜218のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能な細胞(例えば、細胞の集団)。
- 異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、請求項219に記載の細胞(例えば、細胞の集団)を含む組成物をヒト患者に投与するステップを含む方法。
- ヒト患者における胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、請求項219に記載の細胞(例えば、細胞の集団)を含む組成物を前記ヒト患者に投与するステップを含む方法。
- 前記異常ヘモグロビン症は、β−サラセミアまたは鎌状赤血球症である、請求項220に記載の方法。
- 前記ヒト患者は、前記ヒト患者の体重1kg当たり少なくとも約1e6個の請求項219に記載の細胞、例えば前記ヒト患者の体重1kg当たり少なくとも約1e6個の請求項219に記載のCD34+細胞を含む組成物を投与される、請求項220〜222のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒト患者は、前記ヒト患者の体重1kg当たり少なくとも約2e6個の請求項219に記載の細胞、例えば前記ヒト患者の体重1kg当たり少なくとも約2e6個の請求項219に記載のCD34+細胞を含む組成物を投与される、請求項223に記載の方法。
- 前記ヒト患者は、前記ヒト患者の体重1kg当たり約2e6〜約10e6個の請求項219に記載の細胞、例えば前記ヒト患者の体重1kg当たり少なくとも約2e6〜約10e6個の請求項219に記載のCD34+細胞を含む組成物を投与される、請求項223に記載の方法。
- 薬剤として用いられる、請求項1〜86のいずれか一項に記載のgRNA分子、請求項87〜114または180もしくは181のいずれか一項に記載の組成物、請求項115〜122のいずれか一項に記載の核酸、請求項123または124に記載のベクター、請求項145〜168または219のいずれか一項に記載の細胞、あるいは請求項169〜179のいずれか一項に記載の細胞の集団。
- 薬剤の製造に用いられる、請求項1〜86のいずれか一項に記載のgRNA分子、請求項87〜114または180もしくは181のいずれか一項に記載の組成物、請求項115〜122のいずれか一項に記載の核酸、請求項123または124に記載のベクター、請求項145〜168または219のいずれか一項に記載の細胞、あるいは請求項169〜179のいずれか一項に記載の細胞の集団。
- 疾患の治療に用いられる、請求項1〜86のいずれか一項に記載のgRNA分子、請求項87〜114または180もしくは181のいずれか一項に記載の組成物、請求項115〜122のいずれか一項に記載の核酸、請求項123または124に記載のベクター、請求項145〜168または219のいずれか一項に記載の細胞、あるいは請求項169〜179のいずれか一項に記載の細胞の集団。
- 疾患の治療に用いられ、前記疾患は、異常ヘモグロビン症である、請求項1〜86のいずれか一項に記載のgRNA分子、請求項87〜114または180もしくは181のいずれか一項に記載の組成物、請求項115〜122のいずれか一項に記載の核酸、請求項123または124に記載のベクター、請求項145〜168または219のいずれか一項に記載の細胞、あるいは請求項169〜179のいずれか一項に記載の細胞の集団。
- 疾患の治療に用いられ、前記異常ヘモグロビン症は、β−サラセミアまたは鎌状赤血球症である、請求項1〜86のいずれか一項に記載のgRNA分子、請求項87〜114または180もしくは181のいずれか一項に記載の組成物、請求項115〜122のいずれか一項に記載の核酸、請求項123または124に記載のベクター、請求項145〜168または219のいずれか一項に記載の細胞、または請求項169〜179のいずれか一項に記載の細胞の集団。
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