JP2023159185A - 異常ヘモグロビン症の治療用組成物および方法 - Google Patents

異常ヘモグロビン症の治療用組成物および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】異常ヘモグロビン症の治療のためのゲノム編集システム、試薬および方法を提供する。【解決手段】ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、ｃｒＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子（例えば、ヒトＢＣＬ１１ａ遺伝子）、ＢＣＬ１１ａエンハンサー（例えば、ヒトＢＣＬ１１ａエンハンサー）、又はＨＦＰＨ領域（例えば、ヒトＨＰＦＨ領域）の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子を提供する。また、前記ｇＲＮＡ分子を１つ以上、例えば１つ含むＣＲＩＳＰＲシステムを提供する。【選択図】なし

Description

関連出願
本願は、２０１５年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２７１，９６８
号明細書、および２０１６年６月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３４７，４８
４号明細書に対する優先権を主張する。これらの出願の内容全体は、参照により本明細書
に援用される。
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ
Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化した規則的な間隔
の短いパリンドローム型リピート））は、細菌においてウイルスの攻撃を防御するための
適応免疫システムとして進化した。ウイルスへの曝露時、ウイルスＤＮＡの短いセグメン
トが細菌ゲノムのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。ウイルス配列を含むＣＲＩＳＰ
Ｒ遺伝子座の一部からＲＮＡが転写される。ウイルスゲノムに相補的な配列を含むこのＲ
ＮＡがウイルスゲノム中の配列へのＣａｓ９タンパク質のターゲティングを媒介する。Ｃ
ａｓ９タンパク質がウイルス標的を切断し、それによってサイレンシングする。
近年、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが真核細胞のゲノム編集に応用されるように
なっている。部位特異的一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入により
、例えば非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）を用いて標的配列
を改変することが可能になる。
理論によって拘束されるものではないが、本発明は、一部には、例えば本明細書に記載
されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いる
ことにより、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）発現が増加し、および／またはβグロビン（例
えば、疾患原因突然変異を有するβグロビン遺伝子）の発現が低下するように細胞（例え
ば、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ））を修飾することができ、およびかかる細胞を用
いることにより、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球症およびβサラセミアを治療し
得るという発見に基づく。
したがって、ある態様において、本発明は、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分
子を１つ以上、例えば１つ含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓ ＣＲＩＳＰＲシ
ステム、例えばＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇ
ｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲシステム）を提供する。かかるシステム、ならびに本
明細書に記載される方法および細胞では、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子のいずれも
使用し得る。
ある態様において、本発明は、ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子を提供し
、ここで、ｃｒＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子、ＢＣＬ１１ａエンハンサー、またはＨＦ
ＰＨ領域の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
別の態様において、本発明は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的配列に相補的、例えば、ＢＣ
Ｌ１１ａコード領域内（例えば、ＢＣＬ１１ａエクソン内、例えばＢＣＬ１１ａエクソン
２内）の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を提供する。実施形態に
おいて、本ｇＲＮＡは、配列番号１～配列番号８５または配列番号４００～配列番号１２
３１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
別の態様において、本発明は、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーの標的配列に相補的な標的化
ドメインを含むｇＲＮＡ分子を提供する。
実施形態において、本ｇＲＮＡは、配列番号１２３２～配列番号１４９９のいずれか１
つを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの標的配列に対するｇＲＮＡは、ＢＣＬ
１１ａエンハンサーの＋５８領域内の標的配列に対するｇＲＮＡであり、標的化ドメイン
は、配列番号１８２～配列番号２７７または配列番号３３４～配列番号３４１のいずれか
１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３４
１、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２４７、配列番号２４５、配列番号２４
９、配列番号２４４、配列番号１９９、配列番号２５１、配列番号２５０、配列番号３３
４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号３３６、または配列番号３３７のいずれ
か１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２
４８を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２４
７を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２４５
を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３３６を
含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３３７を含
む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３３８を含む
、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３３５を含む、
例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２５２を含む、例
えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡは、例えば５’から３’に、配列番
号２４８－配列番号６６０７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、例えば５’から
３’に、配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むｄｇＲＮＡで
ある。ある実施形態において、ｇＲＮＡは、例えば５’から３’に、配列番号２４７－配
列番号６６０７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、例えば５’から３’に、配列
番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むｄｇＲＮＡである。ある実
施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番
号３３８－配列番号６６０４－ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。ある実施形態にお
いて、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号３３５－
配列番号６６０４－ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲ
ＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号３３６－配列番号６
６０４－ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子は
ｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号２４５－配列番号６６０４－Ｕ
ＵＵＵを含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ
分子であり、例えば５’から３’に、配列番号３３７－配列番号６６０４－ＵＵＵＵを含
む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり
、例えば５’から３’に、配列番号２５２－配列番号６６０４－ＵＵＵＵを含む、例えば
それからなる。
実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの標的配列に対するｇＲＮＡは、ＢＣＬ
１１ａエンハンサーの＋６２領域内の標的配列に対するｇＲＮＡであり、標的化ドメイン
は、配列番号２７８～配列番号３３３のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施
形態において、標的化ドメインは、配列番号３１８、配列番号３１２、配列番号３１３、
配列番号２９４、配列番号３１０、配列番号３１９、配列番号２９８、配列番号３２２、
配列番号３１１、配列番号３１５、配列番号２９０、配列番号３１７、配列番号３０９、
配列番号２８９、または配列番号２８１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実
施形態において、標的化ドメインは、配列番号３１８を含む、例えばそれからなる。
実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの標的配列に対するｇＲＮＡは、ＢＣＬ
１１ａエンハンサーの＋５５領域内の標的配列に対するｇＲＮＡであり、標的化ドメイン
は、配列番号１５９６～配列番号１６９１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。
実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１６８３、配列番号１６３８、配列番号
１６４７、配列番号１６０９、配列番号１６２１、配列番号１６１７、配列番号１６５４
、配列番号１６３１、配列番号１６２０、配列番号１６３７、配列番号１６１２、配列番
号１６５６、配列番号１６１９、配列番号１６７５、配列番号１６４５、配列番号１５９
８、配列番号１５９９、配列番号１６６３、配列番号１６７７、または配列番号１６２６
のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。
別の態様において、本発明は、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症（ＨＰＦＨ）領域の標的
配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を提供する。ある実施形態において、
ＨＰＦＨ領域はフランス型ＨＰＦＨ領域である。実施形態において、標的化ドメインは、
配列番号８６～配列番号１８１または配列番号１５００～配列番号１５９５のいずれか１
つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１００
、配列番号１６５、配列番号１１３、配列番号９９、配列番号１１２、配列番号９８、配
列番号１５８０、配列番号１０６、配列番号１５０３、配列番号１５８９、配列番号１６
０、配列番号１５３７、配列番号１５９、配列番号１０１、配列番号１６２、配列番号１
０４、配列番号１３８、配列番号１５３６、配列番号１５３９、配列番号１５８５のいず
れか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号
１００を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１
６５を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１１
３を含む、例えばそれからなる。
前述の実施形態のいずれにおいても、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載される領域およ
び／または特性をさらに有し得る。ある態様において、ｇＲＮＡ分子（例えば、前述の態
様または実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子）は、記載される標的化ドメイン配列のいず
れか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。実施形態において、記載される標的化
ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４
個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置された１７、１８
、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸である。実施形態におい
て、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２
２、２３、または２４個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’末端に
配置された１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸で
ある。実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、
１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸は、記載される標的化ドメ
イン配列の５’核酸または３’核酸のいずれも含まない。前述の態様または実施形態のい
ずれにおいても、標的化ドメインは、記載される標的化ドメイン配列からなり得る。
前述の態様および実施形態のいずれかにあるものを含め、ｇＲＮＡ分子の実施形態にお
いて、標的化ドメインは、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、
１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３
（参照配列に存在する場合）、２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列
に存在する場合）個の連続する核酸を含む。前述の態様および実施形態のいずれかにある
ものを含め、ｇＲＮＡ分子の他の実施形態において、標的化ドメインは、記載される標的
化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場
合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４
（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸
からなる。前述の態様および実施形態のいずれかにあるものを含め、ｇＲＮＡ分子の実施
形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０
、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列
に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存
在する場合）個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置され
た１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在す
る場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、
または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸である。前述の態様および実施
形態のいずれかにあるものを含め、ｇＲＮＡ分子の他の実施形態において、記載される標
的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する
場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２
４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核
酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９、２０、
２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に
存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在
する場合）個の連続する核酸である。前述の態様および実施形態のいずれかにあるものを
含め、ｇＲＮＡ分子の他の実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか
１つの１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存
在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合
）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸は、記載される標的化ドメ
イン配列の５’核酸または３’核酸のいずれも含まない。
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、ｇＲＮＡ
分子は、ハイブリダイズして配列番号６５８４または６５８５を含むフラッグポールを形
成するｃｒＲＮＡの一部分とｔｒａｃｒの一部分とを含む。実施形態において、フラッグ
ポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第１のフラッグポール伸
長部をさらに含み、前記第１のフラッグポール伸長部は配列番号６５８６を含む。実施形
態において、フラッグポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第
２のフラッグポール伸長部、および存在する場合には第１のフラッグポール伸長部をさら
に含み、前記第２のフラッグポール伸長部は配列番号６５８７を含む。
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は
、配列番号６６６０または配列番号６６６１を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含
むｇＲＮＡ分子を提供する。実施形態において、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分は配列
番号６６０７または配列番号６６０８を含む。
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は
、配列番号６５８９または６５９０を含むｔｒａｃｒと、任意選択で、第１のフラッグポ
ール伸長部が存在する場合、配列番号６５８９または６５９０の５’側に配置された第１
のｔｒａｃｒ伸長部であって、配列番号６５９１を含む第１のｔｒａｃｒ伸長部とを含む
ｇＲＮＡ分子を提供する。
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は
、標的化ドメインとｔｒａｃｒとが別個の核酸分子に配置されるｇＲＮＡ分子（例えば、
ｄｇＲＮＡ分子）を提供する。
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は
、標的化ドメインとｔｒａｃｒとが単一の核酸分子に配置され、ここで、ｔｒａｃｒが標
的化ドメインの３’側に配置されたｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子）を提供する
。実施形態において、ｓｇＲＮＡ分子は、標的化ドメインの３’側かつｔｒａｃｒの５’
側に配置されたループ、例えば、配列番号６５８８を含む、例えばそれからなるループを
含む。
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は
、５’から３’に、［標的化ドメイン］－：
（ａ）配列番号６６０１；
（ｂ）配列番号６６０２；
（ｃ）配列番号６６０３；
（ｄ）配列番号６６０４；または
（ｅ）１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば４個の
ウラシルヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記（ａ）～（ｄ）のいずれかを含むｇＲ
ＮＡ分子を提供する。実施形態において、標的化ドメインと（ａ）～（ｅ）のいずれかの
配列との間に介在ヌクレオチドはない。
別の態様において、本発明は、前述の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子を
１つ以上、例えば１つ含むＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ ＣＲＩＳＰＲシステム
、例えばＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓ）Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲシステムを提供する。ある態様において、本発明は、前述の
態様および実施形態のいずれかの第１のｇＲＮＡ分子を含み、Ｃａｓ９分子をさらに含む
組成物を提供する。実施形態において、Ｃａｓ９分子は活性または不活性化膿レンサ球菌
（ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である。実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子およ
びＣａｓ９分子はリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中に存在する。
別の態様において、本発明は、ｇＲＮＡを２つ以上含む、例えば、本明細書に記載され
るとおりのｇＲＮＡ分子を２つ以上含む、例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様または実施
形態のいずれかのｇＲＮＡ分子を２つ以上含む組成物を提供する。したがって、さらなる
態様において、本発明は、第２のｇＲＮＡ分子；第２のｇＲＮＡ分子および第３のｇＲＮ
Ａ分子；または第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子、および第４のｇＲＮＡ分子を
さらに含む、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物を提供し、ここで、
第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子（存在する場合）、および第４のｇＲＮＡ分子
（存在する場合）は、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子、例えば、前述のｇＲ
ＮＡ分子の態様または実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子である。ある実施形態において
、本組成物の各ｇＲＮＡ分子は異なる標的配列に相補的である。ある実施形態において、
各ｇＲＮＡ分子は同じ遺伝子内または領域内の標的配列と相補的である。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子（存在する場合）、
および第４のｇＲＮＡ分子（存在する場合）は、２００００ヌクレオチド以下、１０００
０ヌクレオチド以下、６０００以下、５０００ヌクレオチド以下、４０００以下、１００
０ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレ
オチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下
、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５０ヌクレオ
チド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下または
１０ヌクレオチド以下離れた標的配列と相補的である。別の態様において、本組成物の各
ｇＲＮＡ分子は異なる遺伝子内または領域内の標的配列と相補的である。
本発明の２つ以上のｇＲＮＡ分子の具体的かつ好ましい組み合わせが本明細書に記載さ
れる。ある態様において、本組成物は第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み
、ここで、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とは異なる標的配列に相補的であり
、および：
（ａ）ＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から
独立して選択されるか；
（ｂ）＋５８ ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇ
ＲＮＡ分子から独立して選択されるか；
（ｃ）＋６２ ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇ
ＲＮＡ分子から独立して選択されるか；
（ｄ）＋５５ ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇ
ＲＮＡ分子から独立して選択されるか；または
（ｅ）ＨＰＦＨ領域に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から独立し
て選択される。
ある態様において、本組成物は第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、こ
こで、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とは異なる標的配列に相補的であり、お
よび：
（ａ）第１のｇＲＮＡ分子はＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記
載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋５８ ＢＣＬ１１ａエンハ
ンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｂ）第１のｇＲＮＡ分子はＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記
載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋６２ ＢＣＬ１１ａエンハ
ンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｃ）第１のｇＲＮＡ分子はＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記
載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋５５ ＢＣＬ１１ａエンハ
ンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｄ）第１のｇＲＮＡ分子はＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記
載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子はＨＰＦＨ領域に対する本明細
書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｅ）第１のｇＲＮＡ分子は＋５８ ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例え
ば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋６２ ＢＣ
Ｌ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択
され；
（ｆ）第１のｇＲＮＡ分子は＋５８ ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例え
ば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋５５ ＢＣ
Ｌ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択
され；
（ｇ）第１のｇＲＮＡ分子は＋５８ ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例え
ば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子はＨＰＦＨ領域
に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｈ）第１のｇＲＮＡ分子は＋６２ ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例え
ば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋５５ ＢＣ
Ｌ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択
され；
（ｉ）第１のｇＲＮＡ分子は＋６２ ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例え
ば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子はＨＰＦＨ領域
に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｊ）第１のｇＲＮＡ分子は＋５５ ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例え
ば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子はＨＰＦＨ領域
に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択される。
別の態様において、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む本組成物は、以
下を含む：
（ａ）ＨＰＦＨ領域に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択さ
れる第１のｇＲＮＡ分子を含み、かつ第２のｇＲＮＡ分子が、βグロビン遺伝子の標的配
列に相補的な標的化ドメインを含むか；または
（ｂ）ＢＣＬ１１ａエンハンサー、例えば、＋５８ ＢＣＬ１１ａエンハンサー、＋５５
ＢＣＬ１１ａエンハンサーまたは＋６２ ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書
（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択される第１のｇＲＮＡ分子を含み、かつ
第２のｇＲＮＡ分子が、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれにおいても、本組成物は、組成物のｇＲＮ
Ａ成分に関して、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とからなり得る。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれにおいても、本組成物は、エレクトロポレ
ーションに好適な媒体中に製剤化し得る。
別の態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲシステムのｇＲＮＡ分子および／またはＣ
ａｓ分子をコードする核酸を提供する。理論によって拘束されるものではないが、かかる
核酸を細胞に送達すると、細胞内でＣＲＩＳＰＲシステムの発現が起こるであろうと考え
られる。ある態様において、本発明は、前出のｇＲＮＡの態様および実施形態のいずれか
の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列を提供する。実施形態において、核酸は
、１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む
。実施形態において、このプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメ
ラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターである。実施形態において、このプロモー
ターはＵ６プロモーターまたはＨＩプロモーターである。
さらなる態様において、核酸は、Ｃａｓ９分子をコードする配列をさらに含む。実施形
態において、核酸は、Ｃａｓ９分子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモータ
ーを含む。実施形態において、このプロモーターは、ＥＦ－１プロモーター、ＣＭＶ Ｉ
Ｅ遺伝子プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、またはホ
スホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。
ある態様において、本発明は、前出の核酸の態様および実施形態のいずれかの核酸を含
むベクターを提供する。実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクター、アデ
ノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（
ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、およびＲＮＡベクター
からなる群から選択される。
別の態様において、本発明は、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載される
とおりのｇＲＮＡ分子、例えば前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかにお
けるｇＲＮＡ分子と、Ｃａｓ９分子をコードする核酸とを含む組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、１つ以上のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載され
るとおりのｇＲＮＡ分子、例えば前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの
ｇＲＮＡ分子）をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子とを含む組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、鋳型核酸をさらに含む組成物、例えば、前述の組成物の
態様および実施形態のいずれかの組成物を提供する。別の態様において、本発明は、鋳型
核酸をコードする核酸配列をさらに含む組成物、例えば、前述の組成物の態様および実施
形態のいずれかの組成物を提供する。実施形態において、鋳型核酸は、ｇＲＮＡ分子の標
的配列のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。実施形態において、鋳型核酸は、
ヒトβグロビン、例えば、突然変異Ｇ１６Ｄ、Ｅ２２ＡおよびＴ８７Ｑの１つ以上を含む
ヒトβグロビンをコードする核酸を含む。実施形態において、鋳型核酸は、ヒトγグロビ
ンをコードする核酸を含む。
別の態様において、本発明は、ｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲシステム、組成物または核
酸（例えば、本明細書に記載されるとおりのもの、例えば、前述の態様および実施形態の
いずれかにあるとおりのもの）を含む（または任意の時点で含んでいた）細胞を提供する
。かかる態様において、本発明は、このように含むことによって修飾されている細胞を提
供する。
したがって、ある態様において、本発明は、細胞の核酸内にある標的配列を改変する方
法、例えば、その構造、例えば配列を改変する方法であって、前記細胞を、
１）前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子、お
よびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）；
２）前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子、お
よびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）をコードする核酸；
３）前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコ
ードする核酸、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）；
４）前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核
酸、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）をコードする核酸；
または
５）上記１）～４）のいずれか、および鋳型核酸（例えば、本明細書に記載されるとおり
の）；
６）上記１）～４）のいずれか、および鋳型核酸（例えば、本明細書に記載されるとおり
の）をコードする配列を含む核酸；
７）本明細書に記載されるとおりの（例えば、前述の組成物の態様および実施形態のいず
れかの）組成物；または
８）前述のベクターの態様および実施形態のいずれかのベクター
と接触させることを含む方法を提供する。
実施形態において、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分
子またはＣａｓ９分子をコードする核酸とは、単一の組成物に製剤化される。他の実施形
態において、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子または
Ｃａｓ９分子をコードする核酸とは、２つ以上の組成物に製剤化される。実施形態におい
て、２つ以上の組成物は同時にまたは逐次的に送達される。
実施形態において、細胞は動物細胞である。実施形態において、細胞は哺乳動物細胞、
霊長類細胞またはヒト細胞である。実施形態において、細胞は造血幹細胞・前駆細胞（Ｈ
ＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋細胞
である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ３８－／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ
－細胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞で
ある。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ３８－／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ－
／ＣＤ４９ｆ＋細胞である。実施形態において、本方法は、ＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋
細胞を富化した細胞の集団を含む。
実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は骨髄から単離されている。実施形態
において、細胞（例えば、細胞の集団）は動員末梢血から単離されている。実施形態にお
いて、細胞（例えば、細胞の集団）は臍帯血から単離されている。
実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は、前記細胞（例えば、細胞の集団）
が投与される患者にとって自己由来である。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集
団）は、前記細胞（例えば、細胞の集団）が投与される患者にとって同種異系由来である
。
本明細書に記載される方法の実施形態では、改変する結果として細胞の胎児ヘモグロビ
ン発現が増加する。本明細書に記載される方法の実施形態では、改変する結果として細胞
の胎児ヘモグロビン発現が減少する。
別の態様において、本発明は、前述の方法の態様および実施形態のいずれかの方法によ
って改変された細胞を提供する。別の態様において、本発明は、前出の態様および実施形
態のいずれかの第１のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）、または
組成物（例えば、本明細書に記載されるとおりの）、または第１のｇＲＮＡ分子（例えば
、本明細書に記載されるとおりの）をコードする核酸を含む細胞を提供する。実施形態に
おいて、細胞は動物細胞である。実施形態において、細胞は哺乳動物細胞、霊長類細胞ま
たはヒト細胞である。実施形態において、細胞は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例
えば、ＨＳＰＣの集団）である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋細胞である。実施
形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ３８－／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ－細胞である
。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞である。実施形
態において、本方法は、ＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を富化した細胞の集団を含む。
実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は骨髄から単離されている。実施形態
において、細胞（例えば、細胞の集団）は動員末梢血から単離されている。実施形態にお
いて、細胞（例えば、細胞の集団）は臍帯血から単離されている。
実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は、前記細胞（例えば、細胞の集団）
が投与される患者にとって自己由来である。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集
団）は、前記細胞（例えば、細胞の集団）が投与される患者にとって同種異系由来である
。
実施形態において、細胞は、第２のｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるとおり
の第２のｇＲＮＡ分子、例えば前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの第
２のｇＲＮＡ分子、または第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含むか、それを含んで
いたか、またはそれを含むことになり、ここで、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分
子とは同一でない標的化ドメインを含む。
実施形態において、細胞における胎児ヘモグロビンの発現が、例えばｇＲＮＡ分子（例
えば、本明細書に記載されるとおりの）を含むように修飾されていない同じ細胞型の細胞
と比べて増加する。実施形態において、細胞におけるβグロビンの発現が、例えばｇＲＮ
Ａ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）を含むように修飾されていない同じ細
胞型の細胞と比べて低下する。実施形態において、例えばｇＲＮＡ分子（例えば、本明細
書に記載されるとおりの）を含むように修飾されていない同じ細胞型の細胞と比べて細胞
における胎児ヘモグロビンの発現が増加し、かつβグロビンの発現が低下する。
ある態様において、本発明の細胞（または細胞を含む方法）は、幹細胞増殖剤、例えば
本明細書に記載されるとおりの幹細胞増殖剤、例えば、化合物１、化合物２、化合物３ま
たは化合物４と接触させたものである。ある態様において、本発明の細胞（または細胞を
含む方法）は、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるとおりの幹細胞増殖剤、例え
ば、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４またはこれらの組み合わせ（例えば、化合
物１および化合物４）と接触させたものである。ある実施形態において、幹細胞増殖剤は
化合物４である。ある実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物１と化合物４との組み合
わせである。実施形態において、接触はエキソビボである。
別の態様において、本発明は、治療方法、例えば異常ヘモグロビン症の治療方法を提供
する。ある態様において、本発明は、前出の細胞または方法の態様および実施形態のいず
れかの細胞（例えば、細胞の集団）を患者に投与することを含む、異常ヘモグロビン症を
治療する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、前出の細胞または方法の態様および実施形態のいずれか
の細胞を患者に投与することを含む、哺乳動物における胎児ヘモグロビン発現を増加させ
る方法を提供する。ある実施形態において、異常ヘモグロビン症はβ－サラセミアまたは
鎌状赤血球症である。
別の態様において、本発明は、薬剤として用いられる、例えば疾患の治療に用いられる
ガイドＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるとおりのガイドＲＮＡ分子を提供する。
実施形態において、疾患は異常ヘモグロビン症、例えばβ－サラセミアまたは鎌状赤血球
症である。
別の態様において、本発明は、ｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載されるとおりの
ｇＲＮＡ分子、例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかに記載され
るとおりのｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが細胞
（例えば、ＣＤ３４＋細胞、例えばＨＳＣ）に導入されると、ＮＧＳによって計測したと
き、生じるインデルの少なくとも約１５％が、非修飾標的ＤＮＡと比べて（ａ）フレーム
シフト突然変異；または（ｂ）大規模欠失を含む。実施形態において、ＮＧＳによって計
測したとき、生じるインデルの少なくとも約２５％が、非修飾標的ＤＮＡと比べて（ａ）
フレームシフト突然変異；または（ｂ）大規模欠失を含む。実施形態において、ＮＧＳに
よって計測したとき、生じるインデルの少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少な
くとも約６０％、少なくとも約７０％ 少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少な
くとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、また
は少なくとも約９９％が、非修飾標的ＤＮＡと比べて（ａ）フレームシフト突然変異；ま
たは（ｂ）大規模欠失を含む。
別の態様において、本発明は、ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）のエキソビボ増殖
および修飾方法を提供する。ある態様において、本発明は、細胞（例えば、細胞の集団）
を修飾する方法であって、
（ａ）細胞の集団を提供するステップと；
（ｂ）エキソビボで幹細胞増殖剤の存在下で前記細胞を増殖させるステップと；
（ｃ）第１のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの第１のｇＲＮＡ分子
、例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの第１のｇＲＮＡ分子）
、第１のｇＲＮＡ分子をコードする核酸分子、または組成物（例えば、本明細書に記載さ
れるとおりの組成物、例えば、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物）
を前記細胞に導入するステップと
を含み、これによりステップ（ｃ）に供されていない同じ細胞型と比べて前記細胞におけ
るヘモグロビン、例えば胎児ヘモグロビンの発現が増加する方法を提供する。
実施形態において、細胞は、それを必要としている対象、例えば、異常ヘモグロビン症
、例えば鎌状赤血球症またはβサラセミアを有する対象に導入される。
実施形態において、細胞はＣＤ３４＋細胞であるか、またはそれを含む。実施形態にお
いて、細胞はＨＳＰＣであるか、またはそれを含む。実施形態において、細胞は骨髄、動
員末梢血または臍帯血から単離されたものである。好ましい実施形態において、細胞は骨
髄から単離されたものである。他の実施形態において、細胞は動員末梢血から単離された
ものである。態様において、動員末梢血は、Ｇ－ＣＳＦが投与された対象から単離された
ものである。態様において、動員末梢血は、Ｇ－ＣＳＦ以外の動員剤、例えばＰｌｅｒｉ
ｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）が投与された対象から単離されたものである
。実施形態において、細胞は、富化された細胞の集団である。
実施形態において、幹細胞増殖剤は、化合物１、化合物２、化合物３、または化合物４
、例えば化合物４である。実施形態において、幹細胞増殖剤は、化合物１、化合物２、化
合物３、化合物４、またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１と化合物４との組み合
わせ）である。実施形態において、細胞は、約１～約２００マイクロモル（μＭ）の濃度
の化合物４に接触させる。ある実施形態において、化合物４の濃度は約７５マイクロモル
（μＭ）である。実施形態において、エキソビボで幹細胞増殖剤の存在下で前記細胞を増
殖させるステップは、約１～１０日、例えば約１～５日、例えば約２～５日、例えば約４
日の期間にわたって行われる。
実施形態において、細胞は、前記細胞の投与が意図される患者にとって自己由来である
。実施形態において、細胞は、前記細胞の投与が意図される患者にとって同種異系由来で
ある。
実施形態において、ステップ（ｂ）の増殖は、さらに、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、
Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）およびヒトインターロイ
キン－６（ＩＬ－６）の存在下である。実施形態において、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）
、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）およびヒトインターロ
イキン－６（ＩＬ－６）は、それぞれ約５０ｎｇ／ｍＬの濃度である。実施形態において
、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（
ＳＣＦ）およびヒトインターロイキン－６（ＩＬ－６）は、それぞれ５０ｎｇ／ｍＬの濃
度である。
さらなる態様および実施形態を以下に記載する。
ある態様において、本発明は、ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子を提供し
、ここで、ｃｒＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子（例えば、ヒトＢＣＬ１１ａ遺伝子）、Ｂ
ＣＬ１１ａエンハンサー（例えば、ヒトＢＣＬ１１ａエンハンサー）、またはＨＦＰＨ領
域（例えば、ヒトＨＰＦＨ領域）の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的配列であり、標的化ドメイン
は、配列番号１～配列番号８５または配列番号４００～配列番号１２３１のいずれか１つ
を含む、例えばそれからなる。これらの実施形態は、本明細書ではｇＲＮＡ分子の実施形
態２と称される。
他の実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、標的化ド
メインは、配列番号１２３２～配列番号１４９９のいずれか１つを含む、例えばそれから
なる。これらの実施形態は、本明細書ではｇＲＮＡ分子の実施形態３と称される。好まし
い実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、標的化ドメイ
ンは、配列番号１８２～配列番号２７７または配列番号３３４～配列番号３４１のいずれ
か１つを含む、例えばそれからなる。これらの実施形態は、本明細書ではｇＲＮＡ分子の
実施形態４と称される。より好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３
４１、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２４７、配列番号２４５、配列番号２
４９、配列番号２４４、配列番号１９９、配列番号２５１、配列番号２５０、配列番号３
３４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号３３６、または配列番号３３７のいず
れか１つを含む、例えばそれからなる。これらの実施形態は、本明細書ではｇＲＮＡ分子
の実施形態５と称される。さらにより好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配
列番号２４７、配列番号２４８、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、ま
たは配列番号３３８のいずれか１つを含み、例えばそれからなり（本明細書においてｇＲ
ＮＡ分子の実施形態６と称される）、例えば、配列番号２４８または配列番号３３８のい
ずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態７と
称される）。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２４８を含む、例えばそれ
からなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態８と称される）。実施形態において
、標的化ドメインは、配列番号３３８を含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇ
ＲＮＡ分子の実施形態９と称される）。
他の実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、標的化ド
メインは、配列番号２７８～配列番号３３３のいずれか１つを含む、例えばそれからなる
（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１０と称される）。好ましい実施形態におい
て、標的化ドメインは、配列番号３１８、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号２
９４、配列番号３１０、配列番号３１９、配列番号２９８、配列番号３２２、配列番号３
１１、配列番号３１５、配列番号２９０、配列番号３１７、配列番号３０９、配列番号２
８９、または配列番号２８１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書にお
いてｇＲＮＡ分子の実施形態１１と称される）。好ましい一実施形態において、標的化ド
メインは、配列番号３１８を含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子
の実施形態１２と称される）。
他の実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、標的化ド
メインは、配列番号１５９６～配列番号１６９１のいずれか１つを含む、例えばそれから
なる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１３と称される）。好ましい実施形態に
おいて、標的化ドメインは、配列番号１６８３、配列番号１６３８、配列番号１６４７、
配列番号１６０９、配列番号１６２１、配列番号１６１７、配列番号１６５４、配列番号
１６３１、配列番号１６２０、配列番号１６３７、配列番号１６１２、配列番号１６５６
、配列番号１６１９、配列番号１６７５、配列番号１６４５、配列番号１５９８、配列番
号１５９９、配列番号１６６３、配列番号１６７７、または配列番号１６２６のいずれか
１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１４と称さ
れる）。
他の実施形態において、標的配列はＨＦＰＨ領域（例えば、フランス型ＨＰＦＨ領域）
のものであり、標的化ドメインは、配列番号８６～配列番号１８１、配列番号１５００～
配列番号１５９５、または配列番号１６９２～配列番号１７６１のいずれか１つを含む、
例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１５と称される）。好ま
しい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１００、配列番号１６５、配列番号
１１３、配列番号９９、配列番号１１２、配列番号９８、配列番号１５８０、配列番号１
０６、配列番号１５０３、配列番号１５８９、配列番号１６０、配列番号１５３７、配列
番号１５９、配列番号１０１、配列番号１６２、配列番号１０４、配列番号１３８、配列
番号１５３６、配列番号１５３９、配列番号１５８５のいずれか１つを含む、例えばそれ
からなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１６と称される）。さらにより好ま
しい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１
５０５、配列番号１５８９、配列番号１７００、または配列番号１７５０のいずれか１つ
を含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１７と称される
）。他の好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１００、配列番号１６
５、または配列番号１１３のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書におい
てｇＲＮＡ分子の実施形態１８と称される）。
実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載される任意の標的化ドメイン配列
、例えば表１または表２の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、
２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。実施形態において、本明細書に記載される標的化ドメイン配列のいず
れか１つ、例えば表１または表２の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１
、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸は、記載される標的化ド
メイン配列の３’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または
２４個、好ましくは２０個の連続する核酸である。他の実施形態において、本明細書に記
載される標的化ドメイン配列のいずれか１つ、例えば表１または表２の標的化ドメイン配
列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連
続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９
、２０、２１、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸である。他
の実施形態において、本明細書に記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つ、例えば
表１または表２の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、ま
たは２４個、好ましくは２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’
核酸または３’核酸のいずれも含まない。
実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載される任意の標的化ドメイン配列
、例えば表５、表６、表７、表８または表９の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、
または２０個、好ましくは２０個の連続する核酸を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。実施形態において、本明細書に記載される標的化ドメイン配列のいずれか１
つ、例えば表５、表６、表７、表８または表９の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９
、または２０個、好ましくは２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の
３’末端に配置された１７、１８、１９、または２０個、好ましくは２０個の連続する核
酸である。他の実施形態において、本明細書に記載される標的化ドメイン配列のいずれか
１つ、例えば表５、表６、表７、表８または表９の標的化ドメイン配列の１７、１８、１
９、または２０個、好ましくは２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列
の５’末端に配置された１７、１８、１９、または２０個、好ましくは２０個の連続する
核酸である。他の実施形態において、本明細書に記載される標的化ドメイン配列のいずれ
か１つ、例えば表５、表６、表７、表８または表９の標的化ドメイン配列の１７、１８、
１９、または２０個、好ましくは２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配
列の５’核酸または３’核酸のいずれも含まない。
以下の態様は、前述の態様および実施形態のいずれかと組み合わせ得るｇＲＮＡ分子の
特徴について記載する。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、前述の態様および実施形態
のいずれかのｇＲＮＡ分子を含め、ハイブリダイズして配列番号６５８４または６５８５
を含むフラッグポールを形成するｃｒＲＮＡの一部分とｔｒａｃｒの一部分とを含む。実
施形態において、フラッグポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置す
る第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第１のフラッグポール伸長部は配列番
号６５８６を含む。実施形態において、フラッグポールは（第１のフラッグポール伸長部
に加えてまたはそれに代えて）フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第２
のフラッグポール伸長部、および存在する場合には第１のフラッグポール伸長部をさらに
含み、ここで、前記第２のフラッグポール伸長部は配列番号６５８７を含む。
前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ｔ
ｒａｃｒは配列番号６６６０または配列番号６６６１を含む。実施形態において、ｔｒａ
ｃｒは配列番号７８１２を含み、任意選択で３’末端に追加的な１、２、３、４、５、６
、または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む。実施形態において、ｃｒＲＮ
Ａは、５’から３’に、［標的化ドメイン］－：ａ）配列番号６５８４；ｂ）配列番号６
５８５；ｃ）配列番号６６０５；ｄ）配列番号６６０６；ｅ）配列番号６６０７；ｆ）配
列番号６６０８；またはｇ）配列番号７８０６を含む。
前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ｔ
ｒａｃｒは、５’から３’に、ａ）配列番号６５８９；ｂ）配列番号６５９０；ｃ）配列
番号６６０９；ｄ）配列番号６６１０；ｅ）配列番号６６６０；ｆ）配列番号６６６１；
ｇ）配列番号７８１２；ｈ）配列番号７８０７；ｉ）配列番号７８０８；ｊ）配列番号７
８０９；ｋ）少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチ
ド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを３’
末端にさらに含む上記ａ）～ｊ）のいずれか；ｌ）少なくとも１、２、３、４、５、６ま
たは７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個
のアデニン（Ａ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記ａ）～ｋ）のいずれか；また
はｍ）少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例
えば、１、２、３、４、５、６、または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドを５’末端に
（例えば、５’側端に）さらに含む上記ａ）～ｌ）のいずれかを含む。
実施形態において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは別個の核酸分子上に配置される。
かかるｇＲＮＡ分子の実施形態において、標的化ドメインを含む核酸分子は、任意選択で
標的化ドメインのすぐ３’側に配置された配列番号６６０７を含み、およびｔｒａｃｒを
含む核酸分子は配列番号６６６０を含む、例えばそれからなる。
実施形態において、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分は配列番号６６０７または配列番
号６６０８を含む。
実施形態において、ｔｒａｃｒは、配列番号６５８９または６５９０と、任意選択で、
第１のフラッグポール伸長部が存在する場合、配列番号６５８９または６５９０の５’側
に配置された第１のｔｒａｃｒ伸長部とを含み、前記第１のｔｒａｃｒ伸長部は配列番号
６５９１を含む。
前述の態様および実施形態のいずれかの実施形態におけるものを含め、実施形態におい
て、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは別個の核酸分子に配置される。前述の態様および実
施形態のいずれかの実施形態におけるものを含め、他の実施形態において、標的化ドメイ
ンとｔｒａｃｒとは単一の核酸分子に配置され、例えば、ｔｒａｃｒは標的化ドメインの
３’側に配置される。
実施形態において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとが単一の核酸分子に配置されるとき
、ｇＲＮＡ分子は、標的化ドメインの３’側かつｔｒａｃｒの５’側に配置されたループ
をさらに含む。実施形態において、ループは配列番号６５８８を含む、例えばそれからな
る。
実施形態において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとが単一の核酸分子に配置されるとき
、ｇＲＮＡ分子は、５’から３’に、［標的化ドメイン］－：（ａ）配列番号６６０１；
（ｂ）配列番号６６０２；（ｃ）配列番号６６０３；（ｄ）配列番号６６０４；（ｅ）配
列番号７８１１；または（ｆ）１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌク
レオチドを３’末端にさらに含む上記（ａ）～（ｅ）のいずれかを含む。実施形態におい
て、ｇＲＮＡ分子は、前記標的化ドメインと配列番号７８１１とを含み、例えばそれから
なり、配列番号７８１１は任意選択で前記標的化ドメインのすぐ３’側に配置される。
前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ｇ
ＲＮＡ分子の核酸残基の各々は、核酸分子の各残基間にある非修飾Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ核
酸残基および非修飾リン酸結合である。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実
施形態を含め、他の実施形態において、ｇＲＮＡ分子を構成する核酸分子の１つ、または
任意選択で２つ以上が、ａ）前記１つまたは複数の核酸分子の３’末端における１つ以上
、例えば３つのホスホロチオエート修飾；ｂ）前記１つまたは複数の核酸分子の５’末端
における１つ以上、例えば３つのホスホロチオエート修飾；ｃ）前記１つまたは複数の核
酸分子の３’末端における１つ以上、例えば３つの２’－Ｏ－メチル修飾；ｄ）前記１つ
または複数の核酸分子の５’末端における１つ以上、例えば３つの２’－Ｏ－メチル修飾
；ｅ）前記１つまたは複数の核酸分子の末端から４番目、末端から３番目、および末端か
ら２番目の３’残基の各々における２’Ｏ－メチル修飾；ｆ）前記１つまたは複数の核酸
分子の末端から４番目、末端から３番目、および末端から２番目の５’残基の各々におけ
る２’Ｏ－メチル修飾；またはｆ）これらの任意の組み合わせを含む。
好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３４２；（ｂ）配列番号
３４３；または（ｃ）配列番号１７６２を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例え
ば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態
４１と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３４４を含む、例えばそれ
からなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３４４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３４５を含む、例えばそれからな
るｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３４５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば
、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態４２と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３４７；（ｂ）配列
番号３４８；または（ｃ）配列番号１７６３を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（
例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態４３と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３４９を含む、例えばそれ
からなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３４９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３５０を含む、例えばそれからな
るｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３５０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば
、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態４４と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３５１；（ｂ）配列
番号３５２；または（ｃ）配列番号１７６４を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（
例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態４５と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３５３を含む、例えばそれ
からなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３５３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３５４を含む、例えばそれからな
るｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３５４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば
、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態４６と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３５５；（ｂ）配列
番号３５６；または（ｃ）配列番号１７６５を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（
例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態４７と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３５７を含む、例えばそれ
からなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３５７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３５８を含む、例えばそれからな
るｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３５８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば
、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態４８と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３５９；（ｂ）配列
番号３６０；または（ｃ）配列番号１７６６を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（
例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態４９と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３６１を含む、例えばそれ
からなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３６１を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３６２を含む、例えばそれからな
るｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３６２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば
、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態５０と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３６３；（ｂ）配列
番号３６４；または（ｃ）配列番号１７６７を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（
例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態５１と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３６５を含む、例えばそれ
からなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３６５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３６６を含む、例えばそれからな
るｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３６６を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば
、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態５２と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３６７；（ｂ）配列
番号３６８；または（ｃ）配列番号１７６８を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（
例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態５３と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３６９を含む、例えばそれ
からなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３６９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３７０を含む、例えばそれからな
るｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３７０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば
、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態５４と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３７１；（ｂ）配列
番号３７２；または（ｃ）配列番号１７６９を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（
例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態５５と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３７３を含む、例えばそれ
からなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３７３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３７４を含む、例えばそれからな
るｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３７４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば
、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態５６と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３７５；（ｂ）配列
番号３７６；または（ｃ）配列番号１７７０を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（
例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態５７と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３７７を含む、例えばそれ
からなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３７８を含む、例えばそれからな
るｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば
、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態５８と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３７９；（ｂ）配列
番号３８０；または（ｃ）配列番号１７７１を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（
例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態５９と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３８１を含む、例えばそれ
からなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３８１を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３８２を含む、例えばそれからな
るｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３８２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば
、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態６０と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３８３；（ｂ）配列
番号３８４；または（ｃ）配列番号１７７２を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（
例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態６１と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３８５を含む、例えばそれ
からなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３８５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３８６を含む、例えばそれからな
るｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３８６を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば
、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態６２と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３８７；（ｂ）配列
番号３８８；または（ｃ）配列番号１７７３を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（
例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態６３と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３８９を含む、例えばそれ
からなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３８９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３９０を含む、例えばそれからな
るｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３９０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば
、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態６４と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３９１；（ｂ）配列
番号３９２；または（ｃ）配列番号１７７４を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（
例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態６５と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３９３を含む、例えばそれ
からなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３９３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３９４を含む、例えばそれからな
るｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３９４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば
、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態６６と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３９５；（ｂ）配列
番号３９６；または（ｃ）配列番号１７７５を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（
例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態６７と称される）。
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３９７を含む、例えばそれ
からなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３９７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３９８を含む、例えばそれからな
るｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３９８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば
、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施
形態６８と称される）。
前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本
発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例え
ば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、インデルは、ｇＲＮ
Ａ分子の標的化ドメインと相補的な標的配列にまたはその近傍に形成される。＋５８エン
ハンサー領域の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む実施形態におけるものを含め、
実施形態において、インデルはＧＡＴＡ－１および／またはＴＡＬ－１結合部位のヌクレ
オチドを含まない。実施形態において、インデルはＧＡＴＡ－１および／またはＴＡＬ－
１のその結合部位への結合を妨げない。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実
施形態を含め、実施形態において、本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分
子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞
の集団に導入されると、インデルは、集団の細胞の少なくとも約４０％、例えば少なくと
も約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも
約８０％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約
９６％、例えば少なくとも約９７％、例えば少なくとも約９８％、例えば少なくとも約９
９％において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相補的な標的配列にまたはその近傍に形
成される。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステ
ム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、ＧＡ
ＴＡ－１および／またはＴＡＬ－１結合部位のヌクレオチドを含まないインデルは、集団
の細胞の少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約３５％、
例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約４５％、例えば少なくとも約５０％、例
えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約６５％、例え
ば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％、例えば
少なくとも約８５％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少
なくとも約９９％において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相補的な標的配列にまたは
その近傍に形成される。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、
実施形態において、インデルは、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７のいずれ
かに挙げられるインデルである。実施形態において、集団の細胞の少なくとも約３０％、
例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例
えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％、例え
ば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９６％、例えば少なくとも約９７％、例えば
少なくとも約９８％、例えば少なくとも約９９％において、インデルは、図２５、表１５
、表２６、表２７または表３７のいずれかに挙げられるインデルである。実施形態におい
て、前記細胞の集団中において最も高頻度で検出される３つのインデルには、図２５、表
１５、表２６、表２７または表３７のいずれかに挙げられる任意のｇＲＮＡ分子に関連す
るインデルが含まれる。実施形態において、インデル（または上位インデルのパターン）
は、例えば当該技術分野で記載されるとおりの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって
計測されるとおりである。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め
、実施形態において、本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲ
ＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入される
と、例えば、ＨＰＣＳ細胞、例えばＣＤ３４＋細胞でアッセイされる、例えば次世代シー
ケンシングおよび／またはヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフタ
ーゲットインデルは、前記細胞において形成されない。前述の態様および実施形態のいず
れかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここ
で、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりの
ＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、例えば、ＨＰＳＣ細胞の集団、例えばＣＤ３４＋
細胞の集団でアッセイされる、例えば次世代シーケンシングおよび／またはヌクレオチド
挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、細胞の集団の約５
％超、例えば約１％超、例えば約０．１％超、例えば約０．０１％超の細胞において検出
されない。
前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本
発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例え
ば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、胎児ヘモグロビンの
発現は、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫
において増加する。実施形態において、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子
孫、例えばその赤血球細胞子孫において胎児ヘモグロビンの発現は、少なくとも約２０％
、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、
例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例
えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９６％、例え
ば少なくとも約９７％、例えば少なくとも約９８％、例えば少なくとも約９９％増加する
。実施形態において、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤
血球細胞子孫は１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグ
ラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグ
ラム、または約８～約９ピコグラム、または約９～約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビ
ンを産生する。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態
において、本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシ
ステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、胎児ヘ
モグロビン（例えば、γグロビン）ｍＲＮＡのレベルは、前記細胞またはその子孫、例え
ばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において増加する。前述の態様および実
施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明はｇＲＮＡ分子を
提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載さ
れるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、ＢＣＬ１１ａ ｍＲＮＡの発現は、前記細
胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において増加す
る。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、
本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例
えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、ＢＣＬ１１ａ ｍ
ＲＮＡのレベルは、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血
球細胞子孫において低下する。
細胞に言及する前述の態様および実施形態のいずれにおいても、細胞は哺乳動物細胞、
霊長類細胞またはヒト細胞であり（または細胞の集団はそれを含み）、例えばヒト細胞ま
たはヒト細胞の集団である。実施形態において、細胞はＨＳＰＣであり（または細胞の集
団はそれを含み）、例えばＣＤ３４＋であり、例えばＣＤ３４＋ＣＤ９０＋である。実施
形態において、細胞（または細胞の集団）は、前記細胞の投与を受ける患者にとって自己
由来である。他の実施形態において、細胞（または細胞の集団）は、前記細胞の投与を受
ける患者にとって同種異系由来である。
別の態様において、本発明は、１）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（第
１のｇＲＮＡ分子を含む）、例えば前出の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇ
ＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子；
２）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）、例え
ば前出の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子
（本明細書に記載される）をコードする核酸；３）本明細書に記載される１つ以上のｇＲ
ＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）、例えば前出の態様および実施形態のいずれかの
１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子（本明細書に記載される
）；４）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）、
例えば前出の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸
、およびＣａｓ９分子（本明細書に記載される）をコードする核酸；または５）上記１）
～４）のいずれか、および鋳型核酸；または６）上記１）～４）のいずれか、および鋳型
核酸をコードする配列を含む核酸を含む組成物を提供する。
好ましい実施形態において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載
されるもの、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの第１のｇＲ
ＮＡ分子）を含み、さらにＣａｓ９分子（本明細書に記載される）を含む組成物を提供す
る。
実施形態において、Ｃａｓ９分子は活性または不活性化膿レンサ球菌（ｓ．ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓ）Ｃａｓ９である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は配列番号６６１１を含む。
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、（ａ）配列番号７８２１；（ｂ）配列番号７８２２
；（ｃ）配列番号７８２３；（ｄ）配列番号７８２４；（ｅ）配列番号７８２５；（ｆ）
配列番号７８２６；（ｇ）配列番号７８２７；（ｈ）配列番号７８２８；（ｉ）配列番号
７８２９；（ｊ）配列番号７８３０；または（ｋ）配列番号７８３１を含む、例えばそれ
からなる。
好ましい実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子はリボ核タンパク
質複合体（ＲＮＰ）に存在する。
実施形態において、本発明は、第２のｇＲＮＡ分子；第２のｇＲＮＡ分子および第３の
ｇＲＮＡ分子；または第２のｇＲＮＡ分子、任意選択で第３のｇＲＮＡ分子、および任意
選択で第４のｇＲＮＡ分子をさらに含む組成物、例えば前出の態様および実施形態のいず
れかの組成物を提供し、ここで、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３のｇＲＮＡ分子、
および任意選択の第４のｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば、
前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子のｇＲＮＡ分子であ
り、ここで、組成物の各ｇＲＮＡ分子は異なる標的配列に相補的である。
実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３のｇＲ
ＮＡ分子、および任意選択の第４のｇＲＮＡ分子の２つ以上は、同じ遺伝子内または領域
内の標的配列に相補的である。実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ
分子、任意選択の第３のｇＲＮＡ分子、および任意選択の第４のｇＲＮＡ分子は、２００
００ヌクレオチド以下、１００００ヌクレオチド以下、６０００以下、５０００ヌクレオ
チド以下、４０００以下、１０００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００
ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオ
チド以下、９０ヌクレオチド以下、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０
ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以
下、２０ヌクレオチド以下または１０ヌクレオチド以下離れた標的配列に相補的である。
他の実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３の
ｇＲＮＡ分子、および任意選択の第４のｇＲＮＡ分子の２つ以上は、異なる遺伝子内また
は領域内の標的配列に相補的である。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的
配列に相補的であるか；
（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的
配列に相補的であるか；
ｃ）ｇＲＮＡ分子の実施形態６のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配
列に相補的であるか；または
（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形態７のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的
配列に相補的であるか；または
（ｅ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４１～５６のいずれかのｇＲＮＡ分子から独立して選択さ
れ、かつ異なる標的配列に相補的である。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１０のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標
的配列に相補的であるか；または
（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１１のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標
的配列に相補的である。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１３のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標
的配列に相補的であるか；または
（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１４のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標
的配列に相補的である。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１６のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標
的配列に相補的であるか；
（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１７のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標
的配列に相補的であるか；
（ｃ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１８のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標
的配列に相補的であるか；または
（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５７～６８のいずれかのｇＲＮＡ分子から独立して選択さ
れ、かつ異なる標的配列に相補的である。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４のｇＲＮＡ分子から選択
されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）ｇ
ＲＮＡ分子の実施形態６のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形
態７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｅ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４１～５６
のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１０のｇＲＮＡ分子から選
択されるか、または（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１１のｇＲＮＡ分子から選択される。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４のｇＲＮＡ分子から選択
されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）ｇ
ＲＮＡ分子の実施形態６のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形
態７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｅ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４１～５６
のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１３のｇＲＮＡ分子から選
択され、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１４のｇＲＮＡ分子から選択される。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４のｇＲＮＡ分子から選択
されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）ｇ
ＲＮＡ分子の実施形態６のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形
態７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｅ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４１～５６
のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１６のｇＲＮＡ分子から選
択されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ
）ｇＲＮＡ分子の実施形態１８のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）ｇＲＮＡ
分子の実施形態５７～６８のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択される。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１０のｇＲＮＡ分子から選
択されるか、または（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１１のｇＲＮＡ分子から選択され；お
よび
（２）第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１３のｇＲＮＡ分子から選
択され、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１４のｇＲＮＡ分子から選択される。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１０のｇＲＮＡ分子から選
択されるか、または（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１１のｇＲＮＡ分子から選択され；お
よび
（２）第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１６のｇＲＮＡ分子から選
択されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ
）ｇＲＮＡ分子の実施形態１８のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）ｇＲＮＡ
分子の実施形態５７～６８のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択される。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１３のｇＲＮＡ分子から選
択され、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１４のｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１６のｇＲＮＡ分子から選
択されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ
）ｇＲＮＡ分子の実施形態１８のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）ｇＲＮＡ
分子の実施形態５７～６８のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択される。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１６のｇＲＮＡ分子から選
択されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ
）ｇＲＮＡ分子の実施形態１８のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）ｇＲＮＡ
分子の実施形態５７～６８のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択され；および（２）第２の
ｇＲＮＡ分子は、βグロビン遺伝子の標的配列と相補的な標的化ドメインを含むか；また
は
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４のｇＲＮＡ分子から選択
されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）ｇ
ＲＮＡ分子の実施形態６のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形
態７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｅ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４１～５６のいず
れかのｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｆ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１０のｇＲＮＡ分
子から選択されるか、（ｇ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１１のｇＲＮＡ分子から選択される
か、（ｈ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１３のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｉ）
ｇＲＮＡ分子の実施形態１４のｇＲＮＡ分子から選択され；および（２）第２のｇＲＮＡ
分子は、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子がｇＲＮＡ分子の実施形
態４１～６８のいずれかのｇＲＮＡ分子から独立して選択される組成物を提供する。
本組成物の実施形態において、組成物のｇＲＮＡ分子成分に関して、本組成物は第１の
ｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とからなる。
本組成物の実施形態において、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａ
ｓ９分子と共にリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中にある。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本発明は、鋳型核酸をさらに含む組成物を提供し、鋳型核酸は、第１のｇＲＮＡ分
子の標的配列にまたはその近傍にあるヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。実施
形態において、鋳型核酸は、（ａ）ヒトβグロビン、例えば突然変異Ｇ１６Ｄ、Ｅ２２Ａ
およびＴ８７Ｑの１つ以上を含むヒトβグロビン、もしくはその断片；または（ｂ）ヒト
γグロビン、もしくはその断片をコードする核酸を含む。
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本組成物は、エレクトロポレーションに好適、例えばＨＳＰＣ細胞へのエレクトロ
ポレーションに好適な媒体中に製剤化される。１つ以上のｇＲＮＡ分子を含む本組成物の
実施形態において、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子と共
にＲＮＰ中にあり、および前記ＲＮＰの各々は、約１０μＭ未満、例えば約３μＭ未満、
例えば約１μＭ未満、例えば約０．５μＭ未満、例えば約０．３μＭ未満、例えば約０．
１μＭ未満の濃度である。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば
、前出の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列を提供する
。実施形態において、本核酸は、１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に
連結されたプロモーター、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩ
ＩＩによって認識されるプロモーター、例えばＵ６プロモーターまたはＨＩプロモーター
を含む。実施形態において、本核酸は、Ｃａｓ９分子、例えば、本明細書に記載されるＣ
ａｓ９分子、例えば、配列番号６６１１、配列番号７８２１、配列番号７８２２、配列番
号７８２３、配列番号７８２４、配列番号７８２５、配列番号７８２６、配列番号７８２
７、配列番号７８２８、配列番号７８２９、配列番号７８３０、または配列番号７８３１
のいずれかを含む（例えば、それからなる）Ｃａｓ９分子をさらにコードする。実施形態
において、本核酸は、Ｃａｓ９分子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモータ
ー、例えば、ＥＦ－１プロモーター、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ－１αプロ
モーター、ユビキチンＣプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プ
ロモーターを含む。
別の態様において、本発明は、前出の核酸の態様および実施形態のいずれかの核酸を含
むベクターを提供する。実施形態において、本ベクターは、レンチウイルスベクター、ア
デノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス
（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、およびＲＮＡベクタ
ーからなる群から選択される。
別の態様において、本発明は、細胞（例えば、細胞の集団）を前記細胞内の標的配列で
またはその近傍で改変する（例えば、核酸の構造（例えば、配列）を改変する）方法であ
って、前記細胞（例えば、細胞の集団）を、１）前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形
態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載
される）；２）前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮ
Ａ分子、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載される）をコードする核酸；３）
前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコード
する核酸、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載される）；４）前出のｇＲＮＡ
分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およ
びＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載される）をコードする核酸；５）上記１）～４
）のいずれか、および鋳型核酸；６）上記１）～４）のいずれか、および鋳型核酸をコー
ドする配列を含む核酸；７）前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物；ま
たは８）前出のベクターの態様および実施形態のいずれかのベクターと接触させる（例え
ば、それに導入する）ステップを含む方法を提供する。実施形態において、ｇＲＮＡ分子
またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９分子をコードする
核酸とは、単一の組成物に製剤化される。他の実施形態において、ｇＲＮＡ分子またはｇ
ＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９分子をコードする核酸とは
、２つ以上の組成物に製剤化される。２つ以上の組成物を含む実施形態において、２つ以
上の組成物は同時にまたは逐次的に送達される。実施形態において、細胞は動物細胞、例
えば、哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞である。実施形態において、細胞は造血
幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）であり、例えば細胞はＣＤ３
４＋細胞であり、例えば細胞はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である。実施形態において、細
胞は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物中に配置される。実施
形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は骨髄、動員末梢血または臍帯血から単離さ
れている。実施形態において、細胞は、前記細胞の投与を受ける患者にとって自己由来で
ある。他の実施形態において、細胞は、前記細胞の投与を受ける患者にとって同種異系由
来である。実施形態において、本方法は、１つ以上のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相
補的なゲノムＤＮＡ配列にまたはその近傍にインデル、例えば、図２５、表１５、表２６
、表２７または表３７に示されるインデル、例えば、図２５、表１５、表２６、表２７ま
たは表３７に示されるとおりのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに関連するインデルをもた
らす。実施形態において、インデルは、約４０ヌクレオチド未満、例えば３０ヌクレオチ
ド未満、例えば２０ヌクレオチド未満、例えば１０ヌクレオチド未満の挿入または欠失で
あり、例えば、単一のヌクレオチド欠失である。実施形態において、本方法は、集団の少
なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少な
くとも約８０％、例えば少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９５％、少なくとも
約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の細
胞が改変されている、例えばインデルを含む細胞の集団をもたらす。実施形態において、
本方法（例えば、細胞の集団、例えば本明細書に記載される細胞の集団に対して実施され
る方法）は、赤血球系統の分化細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞（例
えば、細胞の集団）をもたらし、ここで、前記分化細胞は、例えば非改変細胞（例えば、
細胞の集団）と比べて胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈する。実施形態において、
本方法は、分化細胞の集団、例えば、赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集
団）への分化能を有する細胞の集団をもたらし、ここで、前記分化細胞の集団は、例えば
非改変細胞の集団と比べてＦ細胞の増加した（例えば、少なくとも約１５％、少なくとも
約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％高い）
割合を有する。実施形態において、本方法は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例え
ば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞をもたらし、ここで、前記分化細胞は１細胞当
たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピ
コグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、または約８～約９
ピコグラム、または約９～約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態
において、本方法はエキソビボで実施される。他の実施形態において、本方法はインビボ
で実施される。
別の態様において、本発明は、前出の方法の態様および実施形態のいずれかの細胞を改
変する方法によって改変された細胞を提供する。
別の態様において、本発明は、前出の方法の態様および実施形態のいずれかの細胞を改
変する方法によって得ることが可能な細胞を提供する。
別の態様において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載される第
１のｇＲＮＡ分子、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの第１
のｇＲＮＡ分子、または組成物、例えば、本明細書に記載される組成物、例えば、前出の
組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物、核酸、例えば、本明細書に記載される
核酸、例えば、前出の核酸の態様および実施形態のいずれかの核酸、またはベクター、例
えば、本明細書に記載されるベクター、例えば、前出のベクターの態様および実施形態の
いずれかのベクターを含む細胞を提供する。実施形態において、本細胞は、Ｃａｓ９分子
、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子、例えば、配列番号６６１１、配列番号７
８２１、配列番号７８２２、配列番号７８２３、配列番号７８２４、配列番号７８２５、
配列番号７８２６、配列番号７８２７、配列番号７８２８、配列番号７８２９、配列番号
７８３０、または配列番号７８３１のいずれかを含む、例えばそれからなるＣａｓ９分子
をさらに含む。実施形態において、細胞は、第２のｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記
載される第２のｇＲＮＡ分子、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいず
れかの第２のｇＲＮＡ分子、または第２のｇＲＮＡ分子をコードする、例えば、本明細書
に記載される第２のｇＲＮＡ分子をコードする、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様およ
び実施形態のいずれかの第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含むか、それを含んでい
たか、またはそれを含むことになり、ここで、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子
とは同一でない標的化ドメインを含む。実施形態において、胎児ヘモグロビンの発現は、
ｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じ細胞型の細胞またはその子孫と比べて前
記細胞またはその子孫（例えば、その赤血球系子孫、例えば、その赤血球細胞子孫）にお
いて増加する。実施形態において、本細胞は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例え
ば、赤血球細胞）への分化能を有し、ここで、前記分化細胞は、例えばｇＲＮＡ分子を含
むように修飾されていない同じ型の細胞と比べて胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈
する。実施形態において、分化細胞（例えば、赤血球系統の細胞、例えば、赤血球細胞）
は、例えばｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じ型の細胞と比べて少なくとも
約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少な
くとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、または約８～約９ピコグラム、ま
たは約９～約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、本細
胞は、幹細胞増殖剤、例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、化合物１、化合物２
、化合物３、化合物４、またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１および化合物４）
である幹細胞増殖剤、例えば、化合物４である幹細胞増殖剤と接触させたもの、例えばエ
キソビボで接触させたものである。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形
態を含め、実施形態において、本細胞は、そこに導入されたｇＲＮＡ分子（本明細書に記
載されるとおりのもの、例えば、前述の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子）
の標的化ドメインと相補的なゲノムＤＮＡ配列にまたはその近傍にインデル、例えば、図
２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデル、例えば、そこに導入さ
れたｇＲＮＡ分子（本明細書に記載されるとおりのもの、例えば、前述の態様および実施
形態のいずれかのｇＲＮＡ分子）に関連する図２５、表１５、表２６、表２７または表３
７に示されるインデルを含む。実施形態において、インデルは、約４０ヌクレオチド未満
、例えば３０ヌクレオチド未満、例えば２０ヌクレオチド未満、例えば１０ヌクレオチド
未満の挿入または欠失であり、例えば、インデルは単一のヌクレオチド欠失である。前述
の細胞の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本
細胞は動物細胞であり、例えば、本細胞は哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞であ
る。前述の細胞の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態にお
いて、本細胞は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）であり、
例えば、本細胞はＣＤ３４＋細胞であり、例えば、本細胞はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞で
ある。前述の細胞の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態に
おいて、本細胞（例えば、細胞の集団）は骨髄、動員末梢血または臍帯血から単離されて
いる。前述の細胞の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態に
おいて、本細胞は、前記細胞の投与を受ける患者にとって自己由来である。実施形態にお
いて、本細胞は、前記細胞の投与を受ける患者にとって同種異系由来である。
別の態様において、本発明は、前出の細胞の態様および実施形態のいずれかの細胞を含
む細胞の集団を提供する。実施形態において、本集団の少なくとも約５０％、例えば少な
くとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なく
とも約９０％（例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％
、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の細胞が前出の細胞の態様および実
施形態のいずれかに係る細胞である。実施形態において、本細胞の集団は、分化細胞の集
団、例えば、赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、
ここで、前記分化細胞の集団は、例えば同じ型の非修飾細胞の集団と比べてＦ細胞の増加
した（例えば、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なく
とも約３０％、または少なくとも約４０％高い）割合を有する。実施形態において、分化
細胞の集団のＦ細胞は１細胞当たり平均で少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくと
も約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも
約１０ピコグラム、または約８～約９ピコグラム、または約９～約１０ピコグラム）の胎
児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、本集団は、１）少なくとも１ｅ６ ＣＤ
３４＋細胞／細胞を投与する患者の体重ｋｇ；２）少なくとも２ｅ６ ＣＤ３４＋細胞／
細胞を投与する患者の体重ｋｇ；３）少なくとも３ｅ６ ＣＤ３４＋細胞／細胞を投与す
る患者の体重ｋｇ；４）少なくとも４ｅ６ ＣＤ３４＋細胞／細胞を投与する患者の体重
ｋｇ；または５）２ｅ６～１０ｅ６ ＣＤ３４＋細胞／細胞を投与する患者の体重ｋｇを
含む。実施形態において、本集団の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％（例
えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくと
も約９０％）の細胞がＣＤ３４＋細胞である。実施形態において、本集団の細胞の少なく
とも約１０％、例えば少なくとも約１５％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくと
も約３０％は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である。実施形態において、本細胞の集団は、
骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）、臍帯血、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に
由来する。好ましい実施形態において、本細胞の集団は骨髄に由来する。実施形態におい
て、本細胞の集団は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞を含む、例えばそれからなる。実施
形態において、本細胞の集団は、それが投与される患者にとって自己由来である。他の実
施形態において、細胞の集団は、それが投与される患者にとって同種異系由来である。
別の態様において、本発明は、前出の細胞の態様および実施形態のいずれかの細胞、ま
たは前出の細胞の集団の態様および実施形態のいずれかの細胞の集団を含む組成物を提供
する。実施形態において、本組成物は、薬学的に許容可能な媒体、例えば、凍結保存に好
適な薬学的に許容可能な媒体を含む。
別の態様において、本発明は、前出の細胞の態様および実施形態のいずれかの細胞、前
出の細胞の集団の態様および実施形態のいずれかの細胞の集団、または前出の組成物の態
様および実施形態のいずれかの組成物を患者に投与するステップを含む、異常ヘモグロビ
ン症を治療する方法を提供する。実施形態において、異常ヘモグロビン症はサラセミア、
例えば、β－サラセミア、または鎌状赤血球症である。
別の態様において、本発明は、前出の細胞の態様および実施形態のいずれかの細胞、前
出の細胞の集団の態様および実施形態のいずれかの細胞の集団、または前出の組成物の態
様および実施形態のいずれかの組成物を患者に投与するステップを含む、哺乳動物におけ
る胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法を提供する。
別の態様において、本発明は、（ａ）細胞（例えば、細胞の集団）（例えば、ＨＳＰＣ
（例えば、ＨＳＰＣの集団））を提供するステップ；（ｂ）幹細胞増殖剤を含む細胞培養
培地中で前記細胞（例えば、前記細胞の集団）をエキソビボで培養するステップ；および
（ｃ）第１のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、前出のｇＲＮ
Ａ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子）、第１のｇＲＮＡ分子（例えば
、本明細書に記載されるもの、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいず
れかのｇＲＮＡ分子）をコードする核酸分子、組成物（例えば、本明細書に記載されるも
の、例えば、前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物）、核酸（例えば、
本明細書に記載されるもの、例えば、前出の核酸の態様および実施形態のいずれかの核酸
）、またはベクター（例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、前出のベクターの態
様および実施形態のいずれかのベクター）を前記細胞に導入するステップを含む、細胞（
例えば、細胞の集団）を調製する方法を提供する。前記方法の実施形態において、前記ス
テップ（ｃ）の導入の後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、分化細胞（例えば、分化
細胞の集団）、例えば、赤血球系統の細胞（例えば、赤血球系統の細胞の集団）、例えば
、赤血球細胞（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、ここで、前記分化細胞（
例えば、分化細胞の集団）は、例えばステップ（ｃ）に供されていない同じ細胞と比べて
増加した胎児ヘモグロビンを産生する。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにお
ける実施形態を含め、実施形態において、幹細胞増殖剤は、化合物１、化合物２、化合物
３、化合物４またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１および化合物４）であり、例
えば化合物４である。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含
め、実施形態において、細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガン
ド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む。前述の方法の態様および
実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、細胞培養培地はヒトイ
ンターロイキン－６（ＩＬ－６）をさらに含む。前述の方法の態様および実施形態のいず
れかにおける実施形態を含め、実施形態において、細胞培養培地は、トロンボポエチン（
Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をそれ
ぞれ約１０ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えばそれぞれ約５０ｎｇ
／ｍＬの濃度、例えば５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。前述の方法の態様および実施形態の
いずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、細胞培養培地はヒトインターロイ
キン－６（ＩＬ－６）を約１０ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えば
約５０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。前述の方法の態様および
実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、細胞培養培地は幹細胞
増殖剤を約１ｎＭ～約１ｍＭの範囲の濃度、例えば約１μＭ～約１００μＭの範囲の濃度
、例えば約５０μＭ～約７５μＭの範囲の濃度、例えば約５０μＭの濃度、例えば５０μ
Ｍの濃度、または約７５μＭの濃度、例えば７５μＭの濃度で含む。前述の方法の態様お
よび実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ｂ）の
培養はステップ（ｃ）の導入の前の培養期間を含み、例えば、ステップ（ｃ）の導入の前
の培養期間は少なくとも１２時間であり、例えば約１日～約３日の期間であり、例えば約
１日～約２日の期間であり、例えば約２日の期間である。前述の方法の態様および実施形
態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ｂ）の培養はステ
ップ（ｃ）の導入の後の培養期間を含み、例えば、ステップ（ｃ）の導入の後の培養期間
は少なくとも１２時間であり、例えば約１日～約１０日の期間であり、例えば約１日～約
５日の期間であり、例えば約２日～約４日の期間であり、例えば約２日の期間であり、ま
たは約３日の期間であり、または約４日の期間である。前述の方法の態様および実施形態
のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、細胞の集団は、例えばステップ
（ｂ）により培養されていない細胞と比べて少なくとも４倍、例えば、少なくとも５倍、
例えば、少なくとも１０倍増殖する。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおけ
る実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ｃ）の導入は、エレクトロポレーショ
ン、例えば、１～５パルス、例えば１パルスを含むエレクトロポレーションを含み、ここ
で、各パルスは７００ボルト～２０００ボルトの範囲のパルス電圧であり、かつ１０ｍｓ
～１００ｍｓの範囲のパルス持続時間を有する。前述の方法の態様および実施形態のいず
れかにおける実施形態を含め、実施形態において、エレクトロポレーションは１パルスを
含む、例えばそれからなる。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形
態を含め、実施形態において、パルス電圧は１５００～１９００ボルトの範囲であり、例
えば１７００ボルトである。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形
態を含め、実施形態において、パルス持続時間は１０ｍｓ～４０ｍｓの範囲であり、例え
ば２０ｍｓである。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め
、実施形態において、ステップ（ａ）で提供される細胞（例えば、細胞の集団）はヒト細
胞（例えば、ヒト細胞の集団）である。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにお
ける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ａ）で提供される細胞（例えば、細
胞の集団）は骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）、臍帯血、または人工多能性幹細胞（
ｉＰＳＣ）、好ましくは骨髄から単離されたものである。前述の方法の態様および実施形
態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ａ）で提供される
細胞（例えば、細胞の集団）は骨髄から単離されたもの、例えば、異常ヘモグロビン症に
罹患している患者の骨髄から単離されたものである。前述の方法の態様および実施形態の
いずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ａ）で提供される細胞
の集団は、ＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞に関して富化されている。前述の方法の態様
および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ｃ）
の導入の後、細胞（例えば、細胞の集団）は凍結保存される。前述の方法の態様および実
施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ｃ）の導入の
後、細胞（例えば、細胞の集団）は、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相補的なゲ
ノムＤＮＡ配列にまたはその近傍にインデル、例えば、図２５、表１５、表２６、表２７
または表３７に示されるインデル、例えば第１のｇＲＮＡ分子に関連するとおりの図２５
、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデルを含む。前述の方法の態様お
よび実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ｃ）の
導入の後、細胞の集団の細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約
７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約
９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％は、第１の
ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相補的なゲノムＤＮＡ配列にまたはその近傍にインデル
、例えば、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデル、例えば第
１のｇＲＮＡ分子に関連するとおりの図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示
されるインデルを含む。
別の態様において、本発明は、前出の態様および実施形態のいずれかの細胞調製方法に
よって得ることが可能な細胞（例えば、細胞の集団）を提供する。別の態様において、本
発明は、異常ヘモグロビン症（例えば、サラセミア（例えば、β－サラセミア）または鎌
状赤血球症）を治療する方法であって、前記細胞（例えば、細胞の集団）を含む組成物を
ヒト患者に投与するステップを含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、ヒト
患者の胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、前記細胞（例えば、細胞の集団
）を含む組成物を前記ヒト患者に投与するステップを含む方法を提供する。実施形態にお
いて、ヒト患者には、細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、例えば、前出の態様および実施形
態のいずれかの細胞調製方法によって得ることが可能な細胞）をヒト患者の体重１ｋｇ当
たり少なくとも約１ｅ６個含む、例えば、前出の態様および実施形態のいずれかの細胞調
製方法によって得ることが可能なＣＤ３４＋細胞をヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくと
も約１ｅ６個含む組成物が投与される。実施形態において、ヒト患者には、細胞（例えば
、ＣＤ３４＋細胞、例えば、前出の態様および実施形態のいずれかの細胞調製方法によっ
て得ることが可能な細胞）をヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個含む、例
えば、前出の態様および実施形態のいずれかの細胞調製方法によって得ることが可能なＣ
Ｄ３４＋細胞をヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個含む組成物が投与され
る。実施形態において、ヒト患者には、細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、例えば、前出の
態様および実施形態のいずれかの細胞調製方法によって得ることが可能な細胞）をヒト患
者の体重１ｋｇ当たり約２ｅ６～約１０ｅ６個含む、例えば、前出の態様および実施形態
のいずれかの細胞調製方法によって得ることが可能なＣＤ３４＋細胞をヒト患者の体重１
ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６～約１０ｅ６個含む組成物が投与される。
別の態様において、本発明は、薬剤として用いられる、本明細書に記載されるｇＲＮＡ
分子、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子、本
明細書に記載される組成物、例えば、前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの組
成物、本明細書に記載される核酸、例えば、前出の核酸の態様および実施形態のいずれか
の核酸、本明細書に記載されるベクター、例えば、前出のベクターの態様および実施形態
のいずれかのベクター、本明細書に記載される細胞、例えば、前出の細胞の態様および実
施形態のいずれかの細胞、または本明細書に記載される細胞の集団、例えば、前出の細胞
の集団の態様および実施形態のいずれかの細胞の集団を提供する。
別の態様において、本発明は、薬剤の製造に用いられる、本明細書に記載されるｇＲＮ
Ａ分子、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子、
本明細書に記載される組成物、例えば、前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの
組成物、本明細書に記載される核酸、例えば、前出の核酸の態様および実施形態のいずれ
かの核酸、本明細書に記載されるベクター、例えば、前出のベクターの態様および実施形
態のいずれかのベクター、本明細書に記載される細胞、例えば、前出の細胞の態様および
実施形態のいずれかの細胞、または本明細書に記載される細胞の集団、例えば、前出の細
胞の集団の態様および実施形態のいずれかの細胞の集団を提供する。
別の態様において、本発明は、疾患の治療に用いられる、本明細書に記載されるｇＲＮ
Ａ分子、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子、
本明細書に記載される組成物、例えば、前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの
組成物、本明細書に記載される核酸、例えば、前出の核酸の態様および実施形態のいずれ
かの核酸、本明細書に記載されるベクター、例えば、前出のベクターの態様および実施形
態のいずれかのベクター、本明細書に記載される細胞、例えば、前出の細胞の態様および
実施形態のいずれかの細胞、または本明細書に記載される細胞の集団、例えば、前出の細
胞の集団の態様および実施形態のいずれかの細胞の集団を提供する。
別の態様において、本発明は、疾患の治療に用いられる、本明細書に記載されるｇＲＮ
Ａ分子、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子、
本明細書に記載される組成物、例えば、前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの
組成物、本明細書に記載される核酸、例えば、前出の核酸の態様および実施形態のいずれ
かの核酸、本明細書に記載されるベクター、例えば、前出のベクターの態様および実施形
態のいずれかのベクター、本明細書に記載される細胞、例えば、前出の細胞の態様および
実施形態のいずれかの細胞、または本明細書に記載される細胞の集団、例えば、前出の細
胞の集団の態様および実施形態のいずれかの細胞の集団を提供し、ここで、疾患は異常ヘ
モグロビン症、例えばサラセミア（例えば、β－サラセミア）または鎌状赤血球症である
。
Ｂｃｌ１１ａ ＋５８赤血球系エンハンサー領域のＣａｓ９編集。＋５８エンハンサー領域を標的とするｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡをリポフェクションによって送達した２４時間後にＨＥＫ－２９３ Ｃａｓ９ＧＦＰにおいてＮＧＳにより検出された編集の割合。各ドットが異なるｃｒＲＮＡを示し、ｔｒＲＮＡは一定とした。ゲノム座標は、例えばｈｇ３８をリファレンスとした２番染色体上の位置を示す。（ｎ＝１） Ｂｃｌ１１ａ ＋６２赤血球系エンハンサー領域のＣａｓ９編集。＋６２エンハンサー領域を標的とするｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡをリポフェクションによって送達した２４時間後にＨＥＫ－２９３ Ｃａｓ９ＧＦＰにおいてＮＧＳにより検出された編集の割合。各ドットが異なるｃｒＲＮＡを示し、ｔｒＲＮＡは一定とした。ゲノム座標は、例えばｈｇ３８をリファレンスとした２番染色体上の位置を示す。（ｎ＝１） Ｃａｓ９編集システム導入後の細胞の選択に関するゲーティング戦略。 Ｃａｓ９編集システムで処理したＣＤ３４＋細胞の遺伝子断片のアガロースゲル電気泳動（ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋およびＣＤ３４＋ＣＤ９０－細胞集団の両方を、ソートしていない参照細胞と共に示す）。上側のバンドは切断されていないホモ二重鎖ＤＮＡを表し、下側のバンドはヘテロ二重鎖ＤＮＡから生じた切断産物を示す。一番左寄りのレーンはＤＮＡラダーである。バンド強度はＩｍａｇｅＪソフトウェアによる未処理画像のピーク積分によって計算した。％遺伝子修飾（インデル）は以下のとおり計算したもの：％遺伝子修飾＝１００×（１－（１－切断割合）１／２）であり、ゲルの対応する各レーンの下に示す。 下線のヌクレオチドと相補的な標的化ドメインを含むｓｇＲＮＡ分子によって標的化されるゲノムＤＮＡの部位を示す赤血球系エンハンサー領域。 ＣＤ３４＋ ＨＳＣ細胞におけるｓｇＥＨ１（ＣＲ００２７６）（Ａ）によるインデル形成のＮＧＳ結果。挿入は大文字である。欠失は破線によって示す。切断部位近傍のマイクロホモロジー領域は太字下線で強調表示する。 ＣＤ３４＋ ＨＳＣ細胞におけるｓｇＥＨ２（ＣＲ００２７５）（Ｂ）によるインデル形成のＮＧＳ結果。挿入は大文字である。欠失は破線によって示す。切断部位近傍のマイクロホモロジー領域は太字下線で強調表示する。 ＣＤ３４＋ ＨＳＣ細胞におけるｓｇＥＨ８（ＣＲ００２７３）（Ｃ）によるインデル形成のＮＧＳ結果。挿入は大文字である。欠失は破線によって示す。切断部位近傍のマイクロホモロジー領域は太字下線で強調表示する。 ＣＤ３４＋ ＨＳＣ細胞におけるｓｇＥＨ９（ＣＲ００２７７）（Ｄ）によるインデル形成のＮＧＳ結果。挿入は大文字である。欠失は破線によって示す。切断部位近傍のマイクロホモロジー領域は太字下線で強調表示する。 ｇ７、ｇ８およびｇ２に関するＮＧＳ結果および複数のドナーにわたるインデルパターン形成。ｇ７およびｇ８を用いた２つのバイオロジカルレプリケート実験からの上位３つのインデルの配列は同一であり、ｇ２を用いた上位３つのインデルの配列は前の実験と同一であった。 修飾ｇＲＮＡ足場（ＢＣ）を用いたＮＧＳ結果およびインデルパターン形成。これらの実験からの上位３つのインデルの配列は標準ｇＲＮＡ足場の使用時に形成されるものと同一である。 異なる送達方法間におけるインデルパターンの比較。平均％は、指示されるインデルを呈するＮＧＳリードの％（２つの実験の平均）を指す。 非伸長フラッグポール領域（「ｒｅｇ」）または第１のフラッグポール伸長部および第１のｔｒａｃｒ伸長部有り（「ＢＣ」）のいずれかを有するｇ７ ｇＲＮＡとｇ８ ｇＲＮＡとの共導入によるインデル形成。これらの２つのｇＲＮＡのＰＡＭ配列は囲み線で囲む。 ＮＧＳによって計測したときの（ｎ＝３）、ＣＤ３４＋細胞におけるＢＣＬ１１ａ遺伝子の＋５８エンハンサー領域を指向する上位ｇＲＮＡ配列。 ＮＧＳによって計測したときの（ｎ＝３）、ＣＤ３４＋細胞におけるＢＣＬ１１ａ遺伝子の＋６２エンハンサー領域を指向する上位ｇＲＮＡ配列。 ＣＲ００１８７（薄い灰色のバー）またはＣＲ００２０２（濃い灰色のバー）のいずれかを一定として、指示されるｇＲＮＡの標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子と共に細胞に共挿入したときの、ＢＣＬ１１ ＋６２エンハンサー遺伝子座を標的とする２つのｇＲＮＡ分子をＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９細胞に導入したときの予想切り出しサイズ。 ＣＲ００１８７の標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子およびグラフに指示する第２のｇＲＮＡ分子を加えることによるＢＣＬ１１ａの＋６２エンハンサー内のゲノムＤＮＡの切り出し。星印（＊）は、３０％より高い頻度で観察された切り出しを示し、キャレット（＾）は、それより低い頻度（＜３０％）で観察された切り出しを示す。５０ｎｔ未満の断片をもたらす予想切り出し産物は区別することができなかった。 ＣＲ００２０２の標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子およびグラフに指示する第２のｇＲＮＡ分子を加えることによるＢＣＬ１１ａの＋６２エンハンサー内のゲノムＤＮＡの切り出し。星印（＊）は、３０％より高い頻度で観察された切り出しを示し、キャレット（＾）は、それより低い頻度（＜３０％）で観察された切り出しを示す。 フランス型ＨＰＦＨ領域に標的化された１９２個のｇＲＮＡ分子による％インデル形成（Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．「胎児ヘモグロビンサイレンシングに必要な機能エレメント（Ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｌｅｍｅｎｔ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｆｅｔａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７－８１４）。 ゲノム編集と続く遺伝子および表現型の特徴付けのための初代ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＰＣへのＣａｓ９：ｇＲＮＡリボ核タンパク質（Ｃａｓ９－ＲＮＰ）送達の実験スキーム。 ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣへのモックエレクトロポレーションまたはＣａｓ９－ＲＮＰ複合体のエレクトロポレーション後の細胞生存率。ＲＮＰ複合体のエレクトロポレーション後４８時間にわたってＨＳＰＣをインビトロで増殖させて、細胞生存率をモニタし、およびパーセント生存率を決定した。ＲＮＰ複合体の作製に使用したｇＲＮＡの名称をｘ軸に示し、対応する細胞生存率をｙ軸に示す。ＣＲｘｘｘｘ識別名はｇＲＮＡ分子の標的化ドメインを示す。 Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイを用いたミスマッチ検出。ヒトＨＳＣをエレクトロポレートしてＲＮＰ複合体を送達することにより、ＮＨＥＪによってＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーの＋５８ ＤＨＳ領域にインデルを導入した。標的領域にわたるＰＣＲアンプリコンをＴ７Ｅ１アッセイに供し、得られた断片を２％アガロースゲル電気泳動によって分析した。＋５８赤血球系エンハンサーＢＣＬ１１Ａの領域を両方のガイドＲＮＡフォーマットによって破壊した（デュアルガイドＲＮＡ－黒色；シングルガイドＲＮＡ－灰色（下のグラフ、および上のグラフのｇ７ＢＣＬ１１ａ－ＢＣ（１）およびｇ７ＢＣＬ１１Ａ－ＢＣ（２）））。ＤＮＡバンド強度をＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）によって推定することにより、編集されたアレルのパーセントを求めた。使用したｇＲＮＡの名称およびミスマッチ検出アッセイから求めた対応する遺伝子編集効率もゲル画像の下の表に示す。 次世代シーケンシングによるパーセントアレル編集。ラベルは図１８および図１９について記載されるとおりである。 ５つの選択のｇＲＮＡに関して観察されたコロニー数およびコロニーのタイプを示すコロニー形成細胞（ＣＦＣ）単位アッセイ。＋５８赤血球系エンハンサーで編集されたＨＳＰＣゲノムをメチルセルロースにプレーティングし、ＳＴＥＭｖｉｓｉｏｎを使用して形態学上および表現型上の基準を用いた成熟細胞の数およびタイプに基づきクローナルコロニーを分類およびカウントした。コロニーは、赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ－Ｅ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ－Ｅ）、顆粒球／マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ－ＧＭ）および顆粒球／赤血球／マクロファージ／巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ－ＧＥＭＭ）に分類された。 赤血球系分化中の細胞分裂の動態。赤血球系分化中、０、７、１４および２１日目に細胞の総数を決定し、細胞増殖倍数を計算した。 ゲノム編集および赤血球系分化後のＨＳＣにおけるＢＣＬ１１Ａ、γおよびβ－グロビンｍＲＮＡレベル。単系統赤血球系培養物におけるＢＣＬ１１Ａ、γおよびβ－グロビン鎖の相対ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲによって定量化した。転写物レベルはヒトＧＡＰＤＨ転写物レベルに対して正規化した。 ＢＣＬ１１ａエンハンサー（＋５８）を破壊するためのデュアルｇＲＮＡ／ｃａｓ９システムで達成されたＨＳＣの効率的編集により、高レベルのＨｂＦが誘導された。エレクトロポレーション後４８時間のＨＳＣをインビトロ赤血球系分化に供し、ＨｂＦ発現を計測した。７、１４および２１日目にＦＡＣＳ分析によってＨｂＦ陽性細胞（Ｆ－細胞）パーセントをモニタした。この図に示すデータは、ｄｇＲＮＡが指示される標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡシステムで作成した。 ＢＣＬ１１ａエンハンサー（＋５８）を破壊するためのｓｇＲＮＡ／ｃａｓ９システムで達成されたＨＳＣの効率的編集により、高レベルのＨｂＦが誘導された。エレクトロポレーション後４８時間のＨＳＣをインビトロ赤血球系分化に供し、ＨｂＦ発現を計測した。７、１４および２１日目にＦＡＣＳ分析によってＨｂＦ陽性細胞（Ｆ－細胞）パーセントをモニタした。この図に示すデータは、ｓｇＲＮＡが指示される標的化ドメインを含むｓｇＲＮＡシステムで作成した。 指示される標的化ドメインを含むｇＲＮＡによってＨＳＰＣに生じるインデルパターン。 細胞表面マーカー染色によるＣＤ３４＋細胞増殖培地中の編集済みおよび未編集培養物のフェノタイピング。ｇＲＮＡ分子は全てｄｇＲＮＡフォーマットで試験した。使用したＴｒａｃｒは配列番号７８０８であり、ｃｒＲＮＡは以下のフォーマットおよび配列を有した（２’Ｏ－メチル（ｍ）修飾およびホスホロチオエート結合（＊）修飾を示す）：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（式中、Ｎは、指示される標的化ドメインの残基である）。「材料および方法」に記載するとおり各抗体パネルまたは対応するアイソタイプ対照で染色した細胞の蛍光を示す代表的なドットプロットを示す。示される細胞は、生存細胞集団に関して前方・側方散乱特性およびＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）判別によって予めゲーティングした。プロットの上に名称を指示した各細胞集団のパーセンテージは、太線で囲んで示したゲートによって決定した。 細胞表面マーカー染色によるＣＤ３４＋細胞増殖培地中の編集済みおよび未編集培養物のフェノタイピング。ｇＲＮＡ分子は全てｄｇＲＮＡフォーマットで試験した。使用したＴｒａｃｒは配列番号７８０８であり、ｃｒＲＮＡは以下のフォーマットおよび配列を有した（２’Ｏ－メチル（ｍ）修飾およびホスホロチオエート結合（＊）修飾を示す）：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（式中、Ｎは、指示される標的化ドメインの残基である）。編集済みおよび未編集培養物中にある名称を指示した各細胞集団のパーセンテージを示す。編集済み培養物の標的化ドメインは指示されるとおりである。 ＨＰＦＨ領域内の２つの部位を標的とするｄｇＲＮＡを含むＲＮＰで編集したＣＤ３４＋細胞の集団から分化した赤血球における％Ｆ細胞。「ｇ２」は陽性対照であり（ＢＣＬ１１ａ遺伝子のコード領域に対する標的化ドメイン）、「ｃｎｔｒｌ」は陰性対照である（Ｃａｓ９のみの導入）。 指示されるｄｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）を含むＲＮＰのエレクトロポレーション後２日目のＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにおけるＮＧＳによって決定したときの％編集率。対照は、非修飾ＣＲ００３１７の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡ（ＣＲ００３１７－ｍ）、または緩衝液のみでのエレクトロポレーション（Ｃａｓ９またはｇＲＮＡなし；「モック」）を含む。 指示されるｄｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）を含むＲＮＰのエレクトロポレーション後２日目のＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにおけるＮＧＳによって決定したときの％編集率。対照は、緩衝液のみでのエレクトロポレーション（Ｃａｓ９またはｇＲＮＡなし；「モック」）を含む。 指示されるｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり。いずれの場合にも数字は標的化ドメインのＣＲｘｘｘｘｘｘ識別名に対応し、例えば、Ｕｎｍｏｄ ｓｇ３１２は、ＣＲ００３１２の標的化ドメインを含む非修飾ｓｇＲＮＡを指す）を含むＲＮＰのエレクトロポレーション後２日目のＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにおけるＮＧＳによって決定したときの％編集率。対照は、Ｃａｓ９タンパク質のみのエレクトロポレーション（「Ｃａｓ９」）、緩衝液のみによるエレクトロポレーション（「モック」）、またはエレクトロポレーションなし（「ＷＴ」）を含む。 指示されるｄｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）を含むＲＮＰでＣＤ３４＋ ＨＳＰＣをエレクトロポレートし、次に赤血球系分化培地中で培養することにより分化を誘導した後のＨｂＦ＋である正規化％赤血球（「モック」の％Ｆ細胞を減じた）。対照は、緩衝液のみのエレクトロポレーション（「モック」）を含む。 指示されるｄｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）を含むＲＮＰでＣＤ３４＋ ＨＳＰＣをエレクトロポレートし、次に赤血球系分化培地中で培養することにより分化を誘導した後のＨｂＦ＋である正規化％赤血球（「モック」の％Ｆ細胞を減じた）。対照は、緩衝液のみのエレクトロポレーション（「モック」）を含む。 指示されるｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり。いずれの場合にも数字は標的化ドメインのＣＲｘｘｘｘｘｘ識別名に対応し、例えば、Ｕｎｍｏｄ ｓｇ３１２は、ＣＲ００３１２の標的化ドメインを含む非修飾ｓｇＲＮＡを指す）を含むＲＮＰでＣＤ３４＋ ＨＳＰＣをエレクトロポレートし、次に赤血球系分化培地中で培養することにより分化を誘導した後のＨｂＦ＋である正規化％赤血球（「モック」の％Ｆ細胞を減じた）。対照は、Ｃａｓ９タンパク質およびｔｒａｃｒのみのエレクトロポレーション（「Ｃａｓ９＋ＴｒａｃＲＮＡのみ」）、緩衝液のみでのエレクトロポレーション（「細胞のみ＋パルス」）、またはエレクトロポレーションなし（「細胞のみ、パルスなし」）を含む。 指示されるｓｇＲＮＡ（いずれの場合でも、数字は標的化ドメインのＣＲｘｘｘｘｘｘ識別名に対応し、例えば、Ｕｎｍｏｄ ｓｇ３１２は、ＣＲ００３１２の標的化ドメインを含む非修飾ｓｇＲＮＡを指す）を含むＲＮＰをＣＤ３４＋細胞にエレクトロポレートした後の赤血球系分化後１４日目の培養物における総細胞増殖倍数。対照は、Ｃａｓ９タンパク質およびｔｒａｃｒのみのエレクトロポレーション（「Ｃａｓ９＋ＴｒａｃＲＮＡのみ」）、緩衝液のみでのエレクトロポレーション（「細胞のみ＋パルス」）、またはエレクトロポレーションなし（「細胞のみ、パルスなし」）を含む。 ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域を標的とするｄｇＲＮＡ分子によって導かれるＣａｓ９により切断された潜在的オフターゲット部位の評価。試験した各ガイドＲＮＡについて、三角はオンターゲット部位を表し、一方、白抜きの丸は潜在的オフターゲット部位を表す。 ＮＧＳおよびフローサイトメトリーによって判定したときの、種々のＣａｓ９変異体によるＣＤ３４＋造血幹細胞の標的Ｂ２Ｍ遺伝子座における編集効率。ＮＬＳ＝ＳＶ４０ ＮＬＳ、Ｈｉｓ６またはＨｉｓ８は、それぞれ６個または８個のヒスチジン残基を指し、ＴＥＶ＝タバコエッチウイルス切断部位、Ｃａｓ９＝野生型化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９－突然変異体または変異体は指示されるとおりである）。 データは、増殖培地で合計１０日間培養（エレクトロポレーション前に３日間培養、およびエレクトロポレーション後に７日間培養）した後の細胞数の増加倍数を示す。シングルおよびデュアルガイドＲＮＡフォーマットの両方を含め、試験した全てのガイドＲＮＡで細胞増殖は２～７倍の範囲であった。矢印で示すＣＲ００３１２およびＣＲ００１１２８は、１０日間の細胞増殖後に３～６倍の増加を実証した。ラベル「Ｃｒｘｘｘｘ」は、指示される標的化ドメインを有するｄｇＲＮＡを指し、「ｓｇｘｘｘｘ」は、同じ数字のＣＲｘｘｘｘｘ識別名の標的化ドメインを有するｓｇＲＮＡを指し（例えば、ｓｇ３１２はＣＲ００３１２の標的化ドメインを有する）、「Ｕｎｍｏｄ」は、そのＲＮＡに修飾がないことを示し、「Ｏ’ＭｅＰＳ」は、ｄｇＲＮＡに関して用いられるとき、非修飾ｔｒａｃｒとの組み合わせで、３つの３’および３つの５’ ２’－ＯＭｅ修飾およびホスホロチオエート結合を有するｃｒＲＮＡを指し、「Ｏ’ＭｅＰＳ」は、ｓｇＲＮＡに関して用いられるとき、３つの５’側端２’－ＯＭｅ修飾およびホスホロチオエート結合、３つの３’側端ホスホロチオエート結合、ならびに最後から４番目、最後から３番目および最後から２番目の３’ヌクレオチドの３つの２’ＯＭｅ修飾を有するｇＲＮＡを指す。 異なるＨＳＰＣサブ集団を区別するためのゲーティング戦略。 指示される培地（ＩＬ６、化合物４、またはＩＬ６と化合物４との両方を含む変法ＳＴＦ）中における４８時間のエキソビボ培養後、但しＣＲＩＳＰＲシステムのエレクトロポレーション前の各造血サブセットの頻度。ＳＴＦ＝ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ。 指示される培地（ＩＬ６、化合物４、またはＩＬ６と化合物４との両方を含む変法ＳＴＦ）で培養した、ＢＣＬ１１ａの＋５８エンハンサーを標的とするＣＲＩＳＰＲシステムを導入するエレクトロポレーション後７日の各造血サブセットの頻度。ＳＴＦ＝ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ。 種々のＲＮＰ濃度を用いて遺伝子編集したときの細胞生存率であり、ここで、ＲＮＰは、＋５８領域を標的とするｄｇＲＮＡを含有する。 種々のＲＮＰ濃度を用いて遺伝子編集したときの細胞生存率であり、ここで、ＲＮＰは、＋５８領域を標的とするｓｇＲＮＡを含有する。 種々のＲＮＰ濃度を用いて遺伝子編集したときのＮＧＳによって計測した遺伝子編集効率であり、ここで、ＲＮＰは、＋５８領域を標的とするｄｇＲＮＡを含有する。 種々のＲＮＰ濃度を用いて遺伝子編集したときのＮＧＳによって計測した遺伝子編集効率であり、ここで、ＲＮＰは、＋５８領域を標的とするｓｇＲＮＡを含有する。 種々のＲＮＰ濃度を用いて遺伝子編集したときのフローサイトメトリーによって計測したＨｂＦ誘導のパーセンテージであり、ここで、ＲＮＰは、＋５８領域を標的とするｄｇＲＮＡを含有する。 種々のＲＮＰ濃度を用いて遺伝子編集したときのフローサイトメトリーによって計測したＨｂＦ誘導のパーセンテージであり、ここで、ＲＮＰは、＋５８領域を標的とするｓｇＲＮＡを含有する。 種々のＣａｓ９タンパク質を含むＲＮＰの遺伝子編集効率。遺伝子編集は、種々のＣａｓ９変異体（Ｘ軸に挙げる）を非修飾バージョンのｓｇＲＮＡ ＣＲ００３１２およびｓｇＲＮＡ ＣＲ００１１２８、または修飾バージョンのｓｇＲＮＡ ＣＲ００３１２およびｓｇＲＮＡ ＣＲ００１１２８のいずれかと組み合わせて用いて実施した。編集した細胞はＮＧＳに供して％編集率（Ｙ軸）を決定した。 種々のＣａｓ９タンパク質を用いて遺伝子編集したときのＨｂＦ＋細胞の誘導。遺伝子編集は、種々のＣａｓ９変異体（Ｘ軸に挙げる）を非修飾バージョンのｓｇＲＮＡ ＣＲ００３１２およびｓｇＲＮＡ ＣＲ００１１２８、または修飾バージョンのｓｇＲＮＡ ＣＲ００３１２およびｓｇＲＮＡ ＣＲ００１１２８のいずれかと組み合わせて用いて実施した。編集した細胞は赤血球系統に分化させ、フルオロフォアをコンジュゲートした抗ＨｂＦ抗体を用いたフローサイトメトリーによってＨｂＦ産生を評価した。 指示されるｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）（ラベルは、表３６に指示するとおりのｇＲＮＡ配列を指す）を含むＲＮＰのエレクトロポレーションによるＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにおけるＮＧＳによって決定したときの％編集率。編集はエレクトロポレーションの２日後（黒色のバー）または６日後（灰色のバー）に決定した。Ｃａｓ９タンパク質およびＴｒａｃｒのみ（「なし」、データは示さず）の対照エレクトロポレーション後は各部位で１．５％未満の編集率が検出された。２つのエレクトロポレーションレプリケートの平均値＋標準偏差を示す。 指示されるｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）（ラベルは、表３６に指示するとおりのｇＲＮＡ配列を指す）を含むＲＮＰをＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにエレクトロポレートし、赤血球系分化条件で７日間培養した後のＣＤ７１＋である生存細胞のパーセント。エレクトロポレーション後、細胞は、実施例４．７に記載されるとおりのプロトコル１（黒色のバー）またはプロトコル２（灰色のバー）によって維持した。対照は、Ｃａｓ９タンパク質およびＴｒａｃｒのみのエレクトロポレーション（「なし」）を含む。２つのエレクトロポレーションレプリケートの平均値＋標準偏差を示す。 指示されるｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）（ラベルは、表３６に指示するとおりのｇＲＮＡ配列を指す）を含むＲＮＰをＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにエレクトロポレートし、赤血球系分化条件で７日間培養した後のＨｂＦ＋である赤血球系細胞のパーセント。エレクトロポレーション後、細胞は、実施例４．７に記載されるとおりのプロトコル１（黒色のバー）またはプロトコル２（灰色のバー）によって維持した。対照は、Ｃａｓ９タンパク質およびＴｒａｃｒのみのエレクトロポレーション（「なし」）を含む。２つのエレクトロポレーションレプリケートの平均値＋標準偏差を示す。 指示されるｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）（ラベルは、表３６に指示するとおりのｇＲＮＡ配列を指す）を含むＲＮＰをＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにエレクトロポレートし、赤血球系分化条件で１４日間培養した後のＨｂＦ＋である細胞のパーセント。エレクトロポレーション後、細胞は、実施例４．７に記載されるとおりのプロトコル１（黒色のバー）またはプロトコル２（灰色のバー）によって維持した。対照は、Ｃａｓ９タンパク質およびＴｒａｃｒのみのエレクトロポレーション（「なし」）を含む。２つのエレクトロポレーションレプリケートの平均値＋標準偏差を示す。 指示されるｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）（ラベルは、表３６に指示するとおりのｇＲＮＡ配列を指す）を含むＲＮＰをＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにエレクトロポレートし、赤血球系分化条件で２１日間培養した後のＨｂＦ＋である細胞のパーセント。エレクトロポレーション後、細胞は、実施例４．７に記載されるとおりのプロトコル１（黒色のバー）またはプロトコル２（灰色のバー）によって維持した。対照は、Ｃａｓ９タンパク質およびＴｒａｃｒのみのエレクトロポレーション（「なし」）を含む。２つのエレクトロポレーションレプリケートの平均値＋標準偏差を示す。 指示されるｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）（ラベルは、表３６に指示するとおりのｇＲＮＡ配列を指す）を含むＲＮＰをＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにエレクトロポレートした後の７日間（黒色のバー）または２１日間（黒色のバー）にわたる赤血球系分化培養での総細胞増殖倍数。エレクトロポレーション後、細胞は、実施例４．７に記載されるとおりのプロトコル２によって維持した。対照は、Ｃａｓ９タンパク質およびＴｒａｃｒのみのエレクトロポレーション（「なし」）を含む。２つのエレクトロポレーションレプリケートの平均値＋標準偏差を示す。 ＨＰＦＨ領域を標的とするｄｇＲＮＡ分子によって導かれるＣａｓ９により切断された潜在的オフターゲット部位の評価。試験した各ガイドＲＮＡについて、三角はオンターゲット部位を表し、一方、白抜きの丸は潜在的オフターゲット部位を表す。
定義
用語「ＣＲＩＳＰＲシステム」、「Ｃａｓシステム」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシ
ステム」は、一緒になって標的配列でＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクタ
ー分子による核酸の修飾を誘導し達成するのに必要かつ十分なＲＮＡガイド型ヌクレアー
ゼまたは他のエフェクター分子とｇＲＮＡ分子とを含む分子の組を指す。一実施形態にお
いて、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｇＲＮＡとＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク
質とを含む。Ｃａｓ９または修飾Ｃａｓ９分子を含むかかるシステムは、本明細書では「
Ｃａｓ９システム」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」と称される。一例におい
て、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ分子とは複合体化してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形
成し得る。
用語「ガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ分子」、「ｇＲＮＡ分子」または「ｇＲＮＡ」
は同義的に使用され、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子（典型的
にはｇＲＮＡ分子と複合体化している）が標的配列へ特異的に誘導されるよう促進する核
酸分子の組を指す。一部の実施形態において、前記誘導は、ｇＲＮＡの一部分がＤＮＡに
（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインを介して）ハイブリダイズすることを通じて、および
ｇＲＮＡ分子の一部分がＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子に（例
えば、少なくともｇＲＮＡ ｔｒａｃｒを介して）結合することにより達成される。実施
形態において、ｇＲＮＡ分子は単一の連続するポリヌクレオチド分子からなり、本明細書
において「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」などと称される。他の実施形態
において、ｇＲＮＡ分子は、それ自体が通常ハイブリダイゼーションを通じて会合する能
力を有する複数の、通常２つのポリヌクレオチド分子からなり、本明細書において「デュ
アルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」などと称される。ｇＲＮＡ分子について以下に
さらに詳細に記載するが、概して標的化ドメインとｔｒａｃｒとを含むものである。実施
形態において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは単一のポリヌクレオチドに配置される。
他の実施形態において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは別個のポリヌクレオチドに配置
される。
用語「標的化ドメイン」とは、この用語がｇＲＮＡに関連して使用されるとき、標的配
列、例えば、細胞の核酸内、例えば遺伝子内の標的配列を認識する、例えばそれと相補的
であるｇＲＮＡ分子の一部分である。
用語「ｃｒＲＮＡ」は、この用語がｇＲＮＡ分子に関連して使用されるとき、標的化ド
メインと、ｔｒａｃｒと相互作用してフラッグポール領域を形成する領域とを含むｇＲＮ
Ａ分子の一部分である。
用語「標的配列」は、ｇＲＮＡ標的化ドメインと相補的、例えば完全に相補的な核酸の
配列を指す。実施形態において、標的配列はゲノムＤＮＡ上に配置されている。ある実施
形態において、標的配列は、ヌクレアーゼ活性または他のエフェクター活性を有するタン
パク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列、例えばＣａｓ
９によって認識されるＰＡＭ配列に（ＤＮＡの同じ鎖上または相補鎖上のいずれかで）隣
接している。実施形態において、標的配列は、グロビン遺伝子の発現に影響を及ぼす遺伝
子内または遺伝子座内、例えばβグロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現に影
響を及ぼす遺伝子内または遺伝子座内にある標的配列である。実施形態において、標的配
列は、グロビン遺伝子座内にある標的配列である。実施形態において、標的配列は、ＢＣ
Ｌ１１ａ遺伝子内にある標的配列である。実施形態において、標的配列は、ＢＣＬ１１ａ
エンハンサー領域内にある標的配列である。実施形態において、標的配列は、ＨＰＦＨ領
域内にある標的配列である。
用語「フラッグポール」は、本明細書でｇＲＮＡ分子に関連して使用されるとき、ｃｒ
ＲＮＡとｔｒａｃｒとが互いに結合するかまたはハイブリダイズするｇＲＮＡの一部分を
指す。
用語「ｔｒａｃｒ」は、本明細書でｇＲＮＡ分子に関連して使用されるとき、ヌクレア
ーゼまたは他のエフェクター分子に結合するｇＲＮＡの一部分を指す。実施形態において
、ｔｒａｃｒは、Ｃａｓ９に特異的に結合する核酸配列を含む。実施形態において、ｔｒ
ａｃｒは、フラッグポールの一部を形成する核酸配列を含む。
用語「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９分子」は、ＤＮＡ切断に関与する細菌ＩＩ型ＣＲＩ
ＳＰＲ／Ｃａｓシステムの酵素を指す。Ｃａｓ９には、野生型タンパク質ならびにその機
能性および非機能性突然変異体も含まれる。実施形態において、Ｃａｓ９は化膿レンサ球
菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９である。
用語「相補的」は、核酸に関連して使用されるとき、ＡとＴまたはＵ、およびＧとＣの
塩基の対合を指す。相補的という用語は、完全に相補的である、すなわち参照配列全体に
わたってＡがＴまたはＵと対を形成し、およびＧがＣと対を形成する核酸分子、ならびに
少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％相補的な分子を指す。
「鋳型核酸」は、相同組換え修復または相同的組換えに関連して使用されるとき、切断
部位における遺伝子修復（挿入）のためＣＲＩＳＰＲシステムドナー配列によって修飾部
位に挿入される核酸を指す。
「インデル」は、本明細書においてこの用語が使用されるとき、ｇＲＮＡ分子を含む組
成物、例えばＣＲＩＳＰＲシステムへの曝露後に生じる、参照核酸と比べた１つ以上のヌ
クレオチド挿入、１つ以上のヌクレオチド欠失、またはヌクレオチド挿入および欠失の組
み合わせを含む核酸を指す。インデルは、ｇＲＮＡ分子を含む組成物に曝露した後の核酸
を例えばＮＧＳによってシーケンシングすることにより決定し得る。インデルの部位に関
して、インデルは、それが参照部位から約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、また
は１ヌクレオチドの範囲内に少なくとも１つの挿入または欠失を含むか、または前記参照
部位の一部または全てとオーバーラップしている（例えば、ｇＲＮＡ分子、例えば本明細
書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的な部位とオーバーラップしている
か、またはそれから１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチドの範
囲内にある少なくとも１つの挿入または欠失を含む）場合、参照部位（例えば、ｇＲＮＡ
分子の標的化ドメインと相補的な部位）「にあるかまたはその近傍にある」と言われる。
「インデルパターン」は、本明細書においてこの用語が使用されるとき、ｇＲＮＡ分子
を含む組成物への曝露後に生じるインデルの組を指す。ある実施形態において、インデル
パターンは、出現頻度を基準として上位３つのインデルからなる。ある実施形態において
、インデルパターンは、出現頻度を基準として上位５つのインデルからなる。ある実施形
態において、インデルパターンは、全シーケンシングリードに対して約５％より高い頻度
で存在するインデルからなる。ある実施形態において、インデルパターンは、インデルシ
ーケンシングリードの総数（すなわち、非修飾参照核酸配列からなるのでないリード）に
対して約１０％より高い頻度で存在するインデルからなる。ある実施形態において、イン
デルパターンは、上位５つの最も高頻度に観察されるインデルの任意の３つを含む。イン
デルパターンは、例えばｇＲＮＡ分子に曝露した細胞の集団の細胞をシーケンシングする
ことにより決定し得る。
「オフターゲットインデル」は、本明細書においてこの用語が使用されるとき、ｇＲＮ
Ａ分子の標的化ドメインの標的配列以外の部位にまたはその近傍にあるインデルを指す。
かかる部位は、ｇＲＮＡの標的化ドメインの配列と比べて例えば１、２、３、４、５個ま
たはそれを超えるミスマッチヌクレオチドを含み得る。例示的実施形態において、かかる
部位は、インシリコで予想されるオフターゲット部位の標的シーケンシングを用いるか、
または当該技術分野において公知の挿入法によって検出される。
用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の指示対象の１
つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）を指す。例として、「要素」は１つの要素
または２つ以上の要素を意味する。
量、時間的持続などの計測可能な値に言及するときの用語「約」は、指定される値から
±２０％または一部の例では±１０％、または一部の例では±５％、または一部の例では
±１％、または一部の例では±０．１％の変動を（かかる変動が本開示の方法の実施に適
切であるものとして）包含することが意図される。
用語「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答には
、抗体産生、または特異的免疫適格細胞の活性化のいずれか、または両方が含まれ得る。
当業者は、任意の巨大分子が、事実上あらゆるタンパク質またはペプチドを含めて、抗原
となり得ることを理解するであろう。さらに、抗原は組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに
由来し得る。当業者は、したがって免疫応答を生じさせるタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、その用語が本明細書に
おいて使用されるとおりの「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業
者は、抗原が、ある遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はな
いことを理解するであろう。本発明には、限定はされないが、２つ以上の遺伝子の部分的
ヌクレオチド配列の使用が含まれること、およびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫
応答を生じさせるポリペプチドをコードするように様々な組み合わせで配列されることは
容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は
全くないことを理解するであろう。抗原は合成してもよく、もしくは生体試料から得ても
よく、またはポリペプチド以外の巨大分子である可能性もあることは容易に明らかである
。かかる生体試料には、限定はされないが、組織試料、細胞または他の生物学的成分を含
む体液が含まれ得る。
用語「自己由来」は、後にそれが再び導入されることになる同じ個体に由来する任意の
材料を指す。
用語「同種異系由来」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意
の材料を指す。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でないとき、互い
に同種異系由来であると言われる。一部の態様において、同じ種の個体からの同種異系由
来材料は、抗原として相互作用するのに遺伝的に十分に異なるものであり得る。
用語「異種」は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
「～に由来する」は、その用語が本明細書において使用されるとき、第１の分子と第２
の分子との間の関係を示す。これは、概して、第１の分子と第２の分子との間の構造的類
似性を指し、第２の分子に由来する第１の分子に対するプロセスまたは供給源の限定は含
意または包含しない。
用語「コードする」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなど、ポリヌクレオチド中
の特異的ヌクレオチド配列が、定義付けられたヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔ
ＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定義付けられたアミノ酸配列のいずれかおよびそれから生
じる生物学的特性を有する生物学的過程における他のポリマーおよび巨大分子の合成用鋳
型としての役割を果たす固有の特性を指す。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮ
Ａは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳によって細胞または他の生物学的
システムでタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配
列がｍＲＮＡ配列と同一で、通常配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡ
の転写用鋳型として用いられる非コード鎖との両方が、その遺伝子またはｃＤＮＡのタン
パク質または他の産物をコードすると称され得る。
特記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バ
ージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を全て含む。タンパク
質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句には、そのタンパク質をコード
するヌクレオチド配列が何らかのバージョンで１つまたは複数のイントロンを含み得る限
りにおいて、イントロンも含まれ得る。
用語「有効量」または「治療有効量」は、本明細書では同義的に使用され、本明細書に
記載されるとおりの化合物、製剤、材料、または組成物が特定の生物学的結果を達成する
のに有効な量を指す。
用語「内因性」は、生物、細胞、組織または系由来のまたはその内部で産生される任意
の材料を指す。
用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系の外側から導入されるかまたはその外側
で産生される任意の材料を指す。
用語「発現」は、プロモーターによってドライブされる特定のヌクレオチド配列の転写
および／または翻訳を指す。
用語「トランスファーベクター」は、単離核酸を含む組成物であって、細胞の内部への
単離核酸の送達に使用し得る組成物を指す。限定はされないが、線状ポリヌクレオチド、
イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイル
スを含め、多くのベクターが当該技術分野において公知である。したがって、用語「トラ
ンスファーベクター」には自己複製プラスミドまたはウイルスが含まれる。この用語はま
た、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸のトランスファーを促進
する非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むものと解釈されなければならない
。ウイルストランスファーベクターの例としては、限定はされないが、アデノウイルスベ
クター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクタ
ーなどが挙げられる。
用語「発現ベクター」は、発現させるヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御
配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のため
の十分なシス作用エレメントを含む。他の発現用エレメントは宿主細胞によって供給する
か、またはインビトロ発現系に供給することができる。発現ベクターには、組換えポリヌ
クレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドまたはリポソームに含
まれるもの）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイル
ス、およびアデノ随伴ウイルス）を含め、当該技術分野において公知のもの全てが含まれ
る。
用語「相同」または「同一性」は、２つのポリマー分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子
または２つのＲＮＡ分子など、２つの核酸分子間、または２つのポリペプチド分子間にお
けるサブユニットの配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同
じ単量体サブユニットによって占有されるとき、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の位置
がアデニンによって占有される場合、それらはその位置で相同または同一である。２つの
配列間の相同性は、一致する位置または相同な位置の数の直接の関数である。例えば、２
つの配列における位置の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマーにおける５個の位
置）が相同である場合、それらの２つの配列は５０％相同である。位置の９０％（例えば
、１０個中９個）が一致するかまたは相同である場合、それらの２つの配列は９０％相同
である。
用語「単離されている」は、自然状態から改変されているかまたは取り出されているこ
とを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離さ
れている」のではないが、その自然状態の共存する材料から部分的または完全に分離され
た同じ核酸またはペプチドは「単離されている」。単離核酸またはタンパク質は、実質的
に精製された形態で存在することができ、または例えば宿主細胞など、非天然環境中に存
在することができる。
用語「作動可能に連結された」または「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列との間
における後者の発現をもたらす機能的な連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核
酸配列と機能的に関係した状態に置かれているとき、第１の核酸配列は第２の核酸配列と
作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響
を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結
されるＤＮＡ配列は互いに隣接していてもよく、例えば２つのタンパク質コード領域をつ
なぎ合わせる必要がある場合、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（
ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内注射、腫瘍内、または注入技法を含む。
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそのポリマーを指す。具体
的に限定しない限り、この用語には、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ天然に存在
するヌクレオチドと同じように代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸
が包含される。特に指示されない限り、ある詳細な核酸配列がまた、黙示的に、その保存
的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、およ
び相補配列ならびに明示的に指示される配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換は
、１つ以上の選択の（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデ
オキシイノシン残基で置換されている配列を作成することによって達成し得る（Ｂａｔｚ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）
；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０
８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏ
ｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は同義的に使用され、ペ
プチド結合によって共有結合的に連結したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タン
パク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質
の配列またはペプチドの配列を含むことのできるアミノ酸の最大数に制限は課されない。
ポリペプチドは、互いにペプチド結合によってつなぎ合わされた２つ以上のアミノ酸を含
む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用されるとき、この用語は、当
該技術分野では、一般に例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される
短鎖と、当該技術分野では概してタンパク質と称される、多数の種類があるより長い鎖と
の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同な
ポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修
飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が特に含まれる。ポリペプチドには、
天然ペプチド、組換えペプチド、またはこれらの組み合わせが含まれる。
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるのに必要で
ある、細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す
。
用語「プロモーター／調節配列」は、そのプロモーター／調節配列に作動可能に連結さ
れた遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。一部の例では、この配列はコアプロモー
ター配列であってもよく、他の場合、この配列は、エンハンサー配列および遺伝子産物の
発現に必要な他の調節エレメントも含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、遺伝
子産物を組織特異的に発現するものであり得る。
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたはそれを指定するポリ
ヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、細胞のほとんどまたは全ての生理条件下
で細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたはそれを指定するポリ
ヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的にプロモーターに対応する誘発物
質が細胞に存在する場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド
配列を指す。
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするかまたはそれによって指定さ
れるポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的に細胞がプロモーターに
対応する組織型の細胞である場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌク
レオチド配列を指す。
本明細書でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に関連して使用されるとき、５’キャッ
プ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７－メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ ｍ７Ｇキャッ
プとも称される）は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「前」または５’
末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、１番目の転写ヌク
レオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮア
ーゼからの保護に重要である。キャップ付加は転写と結び付いており、それぞれが他方に
影響を与えるようにして同時転写的に起こる。転写開始直後、合成されるｍＲＮＡの５’
末端に、ＲＮＡポリメラーゼに関連するキャップ合成複合体が結合する。この酵素複合体
が、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は多段階生化学反応として
進行する。キャッピング部分は、ｍＲＮＡのその安定性または翻訳効率などの機能を調整
するため修飾することができる。
本明細書で使用されるとき、「インビトロ転写ＲＮＡ」は、インビトロ合成されたＲＮ
Ａ、好ましくはｍＲＮＡを指す。概して、インビトロ転写ＲＮＡはインビトロ転写ベクタ
ーから作成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡの作成に使用され
る鋳型を含む。
本明細書で使用されるとき、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに付
加される一連のアデノシンである。一過性発現用のコンストラクトの好ましい実施形態に
おいて、ポリＡは５０～５０００（配列番号６５９６）、好ましくは６４より多く、より
好ましくは１００より多く、最も好ましくは３００または４００より多い。ポリ（Ａ）配
列は、局在性、安定性または翻訳効率などのｍＲＮＡ機能を調整するために化学的または
酵素的に修飾することができる。
本明細書で使用されるとき、「ポリアデニル化」は、メッセンジャーＲＮＡ分子へのポ
リアデニリル部分またはその修飾変異体の共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメ
ッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子が３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ（Ａ
）テールは、酵素、ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によってｍＲＮＡ前駆体に付加さ
れるアデニンヌクレオチドの長い配列（多くの場合に数百個）である。高等真核生物では
、ポリ（Ａ）テールは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含有する転写物に付加さ
れる。ポリ（Ａ）テールおよびそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレア
ーゼによる分解から保護するのに役立つ。ポリアデニル化は、転写終結、核からのｍＲＮ
Ａの搬出、および翻訳にも重要である。ポリアデニル化はＤＮＡからＲＮＡへの転写直後
に核内で起こるが、さらに後に細胞質でも起こり得る。転写が終了した後、ＲＮＡポリメ
ラーゼに関連するエンドヌクレアーゼ複合体の作用によってｍＲＮＡ鎖が切断される。切
断部位は、通常、切断部位近傍の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在によって特徴付けられる。
ｍＲＮＡが切断された後、切断部位の遊離３’末端にアデノシン残基が付加される。
本明細書で使用されるとき、「一過性」は、数時間、数日間または数週間の期間にわた
る組み込まれないトランス遺伝子の発現を指し、この発現期間は、宿主細胞のゲノムに組
み込まれた場合または安定プラスミドレプリコンの中に含まれている場合の遺伝子の発現
期間よりも短い。
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療」および「治療している」は、
１つ以上の療法（例えば、本発明のｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲシステム、または修飾細
胞など、１つ以上の療法剤）の投与によってもたらされる障害、例えば異常ヘモグロビン
症の進行、重症度および／または持続期間の低減または改善、または障害、例えば異常ヘ
モグロビン症の１つ以上の症状（好ましくは、１つ以上の認識し得る症状）の改善を指す
。具体的な実施形態において、用語「治療する」、「治療」および「治療している」は、
患者には認識できない、異常ヘモグロビン症障害の少なくとも１つの計測可能な理学的パ
ラメータの改善を指す。他の実施形態において、用語「治療する」、「治療」および「治
療している」は、障害の進行の物理的な、例えば認識し得る症状の安定化による阻害、生
理学的な、例えば理学的パラメータの安定化による阻害のいずれか、または両方を指す。
他の実施形態において、用語「治療する」、「治療」および「治療している」は、異常ヘ
モグロビン症、例えば鎌状赤血球症またはβ－サラセミアの症状の低減または安定化を指
す。
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達
において役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。語句「細胞表面
受容体」は、シグナルを受け取り、細胞の膜を越えてシグナルを伝える分子および分子複
合体を含む。
用語「対象」は、免疫応答を生じさせることのできる生きている生物（例えば、哺乳動
物、ヒト）を含むことが意図される。
用語の「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実
質的に精製された細胞とは、その天然に存在する状態でそれが通常結び付いている他の細
胞型と分離されている細胞も指す。一部の例では、実質的に精製された細胞の集団とは、
均質な細胞の集団を指す。他の例では、この用語は単に、その自然状態でそれが天然に結
び付いている細胞から分離されている細胞を指す。一部の態様において、これらの細胞は
インビトロで培養される。他の態様において、これら細胞はインビトロで培養されない。
用語「療法的」とは、本明細書で使用されるとき、治療を意味する。療法的効果は疾患
状態の低減、抑制、寛解、または根絶によって達成される。
用語「予防」とは、本明細書で使用されるときに疾患または疾患状態の予防または防御
的治療を意味する。
用語「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」
は、外因性核酸および／またはタンパク質を宿主細胞に移入させるかまたは導入するプロ
セスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入さ
れた」細胞は、外因性核酸および／またはタンパク質をトランスフェクトされた、形質転
換された、または形質導入されたものである。細胞には初代対象細胞およびその子孫が含
まれる。
用語「特異的に結合する」は、試料中に存在する結合パートナー（例えば、タンパク質
または核酸）を認識してそれと結合する分子であって、しかし試料中の他の分子を実質的
に認識または結合しない分子を指す。
用語「生物学的に均等」は、参照用量または参照量の参照化合物によって生じる効果と
均等な効果を生じさせるのに必要な量の参照化合物以外の薬剤を指す。
「不応性」は、本明細書で使用されるとき、治療に応答しない疾患、例えば異常ヘモグ
ロビン症を指す。実施形態において、不応性異常ヘモグロビン症は治療の開始前または開
始時点で治療に抵抗性であり得る。他の実施形態において、不応性異常ヘモグロビン症は
治療中に抵抗性になり得る。不応性異常ヘモグロビン症は抵抗性異常ヘモグロビン症とも
称される。
「再発性」は、本明細書で使用されるとき、改善期間後、例えば、ある療法、例えば異
常ヘモグロビン症療法の先行治療後に異常ヘモグロビン症などの疾患（例えば、異常ヘモ
グロビン症）または疾患の徴候および症状が再来することを指す。
範囲：本開示全体を通じて、本発明の様々な態様が範囲の形式で提示され得る。範囲の
形式による記載は単に便宜上のものであり、簡潔にするために過ぎないことが理解されな
ければならず、本発明の範囲を柔軟性なく限定するものと解釈されてはならない。したが
って、範囲の記載は、あらゆる可能な部分的範囲ならびにその範囲内にある個々の数値を
具体的に開示したものと見なされなければならない。例えば、１～６のような範囲の記載
は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分的範囲、ならびにその
範囲内にある個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を具体
的に開示したものと見なされなければならない。別の例として、９５～９９％の同一性の
ような範囲には、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するあるも
のが含まれ、および９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～
９８％および９８～９９％の同一性などの部分的範囲が含まれる。これは範囲の広さとは
無関係に適用される。
用語「ＢＣＬ１１ａ」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩコアプロモーター近接領域配列特異
的ＤＮＡ結合タンパク質であるＢ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ、および前記タンパク質を
コードする遺伝子を、全てのイントロンおよびエクソンと共に指す。この遺伝子はＣ２Ｈ
２型ジンクフィンガータンパク質をコードする。ＢＣＬ１１Ａは、胎児ヘモグロビン産生
の抑制において役割を果たすことが分かっている。ＢＣＬ１１ａは、Ｂ細胞ＣＬＬ／リン
パ腫１１Ａ（ジンクフィンガータンパク質）、ＣＴＩＰ１、ＥＶＩ９、エコトロピックウ
イルス組込み部位９タンパク質ホモログ、ＣＯＵＰ－ＴＦ相互作用タンパク質１、ジンク
フィンガータンパク質８５６、ＫＩＡＡ１８０９、ＢＣＬ－１１Ａ、ＺＮＦ８５６、ＥＶ
Ｉ－９、およびＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａとしても知られる。この用語にはＢＣＬ１
１ａのあらゆるアイソフォームおよびスプライス変異体が包含される。ＢＣＬ１１ａをコ
ードするヒト遺伝子は染色体位置２ｐ１６．１にマッピングされる（Ｅｎｓｅｍｂｌによ
る）。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔお
よびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースを参照することができ、およびヒトＢ
ＣＬ１１ａのゲノム配列はＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＣ＿０００００２．１２を参照する
ことができる。ＢＣＬ１１ａ遺伝子は、全てのイントロンおよびエクソンを含め、このゲ
ノム位置を指す。ＢＣＬ１１ａには複数の既知のアイソタイプがある。
ヒトＢＣＬ１１ａのアイソフォーム１をコードするｍＲＮＡの配列はＮＭ＿０２２８９
３を参照することができる。
ヒトＢＣＬ１１ａのアイソフォーム１のペプチド配列は以下である。
他のＢＣＬ１１ａタンパク質アイソフォームの配列は以下に提供される。
アイソフォーム２：Ｑ９Ｈ１６５－２
アイソフォーム３：Ｑ９Ｈ１６５－３
アイソフォーム４：Ｑ９Ｈ１６５－４
アイソフォーム５：Ｑ９Ｈ１６５－５
アイソフォーム６：Ｑ９Ｈ１６５－６
本明細書で使用されるとき、ヒトＢＣＬ１１ａタンパク質には、その完全長にわたって
ＢＣＬ１１ａアイソフォーム１～６と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７
４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８
４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するタ
ンパク質も包含され、ここで、かかるタンパク質はなおもＢＣＬ１１ａの機能の少なくと
も１つを有する。
用語「グロビン遺伝子座」は、本明細書で使用されるとき、胚（ε）、胎児（Ｇ（γ）
およびＡ（γ））、成人グロビン遺伝子（γおよびβ）、遺伝子座制御領域およびＤＮア
ーゼＩ高感受性部位の遺伝子を含むヒト１１番染色体の領域を指す。
用語「相補的」は、核酸に関連して使用されるとき、ＡとＴまたはＵ、およびＧとＣの
塩基の対合を指す。相補的という用語は、完全に相補的である、すなわち参照配列全体に
わたってＡがＴまたはＵと対を形成し、およびＧがＣと対を形成する核酸分子、ならびに
少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％相補的な分子を指す。
用語「ＨＰＦＨ」は遺伝性高胎児ヘモグロビン血症を指し、成人赤血球細胞における胎
児ヘモグロビンの増加を特徴とする。用語「ＨＰＦＨ領域」は、修飾されると（例えば、
突然変異または欠失すると）成人赤血球細胞におけるＨｂＦ産生の増加を引き起こすゲノ
ム部位を指し、文献に同定されているＨＰＦＨ部位が含まれる（例えば、Ｏｎｌｉｎｅ
Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／１４１７４９を参照されたい）。例示的実施形態におい
て、ＨＰＦＨ領域は、１１番染色体ｐ１５上のβグロビン遺伝子クラスター内にあるかま
たはそれを包含する領域である。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、δグロビン
遺伝子の少なくとも一部の範囲内にあるかまたはそれを包含する。例示的実施形態におい
て、ＨＰＦＨ領域は、ＨＢＧ１のプロモーターの領域である。例示的実施形態において、
ＨＰＦＨ領域は、ＨＢＧ１のプロモーターの領域である。例示的実施形態において、ＨＰ
ＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０
７－８１４に記載される領域である。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎ
ｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７－８１４に記載さ
れるとおりのフランス型ブレイクポイント欠失ＨＰＦＨである。例示的実施形態において
、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５
：８０７－８１４に記載されるとおりのアルジェリア型ＨＰＦＨである。例示的実施形態
において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１
）３６５：８０７－８１４に記載されるとおりのスリランカ型ＨＰＦＨである。例示的実
施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２
０１１）３６５：８０７－８１４に記載されるとおりのＨＰＦＨ－３である。例示的実施
形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０
１１）３６５：８０７－８１４に記載されるとおりのＨＰＦＨ－２である。ある実施形態
において、ＨＰＦＨ－１領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０
１１）３６５：８０７－８１４に記載されるとおりのＨＰＦＨ－３である。例示的実施形
態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１
１）３６５：８０７－８１４に記載されるとおりのスリランカ型（δβ）０－サラセミア
ＨＰＦＨである。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ
ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７－８１４に記載されるとおりのシチリ
ア型（δβ）０－サラセミアＨＰＦＨである。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は
、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７－８１４
に記載されるとおりのマケドニア型（δβ）０－サラセミアＨＰＦＨである。例示的実施
形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０
１１）３６５：８０７－８１４に記載されるとおりのクルド型β０－サラセミアＨＰＦＨ
である。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｃｈｒ１１：５２１３８７４～５２
１４４００（ｈｇ１８）に位置する領域である。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域
は、Ｃｈｒ１１：５２１５９４３～５２１５０４６（ｈｇ１８）に位置する領域である。
例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｃｈｒ１１：５２３４３９０～５２３８４８
６（ｈｇ３８）に位置する領域である。
「ＢＣＬ１１ａエンハンサー」は、本明細書においてこの用語が使用されるとき、ＢＣ
Ｌ１１ａの発現または機能に影響を及ぼす、例えばそれを増進させる核酸配列を指す。例
えば、Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３４２，２０１３，ｐｐ．
２５３－２５７を参照されたい。ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、例えば、ある種の細胞型
、例えば赤血球系統の細胞においてのみ作用することが可能であり得る。ＢＣＬ１１ａエ
ンハンサーの一例は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間の核酸配列（
例えば、ｈｇ３８に記録されているとおりの位置＋５５：Ｃｈｒ２：６０４９７６７６～
６０４９８９４１；＋５８：Ｃｈｒ２：６０４９４２５１～６０４９５５４６；＋６２：
Ｃｈｒ２：６０４９０４０９～６０４９１７３４にあるかまたはそれに対応する核酸）で
ある。ある実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエク
ソン２とエクソン３との間にある核酸配列の＋６２領域である。ある実施形態において、
ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間にあ
る核酸配列の＋５８領域である。ある実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、
ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間にある核酸配列の＋５５領域である
。
用語「造血幹細胞・前駆細胞」または「ＨＳＰＣ」は同義的に使用され、造血幹細胞（
「ＨＳＣ」）および造血前駆細胞（「ＨＰＣ」）の両方を含む細胞の集団を指す。かかる
細胞は、例えばＣＤ３４＋として特徴付けられる。例示的実施形態において、ＨＳＰＣは
骨髄から単離されたものである。他の例示的実施形態において、ＨＳＰＣは末梢血から単
離されたものである。他の例示的実施形態において、ＨＳＰＣは臍帯血から単離されたも
のである。
「幹細胞増殖剤」は、本明細書で使用されるとき、細胞、例えば、ＨＳＰＣ、ＨＳＣお
よび／またはＨＰＣを、前記薬剤がない同じ細胞型と比べて速い速度で増殖させる、例え
ば数を増加させる化合物を指す。例示的な一態様において、幹細胞増殖剤はアリール炭化
水素受容体経路の阻害剤である。幹細胞増殖剤のさらなる例は以下に提供する。実施形態
において、増殖、例えば数の増加はエキソビボで達成される。
「生着」または「生着する」は、レシピエント、例えば哺乳動物またはヒト対象の体内
への細胞または組織、例えばＨＳＰＣの集団の取込みを指す。一例において、生着は、レ
シピエントにおける生着細胞の成長、増殖および／または分化を含む。一例では、ＨＳＰ
Ｃの生着は、レシピエントの体内における前記ＨＳＰＣの赤血球系細胞への分化および成
長を含む。
用語「造血前駆細胞」（ＨＰＣ）は、本明細書で使用されるとき、自己複製能が限られ
た、かつ造血ヒエラルキー内における位置に応じて多系統分化（例えば、骨髄、リンパ）
、単系統分化（例えば、骨髄またはリンパ）または細胞型限定的分化（例えば、赤血球系
前駆細胞）の潜在的能力を有する原始的な造血細胞を指す（Ｄｏｕｌａｔｏｖ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１２）。
「造血幹細胞」（ＨＳＣ）は、本明細書で使用されるとき、自己複製して、顆粒球（例
えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網赤血球、赤血球）、
栓球（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、および単球（例えば、単球、マ
クロファージ）を含むより成熟した血球細胞に分化する能力を有する未熟血球細胞を指す
。本明細書全体を通じてＨＳＣは幹細胞と同義的に記載される。当該技術分野において、
かかる細胞はＣＤ３４＋細胞を含むこともまたは含まないこともあることは公知である。
ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４細胞表面マーカーを発現する未熟細胞である。ＣＤ３４＋細
胞は、上記に定義した幹細胞特性を有する細胞のサブ集団を占めると考えられる。ＨＳＣ
が、原始的前駆細胞（例えば、多能性前駆細胞）および／または特異的造血系統（例えば
、リンパ球前駆細胞）にコミットした前駆細胞を生じさせることができる多能性細胞であ
ることは当該技術分野において周知である。特異的造血系統にコミットした幹細胞は、Ｔ
細胞系統、Ｂ細胞系統、樹状細胞系統、ランゲルハンス細胞系統および／またはリンパ系
組織特異的マクロファージ細胞系統のものであり得る。加えて、ＨＳＣはまた、長期ＨＳ
Ｃ（ＬＴ－ＨＳＣ）および短期ＨＳＣ（ＳＴ－ＨＳＣ）も指す。ＳＴ－ＨＳＣはＬＴ－Ｈ
ＳＣよりも高活性かつ高増殖性である。しかしながら、ＬＴ－ＨＳＣは無制限の自己複製
を有し（すなわち、これは成人期を通して生存する）、一方、ＳＴ－ＨＳＣは自己複製が
限られている（すなわち、これは限られた期間のみ生存する）。本明細書に記載される方
法のいずれにおいても、これらのＨＳＣのいずれを使用することもできる。ＳＴ－ＨＳＣ
は高増殖性で、したがってＨＳＣおよびその子孫の数が急速に増加するため、任意選択で
ＳＴ－ＨＳＣが有用である。造血幹細胞は、任意選択で血液製剤から入手される。血液製
剤には、造血起源の細胞を含む身体または身体の臓器から得られた製剤が含まれる。かか
る供給源には、未分画骨髄、臍帯、末梢血（例えば、動員末梢血、例えば、Ｇ－ＣＳＦま
たはＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）などの動員剤で動員したもの
）、肝臓、胸腺、リンパおよび脾臓が含まれる。前述の粗製または未分画血液製剤は全て
、造血幹細胞特徴を有する細胞を当業者に公知の方法で富化することができる。ある実施
形態において、ＨＳＣはＣＤ３４＋／ＣＤ３８－／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ－として特
徴付けられる。実施形態において、ＨＳＣはＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞
として特徴付けられる。
細胞との関連において「増殖」または「増殖する」は、同じであってもまたは同じでな
くてもよい細胞の初期細胞集団からの１つまたは複数の特徴的細胞型の数の増加を指す。
増殖に使用される初期細胞は、増殖によって生じる細胞と同じでなくてもよい。
「細胞集団」は、生物学的供給源、例えば血液製剤または組織から単離された、かつ２
つ以上の細胞に由来する真核生物哺乳動物、好ましくはヒトの細胞を指す。
「富化された」は、細胞集団との関連で使用されるとき、１つ以上のマーカー、例えば
ＣＤ３４＋の存在に基づき選択された細胞集団を指す。
用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その表面にＣＤ３４マーカーを発現する細胞を指す。ＣＤ
３４＋細胞は、例えばフローサイトメトリーおよび蛍光標識抗ＣＤ３４抗体を用いて検出
およびカウントすることができる。
「ＣＤ３４＋細胞が富化された」は、細胞集団がＣＤ３４マーカーの存在に基づき選択
されていることを意味する。したがって、選択方法後の細胞集団中のＣＤ３４＋細胞のパ
ーセンテージは、ＣＤ３４マーカーに基づく選択ステップ前の初期細胞集団中のＣＤ３４
＋細胞のパーセンテージよりも高い。例えば、ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４＋細胞を富化
した細胞集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または少なくとも９
０％を占め得る。
用語「Ｆ細胞」および「Ｆ－細胞」は、胎児ヘモグロビンを含有および／または産生す
る（例えば、発現する）細胞、通常、赤血球（例えば、赤血球細胞）を指す。例えば、Ｆ
－細胞は、検出可能なレベルの胎児ヘモグロビンを含有または産生する細胞である。例え
ば、Ｆ－細胞は、少なくとも５ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有または産生する細胞
である。別の例において、Ｆ－細胞は、少なくとも６ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含
有または産生する細胞である。別の例において、Ｆ－細胞は、少なくとも７ピコグラムの
胎児ヘモグロビンを含有または産生する細胞である。別の例において、Ｆ－細胞は、少な
くとも８ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有または産生する細胞である。別の例におい
て、Ｆ－細胞は、少なくとも９ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有または産生する細胞
である。別の例において、Ｆ－細胞は、少なくとも１０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを
含有または産生する細胞である。胎児ヘモグロビンのレベルは、本明細書に記載されるア
ッセイを用いるか、または当該技術分野において公知の他の方法、例えば抗胎児ヘモグロ
ビン検出試薬を用いたフローサイトメトリー、高速液体クロマトグラフィー、質量分析法
、または酵素結合免疫吸着アッセイにより計測し得る。
特に指定されない限り、全てのゲノムまたは染色体座標はｈｇ３８に基づく。
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、組成物および方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９シ
ステムを用いた真核細胞におけるゲノム編集に関する。詳細には、本明細書に記載される
ｇＲＮＡ分子、組成物および方法は、グロビンレベルの調節に関し、例えば、グロビン遺
伝子およびタンパク質の発現および産生の調節において有用である。本ｇＲＮＡ分子、組
成物および方法は、異常ヘモグロビン症の治療において有用であり得る。
Ｉ．ｇＲＮＡ分子
ｇＲＮＡ分子は、以下にさらに詳しく記載するとおり幾つものドメインを有し得るが、
しかしながら、ｇＲＮＡ分子は、典型的には、少なくともｃｒＲＮＡドメイン（標的化ド
メインを含む）とｔｒａｃｒとを含む。ＣＲＩＳＰＲシステムの一成分として使用される
本発明のｇＲＮＡ分子は、標的部位にまたはその近傍にあるＤＮＡの修飾（例えば、配列
の修飾）に有用である。かかる修飾には、例えば標的部位を含む遺伝子の機能性産物の発
現の低下または消失をもたらす欠失および／または挿入が含まれる。これらの使用および
さらなる使用について、以下にさらに詳しく説明する。
ある実施形態では、単分子の、すなわちｓｇＲＮＡが、好ましくは５’から３’に、ｃ
ｒＲＮＡ（標的配列と相補的な標的化ドメインおよびフラッグポールの一部を形成する領
域（すなわち、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域）を含有する）；ループ；およびｔｒａｃ
ｒ（ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と相補的なドメイン、およびヌクレアーゼまたは他の
エフェクター分子、例えばＣａｓ分子、例えばＣａｓ９分子をさらに結合するドメインを
含有する）を含み、以下のフォーマットをとり得る（５’から３’に）：
［標的化ドメイン］－［ｃｒＲＮＡフラッグポール領域］－［任意選択の第１のフラッグ
ポール伸長部］－［ループ］－［任意選択の第１のｔｒａｃｒ伸長部］－［ｔｒａｃｒフ
ラッグポール領域］－［ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメイン］。
実施形態において、ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメインはＣａｓタンパク質、例えば
Ｃａｓ９タンパク質に結合する。
ある実施形態では、二分子の、すなわちｄｇＲＮＡが、２つのポリヌクレオチド；第１
のポリヌクレオチド、好ましくは５’から３’に、ｃｒＲＮＡ（標的配列と相補的な標的
化ドメインおよびフラッグポールの一部を形成する領域を含有し；および第２のポリヌク
レオチド、好ましくは５’から３’に、ｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と相
補的なドメイン、およびヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子、例えばＣａｓ分子、
例えばＣａｓ９分子をさらに結合するドメインを含有する）を含み、以下のフォーマット
をとり得る（５’から３’に）：
ポリヌクレオチド１（ｃｒＲＮＡ）：［標的化ドメイン］－［ｃｒＲＮＡフラッグポール
領域］－［任意選択の第１のフラッグポール伸長部］－［任意選択の第２のフラッグポー
ル伸長部］
ポリヌクレオチド２（ｔｒａｃｒ）：［任意選択の第１のｔｒａｃｒ伸長部］－［ｔｒａ
ｃｒフラッグポール領域］－［ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメイン］。
実施形態において、ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメインはＣａｓタンパク質、例えば
Ｃａｓ９タンパク質に結合する。
一部の態様において、標的化ドメインは、本明細書に記載される標的化ドメイン配列、
例えば、表１、表２、表３、表４、表５、または表６に記載される標的化ドメイン、また
は表１、表２、表３、表４、表５、または表６に記載される標的化ドメイン配列の１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個（好ましくは２０個）の連続
するヌクレオチドを含むかまたはそれからなる標的化ドメインを含むかまたはそれからな
る。
一部の態様において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、５’
から３’に、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６５８４）を含む。
一部の態様において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、５’
から３’に、ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６５８５）を含む。
一部の態様においてループは、５’から３’に、ＧＡＡＡ（配列番号６５８８）を含む
。
一部の態様においてｔｒａｃｒは、５’から３’に、

を含み、好ましくは配列番号６５８４を含むｇＲＮＡ分子に使用される。
一部の態様においてｔｒａｃｒは、５’から３’に、

を含み、好ましくは配列番号６５８５を含むｇＲＮＡ分子に使用される。
一部の態様において、ｇＲＮＡは、３’末端に追加的なＵ核酸も含み得る。例えば、ｇ
ＲＮＡは、３’末端に追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＵ
核酸を含み得る。ある実施形態において、ｇＲＮＡは３’末端に追加的な４個のＵ核酸を
含む。ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含
むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に
追加的なＵ核酸を含み得る。例えば、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド
（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオ
チド）の１つ以上が３’末端に追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１
０個のＵ核酸を含み得る。ある実施形態において、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリ
ヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含む
ポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に追加的な４個のＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの
実施形態において、ｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドのみが追加的なＵ核酸、例えば４
個のＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、標的化ドメインを含むポリヌクレオ
チドのみが追加的なＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、標的化ドメインを含
むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドの両方が追加的なＵ核酸、
例えば４個のＵ核酸を含む。
一部の態様において、ｇＲＮＡは、３’末端に追加的なＡ核酸も含み得る。例えば、ｇ
ＲＮＡは、３’末端に追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＡ
核酸を含み得る。ある実施形態において、ｇＲＮＡは３’末端に追加的な４個のＡ核酸を
含む。ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含
むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に
追加的なＡ核酸を含み得る。例えば、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド
（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオ
チド）の１つ以上が３’末端に追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１
０個のＡ核酸を含み得る。ある実施形態において、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリ
ヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含む
ポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に追加的な４個のＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの
実施形態において、ｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドのみが追加的なＡ核酸、例えば４
個のＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、標的化ドメインを含むポリヌクレオ
チドのみが追加的なＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、標的化ドメインを含
むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドの両方が追加的なＵ核酸、
例えば４個のＡ核酸を含む。
実施形態において、ｇＲＮＡ分子のポリヌクレオチドの１つ以上が５’末端にキャップ
を含み得る。
ある実施形態において、単分子の、すなわちｓｇＲＮＡが、好ましくは５’から３’に
、ｃｒＲＮＡ（標的配列と相補的な標的化ドメインを含有する；ｃｒＲＮＡフラッグポー
ル領域；第１のフラッグポール伸長部；ループ；第１のｔｒａｃｒ伸長部（第１のフラッ
グポール伸長部の少なくとも一部分と相補的なドメインを含有する）；およびｔｒａｃｒ
（ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と相補的なドメイン、およびＣａｓ９分子をさらに結合
するドメインを含有する）を含む。一部の態様において、標的化ドメインは、本明細書に
記載される標的化ドメイン配列、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、または表６に
記載される標的化ドメイン、または表１、表２、表３、表４、表５、または表６に記載さ
れる標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２
５個（好ましくは２０個）の連続するヌクレオチド、例えば、表１、表２、表３、表４、
表５、または表６に記載される標的化ドメイン配列の３’側の１７、１８、１９、２０、
２１、２２、２３、２４または２５個（好ましくは２０個）の連続するヌクレオチドを含
むかまたはそれからなる標的化ドメインを含む。
第１のフラッグポール伸長部および／または第１のｔｒａｃｒ伸長部を含む態様におい
て、フラッグポール、ループおよびｔｒａｃｒ配列は上記に記載したとおりであり得る。
一般に任意の第１のフラッグポール伸長部および第１のｔｒａｃｒ伸長部を用いることが
でき、但しそれらは相補的であるものとする。実施形態において、第１のフラッグポール
伸長部および第１のｔｒａｃｒ伸長部は、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそ
れを超える相補ヌクレオチドからなる。
一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部は、５’から３’に、ＵＧＣＵＧ（
配列番号６５８６）を含む。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部は配列番
号６５８６からなる。
一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、５’から３’に、ＣＡＧＣＡ（配列
番号６５９１）を含む。一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部は配列番号６５９
１からなる。
ある実施形態において、ｄｇＲＮＡは２つの核酸分子を含む。一部の態様において、ｄ
ｇＲＮＡは、好ましくは５’から３’に、標的配列と相補的な標的化ドメイン；ｃｒＲＮ
Ａフラッグポール領域；任意選択で第１のフラッグポール伸長部；および任意選択で第２
のフラッグポール伸長部を含有する第１の核酸と；好ましくは５’から３’に、任意選択
で第１のｔｒａｃｒ伸長部；およびｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と相補的
なドメイン、およびＣａｓ、例えばＣａｓ９分子をさらに結合するドメインを含有する）
を含む第２の核酸（本明細書ではｔｒａｃｒと称され得る）、および少なくとも、Ｃａｓ
分子、例えばＣａｓ９分子を結合するドメインを含む）とを含む。第２の核酸は、加えて
、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒの３’側に）追加的なＵ核酸を含み得る。例えば、ｔ
ｒａｃｒは、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒの３’側に）追加的な１、２、３、４、５
、６、７、８、９、または１０個のＵ核酸を含み得る。第２の核酸は、加えてまたは代わ
りに、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒの３’側に）追加的なＡ核酸を含み得る。例えば
、ｔｒａｃｒは、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒの３’側に）追加的な１、２、３、４
、５、６、７、８、９、または１０個のＡ核酸を含み得る。一部の態様において、標的化
ドメインは、本明細書に記載される標的化ドメイン配列、例えば、表１、表２、表３、表
４、表５、または表６に記載される標的化ドメイン、または表１、表２、表３、表４、表
５、または表６に記載される標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２
、２３、２４、または２５個（好ましくは２０個）の連続するヌクレオチドを含むかまた
はそれからなる標的化ドメインを含む。
ｄｇＲＮＡが関わる態様において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域、任意選択の第１の
フラッグポール伸長部、任意選択の第１のｔｒａｃｒ伸長部およびｔｒａｃｒ配列は上記
に記載したとおりであり得る。
一部の態様において、任意選択の第２のフラッグポール伸長部は、５’から３’に、Ｕ
ＵＵＵＧ（配列番号６５８７）を含む。
実施形態において、ｇＲＮＡ分子（およびｄｇＲＮＡ分子の場合、標的化ドメインを含
むポリヌクレオチドおよび／またはｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の３’側の１、
２、３、４、または５ヌクレオチド、５’側の１、２、３、４、または５ヌクレオチド、
または３’側および５’側の両方の１、２、３、４、または５ヌクレオチドは、以下の第
ＸＩＩＩ節にさらに詳しく説明するとおり、修飾核酸である。
これらのドメインについて以下に手短に考察する：
１）標的化ドメイン：
標的化ドメインの選択に関する指針については、例えば、Ｆｕ Ｙ ｅｌ ａｌ．ＮＡ
Ｔ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ ２０１４（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８）お
よびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ ＳＨ ｅｌ ａｌ．ＮＡＴＵＲＥ ２０１４（ｄｏｉ：１０．
１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ３０１１）を参照することができる。
標的化ドメインは、標的核酸上の標的配列と相補的、例えば、少なくとも８０、８５、
９０、９５、または９９％相補的、例えば完全に相補的なヌクレオチド配列を含む。標的
化ドメインはＲＮＡ分子の一部であり、したがって塩基ウラシル（Ｕ）を含むことになり
、一方、ｇＲＮＡ分子をコードする任意のＤＮＡは塩基チミン（Ｔ）を含むことになる。
理論によって拘束されることを望むものではないが、標的配列との標的化ドメインの相補
性は、標的核酸とのｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の相互作用の特異性に寄与すると
考えられる。標的化ドメインと標的配列との対において、標的化ドメイン中のウラシル塩
基は標的配列中のアデニン塩基と対合し得ることが理解される。
ある実施形態において、標的化ドメインは、５～５０、例えば１０～４０、例えば１０
～３０、例えば１５～３０、例えば１５～２５ヌクレオチド長である。ある実施形態にお
いて、標的化ドメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４または２５ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは１６ヌク
レオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは１７ヌクレオチド長である
。ある実施形態において、標的化ドメインは１８ヌクレオチド長である。ある実施形態に
おいて、標的化ドメインは１９ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ド
メインは２０ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは２１ヌク
レオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは２２ヌクレオチド長である
。ある実施形態において、標的化ドメインは２３ヌクレオチド長である。ある実施形態に
おいて、標的化ドメインは２４ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ド
メインは２５ヌクレオチド長である。実施形態において、前述の１６、１７、１８、１９
、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドは、表１、表２、表３、表４
、表５、または表６に記載される標的化ドメインからの５’－１６、１７、１８、１９、
２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドを含む。実施形態において、前
述の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド
は、表１、表２、表３、表４、表５、または表６に記載される標的化ドメインからの３’
－１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドを
含む。
理論によって拘束されるものではないが、標的化ドメインの３’末端に配置された標的
化ドメインの８、９、１０、１１または１２個の核酸が標的配列のターゲティングに重要
であると考えられ、したがって標的化ドメインの「コア」領域と称され得る。ある実施形
態において、コアドメインは標的配列に完全に相補的である。
標的化ドメインが相補的である標的核酸の鎖が、本明細書では標的配列と称される。一
部の態様において、標的配列は染色体上に配置され、例えば遺伝子内の標的である。一部
の態様において標的配列は遺伝子のエクソン内に配置される。一部の態様において標的配
列は遺伝子のイントロン内に配置される。一部の態様において、標的配列は、目的の遺伝
子の調節エレメントの結合部位、例えばプロモーターまたは転写因子結合部位を含むかま
たはそれに近接している（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３
００、４００、５００、または１０００核酸以内にある）。ドメインのヌクレオチドの一
部または全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に掲載される修飾を有し得る。
２）ｃｒＲＮＡフラッグポール領域：
フラッグポールは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒの両方からの一部分を含む。ｃｒＲＮ
Ａフラッグポール領域はｔｒａｃｒの一部分に相補的であり、ある実施形態では、少なく
とも一部の生理条件下、例えば通常の生理条件下で二重鎖化した領域を形成するのに十分
なｔｒａｃｒの一部分との相補性を有する。ある実施形態において、ｃｒＲＮＡフラッグ
ポール領域は５～３０ヌクレオチド長である。ある実施形態において、ｃｒＲＮＡフラッ
グポール領域は５～２５ヌクレオチド長である。ｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、細菌
ＣＲＩＳＰＲアレイからのリピート配列の天然に存在する一部分と相同性を共有するかま
たはそれに由来し得る。ある実施形態において、これは本明細書に開示されるｃｒＲＮＡ
フラッグポール領域、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．サーモ
フィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と少なくとも
５０％の相同性を有する。
ある実施形態において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配
列番号６５８４を含む。ある実施形態において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラ
ッグポール領域は、配列番号６５８４と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８
５％、９０％、９５％または９９％の相同性を有する配列を含む。ある実施形態において
、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号６５８４の少なく
とも５、６、７、８、９、１０、または１１ヌクレオチドを含む。ある実施形態において
、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号６５８５を含む。
ある実施形態において、フラッグポールは、配列番号６５８５と少なくとも５０％、６０
％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の相同性を有する配列を含む
。ある実施形態において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配
列番号６５８５の少なくとも５、６、７、８、９、１０、または１１ヌクレオチドを含む
。
ドメインのヌクレオチドの一部または全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に
記載される修飾を有し得る。
３）第１のフラッグポール伸長部
第１のｔｒａｃｒ伸長部を含むｔｒａｃｒが使用されるとき、ｃｒＲＮＡは第１のフラ
ッグポール伸長部を含み得る。一般に任意の第１のフラッグポール伸長部および第１のｔ
ｒａｃｒ伸長部を用いることができ、但しそれらは相補的であるものとする。実施形態に
おいて、第１のフラッグポール伸長部および第１のｔｒａｃｒ伸長部は、３、４、５、６
、７、８、９、１０個またはそれを超える相補ヌクレオチドからなる。
第１のフラッグポール伸長部は、第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドと相補的、例
えば、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％、例えば完全に相補的なヌクレオチ
ドを含み得る。一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部の相補ヌクレオチドとハイ
ブリダイズする第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドは連続している。一部の態様
において、第１のｔｒａｃｒ伸長部の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする第１のフラ
ッグポール伸長部のヌクレオチドは不連続であり、例えば、第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌ
クレオチドと塩基対合しないヌクレオチドによって分離された２つ以上のハイブリダイゼ
ーション領域を含む。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部は、少なくとも
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、
１８、１９、２０またはそれを超えるヌクレオチドを含む。一部の態様において、第１の
フラッグポール伸長部は、５’から３’に、ＵＧＣＵＧ（配列番号６５８６）を含む。一
部の態様において、第１のフラッグポール伸長部は配列番号６５８６からなる。一部の態
様において第１のフラッグポール伸長部は、配列番号６５８６と少なくとも８０％、８５
％、９０％、９５％または９９％の相同性である核酸を含む。
第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドの一部または全てが、修飾、例えば本明細書の
第ＸＩＩＩ節に掲載される修飾を有し得る。
３）ループ
ループは、ｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡフラッグポール領域（または存在する場合には任意
選択で第１のフラッグポール伸長部）をｔｒａｃｒ（または存在する場合には任意選択で
第１のｔｒａｃｒ伸長部）と連結する役割を果たす。ループはｃｒＲＮＡフラッグポール
領域とｔｒａｃｒとを共有結合的または非共有結合的に連結し得る。ある実施形態におい
て、この連結は共有結合性である。ある実施形態において、ループはｃｒＲＮＡフラッグ
ポール領域とｔｒａｃｒとを共有結合的にカップリングする。ある実施形態において、ル
ープは第１のフラッグポール伸長部と第１のｔｒａｃｒ伸長部とを共有結合的にカップリ
ングする。ある実施形態において、ループは、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と、ｃｒＲ
ＮＡフラッグポール領域にハイブリダイズするｔｒａｃｒのドメインとの間に介在する共
有結合であるか、またはそれを含む。典型的には、ループは１ヌクレオチド以上、例えば
、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを含む。
ｄｇＲＮＡ分子では、２つの分子は、ｃｒＲＮＡの少なくとも一部分（例えば、ｃｒＲ
ＮＡフラッグポール領域）とｔｒａｃｒの少なくとも一部分（例えば、ｃｒＲＮＡフラッ
グポール領域と相補的なｔｒａｃｒのドメイン）との間のハイブリダイゼーションによっ
て会合することができる。
多様なループがｓｇＲＮＡにおける使用に好適である。ループは共有結合からなっても
よく、または１または数ヌクレオチドほどの短さ、例えば、１、２、３、４、または５ヌ
クレオチド長であってもよい。ある実施形態において、ループは、２、３、４、５、６、
７、８、９、１０、１５、２０、または２５ヌクレオチド長であるかまたはそれを超える
。ある実施形態において、ループは、２～５０、２～４０、２～３０、２～２０、２～１
０、または２～５ヌクレオチド長である。ある実施形態において、ループは天然に存在す
る配列と相同性を共有するかまたはそれに由来する。ある実施形態において、ループは、
本明細書に開示されるループと少なくとも５０％の相同性を有する。ある実施形態におい
て、ループは配列番号６５８８を含む。
ドメインのヌクレオチドの一部または全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に
記載される修飾を有し得る。
４）第２のフラッグポール伸長部
ある実施形態において、ｄｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域、または存在す
る場合には第１のフラッグポール伸長部の３’側に、本明細書において第２のフラッグポ
ール伸長部と称される追加的な配列を含み得る。ある実施形態において、第２のフラッグ
ポール伸長部は、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、または２～４ヌ
クレオチド長である。ある実施形態において、第２のフラッグポール伸長部は、２、３、
４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長であるかまたはそれを超える。ある
実施形態において、第２のフラッグポール伸長部は配列番号６５８７を含む。
５）Ｔｒａｃｒ：
ｔｒａｃｒは、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９の結合に必要な核酸配列である。理論に
よって拘束されるものではないが、各Ｃａｓ９種が特定のｔｒａｃｒ配列に関連付けられ
ると考えられる。ｔｒａｃｒ配列はｓｇＲＮＡおよびｄｇＲＮＡの両方のシステムで利用
される。ある実施形態において、ｔｒａｃｒは、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ
）ｔｒａｃｒからの配列を含むかまたはそれに由来する。一部の態様において、ｔｒａｃ
ｒは、ｃｒＲＮＡのフラッグポール部分にハイブリダイズする一部分、例えば、少なくと
もある生理条件下で二重鎖化した領域を形成するのに十分なｃｒＲＮＡフラッグポール領
域との相補性を有する一部分（ときに本明細書においてｔｒａｃｒフラッグポール領域ま
たはｃｒＲＮＡフラッグポール領域と相補的なｔｒａｃｒドメインと称されることもある
）を有する。実施形態において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域とハイブリダイズするｔ
ｒａｃｒのドメインは、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域の相補ヌクレオチドとハイブリダ
イズする少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、
１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドを含む。一部の態様において、ｃｒＲＮＡフ
ラッグポール領域の相補ヌクレオチドとハイブリダイズするｔｒａｃｒヌクレオチドは連
続している。一部の態様において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域の相補ヌクレオチドと
ハイブリダイズするｔｒａｃｒヌクレオチドは不連続であり、例えば、ｃｒＲＮＡフラッ
グポール領域のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドによって分離された２つ以上
のハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様において、ｃｒＲＮＡフラッグポール
領域にハイブリダイズするｔｒａｃｒの一部分は、５’から３’に、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵ
ＡＡＡＡ（配列番号６５９７）を含む。一部の態様において、ｃｒＲＮＡフラッグポール
領域にハイブリダイズするｔｒａｃｒの一部分は、５’から３’に、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵ
ＵＡＡＡ（配列番号６５９８）を含む。実施形態において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領
域とハイブリダイズする配列は、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ分子、例えばＣａｓ９分子
をさらに結合するｔｒａｃｒの配列の５’側のｔｒａｃｒ上に配置される。
ｔｒａｃｒは、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ分子、例えばＣａｓ９分子にさらに結合す
るドメインをさらに含む。理論によって拘束されるものではないが、異なる種のＣａｓ９
は異なるｔｒａｃｒ配列に結合すると考えられる。一部の態様において、ｔｒａｃｒは、
化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子に結合する配列を含む。一部の態
様において、ｔｒａｃｒは、本明細書に開示されるＣａｓ９分子に結合する配列を含む。
一部の態様において、Ｃａｓ９分子をさらに結合するドメインは、５’から３’に、
ＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧ
ＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６５９９）
を含む。一部の態様において、Ｃａｓ９分子をさらに結合するドメインは、５’から３’
に、
ＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧ
ＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号６６００）
を含む。
一部の実施形態において、ｔｒａｃｒは配列番号６５８９を含む。一部の実施形態にお
いて、ｔｒａｃｒは配列番号６５９０を含む。
ｔｒａｃｒのヌクレオチドの一部または全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節
に掲載される修飾を有し得る。実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたは
ｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮ
ＡまたはｇＲＮＡ成分のいずれかは、ｇＲＮＡの５’末端、３’末端または５’末端と３
’末端との両方に逆位脱塩基残基を含む。実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲ
ＮＡまたはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載さ
れるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分のいずれかは、ポリヌクレオチドの５’末端の残基間に
１つ以上のホスホロチオエート結合を含み、例えば、最初の２つの５’残基間、最初の３
つの５’残基の各々の間、最初の４つの５’残基の各々の間、または最初の５つの５’残
基の各々の間にホスホロチオエート結合を含む。実施形態において、ｇＲＮＡまたはｇＲ
ＮＡ成分は、それに代えてまたは加えて、ポリヌクレオチドの３’末端の残基間に１つ以
上のホスホロチオエート結合を含み、例えば、最初の２つの３’残基間、最初の３つの３
’残基の各々の間、最初の４つの３’残基の各々の間、または最初の５つの３’残基の各
々の間にホスホロチオエート結合を含み得る。ある実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば
、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記
に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分のいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の
間にホスホロチオエート結合を含み（例えば、５’末端に３つのホスホロチオエート結合
を含み、例えばそれからなり）、かつ最初の４つの３’残基の各々の間にホスホロチオエ
ート結合を含む（例えば、３’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれ
からなる）。ある実施形態において、上記に記載されるホスホロチオエート修飾のいずれ
かが、ポリヌクレオチドの５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端との両方にお
ける逆位脱塩基残基と組み合わされる。かかる実施形態において、逆位脱塩基ヌクレオチ
ドはリン酸結合またはホスホロチオエート結合によって５’および／または３’ヌクレオ
チドに連結され得る。実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮ
Ａのｔｒａｃｒおよび／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡまたは
ｇＲＮＡ成分のいずれかは、２’Ｏ－メチル修飾を含むヌクレオチドを１つ以上含む。実
施形態において、５’残基の最初の１、２、３つ、またはまたはそれを超えるものの各々
が２’Ｏ－メチル修飾を含む。実施形態において、３’残基の最初の１、２、３つ、また
はまたはそれを超えるものの各々が２’Ｏ－メチル修飾を含む。実施形態において、末端
から４番目、末端から３番目、および末端から２番目の３’残基が２’Ｏ－メチル修飾を
含む。実施形態において、５’残基の最初の１、２、３つまたはまたはそれを超えるもの
の各々が２’Ｏ－メチル修飾を含み、かつ３’残基の最初の１、２、３つまたはまたはそ
れを超えるものの各々が２’Ｏ－メチル修飾を含む。ある実施形態において、５’残基の
最初の３つの各々が２’Ｏ－メチル修飾を含み、かつ３’残基の最初の３つの各々が２’
Ｏ－メチル修飾を含む。実施形態において、５’残基の最初の３つの各々が２’Ｏ－メチ
ル修飾を含み、かつ末端から４番目、末端から３番目、および末端から２番目の３’残基
が２’Ｏ－メチル修飾を含む。実施形態において、２’Ｏ－メチル修飾のいずれか、例え
ば上記に記載したとおりのものが、１つ以上のホスホロチオエート修飾、例えば上記に記
載したとおりのもの、および／または１つ以上の逆位脱塩基修飾、例えば上記に記載した
とおりのものと組み合わされてもよい。ある実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇ
ＲＮＡまたはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載
されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分のいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間にホ
スホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエー
ト結合を含む、例えばそれからなる）、最初の４つの３’残基の各々の間にホスホロチオ
エート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含
む、例えばそれからなる）、最初の３つの５’残基の各々に２’Ｏ－メチル修飾、かつ最
初の３つの３’残基の各々に２’Ｏ－メチル修飾を含む、例えばそれからなる。ある実施
形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／ま
たはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分のいずれかは
、最初の４つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチ
ドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の４
つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末
端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の３つの５’残
基の各々に２’Ｏ－メチル修飾、かつ末端から４番目、末端から３番目、および末端から
２番目の３’残基の各々に２’Ｏ－メチル修飾を含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒ
および／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分の
いずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリ
ヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）
、最初の４つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチ
ドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の３
つの５’残基の各々に２’Ｏ－メチル修飾、最初の３つの３’残基の各々に２’Ｏ－メチ
ル修飾、および５’末端および３’末端の各々に追加的な逆位脱塩基残基を含む、例えば
それからなる。
ある実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒ
および／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分の
いずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリ
ヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）
、最初の４つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチ
ドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の３
つの５’残基の各々に２’Ｏ－メチル修飾、および末端から４番目、末端から３番目、お
よび末端から２番目の３’残基の各々に２’Ｏ－メチル修飾、および５’末端および３’
末端の各々に追加的な逆位脱塩基残基を含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからな
る：
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵ＊
ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ
（式中、ｍは２’Ｏ－メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示
し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（
任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；および
ｔｒａｃｒ：

（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからな
る：
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵ＊
ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ
（式中、ｍは２’Ｏ－メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示
し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（
任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；および
ｔｒａｃｒ：

（式中、ｍは２’Ｏ－メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示
し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（
任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからな
る：
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ
ＣＵＧＵＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＧ
（式中、ｍは２’Ｏ－メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示
し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（
任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；および
ｔｒａｃｒ：

（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからな
る：
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ
ＣＵＧＵＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＧ
（式中、ｍは２’Ｏ－メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示
し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（
任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；および
ｔｒａｃｒ：

（式中、ｍは２’Ｏ－メチル修飾を有する塩基を示し、および＊はホスホロチオエート結
合を示す）（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからな
る：
ｃｒＲＮＡ：
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵ
ＵＧ
（式中、Ｎは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任
意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；および
ｔｒａｃｒ：

（式中、ｍは２’Ｏ－メチル修飾を有する塩基を示し、および＊はホスホロチオエート結
合を示す）（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからな
る：

（式中、ｍは２’Ｏ－メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示
し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（
任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからな
る：

（式中、ｍは２’Ｏ－メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示
し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（
任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからな
る：

（式中、ｍは２’Ｏ－メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示
し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（
任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
６）第１のＴｒａｃｒ伸長部
ｇＲＮＡが第１のフラッグポール伸長部を含む場合、ｔｒａｃｒは第１のｔｒａｃｒ伸
長部を含み得る。第１のｔｒａｃｒ伸長部は、第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチ
ドと相補的、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％、例えば完全に相補
的なヌクレオチドを含み得る。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部の相補
ヌクレオチドとハイブリダイズする第１のｔｒａｃｒ伸長部ヌクレオチドは連続している
。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部の相補ヌクレオチドとハイブリダイ
ズする第１のｔｒａｃｒ伸長部ヌクレオチドは不連続であり、例えば、第１のフラッグポ
ール伸長部のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドによって分離された２つ以上の
ハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、
少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１
６、１７、１８、１９、２０またはそれを超えるヌクレオチドを含む。一部の態様におい
て、第１のｔｒａｃｒ伸長部は配列番号６５９１を含む。一部の態様において第１のｔｒ
ａｃｒ伸長部は、配列番号６５９１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または
９９％の相同性である核酸を含む。
第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドの一部または全てが、修飾、例えば本明細書の
第ＸＩＩＩ節に掲載される修飾を有し得る。
一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、標的化ドメインの３’側に
配置された以下を含み得る：

ｅ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオ
チド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさ
らに含む上記ａ）～ｄ）のいずれか；
ｆ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオ
チド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさ
らに含む上記ａ）～ｄ）のいずれか；または
ｇ）５’末端（例えば、５’側端、例えば、標的化ドメインの５’側）に、少なくとも１
、２、３、４、５、６または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１、２、３、
４、５、６、または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む上記ａ）～ｆ）のい
ずれか。実施形態において、上記ａ）～ｇ）のいずれかは、標的化ドメインのすぐ３’側
に配置される。
ある実施形態において、本発明のｓｇＲＮＡは、５’から３’に、［標的化ドメイン］
－

を含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、本発明のｓｇＲＮＡは、５’から３’に、
［標的化ドメイン］－

を含む、例えばそれからなる。
一部の実施形態において、ｄｇＲＮＡは以下を含み得る：
５’から３’に、好ましくは標的化ドメインのすぐ３’側に配置された以下を含むｃｒＲ
ＮＡ：
ａ） ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６５８４）；
ｂ） ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６５８５）；
ｃ） ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧ（配列番号６６０５）；
ｄ） ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧ（配列番号６６０６）；
ｅ） ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号６６０７）；
ｆ） ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号６６０８）；または
ｇ） ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ （配列番号７８０６）：
および５’から３’に以下を含むｔｒａｃｒ：

ｋ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオ
チド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさ
らに含む上記ａ）～ｊ）のいずれか；
ｌ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオ
チド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさ
らに含む上記ａ）～ｊ）のいずれか；または
ｍ）５’末端に（例えば、５’側端に）少なくとも１、２、３、４、５、６または７個の
アデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のアデニン
（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む上記ａ）～ｌ）のいずれか。
ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、例えば転写にＵ６プロモーターが使用され
る場合、３’配列ＵＵＵＵＵＵを含む。ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、例え
ば転写にＨＩプロモーターが使用される場合、３’配列ＵＵＵＵを含む。ある実施形態に
おいて、上記ｋ）の配列は、例えば使用されるｐｏｌ－ＩＩＩプロモーターの終結シグナ
ルに応じて変わり得る数の３’Ｕを含む。ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、Ｔ
７プロモーターが使用される場合、ＤＮＡ鋳型に由来する可変的な３’配列を含む。ある
実施形態において、上記ｋ）の配列は、例えばインビトロ転写を用いてＲＮＡ分子が作成
される場合、ＤＮＡ鋳型に由来する可変的な３’配列を含む。ある実施形態において、上
記ｋ）の配列は、例えばｐｏｌ－ＩＩプロモーターを用いて転写がドライブされる場合、
ＤＮＡ鋳型に由来する可変的な３’配列を含む。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に
配置される（例えば、標的化ドメインのすぐ３’側に配置される）、配列番号６６０７を
含む、例えばそれからなる配列と、

を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に
配置される（例えば、標的化ドメインのすぐ３’側に配置される）、配列番号６６０８を
含む、例えばそれからなる配列と、

を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に
配置される（例えば、標的化ドメインのすぐ３’側に配置される）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧ
ＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号７８０６）を含む、例えばそれからなる配列と、

を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に
配置される（例えば、標的化ドメインのすぐ３’側に配置される）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧ
ＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号７８０６）を含む、例えばそれからなる配列と、

を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に
配置される（例えば、標的化ドメインのすぐ３’側に配置される）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧ
ＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号６６０７）を含む、例えばそれからなる配列と、

を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
ＩＩ．グロビン遺伝子の発現を改変するのに有用な標的化ドメイン
以下の表に、本発明の様々な態様、例えば、グロビン遺伝子、例えば胎児ヘモグロビン
遺伝子またはヘモグロビンβ遺伝子の発現の改変に用いられるｇＲＮＡ分子の標的化ドメ
インを提供する。
実施形態において、ｇＲＮＡ標的化ドメインは、上記の表中にある配列のいずれか１つ
の２０個の３’ｎｔからなる。
本発明の組成物および方法において有用な例示的な好ましいｇＲＮＡ標的化ドメインを
以下の表に記載する。
本発明の一部の態様において、ＨＰＦＨ領域に対するｇＲＮＡ分子は、例えば実施例４
に記載されるアッセイにおいて、対照と比べて少なくとも約２０％のＦ細胞の増加を生じ
させる能力を有するｇＲＮＡの標的化ドメインを含む、例えばそれからなることが好まし
い。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号９９を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１１
２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子
は、配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５８９を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１
５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ
分子は、配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５９を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１０１を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番
号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮ
Ａ分子は、配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５３６を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５３９を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配
列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
本発明の一部の態様において、例えば、本明細書において指摘するとおり、２つ以上の
、例えば２つの標的部位を標的とするｇＲＮＡ分子（例えば、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子）を含むことが有益であり得る。一部の実施形態において、２つの標
的部位は両方ともにＨＰＦＨ領域に位置する。かかる態様において、表６に挙げる標的化
ドメインを含む２つ以上の、例えば２つのｇＲＮＡ分子（例えば、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子）の任意の組み合わせを用いることができる。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列
番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１
１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号９９を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１１２を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号９８を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１５８０を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１００および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１００および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１００および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１００および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１００および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０
０および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００およ
び配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列
番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１
３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１５３６
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１５３９を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１５８５を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１１３を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号９９を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１６５および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１６５および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１６５および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１６５および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
６５および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５
および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および
配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列
番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１
０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１６２を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１０４を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１３８を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１５３６を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１５３９を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１１３および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１１３および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１１３および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３
および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３およ
び配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列
番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号
１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１６
０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１５３７を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１５９を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１０１を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１６２を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１１３および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１１３および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１１３および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号９９および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９
および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配
列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号９
８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１５８０を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１０６を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１５０３を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１５８９を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分

子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号９９および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号９９および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
９９および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９およ
び配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番
号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１３８
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１５３６を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１５３９を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１５８５を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１６５を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１１２および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１１２および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１１２および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
１２および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２お
よび配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および
配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列
番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１
５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１５９
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１０１を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１６２を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１０４を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１３８を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１１２および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号９８および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号９８および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８
および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列
番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５
８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１０６を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５０３を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５８９を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１６０を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号９８および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号９８および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号９８および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８お
よび配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列
番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５
３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５３９を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５８５を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１６５を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１１３を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号９９を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１５８０および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１５８０および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１５８０および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１５８０および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１５８０および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１５８０および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
５８０および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８
０および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０お
よび配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および
配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列
番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番
号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号
１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１６
５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１１３を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号９９を含む、例え
ば

それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１１２を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１０６および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１０６および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１０６および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１０６および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
０６および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６お
よび配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配
列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号
１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１３８
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１５３６を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１５３９を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１５８５を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１６５を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１１３を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号９９を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１５０３および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１５０３および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１５０３および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１５０３および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１５０３および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
１５０３および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
５０３および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０
３および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３お
よび配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および
配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列
番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号
１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１
５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１５
８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１６５
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１１３を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号９９を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１１２を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号９８を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１５８０を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１５８９および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１５８９および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１５８９および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１５８９および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１５８９および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
５８９および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８
９および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９
および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９お
よび配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および
配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番
号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号９９
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１１２を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号９８を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１５８０を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１０６を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１６０および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１６０および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１６０および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
１６０および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０
および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および
配

列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号
１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１５
３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１５８５
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１６５を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１１３を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号９９を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１１２を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号９８を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１５３７および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１５３７および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１５３７および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１５３７および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１５３７および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
５３７および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３
７および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７お
よび配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７およ
び配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および
配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列
番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１
１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号９９を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１１２を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号９８を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１５８０を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１５９および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１５９および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１５９および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１５９および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５
９および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９およ
び配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列
番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１
５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１５３
９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１５８５を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１６５を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１１３を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号９９を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１０１および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１０１および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１０１および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１０１および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
０１および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１
および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および
配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列
番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１
６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１０４を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１３８を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１５３６を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１５３９を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１５８５を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１６２および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１６２および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１６２および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２
および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２およ
び配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列
番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号
１

５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１６０
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１５３７を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１５９を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１０１を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１６５を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１０４および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１０４および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１０４および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
０４および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４
および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および
配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列
番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号
１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１５３
７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１５９を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１０１を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１６２を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１３８を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１０４および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１３８および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１３８および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１３８および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８
および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および
配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号
１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１０
６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１５０３を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１５８９を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１６０を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１５３７を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１５９を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１３８および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１３８および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１３８および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
１３８および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５
３６および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６
および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６およ
び配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列
番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号
９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１５８
０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１０６を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１５０３を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１５８９を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１６０を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１５３７を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１５９を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１０１を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１６２を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１５３６および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１５３６および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１５３９および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１５３９および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１５３９および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
５３９および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３
９および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９およ
び配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および
配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列
番

号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号
１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１
６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１５３
７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１５９を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１０１を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１６２を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１０４を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１３８を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１５３６を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１５８５を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１５８５および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１５８５および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１５８５および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１５８５および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
１５８５および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５
８５および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８
５および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５
および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５およ
び配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および
配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列
番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号
１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１０
４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１３８を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１５３６を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１５３９を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
本発明の一部の態様において、ＢＣＬ１１ａの＋５８エンハンサー領域に対するｇＲＮ
Ａ分子は、図１１に挙げるｇＲＮＡの標的化ドメインを含むことが好ましい。ある態様に
おいて、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３４１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２４６を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２４８を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号
２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ
分子は、配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２４４を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１９９を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号
２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ
分子は、配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１８５を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１８６を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号
３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ
分子は、配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
本発明の一部の態様において、例えば、本明細書において指摘するとおり、２つ以上の
、例えば２つの標的部位を標的とするｇＲＮＡ分子（例えば、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子）を含むことが有益であり得る。一部の実施形態において、２つの標
的部位は両方ともに＋５８ ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域に位置する。かかる態様にお
いて、表７に挙げる標的化ドメインを含む２つ以上の、例えば２つのｇＲＮＡ分子（例え
ば、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子）の任意の組み合わせを用いることが
できる。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号３４１および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号３４１および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４
１および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１およ
び配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列
番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号１
８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号１８６を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号３３６を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号３３７を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号２４６を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号３４１および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号３４１および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号３４１および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３
４１および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１お
よび配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配
列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号
３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号１８５
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号１８６を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号３３６を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号３３７を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２４４を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号２４６および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号２４６および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号２４６および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
２４６および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６
および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および
配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番
号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２４
８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２４７を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２４５を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２４９を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２４４を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号２４６および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号２４６および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号２４６および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４
６および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６およ
び配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列
番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２
４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号１９９を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２５１を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２５０を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号３３４を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号２４８および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号２４８および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号２４８および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２
４８および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８お
よび配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配
列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号
２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号１９９
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２５１を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２５０を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号３３４を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
Ｒ

ＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号２４８および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号２４８および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号２４７および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２
４７および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７お
よび配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配
列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号
３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号１８５
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号１８６を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号３３６を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号３３７を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号２４６を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号２４７および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号２４７および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号２４７および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
２４７および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７
および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および
配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番
号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号１８
５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号１８６を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号３３６を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号３３７を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２４４を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号２４５および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号２４５および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号２４５および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４
５および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５およ
び配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列
番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２
４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２４８を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２４７を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２４９を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２４４を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号２４５および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号２４５および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号２４５および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２
４５および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５お
よび配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配
列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号
２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号１９９
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号２５１を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号２５０を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号３３４を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号１８５を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号２４９および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号２４９および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号２４９および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
２４９および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９
および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および
配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番
号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号１９
９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号２５１を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号２５０を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号３３４を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号１８５を含む、例えばそれから
な

る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号２４９および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号２４９および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号２４４および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
２４４および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４
および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および
配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番
号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号１８
６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号３３６を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号３３７を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号２４６を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号２４８を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号２４４および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号２４４および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号２４４および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号２４４および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４
４および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４およ
び配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列
番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号１
８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号３３６を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号３３７を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２４４を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２５１を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１９９および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１９９および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１９９および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
９９および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９お
よび配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配
列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号
２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２４５
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２４９を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２４４を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２５１を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２５０を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１９９および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１９９および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１９９および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
１９９および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１
および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および
配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番
号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号３３
４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号１８５を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号１８６を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号３３６を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号３３７を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号２５１および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号２５１および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号２５１および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号２５１および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５
１および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１およ
び配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列
番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号３
３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号１８５を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号１８６を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号３３６を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号３３７を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
Ｎ

Ａ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号２５０および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号２５０および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号２５０および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号２５０および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５
０および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０およ
び配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列
番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２
４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２４８を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２４７を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２４５を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２４９を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号２５０および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号２５０および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号２５０および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２
５０および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０お
よび配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配
列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号
２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号１９９
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２５１を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２５０を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号１８５を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号１８６を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号３３４および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号３３４および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号３３４および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
３３４および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４
および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および
配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番
号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号１９
９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２５１を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２５０を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号１８５を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号１８６を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号３３４および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１８５および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１８５および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１８５および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８
５および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５およ
び配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列
番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号３
３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号３３７を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２４６を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２４８を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２４７を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１８５および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１８５および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１８５および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
８５および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５お
よび配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配
列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号
３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号３３７
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２４４を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号１９９を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２５１を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２５０を含む、例えばそれからな
る

標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１８６および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１８６および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１８６および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
８６および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６お
よび配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配
列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号
２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２４９
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２４４を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号１９９を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２５１を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２５０を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１８６および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１８６および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１８６および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
３３６および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６
および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および
配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番
号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号３３
４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号１８５を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号１８６を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号３３７を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号２４６を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号３３６および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号３３６および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号３３６および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号３３６および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３
６および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６およ
び配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列
番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号３
３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号１８５を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号１８６を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号３３７を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２４４を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号３３７および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号３３７および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号３３７および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３
３７および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７お
よび配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配
列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号
２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２４７
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２４５を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２４９を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２４４を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号１９９を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号３３７および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号３３７および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号３３７および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
３３７および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７
および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
実施形態において、本発明の態様は、ＧＡＴＡ－１結合部位の３’側、例えばＧＡＴＡ
１結合部位およびＴＡＬ－１結合部位の３’側に配置されたＢＣＬ１１ａ遺伝子の＋５８
エンハンサー領域内にある標的配列と相補的なｇＲＮＡ分子に関するかまたはそれを包含
する。実施形態において、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステ
ムは、標的部位にまたはその近傍に１つ以上のインデルを含む。実施形態において、イン
デルはＧＡＴＡ－１結合部位のヌクレオチドを含まず、および／またはＴＡＬ－１結合部
位のヌクレオチドを含まない。実施形態において、本ＣＲＩＳＰＲシステムは、例えばＮ
ＧＳによって計測したとき、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくと
も約３０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％の総フレームシフトインデ
ル率で、標的部位にまたはその近傍に１つ以上のフレームシフトインデルを誘導する。実
施形態において、総インデル率は、例えばＮＧＳによって計測したとき、少なくとも約７
０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である。
本発明の一部の態様において、ＢＣＬ１１ａの＋６２エンハンサー領域に対するｇＲＮ
Ａ分子は、図１２に挙げるｇＲＮＡの標的化ドメインを含むことが好ましい。ある態様に
おいて、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３１８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３１２を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３１３を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号
２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ
分子は、配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２９８を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３２２を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号
３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ
分子は、配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３１７を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３０９を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号
２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ
分子は、配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
本発明の一部の態様において、例えば、本明細書において指摘するとおり、２つ以上の
、例えば２つの標的部位を標的とするｇＲＮＡ分子（例えば、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子）を含むことが有益であり得る。一部の実施形態において、２つの標
的部位は両方ともに＋６２ ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域に位置する。かかる態様にお
いて、表８に挙げる標的化ドメインを含む２つ以上の、例えば２つのｇＲＮＡ分子（例え
ば、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子）の任意の組み合わせを用いることが
できる。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号３１８および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号３１８および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１
８および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８およ
び配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列
番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号２
９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号３２２を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号３１１を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号３１５を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号２９０を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号３１８および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号３１８および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号３１２および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３
１２および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２お
よび配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配
列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号
２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号３２２
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号３１１を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号３１５を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号２９０を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号３１７を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号３１２および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号３１２および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号３１３および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
３１３および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３
および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および
配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番
号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号３２
２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号３１１を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号３１５を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号２９０を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号３１７を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号３１３および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号３１３および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号２９４および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号２９４および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９
４および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４およ
び配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列
番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号３
２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号３１１を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号３１５を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号２９０を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号３１７を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号２９４および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号３１０および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号３１０および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３
１０および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０お
よび配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配
列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号
３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号３１１
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号３１５を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号２９０を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号３１７を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
Ｒ

ＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号３１０および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号３１９および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号３１９および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３
１９および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９お
よび配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配
列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号
３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号３１１
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号３１５を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号２９０を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号３１７を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号３０９を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号３１９および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号２９８および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号２９８および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
２９８および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８
および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および
配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番
号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号３１
１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号３１５を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号２９０を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号３１７を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号３０９を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号２９８および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号３２２および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号３２２および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号３２２および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２
２および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２およ
び配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列
番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号３
１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号３１５を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号２９０を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号３１７を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号３０９を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号３１１および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号３１１および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号３１１および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３
１１および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１お
よび配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配
列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号
３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号３１５
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号２９０を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号３１７を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号３０９を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号２８９を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号３１５および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号３１５および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号３１５および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
３１５および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５
および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および
配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番
号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号３１
１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号２９０を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号３１７を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号３０９を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号２８９を含む、例えばそれから
な

る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号２９０および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号２９０および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号２９０および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
２９０および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０
および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および
配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番
号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号３１
１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号３１５を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号３１７を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号３０９を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号２８９を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号３１７および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号３１７および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号３１７および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号３１７および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１
７および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７およ
び配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列
番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号３
１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号３１５を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号２９０を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号３０９を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号２８９を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号３０９および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号３０９および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号３０９および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３
０９および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９お
よび配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配
列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号
３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号３１５
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号２９０を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号３１７を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号２８９を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号２８１を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号２８９および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号２８９および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号２８９および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
２８９および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９
および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および
配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番
号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号３１
５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号２９０を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号３１７を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号３０９を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号２８１を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号２８１および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号２８１および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号２８１および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号２８１および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８
１および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１およ
び配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列
番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号３
１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号２９０を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号３１７を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号３０９を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号２８９を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。
本発明の一部の態様において、ＢＣＬ１１ａの＋５５エンハンサー領域に対するｇＲＮ
Ａ分子は、配列番号１６８３、配列番号１６３８、配列番号１６４７、配列番号１６０９
、配列番号１６２１、配列番号１６１７、配列番号１６５４、配列番号１６３１、配列番
号１６２０、配列番号１６３７、配列番号１６１２、配列番号１６５６、配列番号１６１
９、配列番号１６７５、配列番号１６４５、配列番号１５９８、配列番号１５９９、配列
番号１６６３、配列番号１６７７、および配列番号１６２６から選択される標的化ドメイ
ン配列を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含むことが好ましい。
本発明の一部の態様において、例えば、本明細書において指摘するとおり、２つ以上の
、例えば２つの標的部位を標的とするｇＲＮＡ分子（例えば、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子）を含むことが有益であり得る。一部の実施形態において、２つの標
的部位は両方ともに＋５５ ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域に位置する。かかる態様にお
いて、＋５５ ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域の異なる標的部位を標的とする、表９に挙
げる標的化ドメインを含む、例えばそれからなる２つ以上の、例えば２つのｇＲＮＡ分子
（例えば、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子）の任意の組み合わせを用いる
ことができる。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１６８３および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１６８３および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１６８３および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１６８３および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１６８３および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１６８３および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１６８３および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
１６８３および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
６８３および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６
８３および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８
３および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３
および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３お
よび配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３およ
び配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および
配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配
列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列
番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番
号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号
１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１
６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６
０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６２
１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６１７
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６５４を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６３１を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６２０を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６３７を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６１２を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６５６を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６１９を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６７５を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６４５を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１５９８を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１５９９を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６６３を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１６４７および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１６４７および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１６４７および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１６４７および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１６４７および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１６４７および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１６４７および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
１６４７および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
６４７および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６
４７および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４
７および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７
および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７お
よび配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７およ
び配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および
配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配
列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列
番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番
号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号
１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１
６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６
３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
Ｎ

Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６２０
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６３７を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６１２を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６５６を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６１９を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６７５を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６４５を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１５９８を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１５９９を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６６３を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６７７を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６２６を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６３８を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１６２１および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１６２１および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１６２１および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１６２１および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１６２１および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１６２１および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１６２１および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
１６２１および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
６２１および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６
２１および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２
１および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１
および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７お
よび配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７およ
び配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および
配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配
列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列
番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番
号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号
１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１
６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６
１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６５
６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６１９
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６７５を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６４５を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１５９８を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１５９９を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６６３を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６７７を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６２６を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６３８を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６４７を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６０９を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６２１を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６１７を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１６５４および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１６５４および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１６５４および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１６５４および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１６５４および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１６５４および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１６５４および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
あ

る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
６５４および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６
３１および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３
１および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１
および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１お
よび配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１およ
び配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および
配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配
列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列
番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番
号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号
１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１
６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６
７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６４
５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１５９８
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１５９９を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６６３を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６７７を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６２６を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６３８を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６４７を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６０９を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６２１を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６１７を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６５４を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６３１を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６３７を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１６２０および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１６２０および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１６２０および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１６２０および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１６２０および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１６３７および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１６３７および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
１６３７および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
６３７および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６
３７および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３
７および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７
および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７お
よび配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７およ
び配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および
配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配
列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列
番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番
号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号
１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１
５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６
６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６７
７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６２６
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６３８を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６４７を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６０９を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６２１を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６１７を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６５４を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６３１を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６２０を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６３７を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６５６を含む、例えばそれか
ら

なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６１９を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１６１２および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１６１２および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１６５６および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１６５６および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１６５６および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１６５６および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１６５６および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
１６５６および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
６５６および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６
５６および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５
６および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６
および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６お
よび配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６およ
び配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および
配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配
列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列
番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番
号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号
１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１
６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６
３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６４
７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６０９
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６２１を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６１７を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６５４を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６３１を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６２０を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６３７を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６１２を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６５６を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６７５を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６４５を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１５９８を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１５９９を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１６７５および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１６７５および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１６７５および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１６７５および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１６７５および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１６７５および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１６７５および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
１６７５および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
６７５および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６
７５および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７
５および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５
および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５お
よび配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５およ
び配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および
配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配
列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列
番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番
号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号
１

６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６
２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６１
７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６５４
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６３１を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６２０を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６３７を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６１２を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６５６を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６１９を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６７５を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６３８を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６４７を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６０９を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６２１を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６１７を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１５９８および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１５９８および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１５９８および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１５９８および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列番号１５９８および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含
む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１５９８および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１５９８および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
１５９８および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
５９９および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５
９９および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９
９および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９
および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９お
よび配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９およ
び配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および
配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配
列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列
番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番
号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号
１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１
６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６
７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６４
５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１５９８
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６６３を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６７７を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６２６を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６３８を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６４７を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６０９を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６２１を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６１７を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６５４を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６３１を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６２０を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６３７を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１６６３および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それ
ぞれ配列番号１６６３および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ
ンを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞ
れ配列番号１６６３および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメイン
を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ
配列番号１６６３および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを
含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配
列

番号１６７７および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番
号１６７７および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号
１６７７および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１
６７７および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある
態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６
７７および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態
様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７
７および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様
において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７
および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様に
おいて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７お
よび配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様にお
いて、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７およ
び配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様におい
て、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および
配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において
、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配
列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、
第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列
番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第
１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番
号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１
のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号
１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１の
ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１
５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇ
ＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１５
９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲ
ＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６６
３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６２６
を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ
分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６３８を
含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分
子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６４７を含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子
および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６０９を含む
、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子お
よび第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６２１を含む、
例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子およ
び第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６１７を含む、例
えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および
第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６５４を含む、例え
ばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第
２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６３１を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２
のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６２０を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２の
ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６３７を含む、例えばそれ
からなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇ
ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６１２を含む、例えばそれか
らなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６５６を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６１９を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ
分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標
的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子
は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化
ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ド
メインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、そ
れぞれ配列番号１６２６および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメ
インを含む。
ＩＩＩ．ｇＲＮＡの設計方法
ｇＲＮＡの設計方法が、標的配列の選択、設計および検証方法を含め、本明細書に記載
される。例示的標的化ドメインも本明細書に提供される。本明細書で考察される標的化ド
メインは、本明細書に記載されるｇＲＮＡに組み込むことができる。
標的配列の選択および検証方法ならびにオフターゲット分析については、例えば、Ｍａ
ｌｉ ｅｌ ａｌ．，２０１３ ＳＣＩＥＮＣＥ ３３９（６１２１）：８２３－８２６
；Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ，２０１３ ＮＡＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ，３１（９）：８２７
－３２；Ｆｕ ｅｔ ａｌ，２０１４ ＮＡＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ，ｄｏｉ：１０．
１０３８／ｎｂｔ．２８０８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭ ＩＤ：２４４６３５７４；Ｈｅｉｇ
ｗｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１４ ＮＡＴ ＭＥＴＨＯＤＳ ｌｌ（２）：１２２－３．ｄ
ｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８１２．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４４８１２
１６；Ｂａｅ ｅｌ ａｌ，２０１４ ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＰｕｂＭｅｄ
ＰＭＩＤ：２４４６３１８１；Ｘｉａｏ Ａ ｅｌ ａｌ，２０１４ ＢＩＯＩＮＦＯＲ
ＭＡＴＩＣＳ ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４３８９６６２に記載される。
例えば、ソフトウェアツールを使用してユーザーの標的配列の範囲内でｇＲＮＡの選択
を最適化する、例えば、ゲノムにわたる全オフターゲット活性を最小限に抑えることがで
きる。オフターゲット活性は切断以外であり得る。ツールは、可能なｇＲＮＡの選択毎に
、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を用いて、特定の数（例えば
、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）に至るまでのミスマッチ塩基対
を含有するゲノムにわたる全てのオフターゲット配列（例えば、ＮＡＧ ＰＡＭまたはＮ
ＧＧ ＰＡＭのいずれかの前にあるもの）を同定し得る。各オフターゲット配列における
切断効率は、例えば、実験的に導き出された重み付けスキームを用いて予想し得る。次に
、可能な各ｇＲＮＡが、その総合的な予想オフターゲット切断に従い順位付けされる。上
位順位のｇＲＮＡが、オンターゲット切断が最大でオフターゲット切断が最小である可能
性が高いものに相当する。他の機能、例えば、ＣＲＩＳＰＲ構築のための自動試薬設計、
オンターゲットＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ用のプライマー設計、および次世代シーケンシ
ングによるオフターゲット切断のハイスループット検出および定量化用のプライマー設計
もツールに含まれ得る。候補ｇＲＮＡ分子は、当該技術分野において公知の方法により、
または本明細書に記載されるとおり判定することができる。
ソフトウェアアルゴリズムを用いて潜在的ｇＲＮＡ分子の初期リストを作成し得るが、
切断効率および特異性は必ずしも予測値を反映しているとは限らず、ｇＲＮＡ分子は、典
型的には、特定の細胞株、例えば初代ヒト細胞株、例えばヒトＨＳＰＣ、例えばヒトＣＤ
３４＋細胞でスクリーニングして、例えば、切断効率、インデル形成、切断特異性および
所望の表現型の変化を決定する必要がある。これらの特性は本明細書に記載される方法に
よってアッセイし得る。
本発明の態様において、ＣＲ００３１２の標的化ドメイン（配列番号２４８、以下に下
線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明
細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシス
テム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
本発明の態様において、ＣＲ００１１２８の標的化ドメイン（配列番号３３８、以下に
下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本
明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシ
ステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
本発明の態様において、ＣＲ００１１２６の標的化ドメイン（配列番号３３６、以下に
下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本
明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシ
ステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
本発明の態様において、ＣＲ００３１１の標的化ドメイン（配列番号２４７、以下に下
線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明
細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシス
テム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
本発明の態様において、ＣＲ００３０９の標的化ドメイン（配列番号２４５、以下に下
線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明
細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシス
テム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
本発明の態様において、ＣＲ００１１２７の標的化ドメイン（配列番号３３７、以下に
下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本
明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシ
ステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
本発明の態様において、ＣＲ００３１６の標的化ドメイン（配列番号２５２、以下に下
線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明
細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシス
テム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
本発明の態様において、ＣＲ００１１２５の標的化ドメイン（配列番号３３５、以下に
下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本
明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシ
ステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
本発明の態様において、ＣＲ００１０３０の標的化ドメイン（配列番号１００、以下に
下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本
明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシ
ステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
本発明の態様において、ＣＲ００１０２８の標的化ドメイン（配列番号９８、以下に下
線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明
細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシス
テム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
本発明の態様において、ＣＲ００１２２１の標的化ドメイン（配列番号１５８９、以下
に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲ
システム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
本発明の態様において、ＣＲ００１１３７の標的化ドメイン（配列番号１５０５、以下
に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲ
システム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
本発明の態様において、ＣＲ００３０３５の標的化ドメイン（配列番号１５０５、以下
に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲ
システム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
本発明の態様において、ＣＲ００３０８５の標的化ドメイン（配列番号１７５０、以下
に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲ
システム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は隣接ヌクレオチド間のホスホ
ロチオエート結合を意味し、および「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＵ）は２’－
ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇ
ＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば本明細書に記載されるとお
りのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかる
ＲＮＰは、例えば本明細書に記載される本発明の方法、細胞、および他の態様および実施
形態において特に有用である。
ＩＶ．Ｃａｓ分子
Ｃａｓ９分子
好ましい実施形態において、Ｃａｓ分子はＣａｓ９分子である。本明細書に記載される
方法および組成物では、様々な種のＣａｓ９分子を使用することができる。化膿レンサ球
菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子が本明細書における開示の多くの主題であるが
、本明細書に挙げる他の種のＣａｓ９タンパク質のＣａｓ９分子、それに由来するＣａｓ
９分子、またはそれをベースとするＣａｓ９分子も同様に使用することができる。換言す
れば、他のＣａｓ９分子、例えば、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）および／または髄
膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子が、本明細書に
記載されるシステム、方法および組成物で用いられ得る。さらなるＣａｓ９種としては、
アシドボラクス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス
・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃ
ｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｉｓ）、アクチノミセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、アリサイクリフィル
ス・デニトリフィカンス（Ａｌｉｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ
）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）
、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．）、ブ
ラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブラディ
リゾビウム属種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、ブレビバチルス・ラテロス
ポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター
・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ
ａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラド（Ｃａｍｐｙｌｏ
ｂａｃｔｅｒ ｌａｄ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ
Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マツルショッティイ（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉ
ｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、ユーバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ ｐｒｏ
ｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃ
ｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、パラインフルエンザ菌
（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトル
ム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈ
ｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シネディ（Ｈｅｌ
ｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂ
ａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅ
ｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、
ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、
リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサ
イトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科（Ｌｉｓ
ｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌、メチロシスティス属種（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ
．）、メチロサイナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓ
ｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ
）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ
）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、黄色球菌（Ｎｅｉ
ｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．）、ナイセリア
・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属種
（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒ
ｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐ
ａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラルクトバクテリウム・スクシ
ナツテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎ
ｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュード
モナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロ
ドブラム属種（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．）、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎ
ｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．）、スポロラクトバチルス・ビネエ（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．）、サブドリグラヌルム属種（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．）、テ
ィストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ属種（Ｔ
ｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．）、またはベルミネフォロバクター・エイセニエ（Ｖｅｒｍｉ
ｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）が挙げられる。
Ｃａｓ９分子は、その用語が本明細書において使用されるとき、ｇＲＮＡ分子（例えば
、ｔｒａｃｒのドメインの配列）と相互作用し、かつｇＲＮＡ分子と協力して標的配列お
よびＰＡＭ配列を含む部位に局在化する（例えば、それを標的化するかまたはそこにホー
ミングする）ことのできる分子を指す。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は標的核酸分子の切断能を有し、これは本明細書
では活性Ｃａｓ９分子と称され得る。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は以下の
活性の１つ以上を含む：ニッカーゼ活性、すなわち、核酸分子の一本鎖、例えば非相補鎖
または相補鎖を切断する能力；二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両方の
鎖を切断して二本鎖切断を作り出す能力、これはある実施形態では２つのニッカーゼ活性
の存在である；エンドヌクレアーゼ活性；エキソヌクレアーゼ活性；およびヘリカーゼ活
性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力。
ある実施形態において、酵素的に活性なＣａｓ９分子は両方のＤＮＡ鎖を切断して二本
鎖切断を生じさせる。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は一方の鎖のみ、例えば、ｇ
ＲＮＡがハイブリダイズする方の鎖、またはｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖に相補的な
鎖を切断する。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメインに関連す
る切断活性を含む。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメ
インに関連する切断活性を含む。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、ＨＮＨ様
ドメインに関連する切断活性とＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性とを含む。
ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、活性なまたは切断コンピテントなＨＮＨ様
ドメインと、不活性なまたは切断インコンピテントなＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む
。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、不活性なまたは切断インコンピテントな
ＨＮＨ様ドメインと、活性なまたは切断コンピテントなＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含
む。
ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子が標的核酸と相互作用してそれを切断する能
力は、ＰＡＭ配列依存的である。ＰＡＭ配列は標的核酸中の配列である。ある実施形態に
おいて、標的核酸の切断はＰＡＭ配列から上流で起こる。異なる細菌種の活性Ｃａｓ９分
子は異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識することができる。ある実施形態
において、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の活性Ｃａｓ９分子は配列モチーフ
ＮＧＧを認識し、その配列から１～１０、例えば３～５塩基対上流の標的核酸配列の切断
を導く。例えば、Ｍａｌｉ ｅｌ ａｉ，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１３；３３９（６１２１
）：８２３－８２６を参照されたい。ある実施形態において、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の活性Ｃａｓ９分子は配列モチーフＮＧＧＮＧおよびＮＮＡ
ＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）を認識し、これらの配列から１～１０、例えば３～５塩基対
上流のコア標的核酸配列の切断を導く。例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＳＣＩ
ＥＮＣＥ ２０１０；３２７（５９６２）：１６７－１７０、およびＤｅｖｅａｕ ｅｔ
ａｌ，Ｊ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ ２００８；１９０（４）：１３９０－１４００を参照
されたい。ある実施形態において、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の活性Ｃａｓ
９分子は配列モチーフＮＧＧまたはＮＡＡＲ（Ｒ－ＡまたはＧ）を認識し、この配列から
１～１０、例えば３～５塩基対上流のコア標的核酸配列の切断を導く。例えば、Ｄｅｖｅ
ａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ ２００８；１９０（４）：１ ３９０－
１４００を参照されたい。
ある実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の活性Ｃａｓ９分子は配
列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識し、その配列から１～１０、例えば３～
５塩基対上流の標的核酸配列の切断を導く。例えば、Ｒａｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴ
ＵＲＥ，ｖｏｌ．５２０，２０１５，ｐｐ．１８６－１９１を参照されたい。ある実施形
態において、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の活性Ｃａｓ９分子は配列モチ
ーフＮＮＮＮＧＡＴＴを認識し、その配列から１～１０、例えば３～５塩基対上流の標的
核酸配列の切断を導く。例えば、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＥＡＲＬＹ ＥＤＩ
ＴＩＯＮ ２０１３，１－６を参照されたい。Ｃａｓ９分子がＰＡＭ配列を認識する能力
は、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１２，３３７：８１６に記
載される形質転換アッセイを用いて決定することができる。
幾つかのＣａｓ９分子はｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と併せてコア標的ド
メインにホーミングする（例えば、標的化または局在化される）能力を有するが、標的核
酸を切断する能力は有しない、または効率的な比率で切断する能力は有しない。切断活性
を全く有しない、または実質的に有しないＣａｓ９分子は、本明細書では、不活性Ｃａｓ
９（酵素的に不活性なＣａｓ９）、デッドＣａｓ９、またはｄＣａｓ９分子と称され得る
。例えば、不活性Ｃａｓ９分子は切断活性を欠き、または実質的に低い、例えば本明細書
に記載されるアッセイによって計測したときに参照Ｃａｓ９分子の２０、１０、５、１ま
たは０．１％未満の切断活性を有し得る。
例示的な天然に存在するＣａｓ９分子については、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ，
ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３；１０：５，７２７－７３７に記載される。かかるＣ
ａｓ９分子には、クラスター１細菌ファミリー、クラスター２細菌ファミリー、クラスタ
ー３細菌ファミリー、クラスター４細菌ファミリー、クラスター５細菌ファミリー、クラ
スター６細菌ファミリー、クラスター７細菌ファミリー、クラスター８細菌ファミリー、
クラスター９細菌ファミリー、クラスター１０細菌ファミリー、クラスター１１細菌ファ
ミリー、クラスター１２細菌ファミリー、クラスター１３細菌ファミリー、クラスター１
４細菌ファミリー、クラスター１細菌ファミリー、クラスター１６細菌ファミリー、クラ
スター１７細菌ファミリー、クラスター１８細菌ファミリー、クラスター１９細菌ファミ
リー、クラスター２０細菌ファミリー、クラスター２１細菌ファミリー、クラスター２２
細菌ファミリー、クラスター２３細菌ファミリー、クラスター２４細菌ファミリー、クラ
スター２５細菌ファミリー、クラスター２６細菌ファミリー、クラスター２７細菌ファミ
リー、クラスター２８細菌ファミリー、クラスター２９細菌ファミリー、クラスター３０
細菌ファミリー、クラスター３１細菌ファミリー、クラスター３２細菌ファミリー、クラ
スター３３細菌ファミリー、クラスター３４細菌ファミリー、クラスター３５細菌ファミ
リー、クラスター３６細菌ファミリー、クラスター３７細菌ファミリー、クラスター３８
細菌ファミリー、クラスター３９細菌ファミリー、クラスター４０細菌ファミリー、クラ
スター４１細菌ファミリー、クラスター４２細菌ファミリー、クラスター４３細菌ファミ
リー、クラスター４４細菌ファミリー、クラスター４５細菌ファミリー、クラスター４６
細菌ファミリー、クラスター４７細菌ファミリー、クラスター４８細菌ファミリー、クラ
スター４９細菌ファミリー、クラスター５０細菌ファミリー、クラスター５１細菌ファミ
リー、クラスター５２細菌ファミリー、クラスター５３細菌ファミリー、クラスター５４
細菌ファミリー、クラスター５５細菌ファミリー、クラスター５６細菌ファミリー、クラ
スター５７細菌ファミリー、クラスター５８細菌ファミリー、クラスター５９細菌ファミ
リー、クラスター６０細菌ファミリー、クラスター６１細菌ファミリー、クラスター６２
細菌ファミリー、クラスター６３細菌ファミリー、クラスター６４細菌ファミリー、クラ
スター６５細菌ファミリー、クラスター６６細菌ファミリー、クラスター６７細菌ファミ
リー、クラスター６８細菌ファミリー、クラスター６９細菌ファミリー、クラスター７０
細菌ファミリー、クラスター７１細菌ファミリー、クラスター７２細菌ファミリー、クラ
スター７３細菌ファミリー、クラスター７４細菌ファミリー、クラスター７５細菌ファミ
リー、クラスター７６細菌ファミリー、クラスター７７細菌ファミリー、またはクラスタ
ー７８細菌ファミリーのＣａｓ９分子が含まれる。
例示的な天然に存在するＣａｓ９分子には、クラスター１細菌ファミリーのＣａｓ９分
子が含まれる。例としては、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（例えば、株ＳＦ
３７０、ＭＧＡＳ １０２７０、ＭＧＡＳ １０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３
１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１およびＳＳ
Ｉ－１）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、株ＬＭＤ－
９）、Ｓ．シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）（例えば、株ＳＰ
ＩＮ ２００２６）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（例えば、株ＵＡ １５９
、ＮＮ２０２５）、Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）（例えば、株ＮＣＴＣ１ １５
５８）、Ｓ．ガロリティカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば、株ＵＣＮ３４
、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－２０６９）、Ｓ．エクイナス（Ｓ．ｅｑｕｉｎｕｓ）（例えば、株
ＡＴＣＣ ９８１２、ＭＧＣＳ １２４）、Ｓ．ディスガラクティアエ（Ｓ．ｄｙｓｇａ
ｌａｃｔｉａｅ）（例えば、株ＧＧＳ １２４）、Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）（例え
ば、株ＡＴＣＣ ７００３３８）、Ｓ．アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（例え
ば、株Ｆ０２１１）、Ｓ．アガラクティアエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、株
ＮＥＭ３１６、Ａ９０９）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎ
ｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（例えば、株Ｆ６８５４）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔ
ｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）、例えば、株Ｃｌ
ｉｐ ｌ ２６２）、エンテロコッカス・イタリクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｔ
ａｌｉｃｕｓ）（例えば、株ＤＳＭ １５９５２）、またはエンテロコッカス・フェシウ
ム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）（例えば、株１，２３１，４０８）の
Ｃａｓ９分子が挙げられる。さらなる例示的Ｃａｓ９分子は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒ
ｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ Ｅ
ａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３，１－６）および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕ
ｓ）Ｃａｓ９分子である。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子、例えば活性Ｃａｓ９分子または不活性Ｃａｓ９
分子は、本明細書に記載される任意のＣａｓ９分子配列または天然に存在するＣａｓ９分
子配列、例えば、本明細書に挙げられるかまたはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒ
ＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３，１０：５，’Ｉ２’Ｉ－Τ，１，Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ
．ＰＮＡＳ Ｅａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３，１－６に記載される種のＣａｓ９
分子と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、それと比較したとき
に１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、または４０％以下のアミノ酸残
基が異なるか、それと１、２、５、１０または２０アミノ酸以上１００、８０、７０、６
０、５０、４０または３０アミノ酸以下異なるか、またはそれと同一である。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃ
ａｓ９：






と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％
、９８％、または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、それと比較したときに１
％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、または４０％以下のアミノ酸残基が
異なるか、それと１、２、５、１０または２０アミノ酸以上１００、８０、７０、６０、
５０、４０または３０アミノ酸以下異なるか、またはそれと同一である。
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、正電荷アミノ酸（例えば、リジン、アルギニンま
たはヒスチジン）に対して非荷電または非極性アミノ酸、例えばアラニンを前記位置に導
入する１つ以上の突然変異を含む配列番号６６１１の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、突然変異は、Ｃａｓ９のｎｔ溝にある
１つ以上の正電荷アミノ酸に対する突然変異である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は
、配列番号６６１１の８５５位における突然変異、例えば、配列番号６６１１の８５５位
における非荷電アミノ酸、例えばアラニンへの突然変異を含む配列番号６６１１の化膿レ
ンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９
分子は、配列番号６６１１と比べて配列番号６６１１の８５５位にのみ、例えば、非荷電
アミノ酸、例えばアラニンへの突然変異を有する。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、
配列番号６６１１の８１０位における突然変異、１００３位における突然変異、および／
または１０６０位における突然変異、例えば配列番号６６１１の８１０位、１００３位、
および／または１０６０位におけるアラニンへの突然変異を含む配列番号６６１１の化膿
レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ
９分子は、配列番号６６１１と比べて配列番号６６１１の８１０位、１００３位、および
１０６０位にのみ突然変異を有し、例えば、ここで、各突然変異は、非荷電アミノ酸、例
えばアラニンへの突然変異である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１
１の８４８位における突然変異、１００３位における突然変異、および／または１０６０
位における突然変異、例えば配列番号６６１１の８４８位、１００３位、および／または
１０６０位におけるアラニンへの突然変異を含む配列番号６６１１の化膿レンサ球菌（Ｓ
．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列
番号６６１１と比べて配列番号６６１１の８４８位、１００３位、および１０６０位にの
み突然変異を有し、例えば、ここで、各突然変異は、非荷電アミノ酸、例えばアラニンへ
の突然変異である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（２０１５年１２月１日、Ｓｃｉｅｎｃｅ ＤＯ
Ｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５２２７においてオンラインで利用可能）
に記載されるとおりのＣａｓ９分子である。
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、１つ以上の突然変異を含む配列番号６６１１の化
膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａ
ｓ９変異体は配列番号６６１１の８０位に突然変異を含み、例えば、配列番号６６１１の
８０位にロイシンを含む（すなわち、Ｃ８０Ｌ突然変異を有する配列番号６６１１を含む
、例えばそれからなる）。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は配列番号６６１１の５７
４位に突然変異を含み、例えば、配列番号６６１１の５７４位にグルタミン酸を含む（す
なわち、Ｃ５７４Ｅ突然変異を有する配列番号６６１１を含む、例えばそれからなる）。
実施形態において、Ｃａｓ９変異体は、配列番号６６１１の８０位における突然変異およ
び５７４位における突然変異を含み、例えば、配列番号６６１１の８０位にロイシン、お
よび配列番号６６１１の５７４位にグルタミン酸を含む（すなわち、Ｃ８０Ｌ突然変異お
よびＣ５７４Ｅ突然変異を有する配列番号６６１１を含む、例えばそれからなる）。理論
によって拘束されるものではないが、かかる突然変異はＣａｓ９分子の溶解特性を改善す
ると考えられる。
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、１つ以上の突然変異を含む配列番号６６１１の化
膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａ
ｓ９変異体は配列番号６６１１の１４７位に突然変異を含み、例えば、配列番号６６１１
の１４７位にチロシンを含む（すなわち、Ｄ１４７Ｙ突然変異を有する配列番号６６１１
を含む、例えばそれからなる）。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は配列番号６６１１
の４１１位に突然変異を含み、例えば、配列番号６６１１の４１１位にスレオニンを含む
（すなわち、Ｐ４１１Ｔ突然変異を有する配列番号６６１１を含む、例えばそれからなる
）。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は、配列番号６６１１の１４７位における突然変
異および４１１位における突然変異を含み、例えば、配列番号６６１１の１４７位にチロ
シン、および配列番号６６１１の４１１位にスレオニンを含む（すなわち、Ｄ１４７Ｙ突
然変異およびＰ４１１Ｔ突然変異を有する配列番号６６１１を含む、例えばそれからなる
）。理論によって拘束されるものではないが、かかる突然変異はＣａｓ９分子の例えば酵
母におけるターゲティング効率を改善すると考えられる。
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、１つ以上の突然変異を含む配列番号６６１１の化
膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａ
ｓ９変異体は配列番号６６１１の１１３５位に突然変異を含み、例えば、配列番号６６１
１の１１３５位にグルタミン酸を含む（すなわち、Ｄ１１３５Ｅ突然変異を有する配列番
号６６１１を含む、例えばそれからなる）。理論によって拘束されるものではないが、か
かる突然変異はＣａｓ９分子のＮＡＧ ＰＡＭ配列と比べたＮＧＧ ＰＡＭ配列に対する
選択性を改善すると考えられる。
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、特定の位置に非荷電または非極性アミノ酸、例え
ばアラニンを導入する１つ以上の突然変異を含む配列番号６６１１の化膿レンサ球菌（Ｓ
．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列
番号６６１１の４９７位における突然変異、６６１位における突然変異、６９５位におけ
る突然変異および／または９２６位における突然変異、例えば配列番号６６１１の４９７
位、６６１位、６９５位および／または９２６位におけるアラニンへの突然変異を含む配
列番号６６１１の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施
形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１と比べて配列番号６６１１の４９７位
、６６１位、６９５位、および９２６位にのみ突然変異を有し、例えば、ここで、各突然
変異は、非荷電アミノ酸、例えばアラニンへの突然変異である。理論によって拘束される
ものではないが、かかる突然変異はＣａｓ９分子によるオフターゲット部位の切断を低減
すると考えられる。
Ｃａｓ９分子に対する本明細書に記載される突然変異は組み合わせてもよく、本明細書
に記載される融合または他の修飾のいずれかと組み合わせて、そのＣａｓ９分子を本明細
書に記載されるアッセイで試験してもよいことが理解されるであろう。
本明細書に開示される本発明の実施には、様々なタイプのＣａｓ分子を使用することが
できる。一部の実施形態において、ＩＩ型ＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。他
の実施形態において、他のＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。例えば、Ｉ型また
はＩＩＩ型Ｃａｓ分子が使用されてもよい。例示的Ｃａｓ分子（およびＣａｓシステム）
については、Ｈａｆｔ ｅｔ ａｉ，ＰＬｏＳ ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＢＩＯＬ
ＯＧＹ ２００５，１（６）：ｅ６０およびＭａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ，ＮＡＴＵＲ
Ｅ ＲＥＶＩＥＷ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ２０１ １，９：４６７－４７７（両方
の参考文献の内容が全体として参照により本明細書に援用される）に記載される。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は、以下の活性の１つ以上を含む：ニッカーゼ活
性；二本鎖切断活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活
性）；ヘリカーゼ活性；またはｇＲＮＡ分子と一緒になって標的核酸に局在化する能力。
改変Ｃａｓ９分子
天然に存在するＣａｓ９分子は、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンド
ヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；ｇＲＮＡ分子
と機能的に関連する能力；および核酸上の部位を標的化する（またはそこに局在化する）
能力（例えば、ＰＡＭ認識および特異性）を含め、幾つもの特性を有する。ある実施形態
において、Ｃａｓ９分子はこれらの特性の全てまたは一部を含み得る。典型的な実施形態
において、Ｃａｓ９分子はｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協力して核酸の部
位に局在化する能力を有する。他の活性、例えば、ＰＡＭ特異性、切断活性、またはヘリ
カーゼ活性はＣａｓ９分子でより広く異なり得る。
所望の特性を有するＣａｓ９分子は、幾つもの方法で、例えば、親の、例えば天然に存
在するＣａｓ９分子の改変によって所望の特性を有する改変Ｃａｓ９分子を提供すること
により作製し得る。例えば、親Ｃａｓ９分子と比べた１つ以上の突然変異または違いを導
入することができる。かかる突然変異および違いには、置換（例えば、保存的置換または
非必須アミノ酸の置換）；挿入；または欠失が含まれる。ある実施形態において、Ｃａｓ
９分子は、参照Ｃａｓ９分子と比べて１つ以上の突然変異または違い、例えば１、２、３
、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０個以上の突然変異、２００、１００
、または８０個未満の突然変異を含み得る。
ある実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、Ｃａｓ９活性、例えば本明細書
に記載されるＣａｓ９活性に実質的な効果を及ぼさない。ある実施形態において、１つま
たは複数の突然変異は、Ｃａｓ９活性、例えば本明細書に記載されるＣａｓ９活性に対し
て実質的な効果を及ぼす。ある実施形態において、例示的活性には、ＰＡＭ特異性、切断
活性、およびヘリカーゼ活性の１つ以上が含まれる。１つまたは複数の突然変異は、例え
ば、１つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン、例えばＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン；ＨＮＨ様ドメイ
ン；ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインの外側の領域に存在し得る。一部の実施
形態において、１つまたは複数の突然変異はＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに存在する。一部
の実施形態において、１つまたは複数の突然変異はＨＮＨ様ドメインに存在する。一部の
実施形態において、突然変異はＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインの両方
に存在する。
詳細な配列、例えば置換が、ターゲティング活性、切断活性などの１つ以上の活性に影
響を及ぼし得るか否かは、例えば、その突然変異が保存されたものかどうかを判定するこ
とにより、または第ＩＩＩ節に記載される方法により、判定または予想することができる
。ある実施形態において、「非必須」アミノ酸残基とは、Ｃａｓ９分子との関連において
使用されるとき、Ｃａｓ９活性（例えば、切断活性）を無効にすることなく、またはより
好ましくはそれを実質的に改変することなくＣａｓ９分子、例えば天然に存在するＣａｓ
９分子、例えば活性Ｃａｓ９分子の野生型配列から改変することのできる残基であり、一
方、「必須」アミノ酸残基の変化は実質的な活性（例えば、切断活性）の喪失をもたらす
。
改変されたＰＡＭ認識を有するかまたはＰＡＭ認識のないＣａｓ９分子
天然に存在するＣａｓ９分子は、特異的ＰＡＭ配列、例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐ
ｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュー
タンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および髄膜炎菌（Ｎ
．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）について上記に記載したＰＡＭ認識配列を認識することが
できる。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は天然に存在するＣａｓ９分子と同じＰＡＭ特異
性を有する。他の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子との
関連性がないＰＡＭ特異性、またはそれが最も近い配列相同性を有する天然に存在するＣ
ａｓ９分子との関連性がないＰＡＭ特異性を有する。例えば、天然に存在するＣａｓ９分
子を改変することにより、例えばＰＡＭ認識を改変する、例えばＣａｓ９分子が認識する
ＰＡＭ配列を改変してオフターゲット部位を減少させる、および／または特異性を向上さ
せるか、またはＰＡＭ認識要件をなくすことができる。ある実施形態において、Ｃａｓ９
分子を改変することにより、例えばＰＡＭ認識配列の長さを増加させ、および／またはＣ
ａｓ９特異性を高い同一性レベルとなるよう向上させて、オフターゲット部位を減少させ
、かつ特異性を高めることができる。ある実施形態において、ＰＡＭ認識配列の長さは少
なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１５アミノ酸長である。異なるＰＡＭ配列
を認識する、および／またはオフターゲット活性が低下したＣａｓ９分子は、定方向進化
を用いて作成することができる。Ｃａｓ９分子の定方向進化に用いることのできる例示的
方法およびシステムについては、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｌ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２
０１１，４７２（７３４４）：４９９－５０３に記載されている。候補Ｃａｓ９分子は、
例えば本明細書に記載される方法によって評価することができる。
非切断型および修飾切断型Ｃａｓ９分子
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子と異なる、例え
ば、最も近い相同性を有する天然に存在するＣａｓ９分子と異なる切断特性を含む。例え
ば、Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏ
ｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子と以下のとおり異なり得る：例えば天然に存在するＣａｓ９
分子（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較したと
きに二本鎖切断の切断（エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）を
調整する、例えば低下または増加させるその能力；例えば天然に存在するＣａｓ９分子（
例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較したときに核
酸の一本鎖、例えば核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖の切断（ニッカーゼ活性
）を調整する、例えば低下または増加させるその能力；または核酸分子、例えば二本鎖ま
たは一本鎖核酸分子を切断する能力を除去し得る。
修飾切断型活性Ｃａｓ９分子
ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、以下の活性の１つ以上を含む：Ｎ末端Ｒ
ｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨド
メインに関連する切断活性およびＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子はＣａｓ９ニッカーゼであり、例えばＤＮＡの一
本鎖のみを切断する。ある実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは配列番号６６１１の
１０位における突然変異および／または８４０位における突然変異を含み、例えば、配列
番号６６１１に対するＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ突然変異を含む。
非切断型不活性Ｃａｓ９分子
ある実施形態において、改変Ｃａｓ９分子は、核酸分子を（二本鎖核酸分子または一本
鎖核酸分子のいずれも）切断しない、または核酸分子を著しく低い効率で、例えば、本明
細書に記載されるアッセイによって例えば計測したときに参照Ｃａｓ９分子の切断活性の
２０、１０、５、１または０．１％未満の効率で切断する不活性Ｃａｓ９分子である。参
照Ｃａｓ９分子は、天然に存在する非修飾Ｃａｓ９分子、例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．
ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、黄色ブド
ウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ
９分子など、天然に存在するＣａｓ９分子であり得る。ある実施形態において、参照Ｃａ
ｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然に存在するＣａｓ９分子であ
る。ある実施形態において、不活性Ｃａｓ９分子は、実質的なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン
に関連する切断活性およびＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性を欠いている。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子はｄＣａｓ９である。Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．（
２０１４），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：５６９－５７７。
触媒的に不活性なＣａｓ９分子が転写リプレッサーと融合してもよい。不活性Ｃａｓ９
融合タンパク質はｇＲＮＡと複合体化し、ｇＲＮＡの標的化ドメインによって指定される
ＤＮＡ配列に局在化するが、活性Ｃａｓ９と異なり、それが標的ＤＮＡを切断することは
ない。転写抑制ドメインなどのエフェクタードメインを不活性Ｃａｓ９に融合すると、ｇ
ＲＮＡによって指定される任意のＤＮＡ部位にそのエフェクターを動員することが可能に
なる。Ｃａｓ９融合タンパク質を遺伝子のプロモーター領域に部位特異的に標的化すると
、そのプロモーター領域へのポリメラーゼの結合、例えば転写因子（例えば、転写活性化
因子）とのＣａｓ９融合および／または核酸への転写エンハンサーの結合を遮断し、また
はそれに影響を及ぼして、転写活性化を増加させるかまたは阻害することができる。ある
いは、転写リプレッサーとのＣａｓ９融合物を遺伝子のプロモーター領域に部位特異的に
標的化することを用いて、転写活性化を低下させることができる。
不活性Ｃａｓ９分子と融合させ得る転写リプレッサーまたは転写リプレッサードメイン
には、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用
ドメイン（ＳＩＤ）またはＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）が含まれ得る。
別の実施形態において、不活性Ｃａｓ９分子が、クロマチンを修飾するタンパク質と融
合してもよい。例えば、不活性Ｃａｓ９分子が、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１
）、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ
２、Ｇ９Ａ、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ ｌ、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１，Ｒ
ＩＺ１）、ヒストンリジンデメチラーゼ（例えば、ＬＳＤ１／ＢＨＣ１１０、ＳｐＬｓｄ
ｌ／Ｓｗ，ｌ／Ｓａｆｌ １０、Ｓｕ（ｖａｒ）３－３、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、
ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、Ｒｐｈｌ、ＪＡＲＩＤ １Ａ
／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤＩＢ／ＰＬＵ－Ｉ、ＪＡＲ１Ｄ １Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１
Ｄ／ＳＭＣＹ、Ｌｉｄ、Ｊｈｎ２、Ｊｍｊ２）、ヒストンリジンデアセチラーゼ（例えば
、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、Ｒｐｄ３、Ｈｏｓｌ、Ｃｉｒ６、
ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、Ｈｄａｌ、Ｃｉｒ３、ＳＩＲＴ１、
ＳＩＲＴ２、Ｓｉｒ２、Ｈｓｔｌ、Ｈｓｔ２、Ｈｓｔ３、Ｈｓｔ４、ＨＤＡＣ１１）およ
びＤＮＡメチラーゼ（ＤＮＭＴ１，ＤＮＭＴ２ａ／ＤＭＮＴ３ｂ、ＭＥＴ１）と融合して
もよい。不活性Ｃａｓ９－クロマチン修飾分子融合タンパク質を使用してクロマチン状態
を改変し、標的遺伝子の発現を低下させることができる。
異種配列（例えば、転写リプレッサードメイン）は不活性Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端
またはＣ末端に融合し得る。代替的実施形態において、異種配列（例えば、転写リプレッ
サードメイン）は不活性Ｃａｓ９タンパク質の内側部分（すなわち、Ｎ末端またはＣ末端
以外の部分）に融合し得る。
Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が標的核酸に結合してそれを切断する能力は、例え
ば、本明細書の第ＩＩＩ節に記載される方法によって判定することができる。Ｃａｓ９分
子、例えば活性Ｃａｓ９または不活性Ｃａｓ９のいずれかの、単独での、またはｇＲＮＡ
分子との複合体での活性も、遺伝子発現アッセイおよびクロマチンに基づくアッセイ、例
えばクロマチン免疫沈降（ＣｈｉＰ）およびクロマチンインビボアッセイ（ＣｉＡ）を含
め、当該技術分野において周知の方法によって判定し得る。
他のＣａｓ９分子融合物
実施形態において、Ｃａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の
Ｃａｓ９は、さらなる活性を付与する１つ以上のアミノ酸配列をさらに含み得る。
一部の態様において、Ｃａｓ９分子は１つ以上の核移行配列（ＮＬＳ）、例えば少なく
とも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるＮＬＳを含み得る
。一部の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、アミノ末端にまたはその近傍に少なくとも
１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれを超えるＮＬＳを含むか、カ
ルボキシ末端にまたはその近傍に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０
個、またはそれを超えるＮＬＳを含むか、またはこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末
端に１つ以上のＮＬＳおよびカルボキシ末端に１つ以上のＮＬＳ）である。２つ以上のＮ
ＬＳが存在するとき、各々は他と独立して選択されてもよく、したがって２つ以上のコピ
ーに単一のＮＬＳが存在することも、および／または１つ以上のコピーに存在する１つ以
上の他のＮＬＳとの組み合わせで存在することもある。一部の実施形態において、ＮＬＳ
は、ＮＬＳの最も近いアミノ酸がポリペプチド鎖に沿ってＮ末端またはＣ末端から約１、
２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０アミノ酸、またはそれを超
える範囲内にあるとき、Ｎ末端またはＣ末端の近傍にあると見なされる。典型的には、Ｎ
ＬＳは、タンパク質表面に露出した正電荷リジンまたはアルギニンの１つ以上の短い配列
からなるが、他のタイプのＮＬＳが公知である。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ
酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６６１２）を有する、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原の
ＮＬＳ；ヌクレオプラスミンのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ
（配列番号６６１３）を有するヌクレオプラスミンバイパータイトＮＬＳ；アミノ酸配列
ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号６６１４）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号６６
１５）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰ
ＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号６６１６）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９
ＮＬＳ；インポーチン－αのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬ
ＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号６６１７）；筋腫Ｔ
タンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号６６１８）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列
番号６６１９）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号６６２０）；マウスｃ－
ａｂ１ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号６６２１）；インフルエンザウ
イルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号６６２２）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号６
６２３）；肝炎ウイルスδ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号６６２４）；マウ
スＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号６６２５）；ヒトポリ（ＡＤ
Ｐ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番
号６６２６）；およびステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫ
ＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号６６２７）を含むかまたはそれに由来するＮ
ＬＳ配列が挙げられる。他の好適なＮＬＳ配列は当該技術分野において公知である（例え
ば、Ｓｏｒｏｋｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）（２００７）７２：１
３，１４３９－１４５７；Ｌａｎｇｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２００７）２８２：
８，５１０１－５）。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ
）Ｃａｓ９分子は、例えばＣａｓ９分子のＮ端側に配置された、ＳＶ４０のＮＬＳ配列を
含む。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓ）Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子のＮ端側に配置されたＳＶ４０のＮＬＳ配列および
Ｃａｓ９分子のＣ端側に配置されたＳＶ４０のＮＬＳ配列を含む。ある実施形態において
、Ｃａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子は、Ｃａ
ｓ９分子のＮ端側に配置されたＳＶ４０のＮＬＳ配列およびＣａｓ９分子のＣ端側に配置
されたヌクレオプラスミンのＮＬＳ配列を含む。前述の実施形態のいずれにおいても、こ
の分子は、例えばＮ末端またはＣ末端に、タグ、例えばＨｉｓタグ、例えばＨｉｓ（６）
タグまたはＨｉｓ（８）タグをさらに含み得る。
一部の態様において、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子が特異的に認識されることを可能
にする１つ以上のアミノ酸配列、例えばタグを含み得る。一実施形態において、タグは、
ヒスチジンタグ、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを
超えるヒスチジンアミノ酸を含むヒスチジンタグである。実施形態において、ヒスチジン
タグはＨｉｓ６タグ（６個のヒスチジン）である。他の実施形態において、ヒスチジンタ
グはＨｉｓ８タグ（８個のヒスチジン）である。実施形態において、ヒスチジンタグは、
リンカーによってＣａｓ９分子の１つ以上の他の部分と分離されていてもよい。実施形態
において、リンカーはＧＧＳである。かかる融合物の例は、Ｃａｓ９分子ｉＰｒｏｔ１０
６５２０である。
一部の態様において、Ｃａｓ９分子は、プロテアーゼによって認識される１つ以上のア
ミノ酸配列を含み得る（例えば、プロテアーゼ切断部位を含む）。実施形態において、切
断部位はタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり、例えば、配列ＥＮＬＹＦＱＧ
（配列番号７８１０）を含む。一部の態様においてプロテアーゼ切断部位、例えばＴＥＶ
切断部位は、タグ、例えばＨｉｓタグ、例えばＨｉｓ６またはＨｉｓ８タグとＣａｓ９分
子の残りの部分との間に配置される。理論によって拘束されるものではないが、かかる導
入により、タグを例えばＣａｓ９分子の精製に使用し、次に続いて切断して、タグがＣａ
ｓ９分子の機能を妨げないようにすることが可能になると考えられる。
実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分
子）はＮ末端ＮＬＳおよびＣ末端ＮＬＳを含み（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、ＮＬＳ－
Ｃａｓ９－ＮＬＳを含み）、例えば、ここで、各ＮＬＳはＳＶ４０ ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲ
ＫＶ（配列番号６６１２））である。実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細
書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末端ＮＬＳ、Ｃ末端ＮＬＳ、およびＣ末端Ｈ
ｉｓ６タグを含み（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＮＬＳ－Ｈｉｓタ
グを含み）、例えば、ここで、各ＮＬＳはＳＶ４０ ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号
６６１２））である。実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載される
とおりのＣａｓ９分子）はＮ末端Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ）、Ｎ末端ＮＬＳ、
およびＣ末端ＮＬＳを含み（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、Ｈｉｓタグ－ＮＬＳ－Ｃａｓ
９－ＮＬＳを含み）、例えば、ここで、各ＮＬＳはＳＶ４０ ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（
配列番号６６１２））である。実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記
載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末端ＮＬＳおよびＣ末端Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉ
ｓ６タグ）を含み（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、Ｈｉｓタグ－Ｃａｓ９－ＮＬＳを含み
）、例えば、ここで、ＮＬＳはＳＶ４０ ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６６１２）
）である。実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣ
ａｓ９分子）はＮ末端ＮＬＳおよびＣ末端Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ）を含み（
例えば、Ｎ末端からＣ末端に、ＮＬＳ－Ｃａｓ９－Ｈｉｓタグを含み）、例えば、ここで
、ＮＬＳはＳＶ４０ ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６６１２））である。実施形態
において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末
端Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ８タグ）、Ｎ末端切断ドメイン（例えば、タバコエッチウ
イルス（ＴＥＶ）切断ドメイン（例えば、配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号７８１０）を含
む））、Ｎ末端ＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ；配列番号６６１２）、およびＣ末端
ＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ；配列番号６６１２）を含む（例えば、Ｎ末端からＣ
末端に、Ｈｉｓタグ－ＴＥＶ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＮＬＳを含む）。前述の実施形態のい
ずれにおいてもＣａｓ９は配列番号６６１１の配列を有する。あるいは、前述の実施形態
のいずれにおいても、Ｃａｓ９は、例えば本明細書に記載されるとおりの、配列番号６６
１１のＣａｓ９変異体の配列を有する。前述の実施形態のいずれにおいても、Ｃａｓ９分
子は、Ｈｉｓタグと分子の別の部分との間にリンカー、例えばＧＧＳリンカーを含む。上
記に記載される例示的Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列を以下に提供する。「ｉＰｒｏｔ」識
別名は図６０のものと一致する。










Ｃａｓ９分子をコードする核酸
Ｃａｓ９分子、例えば活性Ｃａｓ９分子または不活性Ｃａｓ９分子をコードする核酸が
本明細書に提供される。
Ｃａｓ９分子をコードする例示的核酸は、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ，ＳＣＩＥＮＣＥ ２
０１３，３９９（６１２１）：８１９－８２３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，ＣＥＬＬ ２０
１３，１５３（４）：９１０－９１８；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０
１３，３９９（６１２１）：８２３－８２６；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ，ＳＣＩＥＮＣＥ
２０１２，３３７（６０９６）：８１６－８２１に記載されている。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子をコードする核酸は合成核酸配列であってもよい
。例えば、合成核酸分子は、例えば第ＸＩＩＩ節に記載するとおり、化学的に修飾するこ
とができる。ある実施形態において、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは以下の特性の１つ以上、例え
ば全てを有する：これはキャッピングされている、ポリアデニル化されている、５－メチ
ルシチジンおよび／またはプソイドウリジンで置換されている。
加えてまたは代わりに、合成核酸配列はコドン最適化されてもよく、例えば、少なくと
も１つのまれな頻度のコドンまたは低頻度のコドンが高頻度のコドンに置き換えられてい
る。例えば、合成核酸は、例えば本明細書に記載される哺乳動物発現系における発現に例
えば最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を導くことができる。
以下に、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子をコードする例示的
コドン最適化核酸配列を提供する。



上記のＣａｓ９配列をＣ末端でペプチドまたはポリペプチドと融合させる場合（例えば
、Ｃ末端で転写リプレッサーと融合した不活性Ｃａｓ９）、終止コドンは取り除かれるで
あろうことが理解される。
ＶＩ．候補分子の機能分析
候補Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、当
該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり評価すること
ができる。例えば、Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価する例示的方法が、例
えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｌ ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１２；３３７（６０９６）：８
１６－８２１に記載されている。
ＶＩＩ．鋳型核酸（核酸導入用）
用語「鋳型核酸」または「ドナー鋳型」は、本明細書で使用されるとき、本発明のＣＲ
ＩＳＰＲシステムによって修飾、例えば切断された標的配列にまたはその近傍に挿入され
る核酸を指す。ある実施形態において、標的配列のまたはその近傍の核酸配列が、典型的
には１つまたは複数の切断部位にまたはその近傍に鋳型核酸の配列の一部または全てを有
するように修飾される。ある実施形態において、鋳型核酸は一本鎖である。代替的実施形
態において、鋳型核酸は二本鎖である。ある実施形態において、鋳型核酸はＤＮＡ、例え
ば二本鎖ＤＮＡである。代替的実施形態において、鋳型核酸は一本鎖ＤＮＡである。
実施形態において、鋳型核酸は、グロビンタンパク質、例えばβグロビンをコードする
配列を含み、例えばβグロビン遺伝子を含む。ある実施形態において、核酸によってコー
ドされるβグロビンは１つ以上の突然変異、例えば抗鎌状化突然変異を含む。ある実施形
態において、核酸によってコードされるβグロビンは突然変異Ｔ８７Ｑを含む。ある実施
形態において、核酸によってコードされるβグロビンは突然変異Ｇ１６Ｄを含む。ある実
施形態において、核酸によってコードされるβグロビンは突然変異Ｅ２２Ａを含む。ある
実施形態において、βグロビン遺伝子は、突然変異Ｇ１６Ｄ、Ｅ２２ＡおよびＴ８７Ｑを
含む。実施形態において、鋳型核酸は、１つ以上の調節エレメント、例えば、プロモータ
ー（例えば、ヒトβグロビンプロモーター）、３’エンハンサー、および／またはグロビ
ン遺伝子座制御領域の少なくとも一部分（例えば、１つ以上のＤＮアーゼＩ高感受性部位
（例えば、ヒトグロビン遺伝子座のＨＳ２、ＨＳ３および／またはＨＳ４））をさらに含
む。
他の実施形態において、鋳型核酸は、γグロビンをコードする配列を含み、例えばγグ
ロビン遺伝子を含む。実施形態において、鋳型核酸は、γグロビンタンパク質の２つ以上
のコピーをコードする配列を含み、例えば、２つ以上、例えば２つのγグロビン遺伝子配
列を含む。実施形態において、鋳型核酸は１つ以上の調節エレメント、例えばプロモータ
ーおよび／またはエンハンサーをさらに含む。
ある実施形態において、鋳型核酸は、相同組換え修復イベントに関与することによって
標的位置の構造を改変する。ある実施形態において、鋳型核酸は標的位置の配列を改変す
る。ある実施形態において、鋳型核酸は標的核酸への修飾された、または天然に存在しな
い塩基の取込みをもたらす。
本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異は、本明細書で考察する手法
の１つを用いて修正し得る。ある実施形態において、本明細書に記載される遺伝子または
経路における突然変異は、鋳型核酸を用いた相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修正され
る。ある実施形態において、本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異は
、鋳型核酸を用いた相同的組換え（ＨＲ）によって修正される。ある実施形態において、
本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異は、鋳型核酸を用いた非相同末
端結合（ＮＨＥＪ）修復によって修正される。他の実施形態において、目的の分子をコー
ドする核酸が、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムによって修飾された部位にまたはその近傍
に挿入され得る。実施形態において、鋳型核酸は、例えば本明細書に記載されるとおりの
、目的の分子をコードする核酸配列に作動可能に連結された調節エレメント、例えば１つ
以上のプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。
ＨＤＲまたはＨＲ修復および鋳型核酸
本明細書に記載されるとおり、ヌクレアーゼ誘導相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同
的組換え（ＨＲ）を用いて標的配列を改変し、およびゲノムの突然変異を修正（例えば、
修復または編集）することができる。理論によって拘束されることを望むものではないが
、標的配列の改変は、ドナー鋳型または鋳型核酸に基づく修復によって起こると考えられ
る。例えば、ドナー鋳型または鋳型核酸が標的配列の改変をもたらす。プラスミドドナー
または線状二本鎖鋳型を相同的組換えの鋳型として使用し得ることが企図される。さらに
、一本鎖ドナー鋳型を標的配列とドナー鋳型との間の代替的相同組換え修復方法（例えば
、一本鎖アニーリング）による標的配列の改変の鋳型として使用し得ることが企図される
。ドナー鋳型によって達成される標的配列の改変は、Ｃａｓ９分子による切断に依存し得
る。Ｃａｓ９による切断には、二本鎖切断、１つの一本鎖切断、または２つの一本鎖切断
が含まれ得る。
ある実施形態において、突然変異は単一の二本鎖切断または２つの一本鎖切断のいずれ
によっても修正することができる。ある実施形態において、突然変異は、（１）１つの二
本鎖切断、（２）２つの一本鎖切断、（３）標的配列の各側に切断が生じる２つの二本鎖
切断、（４）標的配列の各側に二本鎖切断および２つの一本鎖切断が生じる１つの二本鎖
切断および２つの一本鎖切断、（５）標的配列の各側に一対の一本鎖切断が生じる４つの
一本鎖切断、または（６）１つの一本鎖切断を作り出すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム
および鋳型を提供することにより修正し得る。
二本鎖切断の媒介による修正
ある実施形態において、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性とＲｕｖＣ様ドメイン、
例えばＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性とを有するＣａｓ９分子、例えば野
生型Ｃａｓ９によって二本鎖切断が達成される。かかる実施形態には単一のｇＲＮＡのみ
が必要である。
一本鎖切断の媒介による修正
他の実施形態において、ニッカーゼ活性、例えばＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性
またはＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性を有するＣａｓ９分子によって２つ
の一本鎖切断、すなわちニックが達成される。かかる実施形態には、各一本鎖切断の配置
につき１つずつ、２つのｇＲＮＡが必要である。ある実施形態において、ニッカーゼ活性
を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断し、ｇＲＮＡがハイブ
リダイズする鎖に相補的な鎖は切断しない。ある実施形態において、ニッカーゼ活性を有
するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断せず、むしろｇＲＮＡがハ
イブリダイズする鎖に相補的な鎖を切断する。
ある実施形態において、ニッカーゼはＨＮＨ活性を有し、例えば、ＲｕｖＣ活性が不活
性化されているＣａｓ９分子、例えば、Ｄ１０における突然変異、例えばＤ１０Ａ突然変
異を有するＣａｓ９分子である。Ｄ１０ＡはＲｕｖＣを不活性化する。したがって、Ｃａ
ｓ９ニッカーゼはＨＮＨ活性（のみ）を有し、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖（例えば
、そこにＮＧＧ ＰＡＭを有しない相補鎖）を切断することになる。他の実施形態におい
て、Ｈ８４０、例えばＨ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子をニッカーゼとして使用
することができる。Ｈ８４０ＡはＨＮＨを不活性化する。したがって、Ｃａｓ９ニッカー
ゼはＲｕｖＣ活性（のみ）を有し、非相補鎖（例えば、ＮＧＧ ＰＡＭを有し、かつその
配列がｇＲＮＡと同一である鎖）を切断する。
ニッカーゼおよび２つのｇＲＮＡを使用して２つの一本鎖ニックを配置する実施形態に
おいて、１つのニックは標的核酸の＋鎖上にあり、１つのニックは－鎖上にある。ＰＡＭ
は外側に面している。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡが約０～５０、０～１００、または０～２０
０ヌクレオチド分離されるように選択することができる。ある実施形態において、２つの
ｇＲＮＡの標的化ドメインと相補的な標的配列間にオーバーラップはない。ある実施形態
において、ｇＲＮＡはオーバーラップせず、５０、１００、または２００ヌクレオチドほ
ども分離されている。ある実施形態において、２つのｇＲＮＡを使用すると、例えばオフ
ターゲット結合が減少することにより特異性が増加し得る（Ｒａｎ ｅｌ ｃｉｌ．，Ｃ
ＥＬＬ ２０１３）。
ある実施形態では、単一のニックを使用してＨＤＲが誘導され得る。本明細書では、単
一のニックを使用して所与の切断部位におけるＨＤＲ、ＨＲまたはＮＨＥＪ率を増加させ
得ることが企図される。
標的位置に対する二本鎖切断または一本鎖切断の配置
鎖の一方における二本鎖切断点または一本鎖切断点は、修正が起こるように標的位置に
十分に近くなければならない。ある実施形態において、距離は５０、１００、２００、３
００、３５０または４００ヌクレオチド以下である。理論によって拘束されることを望む
ものではないが、切断点は、末端リセクション間に切断点がエキソヌクレアーゼ媒介性の
除去を受ける領域内にあるように、標的位置に十分に近くなければならないと考えられる
。ドナー配列は末端リセクション領域内の配列の修正にのみ用いられ得ることに伴い、標
的位置と切断点との間の距離が離れ過ぎている場合、末端リセクションに突然変異が含ま
れないこともあり、したがって修正されないこともある。
ｇＲＮＡ（単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ）およびＣａｓ９ヌクレ
アーゼがＨＤＲ媒介性またはＨＲ媒介性の修正を誘導する目的で二本鎖切断を誘導する実
施形態において、切断部位は標的位置から０～２００ｂｐ（例えば、０～１７５、０～１
５０、０～１２５、０～１００、０～７５、０～５０、０～２５、２５～２００、２５～
１７５、２５～１５０、２５～１２５、２５～１００、２５～７５、２５～５０、５０～
２００、５０～１７５、５０～１５０、５０～１２５、５０～１００、５０～７５、７５
～２００、７５～１７５、７５～１５０、７５～１２５、７５～１００ｂｐ）離れている
。ある実施形態において、切断部位は標的位置から０～１００ｂｐ（例えば、０～７５、
０～５０、０～２５、２５～１００、２５～７５、２５～５０、５０～１００、５０～７
５または７５～１００ｂｐ）離れている。
Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体化した２つのｇＲＮＡ（独立に、単分子（またはキメラ）
またはモジュラーｇＲＮＡ）がＨＤＲ媒介性の修正を誘導する目的で２つの一本鎖切断を
誘導する実施形態において、近い方のニックは標的位置から０～２００ｂｐ（例えば、０
～１７５、０～１５０、０～１２５、０～１００、０～７５、０～５０、０～２５、２５
～２００、２５～１７５、２５～１５０、２５～１２５、２５～１００、２５～７５、２
５～５０、５０～２００、５０～１７５、５０～１５０、５０～１２５、５０～１００、
５０～７５、７５～２００、７５～１７５、７５～１５０、７５～１２５、７５～１００
ｂｐ）離れており、および２つのニックは、理想的には互いから２５～５５ｂｐ以内（例
えば、２５～５０、２５～４５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、３０～５５、３
０～５０、３０～４５、３０～４０、３０～３５、３５～５５、３５～５０、３５～４５
、３５～４０、４０～５５、４０～５０、４０～４５ｂｐ）にあり、互いに１００ｂｐ以
下離れている（例えば、互いに９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０
または５ｂｐ以下離れている）。ある実施形態において、切断部位は標的位置から０～１
００ｂｐ（例えば、０～７５、０～５０、０～２５、２５～１００、２５～７５、２５～
５０、５０～１００、５０～７５または７５～１００ｂｐ）離れている。
一実施形態において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）また
はモジュラーｇＲＮＡが、標的位置の両側に二本鎖切断を置くように構成される。代替的
実施形態において、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモ
ジュラーｇＲＮＡが、標的位置のいずれかの側に二本鎖切断（すなわち、１つのｇＲＮＡ
がＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体化する）、および２つの一本鎖切断または対をなす一本
鎖切断（すなわち、２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）を置くように
構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて標的位置の上流（すなわち５’側）を標的
化し、第２のｇＲＮＡを用いて標的位置の下流（すなわち３’側）を標的化する）。別の
実施形態において、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモ
ジュラーｇＲＮＡが、標的位置のいずれかの側に２対の一本鎖切断を生じさせる（すなわ
ち、２対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）ように構成される（例
えば、第１のｇＲＮＡを用いて標的位置の上流（すなわち５’側）を標的化し、第２のｇ
ＲＮＡを用いて標的位置の下流（すなわち３’側）を標的化する）。二本鎖切断または対
における２つの一本鎖ニックのうちのより近い方は、理想的には標的位置から０～５００
ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１
５０、１００、５０または２５ｂｐ以下）にあり得る。ニッカーゼが用いられる場合、対
における２つのニックは互いから２５～５５ｂｐ以内（例えば、２５～５０、２５～４５
、２５～４０、２５～３５、２５～３０、５０～５５、４５～５５、４０～５５、３５～
５５、３０～５５、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、３５～４５、ま
たは４０～４５ｂｐ）にあり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０
、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。
一実施形態において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）また
はモジュラーｇＲＮＡが、標的位置の両側に二本鎖切断を置くように構成される。代替的
実施形態において、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモ
ジュラーｇＲＮＡが、２つの標的配列に二本鎖切断（すなわち、１つのｇＲＮＡがＣａｓ
９ヌクレアーゼと複合体化する）および２つの一本鎖切断または対をなす一本鎖切断（す
なわち、２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）を置くように構成される
（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて挿入部位の上流（すなわち５’側）の標的配列を標的
化し、第２のｇＲＮＡを用いて下流（すなわち３’側）の標的配列を標的化する）。別の
実施形態において、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモ
ジュラーｇＲＮＡが、挿入部位のいずれかの側に２対の一本鎖切断を生じさせる（すなわ
ち、２対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）ように構成される（例
えば、第１のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される上流（すなわち５’側）の標的配列
を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される下流（すなわち３’側）の標
的配列を標的化する）。二本鎖切断または対における２つの一本鎖ニックのうちのより近
い方は、理想的には標的位置から０～５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４
００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０または２５ｂｐ以下）で
ある。ニッカーゼが用いられる場合、対における２つのニックは互いから２５～５５ｂｐ
以内（例えば、２５～５０、２５～４５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、５０～
５５、４５～５５、４０～５５、３５～５５、３０～５５、３０～５０、３５～５０、４
０～５０、４５～５０、３５～４５、または４０～４５ｂｐ）にあり、互いに１００ｂｐ
以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）
離れている。
相同性アームの長さ
相同性アームは、例えばリセクションされた一本鎖オーバーハングがドナー鋳型内の相
補領域を見付けることを可能にするため、少なくとも末端リセクションが起こり得る領域
のところまで延在しなければならない。全長は、プラスミドサイズまたはウイルスパッケ
ージング限界などのパラメータによって制限され得る。ある実施形態において、相同性ア
ームは反復エレメント、例えばＡＬＵリピート、ＬＩＮＥリピートまでは延在しない。鋳
型は同じまたは異なる長さの２つの相同性アームを有し得る。
例示的相同性アーム長さは、少なくとも２５、５０、１００、２５０、５００、７５０
または１０００ヌクレオチドを含む。
標的位置とは、本明細書で使用されるとき、Ｃａｓ９分子依存的過程によって修飾され
る標的核酸（例えば、染色体）上の部位を指す。例えば、標的位置は、修飾Ｃａｓ９分子
による標的核酸の切断および鋳型核酸によって導かれる標的位置の修飾、例えば修正であ
ってもよい。ある実施形態において、標的位置は、１つ以上のヌクレオチドが付加される
標的核酸上の２つのヌクレオチド間、例えば隣接ヌクレオチド間の部位であり得る。標的
位置は、鋳型核酸によって改変、例えば修正される１つ以上のヌクレオチドを含み得る。
ある実施形態において、標的位置は標的配列（例えば、ｇＲＮＡが結合する配列）の範囲
内にある。ある実施形態において、標的位置は標的配列（例えば、ｇＲＮＡが結合する配
列）の上流または下流にある。
典型的には、鋳型配列は標的配列との切断媒介性または触媒性の組換えを起こす。ある
実施形態において、鋳型核酸は、Ｃａｓ９媒介性の切断イベントによって切断される標的
配列上の部位に対応する配列を含む。ある実施形態において、鋳型核酸は、第１のＣａｓ
９媒介性イベントで切断される標的配列上の第１の部位と、第２のＣａｓ９媒介性イベン
トで切断される標的配列上の第２の部位との両方に対応する配列を含む。
ある実施形態において、鋳型核酸は、翻訳配列のコード配列の改変を生じさせる配列、
例えばタンパク質産物における１つのアミノ酸の別のアミノ酸との、例えば突然変異アレ
ルを野生型アレルに転換する、野生型アレルを突然変異アレルに転換する、および／また
は終止コドンを導入する置換、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、またはナンセ
ンス突然変異を生じさせる配列を含み得る。
他の実施形態において、鋳型核酸は、非コード配列の改変、例えば、エクソンまたは５
’もしくは３’非翻訳または非転写領域の改変を生じさせる配列を含み得る。かかる改変
には、制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーの改変、およびシス作用ま
たはトランス作用制御エレメントの改変が含まれる。
鋳型核酸は、組み込まれたときに以下を生じさせる配列を含み得る：
ポジティブ制御エレメントの活性の低下；
ポジティブ制御エレメントの活性の増加；
ネガティブ制御エレメントの活性の低下；
ネガティブ制御エレメントの活性の増加；
遺伝子の発現の低下；
遺伝子の発現の増加；
障害または疾患に対する抵抗性の増加；
ウイルス侵入に対する抵抗性の増加；
突然変異の修正または望ましくないアミノ酸残基の改変；
遺伝子産物の生物学的特性の付与、増加、消失または低下、例えば、酵素の酵素活性の増
加、または遺伝子産物が別の分子と相互作用する能力の増加。
鋳型核酸は、以下を生じさせる配列を含み得る：
標的配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヌクレオチドまたは
それを超える配列の変化。
ある実施形態において、鋳型核酸は、２０±１０、３０±１０、４０±１０、５０±１
０、６０±１０、７０±１０、８０±１０、９０±１０、１００±１０、１１０±１０、
１２０±１０、１３０±１０、１４０±１０、１５０±１０、１６０±１０、１７０±１
０、１８０±１０、１９０±１０、２００±１０、２１０±１０、２２０±１０、２００
～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００
～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～２０００、２０００～３００
０または３０００超のヌクレオチド長である。
鋳型核酸は、以下の成分を含む：
［５’相同性アーム］－［挿入配列］－［３’相同性アーム］。
相同性アームは染色体への組換えをもたらし、これにより、望ましくないエレメント、
例えば突然変異またはシグネチャを置換配列に置き換えることができる。ある実施形態に
おいて、相同性アームは最も遠位の切断部位に隣接する。
ある実施形態において、５’相同性アームの３’末端は置換配列の５’末端の隣の位置
である。ある実施形態において、５’相同性アームは、置換配列の５’末端から５’側に
少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、
１５０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、
１０００、１５００、または２０００ヌクレオチド延在し得る。
ある実施形態において、３’相同性アームの５’末端は置換配列の３’末端の隣の位置
である。ある実施形態において、３’相同性アームは、置換配列の３’末端から３’側に
少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、
１５０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、
１０００、１５００、または２０００ヌクレオチド延在し得る。
本明細書では、一方または両方の相同性アームを短縮することにより特定の配列リピー
トエレメント、例えば、Ａｌｕリピート、ＬＩＮＥエレメントが含まれることを回避し得
ることが企図される。例えば、５’相同性アームを短縮して配列リピートエレメントを回
避し得る。他の実施形態では、３’相同性アームを短縮して配列リピートエレメントを回
避し得る。一部の実施形態では、５’および３’相同性アームの両方を短縮して特定の配
列リピートエレメントが含まれることを回避し得る。
本明細書では、突然変異の修正用の鋳型核酸を一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ
）として用いられるように設計し得ることが企図される。ｓｓＯＤＮを使用するとき、５
’および３’相同性アームは最大約２００塩基対（ｂｐ）長、例えば、少なくとも２５、
５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ｂｐ長までの範囲となり得
る。ｓｓＯＤＮについては、オリゴヌクレオチド合成が改善され続けるように、より長い
相同性アームも企図される。
遺伝子ターゲティングのためのＮＨＥＪ手法
本明細書に記載されるとおり、ヌクレアーゼ誘導性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を用い
て遺伝子特異的ノックアウトを標的化することができる。ヌクレアーゼ誘導性ＮＨＥＪを
用いてまた、目的の遺伝子の配列を除去する（例えば、欠失させる）こともできる。
理論によって拘束されることを望むものではないが、ある実施形態において、本明細書
に記載される方法に関連するゲノム改変は、ヌクレアーゼ誘導性ＮＨＥＪおよびＮＨＥＪ
修復経路のエラープローン的性質に頼るものであると考えられる。ＮＨＥＪはＤＮＡの二
本鎖切断を、その両端を共につなぎ合わせることによって修復する。しかしながら、概し
て、２つの適合性のある末端が二本鎖切断による形成時そのままに完全にライゲートされ
る場合に限り、元の配列が復元される。二本鎖切断のＤＮＡ末端は高頻度で酵素的処理の
対象となるため、それらの末端が再びつなぎ合わされる前に一方または両方の鎖にヌクレ
オチドの付加または除去が生じる。この結果、ＮＨＥＪ修復部位のＤＮＡ配列に挿入およ
び／または欠失（インデル）突然変異が存在することになる。これらの突然変異の３分の
２はリーディングフレームを改変し、したがって非機能性タンパク質を生じ得る。加えて
、リーディングフレームを維持するが、多量の配列を挿入し、または欠失させる突然変異
が、タンパク質の機能を破壊し得る。重要な機能ドメインにおける突然変異はタンパク質
の重要でない領域における突然変異と比べて許容されない可能性が高いため、これは遺伝
子座依存的である。
ＮＨＥＪによって作成されるインデル突然変異は本質的に予測不可能である。しかしな
がら、所与の切断部位で特定のインデル配列が優先され、集団中に多く出現する。欠失の
長さは幅広く異なり得、最も一般的には１～５０ｂｐの範囲であるが、１００～２００ｂ
ｐ超にも容易に達し得る。挿入はそれより短い傾向があり、切断部位を直接取り囲む配列
の短い重複を含むことが多い。しかしながら、大きい挿入を達成することが可能であり、
その場合、挿入された配列は、ゲノムの他の領域までまたは細胞中に存在するプラスミド
ＤＮＡまで至ることが多い。
ＮＨＥＪは変異原性過程であるため、特定の最終配列の作成が不要である限り、ＮＨＥ
Ｊを用いて小さい配列モチーフを欠失させることができる。二本鎖切断が短い標的配列の
近傍に標的化される場合、ＮＨＥＪ修復によって引き起こされる欠失突然変異は多くの場
合に望ましくないヌクレオチドに及び、したがってそれを除去する。より大きいＤＮＡセ
グメントの欠失については、その配列の各側に１つずつ、２つの二本鎖切断を導入すると
、末端間でＮＨＥＪが生じ、介在配列全体が除去され得る。これらの手法は両方とも、特
異的ＤＮＡ配列の欠失に用いることができる。しかしながら、ＮＨＥＪのエラープローン
の性質は、なおも修復部位にインデル突然変異を生じさせ得る。
本明細書に記載される方法および組成物では、ＮＨＥＪ媒介性インデルの作成に、二本
鎖切断Ｃａｓ９分子および一本鎖、またはニッカーゼＣａｓ９分子の両方を使用すること
ができる。遺伝子、例えば目的の遺伝子のコード領域、例えば初期コード領域を標的とす
るＮＨＥＪ媒介性インデルを用いて目的の遺伝子をノックアウトする（すなわち、その発
現を消失させる）ことができる。例えば、目的の遺伝子の初期コード領域は、転写開始部
位の直後、コード配列の最初のエクソンの範囲内、または転写開始部位から５００ｂｐ（
例えば、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００ま
たは５０ｂｐ未満）の範囲内の配列を含む。
標的位置に対する二本鎖または一本鎖切断の配置
ＮＨＥＪ媒介性インデルを誘導する目的でｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼが二本
鎖切断を作成する実施形態において、ｇＲＮＡ、例えば単分子（またはキメラ）またはモ
ジュラーｇＲＮＡ分子は、標的位置のヌクレオチドにごく接近して１つの二本鎖切断を置
くように構成される。ある実施形態において、切断部位は標的位置から０～５００ｂｐ（
例えば、標的位置から５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２
５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｂｐ未満）離れている
。
ＮＨＥＪ媒介性インデルを誘導する目的で２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合
体化して２つの一本鎖切断を誘導する実施形態において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立
に、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡは、標的位置のヌクレオチドのＮ
ＨＥＪ修復をもたらすため２つの一本鎖切断を置くように構成される。ある実施形態にお
いて、ｇＲＮＡは、本質的に二本鎖切断を模倣して、異なる鎖上の同じ位置に、または互
いから数ヌクレオチド以内に切断を置くように構成される。ある実施形態において、近い
方のニックは標的位置から０～３０ｂｐ（例えば、標的位置から３０、２５、２０、１、
１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｂｐ未満）離れており、および２つのニ
ックは互いから２５～５５ｂｐ以内（例えば、２５～５０、２５～４５、２５～４０、２
５～３５、２５～３０、５０～５５、４５～５５、４０～５５、３５～５５、３０～５５
、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、３５～４５、または４０～４５ｂ
ｐ）にあり、互いから１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、
３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。ある実施形態において、ｇＲＮＡは標的位
置のヌクレオチドのいずれかの側に一本鎖切断を配置するように構成される。
本明細書に記載される方法および組成物では、標的位置の両側への切断の作成に、二本
鎖切断Ｃａｓ９分子および一本鎖、またはニッカーゼＣａｓ９分子の両方を使用すること
ができる。標的位置の両側に二本鎖または対をなす一本鎖切断を作成して、２つのカット
間にある核酸配列を除去し得る（例えば、２つの切断間にある領域が欠失する）。一実施
形態において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモジュ
ラーｇＲＮＡが、標的位置の両側に二本鎖切断を置くように構成される（例えば、第１の
ｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異の上流（すな
わち５’側）を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子または経
路における突然変異の下流（すなわち３’側）を標的化する）。代替的実施形態において
、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ
が、標的位置のいずれかの側に二本鎖切断を置き（すなわち、１つのｇＲＮＡがＣａｓ９
ヌクレアーゼと複合体化する）および２つの一本鎖切断または対をなす一本鎖切断を置く
（すなわち、２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）ように構成される（
例えば、第１のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変
異の上流（すなわち５’側）を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される
遺伝子または経路における突然変異の下流（すなわち３’側）を標的化する）。別の実施
形態において、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモジュ
ラーｇＲＮＡが、標的位置のいずれかの側に２対の一本鎖切断を生じさせる（すなわち、
２対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）ように構成される（例えば
、第１のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異の上
流（すなわち５’側）を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子
または経路における突然変異の下流（すなわち３’側）を標的化する）。１つまたは複数
の二本鎖切断または対における２つの一本鎖ニックのうちのより近い方は、理想的には、
標的位置から０～５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３０
０、２５０、２００、１５０、１００、５０または２５ｂｐ以下）にあり得る。ニッカー
ゼが用いられる場合、対における２つのニックは互いから２５～５５ｂｐ以内（例えば、
２５～５０、２５～４５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、５０～５５、４５～５
５、４０～５５、３５～５５、３０～５５、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５
～５０、３５～４５、または４０～４５ｂｐ）にあり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、
９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。
他の実施形態において、鋳型核酸の挿入はマイクロホモロジー末端結合（ＭＭＥＪ）に
よって媒介され得る。例えば、Ｓａｋｓｕｍａ ｅｔ ａｌ．，「ＴＡＬＥＮおよびＣＲ
ＩＳＰＲ－Ｃａｓ９をＰＩＴＣｈシステムと共に用いたＭＭＥＪに基づく遺伝子ノックイ
ン（ＭＭＥＪ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ｕｓｉｎｇ ＴＡＬＥ
Ｎｓ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＩＴＣｈ ｓｙｓｔｅｍ
ｓ）」Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １１，１１８－１３３（２０１６）ｄｏｉ：
１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．１４０、２０１５年１２月１７日オンライン発
表（この内容は全体として参照により援用される）を参照されたい。
ＶＩＩＩ．２つ以上のｇＲＮＡ分子を含むシステム
理論によって拘束されることを意図するものではないが、意外にも、本明細書では、連
続核酸上でごく近接して位置する２つの標的配列を（例えば、各々がそのそれぞれの標的
配列にまたはその近傍に一本鎖または二本鎖切断を誘導する２つのｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ
９分子複合体によって）標的化すると、２つの標的配列間に位置する核酸配列（または核
酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
）の切り出し（例えば、欠失）が誘導されることが示されている。一部の態様において、
本開示は、連続核酸、例えば染色体、例えばそのイントロン、エクソンおよび調節エレメ
ントを含めた遺伝子または遺伝子座上でごく近接した標的配列を標的化する標的化ドメイ
ンを含む２つ以上のｇＲＮＡ分子の使用を提供する。この使用は、例えば、２つ以上のｇ
ＲＮＡ分子を１つ以上のＣａｓ９分子と共に（または２つ以上のｇＲＮＡ分子および／ま
たは１つ以上のＣａｓ９分子をコードする核酸を）細胞に導入することにより得る。
一部の態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子の標的配列は連続核酸上で５、６、７、
８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３
００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３００
０、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１
１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、または１５，０００ヌクレオ
チド以上離れ、連続核酸上で２５，０００ヌクレオチド以下離れて位置する。ある実施形
態において、これらの標的配列は約４０００ヌクレオチド離れて位置する。ある実施形態
において、これらの標的配列は約６０００ヌクレオチド離れて位置する。
一部の態様において、複数のｇＲＮＡ分子は、それぞれ同じ遺伝子内または遺伝子座内
の配列を標的とする。別の態様において、複数のｇＲＮＡ分子は、それぞれ２つ以上の異
なる遺伝子内の配列を標的とする。
一部の態様において、本発明は、本発明のｇＲＮＡ分子を複数、例えば、２つ以上、例
えば２つ含む組成物および細胞を提供し、ここで、複数のｇＲＮＡ分子は、１５，０００
未満、１４，０００未満、１３，０００未満、１２，０００未満、１１，０００未満、１
０，０００未満、９，０００未満、８，０００未満、７，０００未満、６，０００未満、
５，０００未満、４，０００未満、３，０００未満、２，０００未満、１，０００未満、
９００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満、３００未
満、２００未満、１００未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４
０未満、または３０未満のヌクレオチド離れた配列を標的とする。ある実施形態において
、これらの標的配列は二重鎖核酸の同じ鎖上にある。ある実施形態において、これらの標
的配列は二重鎖核酸の異なる鎖上にある。
一実施形態において、本発明は、二重鎖核酸の同じまたは異なる鎖上で２５，０００未
満、２０，０００未満、１５，０００未満、１４，０００未満、１３，０００未満、１２
，０００未満、１１，０００未満、１０，０００未満、９，０００未満、８，０００未満
、７，０００未満、６，０００未満、５，０００未満、４，０００未満、３，０００未満
、２，０００未満、１，０００未満、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満
、５００未満、４００未満、３００未満、２００未満、１００未満、９０未満、８０未満
、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、または３０未満のヌクレオチド離れて配置
された２つのｇＲＮＡ結合部位間に配置された核酸を切り出す（例えば、欠失させる）方
法を提供する。ある実施形態において、この方法は、各ｇＲＮＡ結合部位に関連するＰＡ
Ｍ部位間に配置されたヌクレオチドの５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、８５％
超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％
超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、または１００％の
欠失をもたらす。実施形態において、この欠失は、各ｇＲＮＡ結合部位に関連するＰＡＭ
部位の１つ以上の範囲内にある１つ以上のヌクレオチドをさらに含む。実施形態において
、この欠失は、各ｇＲＮＡ結合部位に関連するＰＡＭ部位間の領域外にある１つ以上のヌ
クレオチドも含む。
一態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、遺伝子調節エレメント、例えば、プロモ
ーター結合部位、エンハンサー領域、またはリプレッサー領域に隣接する標的配列を標的
化する標的化ドメインを含み、介在配列（または介在配列の一部分）の切り出しにより目
的の遺伝子の上方制御または下方制御を生じさせる。
ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表１または表５の標的化ドメイン
配列を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。態様において、２つ以上のｇＲ
ＮＡ分子は、同じ遺伝子内の配列に相補的な標的化ドメインを含む。態様において、２つ
以上のｇＲＮＡ分子は、異なる遺伝子の配列に相補的な標的化ドメインを含む。ある実施
形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表６の標的化ドメイン配列を含む、例えばそ
れからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、
表２、表７、表８および／または表９の標的化ドメイン配列を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、同じ遺伝子内の配列
に相補的な標的化ドメインを含む。態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、異なる遺
伝子の配列に相補的な標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮ
Ａ分子は、表７、表８および／または表９のｇＲＮＡ分子から選択される。ある実施形態
において、第１および第２のｇＲＮＡ分子は、表１～表９から選択される標的化ドメイン
配列を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含み、かつ異なる表から選択され、例
えば、かつ異なる遺伝子の配列に相補的な標的化ドメインを含む。
一態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、遺伝子調節エレメント、例えば、プロモ
ーター結合部位、エンハンサー領域、またはリプレッサー領域に隣接する標的配列を標的
化する標的化ドメインを含み、介在配列（または介在配列の一部分）の切り出しにより目
的の遺伝子の上方制御または下方制御を生じさせる。例として、２つ以上のｇＲＮＡ分子
は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子の赤血球系エンハンサー領域の（例えば、＋５５、＋５８または
＋６２領域内の）ＧＡＴＡ１結合部位（またはその一部分）またはＴＡＬ１結合部位（ま
たはその一部分）に隣接する標的配列を標的化する標的化ドメインを含む。他の実施形態
において、１つまたは複数のｇＲＮＡ分子は、ＢＣＬ１１ａエンハンサー内のＧＡＴＡ１
結合部位またはＴＡＬ１結合部位の破壊をもたらさない。
ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表１から選択される標的化ドメイ
ンを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上
のｇＲＮＡ分子は、表２から選択される標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表３から選択さ
れる標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態に
おいて、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表４から選択される標的化ドメインを含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は
、表５から選択される標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む
。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表６から選択される標的化ドメイ
ンを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上
のｇＲＮＡ分子は、表７から選択される標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的
化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表８から選択さ
れる標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態に
おいて、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表９から選択される標的化ドメインを含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。
態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、上記の第ＩＩ節に挙げられる標的化ドメイ
ン配列対を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
理論によって拘束されるものではないが、胎児ヘモグロビン（例えば、γグロビン）の
発現が増加すると同時にβグロビン（例えば、鎌状赤血球化突然変異を含むβグロビン）
の発現が減少または消失することにより、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球症の治
療における有効性の増加がもたらされるであろうことが考えられる。したがって、一態様
において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、γグロビン発現の増加を生じさせる第１のｇＲＮ
Ａ分子と、βグロビン、例えば鎌状赤血球突然変異を有するβグロビンの発現を減少また
は消失させる第２のｇＲＮＡ分子とを含む。実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子
は、例えば本明細書に記載されるとおりの、ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域内にある配列
を標的とする第１のｇＲＮＡ分子、例えば、表７、表８または表９の標的化ドメインを含
む、例えばそれからなる標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子と、鎌状グロビン遺伝子（例
えば、鎌状赤血球化突然変異を含むβグロビン遺伝子）の配列を標的とする第２のｇＲＮ
Ａ分子とを含む。
ＩＸ．ｇＲＮＡの特性
さらに、意外にも、本明細書では、ｇＲＮＡ分子および前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩ
ＳＰＲシステムが、同じ細胞型、送達方法およびｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ成分を使用する
と複数の実験にわたって同様または同一のインデルパターンを生じることが示されている
。理論によって拘束されるものではないが、ある種のインデルパターンが他よりも有利で
あり得ると考えられる。例えば、「フレームシフト突然変異」（例えば、１塩基対または
２塩基対の挿入または欠失、またはｎ／３（式中、ｎ＝挿入または欠失におけるヌクレオ
チドの数）が整数でない場合の任意の挿入または欠失）をもたらす挿入および／または欠
失を主に含むインデルが、機能タンパク質の発現を低下または消失させるのに有益であり
得る。同様に、「大規模欠失」（１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、ま
たは３０ヌクレオチドより多い欠失）を主に含むインデルも、例えば、同様に機能タンパ
ク質の発現に向上した効果を及ぼし得るプロモーター結合部位などの重要な調節配列の除
去に有益であり得る。所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムによって誘導されるインデ
ルパターンは、意外にも、本明細書に記載されるとおり、細胞型にわたって一貫して再現
されることが分かっているが、所与の細胞においてｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムの導
入時にいずれかの単一のインデル構造が必ず生じるわけではない。
したがって本発明は、例えばフレームシフト突然変異および／または大規模欠失で主に
構成されるインデルパターンまたは構造を有する有益なインデルパターンまたは構造を作
り出すｇＲＮＡ分子を提供する。かかるｇＲＮＡ分子は、試験細胞（例えば、ＨＥＫ２９
３細胞）または目的の細胞、例えばＨＳＰＣ細胞で候補ｇＲＮＡ分子によって作り出され
たインデルパターンまたは構造を本明細書に記載されるとおりＮＧＳによって評価するこ
とにより選択し得る。実施例に示すとおり、所望の細胞集団に導入されると、標的遺伝子
にフレームシフト突然変異を有する細胞が大きな割合を占める細胞の集団をもたらすｇＲ
ＮＡ分子が発見されている。ある場合には、フレームシフト突然変異の比率は、７５％、
８０％、８５％、９０％またはそれを超える高さである。したがって本発明は、本明細書
に記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位にまたはその近傍に、例えば本明細書に記載される
とおりのフレームシフト突然変異を有する細胞が少なくとも約４０％（例えば、少なくと
も約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくと
も約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくと
も約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）を
占める細胞の集団を提供する。本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位
にまたはその近傍に、例えば本明細書に記載されるとおりのフレームシフト突然変異を有
する細胞が少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少
なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少
なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９
％）を占める細胞の集団も提供する。
したがって本発明は、本発明の治療方法に用いられるｇＲＮＡ分子を選択する方法であ
って、１）目的の標的に対する複数のｇＲＮＡ分子を提供することと、２）前記ｇＲＮＡ
分子の使用によって作り出されるインデルパターンまたは構造を評価することと、３）フ
レームシフト突然変異、大規模欠失またはこれらの組み合わせで主に構成されるインデル
パターンまたは構造を形成するｇＲＮＡ分子を選択することと、４）前記選択されたｇＲ
ＮＡを本発明の方法において使用することとを含む方法を提供する。
本発明はさらに、細胞を改変する方法、および改変された細胞を提供し、ここで、その
細胞型では所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムで一貫して特定のインデルパターンが
作製される。本明細書に記載されるｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムで観察される最も出
現頻度が高い上位５つのインデルを含め、インデルパターンが、例えば実施例に開示され
る。実施例に示すとおり、細胞の集団が作成され、ここで、細胞の大きい割合が上位５つ
のインデルの１つを含む（例えば、集団の細胞の３０％超、４０％超、５０％超、６０％
超またはそれを超えて上位５つのインデルの１つが存在する細胞の集団。したがって、本
発明は、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムで観察される上位５つのインデルのいず
れか１つのインデルを含む細胞、例えばＨＳＰＣ（本明細書に記載されるとおりの）を提
供する。さらに、本発明は、例えばＮＧＳによって評価したとき、所与のｇＲＮＡ／ＣＲ
ＩＳＰＲシステムについて本明細書に記載される上位５つのインデルの１つを含む細胞が
高いパーセンテージを占める細胞の集団、例えばＨＳＰＣの集団（本明細書に記載される
とおりの）を提供する。インデルパターン分析との関連において使用するとき、「高いパ
ーセンテージ」は、集団の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくと
も約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくと
も約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少
なくとも約９９％）の細胞が所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムについて本明細書に
記載される上位５つのインデルの１つを含むことを指す。他の実施形態において、細胞の
集団は、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムについて本明細書に記載される上位５つ
のインデルの１つを有する細胞が少なくとも約２５％（例えば、約２５％～約６０％、例
えば約２５％～約５０％、例えば約２５％～約４０％、例えば約２５％～約３５％）を占
める。実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの＋５８領域を標的とする所与のｇ
ＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムについて、上位のインデル、例えば上位５つのインデルは
、表１５、図２５、および表３７に提供される。実施形態において、ＨＰＦＨ領域を標的
とする所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムについて、上位のインデル、例えば上位５
つのインデルは、表２６、表２７および表３７に提供される。
また、特定のｇＲＮＡ分子が、標的細胞型のゲノム内にあるオフターゲット配列にイン
デルを生成しない、またはオフターゲット部位では標的部位におけるインデル生成頻度と
比べて極めて低い頻度（例えば、集団中の細胞の＜５％）でインデルを生じることも発見
されている。したがって、本発明は、標的細胞型においてオフターゲットインデル形成を
呈しない、または＜５％の頻度のオフターゲットインデル形成を生じるｇＲＮＡ分子およ
びＣＲＩＳＰＲシステムを提供する。実施形態において、本発明は、標的細胞型において
いかなるオフターゲットインデル形成も呈しないｇＲＮＡ分子およびＣＲＩＳＰＲシステ
ムを提供する。したがって、本発明はさらに、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的
部位にまたはその近傍にインデル（例えば、フレームシフトインデル、または例えば本明
細書に記載されるとおりの、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムによって生じる上位
５つのインデルのいずれか１つ）を含むが、ｇＲＮＡ分子のいかなるオフターゲット部位
にもインデルを含まない、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞、例えば細胞の集団
、例えばＨＳＰＣの集団を提供する。他の実施形態において、本発明はさらに、本明細書
に記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位にまたはその近傍にインデル（例えば、フレームシ
フトインデル、または例えば本明細書に記載されるとおりの、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳ
ＰＲシステムによって生じる上位５つのインデルのいずれか１つ）を有する細胞が＞５０
％を占めるが、ｇＲＮＡ分子の任意のオフターゲット部位にインデルを含む細胞は５％未
満、例えば、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満を占める、例えば本明細書に
記載されるとおりの細胞の集団、例えばＨＳＰＣの集団を提供する。
実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に
記載されるｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム）によって生じるインデルは、ＧＡ
ＴＡ－１結合部位のヌクレオチドを含まず、および／またはＴＡＬ－１結合部位のヌクレ
オチドを含まない（例えば、図２５に記載されるＧＡＴＡ－１結合部位および／またはＴ
ＡＬ－１結合部位のヌクレオチドを含まない）。
Ｘ．送達／コンストラクト
成分、例えばＣａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子、または両方は、種々の形態で送達、製
剤化、または投与することができる。非限定的な例として、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９
分子は、（１つ以上の組成物に）製剤化し、ゲノム編集イベントが所望される細胞に直接
送達または投与することができる。あるいは、１つ以上の成分、例えばＣａｓ９分子また
はｇＲＮＡ分子、または両方をコードする核酸を（１つ以上の組成物に）製剤化して送達
または投与することもできる。一態様において、ｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子をコード
するＤＮＡとして提供され、およびＣａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子をコードするＤＮＡと
して提供される。一実施形態において、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子とは別個の核酸分子
上にコードされる。一実施形態において、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子とは同じ核酸分子
上にコードされる。一態様において、ｇＲＮＡ分子はＲＮＡとして提供され、およびＣａ
ｓ９分子は、Ｃａｓ９分子をコードするＤＮＡとして提供される。一実施形態において、
ｇＲＮＡ分子は、例えば本明細書に記載されるとおりの、１つ以上の修飾を伴い提供され
る。一態様において、ｇＲＮＡ分子はＲＮＡとして提供され、およびＣａｓ９分子は、Ｃ
ａｓ９分子をコードするｍＲＮＡとして提供される。一態様において、ｇＲＮＡ分子はＲ
ＮＡとして提供され、およびＣａｓ９分子はタンパク質として提供される。一実施形態に
おいて、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９分子はリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として提供さ
れる。一態様において、ｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡとして提供さ
れ、およびＣａｓ９分子はタンパク質として提供される。
送達、例えばＲＮＰの（例えば、本明細書に記載されるとおりのＨＳＰＣ細胞への）送
達は、例えば、エレクトロポレーション（例えば、当該技術分野において公知のとおりの
）または細胞膜を核酸および／またはポリペプチド分子に対して透過性にする他の方法に
より達成し得る。実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば本明細書に記載され
るとおりのＲＮＰは、エレクトロポレーションにより、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ
（Ｌｏｎｚａ）を用いて、例えば、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）のプ
ログラムＣＭ－１３７を用いて送達される。実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステム、
例えば本明細書に記載されるとおりのＲＮＰは、エレクトロポレーションにより、約８０
０ボルト～約２０００ボルト、例えば約１０００ボルト～約１８００ボルト、例えば約１
２００ボルト～約１８００ボルト、例えば約１４００ボルト～約１８００ボルト、例えば
約１６００ボルト～約１８００ボルト、例えば約１７００ボルトの電圧を用いて、例えば
１７００ボルトの電圧で送達される。実施形態において、パルス幅／パルス長は約１０ｍ
ｓ～約５０ｍｓ、例えば約１０ｍｓ～約４０ｍｓ、例えば約１０ｍｓ～約３０ｍｓ、例え
ば約１５ｍｓ～約２５ｍｓ、例えば約２０ｍｓ、例えば２０ｍｓである。実施形態におい
て、１、２、３、４、５つ、またはそれを超える、例えば２つ、例えば１つのパルスが用
いられる。ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば本明細書に記載される
とおりのＲＮＰは、エレクトロポレーションにより、約１７００ボルト（例えば、１７０
０ボルト）の電圧、約２０ｍｓ（例えば、２０ｍｓ）のパルス幅を用いて、単一（１つ）
のパルスを用いて送達される。実施形態において、エレクトロポレーションはＮｅｏｎエ
レクトロポレーターを使用して達成される。膜透過性にするためのさらなる技法は当該技
術分野において公知であり、例えば、セルスクイージング（ｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｚｉｎ
ｇ）（例えば、国際公開第２０１５／０２３９８２号パンフレットおよび国際公開第２０
１３／０５９３４３号パンフレット（これらの内容は、参照により全体として本明細書に
援用される）に記載されるとおり）、ナノニードル（例えば、Ｃｈｉａｐｐｉｎｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔ．，１４；５３２－３９、または米国特許出願公開第２０１４
／０２９５５５８号明細書（これらの内容は、参照により全体として本明細書に援用され
る）に記載されるとおり）およびナノストロー（例えば、Ｘｉｅ，ＡＣＳ Ｎａｎｏ，７
（５）；４３５１－５８（この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に
記載されるとおり）が挙げられる。
成分がＤＮＡにコードされて送達される場合、ＤＮＡは、典型的には、発現を生じさせ
るため、例えばプロモーターを含む制御領域を含むことになる。Ｃａｓ９分子配列に有用
なプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＥＦ－１α、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、ＣＡＧ制御プロモー
ターが挙げられる。ｇＲＮＡに有用なプロモーターとしては、Ｈ１、ＥＦ－１ａおよびＵ
６プロモーターが挙げられる。同様の、または異なる強度のプロモーターを選択して、成
分の発現を調整することができる。Ｃａｓ９分子をコードする配列は、核移行シグナル（
ＮＬＳ）、例えばＳＶ４０ ＮＬＳを含み得る。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子ま
たはｇＲＮＡ分子用のプロモーターは、独立に、誘導性、組織特異的、または細胞特異的
であり得る。
Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子のＤＮＡベースの送達
Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、当該技術分野におい
て公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり対象に投与し、または細胞に送
達することができる。例えば、Ｃａｓ９コードＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡコードＤＮ
Ａは、例えば、ベクター（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター）、非ベクターベ
ースの方法（例えば、ネイキッドＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用して）、またはこれら
の組み合わせによって送達することができる。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは、ベクター
（例えば、ウイルスベクター／ウイルス、プラスミド、ミニサークルまたはナノプラスミ
ド）によって送達される。
ベクターは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードする配列を含み得る。
ベクターは、例えばＣａｓ９分子配列に融合した、シグナルペプチド（例えば、核移行、
核小体移行、ミトコンドリア移行のための）をコードする配列も含み得る。例えば、ベク
ターは、Ｃａｓ９分子をコードする配列に融合した１つ以上の核移行配列（例えば、ＳＶ
４０由来）を含み得る。
ベクターには、１つ以上の調節／制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサ
ー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソー
ム進入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、およびスプライスアクセプターまたはドナーが含ま
れ得る。一部の実施形態において、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識
される（例えば、ＣＭＶプロモーター）。他の実施形態において、プロモーターはＲＮＡ
ポリメラーゼＩＩＩによって認識される（例えば、Ｕ６プロモーター）。一部の実施形態
において、プロモーターは調節型プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。
他の実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態にお
いて、プロモーターは組織特異的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモ
ーターはウイルスプロモーターである。他の実施形態において、プロモーターは非ウイル
スプロモーターである。
一部の実施形態において、ベクターまたは送達媒体はミニサークルである。一部の実施
形態において、ベクターまたは送達媒体はナノプラスミドである。
一部の実施形態において、ベクターまたは送達媒体はウイルスベクター（例えば、組換
えウイルスの作成用）である。一部の実施形態において、ウイルスはＤＮＡウイルス（例
えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）である。他の実施形態において、ウイルス
はＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。
例示的ウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイル
ス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウ
イルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。ウイルスベクター技術は当該技術分
野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥ
ＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅ
ｓ １－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）、ならびに他
のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。
一部の実施形態において、ウイルスは分裂細胞を感染させる。他の実施形態において、
ウイルスは非分裂細胞を感染させる。一部の実施形態において、ウイルスは分裂細胞およ
び非分裂細胞の両方を感染させる。一部の実施形態において、ウイルスは宿主ゲノムに組
み込まれることができる。一部の実施形態において、ウイルスは例えばヒトにおける免疫
が低下するように操作される。一部の実施形態において、ウイルスは複製コンピテントで
ある。他の実施形態において、ウイルスは複製欠損であり、例えば、さらなるビリオン複
製および／またはパッケージングラウンドに必要な遺伝子の１つ以上のコード領域が他の
遺伝子に置き換えられているか、または欠失している。一部の実施形態において、ウイル
スはＣａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の一過性発現を生じさせる。他の実施形態
において、ウイルスはＣａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の持続的な、例えば、少
なくとも１週間、２週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、６ヵ月、９ヵ月、１年、２年、また
は永久的な発現を生じさせる。ウイルスのパッケージング能力は、例えば、少なくとも約
４ｋｂ～少なくとも約３０ｋｂまで様々で、例えば、少なくとも約５ｋｂ、１０ｋｂ、１
５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または５０ｋ
ｂであり得る。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは組換えレト
ロウイルスによって送達される。一部の実施形態において、レトロウイルス（例えば、モ
ロニーマウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノムへの組込みを可能にする逆転写酵
素を含む。一部の実施形態において、レトロウイルスは複製コンピテントである。他の実
施形態において、レトロウイルスは複製欠損であり、例えば、さらなるビリオン複製およ
びパッケージングラウンドに必要な遺伝子の１つ以上のコード領域が他の遺伝子に置き換
えられているか、または欠失している。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは組換えレン
チウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは複製欠損であり、例えば、ウ
イルス複製に必要な１つ以上の遺伝子を含まない。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは組換えアデ
ノウイルスによって送達される。一部の実施形態において、アデノウイルスは、ヒトにお
ける免疫が低下するように操作される。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは組換えＡＡ
Ｖによって送達される。一部の実施形態において、ＡＡＶはそのゲノムを宿主細胞、例え
ば本明細書に記載されるとおりの標的細胞のゲノムに組み込むことができる。一部の実施
形態において、ＡＡＶは自己相補性アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）、例えば、一体に
アニールして二本鎖ＤＮＡを形成する両方の鎖をパッケージングするｓｃＡＡＶである。
本開示の方法において使用し得るＡＡＶ血清型には、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、修飾
ＡＡＶ２（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆおよび／またはＳ６６２Ｖにお
ける修飾）、ＡＡＶ３、修飾ＡＡＶ３（例えば、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆおよび／または
Ｔ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、修飾ＡＡＶ６（例えば、Ｓ
６６３Ｖおよび／またはＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９
、ＡＡＶ ｒｈ １０が含まれ、またＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６な
どのシュードタイプＡＡＶも本開示の方法において使用することができる。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは、ハイブリ
ッドウイルス、例えば、本明細書に記載されるウイルスの１つ以上のハイブリッドによっ
て送達される。
パッケージング細胞を使用して、宿主または標的細胞を感染させる能力を有するウイル
ス粒子が形成される。かかる細胞としては、アデノウイルスをパッケージングすることの
できる２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングすることのできるψ２細胞ま
たはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、
核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞株によって作成さ
れる。ベクターは、典型的には、パッケージングおよび続く宿主または標的細胞への組込
み（該当する場合）に必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現
させるタンパク質をコードする発現カセットに置き換えられている。例えば、遺伝子療法
に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主または標的細胞
における遺伝子発現に必要なＡＡＶゲノム由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有
する。欠損したウイルス機能はパッケージング細胞株によってトランスで付与される。こ
れ以降、ウイルスＤＮＡは細胞株にパッケージングされ、細胞株は、他のＡＡＶ遺伝子、
すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠いているヘルパープラスミド
を含有する。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイル
スは、ヘルパープラスミドからのＡＡＶベクターの複製およびＡＡＶ遺伝子の発現を促進
する。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列を欠いているため多量にはパッケージングされな
い。アデノウイルスによる汚染は、例えばＡＡＶよりもアデノウイルスの方が感受性が高
い熱処理によって低減することができる。
ある実施形態において、ウイルスベクターは細胞型および／または組織型認識能力を有
する。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代替的なウイルスエンベロープ糖タンパク
質を有し、細胞型特異的受容体で操作されており（例えば、ペプチドリガンド、単鎖抗体
、成長因子などの標的リガンドを取り込むようなウイルスエンベロープ糖タンパク質の遺
伝子修飾）、および／またはウイルス糖タンパク質を認識する一端と、標的細胞表面の部
分を認識する他端とを含む二重特異性を有する分子架橋を有するように操作されている（
例えば、リガンド－受容体、モノクローナル抗体、アビジン－ビオチンおよび化学的コン
ジュゲーション）シュードタイプであり得る。
ある実施形態において、ウイルスベクターは細胞型特異的発現を実現する。例えば、組
織特異的プロモーターを構築して、標的細胞においてのみトランス遺伝子（Ｃａｓ９およ
びｇＲＮＡ）が発現するように制限することができる。ベクターの特異性は、トランス遺
伝子発現のマイクロＲＮＡ依存的制御によっても媒介され得る。ある実施形態において、
ウイルスベクターは、ウイルスベクターと標的細胞膜との高い融合効率を有する。例えば
、融合コンピテントな赤血球凝集素（ＨＡ）などの融合タンパク質を組み込んで細胞への
ウイルスの取込みを増加させることができる。ある実施形態において、ウイルスベクター
は核移行能力を有する。例えば、細胞壁の破壊が（細胞分裂中に）必要である、したがっ
て非分裂細胞に感染しないウイルスを改変してウイルスのマトリックスタンパク質に核移
行ペプチドを組み込み、それにより非増殖細胞の形質導入を可能にすることができる。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは、非ベクタ
ーベースの方法により（例えば、ネイキッドＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を用いて）送達さ
れる。例えば、ＤＮＡは、例えば、有機修飾シリカまたはケイ酸塩（オルモシル（Ｏｒｍ
ｏｓｉｌ））、エレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェク
ション、脂質媒介性トランスフェクション、デンドリマー、無機ナノ粒子、リン酸カルシ
ウム、またはこれらの組み合わせにより送達することができる。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは、ベクター
および非ベクターベースの方法の組み合わせにより送達される。例えば、ビロソームは、
不活化ウイルス（例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザウイルス）と組み合わせたリポソ
ームを含み、これにより、ウイルス方法またはリポソーム方法のいずれか単独と比べて、
例えば呼吸上皮細胞においてより効率的な遺伝子トランスファーがもたらされ得る。
ある実施形態において、送達媒体は非ウイルスベクターである。ある実施形態において
、非ウイルスベクターは無機ナノ粒子（例えば、ナノ粒子の表面に対するペイロードに付
加される）である。例示的無機ナノ粒子としては、例えば、磁気ナノ粒子（例えば、Ｆｅ
ｌｖｌｎ０２）、またはシリカが挙げられる。ナノ粒子の外表面は正電荷ポリマー（例
えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）とコンジュゲートすることができ
、それによりペイロードの付加（例えば、コンジュゲーションまたは捕捉）が可能となる
。ある実施形態において、非ウイルスベクターは有機ナノ粒子である（例えば、ナノ粒子
内部へのペイロードの捕捉）。例示的有機ナノ粒子としては、例えば、ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）およびプロタミンで被覆されている中性ヘルパー脂質および脂質コーテ
ィングで被覆された核酸複合体と共にカチオン性脂質を含有するＳＮＡＬＰリポソームが
挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲシステムまたはＣＲＩＳＰＲシステムもしくはその成分をコードする核酸
、例えばベクターのトランスファー用の例示的脂質および／またはポリマーとしては、例
えば、国際公開第２０１１／０７６８０７号パンフレット、国際公開第２０１４／１３６
０８６号パンフレット、国際公開第２００５／０６０６９７号パンフレット、国際公開第
２０１４／１４０２１１号パンフレット、国際公開第２０１２／０３１０４６号パンフレ
ット、国際公開第２０１３／１０３４６７号パンフレット、国際公開第２０１３／００６
８２５号パンフレット、国際公開第２０１２／００６３７８号パンフレット、国際公開第
２０１５／０９５３４０号パンフレット、および国際公開第２０１５／０９５３４６号パ
ンフレット（前述の各々の内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に記載
されるものが挙げられる。ある実施形態において、媒体は、標的細胞によるナノ粒子およ
びリポソームの取込みを増加させるためのターゲティング修飾、例えば、細胞特異的抗原
、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖類、および細胞透過性ペ
プチドを有する。ある実施形態において、媒体は融合性およびエンドソーム不安定化ペプ
チド／ポリマーを使用する。ある実施形態において、媒体は、酸によって惹起されるコン
ホメーション変化を受ける（例えば、それによりカーゴのエンドソームエスケープが加速
する）。ある実施形態において、刺激によって切断可能なポリマーが、例えば細胞内コン
パートメントにおける放出のため使用される。例えば、還元細胞環境で切断されるジスル
フィドベースのカチオン性ポリマーを使用することができる。
ある実施形態において、送達媒体は生物学的非ウイルス送達媒体である。ある実施形態
において、媒体は、弱毒化細菌（例えば、侵入性だが弱毒化されていて発病およびトラン
ス遺伝子の発現を防ぐように天然に、または人工的に操作されたもの（例えば、リステリ
ア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ある種のサ
ルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、および修飾大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ））、栄養向性および組織特異的向性を有して特異的組織を標的とする細菌、修
飾表面タンパク質を有して標的組織特異性を改変する細菌）である。ある実施形態におい
て、媒体は、遺伝子修飾されたバクテリオファージ（例えば、大きいパッケージング能力
、低い免疫原性を有し、哺乳動物プラスミド維持配列を含み、かつ組み込まれた標的リガ
ンドを有する操作されたファージ）である。ある実施形態において、媒体は哺乳動物ウイ
ルス様粒子である。例えば、修飾ウイルス粒子を作成（例えば、「空の」粒子を精製し、
続いてエキソビボでウイルスを所望のカーゴとアセンブルすることにより）することがで
きる。媒体は、標的リガンドを組み込んで標的組織特異性を改変させるように操作するこ
ともできる。ある実施形態において、媒体は生物学的リポソームである。例えば、生物学
的リポソームは、ヒト細胞に由来するリン脂質ベースの粒子（例えば、対象に由来する球
構造体に分解される赤血球細胞である赤血球ゴースト（例えば、組織ターゲティングは、
様々な組織または細胞特異的リガンドの付加によって実現することができる）、または分
泌エキソソーム－エンドサイトーシス起源の対象（すなわち患者）由来膜結合型ナノ小胞
（３０～１００ｎｍ）（例えば、様々な細胞型から作製することができ、したがって標的
リガンドの必要性なしに細胞によって取り込まれ得る）である。
ある実施形態において、Ｃａｓシステムの成分、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ
９分子成分および／またはｇＲＮＡ分子成分以外の１つ以上の核酸分子（例えば、ＤＮＡ
分子）が送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓシステムの成分の１つ
以上が送達されるのと同じ時点で送達される。ある実施形態において、核酸分子はＣａｓ
９システムの成分の１つ以上の送達の（例えば、約３０分、１時間、２時間、３時間、６
時間、９時間、１２時間、１日、２日、３日、１週、２週間、または４週間未満）前また
は後に送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓ９システムの成分の１つ
以上、例えば、Ｃａｓ９分子成分および／またはｇＲＮＡ分子成分が送達されるのと異な
る手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれによっ
ても送達することができる。例えば、核酸分子はウイルスベクター、例えば組込み欠損レ
ンチウイルスによって送達することができ、かつＣａｓ９分子成分および／またはｇＲＮ
Ａ分子成分はエレクトロポレーションによって送達することができ、これにより例えば、
核酸（例えば、ＤＮＡ）によって引き起こされる毒性を低減することができる。ある実施
形態において、核酸分子は治療用タンパク質、例えば本明細書に記載されるタンパク質を
コードする。ある実施形態において、核酸分子はＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載され
るＲＮＡ分子をコードする。
Ｃａｓ９分子をコードするＲＮＡの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、活性Ｃａｓ９分子、不活性Ｃａｓ９分子または不活性Ｃａｓ９
融合タンパク質）および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＲＮＡは、当該技術分野にお
いて公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり、細胞、例えば本明細書に記
載される標的細胞に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９コードＲＮＡおよび／また
はｇＲＮＡコードＲＮＡは、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーショ
ン、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、またはこれらの組み合わせによ
って送達することができる。
タンパク質としてのＣａｓ９分子の送達
Ｃａｓ９分子（例えば、活性Ｃａｓ９分子、不活性Ｃａｓ９分子または不活性Ｃａｓ９
融合タンパク質）は、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載さ
れるとおり細胞に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質分子は、例えば、
マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、
ペプチド媒介送達、セルスクイージングまたはアブレーション（例えば、ナノニードルに
よる）またはこれらの組み合わせによって送達することができる。送達は、ｇＲＮＡをコ
ードするＤＮＡによるか、またはｇＲＮＡにより、例えばｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質
とをリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）に予め複合体化することによって達成し得る。
ある態様において、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子はタンパク質と
して送達され、かつｇＲＮＡ分子は１つ以上のＲＮＡとして（例えば、本明細書に記載さ
れるとおりのｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡとして）送達される。実施形態において、Ｃａ
ｓ９タンパク質は、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞への送達前に、リボ核タン
パク質複合体（「ＲＮＰ」）としてｇＲＮＡ分子と複合体化される。実施形態において、
ＲＮＰは、例えば本明細書に記載される細胞に、当該技術分野において公知の任意の方法
、例えばエレクトロポレーションによって送達することができる。本明細書に記載される
とおり、および理論によって拘束されるものではないが、細胞に送達されるＲＮＰの濃度
が低下する場合でも、例えば本明細書に記載される標的細胞において標的配列に高い％編
集率（例えば、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、または＞９９％）をもたらす
ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を使用することが好ましい。この場合にも、理論によっ
て拘束されるものではないが、標的細胞において（低いＲＮＰ濃度の場合を含め）標的配
列の高い％編集率を生じるｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰを低下したまたは低い濃度で送達す
ることは、オフターゲット編集イベントの頻度および数を低減し得るため有益であり得る
。一態様において、低いまたは低下した濃度のＲＮＰを使用する場合、以下の例示的手順
を用いてｄｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰを作成することができる：
１．Ｃａｓ９分子およびｔｒａｃｒを溶液中に高濃度（例えば、細胞に送達される最終Ｒ
ＮＰ濃度よりも高い濃度）で提供し、これらの２つの成分を平衡化させる；
２．ｃｒＲＮＡ分子を提供し、成分を平衡化させる（それによりＲＮＰの高濃度溶液を形
成する）；
３．ＲＮＰ溶液を所望の濃度に希釈する；
４．前記所望の濃度の前記ＲＮＰを標的細胞に例えばエレクトロポレーションによって送
達する。
上記の手順は、上記のステップ２を省略し、かつステップ１において、溶液中に高濃度
のＣａｓ９分子およびｓｇＲＮＡ分子を提供して成分を平衡化させることにより、ｓｇＲ
ＮＡ分子で用いるように改良し得る。実施形態において、Ｃａｓ９分子および各ｇＲＮＡ
成分は溶液中に１：２比（Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ）、例えば１：２モル比のＣａｓ９：ｇＲ
ＮＡ分子で提供される。ｄｇＲＮＡ分子が使用される場合、比、例えばモル比は１：２：
２（Ｃａｓ９：ｔｒａｃｒ：ｃｒＲＮＡ）である。実施形態において、ＲＮＰは２０μＭ
以上の濃度、例えば約２０μＭ～約５０μＭの濃度で形成される。実施形態において、Ｒ
ＮＰは１０μＭ以上の濃度、例えば約１０μＭ～約３０μＭの濃度で形成される。実施形
態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的
細胞への送達用溶液中に１０μＭ以下の最終濃度（例えば、約０．０１μＭ～約１０μＭ
の濃度）に希釈される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記
載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に３μＭ以下の最終濃度（例えば、
約０．０１μＭ～約３μＭの濃度）に希釈される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細
胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に１μＭ
以下の最終濃度（例えば、約０．０１μＭ～約１μＭの濃度）に希釈される。実施形態に
おいて、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞
への送達用溶液中に０．３μＭ以下の最終濃度（例えば、約０．０１μＭ～約０．３μＭ
の濃度）に希釈される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記
載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約３μＭの最終濃度で提供される
。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む
前記標的細胞への送達用溶液中に約１μＭの最終濃度で提供される。実施形態において、
ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達
用溶液中に約０．３μＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細
胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約０．
１μＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明
細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約０．０５μＭの最終濃
度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載され
るもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約０．０３μＭの最終濃度で提供される
。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む
前記標的細胞への送達用溶液中に約０．０１μＭの最終濃度で提供される。実施形態にお
いて、ＲＮＰは、エレクトロポレーションに好適な媒体中に製剤化される。実施形態にお
いて、ＲＮＰは、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞、例えばＨＳＰＣ細胞にエレ
クトロポレーションにより、例えば本明細書に記載されるエレクトロポレーション条件を
用いて送達される。
成分のバイモーダル送達または差次的送達
Ｃａｓシステムの成分、例えばＣａｓ９分子成分およびｇＲＮＡ分子成分を別々に送達
する、より詳細には成分を異なる様式で送達すると、例えば組織特異性および安全性が改
善されるため、パフォーマンスを増進させることができる。
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子は、異なる様式により、また
は本明細書においてときに差次的様式と称されるとおり送達される。異なる様式または差
次的様式とは、本明細書で使用されるとき、対象成分分子、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲ
ＮＡ分子、または鋳型核酸に異なる薬力学的または薬物動態学的特性を付与する送達様式
を指す。例えば、送達様式は、例えば、選択されたコンパートメント、組織、または臓器
に異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間分布をもたらし得る。
幾つかの送達様式、例えば、細胞、または細胞の子孫において例えば自己複製または細
胞核酸への挿入によって持続する核酸ベクターによる送達は、成分のより持続的な発現お
よび存在をもたらす。
ＸＩ．治療方法
本明細書に記載されるＣａｓ９システム、例えば、１つ以上のｇＲＮＡ分子および１つ
以上のＣａｓ９分子は、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患の治療に有用である。用語「
～を治療する」、「治療された」、「治療している」、および「治療」には、ｃａｓ９シ
ステム、例えば１つ以上のｇＲＮＡ分子および１つ以上のｃａｓ９分子を細胞に投与する
ことにより、疾患の症状、合併症、または生化学的徴候を予防し、またはその発生を遅延
させること、疾患、病態、または障害の症状を軽減し、またはそのさらなる発症を阻止ま
たは阻害することが含まれる。治療には、本発明のｇＲＮＡ分子（または２つ以上のｇＲ
ＮＡ分子）の導入により、または本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムの
導入により、または本明細書に記載される前記細胞の調製方法のいずれかによって修飾さ
れた１つ以上の細胞、例えばＨＳＰＣ（例えば、その集団）の投与により、疾患の症状、
合併症、または生化学的徴候を予防し、またはその発生を遅延させること、疾患、病態、
または障害の症状を軽減し、またはそのさらなる発症を阻止または阻害することも含まれ
得る。治療は予防的であってもよく（それにより疾患を予防し、またはその発生を遅延さ
せるか、またはその臨床的もしくは準臨床的症状の発現を予防する）、または疾患発現後
の症状の療法的抑制または軽減であってもよい。治療は、本明細書に記載される療法的手
段によって計測することができる。したがって、本発明の「治療」方法には、細胞へのｃ
ａｓ９システム（例えば、１つ以上のｇＲＮＡ分子および１つ以上のＣａｓ９分子）の導
入によって改変された細胞を対象に投与することにより、疾患または病態の１つ以上の症
状を治癒し、その重症度を低減し、またはそれを改善すること、かかる治療がない場合の
予想を超えて対象の健康または生存を延ばすことも含まれる。例えば、「治療」には、対
象の疾患症状の少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１
３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３
５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８
５％、９０％、９５％またはそれを超える軽減が含まれる。
本明細書、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、および／また
は表９に記載される標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むＣａｓ９システムは、異常
ヘモグロビン症の治療に有用である。
異常ヘモグロビン症
異常ヘモグロビン症には、赤血球細胞（ＲＢＣ）の産生低下および／または破壊増加（
溶血）がある遺伝的原因の幾つもの貧血症が含まれる。それらには、酸素濃度を維持する
能力の低下が付随する異常ヘモグロビンの産生をもたらす遺伝的欠陥も含まれる。かかる
障害の中には、正常なβ－グロビンを十分な量で産生できないことが関係するものもあれ
ば、正常なβ－グロビンを全く産生できないことが関係するものもある。β－グロビンタ
ンパク質に関連するこれらの障害は、一般にβヘモグロビン異常症と称される。例えば、
β－サラセミアは、β－グロビン遺伝子の発現の部分的または完全な欠損がＨｂＡ欠損ま
たは欠如につながることによって起こる。鎌状赤血球貧血は、β－グロビン構造遺伝子の
点突然変異が異常な（鎌状の）ヘモグロビン（ＨｂＳ）の産生につながることによって起
こる。ＨｂＳは、特に脱酸素化条件下で重合し易い。ＨｂＳ ＲＢＣは正常ＲＢＣと比べ
て脆弱で溶血を起こし易く、最終的に貧血につながる。
ある実施形態において、αグロビンまたはβグロビンの遺伝的欠陥が、例えば、本明細
書に記載されるＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子、例えばＣＲＩＳＰＲシステムを用いた
相同組換えによって修正される。
ある実施形態において、αグロビンまたはβグロビンの野生型（例えば、非突然変異型
）コピーをコードする遺伝子が、例えば、セーフハーバー部位、例えばＡＡＶＳ１セーフ
ハーバー部位に、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムおよび方法を用いた相同組
換えによって細胞のゲノムに挿入される。
ある実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を用い
て異常ヘモグロビン症関連遺伝子が標的化される。例示的標的としては、例えば、γ－グ
ロビン遺伝子の制御に関連する遺伝子が挙げられる。ある実施形態において、標的はＢＣ
Ｌ１１Ａである。ある実施形態において、標的はＢＣＬ１１ａエンハンサーである。ある
実施形態において、標的はＨＰＦＨ領域である。
胎児ヘモグロビンは（またヘモグロビンＦまたはＨｂＦまたはα２γ２も）、２つの成
人α－グロビンポリペプチドおよび２つの胎児β様γ－グロビンポリペプチドの四量体で
ある。ＨｂＦは、ヒト胎児における子宮内発育期の最後の７ヵ月間および新生児における
生後約６ヵ月までの間の主要な酸素輸送タンパク質である。機能上、胎児ヘモグロビンは
、発育中の胎児に母体の血流から酸素がより良好に届くように、酸素を成人型よりも高い
親和性で結合可能である点が、成人ヘモグロビンと最も異なる。
新生児では、胎児ヘモグロビンは生後約６ヵ月までにほぼ完全に成人ヘモグロビンに置
き換わる。成人では、胎児ヘモグロビンの産生を薬理学的に再活性化することができ、こ
れは異常ヘモグロビン症などの疾患の治療に有用である。例えば、特定の異常ヘモグロビ
ン症患者では、高レベルのγ－グロビン発現がβ－グロビン遺伝子産生の欠損または障害
を部分的に代償することができ、これらの疾患における臨床的重症度を改善し得る。Ｈｂ
ＦレベルまたはＦ－細胞（ＨｂＦを含有する赤血球）数の増加は、異常ヘモグロビン症、
例えば重症型β－サラセミアおよび鎌状赤血球貧血の疾患重症度を改善することができる
。
ＨｂＦレベルまたはＦ－細胞の増加は、細胞におけるＢＣＬ１１Ａ発現の低下に関連し
得る。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子はマルチジンクフィンガー転写因子をコードする。ある実施形
態において、ＢＣＬ１１Ａの発現が調整、例えば下方制御される。ある実施形態において
、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が編集される。ある実施形態において、例えば赤血球系統細胞にお
けるＢＣＬ１１ａの機能が障害され、または下方制御される。ある実施形態において、細
胞は造血幹細胞または前駆細胞である。
鎌状赤血球症
鎌状赤血球症は、ヘモグロビンに影響を及ぼす一群の障害である。この障害を持つ人は
異型ヘモグロビン分子（ヘモグロビンＳ）を有し、これによって赤血球細胞が歪んで鎌状
、または三日月形の形状になり得る。この障害に特有の特徴としては、低赤血球細胞数（
貧血症）、反復感染、および周期性疼痛発作が挙げられる。
ＨＢＢ遺伝子の突然変異が鎌状赤血球症を引き起こす。ＨＢＢ遺伝子はβ－グロビン作
製の指令を与える。ＨＢＢ遺伝子の異なる突然変異によって様々なバージョンのβ－グロ
ビンが生じる。１つの特定のＨＢＢ遺伝子突然変異は、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）として
知られる異常なバージョンのβ－グロビンを作り出す。ＨＢＢ遺伝子の他の突然変異は、
ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）およびヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）など、さらなる異常なバージ
ョンのβ－グロビンにつながる。ＨＢＢ遺伝子突然変異は、異常に低いレベルのβ－グロ
ビン、すなわちβサラセミアも生じさせ得る。
鎌状赤血球症の人では、ヘモグロビン中のβ－グロビンサブユニットの少なくとも１つ
がヘモグロビンＳに置き換わっている。鎌状赤血球症の一般的な型である鎌状赤血球貧血
では、ヘモグロビン中の両方のβ－グロビンサブユニットがヘモグロビンＳに置き換わる
。他のタイプの鎌状赤血球症では、ヘモグロビン中の一方のβ－グロビンサブユニットの
みがヘモグロビンＳに置き換わる。他方のβ－グロビンサブユニットは、ヘモグロビンＣ
など、別の異常変異体に置き換わる。例えば、鎌状ヘモグロビンＣ（ＨｂＳＣ）症の人は
、β－グロビンの代わりにヘモグロビンＳおよびヘモグロビンＣを含むヘモグロビン分子
を有する。ヘモグロビンＳを産生する突然変異とβサラセミアとが一緒に起こる場合、個
体はヘモグロビンＳ－βサラセミア（ＨｂＳβＴｈａｌ）症を有する。
βサラセミア
βサラセミアは、ヘモグロビンの産生が低下する血液障害である。βサラセミアの人で
は、低レベルのヘモグロビンが体の多くの箇所の酸素欠乏につながる。罹患者はまた、赤
血球細胞の不足も有し（貧血）、そのため青白い皮膚、脱力感、疲労、およびより重篤な
合併症を生じ得る。βサラセミアの人は血液凝固異常を発症するリスクが高い。
βサラセミアは症状の重症度に応じて２つのタイプ：重症型サラセミア（クーリー貧血
としても知られる）および中間型サラセミアに分けられる。これらの２つのタイプのなか
では、重症型サラセミアがより重篤である。
ＨＢＢ遺伝子の突然変異がβサラセミアを引き起こす。ＨＢＢ遺伝子はβ－グロビン作
製の指令を与える。ＨＢＢ遺伝子の幾つかの突然変異が任意のβ－グロビンの産生を妨げ
る。β－グロビンが存在しない場合、β－ゼロ（Ｂ０）サラセミアと称される。他のＨＢ
Ｂ遺伝子突然変異は何らかのβ－グロビンの産生が可能であるものの量が低下し、すなわ
ち、β－プラス（Ｂ＋）サラセミアである。両方のタイプをもつ人が、重症型サラセミア
および中間型サラセミアと診断されている。
ある実施形態において、第１の遺伝子を標的とするＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体
を使用して、第２の遺伝子、例えば第２の遺伝子の突然変異によって特徴付けられる障害
が治療される。例として、第１の遺伝子を例えば編集またはペイロード送達によって標的
化することにより、第２の遺伝子、例えば突然変異体の第２の遺伝子の影響を代償するか
、またはそれからのさらなる損傷を抑えることができる。ある実施形態において、対象が
保因する第１の遺伝子の１つまたは複数のアレルは、障害の原因ではない。
一態様において、本発明は、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の増加を必要としている哺乳
動物、例えばヒトの治療に関する。
一態様において、本発明は、異常ヘモグロビン症と診断された、またはその発症リスク
がある哺乳動物、例えばヒトの治療に関する。
一態様において、異常ヘモグロビン症はβヘモグロビン異常症である。一態様において
、異常ヘモグロビン症は鎌状赤血球症である。一態様において、異常ヘモグロビン症はβ
サラセミアである。
異常ヘモグロビン症の治療方法
別の態様において、本発明は治療方法を提供する。態様において、本発明のｇＲＮＡ分
子、ＣＲＩＳＰＲシステムおよび／または細胞を使用して、それを必要としている患者が
治療される。態様において、患者は哺乳動物、例えばヒトである。態様において、患者は
異常ヘモグロビン症を有する。実施形態において、患者は鎌状赤血球症を有する。実施形
態において、患者はβサラセミアを有する。
一態様において、本治療方法は、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば、表１、表２、表３
、表４、表５、表６、表７、表８、または表９に記載される標的化ドメインを含む１つ以
上のｇＲＮＡ分子、および本明細書に記載される１つ以上のｃａｓ９分子を哺乳動物、例
えばヒトに投与することを含む。
一態様において、本治療方法は哺乳動物に細胞集団を投与することを含み、ここで、細
胞集団は、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表
７、表８、または表９に記載される標的化ドメインを含む１つ以上のｇＲＮＡ分子、およ
び本明細書に記載される１つ以上のｃａｓ９分子、例えば本明細書に記載されるとおりの
ＣＲＩＳＰＲシステムを投与された哺乳動物、例えばヒト由来の細胞集団である。一実施
形態において、細胞への１つ以上のｇＲＮＡ分子またはＣＲＩＳＰＲシステムの投与はイ
ンビボで達成される。一実施形態において、細胞への１つ以上のｇＲＮＡ分子またはＣＲ
ＩＳＰＲシステムの投与はエキソビボで達成される。
一態様において、本治療方法は、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば、表１、表２、表３
、表４、表５、表６、表７、表８、または表９に記載される標的化ドメインを含む１つ以
上のｇＲＮＡ分子、および本明細書に記載される１つ以上のｃａｓ９分子を含む、または
一時的にそれらを含んでいた細胞、または前記細胞の子孫を含む細胞集団の有効量を哺乳
動物、例えばヒトに投与することを含む。一実施形態において、細胞は哺乳動物にとって
同種異系由来である。一実施形態において、細胞は哺乳動物にとって自己由来である。一
実施形態において、細胞は哺乳動物から採取され、エキソビボで操作されて、哺乳動物に
戻される。
態様において、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、表
６、表７、表８、または表９に記載される標的化ドメインを含む１つ以上のｇＲＮＡ分子
、および本明細書に記載される１つ以上のｃａｓ９分子を含む、または一時的にそれらを
含んでいた細胞、または前記細胞の子孫は、幹細胞または前駆細胞を含む。一態様におい
て、幹細胞は造血幹細胞である。一態様において、前駆細胞は造血前駆細胞である。一態
様において、細胞は造血幹細胞および造血前駆細胞の両方を含み、例えばＨＳＰＣである
。一態様において、細胞はＣＤ３４＋細胞を含む、例えばそれからなる。一態様において
、細胞はＣＤ３４－細胞を実質的に含まない。一態様において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ
９０＋幹細胞を含む、例えばそれからなる。一態様において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ９
０－細胞を含む、例えばそれからなる。ある態様において、細胞は、上記に記載されるま
たは本明細書に記載される細胞型の１つ以上を含む集団である。
一実施形態において、本開示は、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球症またはβ－
サラセミアを治療する方法、またはそれを必要としている哺乳動物、例えばヒトの胎児ヘ
モグロビン発現を増加させる方法を提供し、この方法は、
ａ）哺乳動物からＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を提供する、例えば採取ま
たは単離するステップ；
ｂ）前記細胞をエキソビボで、例えば細胞培養培地中に、任意選択で少なくとも１つの幹
細胞増殖剤を含む組成物の有効量の存在下で提供するステップであって、それにより前記
ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を未処理の集団よりも高い程度に増殖させる
ステップ；
ｃ）ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を、有効量の、本明細書に記載される標
的化ドメイン、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、または表９
に記載される標的化ドメインを含む少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、または前記ｇＲＮＡ
分子をコードする核酸と、例えば本明細書に記載される少なくとも１つのｃａｓ９分子、
または前記ｃａｓ９分子をコードする核酸とを含む組成物、例えば本明細書に記載される
とおりの１つ以上のＲＮＰに、例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムに接
触させるステップ；
ｄ）集団の細胞の少なくとも一部（例えば、集団のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞の少
なくとも一部）に少なくとも１つの修飾を生じさせるステップであって、それにより、例
えば、前記ＨＳＰＣが赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化したとき、例えばステ
ップｃ）により接触させていない細胞と比べて胎児ヘモグロビン発現が増加するステップ
；および
ｆ）前記修飾ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を含む細胞の集団を哺乳動物に戻すス
テップ
を含む。
ある態様において、ＨＳＰＣは、それが戻される哺乳動物にとって同種異系由来である
。ある態様において、ＨＳＰＣは、それが戻される哺乳動物にとって自己由来である。態
様において、ＨＳＰＣは骨髄から単離されたものである。態様において、ＨＳＰＣは末梢
血、例えば動員末梢血から単離されたものである。態様において、動員末梢血は、Ｇ－Ｃ
ＳＦが投与された対象から単離されたものである。態様において、動員末梢血は、Ｇ－Ｃ
ＳＦ以外の動員剤、例えばＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）が投与
された対象から単離されたものである。態様において、ＨＳＰＣは臍帯血から単離された
ものである。
本方法のさらなる実施形態において、本方法は、ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）
の集団を例えば上記に記載される供給源から提供した後、細胞の集団をＨＳＰＣ（例えば
、ＣＤ３４＋細胞）について富化するステップをさらに含む。本方法の実施形態において
、前記富化後、細胞、例えばＨＳＰＣの集団は、ＣＤ３４－細胞を実質的に含まない。
実施形態において、哺乳動物に戻される細胞の集団は、少なくとも７０％の生存細胞を
含む。実施形態において、哺乳動物に戻される細胞の集団は、少なくとも７５％の生存細
胞を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される細胞の集団は、少なくとも８０％の生
存細胞を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される細胞の集団は、少なくとも８５％
の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される細胞の集団は、少なくとも９
０％の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される細胞の集団は、少なくと
も９５％の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される細胞の集団は、少な
くとも９９％の生存細胞を含む。生存率は、代表的な一部の細胞の集団を例えば当該技術
分野において公知のとおりの細胞生死判別マーカーに関して染色することにより決定し得
る。
別の実施形態において、本開示は、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球症またはβ
－サラセミアを治療する方法、またはそれを必要としている哺乳動物、例えばヒトの胎児
ヘモグロビン発現を増加させる方法を提供し、この方法は、
ａ）例えば哺乳動物の骨髄から、哺乳動物のＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団
を提供する、例えば採取または単離するステップ；
ｂ）ステップａ）の細胞の集団からＣＤ３４＋細胞を単離するステップ；
ｃ）前記ＣＤ３４＋細胞をエキソビボで提供し、および前記細胞を例えば細胞培養培地中
、少なくとも１つの幹細胞増殖剤、例えば化合物４、例えば約０．５～約０．７５マイク
ロモル濃度の化合物４を含む組成物の有効量の存在下で培養するステップであって、それ
により前記ＣＤ３４＋細胞の集団を未処理の集団よりも高い程度に増殖させるステップ；
ｄ）ＣＤ３４＋細胞の集団の細胞に、有効量の、例えば本明細書に記載されるとおりのＣ
ａｓ９分子と、例えば本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子とを含む組成物を導入
するステップであって、例えば、任意選択でＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子は、例えば
本明細書に記載されるとおりのＲＮＰの形態であり、および任意選択で前記導入は、前記
細胞への前記ＲＮＰの、例えば本明細書に記載されるとおりのエレクトロポレーションに
よる導入である、ステップ；
ｅ）集団の細胞の少なくとも一部（例えば、集団のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞の少
なくとも一部）に少なくとも１つの遺伝子修飾を生じさせるステップであって、それによ
り、ステップｄ）で導入されたｇＲＮＡの標的化ドメインと相補的なゲノム部位にまたは
その近傍に、例えば本明細書に記載されるとおりのインデルを作り出すステップ；
ｆ）任意選択で、加えて、前記導入後に、例えば細胞培養培地中、少なくとも１つの幹細
胞増殖剤、例えば化合物４、例えば約０．５～約０．７５マイクロモル濃度の化合物４を
含む組成物の有効量の存在下で前記細胞を培養するステップであって、それにより細胞が
少なくとも２倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍に増殖するステップ；
ｇ）前記細胞を凍結保存するステップ；および
ｈ）細胞を哺乳動物に戻すステップであって、哺乳動物に戻される細胞が、１）赤血球系
統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力を維持しており、２）赤血球細胞に分化した
とき、例えばステップｅ）のｇＲＮＡによって修飾されていない細胞と比べて高いレベル
の胎児ヘモグロビンを産生する、例えば、１細胞当たり少なくとも６ピコグラムの胎児ヘ
モグロビンを産生する細胞を含む、ステップ
を含む。
ある態様において、ＨＳＰＣは、それが戻される哺乳動物にとって同種異系由来である
。ある態様において、ＨＳＰＣは、それが戻される哺乳動物にとって自己由来である。態
様において、ＨＳＰＣは骨髄から単離されたものである。態様において、ＨＳＰＣは末梢
血、例えば動員末梢血から単離されたものである。態様において、動員末梢血は、Ｇ－Ｃ
ＳＦが投与された対象から単離されたものである。態様において、動員末梢血は、Ｇ－Ｃ
ＳＦ以外の動員剤、例えばＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）が投与
された対象から単離されたものである。態様において、ＨＳＰＣは臍帯血から単離された
ものである。
上記の方法の実施形態において、記載されるステップｂ）は、ＣＤ３４－細胞を実質的
に含まない細胞の集団をもたらす。
本方法のさらなる実施形態において、本方法は、ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）
の集団を例えば上記に記載される供給源から提供した後、細胞の集団がＨＳＰＣ（例えば
、ＣＤ３４＋細胞）に関して富化されることをさらに含む。
これらの方法のさらなる実施形態において、増加した胎児ヘモグロビン発現を分化する
能力を有する修飾ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋幹細胞）の集団が凍結保存され、哺乳動
物への再導入まで貯蔵される。実施形態において、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞
に分化する能力、および／または赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化したときに
高いレベルの胎児ヘモグロビンを産生する能力を有するＨＳＰＣの凍結保存された集団が
解凍され、次に哺乳動物に再導入される。これらの方法のさらなる実施形態において、本
方法は、哺乳動物の内因性造血前駆細胞または幹細胞を除去または低減するため化学療法
および／または放射線療法を含む。これらの方法のさらなる実施形態において、本方法は
、哺乳動物の内因性造血前駆細胞または幹細胞を除去または低減するため化学療法および
／または放射線療法ステップを含まない。これらの方法のさらなる実施形態において、本
方法は、哺乳動物の内因性造血前駆細胞または幹細胞を部分的に低減する（例えば、部分
的リンパ球枯渇）ため化学療法および／または放射線療法を含む。実施形態において、患
者が完全リンパ球枯渇用量のブスルファンで治療された後、修飾ＨＳＰＣが哺乳動物に再
導入される。実施形態において、患者が部分的リンパ球枯渇用量のブスルファンで治療さ
れた後、修飾ＨＳＰＣが哺乳動物に再導入される。
実施形態において、細胞は、＋５８ ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域に対するｇＲＮＡ
と複合体化したＣａｓ９分子、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子を含む
ＲＮＰと接触させる。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ０００３１２の標的化ドメイン
を含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ０００３１１の標的化ドメインを含む。実施
形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００１１２８の標的化ドメインを含む。実施形態において
、ｇＲＮＡはＣＲ００１１２５の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡは
ＣＲ００１１２６の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００１１
２７の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号２４８］－［
配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、［配列番号７８１２］を
含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な
３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなる
ｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配
列番号２４８］－［配列番号６６０１を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、
３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列
番号２４８］－［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実
施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号２４７］－［配列番号６６０７］を含む、例え
ばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択
で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例
えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲ
ＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号２４７］－［配列番号６６０１
を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的
な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号２４７］－［配列番号７８１１］
を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列
番号３３８］－［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番
号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７
個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えば
それからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲ
ＮＡは、［配列番号３３８］－［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意
選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う
、例えば［配列番号３３８］－［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲ
ＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号３３５］－［配列番号６６０７
］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれから
なる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオ
チドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデ
ュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号３３５］－［配
列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、ま
たは７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号３３５］－［配
列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇ
ＲＮＡは、［配列番号３３６］－［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒ
ＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、
５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６
０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形
態において、ｇＲＮＡは、［配列番号３３６］－［配列番号６６０１］を含む、例えばそ
れからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌ
クレオチドを伴う、例えば［配列番号３３６］－［配列番号７８１１］を含む、例えばそ
れからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号３３７］－［
配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む
、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’
ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒ
ａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番
号３３７］－［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３
、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番
号３３７］－［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。前述
の実施形態のいずれにおいても、ｇＲＮＡのＲＮＡ成分の一部または全てが、例えば本明
細書に記載されるとおりの１つ以上のヌクレオチドで修飾されていてもよい。実施形態に
おいて、ｇＲＮＡ分子は配列番号３４２である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列
番号３４３である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６２である。実施形
態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３４４および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮ
Ａ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３４４および配列番号３４
６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３４５
および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分
子は、配列番号３４５および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態に
おいて、ｇＲＮＡ分子は配列番号３４７である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列
番号３４８である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６３である。実施形
態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３４９および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮ
Ａ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３４９および配列番号３４
６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５０
および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分
子は、配列番号３５０および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態に
おいて、ｇＲＮＡ分子は配列番号３５１である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列
番号３５２である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６４である。実施形
態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５３および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮ
Ａ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５３および配列番号３４
６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５４
および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分
子は、配列番号３５４および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態に
おいて、ｇＲＮＡ分子は配列番号３５５である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列
番号３５６である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６５である。実施形
態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５７および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮ
Ａ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５７および配列番号３４
６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５８
および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分
子は、配列番号３５８および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態に
おいて、ｇＲＮＡ分子は配列番号３５９である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列
番号３６０である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６６である。実施形
態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６１および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮ
Ａ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６１および配列番号３４
６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６２
および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分
子は、配列番号３６２および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態に
おいて、ｇＲＮＡ分子は配列番号３６３である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列
番号３６４である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６７である。実施形
態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６５および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮ
Ａ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６５および配列番号３４
６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６６
および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分
子は、配列番号３６６および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態に
おいて、ｇＲＮＡ分子は配列番号３６７である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列
番号３６８である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６８である。実施形
態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６９および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮ
Ａ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６９および配列番号３４
６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７０
および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分
子は、配列番号３７０および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態に
おいて、ｇＲＮＡ分子は配列番号３７１である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列
番号３７２である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６９である。実施形
態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７３および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮ
Ａ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７３および配列番号３４
６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７４
および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分
子は、配列番号３７４および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。
実施形態において、細胞は、ＨＰＦＨ領域に対するｇＲＮＡと複合体化したＣａｓ９分
子、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子を含むＲＮＰと接触させる。実施
形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００１０３０の標的化ドメインを含む。実施形態において
、ｇＲＮＡはＣＲ００１０２８の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡは
ＣＲ００１２２１の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００１１
３７の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００３０３５の標的化
ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００３０８５の標的化ドメインを含
む。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号９８］－［配列番号６６０７］を含む、
例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意
選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う
、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイ
ドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号９８］－［配列番号６６０
１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追
加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号９８］－［配列番号７８１１
］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配
列番号１００］－［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列
番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または
７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例え
ばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇ
ＲＮＡは、［配列番号１００］－［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任
意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴
う、例えば［配列番号１００］－［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇ
ＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１５８９］－［配列番号６６
０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれ
からなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌク
レオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含
むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１５８９］
－［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、
６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号１５８９
］－［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態にお
いて、ｇＲＮＡは、［配列番号１５０５］－［配列番号６６０７］を含む、例えばそれか
らなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２
、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列
番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡであ
る。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１５０５］－［配列番号６６０１］を含
む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３
’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号１５０５］－［配列番号７８１１］を
含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番
号１７００］－［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番
号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７
個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えば
それからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲ
ＮＡは、［配列番号１７００］－［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任
意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴
う、例えば［配列番号１７００］－［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓ
ｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１７５０］－［配列番号６
６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそ
れからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌ
クレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを
含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１７５０
］－［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５
、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号１７５
０］－［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態に
おいて、ｇＲＮＡ分子は配列番号３７５である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列
番号３７６である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７７０である。実施形
態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７７および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮ
Ａ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７７および配列番号３４
６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７８
および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分
子は、配列番号３７８および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態に
おいて、ｇＲＮＡ分子は配列番号３７９である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列
番号３８０である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７７１である。実施形
態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８１および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮ
Ａ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８１および配列番号３４
６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８２
および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分
子は、配列番号３８２および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態に
おいて、ｇＲＮＡ分子は配列番号３８３である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列
番号３８４である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７７２である。実施形
態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８５および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮ
Ａ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８５および配列番号３４
６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８６
および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分
子は、配列番号３８６および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態に
おいて、ｇＲＮＡ分子は配列番号３８７である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列
番号３８８である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７７３である。実施形
態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８９および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮ
Ａ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８９および配列番号３４
６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９０
および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分
子は、配列番号３９０および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態に
おいて、ｇＲＮＡ分子は配列番号３９１である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列
番号３９２である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７７４である。実施形
態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮ
Ａ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３および配列番号３４
６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９４
および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分
子は、配列番号３９４および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態に
おいて、ｇＲＮＡ分子は配列番号３９５である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列
番号３９６である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７７５である。実施形
態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９７および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮ
Ａ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９７および配列番号３４
６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９８
および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分
子は、配列番号３９８および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。
実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物１である。実施形態において、幹細胞増殖剤
は化合物２である。実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物３である。実施形態におい
て、幹細胞増殖剤は化合物４である。実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物４であり
、２～０．１マイクロモル濃度、例えば１～０．２５マイクロモル濃度、例えば０．７５
～０．５マイクロモル濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は、国際公開第
２０１０／０５９４０１号パンフレットに記載される分子（例えば、国際公開第２０１０
／０５９４０１号パンフレットの実施例１に記載される分子）である。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞、例えばＨＳＰＣは、例
えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させるステップの前に、約
１時間～約１５日の期間、例えば約１２時間～約１２日の期間、例えば約１２時間～４日
の期間、例えば約１日～約４日の期間、例えば約１日～約２日の期間、例えば約１日の期
間または約２日の期間にわたってエキソビボで培養される。実施形態において、前記接触
させるステップの前の前記培養は、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるもの、例
えば化合物４、例えば約０．２５μＭ～約１μＭの濃度の化合物４、例えば約０．７５～
０．５マイクロモル濃度の化合物４を含む組成物（例えば、細胞培養培地）中における培
養である。実施形態において、細胞は、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステ
ムと細胞を接触させるステップの後、例えば、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載され
るもの、例えば化合物４、例えば約０．２５μＭ～約１μＭの濃度の化合物４、例えば約
０．７５～０．５マイクロモル濃度の化合物４を含む細胞培養培地中で約１日以下、例え
ば、約１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、
４、３、２、または１時間以下の期間にわたってエキソビボで培養される。他の実施形態
において、細胞は、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させ
るステップの後、細胞培養培地中、例えば、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載される
もの、例えば化合物４、例えば約０．２５μＭ～約１μＭの濃度の化合物４、例えば約０
．７５～０．５マイクロモル濃度の化合物４を含む細胞培養培地中で約１時間～約１５日
の期間、例えば約１２時間～約１０日の期間、例えば約１日～約１０日の期間、例えば約
１日～約５日の期間、例えば約１日～約４日の期間、例えば約２日～約４日の期間、例え
ば約２日、約３日または約４日の期間にわたってエキソビボで培養される。実施形態にお
いて、細胞は、約１時間～約２０日の期間、例えば約６～１２日の期間、例えば約６、約
７、約８、約９、約１０、約１１、または約１２日の期間にわたってエキソビボで培養さ
れる（例えば、前記接触させるステップの前に培養される、および／または前記接触させ
るステップの後に培養される）。
実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当た
り少なくとも約１００万個の細胞（例えば、少なくとも約１００万個のＣＤ３４＋細胞）
を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋ
ｇ当たり少なくとも約２００万個の細胞（例えば、少なくとも約２００万個のＣＤ３４＋
細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は
、１ｋｇ当たり少なくとも約３００万個の細胞（例えば、少なくとも約３００万個のＣＤ
３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の
集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約４００万個の細胞（例えば、少なくとも約４００万個
のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む
細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約５００万個の細胞（例えば、少なくとも約５０
０万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣ
を含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約６００万個の細胞（例えば、少なくとも
約６００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾Ｈ
ＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも１００万個の細胞（例えば、少なく
とも１００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾
ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも２００万個の細胞（例えば、少な
くとも２００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修
飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも３００万個の細胞（例えば、少
なくとも３００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される
修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも４００万個の細胞（例えば、
少なくとも４００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻され
る修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも５００万個の細胞（例えば
、少なくとも５００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻さ
れる修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも６００万個の細胞（例え
ば、少なくとも６００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻
される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約１００万個の細胞（例えば、約
１００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳ
ＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約２００万個の細胞（例えば、約２００万個のＣ
Ｄ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞
の集団は、１ｋｇ当たり約３００万個の細胞（例えば、約３００万個のＣＤ３４＋細胞）
を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋ
ｇ当たり約４００万個の細胞（例えば、約４００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形
態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約５０
０万個の細胞（例えば、約５００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺
乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約６００万個の細胞（
例えば、約６００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻され
る修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、患者の体重１ｋｇ当たり約２×１０６個の細胞を含
む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、患者の体
重１ｋｇ当たり少なくとも２×１０６個の細胞を含む。
実施形態において、上記に記載される方法のいずれによっても、例えば、哺乳動物への
細胞の再導入から少なくとも１５日後、例えば、少なくとも２０、少なくとも３０、少な
くとも４０、少なくとも５０または少なくとも６０日後に計測したとき、患者が有するそ
の循環ＣＤ３４＋細胞の少なくとも８０％が、本方法で使用されるｇＲＮＡ分子の標的化
ドメインと相補的なゲノム部位にまたはその近傍にインデルを含むことになる。
実施形態において、上記に記載される方法のいずれによっても、例えば、哺乳動物への
細胞の再導入から少なくとも１５日後、例えば、少なくとも２０、少なくとも３０、少な
くとも４０、少なくとも５０または少なくとも６０日後に計測したとき、患者が有するそ
の骨髄ＣＤ３４＋細胞の少なくとも２０％が、本方法で使用されるｇＲＮＡ分子の標的化
ドメインと相補的なゲノム部位にまたはその近傍にインデルを含むことになる。
実施形態において、哺乳動物に再導入されるＨＳＰＣは、インビボで赤血球系統の細胞
、例えば赤血球細胞に分化可能であり、および前記分化細胞は、胎児ヘモグロビンの増加
したレベルを呈し、例えば、１細胞当たり少なくとも６ピコグラムの胎児ヘモグロビン、
例えば、１細胞当たり少なくとも７ピコグラムの胎児ヘモグロビン、１細胞当たり少なく
とも８ピコグラムの胎児ヘモグロビン、１細胞当たり少なくとも９ピコグラムの胎児ヘモ
グロビン、１細胞当たり少なくとも１０ピコグラムの胎児ヘモグロビン、例えば１細胞当
たり約９～約１０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生して、例えばそれにより哺乳動物
の異常ヘモグロビン症が治療される。
細胞が増加した胎児ヘモグロビンを有すると特徴付けられるとき、それには、その細胞
の子孫、例えば分化した子孫が増加した胎児ヘモグロビンを呈する実施形態が含まれるこ
とは理解されるであろう。例えば、本明細書に記載される方法において、改変または修飾
ＣＤ３４＋細胞（または細胞集団）は増加した胎児ヘモグロビンを発現しないこともある
が、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化すると、細胞は増加した胎児ヘモグロビ
ン、例えば同様の条件下にある非修飾または非改変細胞と比べて増加した胎児ヘモグロビ
ンを発現する。
ＸＩＩ．培養方法および細胞の製造方法
本開示は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子で修飾された、または修飾されることに
なる細胞、例えばＨＳＰＣ、例えば造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞の培養方法を提供
する。
ＤＮＡ修復経路阻害剤
理論によって拘束されるものではないが、特定の標的配列において所与のｇＲＮＡ分子
によって作り出されるインデルのパターンは、細胞内の活性ＤＮＡ修復機構（例えば、非
相同末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合等）の各々の産物であると考えられる。
理論によって拘束されるものではないが、編集しようとする細胞を、所望のインデルを生
じないＤＮＡ修復経路の阻害剤と接触させることにより、特に有利なインデルを選択また
は富化し得ると考えられる。したがって、本発明のｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲシステム
、方法および他の態様は、かかる阻害剤と組み合わせて実施し得る。かかる阻害剤の例と
しては、例えば、国際公開第２０１４／１３０９５５号パンフレット（この内容は、参照
により全体として本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。実施形態にお
いて、阻害剤はＤＮＡＰＫｃ阻害剤、例えばＮＵ７４４１である。
幹細胞増殖剤
一態様において本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子で修飾された、または修
飾されることになる細胞、例えばＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を、薬剤で処理されて
いない細胞と比べて増殖速度の増加、増殖レベルの増加、または生着の増加をもたらす１
つ以上の薬剤と共に培養することに関する。かかる薬剤は、本明細書では幹細胞増殖剤と
称される。
ある態様において、薬剤で処理されていない細胞と比べて増殖速度の増加または増殖レ
ベルの増加をもたらす１つ以上の薬剤、例えば幹細胞増殖剤には、アリール炭化水素受容
体（ＡＨＲ）経路の阻害剤である薬剤が含まれる。態様において、幹細胞増殖剤は、国際
公開第２０１３／１１０１９８号パンフレットに開示される化合物または国際公開第２０
１０／０５９４０１号パンフレットに開示される化合物である（これらの明細書の内容は
全体として参照により援用される）。
一態様において、薬剤で処理されていない細胞と比べて増殖速度の増加または増殖レベ
ルの増加をもたらす１つ以上の薬剤は、例えば国際公開第２０１３／１１０１９８号パン
フレット（この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に開示されるとお
りの、ピリミド［４，５－ｂ］インドール誘導体である。一実施形態において薬剤は化合
物１（（１ｒ，４ｒ）－Ｎ１－（２－ベンジル－７－（２－メチル－２Ｈ－テトラゾール
－５－イル）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－４－イル）シクロヘキサン－
１，４－ジアミン）：
化合物１：

である。
別の態様において、薬剤は化合物２（メチル４－（３－ピペリジン－１－イルプロピル
アミノ）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－７－カルボキシレート）：
化合物２：

である。
別の態様において、薬剤で処理されていない細胞と比べて増殖速度の増加または増殖レ
ベルの増加をもたらす１つ以上の薬剤は、国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレ
ット（この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に開示される薬剤であ
る。
一実施形態において、幹細胞増殖剤は４－（２－（２－（ベンゾ［ｂ］チオフェン－３
－イル）－９－イソプロピル－９Ｈ－プリン－６－イルアミノ）エチル）フェノールであ
り、すなわち、以下の構造を有する国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレットの
実施例１の化合物：
化合物３：

である。
別の態様において、幹細胞増殖剤は化合物４（（Ｓ）－２－（６－（２－（１Ｈ－イン
ドール－３－イル）エチルアミノ）－２－（５－フルオロピリジン－３－イル）－９Ｈ－
プリン－９－イル）プロパン－１－オールであり、すなわち、以下の構造を有する国際公
開第２０１０／０５９４０１号パンフレット）に係る化合物１５７Ｓ：
化合物４：

である。
実施形態においてＨＳＰＣの集団は、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本発明のｇＲＮ
Ａ分子および／またはＣａｓ９分子）を前記ＨＳＰＣに導入する前に、幹細胞増殖剤、例
えば、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、またはこれらの組み合わせ（例えば、
化合物１と化合物４との組み合わせ）に接触させる。実施形態において、ＨＳＰＣの集団
は、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本発明のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子
）を前記ＨＳＰＣに導入した後、幹細胞増殖剤、例えば、化合物１、化合物２、化合物３
、化合物４、またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１と化合物４との組み合わせ）
に接触させる。実施形態において、ＨＳＰＣの集団は、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、
本発明のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子）を前記ＨＳＰＣに導入する前および
導入した後の両方に、幹細胞増殖剤、例えば、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４
、またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１と化合物４との組み合わせ）に接触させ
る。
実施形態において、幹細胞増殖剤は、同じ培地中にあるが幹細胞増殖剤の非存在下であ
るＨＳＰＣと比べてＨＳＰＣの増殖レベルを増加させるのに有効な量で存在する。実施形
態において、幹細胞増殖剤は約０．０１～約１０μＭ、例えば約０．１μＭ～約１μＭの
濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は細胞培養培地中に約１μＭ、約９５
０ｎＭ、約９００ｎＭ、約８５０ｎＭ、約８００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約７００ｎＭ、約
６５０ｎＭ、約６００ｎＭ、約５５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約４５０ｎＭ、約４００ｎＭ
、約３５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１００
ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、または約１０ｎＭの濃度で存在する。実施形態において
、幹細胞増殖剤は約５００ｎＭ～約７５０ｎＭの範囲の濃度で存在する。
実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物４であり、これは細胞培養培地中に約０．０
１～約１０マイクロモル（μＭ）の範囲の濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増
殖剤は化合物４であり、これは細胞培養培地中に約０．１～約１マイクロモル（μＭ）の
範囲の濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物４であり、これは細胞
培養培地中に約０．７５マイクロモル（μＭ）の濃度で存在する。実施形態において、幹
細胞増殖剤は化合物４であり、これは細胞培養培地中に約０．５マイクロモル（μＭ）の
濃度で存在する。前述のいずれの実施形態においても、細胞培養培地は化合物１をさらに
含む。
実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物１と化合物４との混合物である。
実施形態において、本発明の細胞は、ＣＤ３４＋細胞の２～１０，０００倍の増殖、例
えばＣＤ３４＋細胞の２～１０００倍の増殖、例えばＣＤ３４＋細胞の２～１００倍の増
殖、例えばＣＤ３４＋細胞の２０～２００倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたっ
て、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子と接触させる。本明細書に記載される
とおり、１つ以上の幹細胞増殖剤との接触は、細胞を例えば本明細書に記載されるとおり
のＣＲＩＳＰＲシステムに接触させる前、細胞を例えば本明細書に記載されるとおりのＣ
ＲＩＳＰＲシステムに接触させた後、またはこれらの組み合わせであり得る。ある実施形
態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば、前記細胞に導入されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃ
ａｓ９システムのｇＲＮＡの標的化ドメインと相補性を有する標的部位にまたはその近傍
にインデルを含むＣＤ３４＋細胞の少なくとも２倍の増殖を生じさせるのに十分な時間に
わたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子、例えば化合物４に接触させる
。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば、前記細胞に導入されるＣＲ
ＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｇＲＮＡの標的化ドメインと相補性を有する標的部位にま
たはその近傍にインデルを含むＣＤ３４＋細胞の少なくとも４倍の増殖を生じさせるのに
十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子、例えば化合物４
に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば、前記細胞に導
入されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｇＲＮＡの標的化ドメインと相補性を有する
標的部位にまたはその近傍にインデルを含むＣＤ３４＋細胞の少なくとも５倍の増殖を生
じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子、例
えば化合物４に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少なくと
も１０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹
細胞増殖剤分子に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少なく
とも２０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の
幹細胞増殖剤分子に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少な
くとも３０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上
の幹細胞増殖剤分子に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少
なくとも４０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以
上の幹細胞増殖剤分子に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の
少なくとも５０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ
以上の幹細胞増殖剤分子に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞
の少なくとも６０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１
つ以上の幹細胞増殖剤分子に接触させる。実施形態において、細胞は、約１～６０日、例
えば約１～５０日、例えば約１～４０日、例えば約１～３０日、例えば１～２０日、例え
ば約１～１０日、例えば約７日、例えば約１～５日、例えば約２～５日、例えば約２～４
日、例えば約２日、または例えば約４日の期間にわたって１つ以上の幹細胞増殖剤に接触
させる。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞、例えばＨＳＰＣは、例
えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させるステップの前に、約
１時間～約１０日の期間、例えば約１２時間～約５日の期間、例えば約１２時間～４日の
期間、例えば約１日～約４日の期間、例えば約１日～約２日の期間、例えば約１日の期間
または約２日の期間にわたってエキソビボで培養される。実施形態において、前記接触さ
せるステップの前の前記培養は、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるもの、例え
ば化合物４、例えば約０．２５μＭ～約１μＭの濃度の化合物４、例えば約０．７５～０
．５マイクロモル濃度の化合物４を含む組成物（例えば、細胞培養培地）中における培養
である。実施形態において、細胞は、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステム
と細胞を接触させるステップの後、例えば、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載される
もの、例えば化合物４、例えば約０．２５μＭ～約１μＭの濃度の化合物４、例えば約０
．７５～０．５マイクロモル濃度の化合物４を含む細胞培養培地中で約１日以下、例えば
、約１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４
、３、２、または１時間以下の期間にわたってエキソビボで培養される。他の実施形態に
おいて、細胞は、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させる
ステップの後、細胞培養培地中、例えば、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるも
の、例えば化合物４、例えば約０．２５μＭ～約１μＭの濃度の化合物４、例えば約０．
７５～０．５マイクロモル濃度の化合物４を含む細胞培養培地中で約１時間～約１４日の
期間、例えば約１２時間～約１０日の期間、例えば約１日～約１０日の期間、例えば約１
日～約５日の期間、例えば約１日～約４日の期間、例えば約２日～約４日の期間、例えば
約２日、約３日または約４日の期間にわたってエキソビボで培養される。
実施形態において、細胞培養培地は化学限定培地である。実施形態において、細胞培養
培地は、例えばＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ；カタログ番号０９６５０）をさらに含有し得る。実施形態において、細胞培養培地
は、それに代えてまたは加えて、例えば、ＨＳＣ Ｂｒｅｗ、ＧＭＰ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
）を含有し得る。実施形態において、培地には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒトＦｌ
ｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、ヒトインターロイキン－６
、Ｌ－グルタミン、および／またはペニシリン／ストレプトマイシンが補足され得る。実
施形態において、培地には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌ
ｔ－３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、ヒトインターロイキン－６、およびＬ－グルタ
ミンが補足される。他の実施形態において、培地には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒ
トＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびヒトインター
ロイキン－６が補足される。他の実施形態において、培地には、トロンボポエチン（ＴＰ
Ｏ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）が補足
されるが、ヒトインターロイキン－６は補足されない。培地中に存在するとき、トロンボ
ポエチン（ＴＰＯ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ
）、ヒトインターロイキン－６、および／またはＬ－グルタミンは、それぞれ約１ｎｇ／
ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えば約１０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍ
Ｌの範囲の濃度、例えば約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えば約
２５ｎｇ／ｍＬ～約７５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えば約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在
する。実施形態において、補足される成分の各々は同じ濃度である。他の実施形態におい
て、補足される成分の各々は異なる濃度である。ある実施形態において、培地は、Ｓｔｅ
ｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０
９６５０）、５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（Ｔｐｏ）、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｌ
ｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、５０ｎｇ／ｍＬのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、および５
０ｎｇ／ｍＬのヒトインターロイキン－６（ＩＬ－６）を含む。ある実施形態において、
培地は、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；
カタログ番号０９６５０）、５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（Ｔｐｏ）、５０ｎｇ／
ｍＬのヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、および５０ｎｇ／ｍＬのヒト幹細胞因子
（ＳＣＦ）を含み、かつＩＬ－６を含まない。実施形態において、培地は、幹細胞増殖剤
、例えば化合物４、例えば０．７５μＭの濃度の化合物４をさらに含む。実施形態におい
て、培地は、幹細胞増殖剤、例えば化合物４、例えば０．５μＭの濃度の化合物４をさら
に含む。実施形態において、培地は、１％Ｌ－グルタミンおよび２％ペニシリン／ストレ
プトマイシンをさらに含む。実施形態において、細胞培養培地は無血清である。
ＸＩＩ．併用療法
本開示は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、または本明細書に記載されるｇＲＮＡ
分子で修飾された細胞（例えば、造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞）を１つ以上の他の
治療モダリティおよび／または薬剤と併用した使用を企図する。したがって、本明細書に
記載されるｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子で修飾された細胞の使用に加えて、異常ヘモ
グロビン症を治療するための１つ以上の「標準」療法も対象に投与し得る。
異常ヘモグロビン症を治療するための１つ以上の追加的な療法には、例えば、追加的な
幹細胞移植、例えば造血幹細胞移植が含まれ得る。幹細胞移植は同種異系由来または自己
由来であり得る。
異常ヘモグロビン症を治療するための１つ以上の追加的な療法には、例えば、輸血およ
び／または鉄キレート化（例えば、除去）療法が含まれ得る。公知の鉄キレート化剤とし
ては、例えば、デフェロキサミンおよびデフェラシロクスが挙げられる。
異常ヘモグロビン症を治療するための１つ以上の追加的な療法としては、例えば、葉酸
補充、またはヒドロキシウレア（例えば、５－ヒドロキシウレア）を挙げることができる
。異常ヘモグロビン症を治療するための１つ以上の追加的な療法はヒドロキシウレアであ
り得る。実施形態において、ヒドロキシウレアは、例えば１日１０～３５ｍｇ／ｋｇ、例
えば１日１０～２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。実施形態において、ヒドロキシウ
レアは１日１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。実施形態において、ヒドロキシウレアは
１日１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。実施形態において、ヒドロキシウレアは１日２
０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。実施形態において、ヒドロキシウレアは、例えば本明
細書に記載されるとおりの、本発明の細胞（または細胞の集団）、例えばＣＤ３４＋細胞
（または細胞の集団）の前および／または後に投与される。
１つ以上の追加的な療法剤としては、例えば、抗ｐ－セレクチン抗体、例えばＳｅｌＧ
１（Ｓｅｌｅｘｙｓ）を挙げることができる。Ｐ－セレクチン抗体については、例えば、
国際公開第１９９３／０２１９５６号パンフレット、国際公開第１９９５／０３４３２４
号パンフレット、国際公開第２００５／１００４０２号パンフレット、国際公開第２００
８／０６９９９９号パンフレット、米国特許出願公開第２０１１／０２９３６１７号明細
書、米国特許第５８００８１５号明細書、米国特許第６６６７０３６号明細書、米国特許
第８９４５５６５号明細書、米国特許第８３７７４４０号明細書および米国特許第９０６
８００１号明細書（これらの各々の内容は全体として本明細書に援用される）に記載され
ている。
１つ以上の追加的な薬剤としては、例えば、胎児ヘモグロビンを上方制御する小分子を
挙げることができる。かかる分子の例としては、ＴＮ１（例えば、Ｎａｍ，Ｔ．ｅｔ ａ
ｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ ２０１１，６，７７７－７８０，ＤＯＩ：１０．１００
２／ｃｍｄｃ．２０１０００５０５（本明細書において参照により援用される）に記載さ
れるとおり）が挙げられる。
１つ以上の追加的な療法としては、照射または当該技術分野において公知の他の骨髄ア
ブレーション療法も挙げることができる。かかる療法の例はブスルファンである。かかる
追加的な療法は、本発明の細胞を対象に導入する前に実施され得る。ある実施形態におい
て、本明細書に記載される治療方法（例えば、本明細書に記載される方法によって修飾さ
れた（例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムで例えばＨｂＦ産生が増加す
るように修飾された）細胞（例えば、ＨＳＰＣ）の投与を含む治療方法）であり、本方法
は、骨髄アブレーションステップを含まない。実施形態において、本方法は部分的骨髄ア
ブレーションステップを含む。
本明細書に記載される療法（例えば、ＨＳＰＣ、例えば、本明細書に記載されるＣＲＩ
ＳＰＲシステムを用いて修飾されたＨＳＰＣの集団を投与することを含む）は、追加的な
療法剤と併用することもできる。ある実施形態において、追加的な療法剤はＨＤＡＣ阻害
薬、例えばパノビノスタットである。ある実施形態において、追加的な療法薬は、国際公
開第２０１４／１５０２５６号パンフレットに記載される化合物、例えば、国際公開第２
０１４／１５０２５６号パンフレットの表１に記載される化合物、例えばＧＢＴ４４０で
ある。ＨＤＡＣ阻害薬の他の例としては、例えばスベロイルアニリドヒドロキサム酸（Ｓ
ＡＨＡ）が挙げられる。１つ以上の追加的な薬剤としては、例えばＤＮＡメチル化阻害薬
を挙げることができる。かかる薬剤は、ＢＣＬ１１ａ活性が低下した細胞におけるＨｂＦ
誘導を増加させることが示されている（例えば、Ｊｉａｎ Ｘｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ３３４，９９３（２０１１）；ＤＯＩ：０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２１
１０５３（本明細書において参照により援用される））。他のＨＤＡＣ阻害薬としては、
当該技術分野において公知の任意のＨＤＡＣ阻害薬、例えば、トリコスタチンＡ、ＨＣ毒
素、ＤＡＣＩ－２、ＦＫ２２８、ＤＡＣＩ－１４、デピュディシン（ｄｅｐｕｄｉｃｉｎ
）、ＤＡＣＩ－１６、チュバシン（ｔｕｂａｃｉｎ）、ＮＫ５７、ＭＡＺ１５３６、ＮＫ
１２５、スクリプタイド、ピロキサミド、ＭＳ－２７５、ＩＴＦ－２３５７、ＭＣＧ－Ｄ
０１０３、ＣＲＡ－０２４７８１、ＣＩ－９９４、およびＬＢＨ５８９が挙げられる（例
えば、Ｂｒａｄｎｅｒ ＪＥ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１０（ｖｏｌ．１０７：２
８），１２６１７－１２６２２（本明細書において全体として参照により援用される）を
参照されたい）。
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、または本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子で修飾
された細胞（例えば、造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞）と、共療法剤または共療法と
は、同じ製剤でまたは別個に投与することができる。別個に投与する場合、本明細書に記
載されるｇＲＮＡ分子、または本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子で修飾された細胞は、
共療法薬または共療法の前、その後、またはそれと同時に投与することができる。一方の
薬剤が他方の薬剤の投与に数分間～数週間の範囲にわたる間隔で先行または後続してもよ
い。２つ以上の異なる種類の療法剤が別個に対象に適用される実施形態では、概して各送
達時点間に著しく長い期間が経過しないことが確実にされ、したがってこれらの異なる種
類の薬剤はなおも有利には標的組織または細胞に併用効果を発揮し得る。
ＸＩＩＩ．修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは核酸、例えば、特にｇＲＮＡに存在し、し
かし他の形態のＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはｓｉＲＮＡにも存在し得る
。本明細書に記載されるとおり「ヌクレオシド」は、五炭糖分子（ペントースまたはリボ
ース）またはその誘導体、および有機塩基、プリンまたはピリミジンまたはその誘導体を
含有する化合物として定義される。本明細書に記載されるとおり、「ヌクレオチド」は、
リン酸基をさらに含むヌクレオシドとして定義される。
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の１つ以上を含み得る：
（ｉ）非連結リン酸酸素の一方または両方、および／またはリン酸ジエステル骨格連結に
おける連結リン酸酸素の１つ以上の改変、例えば置換；
（ｉｉ）リボース糖の構成要素、例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの改変、例えば
置換；
（ｉｉｉ）「デホスホ」リンカーによるリン酸部分のホールセール置換；
（ｉｖ）非カノニカル核酸塩基によるものを含めた、天然に存在する核酸塩基の修飾また
は置換；
（ｖ）リボース－リン酸骨格の置換または修飾；
（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の
除去、修飾もしくは置換、または部分、キャップもしくはリンカーのコンジュゲーション
；および
（ｖｉｉ）糖の修飾または置換。
上記に列挙する修飾を組み合わせて、２、３、４個、またはそれを超える修飾を有し得
る修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドを提供することができる。例えば、修飾ヌクレオ
シドまたはヌクレオチドは修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。ある実施形態において
、ｇＲＮＡのあらゆる塩基が修飾され、例えば、全ての塩基が修飾リン酸基を有し、例え
ば、全てがホスホロチオエート基である。ある実施形態において、単分子またはモジュラ
ーｇＲＮＡ分子のリン酸基の全て、または実質的に全てがホスホロチオエート基に置換さ
れている。実施形態において、ｇＲＮＡの５つの３’末端塩基の１つ以上および／または
５つの５’末端塩基の１つ以上がホスホロチオエート基で修飾されている。
ある実施形態において、修飾ヌクレオチド、例えば本明細書に記載されるとおりの修飾
を有するヌクレオチドは、核酸、例えば「修飾核酸」に取り込まれ得る。一部の実施形態
において、修飾核酸は、１、２、３個またはそれを超える修飾ヌクレオチドを含む。一部
の実施形態において、修飾核酸中の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、
少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、
少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、
少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、
少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、
少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）が修飾ヌクレオチドであ
る。
非修飾核酸は、例えば細胞ヌクレアーゼによる分解を受け易いものであり得る。例えば
、ヌクレアーゼは核酸リン酸ジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様にお
いて、本明細書に記載される修飾核酸は１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド
を含有し、それにより例えばヌクレアーゼに対する安定性を導入し得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド
、および修飾核酸は、インビボおよびエキソビボの両方で、細胞の集団に導入されたとき
に自然免疫応答の低下を呈し得る。用語「自然免疫応答」には、サイトカインの発現およ
び放出、特にインターフェロンの誘導、および細胞死に関わる、概してウイルスまたは細
菌起源の、一本鎖核酸を含めた外因性核酸に対する細胞応答が含まれる。一部の実施形態
において、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸
は、核酸との主溝相互作用パートナーの結合を破壊し得る。一部の実施形態において、本
明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、インビボ
およびエキソビボの両方で、細胞の集団に導入されたときに自然免疫応答の低下を呈し、
また核酸との主溝相互作用パートナーの結合も破壊し得る。
化学基の定義
本明細書で使用されるとき、「アルキル」とは、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素基
を指すことが意図される。例示的なアルキル基としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ
）、プロピル（例えば、ｎ－プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ－ブチ
ル、イソブチル、ｔ－ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオ
ペンチル）などが挙げられる。アルキル基は、１～約２０、２～約２０、１～約１２、１
～約８、１～約６、１～約４、または１～約３個の炭素原子を含有し得る。
本明細書で使用されるとき、「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、アントラ
セニル、フェナントレニル、インダニル、インデニルなど、単環式または多環式（例えば
、２、３または４個の縮合環を有する）芳香族炭化水素を指す。一部の実施形態において
、アリール基は６～約２０個の炭素原子を有する。
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する
脂肪族基を指す。本明細書で使用されるとき、「アルキニル」は、２～１２個の炭素原子
を含有し、かつ１つ以上の三重結合を有することを特徴とする直鎖状または分枝状炭化水
素鎖を指す。例示的なアルキニル基としては、限定はされないが、エチニル、プロパルギ
ル、および３－ヘキシニルが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「アリールアルキル」または「アラルキル」は、アルキル
水素原子がアリール基に置換されているアルキル部分を指す。アラルキルは、２つ以上の
水素原子がアリール基に置換されている基を含む。「アリールアルキル」または「アラル
キル」の例としては、ベンジル、２－フェニルエチル、３－フェニルプロピル、９－フル
オレニル、ベンズヒドリル、およびトリチル基が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「シクロアルキル」は、３～１２個の炭素を有する環式、
二環式、三環式、または多環式非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例とし
ては、限定はされないが、シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙
げられる。
本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクリル」は、複素環系の一価ラジカルを指す。
代表的なヘテロシクリルとしては、限定なしに、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチ
エニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオ
キサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、およびモル
ホリニルが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール」は、ヘテロ芳香環系の一価ラジカルを
指す。ヘテロアリール部分の例としては、限定はされないが、イミダゾリル、オキサゾリ
ル、チアゾリル、トリアゾリル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニル、ピラ
ゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリ
ニル、ナフチリジニル、キノリル、およびプテリジニルが挙げられる。
リン酸骨格修飾
リン酸基
一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドのリン酸基が、酸素の１つ以上を異なる置
換基に置換することによって修飾されてもよい。さらに、修飾ヌクレオチド、例えば修飾
核酸に存在する修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるとおりの修飾リン酸による非
修飾リン酸部分のホールセール置換を含み得る。一部の実施形態において、リン酸骨格の
修飾は、非荷電リンカーまたは非対称電荷分布の荷電リンカーのいずれかをもたらす改変
を含み得る。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート類、ボラノホス
フェート類、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート類、ホスホロアミデート類、アル
キルまたはアリールホスホネート類およびリン酸トリエステル類が挙げられる。一部の実
施形態において、リン酸骨格部分における非架橋リン酸酸素原子の１つが以下の基：硫黄
（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ３（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリー
ルであり得る）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（式中、Ｒは
、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、またはＯＲ（式中、Ｒは、例
えばアルキルまたはアリールであり得る）のいずれかに置換されてもよい。非修飾リン酸
基のリン原子はアキラルである。しかしながら、非架橋酸素の１つを上記の原子または原
子団の１つに置換すると、リン原子をキラルにすることができる。すなわち、このように
修飾されたリン酸基のリン原子はステレオジェン中心である。ステレオジェニックなリン
原子は「Ｒ」配置（本明細書ではＲｐ）または「Ｓ」配置（本明細書ではＳｐ）のいずれ
かを有し得る。
ホスホロジチオエート類では両方の非架橋酸素が硫黄によって置換される。ホスホロジ
チオエート類のリン中心はアキラルであり、これがオリゴリボヌクレオチドジアステレオ
マーの形成を妨げる。一部の実施形態において、一方または両方の非架橋酸素に対する修
飾は、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、およびＯＲ（Ｒは、例えばアルキルまたはアリールで
あり得る）から独立して選択される基による非架橋酸素の置換も含み得る。
リン酸リンカーは、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）を窒
素（架橋ホスホロアミデート類）、硫黄（架橋ホスホロチオエート類）および炭素（架橋
メチレンホスホネート類）で置換することによっても修飾し得る。この置換は、連結酸素
のいずれか、または連結酸素の両方に行うことができる。
リン酸基の置換
リン酸基は非リン含有連結基によって置換することができる。一部の実施形態において
、荷電リン酸基が中性部分によって置換されてもよい。
リン酸基を置換することのできる部分の例としては、限定なしに、例えば、メチルホス
ホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバ
メート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンア
ミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレン
メチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチ
ルイミノを挙げることができる。
リボリン酸骨格の置換
核酸を模倣することのできる足場も構築することができ、ここで、リン酸リンカーおよ
びリボース糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートに置換され
る。一部の実施形態において、核酸塩基はサロゲート骨格によってテザー係留することが
できる。例としては、限定なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジンおよびペプチ
ド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートを挙げることができる。
糖修飾
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖基に１つ以上の修飾を含み得る。例え
ば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）が幾つもの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基
によって修飾または置換されてもよい。一部の実施形態において、２’ヒドロキシル基に
対する修飾は、ヒドロキシルが脱プロトン化して２’－アルコキシドイオンを形成するこ
とがもはやできないため、核酸の安定性を増進し得る。２’－アルコキシドは、リンカー
リン原子に対する分子内求核攻撃による分解を触媒し得る。
「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ
（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、
ヘテロアリールまたは糖であってよい）；ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）、Ｏ（Ｃ
Ｈ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意選択で置換され
ていてもよいアルキルであってよく、およびｎは、０～２０（例えば、０～４、０～８、
０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８
、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、および４～２０）の整
数であってよい）を挙げることができる。一部の実施形態において、「オキシ」－２’ヒ
ドロキシル基修飾としては、２’ヒドロキシルが例えばＣ１～６アルキレンまたはＣ１～
６ヘテロアルキレン架橋によって同じリボース糖の４’炭素に結合されていてもよい「ロ
ックド」核酸（ＬＮＡ）を挙げることができ、ここで、例示的架橋としては、メチレン、
プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ－アミノ（ここで、アミノは、例えば、Ｎ
Ｈ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリー
ルアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、
またはポリアミノであってよい）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ－アミノ（こ
こで、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル
、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリール
アミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであってよい）を挙げることができる。一
部の実施形態において、「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾としては、メトキシエチル
基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えばＰＥＧ誘導体）を挙げることができる。
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわちデオキシリボース糖、例えば部分的ｄｓＲ
ＮＡのオーバーハング部分におけるもの）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、
またはヨード）；アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアル
キルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミ
ノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であってよい）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ
）ｎＣＨ２ＣＨ２－アミノ（ここで、アミノは、例えば本明細書に記載されるとおりであ
ってよい）、－ＮＨＣ（０）Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリ
ール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であってよい）、シアノ；メルカプト；アル
キル－チオ－アルキル；チオアルコキシ；およびアルキル、シクロアルキル、アリール、
アルケニルおよびアルキニル（これらは任意選択で、例えば本明細書に記載されるとおり
のアミノによって置換されていてもよい）を挙げることができる。
糖基は、リボースの対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素も含有
し得る。したがって、修飾核酸は、例えばアラビノースを糖として含有するヌクレオチド
を含み得る。ヌクレオチド「単量体」は、糖上のγ位にα結合、例えばα－ヌクレオシド
を有し得る。修飾核酸は、Ｃ－に核酸塩基を欠く「脱塩基」糖も含み得る。これらの脱塩
基糖はまた、構成糖原子の１つ以上でさらに修飾されてもよい。修飾核酸は、Ｌ型の１つ
以上の糖、例えばＬ－ヌクレオシドも含み得る。
概して、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖基リボースを含む。例示的修飾ヌクレ
オシドおよび修飾ヌクレオチドは、限定なしに、リボースの酸素の（例えば、硫黄（Ｓ）
、セレン（Ｓｅ）、または例えばメチレンもしくはエチレンなどのアルキレンによる）置
換；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置
換する）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成す
る）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニト
ール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびホスホルアミデート骨格も有するモ
ルホリノなど、追加の炭素またはヘテロ原子を有する６員または７員環を例えば形成する
）を含み得る。一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、多環型（例えば、トリシ
クロ；および「アンロックド」型、例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ－Ｇ
ＮＡまたはＳ－ＧＮＡ（リン酸ジエステル結合に付加されたグリコール単位によってリボ
ースが置換されている）、トレオース核酸（ＴＮＡ、ａ－Ｌ－トレオフラノシル－（３’
－→２’）によってリボースが置換されている））を含み得る。
核酸塩基に対する修飾
修飾核酸に組み込むことのできる本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌ
クレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、限定はされないが、ア
デニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。
これらの核酸塩基を修飾し、または完全に置換して、修飾核酸に組み込むことのできる修
飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供することができる。ヌクレオチドの核酸塩
基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジン類似体から独立して選択することが
できる。一部の実施形態において、核酸塩基は、例えば、塩基の天然に存在するおよび合
成の誘導体を含み得る。
ウラシル
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する
例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、プソイドウリジン（ψ）、ピ
リジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チ
オ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ４Ｕ
）、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシ－ウリ
ジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば、５－ヨ
ード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、３－メチル－ウリジン（ｍ３Ｕ）、５－
メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５
－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ
５Ｕ）、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－
ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（
ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキ
シカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－
チオ－ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、
５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメ
チル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン
（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－
カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピ
ニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（
ｔｃｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ
－ウリジン（ｔｒｎ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－プソイドウリジン、５
－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有する）、１－メチ
ル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１
－メチル－４－チオ－プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４－チオ－１－メチル－プソイ
ドウリジン、３－メチル－プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２－チオ－１－メチル－プソイ
ドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－
デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，
６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロ
ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキ
シ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－
プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキ
シプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシ
プロピルプソイドウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ
）、５－（イソペンテニルアミノメチル］））－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）
、ａ－チオ－ウリジン、２’－０－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－０－ジメチル
－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－０－メチル－プソイドウリジン（ψｍ）、２－チオ－２
’－０－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－０－メ
チル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－０－メチル－ウリジ
ン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－０－メチル－ウリジン
（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－０－ジメチル－ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペン
テニルアミノメチル）－２’－０－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウリ
ジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－ａｒａ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－Ｏ
Ｈ－ａｒａ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、５－［３－（１－
Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン類、キサンチン、
およびヒポキサンチンが挙げられる。
シトシン
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾シトシンである。修飾シトシンを有する
例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、５－アザ－シチジン、６－ア
ザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４－アセチ
ル－シチジン（ａｃｔ）、５－ホルミル－シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４－メチル－シチジン
（ｍ４Ｃ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シチジン（例えば、５－ヨー
ド－シチジン）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－プソイド
イソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン
（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－
チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイ
ドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－ア
ザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ
－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メ
トキシ－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン、リ
シジン（ｋ２Ｃ）、ａ－チオ－シチジン、２’－０－メチル－シチジン（Ｃｍ）、５，２
’－０－ジメチル－シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４－アセチル－２’－０－メチル－シチジ
ン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’－０－ジメチル－シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５－ホルミル－
２’－０－メチル－シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’－０－トリメチル－シチジ
ン（ｍ４ ２Ｃｍ）、１－チオ－シチジン、２’－Ｆ－ａｒａ－シチジン、２’－Ｆ－シチ
ジン、および２’－ＯＨ－ａｒａ－シチジンが挙げられる。
アデニン
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾アデニンである。修飾アデニンを有する
例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、２－アミノ－プリン、２，６
－ジアミノプリン、２－アミノ－６－ハロ－プリン（例えば、２－アミノ－６－クロロ－
プリン）、６－ハロ－プリン（例えば、６－クロロ－プリン）、２－アミノ－６－メチル
－プリン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－ア
デニン、７－デアザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノ－プリン
、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリ
ン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチ
ル－アデノシン（ｍ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ
）、Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン（ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテ
ニル－アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデ
ノシン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）ア
デノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイル－アデノシン（ｇ６Ａ）、
Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニ
ルカルバモイル－アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバ
モイル－アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル－アデノシン（ｍ６ ２Ａ）
、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ
－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６－ア
セチル－アデノシン（ａｃ６Ａ）、７－メチル－アデニン、２－メチルチオ－アデニン、
２－メトキシ－アデニン、ａ－チオ－アデノシン、２’－０－メチル－アデノシン（Ａｍ
）、Ｎ６，２’－０－ジメチル－アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６－メチル－２’－デオキ
シアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’－０－トリメチル－アデノシン（ｍ６ ２Ａｍ）、ｌ，２
’－０－ジメチル－アデノシン（ｍ’Ａｍ）、２’－０－リボシルアデノシン（リン酸）
（Ａｒ（ｐ））、２－アミノ－Ｎ６－メチル－プリン、１－チオ－アデノシン、８－アジ
ド－アデノシン、２’－Ｆ－ａｒａ－アデノシン、２’－Ｆ－アデノシン、２’－ＯＨ－
ａｒａ－アデノシン、およびＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）－アデノ
シンが挙げられる。
グアニン
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾グアニンである。修飾グアニンを有する
例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、イノシン（Ｉ）、１－メチル
－イノシン（ｍ’ｌ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４－デ
メチル－ワイオシン（ｉｍＧ－１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙ
Ｗ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、不
完全修飾型ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７－デアザ－グアノシン、キューオ
シン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル－キューオシン（ｇａｌＱ）
、マンノシル－キューオシン（ｍａｎＱ）、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒ
ｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱｉ）、アーケオシン（
Ｇ＋）、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デ
アザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノ
シン（ｍ７Ｇ）、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチル－イノシン、６－メト
キシ－グアノシン、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２－メチル－グアノシン（ｍ
２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－グアノシン（ｍ２ ２Ｇ）、Ｎ２，７－ジメチル－グアノ
シン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－ジメチル－グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８－
オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メト チオ－グアノシ
ン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシ
ン、ａ－チオ－グアノシン、２’－０－メチル－グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２－メチル－２
’－０－メチル－グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－２’－０－メチル－
グアノシン（ｍ２ ２Ｇｍ）、１－メチル－２’－０－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、
Ｎ２，７－ジメチル－２’－０－メチル－グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’－０－メチ
ル－イノシン（Ｉｍ）、ｌ，２’－０－ジメチル－イノシン（ｍ１Ｉｍ）、０６－フェニ
ル－２’－デオキシイノシン、２’－０－リボシルグアノシン（ホスフェート）（Ｇｒ（
ｐ））、１－チオ－グアノシン、０６－メチル］）－グアノシン、０６－メチル－２’－
デオキシグアノシン、２’－Ｆ－ａｒａ－グアノシン、および２’－Ｆ－グアノシンが挙
げられる。
修飾ｇＲＮＡ
一部の実施形態において、修飾核酸は修飾ｇＲＮＡであり得る。一部の実施形態におい
て、ｇＲＮＡは３’末端で修飾されてもよい。この実施形態において、ｇＲＮＡは３’末
端Ｕリボースで修飾されてもよい。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基をア
ルデヒド基に酸化し、同時にリボース環を開環すると、修飾ヌクレオシド（Ｕは非修飾ま
たは修飾ウリジンであってよい）を得ることができる。
別の実施形態において、３’末端Ｕは２’３’環状リン酸で修飾されてもよい（Ｕは非
修飾または修飾ウリジンであってよい）。一部の実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、例
えば本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの１つ以上を取り入れることにより、分解に
対して安定化させ得る３’ヌクレオチドを含有し得る。この実施形態において、例えばウ
リジンは、修飾ウリジン、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、および５－ブ
ロモウリジンに置換するか、または本明細書に記載される修飾ウリジンのいずれかに置換
することができ、アデノシンおよびグアノシンは、修飾アデノシンおよびグアノシン、例
えば８位の修飾、例えば８－ブロモグアノシンに置換するか、または本明細書に記載され
る修飾アデノシンまたはグアノシンのいずれかに置換することができる。一部の実施形態
において、デアザヌクレオチド、例えば７－デアザ－アデノシンをｇＲＮＡに取り入れる
ことができる。一部の実施形態において、Ｏ－およびＮ－アルキル化ヌクレオチド、例え
ばＮ６－メチルアデノシンをｇＲＮＡに取り入れることができる。一部の実施形態におい
て、糖修飾リボヌクレオチドを取り入れることができ、例えば、ここで、２’ＯＨ基が、
Ｈ、－ＯＲ、－Ｒ（式中、Ｒは、例えば、メチル、アルキル、シクロアルキル、アリール
、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であってよい）、ハロ、－ＳＨ、－ＳＲ（式中、
Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまた
は糖であってよい）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジア
ルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールア
ミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であってよい）；またはシアノ（－ＣＮ
）から選択される基に置換される。一部の実施形態において、リン酸骨格が本明細書に記
載されるとおり、例えばホスホチオエート基で修飾されてもよい。一部の実施形態におい
て、ｇＲＮＡのオーバーハング領域のヌクレオチドが、各々独立して、２－Ｆ ２’－０
－メチル，チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）
、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メ
チルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組み合わせなど、限定はされないが
２’－糖修飾型を含め、修飾型または非修飾型ヌクレオチドであってよい。
ある実施形態において、ＲＮＡ分子、例えばｇＲＮＡ分子の一本鎖オーバーハングにお
けるヌクレオチドの１つ以上または全てがデオキシヌクレオチドである。
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載さ
れるとおりの複数のｇＲＮＡ分子、または本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子
で修飾された１つ以上の細胞を含む細胞（例えば、細胞の集団、例えば、造血幹細胞の、
例えばＣＤ３４＋細胞の集団）を、１つ以上の薬学的または生理学的に許容可能な担体、
希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。かかる組成物は、中性緩衝生理食塩水、リ
ン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキスト
ラン類、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどの
アミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例
えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。本発明の組成物は、一態様では
、静脈内投与用に製剤化される。
本発明の医薬組成物は、治療（または予防）しようとする疾患に適切な方法で投与し得
る。投与の分量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度な
どの要因によって決まることになるが、適切な投薬量は臨床試験によって決定されてもよ
い。
一実施形態において、本医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、マ
ウス抗体、ヒトプール血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地成分、望ましくな
いＣＲＩＳＰＲシステム成分、細菌および真菌からなる群から選択される夾雑物を実質的
に含まず、例えば、検出可能なレベルの夾雑物は存在しない。一実施形態において、細菌
は、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、カン
ジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｏｍｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａ）、およびＡ群化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）
からなる群から選択される少なくとも１つである。
主題組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、植込みまたは移植によるこ
とを含め、任意の好都合な方法で行われてもよい。本明細書に記載される組成物は、患者
に対し、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内（
ｉ．ｖ．）注射により、または腹腔内に投与され得る。一態様において、本発明の組成物
は患者に対して皮内または皮下注射によって投与される。一態様において、本発明の細胞
組成物はｉ．ｖ．注射によって投与される。
患者に投与する上記の治療の投薬量は、治療下の病態および治療の被投与者の詳細な性
質によって異なり得る。ヒト投与についての投薬量のスケーリングは、当該技術分野で認
められている手法に従い実施することができる。
細胞
本発明は、本発明のｇＲＮＡ分子、または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含む細
胞にも関する。
ある態様において本細胞は、本明細書に記載される方法によって作製される細胞である
。
実施形態において、細胞は造血幹細胞（例えば、造血幹細胞・前駆細胞；ＨＳＰＣ）、
例えばＣＤ３４＋幹細胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋幹細
胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ９０－幹細胞である。実施形態に
おいて、細胞はヒト造血幹細胞である。実施形態において、細胞は自己由来である。実施
形態において、細胞は同種異系由来である。
実施形態において、細胞は骨髄、例えば自己由来の骨髄に由来する。実施形態において
、細胞は末梢血、例えば動員末梢血、例えば自己由来の動員末梢血に由来する。動員末梢
血を用いる実施形態において、細胞は、動員剤を投与された患者から単離されたものであ
る。実施形態において、動員剤はＧ－ＣＳＦである。実施形態において、動員剤はＰｌｅ
ｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）である。実施形態において、細胞は臍帯
血、例えば同種異系由来の臍帯血に由来する。
実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。実施形態において、細胞はヒト細胞で
ある。
ある態様において、本発明は、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシス
テムの一部として前記細胞に導入される例えば本明細書に記載されるとおりの１つまたは
複数のｇＲＮＡ分子と相補性を有する核酸配列にまたはその近傍に（例えば、それから２
０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、
５、４、３、２または１ヌクレオチド以内に）修飾または改変、例えばインデルを含む細
胞を提供する。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋細胞である。実施形態において、改
変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、多系統の細胞に分化する能力を維持
しており、例えば、赤血球系統の細胞に分化する能力を維持している。実施形態において
、改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、培養液中、例えば、幹細胞増殖
剤、例えば化合物４を含む培養液中で少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少な
くとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも
１０回またはそれを超える倍加を起こしているか、またはそれを起こす能力がある。実施
形態において、改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、培養液中、例えば
、幹細胞増殖剤分子、例えば本明細書に記載されるとおりのもの、例えば化合物４を含む
培養液中で少なくとも５回、例えば約５回の倍加を起こしているか、またはそれを起こす
能力がある。実施形態において、改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、
同様の非修飾または非改変細胞と比べて胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベルお
よび／またはタンパク質レベル）の増加、例えば胎児ヘモグロビンタンパク質レベルの少
なくとも２０％の増加を呈する、および／またはそれを呈する細胞、例えば赤血球系統の
細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力がある。実施形態において、改変または修飾され
た細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、同様の非修飾または非改変細胞と比べて胎児ヘモグロ
ビンレベル（例えば、発現レベルおよび／またはタンパク質レベル）の増加を呈し、およ
び／またはそれを呈する細胞、例えば赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能
力があり、例えば、少なくとも６ピコグラム、例えば、少なくとも７ピコグラム、少なく
とも８ピコグラム、少なくとも９ピコグラム、または少なくとも１０ピコグラムの胎児ヘ
モグロビンを産生する。実施形態において、改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４
＋細胞は、同様の非修飾または非改変細胞と比べて胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発
現レベルおよび／またはタンパク質レベル）の増加を呈し、および／またはそれを呈する
細胞、例えば赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力があり、例えば、約６
～約１２、約６～約７、約７～約８、約８～約９、約９～約１０、約１０～約１１または
約１１～約１２ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。
ある態様において、本発明は、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシス
テムの一部として前記細胞に導入される例えば本明細書に記載されるとおりの１つまたは
複数のｇＲＮＡ分子と相補性を有する核酸配列にまたはその近傍に（例えば、それから２
０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、
５、４、３、２または１ヌクレオチド以内に）修飾または改変、例えばインデルを有する
細胞を含む細胞の集団を提供する。実施形態において、例えば本発明のｇＲＮＡおよび／
またはＣＲＩＳＰＲシステムの導入後２日目に、例えば本明細書に記載されるとおり例え
ばＮＧＳによって計測したとき、集団の細胞の少なくとも５０％、例えば、少なくとも６
０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％は、修飾または改変
を有する（例えば、少なくとも１つの修飾または改変を有する）。実施形態において、例
えば本発明のｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲシステムの導入後２日目に、例えば本
明細書に記載されるとおり例えばＮＧＳによって計測したとき、集団の細胞の少なくとも
９０％、例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも
９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％ま
たは少なくとも９９％は、修飾または改変を有する（例えば、少なくとも１つの修飾また
は改変を有する）。実施形態において、細胞の集団はＣＤ３４＋細胞を含み、例えば少な
くとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少な
くとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９８％のＣＤ３４＋細胞を含む
。実施形態において、細胞の集団は改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞を
含み、例えば、多系統の細胞を産生する能力、例えばそれに分化する能力を維持しており
、例えば、赤血球系統の細胞を産生する能力、例えばそれに分化する能力を維持している
。実施形態において、細胞の集団、例えばＣＤ３４＋細胞の集団は、培養液中、例えば、
幹細胞増殖剤、例えば化合物４を含む培養液中で少なくとも２、少なくとも３、少なくと
も４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または
少なくとも１０回またはそれを超える集団倍加を起こしているか、またはそれを起こす能
力がある。実施形態において、改変または修飾された細胞の集団、例えばＣＤ３４＋細胞
の集団は、培養液中、例えば、幹細胞増殖剤分子、例えば本明細書に記載されるとおりの
もの、例えば化合物４を含む培養液中で少なくとも５回、例えば約５回の集団倍加を起こ
しているか、またはそれを起こす能力がある。実施形態において、改変または修飾された
細胞、例えばＣＤ３４＋細胞を含む細胞の集団は、同様の非修飾または非改変細胞と比べ
て胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベルおよび／またはタンパク質レベル）の増
加、例えば胎児ヘモグロビンタンパク質レベルの少なくとも２０％の増加を呈する、およ
び／またはそれを呈する細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団、例えば赤血球細胞
の集団に分化する能力がある。実施形態において、改変または修飾された細胞、例えばＣ
Ｄ３４＋細胞を含む細胞の集団は、同様の非修飾または非改変細胞と比べて胎児ヘモグロ
ビンレベル（例えば、発現レベルおよび／またはタンパク質レベル）の増加を呈し、およ
び／またはそれを呈する細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団、例えば赤血球細胞
の集団に分化する能力があり、例えば、１細胞当たり少なくとも６ピコグラム、例えば、
少なくとも７ピコグラム、少なくとも８ピコグラム、少なくとも９ピコグラム、または少
なくとも１０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する細胞を含む。実施形態において、
改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞の集団は、同様の非修飾または非改変
細胞と比べて胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベルおよび／またはタンパク質レ
ベル）の増加を呈し、および／またはそれを呈する細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞
の集団、例えば赤血球細胞の集団に分化する能力があり、例えば、１細胞当たり約６～約
１２、約６～約７、約７～約８、約８～約９、約９～約１０、約１０～約１１または約１
１～約１２ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する細胞を含む。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約
１ｅ３個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の
集団は、少なくとも約１ｅ４個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載
されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ５個の細胞を含む。実施形態において、
例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ６個の細胞を含む
。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約
１ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の
集団は、少なくとも約１ｅ８個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載
されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ９個の細胞を含む。実施形態において、
例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ１０個の細胞を含
む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも
約１ｅ１１個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細
胞の集団は、少なくとも約１ｅ１２個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書
に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少な
くとも約１ｅ１３個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとお
りの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ６個
の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、
それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ６個の細胞を含む。実施
形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者
の体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例え
ば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム
当たり少なくとも約４ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載さ
れるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約
５ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の
集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約６ｅ６個の細胞を含
む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与
する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約７ｅ６個の細胞を含む。実施形態におい
て、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キ
ログラム当たり少なくとも約８ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書
に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少な
くとも約９ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおり
の細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ７個の
細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、そ
れを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ７個の細胞を含む。実施形
態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の
体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば
本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当
たり少なくとも約４ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載され
るとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約５
ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集
団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約６ｅ７個の細胞を含む
。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与す
る患者の体重１キログラム当たり少なくとも約７ｅ７個の細胞を含む。実施形態において
、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キロ
グラム当たり少なくとも約８ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に
記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なく
とも約９ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの
細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ８個の細
胞を含む。前述の実施形態のいずれにおいても、細胞の集団は、少なくとも約５０％（例
えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９
０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％）のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細
胞を含み得る。前述の実施形態のいずれにおいても、細胞の集団は、約６０％のＨＳＰＣ
、例えばＣＤ３４＋細胞を含み得る。ある実施形態において、例えば本明細書に記載され
るとおりの細胞の集団は、約３ｅ７個の細胞を含み、および約２ｅ７個のＨＳＰＣ、例え
ばＣＤ３４＋細胞を含む。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与す
る患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細
胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それ
を投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１．５ｅ６個のＨＳＰＣ、例えば
ＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の
集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ６個のＨＳＰＣ
、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおり
の細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ６個の
ＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載され
るとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約４
ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に
記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なく
とも約５ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本
明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当た
り少なくとも約６ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、
例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログ
ラム当たり少なくとも約７ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態に
おいて、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重
１キログラム当たり少なくとも約８ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実
施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患
者の体重１キログラム当たり少なくとも約９ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を
含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投
与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４
＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、
それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ７個のＨＳＰＣ、例えば
ＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の
集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ７個のＨＳＰＣ
、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおり
の細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約４ｅ７個の
ＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載され
るとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約５
ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に
記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なく
とも約６ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本
明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当た
り少なくとも約７ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、
例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログ
ラム当たり少なくとも約８ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態に
おいて、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重
１キログラム当たり少なくとも約９ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実
施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患
者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を
含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投
与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４
＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、
それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ８個のＨＳＰＣ、例えば
ＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の
集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約４ｅ８個のＨＳＰＣ
、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおり
の細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約５ｅ８個の
ＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与す
る患者の体重１キログラム当たり約１ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する
患者の体重１キログラム当たり約１．５ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む
。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与す
る患者の体重１キログラム当たり約２ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する
患者の体重１キログラム当たり約３ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実
施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患
者の体重１キログラム当たり約４ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施
形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者
の体重１キログラム当たり約５ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形
態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の
体重１キログラム当たり約６ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態
において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体
重１キログラム当たり約７ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態に
おいて、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重
１キログラム当たり約８ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態にお
いて、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１
キログラム当たり約９ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態におい
て、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キ
ログラム当たり約１ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において
、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キロ
グラム当たり約２ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、
例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログ
ラム当たり約３ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例
えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラ
ム当たり約４ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例え
ば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム
当たり約５ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば
本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当
たり約６ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本
明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当た
り約７ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明
細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり
約８ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細
書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約
９ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書
に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約１
ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に
記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約２ｅ
８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記
載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約３ｅ８
個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載
されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約４ｅ８個
のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載さ
れるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約５ｅ８個の
ＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与す
る患者の体重１キログラム当たり約２ｅ６～約１０ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋
細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、そ
れを投与する患者の体重１キログラム当たり２ｅ６～１０ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ
３４＋細胞を含む。
本発明の細胞は、本発明のｇＲＮＡ分子、または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸、
および本発明のＣａｓ９分子、または前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸を含み得る。あ
る実施形態において、本発明の細胞は、本発明のｇＲＮＡ分子と本発明のＣａｓ９分子と
を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含み得る。
本発明の細胞は、好ましくは、本発明のｇＲＮＡ分子を含むように、例えば本明細書に
記載される方法、例えばエレクトロポレーションによってエキソビボで修飾される。
本発明の細胞には、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムの導入によって１つ
以上の遺伝子の発現が改変されている、例えば低下または阻害されている細胞が含まれる
。例えば、本発明の細胞は、非修飾細胞と比べて低下したＢＣＬ１１ａ発現レベルを有し
得る。別の例として、本発明の細胞は、非修飾細胞と比べて増加した胎児ヘモグロビン発
現レベルを有し得る。別の例として、本発明の細胞は、非修飾細胞と比べて低下したβグ
ロビン発現レベルを有し得る。それに代えて、または加えて、本発明の細胞は、非修飾細
胞から分化した細胞と比べて低下したＢＣＬ１１ａ発現レベルを有する別のタイプの細胞
、例えば赤血球を生じ得る、例えばそれに分化し得る。それに代えて、または加えて、本
発明の細胞は、非修飾細胞から分化した細胞と比べて増加した胎児ヘモグロビン発現レベ
ルを有する別のタイプの細胞、例えば赤血球を生じ得る、例えばそれに分化し得る。それ
に代えて、または加えて、本発明の細胞は、非修飾細胞から分化した細胞と比べて低下し
たβグロビン発現レベルを有する別のタイプの細胞、例えば赤血球を生じ得る、例えばそ
れに分化し得る。
本発明の細胞には、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムの導入によって１つ
以上の遺伝子の発現が改変されている、例えば低下または阻害されている細胞が含まれる
。例えば、本発明の細胞は、非修飾細胞と比べて低下したヘモグロビンβ、例えば突然変
異型または野生型ヘモグロビンβの発現レベルを有し得る。別の態様において、本発明は
、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞から誘導された、例え
ばそれから分化した細胞を提供する。かかる態様において、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲ
ＩＳＰＲシステムが導入された細胞は、ヘモグロビンβ、例えば突然変異型または野生型
ヘモグロビンβのレベルの低下を呈しないものであり得るが、前記細胞から誘導された、
例えばそれから分化した細胞は、ヘモグロビンβ、例えば突然変異型または野生型ヘモグ
ロビンβのレベルの低下を呈し得る。実施形態において、誘導、例えば分化は、インビボ
で（例えば、患者の体内で）達成される。実施形態において、本発明のｇＲＮＡを含むＣ
ＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞はＣＤ３４＋細胞であり、それから誘導された、例
えば分化した細胞は赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞である。
本発明の細胞には、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムの導入によって１つ
以上の遺伝子の発現が改変されている、例えば増加しているか、または促進されている細
胞が含まれる。例えば、本発明の細胞は、非修飾細胞と比べて増加した胎児ヘモグロビン
発現レベルを有し得る。別の態様において、本発明は、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳ
ＰＲシステムが導入された細胞から誘導された、例えばそれから分化した細胞を提供する
。かかる態様において、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞
は、胎児ヘモグロビンレベルの増加を呈しないものであり得るが、前記細胞から誘導され
た、例えばそれから分化した細胞は、胎児ヘモグロビンレベルの増加を呈し得る。実施形
態において、誘導、例えば分化は、インビボで（例えば、患者の体内で）達成される。実
施形態において、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞はＣＤ
３４＋細胞であり、それから誘導された、例えば分化した細胞は赤血球系統の細胞、例え
ば赤血球細胞である。
別の態様において、本発明は、細胞に導入される１つまたは複数のｇＲＮＡ分子と相補
性を有する核酸配列に（例えば、その範囲内に）またはその近傍に（例えば、それから２
０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、
５、４、３、２または１ヌクレオチド以内に）インデルを含む細胞に関する。実施形態に
おいて、インデルはフレームシフトインデルである。実施形態において、インデルは、表
１５に挙げられるインデルである。実施形態において、インデルは、表２６、表２７また
は表３７に挙げられるインデルである。実施形態において本発明は、例えば本明細書に記
載されるとおりの細胞の集団に関し、ここで、細胞の集団は、表１５に挙げられるインデ
ルを有する細胞を含む。実施形態において本発明は、例えば本明細書に記載されるとおり
の細胞の集団に関し、ここで、細胞の集団は、表２６、表２７または表３７に挙げられる
インデルを有する細胞を含む。
ある態様において、本発明は、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞に導入される
例えば本明細書に記載されるとおりの１つまたは複数のｇＲＮＡ分子と相補性を有する核
酸配列にまたはその近傍に（例えば、それから２０、１９、１８、１７、１６、１５、１
４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ヌクレオチド以
内に）、例えば本明細書に記載されるとおりのインデル、例えば、図２５、表１５、表２
６、表２７または表３７に記載されるインデルまたはインデルパターンを含む細胞を含む
細胞の集団、例えばＨＳＰＣの集団に関する。実施形態において、インデルはフレームシ
フトインデルである。実施形態において、集団の細胞の２０％～１００％が前記１つまた
は複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の３０％～１００％が前記１つ
または複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の４０％～１００％が前記
１つまたは複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の５０％～１００％が
前記１つまたは複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の６０％～１００
％が前記１つまたは複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の７０％～１
００％が前記１つまたは複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の８０％
～１００％が前記１つまたは複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の９
０％～１００％が前記１つまたは複数のインデルを含む。実施形態において、細胞の集団
は複数の細胞型に分化する能力を保持しており、例えば、赤血球系統の細胞、例えば赤血
球細胞に分化する能力を維持している。実施形態において、編集され、かつ分化した細胞
（例えば、赤血球細胞）は、増殖する能力、例えば、例えば実施例に記載されるとおりの
赤血球系分化培地（ＥＤＭ）中で７日後に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくと
も１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍
、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍またはそれを超えて増殖する
能力、および／または例えば実施例に記載されるとおりの赤血球系分化培地（ＥＤＭ）中
で２１日後に少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５
倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少な
くとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９
０倍、少なくとも９５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１１０倍、少なくとも１２０
倍、少なくとも１３０倍、少なくとも１４０倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００
倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００
倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１００
０倍、少なくとも１１００倍、少なくとも１２００倍、少なくとも１３００倍、少なくと
も１４００倍、少なくとも１５００倍またはそれを超えて増殖する能力を維持している。
ある実施形態において、本発明は、集団の細胞の少なくとも９０％、例えば少なくとも
９５％、例えば少なくとも９８％は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的化ドメイ
ンと相補的な部位にまたはその近傍に、例えば本明細書に記載されるとおりのインデルを
含む細胞、例えばＣＤ３４＋細胞の集団を提供し（理論によって拘束されるものではない
が、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子またはＣＲＩＳＰＲシステムを細胞の集
団に導入すると、前記集団にインデルパターンが生じ、したがってインデルを含む集団の
各細胞が同じインデルを呈しないこともあると考えられる）、ここで、前記細胞は、赤血
球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力を維持している、および／または同様の
非修飾細胞の集団から分化した細胞と比べて、細胞の集団から分化した前記細胞は増加し
た胎児ヘモグロビンレベルを有する（例えば、集団はより高い％Ｆ細胞を有する）。実施
形態において、細胞の集団はエキソビボで、例えば化合物４を含む培養液中で少なくとも
５倍の増殖を起こしている。
実施形態において、インデルは、約５０ヌクレオチド未満、例えば、約４５未満、約４
０未満、約３５未満、約３０未満または約２５未満のヌクレオチドである。実施形態にお
いて、インデルは約２５ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約２０
ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約１５ヌクレオチド未満である
。実施形態において、インデルは約１０ヌクレオチド未満である。実施形態において、イ
ンデルは約９ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約９ヌクレオチド
未満である。実施形態において、インデルは約７ヌクレオチド未満である。実施形態にお
いて、インデルは約６ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約５ヌク
レオチド未満である。実施形態において、インデルは約４ヌクレオチド未満である。実施
形態において、インデルは約３ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは
約２ヌクレオチド未満である。前述の実施形態のいずれにおいても、インデルは少なくと
も１ヌクレオチドである。実施形態において、インデルは１ヌクレオチドである。
ある態様において、本発明は、例えば本明細書に記載されるとおりの、修飾ＨＳＰＣま
たは前記ＨＳＰＣから分化した（例えば、エキソビボでまたは患者の体内で分化した）赤
血球系細胞の集団を提供し、ここで、細胞の少なくとも１５％、少なくとも２０％、少な
くとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４
５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少
なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも
９０％、または少なくとも９５％がＦ細胞である。実施形態において、細胞の集団は、例
えば本明細書に記載されるとおりの１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が細胞に導入されてい
ない同様の細胞の集団と比べてより高い割合のＦ細胞を含有する（またはそれを含有する
赤血球系の集団への例えばインビボでの分化能を有する）。実施形態において、細胞の集
団は、例えば本明細書に記載されるとおりの１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が細胞に導入
されていない同様の細胞の集団と比べてＦ細胞の少なくとも２０％の増加、例えば、少な
くとも２１％の増加、少なくとも２２％の増加、少なくとも２３％の増加、少なくとも２
４％の増加、少なくとも２５％の増加、少なくとも２６％の増加、少なくとも２７％の増
加、少なくとも２８％の増加、または少なくとも２９％の増加を有する（またはそれを有
する赤血球系の集団への例えばインビボでの分化能を有する）。実施形態において、細胞
の集団は、例えば本明細書に記載されるとおりの１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が細胞に
導入されていない同様の細胞の集団と比べてＦ細胞の少なくとも３０％の増加、例えば、
少なくとも３５％の増加、少なくとも４０％の増加、少なくとも４５％の増加、少なくと
も５０％の増加、少なくとも５５％の増加、少なくとも６０％の増加、少なくとも６５％
の増加、少なくとも７０％の増加、少なくとも７５％の増加、少なくとも８０％の増加、
少なくとも８５％の増加、少なくとも９０％の増加または少なくとも９５％の増加を有す
る（またはそれを有する赤血球系の集団への例えばインビボでの分化能を有する）。実施
形態において、細胞の集団は、例えば本明細書に記載されるとおりの１つまたは複数のｇ
ＲＮＡ分子が細胞に導入されていない同様の細胞の集団と比べてＦ細胞の１０～９０％、
２０％～８０％、２０％～７０％、２０％～６０％、２０％～５０％、２０％～４０％、
２０％～３０％、２５％～８０％、２５％～７０％、２５％～６０％、２５％～５０％、
２５％～４０％、２５％～３５％、２５％～３０％、３０％～８０％、３０％～７０％、
３０％～６０％、３０％～５０％、３０％～４０％、または３０％～３５％の増加を有す
る（またはそれを有する赤血球系の集団への例えばインビボでの分化能を有する）。実施
形態において、細胞の集団、例えば本明細書に記載される方法によって作製されるとおり
の細胞の集団は、それを必要としている患者に例えば治療有効量で導入したとき、前記患
者の異常ヘモグロビン症、例えば本明細書に記載されるとおりのもの、例えば鎌状赤血球
症および／またはβサラセミアを治療するのに十分な数の細胞および／または十分な％Ｆ
細胞の増加を含む。実施形態において、Ｆ細胞の増加は、例えば本明細書に記載されると
おりの赤血球系分化アッセイで計測されるとおりである。
本明細書に記載される実施形態および態様のいずれかにおける実施形態を含め、実施形
態において、本発明は、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、方法および／またはＣ
ＲＩＳＰＲシステムのいずれかによって修飾されるとおりの、１細胞当たり少なくとも６
ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生するＦ細胞を含む細胞、例えば細胞の集団に関する
。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当たり少なくとも７ピコグラムの胎児ヘモグロビン
を産生する。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当たり少なくとも８ピコグラムの胎児ヘ
モグロビンを産生する。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当たり少なくとも９ピコグラ
ムの胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当たり少なくとも
１０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当た
り平均６．０～７．０ピコグラム、７．０～８．０、８．０～９．０、９．０～１０．０
、１０．０～１１．０、または１１．０～１２．０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生
する。
前述の実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明の細胞
および／または細胞の集団は、Ｃａｓ９分子をコードする核酸を含まない細胞を含む、例
えばそれからなる。
治療方法
送達タイミング
ある実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓシステムの成分、例えばＣａｓ９
分子成分および／またはｇＲＮＡ分子成分以外の１つ以上の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分
子）が送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓシステムの成分の１つ以
上が送達されるのと同時に送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓシス
テムの成分の１つ以上が送達される前またはその後（例えば、約３０分、１時間、２時間
、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日、３日、１週、２週間、または４週間
未満）に送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓシステムの成分の１つ
以上、例えば、Ｃａｓ９分子成分および／またはｇＲＮＡ分子成分が送達されるのと異な
る手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによ
って送達することができる。例えば、核酸分子はウイルスベクター、例えば組込み欠損レ
ンチウイルスによって送達することができ、かつＣａｓ９分子成分および／またはｇＲＮ
Ａ分子成分はエレクトロポレーションによって送達することができ、これにより例えば、
核酸（例えば、ＤＮＡ）によって引き起こされる毒性を低減することができる。ある実施
形態において、核酸分子は治療用タンパク質、例えば、本明細書に記載されるタンパク質
をコードする。ある実施形態において、核酸分子はＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載
されるＲＮＡ分子をコードする。
成分のバイモーダル送達または差次的送達
Ｃａｓシステムの成分、例えばＣａｓ９分子成分およびｇＲＮＡ分子成分を別々に送達
する、より詳細には成分を異なる様式で送達すると、例えば組織特異性および安全性が改
善されるため、パフォーマンスを増進させることができる。ある実施形態において、Ｃａ
ｓ９分子およびｇＲＮＡ分子は、異なる様式により、または本明細書においてときに差次
的様式と称されるとおり送達される。異なる様式または差次的様式とは、本明細書で使用
されるとき、対象成分分子、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、鋳型核酸、またはペ
イロードに異なる薬力学的または薬物動態学的特性を付与する送達様式を指す。例えば、
送達様式は、例えば、選択されたコンパートメント、組織、または臓器に異なる組織分布
、異なる半減期、または異なる時間分布をもたらし得る。
幾つかの送達様式、例えば、細胞、または細胞の子孫において例えば自己複製または細
胞核酸への挿入によって持続する核酸ベクターによる送達は、成分のより持続的な発現お
よび存在をもたらす。例としては、ウイルス送達、例えばアデノ随伴ウイルスまたはレン
チウイルス送達が挙げられる。
例として、成分、例えばＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子は、身体、または特定のコン
パートメント、組織もしくは臓器における送達された成分がもたらす半減期または持続性
の点で異なる様式によって送達することができる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子
は、かかる様式によって送達することができる。Ｃａｓ９分子成分は、持続性がより低い
、または身体または特定のコンパートメントもしくは組織もしくは臓器へのその曝露量が
より低い様式によって送達することができる。
より一般的には、ある実施形態において、第１の送達様式を用いて第１の成分が送達さ
れ、および第２の送達様式を用いて第２の成分が送達される。第１の送達様式は第１の薬
力学的または薬物動態学的特性を付与する。第１の薬力学的特性は、例えば、身体、コン
パートメント、組織または臓器における成分または成分をコードする核酸の分布、持続性
、または曝露量であり得る。第２の送達様式は第２の薬力学的または薬物動態学的特性を
付与する。第２の薬力学的特性は、例えば、身体、コンパートメント、組織または臓器に
おける成分または成分をコードする核酸の分布、持続性、または曝露量であり得る。
ある実施形態において、第１の薬力学的または薬物動態学的特性、例えば、分布、持続
性または曝露量は、第２の薬力学的または薬物動態学的特性よりも限定的である。
ある実施形態において、第１の送達様式は、薬力学的または薬物動態学的特性、例えば
、分布、持続性または曝露量を最適化する、例えば最小限に抑えるように選択される。
ある実施形態において、第２の送達様式は、薬力学的または薬物動態学的特性、例えば
、分布、持続性または曝露量を最適化する、例えば最大化するように選択される。
ある実施形態において、第１の送達様式は、比較的持続性の高いエレメント、例えば核
酸、例えばプラスミドまたはウイルスベクター、例えばＡＡＶまたはレンチウイルスの使
用を含む。かかるベクターは比較的持続性が高いため、それから転写された産物は比較的
持続性が高いものとなり得る。
ある実施形態において、第２の送達様式は、比較的一過性のエレメント、例えばＲＮＡ
またはタンパク質を含む。
ある実施形態において、第１の成分はｇＲＮＡを含み、および送達様式は比較的持続性
が高く、例えばｇＲＮＡはプラスミドまたはウイルスベクター、例えばＡＡＶまたはレン
チウイルスから転写される。これらの遺伝子の転写は、遺伝子がタンパク質産物をコード
せず、かつｇＲＮＡは単独では作用できないため、生理学的影響がほとんどないものであ
り得る。第２の成分、Ｃａｓ９分子は一過性方式で、例えばｍＲＮＡとして、またはタン
パク質として送達され、完全なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が短期間のみ存在して
活性であることが確実にされる。
さらに、成分を異なる分子型でまたは互いに相補的な異なる送達ベクターによって送達
することにより、安全性および組織特異性を増進させることができる。
差次的送達様式を用いると、パフォーマンス、安全性および有効性を増進させることが
できる。例えば、最終的なオフターゲット修飾の可能性を低下させることができる。免疫
原性成分、例えばＣａｓ９分子を持続性の低い様式で送達すると、細菌由来のＣａｓ酵素
からのペプチドはＭＨＣ分子によって細胞の表面上に提示されるため、免疫原性が低下し
得る。２パート送達システムはこのような欠点を緩和することができる。
差次的送達様式を用いて、異なる、しかしオーバーラップする標的領域に成分を送達す
ることができる。標的領域のオーバーラップ外での活性複合体の形成は最小限に抑えられ
る。したがって、ある実施形態において、第１の成分、例えばｇＲＮＡ分子が、第１の空
間分布、例えば組織分布をもたらす第１の送達様式によって送達される。第２の成分、例
えばＣａｓ９分子が、第２の空間分布、例えば組織分布をもたらす第２の送達様式によっ
て送達される。ある実施形態において、第１の様式は、リポソーム、ナノ粒子、例えばポ
リマーナノ粒子、および核酸、例えばウイルスベクターから選択される第１のエレメント
を含む。第２の様式は、この群から選択される第２のエレメントを含む。ある実施形態に
おいて、第１の送達様式は第１の標的化エレメント、例えば細胞特異的受容体または抗体
を含み、第２の送達様式はそのエレメントを含まない。ある実施形態において、第２の送
達様式は第２の標的化エレメント、例えば第２の細胞特異的受容体または二次抗体を含む
。
Ｃａｓ９分子がウイルス送達ベクター、リポソーム、またはポリマーナノ粒子で送達さ
れるとき、単一組織のみの標的化が所望され得る場合に複数の組織に送達されて治療活性
が生じる可能性がある。２パート送達系はこの難題を解消し、組織特異性を増進させるこ
とができる。ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子が、異なるが重複もある組織向性を有する
別々の送達媒体にパッケージングされる場合、完全に機能性の複合体は、両方のベクター
によって標的化される組織においてのみ形成される。
候補Ｃａｓ分子、例えばＣａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮ
Ａ分子複合体、および候補ＣＲＩＳＰＲシステムは、当該技術分野において公知の方法に
より、または本明細書に記載されるとおり評価することができる。例えば、Ｃａｓ９分子
のエンドヌクレアーゼ活性を評価する例示的方法が、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｌ ａｌ．
，ＳＣＩＥＮＣＥ ２０１２；３３７（６０９６）：８ １６－８２１に記載されている
。
実施例１
ガイド選択および設計
目的の領域内にあるＰＡＭを同定するため、インシリコでヒト参照ゲノムおよびユーザ
ー定義による目的のゲノム領域（例えば、遺伝子、遺伝子のエクソン、非コード調節領域
等）を使用して初期ガイド選択を実施した。同定されたＰＡＭの各々について分析を実施
し、統計が報告された。例えば、本明細書に記載されるとおり、効率および有効性を決定
するための幾つもの方法に基づきｇＲＮＡ分子をさらに選択し、順位付けした。
本実施例全体を通じて、以下の実験では、ｓｇＲＮＡ分子またはｄｇＲＮＡ分子のいず
れかを使用した。特に指示がない限り、ｄｇＲＮＡ分子を使用した場合、ｇＲＮＡは以下
を含む。
ｃｒＲＮＡ：［標的化ドメイン］－［配列番号６６０７］
ｔｒａｃｒ（ｔｒＲＮＡ）：配列番号６６６０
特に指示がない限り、ｓｇＲＮＡ分子を用いる実験では、以下の配列を使用した。
［標的化ドメイン］－［配列番号６６０１］－ＵＵＵＵ
特に指示がない限り、「ＢＣ」と表示されるｓｇＲＮＡ分子を用いる実験では、以下の
配列を使用した。
［標的化ドメイン］－［配列番号６６０４］－ＵＵＵＵ
一次ガイドスクリーニングのためのＨＥＫ－２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞のトランスフェ
クション
標的特異的ｃｒＲＮＡの一次スクリーニングには、Ｃａｓ９ＧＦＰを発現するＨＥＫ２
９３細胞（ＨＥＫ－２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ）のトランスフェクションを用いた。この例
では、例えば本明細書に記載されるとおりのインシリコオフターゲット検出を含む定義さ
れた基準を用いて一次スクリーニング用に標的特異的ｃｒＲＮＡを設計し、選択した。選
択されたｃｒＲＮＡを化学的に合成し、９６ウェルフォーマットで送達した。ＨＥＫ－２
９３－Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞に標的ｃｒＲＮＡをストックｔｒＲＮＡと１：１比でトランス
フェクトした。トランスフェクションは、製造者のプロトコル（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉ
ｎｅ ２０００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従いリポフェクション技術を
用いて媒介した。リポフェクション後２４時間でトランスフェクト細胞を溶解させて、ラ
イセート中でＴ７Ｅ１アッセイおよび／または次世代シーケンシング（ＮＧＳ；以下）に
よって編集（例えば、切断）を検出した。
Ｔ７Ｅ１アッセイ
Ｔ７Ｅ１アッセイを用いて、Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断後の非相同末端結合（ＮＨＥＪ
）によって作り出された挿入、欠失および置換などのゲノムＤＮＡの突然変異イベントを
検出した（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｓ９ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによる
ヒト細胞の標的ゲノムエンジニアリング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎ
ｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃａｓ９ ＲＮＡ－
ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）」．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ．２０１３；３１，２３０－２３２を参照されたい）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって切断の標的となったゲノムＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅し
、９５℃で１０分間変性させて、次に９５℃から２５℃まで０．５℃／秒で降下させるこ
とによりリアニールした。増幅領域内に突然変異が存在した場合、そのＤＮＡを組み合わ
せてヘテロ二重鎖を形成した。次にリアニールしたヘテロ二重鎖をＴ７Ｅ１（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって３７℃で２５分間またはそれを超えて消化した
。Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼはＤＮＡミスマッチ、ヘテロ二重鎖およびニック入りの二
本鎖ＤＮＡを認識して、それらの部位に二本鎖切断を作成する。得られたＤＮＡ断片を、
フラグメントアナライザーを用いて分析し、定量化して切断効率を決定した。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ならびにオンターゲット切断効率およびインデル形成に
関する分析
ゲノムにおける標的位置の編集（例えば、切断）効率を決定するため、ディープシーケ
ンシングを利用して、非相同末端結合によって導入された挿入および欠失の存在を同定し
た。
初めに標的部位に関するＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム範囲をＰＣＲ増幅し
た。製造者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従いさらなるＰＣＲを実施して、シーケ
ンシングに必要な化学基を加えた。次にＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器でアンプリコ
ンをシーケンシングした。次に、低品質スコアを有するものを除去した後、リードをヒト
参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）とアラインメントした。参照ゲノムにマッピングしたリ
ードを含む得られたファイル（ＢＡＭファイル）から、目的の標的領域とオーバーラップ
するリードを選択し、野生型リードの数に対する挿入または欠失を含むリードの数を計算
した。次に編集率パーセンテージを、野生型を含めたリードの総数に対する、挿入または
欠失を有するリードの総数として定義した。編集によって生じた挿入および／または欠失
パターンを決定するため、インデルを含むアラインメントされたリードを選択し、所与の
インデルを含むリードの数を合計した。次にこの情報をリストとして表示すると共に、各
インデルの頻度を表すヒストグラムの形式で視覚化した。
ＲＮＰ作成
Ｃａｓ９タンパク質にｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを加えると活性Ｃａｓ９ リボ核タ
ンパク質複合体（ＲＮＰ）が形成され、これはｃｒＲＮＡによって指定される標的領域へ
の結合および標的ゲノムＤＮＡの特異的切断を媒介する。ｔｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを
Ｃａｓ９に負荷することによってこの複合体を形成した。これはＣａｓ９にコンホメーシ
ョン変化を引き起こし、Ｃａｓ９によるｄｓＤＮＡへの結合および切断が可能になるもの
と考えられる。
ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを別々に９５℃で２分間変性させ、室温に戻した。Ｃａｓ
９タンパク質（１０ｍｇ／ｍｌ）を５×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍ
Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール）に加え、次にそ
こにｔｒＲＮＡおよび様々なｃｒＲＮＡを（別個の反応で）加え、３７℃で１０分間イン
キュベートすると、それにより活性ＲＮＰ複合体が形成された。この複合体をエレクトロ
ポレーションおよび他の方法によってＨＥＫ－２９３およびＣＤ３４＋造血細胞を含めた
多様な細胞に送達した。
ＣＤ３４＋ ＨＳＣへのＲＮＰの送達
ＣＤ３４＋ ＨＳＣにＣａｓ９ ＲＮＰを送達した。
ＣＤ３４＋ ＨＳＣを解凍し、ＩＬ１２、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌおよびペニシリ
ン／ストレプトマイシンを添加したＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地で一晩培養した（約５００，０００細胞／ｍｌ）。約９０
，０００細胞をアリコートに分け、それぞれのＲＮＰ送達反応毎にペレット化した。次に
細胞を６０μｌ Ｐ３ヌクレオフェクション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁し、続いてそ
こに活性ＲＮＰを加えた。次にトリプリケート（２０μＬ／エレクトロポレーション）で
ＨＳＣをエレクトロポレートした（例えば、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのプ
ログラムＣＡ－１３７を使用してヌクレオフェクションした）。エレクトロポレーション
後直ちにＨＳＣにＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地（ＩＬ１２、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ
３Ｌおよびペニシリン／ストレプトマイシン含有）を加え、これを少なくとも２４時間培
養した。次にＨＳＣを回収し、Ｔ７Ｅ１、ＮＧＳ、および／または表面マーカー発現分析
に供した。
ＨＳＣ機能アッセイ
ＣＤ３４＋ ＨＳＣは、フローサイトメトリーまたはインビトロコロニー形成アッセイ
など、既知の技法を用いて幹細胞表現型に関してアッセイし得る。例として、製造者のプ
ロトコルを用いたＭｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４０３４ Ｏｐｔｉｍｕｍキット（ＳｔｅｍＣ
ｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するインビトロコロニー形成アッセイ（ＣＦ
Ｃ）により、細胞をアッセイした。簡潔に言えば、１～１．２５ｍｌ ｍｅｔｈｏｃｕｌ
ｔに≦１００μｌ容積中の５００～２０００個のＣＤ３４＋細胞を加える。この混合物を
４～５秒間激しくボルテックスして完全に混合し、次に室温に少なくとも５分間放置した
。シリンジを使用して１～１．２５ｍｌのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ＋細胞を３５ｍｍディッシ
ュまたは６ウェルプレートのウェルに移した。１２～１４日後に製造者のプロトコルに従
いコロニーの数および形態を評価した。
インビボ異種移植
ＨＳＣは、機能的には、その自己複製能力により、および多系統分化について定義され
る。この機能性はインビボでのみ評価することができる。ヒトＨＳＣ機能を決定する際の
ゴールドスタンダードは、一連の突然変異によって重度免疫不全となり、したがってヒト
細胞のレシピエントとしての役割を果たすことができるＮＯＤ－ＳＣＩＤγマウス（ＮＳ
Ｇ）への異種移植によるものである。編集後のＨＳＣがＮＳＧマウスに移植され、誘導さ
れた編集がＨＳＣ機能に影響しないことを検証し得る。毎月の末梢血分析を用いてヒトキ
メラ状態および系統発達を評価し、２０週後の二次移植を用いて機能性ＨＳＣの存在を確
立し得る。
結果
Ｔ７Ｅ１（「Ｔ７」）および／またはＮＧＳによってアッセイしたときの、本明細書に
記載されるｇＲＮＡ分子（例えば、上記に記載されるとおりのｄｇＲＮＡ分子）を用いた
ＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞における編集の結果は、図１（＋５８ ＢＣＬ１１ａ
エンハンサー領域に対するｇＲＮＡ分子）および図２（＋６２ ＢＣＬ１１ａエンハンサ
ー領域に対するｇＲＮＡ分子）、ならびに以下の表に指示されるとおり要約される。ＣＤ
３４＋ ＨＳＰＣにおける平均編集率は、例えば、以下の表１０（＋５８ ＢＣＬ１１ａ
エンハンサー領域に対するｇＲＮＡ分子）、表１１（＋６２ ＢＣＬ１１ａエンハンサー
領域に対するｇＲＮＡ分子）、表１２Ｂ（＋５５ ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域に対す
るｇＲＮＡ分子）、および表１３（フランス型ＨＰＦＨ領域に対するｇＲＮＡ分子）に報
告される。Ｔ７Ｅ１アッセイ結果を報告する場合、「２」は高効率切断を示し、「１」は
低効率切断を示し、および「０」は切断がないことを示す。一般に、Ｔ７Ｅ１結果は、Ｎ
ＧＳによってアッセイされる定量的切断と相関する。上位１５個のｇＲＮＡ（ＣＤ３４＋
細胞における最も高い％編集率によって順位付けしたとき）を図１１（＋５８ ＢＣＬ１
１ａエンハンサー領域）および図１２（＋６２ ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域）に示す
。
上記の実験後、同じガイドＲＮＡ分子をＨＥＫ－２９３－Ｃａｓ９細胞およびＣＤ３４
＋細胞の両方において、新規に設計したＮＧＳ分析用プライマーの組を用いてトリプリケ
ートで再び試験した。結果は以下の表１２Ｂに報告する。
ＢＣＬ１１ａエンハンサー部位におけるゲノム編集
ＢＣＬ１１ａの＋５８または＋６２赤血球系エンハンサー領域内のゲノムＤＮＡに特異
的な標的化ドメインを含有する合成ｓｇＲＮＡ分子を注文した。図５は、ｓｇＥＨ１～ｓ
ｇＥＨ９と命名した、ｓｇＲＮＡによって標的化されるゲノムＤＮＡを示す。
ｓｇＥＨ１標的化ドメイン（ＣＲ００２７６）：ＡＵＣＡＣＡＵＡＵＡＧＧＣＡＣＣＵ
ＡＵＣ（配列番号２１２）
ｓｇＥＨ２標的化ドメイン（ＣＲ００２７５）：ＣＡＣＡＧＵＡＧＣＵＧＧＵＡＣＣＵ
ＧＡＵ（配列番号２１１）
ｓｇＥＨ８標的化ドメイン（ＣＲ００２７３）：ＣＡＧＧＵＡＣＣＡＧＣＵＡＣＵＧＵ
ＧＵＵ（配列番号２０９）
ｓｇＥＨ９（ＣＲ００２７７）標的化ドメイン：ＵＧＡＵＡＧＧＵＧＣＣＵＡＵＡＵＧ
ＵＧＡ（配列番号２１３）
Ｃａｓ９と予め複合体化したｓｇＥＨ［Ｘ］を含有するＲＮＰをＣＤ３４＋骨髄細胞（
Ｌｏｎｚａに注文した骨髄ＣＤ３４＋細胞、カタログ番号２Ｍ－１０１Ｃ、ロット番号４
６６９７７、３０ｙ、Ｆ、Ｂ（９６．８％））にエレクトロポレーション（ＮＥＯＮエレ
クトロポレーター）を用いて導入した。Ｔ７Ｅ１およびＮＧＳを用いてＣＤ３４＋幹細胞
で切断を決定した。結果は図６Ａ～図６Ｄに要約し、これらの図は、４つの実験（２人の
異なるドナーから２つの実験）にわたる総合的なインデル形成、ならびに上位のインデル
パターンを示す。ｓｇＥＨ１、２および９は、切断を高効率で導く能力があった。
意外にも、異なるドナー由来の細胞を用いる実験を含め、複数の実験にわたってインデ
ルパターンが一定のままであったことが分かった（図６Ａ～図６Ｄを参照されたい）。す
なわち、各ｇＲＮＡが一定のインデル形成パターンをもたらした。同様に欠失も、切断部
位近傍のマイクロホモロジー領域と関係があるように見えた。
この現象をさらに調べるため、ＢＣＬ１１ａ遺伝子座に対するｇＲＮＡを設計し、異な
る生体試料ならびに異なる送達方法、およびｇＲＮＡ足場を用いて試験した。この実験に
は、以下の標的化ドメインを含むｇＲＮＡを使用した。
Ｇ７（ｇ７とも称される）標的化ドメイン：ＧＵＧＣＣＡＧＡＵＧＡＡＣＵＵＣＣＣＡＵ
（例えば、配列番号１１９１の３’２０ｎｔ）
Ｇ８（ｇ８とも称される）標的化ドメイン：ＣＡＣＡＡＡＣＧＧＡＡＡＣＡＡＵＧＣＡＡ
（例えば、配列番号１１８６の３’２０ｎｔ）
最初の実験では、２つの異なる生体試料にわたってｇ７およびｇ８を試験した。図７に
示すとおり、各ｇＲＮＡについて上位３つの最も高頻度に見られるインデルのパターンは
同一であった。次に、Ｇ７およびＧ８標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を異なるｔｒａ
ｃｒＲＮＡ成分で試験した。前の実験では、配列番号６６０１と、続く－ＵＵＵＵをｇＲ
ＮＡ標的化ドメインに直接付加してｓｇＲＮＡを形成した。次の実験セットでは、配列番
号６６０４と、続く－ＵＵＵＵをｇ７およびｇ８のｇＲＮＡ標的化ドメインに直接付加し
て、異なる足場を有するｓｇＲＮＡ分子（ｇ７ＢＣまたはｇ８ＢＣと呼ばれるｇＲＮＡ）
を作った。図８に示すとおり、異なるｓｇＲＮＡ足場を使用した場合でもインデルパター
ンは一定のままであった。最後に、異なる送達方法を用いてインデルパターンを比較した
。ＲＮＰエレクトロポレーションを用いるか、またはｇ７をコードするプラスミドのＬｉ
ｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いた送達によるかのいずれかの２９３細胞へのｇ
７の送達を調べ、結果を図９に報告した。示されるとおり、インデルパターンは同じまま
であった。総合すると、これらの結果は、インデルパターン形成が配列依存的であること
を強く示唆している。切断が大規模欠失および／またはフレームシフト欠失をもたらす場
合の配列を標的とするｇＲＮＡ分子は、機能喪失に有益であり得る。
複数のガイドによる切り出し
上記のＧ７およびｇ８は、近接部位のゲノムＤＮＡを標的とする（ＰＡＭ配列はＢＣＬ
１１ａ遺伝子内で互いから５０ヌクレオチド以内にある）。２つの近接部位を同時に標的
化する効果を調べるため、Ｇ７の標的化ドメインを有するｇＲＮＡを含むＲＮＰならびに
Ｇ８の標的化ドメインを有するｇＲＮＡを含むＲＮＰでＣＤ３４＋細胞をトランスフェク
トした。切断効率およびインデルパターンをＮＧＳによって評価した。図１０に示すとお
り、主要なインデルは、２つのｇＲＮＡ結合部位間のヌクレオチドの欠失である。これら
の結果は、近接して結合する複数の、例えば２つのガイドを使用して、それらの２つの結
合部位間にあるＤＮＡの切り出しを達成し得ることを実証している。
ＣＤ３４＋幹細胞におけるゲノム編集
ＣＤ３４＋初代造血幹細胞でＢＣＬ１１ａ遺伝子座におけるゲノム編集を実証した。簡
潔に言えば、製造者の指示に従い免疫選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて成人ドナー由来
のＧ－ＣＳＦ動員末梢血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）からＣＤ３４＋細胞を単離した。細胞ゲー
ティングは図３に示す。細胞をアリコートに分けて凍結保存した。解凍した細胞を２×１
０５／ｍｌでＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋１×抗生物質
／抗真菌薬＋各５０ｎｇ／ｍｌのサイトカイン（ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ６およびＳＣ
Ｆ）＋５００ｎＭ化合物４に播種し、加湿インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２
で５日間培養した。５日後の細胞濃度は１×１０６／ｍｌであった。
各１５０ｎｇのＣａｓ９（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ ＃２６５４２５－７）およびｓｇＲＮ
Ａ（ＴｒｉＬｉｎｋ、ｓｇＢＣＬ１１Ａ＿７標的化ドメイン（すなわちｇ７の標的化ドメ
イン）：

を含む）からなるプレインキュベートしたＲＮＰ複合体を２×１０５細胞に加え、製造者
のプロトコルに従いＮｅｏｎシステム（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でパルスパ
ラメータ：１６００Ｖ、２０ｍｓ、１パルスを用いてエレクトロポレートした。デュプリ
ケートのエレクトロポレーションを実施した。ＲＮＰ複合体の非存在下でモックエレクト
ロポレーションも実施した。エレクトロポレーション後、細胞を１ｍｌ培地に播種して一
晩回復させた。
エレクトロポレーションの翌日、未選別の培養物の１／２０をＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅ
ｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋１×抗生物質／抗真菌薬＋各５０ｎｇ／ｍｌのＴＰ
Ｏ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＩＬ３およびＧＣＳＦに６日間播種した。残りの細胞
はヒトＣＤ３４およびヒトＣＤ９０に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによっ
てＣＤ３４＋ＣＤ９０＋およびＣＤ３４＋ＣＤ９０－集団を選別した。ＣＤ３４＋ＣＤ９
０＋細胞は、免疫不全マウスにおける長期多系統生着によって定義付けられるとおり、造
血幹細胞を含有することが知られている（Ｍａｊｅｔｉ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｃｅｌ
ｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １，６３５－６４５を参照されたい）。選別用に選択した細胞
集団は、図３の代表的なドットプロットにゲートによって指示する。選別した細胞をＳＦ
ＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋１×抗生物質／抗真菌薬＋各５
０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＩＬ３およびＧＣＳＦで６日間培
養し、６日経った時点でゲノム編集分析のため全ての培養物を回収した。
回収した細胞からゲノムＤＮＡを精製し、以下のプライマー：ＢＣＬ１１Ａ－７ Ｆ、
ｇｃｔｔｇｇｃｔａｃａｇｃａｃｃｔｃｔｇａ；ＢＣＬ１１Ａ－７ Ｒ、ｇｇｃａｔｇｇ
ｇｇｔｔｇａｇａｔｇｔｇｃｔで標的領域を増幅した。ＰＣＲ産物を変性させてリアニー
リングし、続いて製造者の推奨に従いＴ７Ｅ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）と共にインキュベートした。次にこの反応物をアガロースゲル電気泳動によって分析
した（図４）。上側のバンドは切断されていないホモ二重鎖ＤＮＡを表し、下側のバンド
はヘテロ二重鎖ＤＮＡから生じた切断産物を示す。一番左寄りのレーンはＤＮＡラダーで
ある。バンド強度はＩｍａｇｅＪソフトウェアによる未処理画像のピーク積分によって計
算した。％遺伝子修飾（インデル）は以下のとおり計算した：％遺伝子修飾＝１００×（
１－（１－切断割合）１／２）、ゲルの対応する各レーンの下に示す。
結果は図４に示す。造血幹細胞を含有するＣＤ３４＋ＣＤ９０＋集団の遺伝子編集効率
はＣＤ３４＋ＣＤ９０－細胞または未選別と均等であった。これらの実験は、ＨＳＣがさ
らに富化されているＣＤ３４＋ ＨＳＰＣおよびＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞で遺伝子編集
を達成し得ることを実証している。
実施例３．成人赤血球系細胞における胎児グロビン発現の抑制を解除するためのＣＲＩＳ
ＰＲ－Ｃａｓ９を用いた造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）におけるＢＣＬ１１Ａ赤血球
系エンハンサー編集
方法：
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞をＡｌｌＣｅｌｌｓ（カタログ番号
：ＡＢＭ０１７Ｆ）またはＬｏｎｚａ（カタログ番号：２Ｍ－１０１Ｃ）のいずれかから
購入し、５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（Ｔｐｏ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番
号３００－１８）、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ、Ｐｅｐｒｏ
ｔｅｃｈ；カタログ番号３００－１９）、５０ｎｇ／ｍＬのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｐ
ｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号３００－０７）、ヒトインターロイキン－６（ＩＬ－６
、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号２００－０６）、１％Ｌ－グルタミン；２％ペニシ
リン／ストレプトマイシン、および化合物４（０．７５μＭ）を補足したＳｔｅｍＳｐａ
ｎ ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０９６５０
）を用いて２～３日間増殖させた。２～３日間増殖させた後、培養物をＡｌｌＣｅｌｌｓ
から購入した出発細胞数と比べて２倍～３倍およびＬｏｎｚａからのと比べて１倍～１．
５倍に増殖させた。本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの導入
前および導入後の両方を含め、全てのＣＤ３４＋増殖ステップについてこれらの培養条件
を用いた。
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＣ
の調製、およびＨＳＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡリ
ボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）はエレクトロポレーションの直前に調製した。デュアル
ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を用いるＲＮＰの形成については、初めに各３μｇのｃｒＲ
ＮＡ（２．２４μＬ中）およびｔｒａｃｒ（１．２５μＬ中）を別個のチューブにおいて
９５℃で２分間変性させて、次に室温に冷却した。Ｃａｓ９タンパク質の調製のため、７
．３μｇのＣＡＳ９タンパク質（１．２１μＬ中）を０．５２μＬの５×ＣＣＥ緩衝液（
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣＬ、５ｍＭ ＭｇＣＬ２、５％グリセロールお
よび新たに添加した１ｍＭ ＤＴＴ）と混合した。初めにＴｒａｃｒをＣａｓ９調製物と
混合し、３７℃で５分間インキュベートした。次にｃｒＲＮＡをＴｒａｃｒ／ＣＡＳ９複
合体に加え、３７℃で５分間インキュベートした。２００×ｇで１５分間遠心することに
よりＨＳＣを回収し、Ｎｅｏｎエレクトロポレーションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；
カタログ番号：ＭＰＫ１０９６）に付属するＴ緩衝液中に２×１０７／ｍＬの細胞密度で
再懸濁した。ＲＮＰを１２μＬの細胞と上下に３回穏やかにピペッティングすることによ
って混合した。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびＣａｓ９複合体の調製には、
２．２５μｇ ｓｇＲＮＡ（１．５μＬ中）を２．２５μｇ Ｃａｓ９タンパク質（３μ
Ｌ中）と混合し、室温で５分間インキュベートした。次にｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を
１０．５μＬの２×１０７／ｍＬ細胞と上下に数回穏やかにピペッティングすることによ
って混合し、室温で２分間インキュベートした。ＲＮＰ／細胞混合物（１０μＬ）をＮｅ
ｏｎエレクトロポレーションプローブに移した。Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＭＰＫ５０００Ｓ）で１７００ボルト／２０ミリ秒および１パ
ルスを用いてエレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーション後、上記に記
載したとおりの成長因子およびサイトカインを補足した０．５ｍＬの予め温めたＳｔｅｍ
Ｓｐａｎ ＳＦＥＭ培地に細胞を移し、３７℃で２日間培養した。
ゲノムＤＮＡ調製。エレクトロポレーションの４８時間後、編集済みおよび未編集ＨＳ
ＣからゲノムＤＮＡを調製した。１０ｍＭトリス－ＨＣＬ、ｐＨ８．０；０．０５％ＳＤ
Ｓおよび２５μｇ／ｍＬの新たに添加したプロテアーゼＫ中に細胞を溶解させ、３７℃で
１時間インキュベートした後、８５℃で１５分間さらにインキュベートしてプロテアーゼ
Ｋを不活性化した。
Ｔ７Ｅ１アッセイ。ＨＳＣの編集効率を決定するため、Ｔ７Ｅ１およびアッセイを実施
した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙキット
（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号：Ｆ－５４９Ｌ）を以下のサイク
ル条件で用いてＰＣＲを実施した：９８℃で３０秒；９８℃で５秒、６８℃で２０分、７
２℃で３０秒を３５サイクル；７２℃で５分。以下のプライマーを使用した：フォワード
プライマー：５’－ＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＡＣＣＡＣＡＧＧＧ－３’（配列
番号２００１）およびリバースプライマー：５’－ＴＡＣＡＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＴＣＣ
ＡＣＡＣＧＧＣＡ－３’（配列番号２００２）。以下の条件を用いてＰＣＲ産物を変性さ
せてリアニーリングした：９５℃で５分、－２℃／ｓで９５～８５℃、－０．１℃／ｓで
８５～２５℃、４℃で保持。アニーリング後、１０μＬの上記のＰＣＲ産物に１μＬのミ
スマッチ高感受性Ｔ７ Ｅ１ヌクレアーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０３０２Ｌ）を加え
、３７℃で１５分間さらにインキュベートしてヘテロ二重鎖を消化し、得られたＤＮＡ断
片をアガロースゲル（２％）電気泳動によって分析した。編集効率はＩｍａｇｅＪソフト
ウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて定量化し
た。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。編集効率ならびに挿入および欠失（インデル）のパ
ターンをより正確に決定するため、ＰＣＲ産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し
た。Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｔａｑ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ；カタログ番号：６３９２１０）を以下のサイクル条件で使用してＰＣＲをデュプ
リケートで実施した：９８℃で５分；９５℃で１５秒、６８℃で１５秒、７２℃で１分を
３０サイクル；７２℃で７分。以下のプライマーを使用した：フォワードプライマー：５
’－ＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＡＣＣＡＣＡＧＧＧ－３’（配列番号２００１）
およびリバースプライマー：５’－ＴＡＣＡＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＧＣ
Ａ－３’（配列番号２００２）。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動によって分析
し、ディープシーケンシングにかけた。
ＨＳＰＣ培養物のフローサイトメトリー分析。ＨＳＰＣをフローサイトメトリーに供し
て幹細胞および前駆細胞集団を特徴付けた。細胞培養物のアリコートでゲノム編集前およ
び編集後のＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞サブセットのパーセンテージを決定し
た。０．５％ＢＳＡを補足したＰＢＳを含有する染色緩衝液中、抗ＣＤ３４（ＢＤ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５８２４）、抗ＣＤ９０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、
カタログ番号３２８１０９）と共に細胞を暗所下４℃で３０分間インキュベートした。細
胞生存率は７ＡＡＤによって決定する。細胞を染色緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ
（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で多色ＦＡＣＳ分析を実施した。Ｆｌｏｗｊｏを
用いてフローサイトメトリー結果を分析し、データは全細胞集団に対するパーセントＣＤ
３４＋、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋として提示した。培養物中の各細胞型集団の絶対数は、細
胞の総数に各集団のパーセンテージを乗じることにより計算した。
インビトロ赤血球新生およびＨｂＦ含有赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。エレクト
ロポレーションの４８時間後、ゲノム編集したＨＳＣをインビトロ赤血球系分化に供した
。簡潔に言えば、３３０μｇ／ｍＬヒトホロトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番
号Ｔ０６６５）、１０μｇ／ｍＬ組換えヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ３
５３６）、２ＩＵ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ３１４９）、５％ヒト血
漿（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ９５２３）、３ＩＵ／ｍＬヒトエリスロポエチン（Ｒ＆
Ｄ、カタログ番号２８７－ＴＣ）、１％Ｌ－グルタミン、および２％ペニシリン／ストレ
プトマイシンを補足したＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１９８０－０
９７）からなる赤血球系分化培地（ＥＤＭ）中において編集済みＨＳＣを培養した。培養
０～７日目の間、ＥＤＭには、１０－６Ｍヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号
Ｈ０８８８）、１００ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３００
－０７）、および５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００
－０３）を７日間にわたってさらに補足した。培養７～１１日目の間、ＥＤＭには１００
ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦのみを補足した。培養１１～２１日目の間、ＥＤＭに追加の補足
はしない。培養７、１４および２１日目、細胞（２～１０×１０５）をＨｂＦ発現に関し
て細胞内染色によって分析した。簡潔に言えば、３５０×ｇで５分間遠心することによっ
て細胞を回収し、染色緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０２０１）で１回
洗浄した。細胞を０．５ｍＬの固定化緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０
８０１）で固定化し、３５０×ｇで５分間遠心することによって２ｍＬの１×細胞内染色
・透過処理・洗浄緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２１００２）で３回洗浄
した。次に、１００μＬの１×細胞内染色・透過処理・洗浄緩衝液中、細胞を５μＬの抗
ＨｂＦ抗体（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＭＨＦＨ０１）と共に
室温で２０分間インキュベートした。細胞を２ｍＬの１×細胞内染色・透過処理・洗浄緩
衝液で２回洗浄し、２００μＬ染色緩衝液中に再懸濁して、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でＨｂＦ発現に関して分析した。Ｆｌｏｗｊｏを用いて
結果を分析し、データは全細胞集団中のＨｂＦ陽性細胞（Ｆ－細胞）の％として提示した
。
遺伝子発現アッセイ。ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７
４１０４）を使用したＲＮＡの精製に、約１×１０６細胞を使用した。ｑＳｃｒｉｐｔ
ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ、カタログ番号９５０４７－５００）を使用した第１
鎖合成に、２００～４００ｎｇのＲＮＡを使用した。供給者のプロトコルに従いＴａｑ－
Ｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅ ＰＲ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ、カタログ番号４４４４９６３）およびＧＡＰＤＨ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、ＩＤ番号Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１）、ＨｂＢ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ、ＩＤ番号：Ｈｓ００７４７２２３＿ｇ１）、ＨｂＧ２／ＨｂＧ１（Ｌｉｆｅ ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤ番号Ｈｓ００３６１１３１＿ｇ１）およびＢＣＬ１１Ａ（
Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤ番号：Ｈｓ０１０９３１９７＿ｍ１）を使用
してＴａｑ－ｍａｎ ＰＣＲを実施した。各遺伝子の相対発現はＧＡＰＤＨ発現に対して
正規化した。
コロニー形成単位細胞アッセイ。コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイのため、ＳＣＦ
、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、およびエリスロポエチンを含有するＭｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ
４４３４メチルセルロース培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にデュ
プリケートで１．１ｍＬ Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ／３５ｍｍディッシュ当たり３００細胞を
プレーティングした。Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔにペニシリン／ストレプトマイシンを添加した
。培養ディッシュを加湿インキュベーターにおいて３７℃でインキュベートした。プレー
ティング後１４日目に、ＳｔｅｍＶｉｓｉｏｎ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）を使用してプレート全体の画像を撮ることにより、少なくとも３０細胞を含有す
るコロニーをカウントした。次に、コロニーの総数、ＣＦＵ－ＧＥＭＭ（顆粒球、赤血球
、マクロファージ、巨核球）、ＣＦＵ－ＧＭ（顆粒球、マクロファージ）、ＣＦＵ－Ｍ（
マクロファージ）、ＣＦＵ－Ｅ（赤血球）およびＢＦＵ－Ｅ（赤芽球バースト形成細胞）
の数をＳｔｅｍＶｉｓｉｏｎ画像分析ソフトウェアでカウントし、ＳｔｅｍＶｉｓｉｏｎ
コロニーマーカーソフトウェアを使用して手動で確認した。
インビボ生着試験。インビボ生着試験はＩＡＣＵＣの承認を得たプロトコル下で行われ
る。３０，０００出発細胞と均等なゲノム編集済みＨＳＣの最終培養物の一部を亜致死的
に照射された（２００ｃＧＹ）６～８週齢ＮＳＧマウスに尾静脈から静脈内注射する。生
着は照射後２４時間以内に実施する。生着は、抗ヒトＣＤ４５および抗マウスＣＤ４５抗
体を使用した、注射後４、８、および１２週間で採取した血液のフローサイトメトリー分
析によってモニタする。移植後１３週間でマウスを犠牲にし、フローサイトメトリーおよ
びコロニー形成細胞単位アッセイによる分析のため、骨髄、脾臓および胸腺を採取する。
二次生着については、各レシピエントマウスの骨髄の５０％を１匹の亜致死的に照射され
た二次ＮＳＧマウスに移植する。生着は、抗ヒトＣＤ４５および抗マウスＣＤ４５抗体を
用いた汎白血球マーカーＣＤ４５を使用した、注射後４、８、および１２週間で採取した
血液のフローサイトメトリー分析によってモニタする。移植１５週間後、二次マウスから
骨髄および脾臓を摘出し、フローサイトメトリーおよびコロニー形成細胞単位アッセイに
よって分析した。
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＳＣのＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー
を標的化して遺伝子破壊すると、赤血球系細胞系統におけるＢＣＬ１１Ａの発現が選択的
に下方制御され、γ－グロビン発現の抑制が解除されて、ＨｂＦタンパク質の含有量が高
い赤血球細胞であるＦ－細胞の産生が可能になると考えられる。高いＨｂＦは脱酸素化条
件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β－サラセミアおよびＳＣＤの両方の患者に治療効果
／治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受
容体（ＡＨＲ）阻害剤、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この
内容は全体として参照により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と
併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞お
よび組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠
である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ
）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異
的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９－ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に
染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する
。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを
使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化す
る。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより
臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａ
ｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験
概要は図１７に示す。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し
、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）または完全
長シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と複合体化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複
合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのリストおよび配列は、表１４に示す。「材
料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレーションによってＲＮＰ複合体を健常
またはＳＣＤ患者由来の骨髄ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複
合体の送達前に、化合物４を含有するＨＳＣ増殖培地で細胞を２日間にわたって増殖させ
た。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによって送達されたＲＮＰ複合
体の取込みを促進し得る。トランスフェクション過程からの回復を促進するため、化合物
４を含有する変法増殖培地で細胞をさらに２日間培養した。エレクトロポレーション後４
８時間の細胞の生存率を、７ＡＡＤを用いたフローサイトメトリーにより決定した。生存
率は比較的高く、＞８０％の細胞が生存していた（図１８）ことから、文献に報告される
Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ送達システムの他の方法と比べてＨＳＰＣがＲＮＰ複合体のエレ
クトロポレーションに比較的よく耐えたことが示唆される。
Ｔ７Ｅ１アッセイは、ゲノム中の特定の部位における編集を評価する簡便な方法である
。エレクトロポレーションの２日後にＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを抽出した。標的ＢＣＬ
１１Ａ赤血球系エンハンサー領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。
ＰＣＲ産物をＴ７Ｅ１アッセイに供した。Ｔ７Ｅ１アッセイの最終産物を２％アガロース
ゲル電気泳動に供し、編集されたアレルのパーセントをｉｍａｇｅＪ（ｈｔｔｐ：／／ｒ
ｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）によって定量化した。予想ＰＣＲ産物サイズ
およびＴ７Ｅ１消化断片の近似的予想サイズを図１９に示す。総編集頻度はアガロースゲ
ル画像の下に全編集に対するパーセンテージとして示す。ＢＣＬ１１Ａ Ｃａｓ９ ＲＮ
Ｐで処理した細胞ではＢＣＬ１１Ａ遺伝子座におけるゲノム編集が観察されたが、モック
エレクトロポレーション対照細胞では観察されなかった（図１９）。
ＢＣＬ１１Ａの＋５８赤血球系エンハンサー領域のゲノムＰＣＲ産物は、次世代シーケ
ンシング（ＮＧＳ）にも供した。ＮＧＳは多数の試料の同時モニタリングを促進し、アレ
ルの全体像をもたらす。さらに、ＮＧＳは、挿入および欠失（インデル）の不均一性に関
する情報を提供する。配列を対照（モック）処理細胞の配列と比較した。配列解析の結果
から、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって誘導された二本鎖切断がＮＨＥＪによって修復さ
れ、＋５８ ＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー領域に位置するＣａｓ９切断部位の近傍
に様々な頻度の小さい欠失および挿入（インデル）が生じたことが示された（図２０およ
び表１５）。全体的に見て、観察された編集効率は、同じ配列を標的とするｄｇＲＮＡと
比較してｓｇＲＮＡでより高く、１４個中１２個のｓｇＲＮＡが５０％超のアレルに編集
を生じたが（図２０および表１５）、しかしながら（理論によって拘束されるものではな
いが）ｓｇＲＮＡとｄｇＲＮＡとの間の効率の差は、材料の供給源の影響を受けたもので
あり得る。
ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣがゲノム編集を含めたエキソビボ操作後にもエフェクター細胞に
分化するその多系統分化能を保持しているかどうかを決定するため、選択のｇＲＮＡにつ
いてインビトロコロニー形成細胞（ＣＦＣ）単位アッセイを実施した。ゲノム編集済み細
胞をサイトカイン添加メチルセルロース中に懸濁し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃
で１４日間維持した。個別のコロニーが発達し、それらに含まれる成熟細胞の数およびタ
イプに基づき形態学上および表現型上の基準を用いて（ＳＴＥＭｖｉｓｉｏｎ）それらを
分類してカウントし、赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ－Ｅ）、赤芽球バースト形成細胞
（ＢＦＵ－Ｅ）、顆粒球／マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ－ＧＭ）および顆粒
球／赤血球／マクロファージ／巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ－ＧＥＭＭ；図２１）へ
の寄与に関してスコア化した。モックトランスフェクト細胞のコロニー形成能が最も高く
、それにＢＣＬ１１Ａの＋５８赤血球系エンハンサーを標的とするｇＲＮＡが続いた。Ｂ
ＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーを標的とするｇＲＮＡについて同様の数およびタイプの
コロニーが観察された。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするガイドＲＮＡで得られた
コロニーが最小数であった（図２２）。
単系統赤血球系培養物におけるＢＣＬ１１Ａ、γ－およびβ－グロビン鎖の相対ｍＲＮ
Ａ発現レベルをリアルタイムＰＣＲによって定量化した。転写物レベルはヒトＧＡＰＤＨ
転写物レベルに対して正規化した。ゲノム編集済みＨＳＰＣではＢＣＬ１１Ａ ｍＲＮＡ
レベルが低下した。対照的に、赤血球系分化の７日目および１４日目におけるＢＣＬ１１
Ａのエクソン２のＢＣＬ１１Ａ ｍＲＮＡレベルは未編集または編集済みＨＳＰＣで同じ
ままであった（図２３）。赤血球系分化中、編集済みＨＳＰＣではγグロビンｍＲＮＡレ
ベルが増加し、対応してβ－グロビン ｍＲＮＡが徐々に減少した（図２３）。ゲノム編
集済み細胞に由来する赤血球におけるＨｂＦレベルの増加およびβ－グロビン（鎌状化グ
ロビン）レベルの減少は、鎌状化の低下による治療的意味を有するものと思われる。
赤血球系分化の様々な段階（７、１４および２１日目）にあるゲノム編集済みおよび未
編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体を使用して胎児グロビンな
らびに２つの赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）およびグ
リコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現レベルをフローサイトメトリーによって分析した。
７ＡＡＤの除外によって生存細胞を同定し、ゲーティングした。培養細胞が後期赤芽球に
一致する同様のＣＤ７１およびＣＤ２３５Ａ陽性レベルを示したとおり、ゲノム編集は赤
血球系分化に悪影響を及ぼさなかった。＋５８赤血球系エンハンサー領域のゲノム編集に
より、他のｇＲＮＡおよびモックエレクトロポレート細胞と比べてＨｂＦ含有細胞の増加
（最大６７％）が大きくなった（図２４）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ７
ｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の極めて高い誘導が観察された。しかしながら、エクソ
ン２標的化細胞の細胞増殖およびコロニー形成能は劇的に低下した（図２１および図２２
）。
本発明者らは、標的領域のディープシーケンシングに基づき、ゲノム編集した標的領域
においてＧＡＴＡ１およびＴＡＬ１結合モチーフがインタクトであったことを認めた（図
２５）。最近の文献において、ＢＣＬ１１Ａ発現の調節および胎児グロビンの抑制解除に
おけるＧＡＴＡ１結合部位の重要性が実証された。Ｖｉｅｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５，１２：９２７。成人赤血球系細胞におけるＢＣＬ
１１Ａレベルの維持にこれらの２つのモチーフが重要であることを示した文献報告と対照
的に、本発明者らの知見は、これらの２つの転写因子結合部位の上流の配列もＢＣＬ１１
ａ遺伝子発現の調節において重要であり、およびこれらの上流部位のみをゲノム編集する
ことにより、ＧＡＴＡ１およびＴＡＬ１結合部位がインタクトなままであっても、ＨｂＦ
の上方制御がもたらされることを実証している。
実施例３．１
方法：
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。製造業者の説明書に従って免疫選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を
用いて成人ドナーのＧ－ＣＳＦ動員末梢血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）からヒトＣＤ３４＋細胞
を単離し、各５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポイエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌ
ｔ３Ｌ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ９４１３）、ヒト幹
細胞因子（ＳＣＦ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３
）、およびヒトインターロイキン－６（ＩＬ－６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
、カタログ番号ＰＨＣ００６３）、さらには１×抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ、カタ
ログ番号１０３７８－０１６）および５００ｎＭの化合物４が追加されたＳｔｅｍＳｐａ
ｎ ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０９６５０
）を用いて３日間増殖させた。
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳ
ＰＣの調製、ならびにＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。Ｃａｓ９－ガイド
ＲＮＡリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）は、エレクトロポレーションの直前に調製した
。デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を用いてＲＮＰを形成するために、最初に、各３
μｇのｃｒＲＮＡ（２．２４μＬ中）およびｔｒａｃｒ（１．２５μＬ中）を個別のチュ
ーブにおいて９５℃で２分間変性し、次いで室温に冷却した。Ｃａｓ９タンパク質の調製
物を得るために、６μｇのＣＡＳ９タンパク質（１μＬ中）を０．５μＬの５×ＣＣＥ緩
衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣＬ、５ｍＭ ＭｇＣＬ２、５％グリセロ
ール、および新たに添加した１ｍＭ ＤＴＴ）と混合した。最初に、ＴｒａｃｒをＣａｓ
９調製物と混合し、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、ｃｒＲＮＡをＴｒａｃ
ｒ／ＣＡＳ９複合体に添加し、３７℃で５分間インキュベートした。無／対照条件では、
ｃｒＲＮＡではなく媒体をＴｒａｃｒ／ＣＡＳ９複合体に添加した。ＨＳＰＣを遠心分離
により捕集し、２．５×１０６／ｍＬの細胞密度でＰ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ、カタ
ログ番号ＰＢＰ３－００６７５）に再懸濁した。上下にピペッティングすることによって
ＲＮＰを２０μＬの細胞と混合し、室温で２分間インキュベートした。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅ
ｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ－１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物（２０
μＬ）をエレクトロポレートした。デュプリケートで２０μＬのエレクトロポレーション
を行った。この実施例３．１の実験では、使用したｔｒａｃｒは、配列番号７８０８であ
り、ｃｒＲＮＡは、指定された２’Ｏ－メチル（ｍ）修飾およびホスホロチオエート結合
（＊）修飾を伴って以下の形式および配列：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒ
ＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒ
ＧｒＣｒＵｒＡｒＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（式中、Ｎは、指定された（例えば、ＣＲｘｘｘ
ｘｘ識別子によって指定された）標的化ドメインのヌクレオチドである）を有していた。
インビトロ赤血球新生およびＨｂＦ含有赤血球系細胞のＦＡＣＳ分析。エレクトロポレ
ーション後、ＩＭＤＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２２８．０１）、３３０
μｇ／ｍＬヒトホロトランスフェリン（Ｉｎｖｉｔｒｉａ、カタログ番号７７７ＴＲＦ０
２９）、１０μｇ／ｍＬ組換えヒトインスリン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１１３８２
１１）、２ＩＵ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ、品番Ｈ３３９３）、５％ヒトＡＢ血清（Ｓ
ｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ４５２２）、１２５ｎｇ／ｍＬヒトエリトロポイエチン（Ｐｅ
ｐｒｏｔｅｃｈ番号１０７７９－０５８）、および１×抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ
、カタログ番号１０３７８－０１６）からなる２５０μＬの予備加温した赤血球系分化培
地（ＥＤＭ）に細胞を直ちに移した。１μＭヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ Ｈ８６７２
）、１００ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号
ＰＨＣ２１１３）、および５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ番号１０７７
９－５９８）をＥＤＭにさらに追加した。２日後、細胞培養物を新鮮培地で希釈した。培
養物を合計７日間にわたり維持し、その時点でＨｂＦ発現に関して細胞内染色により細胞
を分析した。簡潔に述べると、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商
標）固定可能菫色死細胞染色液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｌ３４９６３、ＰＢＳ中１
：１０００）に再懸濁し、３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、抗ＣＤ
７１－ＢＶ７１１抗体（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｌｃ
．ＢＤＢ５６３７６７）および抗ＣＤ２３５ａ－ＡＰＣ抗体（ＢＤ５５１３３６）で３０
分間染色した。次いで、細胞を洗浄し、続いて固定緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタロ
グ番号４２０８０１）で固定し、かつ製造業者の説明書に従って１×細胞内染色透過化洗
浄緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２１００２）で透過化した。次いで、５
０μＬの１×細胞内染色透過化洗浄緩衝液中で０．５μＬの抗ＨｂＦ－ＰＥ抗体（Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、品番ＭＨＦＨ０４）と共に細胞を室温で２０分間インキ
ュベートした。２ｍＬの１×細胞内染色透過化洗浄緩衝液で細胞を２回洗浄し、染色緩衝
液に再懸濁し、ＨｂＦ発現に関してＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。Ｆｌｏｗｊｏを用いて結果を分析し、生存可能
ＣＤ７１陽性赤血球系細胞集団中のＨｂＦ陽性細胞（Ｆ細胞）の％としてデータを提示し
た。
ゲノムＤＮＡの調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａ
ｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）を用いて、
エレクトロポレーションの４８時間後に編集および未編集のＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを
調製した。挿入および欠失（インデル）の編集効率およびパターンを決定するために、標
的部位にフランキングするプライマーを用いてＰＣＲ産物を生成し、次いでそれを次世代
シーケンシング（ＮＧＳ）に供した。未編集サンプル中の対応する配列のパーセント編集
は、典型的には１％未満であり、決して３％を超えなかった。
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー領域の標
的遺伝子破壊は、γ－グロビン発現の抑制を解除することにより、上昇したＨｂＦタンパ
ク質を含有する赤血球の産生を可能にするであろうと考えられる（胎児ヘモグロビンを発
現する細胞、例えば、上昇したレベルの胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、本明細書で
は「Ｆ細胞」ということがある。実施形態では、１細胞当たり少なくとも６ピコグラムの
胎児ヘモグロビンを産生する場合、細胞はＦ細胞と見なされる）。上昇したＨｂＦは、脱
酸素条件下で赤血球の鎌状化を予防するため、βサラセミア患者およびＳＣＤ患者の両方
に治療効果／治癒効果があるであろう。また、エキソビボ増殖を向上させて、送達される
遺伝子改変ＨＳＣの用量を増加させるために、ＳＣＤ患者のエキソビボゲノム編集ＨＳＣ
を用いた自己造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）と、幹細胞増殖促進技術、例えば、アリール炭
化水素レセプター（ＡＨＲ）阻害剤、例えば、国際公開第２０１０／０５９４０１号パン
フレット（その内容は、その全体が参照により組み込まれる）に記載のもの、例えば化合
物４とが組み合わされた。
プログラマブルヌクレアーゼＣａｓ９を介して効率的ゲノム編集を行うには、標的細胞
内および標的組織内へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達に成
功することが不可欠である。Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、エレクトロ
ポレーションによって標的細胞内に送達した場合、幾つかの異なる細胞型で効率的かつ特
異的なゲノム編集を達成可能であることが最近の報告で実証された。Ｃａｓ９－ＲＮＰ複
合体は、ほぼ送達直後に染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で迅速に分解されるため、オフタ
ーゲット効果を低減する。これとは対照的に、Ｃａｓ９送達に用いられるプラスミドベク
ター系およびウイルスベクター系の使用は、酵素の長期発現をもたらすため、系に関連す
るオフターゲット効果を悪化させる。加えて、標的細胞内へのＲＮＰの送達は、追加のツ
ールを必要としないため、ゲノム編集を治療目的の診療に移すことがかなり容易になるで
あろう。精製した組換えＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡの複合体（ＲＮＰ）を培養Ｈ
ＳＰＣ内に送達した。また、使用した実験の概要を図１７に示す。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し
、かつｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合
体化することにより、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を生成した。研究に使用したｇ
ＲＮＡのリストを表１７に示す（例えば、指定されたＣＲｘｘｘｘｘｘ識別子の標的化ド
メインを含むｇＲＮＡ）。材料および方法に記載したように、エレクトロポレーションを
介してＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の
送達前に細胞を増殖させた。活発に分裂する細胞は、エレクトロポレーションによって送
達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
蛍光色素にコンジュゲートされた抗体を用いて、胎児グロビンならびに２種の赤血球系
細胞表面マーカー、すなわちトランスフェリンレセプター（ＣＤ７１）およびグリコホリ
ンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現レベルに関して、ゲノム編集およびゲノム未編集のＨＳＰＣ
をフローサイトメトリーによって分析した。生細胞を同定し、Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ Ｖｉ
ｏｌｅｔの排除によってゲートした。ＢＣＬ１１Ａ赤血球特異的エンハンサー領域標的化
は、モックエレクトロポレート細胞（２２．４％）と比較して、ＨｂＦを含有する赤血球
系細胞のパーセントの増加（５０．７％まで）をもたらした（表１７）。ＢＣＬ１１Ａの
エクソン２を標的とするｇ８の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の
誘導も並行して観測された。また、ＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー領域のゲノムＰＣ
Ｒ産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供して、細胞集団中の編集対立遺伝子のパー
セントを決定した。４０％超のＨｂＦ＋細胞を生じたｄｇＲＮＡ処理は、７４．８％～９
４．０％の範囲内の編集を有していた（表１７）。同じ標的化ドメインに対して、この実
施例のｄｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒおよびｃｒＲＮＡの配列が実施例３のものと異なってい
たが、編集およびＨｂＦ誘導は、ｄｇＲＮＡ形式全体にわたりほとんどの標的化ドメイン
で類似していた。注目すべきことに、本研究のｄｇＲＮＡ形式のＣＲ０００３１７＿ＥＨ
４は、５０．７％のＨｂＦ＋細胞までの高いＨｂＦ誘導をもたらした。ゲノム編集細胞に
由来するＨｂＦ含有赤血球の増加は、鎌状化が低減されることから、確かな治療的意義を
有する可能性がある。
実施例３．２．ＨＳＰＣにおけるＢＣＬ１１ａエンハンサーの＋５８領域を標的とするｇ
ＲＮＡを使用したｇＲＮＡ編集および胎児ヘモグロビン上方制御の最適化
ＢＣＬ１１ａエンハンサーの＋５８領域を標的とするｇＲＮＡの包括的スクリーニング
による％編集率の結果に基づき、さらなる研究および最適化に８つのｇＲＮＡ標的化ドメ
インを選択した。ｇＲＮＡ分子に対する修飾が％編集率、赤血球系分化、および胎児ヘモ
グロビン発現に及ぼす効果を試験するため、ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域の＋５８領域
内にある部位を標的とする種々のバージョンの８つのｇＲＮＡ分子を設計した。ＣＲ００
３０９、ＣＲ００３１１、ＣＲ００３１２、ＣＲ００３１６、ＣＲ０１１２５、ＣＲ０１
１２６、ＣＲ０１１２７、およびＣＲ０１１２８の標的化ドメインを含む以下のバージョ
ンのｇＲＮＡを作製した。
ｄｇＲＮＡ（標的化ドメインの配列以外の全配列は実施例１に記載されるとおり）：
１．非修飾ｃｒＲＮＡおよび非修飾ｔｒａｃｒ（「非修飾」または「Ｕｎｍｏｄ」）
２．非修飾ｃｒＲＮＡおよび非修飾ｔｒａｃｒ、但し、指示される標的化ドメインの５’
－１８ｎｔのみを含む（完全な２０ｎｔでない）（「１８ｎｔ」）
３．ホスホロチオエート結合で修飾されたｃｒＲＮＡの３個の３’ｎｔおよび３個の５’
ｎｔ、および非修飾ｔｒａｃｒ（「ＰＳ」）
４．ｃｒＲＮＡの５’末端および３’末端の両方に追加的な逆位脱塩基残基、および非修
飾ｔｒａｃｒ（「Ｉｎｖｄ」）
５．ホスホロチオエート結合および２’－Ｏメチル基で修飾されたｃｒＲＮＡの３個の３
’ｎｔおよび３個の５’ｎｔ、および非修飾ｔｒａｃｒ（「ＯＭｅＰＳ」）
６．２’－フルオロ基で修飾されたｃｒＲＮＡの３個の３’ｎｔおよび３個の５’ｎｔ、
および非修飾ｔｒａｃｒ（「Ｆ」）
７．ホスホロチオエート結合および２’－フルオロ基で修飾されたｃｒＲＮＡの３個の３
’ｎｔおよび３個の５’ｎｔ、および非修飾ｔｒａｃｒ（「Ｆ－ＰＳ」）
ｓｇＲＮＡ（標的化ドメイン以外の全配列は実施例１に記載されるとおりである）：
１．非修飾ｓｇＲＮＡ（「非修飾」または「Ｕｎｍｏｄ」）
２．指示される標的化ドメインの５’－１８ｎｔのみからなる標的化ドメイン（完全な２
０ｎｔでない）（「１８ｎｔ」）
３．ホスホロチオエート結合で修飾されたｓｇＲＮＡの３個の３’ｎｔおよび３個の５’
ｎｔ（「ＰＳ」）
４．ｓｇＲＮＡの５’末端および３’末端の両方に追加的な逆位脱塩基残基（「Ｉｎｖｄ
」）
５．ホスホロチオエート結合および２’－Ｏメチル基で修飾されたｓｇＲＮＡの３個の３
’ｎｔおよび３個の５’ｎｔ（「ＯＭｅＰＳ」）
６．２’－フルオロ基で修飾されたｓｇＲＮＡの３個の３’ｎｔおよび３個の５’ｎｔ（
「Ｆ」）
７．ホスホロチオエート結合および２’－フルオロ基で修飾されたｓｇＲＮＡの３個の３
’ｎｔおよび３個の５’ｎｔ（「Ｆ－ＰＳ」）
他の全ての試薬および方法は実施例３に記載されるとおりであった。結果は全てデュプ
リケートで実行したものであり、結果は図２８～図３２に報告する。図２８Ａおよび図２
８Ｂは、指示されるデュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を含むＲＮＰのエレクトロポレ
ーション後２日のＣＤ３４＋細胞におけるＮＧＳによって計測したときの％編集率を示す
。図２９は、指示されるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むＲＮＰのエレクトロ
ポレーション後２日のＣＤ３４＋細胞におけるＮＧＳによって計測したときの％編集率を
示す。図３０は、指示されるデュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を含むＲＮＰのエレク
トロポレーション後、編集したＣＤ３４＋細胞を赤血球系分化培地に移してから１４日目
にフローサイトメトリーによって計測したときの％ＨｂＦ陽性細胞を示す。図３１は、指
示されるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むＲＮＰのエレクトロポレーション後
、編集したＣＤ３４＋細胞を赤血球系分化培地に移してから１４日目にフローサイトメト
リーによって計測したときの％ＨｂＦ陽性細胞を示す。図３２は、赤血球系分化培地中で
１４日後の編集済み細胞の増殖倍数を示す。これらの結果は、選択されたｇＲＮＡ分子の
多くが、ｄｇＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの両方のフォーマットとも、ＲＮＰとしてエレクト
ロポレーションによってＣＤ３４＋細胞に送達したとき、標的部位におけるゲノム編集を
９０％より高い効率、ある場合には９８％より高い効率で実現する能力を有することを示
している。同様に、選択されたｇＲＮＡの多くが、非修飾細胞（「モック」）と比べて２
０％より高い％Ｆ細胞の増加を実現することが可能であった。最後に、ＨＳＰＣにおける
ＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーのゲノム編集によって赤血球系細胞の増殖能が低下し
、一部のｇＲＮＡ（例えば、ＣＲ００３０９）は他のｇＲＮＡ（例えば、ＣＲ００３１２
）よりもその効果が一層顕著であったが、赤血球に分化した編集済み細胞集団のほとんど
は、それでもなおエキソビボで赤血球系分化培地中において１４日間で５００～１５００
倍の集団倍加を実現する能力を有したことから、編集済み細胞は患者の鎌状赤血球症また
はβサラセミアなどの異常ヘモグロビン症の治療において療法として有用であり得ること
が示される。
実施例４．成人赤血球系細胞における胎児グロビン発現の抑制を解除するためのＣＲＩＳ
ＰＲ－Ｃａｓ９を用いた造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）におけるＨＰＦＨ領域編集
方法：
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。製造者の指示に従い免疫選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて
成人ドナー由来のＧ－ＣＳＦ動員末梢血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）からヒトＣＤ３４＋細胞を
単離し、各５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－
３Ｌ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ９４１３）、ヒト幹細
胞因子（ＳＣＦ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３）
およびヒトインターロイキン－６（ＩＬ－６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カ
タログ番号ＰＨＣ００６３）、ならびに１×抗生物質／抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ、カタログ
番号１０３７８－０１６）および５００ｎＭ化合物４を補足したＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦ
ＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０９６５０）を用い
て４～６日間増殖させた。この実施例全体を通じて（そのサブ実施例を含め）、プロトコ
ルがその細胞を「増殖させた」と指示する場合、この培地を使用した。この培地は本実施
例では（そのサブ実施例を含め）「幹細胞増殖培地」、または「増殖培地」とも称される
。
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰ
Ｃの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。Ｃａｓ９－ガイドＲＮ
Ａリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）はエレクトロポレーションの直前に調製した。デュ
アルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を用いるＲＮＰの形成については、初めに各３μｇのｃ
ｒＲＮＡ（２．２４μＬ中）およびｔｒａｃｒ（１．２５μＬ中）を別個のチューブにお
いて９５℃で２分間変性させて、次に室温に冷却した。Ｃａｓ９タンパク質の調製のため
、６μｇのＣＡＳ９タンパク質（０．８～１μＬ中）を０．５μＬの５×ＣＣＥ緩衝液（
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣＬ、５ｍＭ ＭｇＣＬ２、５％グリセロールお
よび新たに添加した１ｍＭ ＤＴＴ）と混合した。初めにＴｒａｃｒをＣａｓ９調製物と
混合し、３７℃で５分間インキュベートした。次にｃｒＲＮＡをＴｒａｃｒ／ＣＡＳ９複
合体に加え、３７℃で５分間インキュベートした。無し／対照条件については、Ｔｒａｃ
ｒ／ＣＡＳ９複合体にｃｒＲＮＡではなく媒体を加えた。遠心によってＨＳＰＣを回収し
、Ｎｅｏｎエレクトロポレーションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号：ＭＰ
Ｋ１０９６）に付属するＴ緩衝液中に５×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰ
を２０μＬの細胞と上下にピペッティングすることにより混合し、室温で２分間インキュ
ベートした。ＲＮＰ／細胞混合物（１０μＬ）をＮｅｏｎエレクトロポレーションプロー
ブに移した。Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＭＰＫ５
０００Ｓ）で１７００ボルト／２０ミリ秒および１パルスを用いてエレクトロポレーショ
ンを実施した。デュプリケートの１０μＬエレクトロポレーションを実施した。
インビトロ赤血球新生およびＨｂＦを含有する赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。エ
レクトロポレーション後、直ちに、ＩＭＤＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２
２８．０１）、３３０μｇ／ｍＬヒトホロトランスフェリン（Ｉｎｖｉｔｒｉａ カタロ
グ番号７７７ＴＲＦ０２９）、１０μｇ／ｍＬ組換えヒトインスリン（Ｇｉｂｃｏ カタ
ログ番号Ａ１１３８２１１）、２ＩＵ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ、品番Ｈ３３９３）、
５％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ４５２２）、１２５ｎｇ／ｍＬヒトエリ
スロポエチン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１０７７９－０５８）、および１×抗生物質／抗
真菌薬（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８－０１６）からなる２５０μＬの予め温め
た赤血球系分化培地（ＥＤＭ）に細胞を移した。ＥＤＭには、１μＭヒドロコルチゾン（
Ｓｉｇｍａ Ｈ８６７２）、１００ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３）、および５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－３（Ｐｅｐｒ
ｏｔｅｃｈ ＃１０７７９－５９８）をさらに補足した。２日後、細胞培養物を新鮮培地
に希釈した。培養物は合計７日間維持し、７日経った時点で細胞をＨｂＦ発現に関して細
胞内染色によって分析した。簡潔に言えば、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥ
ＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ死細胞染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
Ｌ３４９６３；ＰＢＳ中１：１０００）に再懸濁して、３０分間インキュベートした。
次に細胞を洗浄し、抗ＣＤ７１－ＢＶ７１１（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃ
ｏｍｐａｎｙ Ｌｌｃ．ＢＤＢ５６３７６７）および抗ＣＤ２３５ａ－ＡＰＣ（ＢＤ ５
５１３３６）抗体で３０分間染色した。次に細胞を洗浄し、続いて製造者の指示に従い固
定化緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０８０１）で固定化し、および１×
細胞内染色・透過処理・洗浄緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２１００２）
で透過処理した。次に細胞を５０μＬの１×細胞内染色・透過処理・洗浄緩衝液中０．５
μＬの抗ＨｂＦ－ＰＥ抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、品番ＭＨＦＨ０４）
と共に室温で２０分間インキュベートした。細胞を２ｍＬの１×細胞内染色・透過処理・
洗浄緩衝液で２回洗浄し、染色緩衝液中に再懸濁し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイ
トメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＨｂＦ発現に関して分析した。結果はＦ
ｌｏｗｊｏを使用して分析し、およびデータは、生存ＣＤ７１陽性赤血球系細胞集団中の
ＨｂＦ陽性細胞（Ｆ－細胞）の％として提示した。
遺伝子発現解析。記載されるとおりのインビトロ赤血球新生の７日後、Ｚｙｍｏ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ＺＲ－９６ ｑｕｉｃｋ ＲＮＡキット（Ｚｙｍｏ カタログ番号Ｒ１０
５３）を使用したＲＮＡの精製に、約１×１０５細胞を使用した。Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉ
ｐｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２０５３１３）を使用した第１鎖合成に
、最大１μｇのＲＮＡを使用した。供給業者のプロトコルに従い２×Ｔａｑ－Ｍａｎ Ｆ
ａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅ ＰＲ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタロ
グ番号４４４４９６３）を使用してＴａｑ－ｍａｎ定量的リアルタイムＰＣＲを実施し、
およびＧＡＰＤＨ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤ番号Ｈｓ０２７５８９９
１＿ｇ１、ＶＩＣ）、ＨＢＢ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤ番号Ｈｓ００
７４７２２３＿ｇ１、ＶＩＣ）およびＨＢＧ２／ＨＢＧ１（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ、ＩＤ番号Ｈｓ００３６１１３１＿ｇ１、ＦＡＭ）に関してＴａｑ－Ｍａｎ遺伝
子発現アッセイを実施した。各遺伝子の相対発現はＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、Δ
ΔＣｔ法による無し／対照ＲＮＰを送達した試料の倍数として報告した。あるいは、転写
物をＧＡＰＤＨ正規化相対量に変換した後（２＾－ΔＣｔ）、ＨＢＢおよびＨＢＧ２／Ｈ
ＢＧ１発現の合計に対するパーセンテージとしてＨＢＧ２／ＨＢＧ１発現レベルを計算し
た。
ゲノムＤＮＡ調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。エレクトロポレーションの
４８時間後に、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ カ
タログ番号ＱＥ０９０５０）を使用して編集済みおよび未編集ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡ
を調製した。編集効率ならびに挿入および欠失（インデル）のパターンを決定するため、
文献に記載されるとおり標的部位に隣接するプライマーを用いてＰＣＲ産物を作成し、次
にこれを次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供した。未編集試料（Ｃａｓ９およびＴｒａ
ｃｒのみからなるＲＮＰをエレクトロポレートした）における対応する配列のパーセント
編集率は、典型的には１％未満であり、３％を超えることはなかった。
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＰＦＨ領域を標的化して遺伝子破壊すると
γ－グロビン発現の抑制が解除され、高いＨｂＦタンパク質を含有する赤血球細胞（胎児
ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「Ｆ－細胞」と称されることも
ある）の産生が可能になると考えられる。高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌
状化を防ぎ、β－サラセミアおよびＳＣＤの両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る
。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳ
ＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤
、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は全体として参照
により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と併用すると、エキソビ
ボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞お
よび組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠
である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ
）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異
的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９－ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に
染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する
。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを
使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化す
る。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより
臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａ
ｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験
概要は図１７に示す。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し
、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化
して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのリス
トおよび配列は、表１６に示す。「材料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレ
ーションによってＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮ
Ｐ複合体の送達前に細胞は増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーシ
ョンによって送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
ゲノム編集済みおよび未編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体
を使用して胎児グロビンならびに２つの赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受
容体（ＣＤ７１）およびグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現レベルをフローサイトメ
トリーによって分析した。Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ Ｖｉｏｌｅｔの除外によって生存細胞を
同定し、ゲーティングした。培養細胞が未編集細胞と同様の赤芽球と一致するＣＤ７１＋
細胞のパーセンテージを示したとおり、ゲノム編集は赤血球系分化に悪影響を及ぼさなか
った。ＨＰＦＨ領域を標的化すると、モックエレクトロポレート細胞（２１．０％）と比
較して、ＨｂＦを含有する赤血球系細胞のパーセンテージが（５１．４％まで）増加した
（表１６）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の標的化ドメインを含むｄｇＲ
ＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の誘導も並行して観察された。またＨＰＦＨ領域のゲノムＰＣ
Ｒ産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し、細胞集団中の編集されたアレルのパー
センテージを決定した。Ｃａｓ９、所与の標的化ドメインのｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒ
を含むＲＮＰをエレクトロポレートした細胞培養物の多くでは、ＨＦＰＨ遺伝子座におけ
る高いゲノム編集パーセンテージが観察されたが（表１６）、標的化ドメインを送達しな
い対照細胞（Ｃａｓ９およびＴｒａｃｒのみを含むＲＮＰ）では観察されなかった。詳細
には、４０％より高いＨｂＦ＋細胞をもたらしたｄｇＲＮＡ処理では、編集されたアレル
は４３．０％～９１．７％の範囲であった（表１６）。
本研究における一部の培養物をヘモグロビン遺伝子発現に関して分析した。これらの標
的化ドメインのうち、胎児γ－グロビン遺伝子発現が無し／対照と比べて１．６～３．８
倍誘導され、これは成人β－グロビン発現の中程度の低下を伴った（無し／対照の０．５
８～０．９１倍）（表１８）。これらの効果が一緒になって、細胞集団における全β型グ
ロビンの１３．８％～２６．６％の範囲のγ－グロビン発現レベル（γ／［γ＋β］）を
もたらし（表１７）、標的化ドメインにわたる相対的胎児グロビン誘導は、ＨｂＦタンパ
ク質誘導について観察されるものと同様であった（表１６）。ゲノム編集済み細胞に由来
する赤血球におけるＨｂＦ／γ－グロビンの増加またはβ－グロビン（鎌状化したグロビ
ン）レベルの低下と併せたＨｂＦ／γ－グロビンの増加のいずれも、鎌状化の低下による
治療的意味を有するものと思われる。
実施例４．２
方法：方法は、以下の点を除いて実施例４にあるとおりである。
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰ
Ｃの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。遠心によって収集した
ＨＳＰＣをＰ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ カタログ番号ＰＢＰ３－００６７５）に２．
５×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを２０μＬの細胞と上下にピペッティ
ングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅ
ｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ－１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物（２０μＬ）
をエレクトロポレートした。
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＰＦＨ領域を標的化して遺伝子破壊すると
γ－グロビン発現の抑制が解除され、高いＨｂＦタンパク質を含有する赤血球細胞（胎児
ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「Ｆ－細胞」と称されることも
ある）の産生が可能になると考えられる。高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌
状化を防ぎ、β－サラセミアおよびＳＣＤの両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る
。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳ
ＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤
、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は全体として参照
により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と併用すると、エキソビ
ボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞お
よび組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠
である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ
）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異
的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９－ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に
染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する
。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを
使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化す
る。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより
臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａ
ｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験
概要は図１７に示す。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し
、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化
して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのリス
トは、表１９に示す。「材料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレーションに
よってＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の
送達前に細胞は増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによっ
て送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
ゲノム編集済みおよび未編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体
を使用して胎児グロビンならびに２つの赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受
容体（ＣＤ７１）およびグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現レベルをフローサイトメ
トリーによって分析した。Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ Ｖｉｏｌｅｔの除外によって生存細胞を
同定し、ゲーティングした。培養細胞が未編集細胞と同様の赤芽球と一致するＣＤ７１＋
細胞のパーセンテージを示したとおり、ゲノム編集は赤血球系分化に悪影響を及ぼさなか
った。ＨＰＦＨ領域を標的化すると、モックエレクトロポレート細胞（１８．９および２
１．１％）と比較して、ＨｂＦを含有する赤血球系細胞のパーセンテージが（４６．６％
まで）増加した（表１９）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の標的化ドメイ
ンを含むｄｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の誘導も並行して観察された。
最後に、ＣＲ００３０３１、ＣＲ００３０３３、ＣＲ００３０３５、ＣＲ００３０３７
、ＣＲ００３０３８、ＣＲ００３０５２、ＣＲ００３０８５の標的化ドメインを含むｄｇ
ＲＮＡについて標的部位にまたはその近傍に作り出されたインデルパターンをＮＧＳによ
って評価した。各位置における上位５つの最も高頻度のインデルを表２７に示す。
これらの結果は、指示されるｇＲＮＡ分子によって標的とされるＨＰＦＨ領域の小さい
インデル（例えば、この場合、１～２０ヌクレオチドのインデル）が、ＨｂＦの発現およ
び産生に大きい影響を有し得るという本明細書に記載される前出の実験の結論を裏付けて
いる。ゲノム編集済み細胞に由来するＨｂＦ含有赤血球の増加は、鎌状化の低下による治
療的意味を有するものと思われる。
実施例４．３
方法：方法は、以下の点を除いて実施例４にあるとおりである。
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。ヒトＣＤ３４＋細胞を増殖培地でＲＮＰ送達前に３日間増殖
させた。
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰ
Ｃの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。遠心によって収集した
ＨＳＰＣをＰ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ カタログ番号ＰＢＰ３－００６７５）に６．
４×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを２０μＬの細胞と上下にピペッティ
ングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅ
ｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ－１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物（２０μＬ）
をエレクトロポレートした。エレクトロポレーションはデュプリケートで実施した。Ｔｒ
ａｃｒは配列番号７８０８であり、およびｃｒＲＮＡは、以下のフォーマット（２’Ｏ－
メチル（ｍ）およびホスホロチオエート結合（＊）修飾が指示される）：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍ
Ｎ＊ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵ
ｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（式中、Ｎは標的化
ドメインのヌクレオチドである）を有した。
インビトロ赤血球新生およびＨｂＦを含有する赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。エ
レクトロポレーション後、直ちに、ＥＤＭおよび補足物からなる予め温めた培地に細胞を
移した。培養０～７日目の間、ＥＤＭには、１μＭヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ Ｈ８
６７２）、１００ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタロ
グ番号ＰＨＣ２１１３）、および５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１
０７７９－５９８）をさらに補足した。培養７～１１日目の間、ＥＤＭには１００ｎｇ／
ｍＬのヒトＳＣＦのみを補足した。培養１１～２１日目の間、ＥＤＭに追加の補足はしな
かった。細胞培養物０日目に２．６×１０４細胞／ｍｌで開始し、７日目に４．０×１０
４細胞／ｍｌに調整し、および１１日目に１．０×１０６細胞／ｍｌに調整した。１４日
目および１９日目に培地を補充した。ＲＮＰ送達後１、４、７、１１、１４および２１日
に生存細胞をカウントした。生存細胞数は全て、ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ
Ｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号ＰＣＢ１００）を用いたフロー
サイトメトリーにより、ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）染
色によって生存不能細胞を判別して決定した。培養７、１６および２１日目、細胞（１×
１０５）をＨｂＦ発現に関して細胞内染色によって分析した。１６日目および２１日目、
ＨｂＦ発現に関する細胞内染色に抗ＣＤ７１および抗ＣＤ２３５ａ抗体は含まず、生存細
胞集団全体におけるＨｂＦ陽性細胞（Ｆ－細胞）の％を報告した。２１日目、生死判別色
素としてＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ
Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｌ３４９７５）を使用した。
ゲノムＤＮＡ調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。エレクトロポレーションの
７日後に、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ カタロ
グ番号ＱＥ０９０５０）を使用して編集済みおよび未編集ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを調
製した。
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＰＦＨ領域を標的化して遺伝子破壊すると
γ－グロビン発現の抑制が解除され、高いＨｂＦタンパク質を含有する赤血球細胞（胎児
ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「Ｆ－細胞」と称されることも
ある）の産生が可能になると考えられる。高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌
状化を防ぎ、β－サラセミアおよびＳＣＤの両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る
。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳ
ＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤
、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は全体として参照
により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と併用すると、エキソビ
ボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞お
よび組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠
である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ
）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異
的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９－ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に
染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する
。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを
使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化す
る。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより
臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａ
ｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験
概要は図１７に示す。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し
、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化
して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのリス
トは、表２０に示す。「材料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレーションに
よってＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の
送達前に細胞は増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによっ
て送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
ゲノム編集済みおよび未編集のＨＳＰＣについて、三段階赤血球系分化細胞培養プロト
コルで増殖に関して分析した。エレクトロポレーション後１日のパーセント細胞回収率は
５８％～９６％の範囲であり、未編集であるがエレクトロポレートした対照を含め、条件
間で同様であった（表２０）。増殖は、ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の標
的化ドメインを含むｄｇＲＮＡによって編集した細胞では抑制されたが（２１日目に未編
集対照の１０～１２％、表２０）、含まれたＨＰＦＨ領域を標的とするｄｇＲＮＡによっ
て編集した細胞の増殖は対照と同様であった（２１日目に未編集対照の４７～９９％、表
２０）。
ゲノム編集済みおよび未編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体
を使用して胎児グロビンならびに２つの赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受
容体（ＣＤ７１）およびグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現レベルをフローサイトメ
トリーによって分析した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ死細胞染色の除外によっ
て生存細胞を同定し、ゲーティングした。分化７日目に培養細胞が未編集細胞と同様の赤
芽球と一致するＣＤ７１＋細胞のパーセンテージを示したとおり、ゲノム編集は赤血球系
分化に悪影響を及ぼさなかった。含まれたＨＰＦＨ領域標的化ｄｇＲＮＡで培養物を処理
すると、モックエレクトロポレート細胞と比較して、２１日間の培養期間全体を通じてＨ
ｂＦを含有する赤血球系細胞のパーセンテージが増加した（表２１）。ＢＣＬ１１Ａのエ
クソン２を標的とするｇ８の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の誘
導も並行して観察された。またＨＰＦＨ領域のゲノムＰＣＲ産物を次世代シーケンシング
（ＮＧＳ）に供し、細胞集団中の編集されたアレルのパーセンテージを決定した。Ｃａｓ
９、所与の標的化ドメインのｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒを含有するＲＮＰをエレクトロ
ポレートした細胞培養物ではＨＦＰＨ遺伝子座におけるゲノム編集が観察されたが（表２
１）、標的化ドメインを送達しない対照細胞（Ｃａｓ９およびＴｒａｃｒのみを含むＲＮ
Ｐ）では観察されなかった。ゲノム編集済み細胞に由来するＨｂＦ含有赤血球の増加は、
鎌状化の低下による治療的意味を有するものと思われる。
実施例４．４
方法：方法は、以下の点を除いて実施例４にあるとおりである。
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。研究に応じて、ＲＮＰ送達前の３～６日間にわたって増殖培
地でヒトＣＤ３４＋細胞を増殖させた。
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰ
Ｃの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。一部の研究については
、ＲＮＰ複合体は４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して送達した。
そのような研究では、遠心によって収集したＨＳＰＣをＰ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ
カタログ番号ＰＢＰ３－００６７５）に、研究に応じて２．２×１０６／ｍＬ～６．４×
１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを２０μＬの細胞と上下にピペッティング
することにより混合し、室温で２分間インキュベートした。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔ
ｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ－１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物（２０μＬ）をエ
レクトロポレートした。エレクトロポレーションはデュプリケートで実施した。ｄｇＲＮ
Ａフォーマットは、研究間で異なり、以下の表記法によって表２２に示す。フォームＡは
、上記の実施例１に記載したｄｇＲＮＡフォーマットであり、指示される標的化ドメイン
配列を含む。フォームＢは、ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒ
ＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵｒ
ＧｒＣｒＵ（式中、ｒはＲＮＡ塩基を示し、およびＮは、指示される標的化ドメイン配列
に対応する）のｃｒＲＮＡ、および配列番号７８０８からなるｔｒａｃｒを用いるｄｇＲ
ＮＡフォーマットである。フォームＣは、配列ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮ
ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡ
ｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（式中、ｒはＲＮＡ塩基を示し、Ｎは、指示さ
れる標的化ドメイン配列に対応し、ｍは２’Ｏ－メチル修飾を有する塩基を示し、および
＊はホスホロチオエート結合を示す）のｃｒＲＮＡ、および配列番号７８０８からなるｔ
ｒａｃｒを用いるｄｇＲＮＡフォーマットである。
インビトロ赤血球新生およびＨｂＦを含有する赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。一
研究では、細胞培養は０日目に２．６×１０４細胞／ｍｌで開始した。２５０μｌに直接
播種することにより開始したものについては（実施例４に記載されるとおり）、研究に応
じて１～３日後に細胞培養物を新鮮培地に希釈した。
ゲノムＤＮＡ調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。研究に応じてエレクトロポ
レーションの２４時間～７日後に、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐ
ｉｃｅｎｔｒｅ カタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用して編集済みおよび未編集ＨＳＰ
ＣからゲノムＤＮＡを調製した。
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＰＦＨ領域を標的化して遺伝子破壊すると
γ－グロビン発現の抑制が解除され、高いＨｂＦタンパク質を含有する赤血球細胞（胎児
ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「Ｆ－細胞」と称されることも
ある）の産生が可能になると考えられる。高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌
状化を防ぎ、β－サラセミアおよびＳＣＤの両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る
。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳ
ＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤
、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は全体として参照
により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と併用すると、エキソビ
ボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞お
よび組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠
である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ
）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異
的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９－ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に
染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する
。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを
使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化す
る。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより
臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａ
ｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験
概要は図１７に示す。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し
、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化
して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのリス
トは、表２２に示す。「材料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレーションに
よってＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の
送達前に細胞は増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによっ
て送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
ゲノム編集済みおよび未編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体
を使用して胎児グロビンならびに２つの赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受
容体（ＣＤ７１）およびグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現レベルをフローサイトメ
トリーによって分析した。Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ Ｖｉｏｌｅｔの除外によって生存細胞を
同定し、ゲーティングした。ＨＰＦＨ領域を標的化すると、モックエレクトロポレート細
胞と比較して、ＨｂＦを含有する赤血球系細胞のパーセンテージが増加し、これは複数の
評価およびｄｇＲＮＡフォーマット間で一貫した結果であった（表２２）。一部の例では
、％ＨｂＦ＋細胞の増加は特定のｄｇＲＮＡフォーム、例えばＣＲ００１０２８について
のフォームＣと関連付けられた（表２２）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８
の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の誘導も並行して観察された。
またＨＰＦＨ領域のゲノムＰＣＲ産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し、細胞集
団中の編集されたアレルのパーセンテージを決定した。Ｃａｓ９、所与の標的化ドメイン
のｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒを含有するＲＮＰをエレクトロポレートした細胞培養物で
はＨＦＰＨ遺伝子座におけるゲノム編集が観察されたが（表２２）、標的化ドメインを送
達しない対照細胞（Ｃａｓ９およびＴｒａｃｒのみを含むＲＮＰ）では観察されなかった
。
最後に、各ｇＲＮＡについてインデルパターンならびに各インデルの頻度をＮＧＳによ
って評価した。各標的部位に最も高頻度に出現するインデルを表２６に示す。
ある場合には、最も高頻度のインデルの相対的存在量は実験毎に異なったが、上位のイ
ンデルは、いずれの所与のｇＲＮＡについても両方の実験で概して同じであった。これは
、これらのｄｇＲＮＡについて、ＨＳＣ細胞に作り出されたインデルパターンが一貫して
いたことを示している。同様に、これらの結果は、これらのｇＲＮＡによって標的化され
るＨＰＦＨ領域における小さいインデル（例えば、この場合、１～２０ヌクレオチドのイ
ンデル）が胎児ヘモグロビンの大幅な上方制御をもたらし得るという前出の実験からの意
外な知見を裏付けている。ゲノム編集済み細胞に由来するＨｂＦ含有赤血球の増加は、鎌
状化の低下による治療的意味を有するものと思われる。
実施例４．５
方法：方法は、以下の点を除いてサブ実施例４．１にあるとおりである。
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。ヒトＣＤ３４＋細胞は骨髄に由来した（Ｈｅｍａｃａｒｅ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号ＢＭ３４Ｃ－３）。ＣＤ３４＋細胞を解凍し、Ｒ
ＮＰ送達前に増殖培地で１日増殖させた。ＲＮＰ送達後、細胞を直ちに２００μｌ増殖培
地に戻し、一晩回復させた。翌日、培養物をカウントし、２．０×１０５生存細胞／ｍｌ
に調整した。パーセント回収率は、エレクトロポレートした生存細胞のパーセンテージと
してＲＮＰ送達後１日の生存細胞数として計算した。増殖培地中でさらに７日後（ＲＮＰ
送達後８日）、生存細胞数を再び決定した。増殖倍数は、増殖培地中で７日後の生存細胞
数を２．０×１０５細胞／ｍｌで除したものとして計算した。生存細胞数は全て、Ａｃｃ
ｕＣｈｅｃｋ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番
号ＰＣＢ１００）を用いたフローサイトメトリーにより、ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジ
ノ－２－フェニルインドール）染色によって生存不能細胞を判別して計測した。増殖培地
中でさらに１日後（ＲＮＰ送達後９日）、細胞培養物の表現型を「細胞フェノタイピング
」に記載するとおりフローサイトメトリーによって決定した。
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰ
Ｃの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。遠心によって収集した
ＨＳＰＣをＰ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ カタログ番号ＰＢＰ３－００６７５）に５．
４×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを２０μＬの細胞と上下にピペッティ
ングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅ
ｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ－１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物（２０μＬ）
をエレクトロポレートした。エレクトロポレーションはデュプリケートで実施した。使用
したｃｒＲＮＡは配列ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒ
ＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵ＊
ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（式中、ｒはＲＮＡ塩基を示し、ｍは２’Ｏ－メチル修飾を有する塩基
を示し、および＊はホスホロチオエート結合を示す）のものであった。Ｎは、指示される
標的化ドメインの残基を示す。使用したｔｒａｃｒ配列は配列番号７８０８であった。
コロニー形成単位細胞アッセイ。ＲＮＰ送達の翌日、「ヒトＣＤ３４＋細胞培養」に記
載されるとおり生存細胞をカウントした。顆粒球／マクロファージ前駆細胞コロニー形成
単位（ＣＦＵ）アッセイについて、１ｍＬのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ Ｈ４０３５メチルセル
ロース培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）当たり２２７細胞をデュプ
リケートでプレーティングした。Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔに１×抗生物質／抗真菌薬（Ｇｉｂ
ｃｏ、カタログ番号１０３７８－０１６）を添加した。培養ディッシュを加湿インキュベ
ーターにおいて３７℃でインキュベートした。プレーティング後１５日目に、少なくとも
５０細胞を含むコロニーをカウントした。Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ １ｍｌ当たりのコロニー
数を２２７で除して１０００を乗じることにより、１０００細胞当たりのＣＦＵ頻度を求
めた。
細胞フェノタイピング。以下の抗体パネルで染色した後、表面マーカー発現に関して細
胞を分析した。パネル１：ＣＤ３８（ＦＩＴＣコンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ ＃３４０９２６、クローンＨＢ７）、ＣＤ１３３エピトープ１（ＰＥコンジュゲ
ート、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＃１３０－０８０－８０１、クローンＡＣ１３３）、ＣＤ３４
（ＰｅｒＣＰコンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃３４０６６６、クロー
ン８Ｇ１２）、ＣＤ９０（ＡＰＣコンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５
９８６９５、クローンＥ１０）、ＣＤ４５ＲＡ（Ｐｅ－Ｃｙ７コンジュゲート、ｅＢｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ ＃２５－０４５８－４２、クローンＨＩ１００）。パネル２：ＣＤ３４
（ＰｅｒＣＰコンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃３４０６６６、クロー
ン８Ｇ１２）、ＣＤ３３（ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ
＃３３３９４６、クローンＰ６７．６）、ＣＤ１４（ＡＰＣ－Ｈ７コンジュゲート、Ｂ
Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６０２７０、クローンＭφＰ９）、ＣＤ１５（ＰＥコ
ンジュゲート、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３０１９０５、クローンＨＩ９８）。パネル３：
ＣＤ３４（ＰｅｒＣＰコンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃３４０６６６
、クローン８Ｇ１２）、ＣＤ４１ａ（ＡＰＣ－Ｈ７コンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ ＃５６１４２２、クローンＨＩＰ８）、ＣＤ７１（ＦＩＴＣコンジュゲート
、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５５５５３６、クローンＭ－Ａ７１２）、ＣＤ１９
（ＰＥコンジュゲート、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃３４０７２０、クローンＳＪ
２５Ｃ１）、ＣＤ５６（ＡＰＣコンジュゲート、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３１８３１０、
クローンＨＣＤ５６）に特異的な抗体。並行して、対応するアイソタイプ対照抗体パネル
を使用して培養物を染色し、但し、そのアイソタイプ対照の代わりに抗ＣＤ４５ＲＡを含
めた。生存不能細胞はＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）染色
によって判別した。染色した試料をＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞表面タンパク質発現に関して分析した。結果はＦｌｏ
ｗｊｏを使用して分析し、データはＤＡＰＩ陰性生存細胞集団の％として提示した。
ゲノムＤＮＡ調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。エレクトロポレーションの
１日および８日後に、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒ
ｅ カタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用して編集済みおよび未編集ＨＳＰＣからゲノム
ＤＮＡを調製した。
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＰＦＨまたはＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハ
ンサー領域を標的化して遺伝子破壊すると、γ－グロビン発現の抑制が解除されて、高い
ＨｂＦタンパク質を含有する赤血球細胞（胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本
明細書において「Ｆ－細胞」と称されることもある）の産生が可能になると考えられる。
高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β－サラセミアおよびＳＣＤ
の両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者
由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例
えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤、例えば国際公開第２０１０／０５９４０
１号パンフレット（この内容は全体として参照により援用される）に記載されるとおりの
もの、例えば化合物４と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの
送達用量が増加した。
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞お
よび組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠
である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ
）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異
的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９－ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に
染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する
。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを
使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化す
る。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより
臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａ
ｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験
概要は図１７に示す。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し
、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化
して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのリス
トは、表２３に示す。「材料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレーションに
よってＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の
送達前に細胞は増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによっ
て送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
エレクトロポレーション１日後のパーセント細胞回収率は７２．５％～８９．８％の範
囲であり、未編集であるがエレクトロポレートした対照を含め、条件間で同様であった（
表２３）。ゲノム編集済みおよび未編集ＨＳＰＣをＣＤ３４＋細胞増殖培地での増殖に関
して分析した。増殖は７日間で編集済み細胞培養物について４．８倍～１７．３倍の範囲
であり、未編集の細胞について１９．３～２０．５倍の範囲であった（表２２）。表面マ
ーカー発現によって決定するとき、未編集対照と比較して培養物における細胞型の組成が
、ＨＰＦＨまたはＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー領域を標的とする本研究におけるｄ
ｇＲＮＡによる編集によって変化することはなく、これらの条件下でこれらの部位のター
ゲティングによってはＨＳＰＣ運命が変化しないことが示された（図２６Ａ～図２６Ｂ）
。対照的に、ＢＣＬ１１Ａエクソンのｇ８を標的とするｄｇＲＮＡで編集すると、増殖は
中程度の低下となったが、細胞組成の顕著なシフトが起こり、特に全ＣＤ３４＋ ＨＳＰ
ＣサブタイプならびにＣＤ７１＋赤血球系集団のパーセンテージが減少し、およびＣＤ１
４＋単球およびＣＤ１５＋顆粒球集団のパーセンテージが増加した（表２３および図２６
Ａ～図２６Ｂ）。顆粒球／マクロファージ前駆細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ）の頻度は
編集済み培養物間で同様で、未編集の培養物（１０００細胞当たり１５４～１８５ＣＦＵ
）と比較して編集済み培養物ではＣＦＵの低下は僅かであった（１０００細胞当たり９５
～１４５ＣＦＵの範囲）ことから、これらの部位を標的化することにより顆粒球／マクロ
ファージ前駆細胞機能が著しく変化することはないことが示唆される（表２３）。
実施例４．６
方法：方法は、以下の点を除いて実施例４にあるとおりである。
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰ
Ｃの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。一部の例では、２つの
異なる標的化ドメインを含むｃｒＲＮＡを同じ細胞培養物に送達した。このような場合、
細胞に送達される全ＲＮＰは、サブ実施例４．１にあるとおり、６μｇのＣａｓ９、３μ
ｇのｃｒＲＮＡおよび３μｇのＴｒａｃｒを含んだ。しかしながら、各１．５μｇを含む
２つのｃｒＲＮＡは、１．５μｇ Ｔｒａｃｒおよび３μｇ Ｃａｓ９を含むＴｒａｃｒ
／ＣＡＳ９混合物と独立に複合体化し、細胞に加えるときにのみ組み合わせた。遠心によ
って収集したＨＳＰＣをＰ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ カタログ番号ＰＢＰ３－００６
７５）に２．５×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを２０μＬの細胞と上下
にピペッティングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。４Ｄ－Ｎｕ
ｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ－１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物
（２０μＬ）をエレクトロポレートした。エレクトロポレーションはデュプリケートで実
施した。ｄｇＲＮＡフォーマットは、配列番号７８０８を有するｔｒａｃｒ、および配列
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒ
ＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（式
中、ｒはＲＮＡ塩基を示し、ｍは２’Ｏ－メチル修飾を有する塩基を示し、および＊はホ
スホロチオエート結合を示し、およびＮは、指示される標的化ドメインの残基を示す）の
ｃｒＲＮＡを使用した。
インビトロ赤血球新生およびＨｂＦを含有する赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。３
日後に細胞培養物を新鮮培地に希釈した。
ゲノムＤＮＡ調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。エレクトロポレーションの
３日後に、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ カタロ
グ番号ＱＥ０９０５０）を使用して編集済みおよび未編集ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを調
製した。
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＰＦＨまたはＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハ
ンサー領域を標的化して遺伝子破壊すると、γ－グロビン発現の抑制が解除されて、高い
ＨｂＦタンパク質を含有する赤血球細胞（胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本
明細書において「Ｆ－細胞」と称されることもある）の産生が可能になると考えられる。
高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β－サラセミアおよびＳＣＤ
の両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者
由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例
えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤、例えば国際公開第２０１０／０５９４０
１号パンフレット（この内容は全体として参照により援用される）に記載されるとおりの
もの、例えば化合物４と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの
送達用量が増加した。
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞お
よび組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠
である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ
）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異
的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９－ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に
染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する
。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを
使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化す
る。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより
臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａ
ｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験
概要は図１７に示す。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し
、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化
して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのリス
トは、表２４に示す。「材料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレーションに
よってＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋ ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の
送達前に細胞は増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによっ
て送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
ゲノム編集済みおよび未編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体
を使用して胎児グロビンならびに２つの赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受
容体（ＣＤ７１）およびグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現レベルをフローサイトメ
トリーによって分析した。Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ Ｖｉｏｌｅｔの除外によって生存細胞を
同定し、ゲーティングした。ＨＰＦＨ領域またはＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーを標
的化すると、モックエレクトロポレート細胞と比較して、ＨｂＦを含有する赤血球系細胞
のパーセンテージが増加した（表２４）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の
標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の誘導も並行して観察された。Ｈ
ＰＦＨ領域およびＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーを同じ細胞集団中で同時に標的化し
たとき、ＨｂＦ含有細胞のパーセンテージは、いずれか一方の領域を独立に標的化した場
合を上回って増加した（表２４）。したがって、編集済み細胞に由来するＨｂＦ含有赤血
球の増加は、ＨＰＦＨ領域またはＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーのいずれかを標的化
することによって実現できると共に、両方の領域を同時に標的化することによっても一層
高い程度で実現できる。
両方の領域のゲノムＰＣＲ産物を独立に次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供して、細
胞集団中における編集されたアレルのパーセンテージを決定した。Ｃａｓ９、所与の標的
化ドメインのｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒを含有するＲＮＰをエレクトロポレートした細
胞培養物ではゲノム編集が観察されたが（表２４）、標的化ドメインを送達しない対照細
胞（Ｃａｓ９およびＴｒａｃｒのみを含むＲＮＰ）では観察されなかった。２つの部位を
標的とするＲＮＰを同じ細胞集団に送達したとき、両方の部位における編集が観察された
（表２４）。一部の例では、２つのＲＮＰを送達したとき、１つのみのＲＮＰを送達した
ときと比較して、所与の部位におけるパーセント編集済み細胞がやや低下し（表２４）、
これは恐らく、所与の部位を標的化するＲＮＰ濃度が前者の例では低かったことに起因し
た。２つのＲＮＰを同時に送達する場合、各個別のＲＮＰ濃度を増加させることにより、
より高い編集率パーセンテージおよび潜在的にはより高いＨｂＦ含有細胞パーセンテージ
を実現し得る。ゲノム編集済み細胞に由来するＨｂＦ含有赤血球の増加は、鎌状化の低下
による治療的意味を有するものと思われる。
実施例４．７
方法：方法は、以下の点を除いて実施例４にあるとおりである。
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。ヒトＣＤ３４＋細胞は骨髄に由来した（Ｌｏｎｚａ、カタロ
グ番号２Ｍ－１０１Ｄ）。ＣＤ３４＋細胞を解凍し、ＲＮＰ送達前に増殖培地で２日間増
殖させた。
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰ
Ｃの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。シングルガイドＲＮＡ
（ｓｇＲＮＡ）を用いるＲＮＰの形成については、５μＬの総容積中の６μｇのＣａｓ９
タンパク質（０．８～１μＬ中）および０．５μＬの５×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣＬ、５ｍＭ ＭｇＣＬ２、５％グリセロールおよび新たに添加
した１ｍＭ ＤＴＴ）に６μｇのｓｇＲＮＡを加え、３７℃で５分間インキュベートした
。ＨＳＰＣを遠心によって収集し、Ｐ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ カタログ番号ＰＢＰ
３－００６７５）に６．４×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを２０μＬの
細胞と上下にピペッティングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。
４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ－１３７を用いてＲＮＰ／
細胞混合物（２０μＬ）をエレクトロポレートした。エレクトロポレーションはデュプリ
ケートで実施した。ｄｇＲＮＡについては、ｄｇＲＮＡ－ＰＳおよびｄｇＲＮＡ－ＯＭｅ
ＰＳ Ｔｒａｃｒは配列番号６６６０であり、但しｇ８は除き、これはｔｒａｃｒ配列番
号７８０８と使用した。この実験で使用した全てのｇＲＮＡのフォーマットを表３６に示
し、但しｄｇＲＮＡ ｇ８ ＯＭｅＰＳは除き、これは配列ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＣ＊ＡＡＡＣ
ＧＧＡＡＡＣＡＡＵＧＣＡＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵを有するｃ
ｒＲＮＡおよび配列番号７８０８の配列を有するｔｒａｃｒを含んだ。
インビトロ赤血球新生およびＨｂＦを含有する赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。Ｒ
ＮＰ送達後、細胞をプロトコル１またはプロトコル２に従い維持した。プロトコル１につ
いては、細胞は直ちに、ＥＤＭおよび補足物からなる予め温めた培地に移した。培養０～
７日目の間、ＥＤＭには、１μＭヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ Ｈ８６７２）、１００
ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１
１３）、および５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１０７７９－５９８
）をさらに補足した。培養７～１１日目の間、ＥＤＭには１００ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦ
のみを補足した。培養１１～２１日目の間、ＥＤＭに追加の補足はしなかった。７日目に
細胞培養物を４．０×１０４細胞／ｍｌに調整した。１１、１４および１９日目に培地を
補充した。プロトコル２については、細胞を直ちに２００μｌ増殖培地に戻し、さらに２
日間増殖させた。ＲＮＰ送達２日後に培養物をカウントした。次に細胞をペレット化し、
ＥＤＭおよび補足物からなる予め温めた培地に再懸濁した。ＥＤＭ培養０～７日目の間、
ＥＤＭには、１μＭヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ Ｈ８６７２）、１００ｎｇ／ｍＬヒ
トＳＣＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３）、およ
び５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１０７７９－５９８）をさらに補
足した。培養７～１１日目の間、ＥＤＭには１００ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦのみを補足し
た。培養１１～２１日目の間、ＥＤＭに追加の補足はしなかった。細胞培養は０日目に４
．０×１０４細胞／ｍｌで開始し、４日目に新鮮培地で４倍希釈し、および７日目に２．
０×１０５細胞／ｍｌに調整した。１１、１４および１９日目に培地を補充した。７、１
８および２１日にＥＤＭ培養物中の生存細胞をカウントした。生存細胞数は全て、Ａｃｃ
ｕＣｈｅｃｋ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番
号ＰＣＢ１００）を用いたフローサイトメトリーにより、ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジ
ノ－２－フェニルインドール）染色によって生存不能細胞を判別して決定した。両方のプ
ロトコルとも、赤血球系分化培養７、１４および２１日目に、細胞をＨｂＦ発現に関して
細胞内染色によって分析した。１４日目および２１日目に、ＨｂＦ発現に関する細胞内染
色に抗ＣＤ７１および抗ＣＤ２３５ａ抗体は含まず、生存細胞集団全体におけるＨｂＦ陽
性細胞（Ｆ－細胞）の％を報告した。生死判別色素としてＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標
）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦ
ｉｓｈｅｒ Ｌ３４９７５）を使用した。
ゲノムＤＮＡ調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。プロトコル２によって培養
した編集済みおよび未編集のＨＳＰＣから、エレクトロポレーションの２日および６日後
にＱｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ カタログ番号Ｑ
Ｅ０９０５０）を使用してゲノムＤＮＡを調製した。
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＰＦＨ領域を標的化して遺伝子破壊すると
γ－グロビン発現の抑制が解除され、高いＨｂＦタンパク質を含有する赤血球細胞（胎児
ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「Ｆ－細胞」と称されることも
ある）の産生が可能になると考えられる。高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌
状化を防ぎ、β－サラセミアおよびＳＣＤの両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る
。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳ
ＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤
、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は全体として参照
により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と併用すると、エキソビ
ボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞お
よび組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠
である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ
）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異
的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９－ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に
染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する
。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを
使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化す
る。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより
臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａ
ｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験
概要は図１７に示す。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し
、合成シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなるデュ
アルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成
した。本研究に使用したｇＲＮＡのフォーマットは、表３６に示す。「材料および方法」
に記載されるとおりエレクトロポレーションによってＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋ ＨＳＰ
Ｃにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の送達前に、ある場合には（プロトコル２）
エレクトロポレーション後にも細胞を増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクト
ロポレーションによって送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
ＨＰＦＨ領域のゲノムＰＣＲ産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し、細胞集団
中の編集されたアレルのパーセンテージを決定した。Ｃａｓ９、所与の標的化ドメインの
ｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒを含有するＲＮＰをエレクトロポレートした細胞培養物では
ＨＦＰＨ遺伝子座におけるゲノム編集が観察されたが（図４３）、標的化ドメインを送達
しない対照細胞（Ｃａｓ９およびＴｒａｃｒのみを含むＲＮＰ）では観察されなかった。
一部の例では、修飾ｓｇＲＮＡを使用した所与の標的部位における編集率が、他のｇＲＮ
Ａフォーマットと比べて高かった（図４３）。最後に、各ｇＲＮＡについてインデルパタ
ーンならびに各インデルの頻度をＮＧＳによって評価した。同じｇＲＮＡ／Ｃａｓ９を使
用した複数のレプリケート間でインデルパターンは同様であった。各標的部位に最も高頻
度に出現する代表的なインデルを表３７に示す。
ゲノム編集済みおよび未編集ＨＳＰＣについて、三段階赤血球系分化細胞培養プロトコ
ルで増殖およびＨｂＦ上方制御に関して分析した。ゲノム編集済みおよび未編集ＨＳＰＣ
について、胎児グロビンの発現レベルをフローサイトメトリーによって分析し、７日目に
、２つの赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）およびグリコ
ホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）について、蛍光色素にコンジュゲートした抗体を使用して分析
した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ死細胞染色の除外によって生存細胞を同定し
、ゲーティングした。含まれたＨＰＦＨ領域標的化およびＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハン
サー標的化ｇＲＮＡによるゲノム編集は、培養細胞が分化７日目に未編集の細胞と同様の
赤芽球と一致するＣＤ７１＋細胞のパーセンテージを示したとおり、赤血球系分化に悪影
響を及ぼさなかったが、プロトコル１およびプロトコル２は条件間でＣＤ７１＋のパーセ
ンテージに違いがあった（図４４）。含まれたＨＰＦＨ領域標的化およびＢＣＬ１１Ａ赤
血球系エンハンサー標的化ｇＲＮＡで培養物を処理すると、２１日間の培養期間全体を通
じてモックエレクトロポレート細胞と比較して、およびこれらの２つのプロトコル間で、
ＨｂＦを含有する赤血球系細胞のパーセンテージの相対的変化は同様のパターンになった
（図４５、図４６および図４７）。ＲＮＰに曝露し、かつプロトコル１またはプロトコル
２のいずれかで維持した細胞ではＨｂＦが誘導されたが、しかしながら、ＨｂＦ陽性の細
胞のパーセンテージはプロトコル２を用いた条件および時点で低くなる傾向があった（図
４５、図４６および図４７）。ＨｂＦの誘導は、標的ドメインＣＲ００１０３０、ＣＲ０
０３１２およびＣＲ００１１２８からなるｇＲＮＡで、特に遅い時点において最も顕著で
あった（図４５、図４６および図４７）。標的化ドメイン間では、ｓｇＲＮＡ、特にＯＭ
ｅＰＳ修飾ｓｇＲＮＡが、ｄｇＲＮＡよりも高いＨｂＦを誘導する傾向があった（図４５
、図４６および図４７）。標的化ドメインＣＲ００１１３７による比較的低いＨｂＦの誘
導は、この標的部位における低い編集レベルによって説明し得る（図４３、図４５～図４
７）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡに
よるＨｂＦ陽性細胞の誘導も並行して観察された（図４５～図４７）。ゲノム編集済み細
胞に由来するＨｂＦ含有赤血球の増加は、鎌状化の低下による治療的意味を有するものと
思われる。編集済み細胞は、赤血球系分化条件下で増殖能を有したが（７日目に９～５３
倍および２１日目に３６～１４３倍、図４８）、しかしながら、ある場合には、未編集対
照細胞と比べて増殖は抑制された（７日目に未編集対照の１４～８３％および２１日目に
未編集対照の１８～９５％）（図４８）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の
標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡ（７日目に未編集対照の３０％および２１日目に未編集
対照の１８％）およびＯＭｅＰＳ修飾ｓｇＲＮＡの多くによって編集した細胞で最も低い
増殖が観察された（図４８）。
実施例５ ＨＰＦＨ領域に対する２つのｇＲＮＡを使用した切り出し
初代ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＰＣに、ＨＰＦＨ領域内の異なる部位に対する２つの異なる
ｇＲＮＡ分子を含有するＲＮＰをエレクトロポレートした。各ＲＮＰに、上記に記載した
とおりのｄｇＲＮＡ分子を使用した。簡潔に言えば、フランス型ＨＰＦＨ領域内の第１の
部位を標的とするｄｇＲＮＡを含むＲＮＰと、フランス型ＨＰＦＨ領域内の第２の部位を
標的とするｄｇＲＮＡを含むＲＮＰとを以下の比で組み合わせて、ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣ
にエレクトロポレートした：０．５×第１のｄｇＲＮＡ ＲＮＰ＋０．５×第２のｄｇＲ
ＮＡ ＲＮＰ；１．０×ｇ２ ｄｇＲＮＡ（「ｇ２」＝ＢＣＬ１１ａ遺伝子のコード配列
を標的とする、ＣＲ００００８８の標的化ドメインを含む陽性対照）；ＲＮＰなし（「対
照」）。上記に記載されるプロトコルを用いて細胞を上記に記載したとおり培養し、赤血
球に分化させた（図１７を参照されたい）。胎児ヘモグロビン発現を評価した。結果は図
２７および表２５に示す。理論によって拘束されるものではないが、２つの標的配列に対
するｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰを同時に導入すると、その領域内に含まれる任意の調節配
列またはコード配列を含め、２つの切断部位間のＤＮＡ（例えば、２つの切断部位間にあ
る全てまたはほとんどのＤＮＡ）の欠失（すなわち、切り出し）が起こることになると考
えられる。これらの結果は、ＨＰＦＨ領域内の２つの別個の領域を標的とするＲＮＰをエ
レクトロポレーションによってＣＤ３４＋ ＨＳＰＣに同時に送達して、赤血球に分化し
た編集済み細胞に胎児ヘモグロビン発現を誘導できたことを示している。
実施例６．ＢＣＬ１１ａエンハンサーを標的とするｇＲＮＡの潜在的オフターゲット編集
の評価
オリゴ挿入に基づくアッセイ（例えば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．３３，１８７－１９７；２０１５を参照されたい）を用いて、
ＢＣＬ１１ａエンハンサーを標的とするＣａｓ９によって切断される潜在的オフターゲッ
トゲノム部位を決定した。ＢＣＬ１１ａエンハンサーを標的とする合計２８個のガイド（
指示される標的化ドメインを含むデュアルガイドＲＮＡ）およびＨＰＦＨ領域を標的とす
る１０個のｇＲＮＡを上記に記載されるＣａｓ９発現ＨＥＫ２９３細胞でスクリーニング
した。結果は図３３（ＢＣＬ１１ａエンハンサー）および図４９（ＨＰＦＨ）にプロット
する。ＢＣＬ１１ａエンハンサーを標的とするｇＲＮＡに関して、このアッセイで一部の
ガイドの潜在的オフターゲット部位が同定されたが、しかしながら標的ディープシーケン
シングを用いて、それらの潜在的な部位が本当にＣａｓ９によって切断されるオフターゲ
ット部位かどうかを決定した。潜在的オフターゲット部位に隣接するプライマーを用いて
単離ゲノムＤＮＡを増幅し、アンプリコンをシーケンシングした。潜在的オフターゲット
部位がＣａｓ９によって切断された場合、その部位にインデルが検出されるはずである。
ガイドＲＮＡの少なくとも３つ：ＣＲ０００３１１、ＣＲ０００３１２、ＣＲ００１１２
８について、これらの潜在的オフターゲット部位に関する後続研究からは、潜在的オフタ
ーゲット部位にインデルは検出されなかった。ＢＣＬ１１ａエンハンサーを標的とするｇ
ＲＮＡに関しては、少なくともｇＲＮＡ、ＣＲ００１１３７、ＣＲ００１２１２、および
ＣＲ００１２２１について、このアッセイでいかなる潜在的オフターゲット部位も同定さ
れなかった。標的ディープシーケンシングを実施して、他のｇＲＮＡ分子について同定さ
れた潜在的オフターゲット部位が本当にＣａｓ９によって切断されるオフターゲット部位
かどうかを決定することになる。
実施例７：Ｃａｓ９変異体の評価
ＣＤ３４＋造血幹細胞における評価
本発明者らは、初代ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）におけるβ－２－ミクログロブリン（Ｂ
２Ｍ）遺伝子のノックアウト効率を計測することにより、１４個の精製化膿レンサ球菌（
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳＰｙＣａｓ９）タンパク
質を評価した。これらのタンパク質は３群に分けた：第１群は、選択性が向上したＳＰｙ
Ｃａｓ９変異体からなった（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ３５１：８４（ｅ１．０、ｅ１．１およびＫ８５５Ａ）；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ
ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｎａｔｕｒｅ ５２９：４９０（ＨＦ））。第２群は、数および
／または位置が異なるＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）および切断可能なＴＥＶ部位を
伴うまたは伴わない６×ヒスチジン（Ｈｉｓ６）または８×ヒスチジン（Ｈｉｓ８）タグ
を含む野生型ＳＰｙＣａｓ９、および２つのシステイン置換（Ｃ８０Ｌ、Ｃ５７４Ｅ）（
構造研究用にＣａｓ９を安定化させることが報告されている（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ
ａｌ．２０１４，Ｃｅｌｌ １５６：９３５））を有するＳＰｙＣａｓ９タンパク質か
らなった。第３群は、異なるプロセスによって作製した同じ組換えＳＰｙＣａｓ９からな
った（図６０）。Ｂ２ＭノックアウトはＦＡＣＳおよび次世代シーケンシング（ＮＧＳ）
によって決定した。
方法
材料
１．Ｎｅｏｎエレクトロポレーション機器（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＰＫ５０００）
２．Ｎｅｏｎエレクトロポレーションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＰＫ１０２５）
３．ｃｒＲＮＡ（ＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＵＣＵの標的化ドメイン配列、Ｂ
２Ｍ遺伝子中の配列と相補的、配列番号６６０７と融合）
４．ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号６６６０）
５．Ｃａｓ９保存緩衝液：２０ｍＭトリス－Ｃｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＫＣｌ、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ２
６．骨髄由来ＣＤ３４＋ ＨＳＣ（Ｌｏｎｚａ、２Ｍ－１０１Ｃ）
７．細胞培養培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳｔｅｍＳｐａｍ
ＳＦＥＭ ＩＩ、ＳｔｅｍＳｐａｍ ＣＣ－１００含有）
８．ＦＡＣＳ洗浄緩衝液：ＰＢＳ中２％ＦＣＳ
９．ＦＡＣＳブロック緩衝液：ＰＢＳ１ｍＬ当たり、０．５ｕｇマウスＩｇＧ、１５０ｕ
ｇ Ｆｃブロック、２０μＬ ＦＣＳを添加
１０．Ｃｈｅｌｅｘ懸濁液：Ｈ２Ｏ中１０％Ｃｈｅｌｅｘ １００（ｂｉｏＲａｄ、カタ
ログ番号１４２－１２５３）
１１．抗Ｂ２Ｍ抗体：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１６３０４
プロセス
Ｌｏｎｚａの推奨に従い細胞を解凍して成長させ、２～３日おきに培地を加える。５日
目、細胞を２００×ｇで１５分間ペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄し、細胞をＮＥＯＮキ
ットのＴ－緩衝液に２×１０４／μＬで再懸濁し、氷上に置く。Ｃａｓ９タンパク質をＣ
ａｓ９保存緩衝液で５ｍｇ／ｍｌに希釈する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをＨ２
Ｏで１００μＭに再構成する。各０．８μＬのＣＡＳ９タンパク質、ｃｒＲＮＡおよびｔ
ｒａｃｒＲＮＡを０．６μＬのＣａｓ９保存緩衝液と混合することによりリボ核タンパク
質（ＲＮＰ）複合体を作製し、室温で１０分間インキュベートする。７μＬのＨＳＣをＲ
ＮＰ複合体と２分間混合し、１０μＬ全てをＮｅｏｎピペットティップに移し、１７００
ｖ、２０ｍｓおよび１パルスでエレクトロポレートする。エレクトロポレーション後直ち
に、３７℃、５％ＣＯ２で予めキャリブレーションした１ｍｌ培地が入った２４ウェルプ
レートのウェルに細胞を移す。エレクトロポレーション後７２時間でＦＡＣＳおよびＮＧ
Ｓ分析のため細胞を回収する。
ＦＡＣＳ：２４ウェルプレートの各ウェルから２５０μＬの細胞を９６ウェルＵ底プレ
ートのウェルに取り、細胞をペレット化する。２％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）－ＰＢＳで１
回洗浄する。細胞に５０μＬ ＦＡＣＳブロック緩衝液を加え、氷上で１０分間インキュ
ベートし、１μＬ ＦＩＴＣ標識Ｂ２Ｍ抗体を加え、３０分間インキュベートする。１５
０μＬ ＦＡＣＳ洗浄緩衝液で１回洗浄し、続いてもう１回２００μＬ ＦＡＣＳ洗浄緩
衝液で１回洗浄する。細胞を２００μＬ ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁してＦＡＣＳ分析を行
った。
ＮＧＳ試料調製：２４ウェルプレートの各ウェルから２５０μＬの細胞懸濁液を１．５
ｍｌエッペンドルフチューブに移し、１ｍＬ ＰＢＳを加え、細胞をペレット化する。１
００μＬのＣｈｅｌｅｘ懸濁液を加え、９９℃で８分間インキュベートして１０秒間ボル
テックスし、続いて９９℃で８分間インキュベートし、１０秒間ボルテックスする。１０
，０００×ｇで３分間遠心することにより樹脂をペレットダウンさせて、上清ライセート
をＰＣＲに使用する。４μＬライセートを取り、Ｔｉｔａｎｉｕｍキット（Ｃｌｏｎｅｔ
ｅｃｈ、カタログ番号６３９２０８）を使用して、かつ製造者の指示に従い、ｂ２ｍプラ
イマー（ｂ２ｍｇ６７Ｆ：ＣＡＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴ、ｂ２ｍｇ６７
Ｒ：ＣＴＧＡＣＧＣＴＴＡＴＣＧＡＣＧＣＣＣＴ）でＰＣＲ反応を行う。以下のＰＣＲ条
件を用いる：９８℃で５分を１サイクル；９５℃で１５秒、６２℃で１５秒、および７２
℃で１分を３０サイクル；および最後に７２℃で３分を１サイクル。このＰＣＲ産物をＮ
ＧＳに使用した。
統計：ＦＡＣＳによるＢ２Ｍ ＫＯ細胞のパーセンテージおよびＮＧＳによるインデル
のパーセンテージを用いてＣＡＳ９切断効率を評価する。この実験はＣａｓ９を固定効果
として設計した。各実験は、入れ子型変量効果として、ドナー内に入れ子になっている。
したがって、ＦＡＣＳおよびＮＧＳデータの分析には混合線形モデルを適用した。
結果
実験およびドナーのばらつきを正規化するため、本発明者らは、２つのＳＶ４０ ＮＬ
Ｓが野生型ＳＰｙＣａｓ９に隣接し、かつタンパク質のＣ末端のＨｉｓ６タグを含む元の
設計であるｉＰｒｏｔ１０５０２６に対する各タンパク質の相対活性をグラフ化した（図
３４）。統計的分析は、参照Ｃａｓ９タンパク質ｉＰｒｏｔ１０５０２６と比較して、ｉ
Ｐｒｏｔ１０６３３１、ｉＰｒｏｔ１０６５１８、ｉＰｒｏｔ１０６５２０およびｉＰｒ
ｏｔ１０６５２１のＨＳＣにおけるＢ２Ｍのノックアウトに有意な差はないが、試験した
他の変異体（ＰＩＤ４２６３０３、ｉＰｒｏｔ１０６５１９、ｉＰｒｏｔ１０６５２２、
ｉＰｒｏｔ１０６５４５、ｉＰｒｏｔ１０６６５８、ｉＰｒｏｔ１０６７４５、ｉＰｒｏ
ｔ１０６７４６、ｉＰｒｏｔ１０６７４７、ｉＰｒｏｔ１０６８８４）はＨＳＣにおける
Ｂ２Ｍのノックアウトに参照ｉＰｒｏｔ１０５０２６と比べて大きい有意差があることを
示している。本発明者らは、Ｈｉｓ６タグをＣ末端からＮ末端に動かしても（ｉＰｒｏｔ
１０６５２０）、タンパク質の活性に影響が及ばないことを見出した（図３４）。ＮＬＳ
がタンパク質のＣ末端に配置された場合に限り、活性を維持するのに１つのＮＬＳで十分
であった（ｉＰｒｏｔ１０６５２１対ｉＰｒｏｔ１０６５２２、図３４）。プロセス１か
ら精製したタンパク質は、一貫してプロセス２および３よりも高いノックアウト効率を有
した（ｉＰｒｏｔ１０６３３１対ｉＰｒｏｔ１０６５４５およびＰＩＤ４２６３０３、図
３４）。一般に、既報告の向上した選択性を有するＳＰｙＣａｓ９変異体は、野生型ＳＰ
ｙＣａｓ９ほど活性でなかった（ｉＰｒｏｔ１０６７４５、ｉＰｒｏｔ１０６７４６およ
びｉＰｒｏｔ１０６７４７、図３４）。興味深いことに、ｉＰｒｏｔ１０６８８４は標的
化部位を切断しなかった。これは、この変異体が哺乳動物細胞における論理的な標的化部
位の最大２０％を切断できなかったというＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌによる報
告と一致する（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｎａｔｕｒｅ ５２９
：４９０）。最後に、２つのシステイン置換を含むＣａｓ９変異体（ｉＰｒｏｔ１０６５
１８）は高レベルの酵素活性を維持した（図３４）。
次に、＋５８エンハンサー領域を標的とする修飾ｇＲＮＡまたは非修飾ｇＲＮＡのいず
れかと共に、異なるＣａｓ９変異体を含むＲＮＰの編集効率を試験した。非修飾（ＣＲ０
０３１２＝配列番号３４２；ＣＲ００１１２８＝配列番号３４７）または修飾（ＯＭｅＰ
Ｓ ＣＲ００３１２＝配列番号１７６２；ＯＭｅＰＳ ＣＲ００１１２８＝配列番号１７
６３）のいずれかでｃｒ００３１２およびｃｒ１１２８の標的化ドメインを含むｓｇＲＮ
Ａ分子を試験し、表３５に示すＣａｓ９変異体と予め複合体化した。
これらの実施例に記載されるとおり、上記に記載したとおり形成したＲＮＰを上記に記
載したとおりＨＳＰＣ細胞に送達し、％編集率（ＮＧＳによる）および赤血球系分化時の
％ＨｂＦ誘導に関して細胞を評価した。結果は図４２Ａ（％編集率）および図４２Ｂ（Ｈ
ｂＦ誘導）に示す。これらの結果は、試験した変異体間でＣａｓ９成分が異なっても非修
飾および修飾の両方のバージョンのｓｇＲＮＡ ＣＲ００３１２およびＣＲ００１１２８
の遺伝子編集効率は変わらず、Ｃａｓ９変異体が赤血球分化した遺伝子編集済み細胞のＨ
ｂＦ産生能力にも影響を与えなかったことを示している。
実施例８：遺伝子編集済みＨＳＰＣのエキソビボ増殖、およびＨＳＰＣサブセットにおけ
る編集分析
遺伝子編集前の細胞の増殖
ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞をＡｌｌＣｅｌｌｓ（カタログ番号：ＡＢＭ０１７Ｆ）または
Ｌｏｎｚａ（カタログ番号：２Ｍ－１０１Ｃ）のいずれかから購入し、５０ｎｇ／ｍＬの
トロンボポエチン（Ｔｐｏ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号３００－１８）、５０ｎ
ｇ／ｍＬのヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号３
００－１９）、５０ｎｇ／ｍＬのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタロ
グ番号３００－０７）、ヒトインターロイキン－６（ＩＬ－６、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カ
タログ番号２００－０６）、１％Ｌ－グルタミン；２％ペニシリン／ストレプトマイシン
、および化合物４（０．７５μＭ）を補足したＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣ
ｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０９６５０）を使用して２～３日間増
殖させた。
細胞へのＣａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のエレクトロポ
レーション
Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）はエレクトロポレーション
の直前に調製した。デュアルガイドＲＮＡを用いるＲＮＰの形成については、初めに各３
μｇのｃｒＲＮＡ（２．２４μＬ中）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（１．２５μＬ中）を別個
のチューブにおいて９５℃で２分間変性させて、次に室温に冷却した。Ｃａｓ９タンパク
質の調製のため、７．３μｇのＣａｓ９タンパク質（１．２１μＬ中）を０．５２μＬの
５×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣＬ、５ｍＭ ＭｇＣＬ２、
５％グリセロールおよび新たに添加した１ｍＭ ＤＴＴ）と混合した。初めにＴｒａｃｒ
ＲＮＡをＣａｓ９調製物と混合し、３７℃で５分間インキュベートした。次にＣｒＲＮＡ
をＴｒａｃｒＲＮＡ／ＣＡＳ９複合体に加え、３７℃で５分間インキュベートした。２０
０×ｇで１５分間遠心することによりＨＳＰＣを収集し、Ｎｅｏｎエレクトロポレーショ
ンキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号：ＭＰＫ１０９６）に付属するＴ緩衝液
に２×１０７／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを１２μＬの細胞と上下に３回穏や
かにピペッティングすることによって混合した。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）お
よびＣａｓ９複合体の調製には、２．２５μｇ ｓｇＲＮＡ（１．５μＬ中）を２．２５
μｇ Ｃａｓ９タンパク質（３μＬ中）と混合し、室温で５分間インキュベートした。次
にｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を１０．５μＬの２×１０７／ｍＬ細胞と上下に数回穏や
かにピペッティングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。ＲＮＰ／
細胞混合物（１０μＬ）をＮｅｏｎエレクトロポレーションプローブに移した。Ｎｅｏｎ
トランスフェクションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＭＰＫ５０００Ｓ）で１７００
ボルト／２０ミリ秒および１パルスを用いてエレクトロポレーションを実施した。
遺伝子編集後の細胞の増殖
エレクトロポレーション後、上記に記載したとおりの成長因子、サイトカインおよび化
合物４を補足した０．５ｍＬの予め温めたＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地に細胞を移し
、３７℃で３日間培養した。エレクトロポレーション前３日間およびエレクトロポレーシ
ョン後７日間の合計１０日間の細胞増殖の後、総細胞数は出発細胞数と比べて２～７倍増
加した（図３５）。
ゲノムＤＮＡ調製
エレクトロポレーションの４８時間後、編集済みおよび未編集ＨＳＰＣからゲノムＤＮ
Ａを調製した。１０ｍＭトリス－ＨＣＬ、ｐＨ８．０；０．０５％ＳＤＳおよび２５μｇ
／ｍＬの新たに添加したプロテアーゼＫ中に細胞を溶解させ、３７℃で１時間インキュベ
ートした後、８５℃で１５分間さらにインキュベートしてプロテアーゼＫを不活性化した
。
Ｔ７Ｅ１アッセイ
ＨＳＰＣの編集効率を決定するため、Ｔ７Ｅ１アッセイを実施した。Ｐｈｕｓｉｏｎ
Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号：Ｆ－５４９Ｌ）を以下のサイクル条件で用いてＰＣＲを
実施した：９８℃で３０秒；９８℃で５秒、６８℃で２０分、７２℃で３０秒を３５サイ
クル；７２℃で５分。以下のプライマーを使用した：フォワードプライマー：５’－ＡＧ
ＣＴＣＣＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＡＣＣＡＣＡＧＧＧ－３’およびリバースプライマー：５
’－ＴＡＣＡＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＧＣＡ－３’。以下の条件を用いて
ＰＣＲ産物を変性させてリアニーリングした：９５℃で５分、－２℃／ｓで９５～８５℃
、－０．１℃／ｓで８５～２５℃、４℃で保持。アニーリング後、１０μＬの上記のＰＣ
Ｒ産物に１μＬのミスマッチ高感受性Ｔ７ Ｅ１ヌクレアーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ
０３０２Ｌ）を加え、３７℃で１５分間さらにインキュベートしてヘテロ二重鎖を消化し
、得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル（２％）電気泳動によって分析した。編集効率は
ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／
）を用いて定量化した。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）用のＰＣＲ調製
編集効率ならびに挿入および欠失（インデル）のパターンをより正確に決定するため、
ＰＣＲ産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供した。Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｔａｑ Ｐ
ＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カタログ番号：６３９２１
０）を以下のサイクル条件で使用してＰＣＲをデュプリケートで実施した：９８℃で５分
；９５℃で１５秒、６８℃で１５秒、７２℃で１分を３０サイクル；７２℃で７分。以下
のプライマーを使用した：フォワードプライマー：５’－ＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＴＣＴＣ
ＡＡＡＣＣＡＣＡＧＧＧ－３’およびリバースプライマー：５’－ＴＡＣＡＡＴＴＴＴＧ
ＧＧＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＧＣＡ－３’。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動によ
って分析し、ディープシーケンシングにかけた。
造血幹細胞・前駆細胞サブ集団における編集効率のフローサイトメトリー分析
細胞をフローサイトメトリーに供して幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）サブ集団における
編集効率を特徴付けた。ゲノム編集前（培養下４８時間）およびゲノム編集後（培養下１
０日；ゲノム編集後３日）における、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ
３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞、およびＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ
４９ｆ＋細胞を含むＨＳＰＣサブセットの頻度を細胞培養物のサンプリングアリコートか
ら決定した（図３６、図３７、図３８）。細胞を抗ＣＤ３４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ、カタログ番号５５５８２４）、抗ＣＤ３８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタ
ログ番号５６０６７７）、抗ＣＤ９０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５
５５５９６）、抗ＣＤ４５ＲＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６３９
６３）、抗ＣＤ４９ｆ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６２５８２）と
共に、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４を補足したＰＢＳを含有する改良
ＦＡＣＳ緩衝液中、暗所下４℃で３０分間インキュベートした。細胞生存率は７ＡＡＤに
よって決定した。細胞を改良ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で多色ＦＡＣＳ分析を実施した。フローサイトメトリー結果はＦｌｏ
ｗｊｏソフトウェアを使用して分析した。化合物４（単独）の存在下で成長させたゲノム
編集済み細胞は、ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５Ｒ
Ａ－、およびＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４９ｆ＋サブセットを含め、評価
した全てのＨＳＰＣサブセットについて検出可能なレベルを呈したことから、ゲノム編集
後に化合物４（単独）の存在下で細胞培養物中に長期ＨＳＣ集団が存在し続けることが示
される（図３８）。
遺伝子編集の４時間後、細胞培養物のアリコートをサンプリングし、細胞をＨＳＰＣサ
ブセット（ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋ＣＤ
３８－ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ－、
ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０－ＣＤ４９ｆ－、およびＣＤ３４＋ＣＤ３
８－ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０－ＣＤ４９ｆ＋細胞）に選別し、ＮＧＳに供して編集効率を
計測した（表２８）。長期ＨＳＣが富化されたサブセットを含め、全ての造血サブセット
が、同様に高い遺伝子編集効率（＞９５％）を示した点に留意することが重要である。こ
れらの細胞は長期にわたる患者への生着能を有し、かつ生涯の造血多系統再生を維持する
ため、長期ＨＳＣにおけるこの高い遺伝子編集効率は大きい治療的影響を有する。
実施例９ 潜在的オフターゲット編集の評価
ＨＳＰＣ培養およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集
ＲＮＰ作成および細胞操作方法は、以下を除いて実施例４にあるとおりである。ヒトＣ
Ｄ３４＋細胞培養。ヒトＣＤ３４＋細胞は、成人ドナー由来のＧ－ＣＳＦ動員末梢血（Ａ
ｌｌＣｅｌｌｓ、カタログ番号ｍＰＢ０２５－Ｒｅｇ．Ｅ）から製造者の指示に従い免疫
選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて単離するか、または骨髄（Ｈｅｍａｃａｒｅ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号ＢＭ３４Ｃ－３）から誘導するかのいずれかであった。
ＣＤ３４＋細胞を解凍し、ＲＮＰ送達前に２日間または５日間増殖させた。ＲＮＰ送達後
、以下のとおり、細胞を増殖培地でさらに１３日間培養するか、または赤血球系分化培地
で７日または１１日間培養した。培養０～７日目の間、ＥＤＭには、１μＭヒドロコルチ
ゾン（Ｓｉｇｍａ Ｈ８６７２）、１００ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３）、および５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－３（Ｐ
ｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１０７７９－５９８）をさらに補足した。培養７～１１日目の間、
ＥＤＭには１００ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦのみを補足した。培養期間の終わりに、ゲノム
ＤＮＡ調製および分析用に細胞を回収した。
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰ
Ｃの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。遠心によって収集した
ＨＳＰＣをＰ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ カタログ番号ＰＢＰ３－００６７５）に再懸
濁した。ＲＮＰを２０μＬの細胞と上下にピペッティングすることにより混合し、室温で
２分間インキュベートした。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣ
Ｍ－１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物（２０μＬ）をエレクトロポレートした。配列Ｎ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵ
Ｇ（式中、Ｎは、指示される標的化ドメインの残基を示す）を有するｃｒＲＮＡと、配列
番号６６６０の配列を有するｔｒａｃｒとを含むｄｇＲＮＡを使用した。
ゲノムＤＮＡ抽出
製造者の推奨に従いＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号
６９５０６）を使用してＲＮＰ処理済みおよび未処理ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを単離し
た。
潜在的ｇＲＮＡオフターゲット遺伝子座のインシリコ同定
ＢＣＬ１１＋５８領域ｇＲＮＡ、ＣＲ００３０９、ＣＲ００３１１、ＣＲ００３１２、
ＣＲ００３１６、ＣＲ００１１２５、ＣＲ００１１２６、ＣＲ００１１２７、およびＣＲ
００１１２８、およびＨＰＦＨ領域ｇＲＮＡ、ＣＲ００１０２８、ＣＲ００１０３０、Ｃ
Ｒ００１１３７、ＣＲ００１２２１、ＣＲ００３０３５、およびＣＲ００３０８５の潜在
的オフターゲット遺伝子座を以下のとおり同定した。各ｇＲＮＡについて、ＢＦＡＳＴシ
ーケンスアライナー（バージョン０．６．４ｆ、Ｈｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ Ｏ
ｎｅ，２００９，４（１１），ｅ７７６７，ＰＭＩＤ：１９９０７６４２）を使用して、
最大５ヌクレオチドまでのミスマッチを許容する標準パラメータを用いて、２０ヌクレオ
チドｇＲＮＡプロトスペーサー配列をヒトゲノム参照配列（ｂｕｉｌｄ ＧＲＣｈ３８）
とアラインメントした。Ｃａｓ９カノニカル５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭ配列に隣接して５
’側にある部位のみを含むように同定された遺伝子座をフィルタリングした（すなわち５
’－オフターゲット遺伝子座－ＰＡＭ－３’）。ＢＥＤＴｏｏｌｓスクリプト（バージョ
ン２．１１．２、Ｑｕｉｎｌａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，
２０１０ ２６（６）：８４１－２，ＰＭＩＤ：２０１１０２７８）を用いて、５ヌクレ
オチドミスマッチを有する部位をＲｅｆＳｅｑ遺伝子アノテーションに対して、エクソン
としてアノテートされた遺伝子座のみを含むようにさらにフィルタリングした（Ｐｒｕｉ
ｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１４ ４２（Ｄａｔａ
ｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ７５６－６３，ＰＭＩＤ：２４２５９４３２）。ＢＣＬ１１
＋５８領域およびＨＰＦＨ領域ｇＲＮＡについて同定された潜在的オフターゲット遺伝子
座のカウントを、それぞれ表１および表２に示す。
潜在的オフターゲット部位の標的増幅用ＰＣＲプライマー設計
Ｐｒｉｍｅｒ３（バージョン２．３．６、Ｕｎｔｅｒｇａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１２ ４０（１５）：ｅ１１５，ＰＭＩＤ：２
２７３０２９３）を使用して、アンプリコンの中心にｇＲＮＡプロトスペーサー配列が位
置する約１６０～３００塩基対長のアンプリコンサイズ範囲を目標とするデフォルトパラ
メータを用いて、ＢＣＬ１１＋５８領域ｇＲＮＡ（ＣＲ００３０９、ＣＲ００３１１、Ｃ
Ｒ００３１２、ＣＲ００３１６、ＣＲ００１１２５、ＣＲ００１１２６、ＣＲ００１１２
７、およびＣＲ００１１２８）およびＨＰＦＨ領域ｇＲＮＡ（ＣＲ００１０２８、ＣＲ０
０１０３０、ＣＲ００１１３７、ＣＲ００１２２１、ＣＲ００３０３５、およびＣＲ００
３０８５）について同定された潜在的オフターゲット遺伝子座（およびオンターゲット遺
伝子座）を標的とするＰＣＲアンプリコンを設計した。ｇＲＮＡ ＣＲ００１１２７につ
いては、ＰＣＲプライマーは０～４ヌクレオチドミスマッチを含む部位のみを設計し、Ｒ
ｅｆＳｅｑエクソン内に５ヌクレオチドミスマッチを含む部位のプライマーは設計しなか
った。得られたＰＣＲプライマー対およびアンプリコン配列は、ヒトゲノム参照配列（ｂ
ｕｉｌｄ ＧＲＣｈ３８）に対して配列をＢＬＡＳＴ検索（バージョン２．２．１９、Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５（３）：４０
３－１０，ＰＭＩＤ：２２３１７１２）することによりユニークさを調べた。２つ以上の
アンプリコン配列をもたらすプライマー対は破棄し、設計し直した。表３および表５は、
それぞれＢＣＬ１１＋５８領域およびＨＰＦＨ領域ｇＲＮＡについて設計した成功するＰ
ＣＲプライマー対のカウントを示す。
Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリ調製、定量化およびシーケンシング
製造者の推奨を用いてＱｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡキット（Ｔ
ｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｐ７５８１）を使用して、ＲＮＰ処理済み（ｇ
ＲＮＡ当たり２レプリケート）、および未処理（ｇＲＮＡ当たり１レプリケート）のＨＳ
ＰＣ試料からのゲノムＤＮＡを定量化した。各試料について、二連続ＰＣＲ反応を用いて
、個々のオフターゲット遺伝子座（およびオンターゲット遺伝子座）を標的とするＩｌｌ
ｕｍｉｎａシーケンシングライブラリを作成した。最初のＰＣＲでは、ユニバーサルなＩ
ｌｌｕｍｉｎａシーケンシング適合配列をテール付加した標的特異的ＰＣＲプライマー（
上記で設計した）を使用して標的遺伝子座を増幅した。２回目のＰＣＲでは、シーケンシ
ング時の多重化を可能にするサンプルバーコードを含め、追加的なＩｌｌｕｍｉｎａシー
ケンシング適合配列を最初のＰＣＲアンプリコンに加えた。ＰＣＲ１は１０μＬの最終容
積で実施し、各反応には、３～６ｎｇのｇＤＮＡ（約５００～１０００細胞相当）、０．
２５μＭの最終濃度のＰＣＲ１プライマー対（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１×最終濃度のＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍ
ｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号１０２５００－１４０）
が含まれた。ＰＣＲ１左プライマーは、配列５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡ
ＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’で５’テールが付加され（すなわち５’－テー
ル－標的特異的左プライマー－３’）、および右プライマーは、配列５’－ＧＴＣＴＣＧ
ＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’で５’テールが付加
された（すなわち５’－テール－標的特異的右プライマー－３’）。ＰＣＲ１は、サーモ
サイクラーで以下のサイクル条件を用いて実施した：９８℃で１分を１サイクル；９８℃
で１０秒、６３℃で２０秒、および７２℃で３０秒を２５サイクル；７２℃で２分を１サ
イクル。次にヌクレアーゼフリー水（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ９９３２）を使用
してＰＣＲ１を１００に対して１で希釈し、ＰＣＲ２への入力として使用した。ＰＣＲ２
は１０μＬの最終容積で実施し、各反応には、２μＬの希釈したＰＣＲ１産物、０．５μ
Ｍの最終濃度のＰＣＲ２プライマー対（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ）および１×最終濃度のＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号１０２５００－１４０）が含ま
れた。使用したＰＣＲ２左プライマー配列は５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣ
ＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ－３’であり
、使用したＰＣＲ２右プライマー配列は５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣ
ＧＡＧＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ－３’であった（式中、Ｎ
ＮＮＮＮＮＮＮは、標準Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプロセスの一部としてサンプル
多重化に使用した８ヌクレオチドバーコード配列を意味する）。ＰＣＲ２は、サーモサイ
クラーで以下のサイクル条件を用いて実施した：７２℃で３分を１サイクル；９８℃で２
分を１サイクル；９８℃で１０秒、６３℃で３０秒、および７２℃で２分を１５サイクル
。ここで、実行可能となったＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリであるＰＣＲ２
アンプリコンを、製造者の推奨に従いＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（
Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ａ６３８８２）を使用してクリーンアッ
プした。次に、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４３６７６６０）およびＩｌｌｕｍｉｎａシーケン
シングライブラリ末端に特異的なプライマー（フォワードプライマー配列５’－ＣＡＡＧ
ＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ－３’およびリバースプライマー配列５’－ＡＡＴ
ＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡ－３’）を使用した標準的なｑＰＣＲ定量化方
法を用いて、クリーンなＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリを定量化した。次に
Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリを等モルでプールし、製造者の推奨に従いＭ
ｉＳｅｑ試薬キットｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＭＳ－１０２－３００３）を
使用してＭｉＳｅｑ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＳＹ－４１０－１００３）で
３００塩基ペアエンドリードによってＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングに供した。少なく
とも１つの処理済みレプリケートについて各遺伝子座につき最低１０００倍の配列カバレ
ッジが生成された。処理済みおよび未処理の試料のＰＣＲ、クリーンアップ、プールおよ
びシーケンシングは別個に実施して、処理済み試料と未処理試料との間のクロスコンタミ
ネーションまたはそれから生成されるＰＣＲアンプリコンのいかなる可能性も回避した。
ＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングデータＱＣおよび変異体分析
デフォルトパラメータを用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ分析ソフトウェア（Ｍ
ｉＳｅｑレポーター、バージョン２．６．２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してアンプリコ
ン特異的ＦＡＳＴＱシーケンシングデータファイルを作成した（Ｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１０，３８（６）：１７６７－７１，ＰＭＩ
Ｄ：２００１５９７０）。次に、標準Ｐｅｒｌスクリプトラッパーを用いて一体に結合し
た一連のパブリックドメインソフトウェアパッケージからなる内部開発の変異体分析パイ
プラインでＦＡＳＴＱファイルを処理した。使用したワークフローは５段階に分けられた
。
ステージ１、ＰＣＲプライマーならびにオンターゲットおよびオフターゲット配列ＱＣ
：オンターゲット部位およびオフターゲット部位の両方について、２０ヌクレオチドｇＲ
ＮＡプロトスペーサー配列＋ＰＡＭ配列および標的特異的ＰＣＲプライマー配列（左およ
び右、追加的なＩｌｌｕｍｉｎａ配列はなし）をＢＬＡＳＴ検索（バージョン２．２．２
９＋、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５（３
）：４０３－１０，ＰＭＩＤ：２２３１７１２）を用いてヒトゲノム参照配列（ｂｕｉｌ
ｄ ＧＲＣｈ３８）とアラインメントした。複数のゲノム位置を含むオンターゲット部位
およびオフターゲット部位にフラグを立てた。
ステージ２、シーケンサーファイル解凍：ｇｚｉｐスクリプト（バージョン１．３．１
２）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサーにより作成されたＦＡＳＴＱ．ＧＺファイ
ルを解凍してＦＡＳＴＱファイルにし、ファイル当たりのリード数を計算した。リードの
ないファイルは以降の分析から除外した。
ステージ３、配列リードアラインメントおよびクオリティトリミング：ＢＷＡ－ＭＥＭ
アライナー（バージョン０．７．４－ｒ３８５、Ｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ，Ｂｉｏｉ
ｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９，２５（１４）：１７５４－６０，ＰＭＩＤ：１９４５
１１６８）を使用して、「ハードクリッピング」を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ配列のリード
の３’末端および低品質塩基をトリミングして、ＦＡＳＴＱファイルのシーケンシングリ
ードをヒトゲノム参照配列（ｂｕｉｌｄ ＧＲＣｈ３８）とアラインメントした。ＢＡＭ
ファイル形式（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９ ２５（１
６）：２０７８－９，ＰＭＩＤ：１９５０５９４３）の得られたアラインメント後のリー
ドをＳＡＭｔｏｏｌｓスクリプト（バージョン０．１．１９－４４４２８ｃｄ、Ｌｉ ｅ
ｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９ ２５（１６）：２０７８－９，Ｐ
ＭＩＤ：１９５０５９４３）を使用してＦＡＳＴＱファイルに変換した。次にＢＷＡ－Ｍ
ＥＭアライナーを今回は「ハードクリッピング」なしで使用して、ＦＡＳＴＱファイルを
再びヒトゲノム参照配列（ｂｕｉｌｄ ＧＲＣｈ３８）とアラインメントした。
ステージ４、変異体（ＳＮＰおよびインデル）分析：アレル頻度検出限界を＞＝０．０
００１に設定したＶａｒＤｉｃｔバリアントコーラー（開発者ＺｈａｎｇＷｕ Ｌｉａに
よって改良されたバージョン１．０「Ｃａｓ９アウェア（Ｃａｓ９ ａｗａｒｅ）」、Ｌ
ａｉ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１６，４４（１１）：
ｅ１０８，ＰＭＩＤ：２７０６０１４９）を使用して、アラインメントされたリードのＢ
ＡＭファイルを処理し、変異体（ＳＮＰおよびインデル）を同定した。Ｃａｓ９アウェア
ＶａｒＤｉｃｔコーラーはパブリックドメインパッケージに基づくが、変異イベントのア
ラインメント領域における反復配列に起因して生成された曖昧な変異体コールを、ＰＡＭ
配列の５’側の３塩基に位置するｇＲＮＡプロトスペーサー配列の潜在的Ｃａｓ９ヌクレ
アーゼ切断部位の方へ動かすことができる。ＳＡＭｔｏｏｌｓスクリプトを使用してサン
プルアンプリコン当たりのリードカバレッジを計算し、オンターゲット部位およびオフタ
ーゲット部位が＞１０００倍配列カバレッジでカバーされたかどうかを決定した。＜１０
００倍配列カバレッジの部位にフラグを立てた。
ステージ５、ｄｂＳＮＰフィルタリングおよび処理済み／未処理判別分析：同定された
変異体は、ｄｂＳＮＰに見られる公知の変異体（ＳＮＰおよびインデル）に関してフィル
タリングした（ｂｕｉｌｄ １４２、Ｓｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．２００１，２９（１）：３０８－１１，ＰＭＩＤ：１１１２５１２２）。
処理済みサンプルの変異体をさらにフィルタリングして、以下を除外した：１）未処理対
照サンプルに同定される変異体；２）ＶａｒＤｉｃｔ鎖バイアスが２：１の変異体（ここ
では参照配列を支持するフォワードおよびリバースリードカウントがバランスしているが
、非参照変異体コールについてはアンバランスである）；３）潜在的Ｃａｓ９切断部位の
周囲１００ｂｐウィンドウ外に位置する変異体；４）潜在的Ｃａｓ９切断部位の周囲１０
０ｂｐウィンドウ内にあるシングルヌクレオチド変異体。最後に、潜在的Ｃａｓ９切断部
位の１００ｂｐウィンドウにおける合計インデル頻度が＞２％（約１０～２０細胞超にお
ける編集）の部位のみが考慮された。ゲノム参照配列とのリードアラインメントの目視検
査を可能にするＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶバージョ
ン２．３、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１，
９（１）：２４－６，ＰＭＩＤ：２１２２１０９５）を使用して、潜在的な活性編集部位
をリードアラインメントレベルでさらに調べた。
オンターゲットおよびオフターゲット分析結果
ＢＣＬ１１＋５８領域およびＨＰＦＨ領域ｇＲＮＡのオンターゲット部位は、処理済み
サンプルにおいて意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、インデル頻度は全
てのｇＲＮＡについて８８％より高かった。表３および表５は、少なくとも１つのバイオ
ロジカルレプリケートで特徴付けられたオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられて
いない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調
査中である。
ＢＣＬ１１＋５８領域インシリコ標的分析結果
ｇＲＮＡ ＣＲ００３０９：ｇＲＮＡ ＣＲ００３０９のオンターゲット部位は意図し
たＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９２％であった。表
３１は、特徴付けられたオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰ
ＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。潜
在的オフターゲット部位の特徴付けにより、両方の処理済みレプリケートにおいて、提案
されるＣａｓ９切断部位の周囲１００ｂｐウィンドウに４つのオフターゲット部位が同定
された。部位１は約１８％の平均インデル頻度を有し、オンターゲットｇＲＮＡプロトス
ペーサー配列と比べて

を有し、およびエクソン１から約２．３ｋｂ離れた、１１番染色体上の塩基対位置２２，
１９５，８００～２２，１９５，８１９におけるアノクタミン５遺伝子（ＡＮＯ５）のイ
ントロン１に位置する。部位２は約１８％の平均インデル頻度を有し、オンターゲットｇ
ＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて

を有し、および１２番染色体上の塩基対位置３，３１１，９０１～３，３１１，９２６に
おける遺伝子間領域に位置する。部位３は約８０％の平均インデル頻度を有し、オンター
ゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて

を有し、および１番染色体上の塩基対位置２３６，０６５，４１５～２３６，０６５，４
３４におけるＧｅｎＢａｎｋ（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２０１６ Ｊａｎ ４；４４（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ６７－Ｄ
７２，ＰＭＩＤ：２６５９０４０７）転写物（ＢＣ０１２５０１ ＲｅｆＳｅｑでアノテ
ーションなし）に位置する。部位４は約２％の平均インデル頻度を有し、オンターゲット
ｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて

を有し、および１番染色体上の塩基対位置３３，４１２，６５９～３３，４１２，６７８
におけるポリホメオティック２タンパク質（ＲｅｆＳｅｑでアノテーションなし）と呼ば
れるＧｅｎＢａｎｋアノテーション付き転写物のイントロン１に位置する。
ｇＲＮＡ ＣＲ００３１１：ｇＲＮＡ ＣＲ００３１１のオンターゲット部位は意図し
たＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９５％であった。表
３１は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位
はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である
。これまでのところ、調べた部位に有意なオフターゲット活性は観察されなかった。
ｇＲＮＡ ＣＲ０００３１２：ｇＲＮＡ ＣＲ０００３１２のオンターゲット部位は意
図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９８％であった
。表３１は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない
部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中で
ある。これまでのところ、調べた部位に有意なオフターゲット活性は観察されなかった。
ｇＲＮＡ ＣＲ０００３１６：ｇＲＮＡ ＣＲ０００３１６のオンターゲット部位は意
図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９１％であった
が、しかしながらオフターゲット部位の大多数は依然として特徴付けられていない。
ｇＲＮＡ ＣＲ００１１２５：ｇＲＮＡ ＣＲ０００１１２５のオンターゲット部位は
意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９１％であっ
た。表３１は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていな
い部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中
である。これまでのところ、調べた部位に有意なオフターゲット活性は観察されなかった
。
ｇＲＮＡ ＣＲ００１１２６：ｇＲＮＡ ＣＲ０００１１２６のオンターゲット部位は
意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９２％であっ
た。表３１は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていな
い部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中
である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、これまでに、両方の処理済みレプ
リケートにおいて、提案されるＣａｓ９切断部位の周囲１００ｂｐウィンドウに２つのオ
フターゲット部位が同定された。第１の部位は約２％の平均インデル頻度を有し、オンタ
ーゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて３つのミスマッチ

を有し、および最も近いＧｅｎＢａｎｋ転写物（ＲｅｆＳｅｑでアノテーションなし）か
ら約９．５ｋｂ離れた、４番染色体上の塩基対位置３５，８８１，８１５～３５，８８１
，８３４における遺伝子間領域に位置する。第２の部位は約１．７％の平均インデル頻度
を有し、オンターゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて４つのミスマッチ

を有し、およびエクソン６から約２．７ｋｂ離れた、６番染色体上の塩基対位置１６，５
１９，９０７～１６，５１９，９２６におけるアタキシン１遺伝子（ＡＴＸＮ１）のイン
トロン６に位置する。
ｇＲＮＡ ＣＲ００１１２７：ｇＲＮＡ ＣＲ０００１１２７のオンターゲット部位は
意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９７％であっ
た。表３１は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていな
い部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中
である。これまでのところ、調べた部位に有意なオフターゲット活性は観察されなかった
。
ｇＲＮＡ ＣＲ００１１２８：ｇＲＮＡ ＣＲ０００１１２８のオンターゲット部位は
意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９４％であっ
た。表３１は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていな
い部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中
である。これまでのところ、調べた部位に有意なオフターゲット活性は観察されなかった
。
同定された全ての活性に編集されたＢＣＬ１１ ＋５８領域オフターゲット部位を手動
で調べると、Ｃａｓ９媒介性二本鎖切断の非相同末端結合ＤＮＡ修復に典型的である、提
案されるＣａｓ９切断部位を取り囲む典型的なインデルパターンが示された。同定された
部位における編集が遺伝子発現または細胞生存率に有害な影響を及ぼすかどうかは不明で
あり、さらなる分析が必要である。
ＢＣＬ１１＋５８領域ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑヒットバリデーション結果
ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１
５，３３（２）：１８７－９７，ＰＭＩＤ：２５５１３７８２）によって同定された潜在
的オフターゲットヒットをＲＮＰ処理済みおよび未処理ＨＳＰＣにおいて上記にインシリ
コで定義された部位に関して記載した標的シーケンシング方法を用いて特徴付けた。ｇＲ
ＮＡ ＣＲ００３１２、ＣＲ００３１６、ＣＲ００１１２５、ＣＲ００１１２６、ＣＲ０
０１１２７およびＣＲ００１１２８について、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ潜在的ヒットが同定さ
れた。ｇＲＮＡ ＣＲ００３１１およびＣＲ００１１２８について、潜在的ヒットは同定
されなかった。標的シーケンシングを用いて潜在的ヒットをＨＳＰＣで調べたとき、ｇＲ
ＮＡ ＣＲ００３１２、ＣＲ００１１２５およびＣＲ００１１２７について処理済みＨＳ
ＰＣでは潜在的ヒットのいずれもバリデートされなかった。ｇＲＮＡ ＣＲ００１１２６
について１つの潜在的ヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法（ｉｎ ｓｉｌｉ
ｃｏ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）によってＡＴＸＮ１のイントロン６に同定され
たのと同じ部位（６番染色体：１６，５１９，９０７～１６，５１９，９２６塩基対）で
あった。ｇＲＮＡ ＣＲ００３０９およびＣＲ００３１６の潜在的ヒットのバリデーショ
ンはなおも進行中である。
ＨＰＦＨ領域インシリコ標的分析結果
ｇＲＮＡ ＣＲ００１０２８：ｇＲＮＡ ＣＲ０００１０２８のオンターゲット部位は
意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９１％であっ
た。表３２は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていな
い部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中
である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、これまでに、両方の処理済みレプ
リケートにおいて、提案されるＣａｓ９切断部位の周囲１００ｂｐウィンドウに２つのオ
フターゲット部位が同定された。部位１は約２．８％の平均インデル頻度を有し、オンタ
ーゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて２つのミスマッチ

を有し、および４番染色体上の塩基対位置５８，１６９，３０８～５８，１６９，３２７
に位置する非コードＲＮＡ（ＬＦ３３０４１０、ＲｅｆＳｅｑでアノテーションなし）の
イントロン２に位置する。部位２は約３．５％の平均インデル頻度を有し、オンターゲッ
トｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて３つのミスマッチ

を有し、およびエクソン２から約１．３ｋｂの、６番染色体上の塩基対位置２６，３６６
，７３３～２６，３６６，７５２に位置するブチロフィリンサブファミリー３メンバーＡ
２遺伝子（ＢＴＮ３Ａ２）のイントロン１に位置する。
ｇＲＮＡ ＣＲ００１０３０：ｇＲＮＡ ＣＲ０００１０３０のオンターゲット部位は
意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約８９％であっ
た。表３２は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていな
い部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中
である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、これまでに、両方の処理済みレプ
リケートにおいて、提案されるＣａｓ９切断部位の周囲１００ｂｐウィンドウに５７％の
平均インデル頻度で１つのオフターゲット部位が同定された。この部位はオンターゲット
ｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて３つのミスマッチ

を有し、およびＸ染色体上の塩基対位置２４，５０３，４７６～２４，５０３，４９５に
位置するピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ３遺伝子（ＰＤＫ３）のエクソン４に位置
する。
ｇＲＮＡ ＣＲ００１１３７：ｇＲＮＡ ＣＲ０００１０３７のオンターゲット部位は
意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約８４％であっ
た。表３２は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていな
い部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中
である。これまでのところ、調べた部位に有意なオフターゲット活性は観察されなかった
。
ｇＲＮＡ ＣＲ００１２２１：ｇＲＮＡ ＣＲ０００１２２１のオンターゲット部位は
意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９５％であっ
た。表３２は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていな
い部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中
である。これまでのところ、調べた部位に有意なオフターゲット活性は観察されなかった
。
ｇＲＮＡ ＣＲ００３０３５：ｇＲＮＡ ＣＲ０００３０３５のオンターゲット部位は
意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約８９％であっ
た。表３２は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていな
い部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中
である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、これまでに、両方の処理済みレプ
リケートにおいて、提案されるＣａｓ９切断部位の周囲１００ｂｐウィンドウに２つのオ
フターゲット部位が同定された。部位１は約２０％の平均インデル頻度を有し、オンター
ゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて２つのミスマッチ

を有し、および２番染色体上の塩基対位置６６，２８１，７８１～６６，２８１，８００
における遺伝子間領域に位置し、最も近い転写物（ＪＤ４３２５６４、ＲｅｆＳｅｑでア
ノテーションなし）から約７．１ｋｂである。部位２は約２．５％の平均インデル頻度を
有し、オンターゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて３つのミスマッチ

を有し、および１０番染色体上の塩基対位置４２，９９７，２８９～４２，９９７，３０
８における遺伝子間領域に位置し、マイクロＲＮＡ５１００（ＭＩＲ５１００）から約０
．３ｋｂである。
ｇＲＮＡ ＣＲ００３０８５：ｇＲＮＡ ＣＲ０００３０３８のオンターゲット部位は
意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９４％であっ
た。表３２は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていな
い部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中
である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、これまでに、両方の処理済みレプ
リケートにおいて、提案されるＣａｓ９切断部位の周囲１００ｂｐウィンドウに約２％の
平均インデル頻度で１つのオフターゲット部位が同定された。この部位はオンターゲット
ｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて３つのミスマッチ

を有し、および２番染色体上の塩基対位置１７１，８７２，６３０～１７１，８７２，６
４９に位置する溶質輸送体ファミリー２５メンバー１２遺伝子（ＳＬＣ２５Ａ１２）のイ
ントロン２に位置し、エクソン３から約３．８ｋｂである。
同定された全ての活性に編集されたＨＰＦＨ領域オフターゲット部位を手動で調べると
、Ｃａｓ９媒介性二本鎖切断の非相同末端結合ＤＮＡ修復に典型的である、提案されるＣ
ａｓ９切断部位を取り囲む典型的なインデルパターンが示された。同定された部位におけ
る編集が遺伝子発現または細胞生存率に有害な影響を及ぼすかどうかは不明であり、さら
なる分析が必要である。
ＨＰＦＨ領域ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑヒットバリデーション結果
ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１
５，３３（２）：１８７－９７，ＰＭＩＤ：２５５１３７８２）を用いて同定された潜在
的オフターゲットヒットをＲＮＰ処理済みおよび未処理のＨＳＰＣにおいてインシリコ部
位に関して記載したのと同じ方法を用いて調べた。ｇＲＮＡ ＣＲ００１０２８、ＣＲ０
０１０３０、ＣＲ００３０３５およびＣＲ００３０８５についてＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ潜在
的オフターゲットヒットが（現在までのところ）同定された。ｇＲＮＡ ＣＲ００１１３
７およびＣＲ００１２２１については現在までにヒットは同定されていない。ＨＳＰＣに
おいてｇＲＮＡ ＣＲ００１０２８について１つのヒットがバリデートされ、インシリコ
主導の方法によって４番染色体上の塩基対位置５８，１６９，３０８～５８，１６９，３
２７に同定されたのと同じ部位であった。ＨＳＰＣにおいてｇＲＮＡ ＣＲ００１０３０
について１つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によってＰＤＫ３遺伝子
のエクソン４に同定されたのと同じ部位であった。ＨＳＰＣにおいてｇＲＮＡ ＣＲ００
３０３５について１つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によって２番染
色体上の塩基対位置６６，２８１，７８１～６６，２８１，８００における遺伝子間領域
に同定されたのと同じ部位であった。ＨＳＰＣにおいてｇＲＮＡ ＣＲ００３０８５につ
いて１つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によって２番染色体上の塩基
対位置１７１，８７２，６３０～１７１，８７２，６４９に同定されたのと同じ部位であ
った。
ｇＲＮＡ編集効率スクリーニングのオンターゲット分析
ｇＲＮＡオンターゲット部位を標的とするＰＣＲアンプリコンを製造者の推奨に従いＡ
ｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタ
ログ番号Ａ６３８８２）を使用してクリーンアップした。製造者の推奨を用いてＱｕａｎ
ｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタ
ログ番号Ｐ７５８１）を使用して試料を定量化した。製造者の推奨に従いＮｅｘｔｅｒａ
ＤＮＡライブラリ調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号 ＦＣ－１２１－１０
３１）を使用してアンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリに転換した
。得られたシーケンシングライブラリをＡＭＰｕｒｅビーズでクリーンアップし、ｑＰＣ
Ｒで定量化し、プールし、およびオフターゲット分析の節に記載されるとおり、Ｉｌｌｕ
ｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器で１５０塩基（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＭＳ－１０２
－２００２）または２５０塩基（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＭＳ－１０２－２００
３）のペアエンドリードを用いてシーケンシングした。各ライブラリにつき最低１０００
倍のシーケンシングカバレッジが生じ、一連のインハウススクリプトを用いて変異体をコ
ールした。簡単に言えば、ストリングベースの配列検索を用いてｇＲＮＡ配列の中央にあ
る８０～１００塩基対ウィンドウにわたるシーケンシングリードを同定し、アンプリコン
配列と比較し、配列の違いでビニングして、変異体頻度を計算した。加えて、Ｉｌｌｕｍ
ｉｎａ ＭｉＳｅｑレポーターソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａバージョン２．６．１）
を使用してシーケンシングリードをアンプリコン配列とアラインメントし、得られたリー
ドアラインメントをＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶバー
ジョン２．３、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１
１，９（１）：２４－６，ＰＭＩＤ：２１２２１０９５）を用いて調べた。
実施例１０：遺伝子編集およびＨｂＦ誘導に対するＲＮＰ濃度の評価
ＲＮＰ希釈アッセイによる遺伝子編集に最適なＲＮＰ濃度の決定
Ｃａｓ９（ｉＰｒｏｔ：１０６３３１）およびガイドリボヌクレオチド複合体（ＲＮＰ
）濃縮物の段階希釈液を用いて遺伝子編集を実施した（表３３）。使用した様々なｇＲＮ
Ａ、そのフォーマット、およびこのアッセイで適用した修飾を表３４に挙げる。
ＣＤ３４＋細胞を先述のとおりエレクトロポレートし、細胞生存率、遺伝子編集効率、
およびＨｂＦ産生能力の測定に供した。細胞生存率を評価したとき、結果は、シングルま
たはデュアルのいずれのガイドフォーマットを使用したときも、ＲＮＰ濃度の違いはエレ
クトロポレーション時の細胞生存率に影響を与えなかったことを示した（図３９Ａおよび
図３９Ｂ）。ＣＤ３４＋細胞の遺伝子編集では、ＮＧＳデータは、１．４７μＭに至るま
での低いＲＮＰ濃度が非修飾ＣＲ００３１２およびＣＲ００１１２８、および修飾ＣＲ０
０３１２について最大％遺伝子編集効率を達成した一方、修飾ＣＲ００１２２８について
最大％遺伝子編集効率は２．９４μＭもの低いＲＮＰ濃度で達成されたことを示した（図
４０Ａ）。ｓｇＲＮＡフォーマットについては、試験した全てのｇＲＮＡが、０．４８μ
Ｍに至るまでの低いＲＮＰ濃度で最大％編集率を達成した（図４０Ｂ）。遺伝子編集済み
細胞が赤血球系統に分化してＨｂＦを産生する能力の測定では、本発明者らのデータは、
ｄｇＲＮＡ含有ＲＮＰについて２．９４μＭに至るまでの低いＲＮＰ濃度（図４１Ａ）お
よびｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰについて０．９７μＭに至るまでの低いＲＮＰ濃度（図４１Ｂ
）が最高レベルのＨｂＦ誘導をもたらしたことを示した。
本願は配列表と共に出願されるものである。配列表と本明細書に記載される任意の配列
との間に相違がある範囲において、本明細書に記載される配列が正しい配列であると見な
されるべきである。特に指示されない限り、全てのゲノム位置はｈｇ３８に基づく。
参照による援用
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許
または特許出願が参照によって援用されることが具体的かつ個別的に指示されたものとし
て参照により全体として本明細書に援用される。矛盾が生じる場合、本明細書における任
意の定義を含め、本願が優先する。
均等物
当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、
またはルーチンに過ぎない実験を用いて確認することができるであろう。本発明は具体的
な態様を参照して開示されているが、本発明の他の態様および変形形態が当業者によって
本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく考案され得ることは明らかである。添
付の特許請求の範囲は、かかる態様および均等な変形形態の全てを含むものと解釈される
ことが意図される。

Claims (230)

  1. ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、前記ｃｒＲＮＡは、ＢＣＬ１
    １Ａ遺伝子（例えば、ヒトＢＣＬ１１ａ遺伝子）、ＢＣＬ１１ａエンハンサー（例えば、
    ヒトＢＣＬ１１ａエンハンサー）、またはＨＦＰＨ領域（例えば、ヒトＨＰＦＨ領域）の
    標的配列に相補的な標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子。
  2. 前記標的配列は、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のものであり、かつ前記標的化ドメインは、
    配列番号１～配列番号８５または配列番号４００～配列番号１２３１のいずれか１つを含
    む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  3. 前記標的配列は、ＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、かつ前記標的化ドメインは
    、配列番号１２３２～配列番号１４９９のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請
    求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  4. 前記標的配列は、ＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、かつ前記標的化ドメインは
    、配列番号１８２～配列番号２７７または配列番号３３４～配列番号３４１のいずれか１
    つを含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  5. 前記標的化ドメインは、配列番号３４１、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号
    ２４７、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２４４、配列番号１９９、配列番号
    ２５１、配列番号２５０、配列番号３３４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号
    ３３６、または配列番号３３７のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項４に
    記載のｇＲＮＡ分子。
  6. 前記標的化ドメインは、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号３３５、配列番号
    ３３６、配列番号３３７、または配列番号３３８のいずれか１つを含む、例えばそれから
    なる、請求項４に記載のｇＲＮＡ分子。
  7. 前記標的化ドメインは、配列番号２４８または配列番号３３８のいずれか１つを含む、
    例えばそれからなる、請求項４に記載のｇＲＮＡ分子。
  8. 前記標的化ドメインは、配列番号２４８を含む、例えばそれからなる、請求項４に記載
    のｇＲＮＡ分子。
  9. 前記標的化ドメインは、配列番号３３８を含む、例えばそれからなる、請求項４に記載
    のｇＲＮＡ分子。
  10. 前記標的配列は、ＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、かつ標的化ドメインは、配
    列番号２７８～配列番号３３３のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１に
    記載のｇＲＮＡ分子。
  11. 前記標的化ドメインは、配列番号３１８、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号
    ２９４、配列番号３１０、配列番号３１９、配列番号２９８、配列番号３２２、配列番号
    ３１１、配列番号３１５、配列番号２９０、配列番号３１７、配列番号３０９、配列番号
    ２８９、または配列番号２８１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１０
    に記載のｇＲＮＡ分子。
  12. 前記標的化ドメインは、配列番号３１８を含む、例えばそれからなる、請求項１０に記
    載のｇＲＮＡ分子。
  13. 前記標的配列は、ＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、かつ前記標的化ドメインは
    、配列番号１５９６～配列番号１６９１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請
    求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  14. 前記標的化ドメインは、配列番号１６８３、配列番号１６３８、配列番号１６４７、配
    列番号１６０９、配列番号１６２１、配列番号１６１７、配列番号１６５４、配列番号１
    ６３１、配列番号１６２０、配列番号１６３７、配列番号１６１２、配列番号１６５６、
    配列番号１６１９、配列番号１６７５、配列番号１６４５、配列番号１５９８、配列番号
    １５９９、配列番号１６６３、配列番号１６７７、または配列番号１６２６のいずれか１
    つを含む、例えばそれからなる、請求項１３に記載のｇＲＮＡ分子。
  15. 前記標的配列は、ＨＦＰＨ領域（例えば、フランス型ＨＰＦＨ領域）のものであり、か
    つ前記標的化ドメインは、配列番号８６～配列番号１８１、配列番号１５００～配列番号
    １５９５、または配列番号１６９２～配列番号１７６１のいずれか１つを含む、例えばそ
    れからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  16. 前記標的化ドメインは、配列番号１００、配列番号１６５、配列番号１１３、配列番号
    ９９、配列番号１１２、配列番号９８、配列番号１５８０、配列番号１０６、配列番号１
    ５０３、配列番号１５８９、配列番号１６０、配列番号１５３７、配列番号１５９、配列
    番号１０１、配列番号１６２、配列番号１０４、配列番号１３８、配列番号１５３６、配
    列番号１５３９、配列番号１５８５のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項
    １５に記載のｇＲＮＡ分子。
  17. 前記標的化ドメインは、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１５０５、配列番号
    １５８９、配列番号１７００、または配列番号１７５０のいずれか１つを含む、例えばそ
    れからなる、請求項１５に記載のｇＲＮＡ分子。
  18. 前記標的化ドメインは、配列番号１００、配列番号１６５、または配列番号１１３のい
    ずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１５に記載のｇＲＮＡ分子。
  19. 前記標的化ドメインは、前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１
    ８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸を含む、例えばそれか
    らなる、請求項２～１８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  20. 前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、
    ２２、２３、または２４個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の３’
    末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する
    核酸である、請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子。
  21. 前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、
    ２２、２３、または２４個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の５’
    末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する
    核酸である、請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子。
  22. 前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、
    ２２、２３、または２４個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の５’
    核酸または３’核酸のいずれも含まない、請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子。
  23. 前記標的化ドメインは、前記記載される標的化ドメイン配列からなる、請求項２～２２
    のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  24. 前記ｃｒＲＮＡの一部分と前記ｔｒａｃｒの一部分とは、ハイブリダイズして、配列番
    号６５８４または６５８５を含むフラッグポールを形成する、請求項１～２３のいずれか
    一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  25. 前記フラッグポールは、前記フラッグポールの前記ｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する
    第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第１のフラッグポール伸長部は、配列番
    号６５８６を含む、請求項２４に記載のｇＲＮＡ分子。
  26. 前記フラッグポールは、前記フラッグポールの前記ｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する
    第２のフラッグポール伸長部および存在する場合には前記第１のフラッグポール伸長部を
    さらに含み、前記第２のフラッグポール伸長部は、配列番号６５８７を含む、請求項２４
    または２５に記載のｇＲＮＡ分子。
  27. 前記ｔｒａｃｒは、配列番号６６６０または配列番号６６６１を含む、請求項１～２６
    のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  28. 前記ｔｒａｃｒは、配列番号７８１２を含み、任意選択で３’末端に追加の１、２、３
    、４、５、６、または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、請求項１～２６
    のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  29. 前記ｃｒＲＮＡは、５’から３’に、［標的化ドメイン］－：
    ａ）配列番号６５８４；
    ｂ）配列番号６５８５；
    ｃ）配列番号６６０５；
    ｄ）配列番号６６０６；
    ｅ）配列番号６６０７；
    ｆ）配列番号６６０８；または
    ｇ）配列番号７８０６
    を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  30. 前記ｔｒａｃｒは、５’から３’に、
    ａ）配列番号６５８９；
    ｂ）配列番号６５９０；
    ｃ）配列番号６６０９；
    ｄ）配列番号６６１０；
    ｅ）配列番号６６６０；
    ｆ）配列番号６６６１；
    ｇ）配列番号７８１２；
    ｈ）配列番号７８０７；
    ｉ）（配列番号７８０８；
    ｊ）配列番号７８０９；
    ｋ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオ
    チド、例えば１、２、３、４、５、６、または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさら
    に含む前記ａ）～ｊ）のいずれか；
    ｌ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオ
    チド、例えば１、２、３、４、５、６、または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさら
    に含む前記ａ）～ｋ）のいずれか；または
    ｍ）５’末端に（例えば、５’側端に）少なくとも１、２、３、４、５、６または７個の
    アデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６、または７個のアデニン（
    Ａ）ヌクレオチドをさらに含む前記ａ）～ｌ）のいずれか
    を含む、請求項１～２３または２９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  31. 前記標的化ドメインと前記ｔｒａｃｒとは、別個の核酸分子に配置され、前記標的化ド
    メインを含む前記核酸分子は配列番号６６０７を含み、配列番号６６０７は任意選択で前
    記標的化ドメインのすぐ３’側に配置され、および前記ｔｒａｃｒを含む前記核酸分子は
    、配列番号６６６０を含む、例えばそれからなる、請求項１～２３のいずれか一項に記載
    のｇＲＮＡ分子。
  32. 前記フラッグポールの前記ｃｒＲＮＡ部分は、配列番号６６０７または配列番号６６０
    ８を含む、請求項２７または２８に記載のｇＲＮＡ分子。
  33. 前記ｔｒａｃｒは、配列番号６５８９または６５９０と、任意選択で、第１のフラッグ
    ポール伸長部が存在する場合、配列番号６５８９または６５９０の５’側に配置された第
    １のｔｒａｃｒ伸長部とを含み、前記第１のｔｒａｃｒ伸長部は、配列番号６５９１を含
    む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  34. 前記標的化ドメインと前記ｔｒａｃｒとは、別個の核酸分子に配置される、請求項１～
    ３３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  35. 前記標的化ドメインと前記ｔｒａｃｒとは、単一の核酸分子に配置され、前記ｔｒａｃ
    ｒは、前記標的化ドメインの３’側に配置される、請求項１～３３のいずれか一項に記載
    のｇＲＮＡ分子。
  36. 前記標的化ドメインの３’側かつ前記ｔｒａｃｒの５’側に配置されたループをさらに
    含む、請求項３５に記載のｇＲＮＡ分子。
  37. 前記ループは、配列番号６５８８を含む、請求項３６に記載のｇＲＮＡ分子。
  38. ５’から３’に、［標的化ドメイン］－：
    （ａ）配列番号６６０１；
    （ｂ）配列番号６６０２；
    （ｃ）配列番号６６０３；
    （ｄ）配列番号６６０４；
    （ｅ）配列番号７８１１；または
    （ｆ）３’末端に１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさ
    らに含む前記（ａ）～（ｅ）のいずれか
    を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  39. 前記標的化ドメインと前記ｔｒａｃｒとは、単一の核酸分子に配置され、前記核酸分子
    は、前記標的化ドメインと配列番号７８１１とを含み、例えばそれからなり、配列番号７
    ８１１は任意選択で前記標的化ドメインのすぐ３’側に配置される、請求項１～４０のい
    ずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  40. 前記ｇＲＮＡ分子を含む前記核酸分子の１つまたは任意選択で２つ以上は、
    ａ）前記１つまたは複数の核酸分子の３’末端における１つ以上、例えば３つのホスホロ
    チオエート修飾；
    ｂ）前記１つまたは複数の核酸分子の５’末端における１つ以上、例えば３つのホスホロ
    チオエート修飾；
    ｃ）前記１つまたは複数の核酸分子の前記３’末端における１つ以上、例えば３つの２’
    －Ｏ－メチル修飾；
    ｄ）前記１つまたは複数の核酸分子の前記５’末端における１つ以上、例えば３つの２’
    －Ｏ－メチル修飾；
    ｅ）前記１つまたは複数の核酸分子の末端から４番目、末端から３番目、および末端から
    ２番目の３’残基の各々における２’Ｏ－メチル修飾；
    ｆ）前記１つまたは複数の核酸分子の末端から４番目、末端から３番目、および末端から
    ２番目の５’残基の各々における２’Ｏ－メチル修飾；または
    ｆ）これらの任意の組み合わせ
    を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  41. 配列：
    （ａ）配列番号３４２；
    （ｂ）配列番号３４３；または
    （ｃ）配列番号１７６２
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  42. （ａ）配列番号３４４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６
    ０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号３４４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号３４５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０
    を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
    （ｄ）配列番号３４５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  43. 配列：
    （ａ）配列番号３４７；
    （ｂ）配列番号３４８；または
    （ｃ）配列番号１７６３
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  44. （ａ）配列番号３４９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６
    ０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号３４９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号３５０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０
    を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
    （ｄ）配列番号３５０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  45. 配列：
    （ａ）配列番号３５１；
    （ｂ）配列番号３５２；または
    （ｃ）配列番号１７６４
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  46. （ａ）配列番号３５３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６
    ０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号３５３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号３５４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０
    を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
    （ｄ）配列番号３５４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  47. 配列：
    （ａ）配列番号３５５；
    （ｂ）配列番号３５６；または
    （ｃ）配列番号１７６５
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  48. （ａ）配列番号３５７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６
    ０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号３５７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号３５８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０
    を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
    （ｄ）配列番号３５８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  49. 配列：
    （ａ）配列番号３５９；
    （ｂ）配列番号３６０；または
    （ｃ）配列番号１７６６
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  50. （ａ）配列番号３６１を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６
    ０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号３６１を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号３６２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０
    を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
    （ｄ）配列番号３６２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  51. 配列：
    （ａ）配列番号３６３；
    （ｂ）配列番号３６４；または
    （ｃ）配列番号１７６７
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  52. （ａ）配列番号３６５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６
    ０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号３６５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号３６６を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０
    を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
    （ｄ）配列番号３６６を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  53. 配列：
    （ａ）配列番号３６７；
    （ｂ）配列番号３６８；または
    （ｃ）配列番号１７６８
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  54. （ａ）配列番号３６９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６
    ０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号３６９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号３７０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０
    を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
    （ｄ）配列番号３７０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  55. 配列：
    （ａ）配列番号３７１；
    （ｂ）配列番号３７２；または
    （ｃ）配列番号１７６９
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  56. （ａ）配列番号３７３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６
    ０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号３７３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号３７４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０
    を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
    （ｄ）配列番号３７４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  57. 配列：
    （ａ）配列番号３７５；
    （ｂ）配列番号３７６；または
    （ｃ）配列番号１７７０
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  58. （ａ）配列番号３７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６
    ０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号３７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号３７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０
    を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
    （ｄ）配列番号３７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  59. 配列：
    （ａ）配列番号３７９；
    （ｂ）配列番号３８０；または
    （ｃ）配列番号１７７１
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  60. （ａ）配列番号３８１を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６
    ０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号３８１を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号３８２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０
    を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
    （ｄ）配列番号３８２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  61. 配列：
    （ａ）配列番号３８３；
    （ｂ）配列番号３８４；または
    （ｃ）配列番号１７７２
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  62. （ａ）配列番号３８５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６
    ０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号３８５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号３８６を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０
    を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
    （ｄ）配列番号３８６を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  63. 配列：
    （ａ）配列番号３８７；
    （ｂ）配列番号３８８；または
    （ｃ）配列番号１７７３
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  64. （ａ）配列番号３８９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６
    ０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号３８９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号３９０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０
    を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
    （ｄ）配列番号３９０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  65. 配列：
    （ａ）配列番号３９１；
    （ｂ）配列番号３９２；または
    （ｃ）配列番号１７７４
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  66. （ａ）配列番号３９３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６
    ０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号３９３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号３９４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０
    を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
    （ｄ）配列番号３９４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  67. 配列：
    （ａ）配列番号３９５；
    （ｂ）配列番号３９６；または
    （ｃ）配列番号１７７５
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  68. （ａ）配列番号３９７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６
    ０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｂ）配列番号３９７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
    （ｃ）配列番号３９８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０
    を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
    （ｄ）配列番号３９８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を
    含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
    を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  69. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおり
    のＲＮＰ）が細胞に導入されると、インデルは、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメイン
    と相補的な前記標的配列にまたはその近傍に形成される、請求項１～６８のいずれか一項
    に記載のｇＲＮＡ分子。
  70. 前記インデルは、ＧＡＴＡ－１またはＴＡＬ－１結合部位のヌクレオチドを含まない、
    請求項６９に記載のｇＲＮＡ分子。
  71. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおり
    のＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、インデルは、前記集団の細胞の少なくとも約４
    ０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０
    ％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％
    、例えば少なくとも約９６％、例えば少なくとも約９７％、例えば少なくとも約９８％、
    例えば少なくとも約９９％において、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインと相補的な
    前記標的配列にまたはその近傍に形成される、請求項１～７０のいずれか一項に記載のｇ
    ＲＮＡ分子。
  72. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおり
    のＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、ＧＡＴＡ－１またはＴＡＬ－１結合部位のヌク
    レオチドを含まないインデルは、前記集団の細胞の少なくとも約２０％、例えば少なくと
    も約３０％、例えば少なくとも約３５％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも
    約４５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約
    ６０％、例えば少なくとも約６５％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７
    ５％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、例えば少なくとも約９０
    ％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９９％において、前記ｇＲＮＡ分子
    の前記標的化ドメインと相補的な前記標的配列にまたはその近傍に形成される、請求項１
    ～６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  73. 前記インデルは、前記集団の細胞の少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、
    例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例
    えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例え
    ば少なくとも約９６％、例えば少なくとも約９７％、例えば少なくとも約９８％、例えば
    少なくとも約９９％において、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７のいずれか
    に挙げられるインデルである、請求項７１または７２に記載のｇＲＮＡ分子。
  74. 前記細胞の集団中において最も高頻度で検出される３つのインデルは、図２５、表１５
    、表２６、表２７または表３７のいずれかに挙げられる任意のｇＲＮＡ分子に関連するイ
    ンデルを含む、請求項７１～７３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  75. 前記インデルは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって計測されるとおりである、
    請求項６９～７４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  76. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおり
    のＲＮＰ）が細胞に導入されると、胎児ヘモグロビンの発現は、前記細胞またはその子孫
    、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において増加する、請求項１～７
    ５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  77. 胎児ヘモグロビンの発現は、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例え
    ばその赤血球細胞子孫において少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば
    少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少
    なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％、例えば少な
    くとも約９５％、例えば少なくとも約９６％、例えば少なくとも約９７％、例えば少なく
    とも約９８％、例えば少なくとも約９９％増加する、請求項７６に記載のｇＲＮＡ分子。
  78. 前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫は、１
    細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも
    約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、または約８
    ～約９ピコグラム、または約９～約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、請
    求項７６または７７に記載のｇＲＮＡ分子。
  79. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおり
    のＲＮＰ）が細胞に導入されると、オフターゲットインデル、例えば次世代シーケンシン
    グおよび／またはヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲット
    インデルは、前記細胞において形成されない、請求項１～７８のいずれか一項に記載のｇ
    ＲＮＡ分子。
  80. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおり
    のＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、オフターゲットインデル、例えば次世代シーケ
    ンシングおよび／またはヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフター
    ゲットインデルは、前記細胞の集団の細胞の約５％超、例えば約１％超、例えば約０．１
    ％超、例えば約０．０１％超において検出されない、請求項１～７８のいずれか一項に記
    載のｇＲＮＡ分子。
  81. 前記細胞は、哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞であり、例えばヒト細胞である
    （または細胞の集団はそれを含む）、請求項６９～８０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ
    分子。
  82. 前記細胞は、ＨＳＰＣである（または細胞の集団はそれを含む）、請求項８１に記載の
    ｇＲＮＡ分子。
  83. 前記ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋である、請求項８２に記載のｇＲＮＡ分子。
  84. 前記ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋である、請求項８３に記載のｇＲＮＡ分子。
  85. 前記細胞は、前記細胞が投与される患者にとって自己由来である、請求項６９～８４の
    いずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  86. 前記細胞は、前記細胞が投与される患者にとって同種異系由来である、請求項６９～８
    ４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  87. １）請求項１～８６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ
    分子を含む）、およびＣａｓ９分子；
    ２）請求項１～８６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分
    子を含む）、およびＣａｓ９分子をコードする核酸；
    ３）請求項１～８６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分
    子を含む）をコードする核酸、およびＣａｓ９分子；
    ４）請求項１～８６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分
    子を含む）をコードする核酸、およびＣａｓ９分子をコードする核酸；または
    ５）前記１）～４）のいずれか、および鋳型核酸；または
    ６）前記１）～４）のいずれか、および鋳型核酸をコードする配列を含む核酸
    を含む組成物。
  88. Ｃａｓ９分子をさらに含む、請求項１～８６のいずれか一項に記載の第１のｇＲＮＡ分
    子を含む組成物。
  89. 前記Ｃａｓ９分子は、活性または不活性化膿レンサ球菌（ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａ
    ｓ９である、請求項８７または８８に記載の組成物。
  90. 前記Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１を含む、請求項８７～８９のいずれか一項に記
    載の組成物。
  91. 前記Ｃａｓ９分子は、
    （ａ）配列番号７８２１；
    （ｂ）配列番号７８２２；
    （ｃ）配列番号７８２３；
    （ｄ）配列番号７８２４；
    （ｅ）配列番号７８２５；
    （ｆ）配列番号７８２６；
    （ｇ）配列番号７８２７；
    （ｈ）配列番号７８２８；
    （ｉ）配列番号７８２９；
    （ｊ）配列番号７８３０；または
    （ｋ）配列番号７８３１
    を含む、例えばそれからなる、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の組成物。
  92. 前記第１のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子は、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）に
    存在する、請求項８８～９１のいずれか一項に記載の組成物。
  93. 第２のｇＲＮＡ分子；第２のｇＲＮＡ分子および第３のｇＲＮＡ分子；または第２のｇ
    ＲＮＡ分子、任意選択で第３のｇＲＮＡ分子、および任意選択で第４のｇＲＮＡ分子をさ
    らに含み、前記第２のｇＲＮＡ分子、前記任意選択の第３のｇＲＮＡ分子、および前記任
    意選択の第４のｇＲＮＡ分子は、請求項１～６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子で
    あり、前記組成物の各ｇＲＮＡ分子は、異なる標的配列と相補的である、請求項８７～９
    ２のいずれか一項に記載の組成物。
  94. 前記第１のｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子、前記任意選択の第３のｇＲＮＡ分
    子、および前記任意選択の第４のｇＲＮＡ分子の２つ以上は、同じ遺伝子または領域内の
    標的配列と相補的である、請求項９３に記載の組成物。
  95. 前記第１のｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子、前記任意選択の第３のｇＲＮＡ分
    子、および前記任意選択の第４のｇＲＮＡ分子は、２００００ヌクレオチド以下、１００
    ００ヌクレオチド以下、６０００以下、５０００ヌクレオチド以下、４０００以下、１０
    ００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌク
    レオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以
    下、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５０ヌクレ
    オチド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下また
    は１０ヌクレオチド以下離れた標的配列と相補的である、請求項９３または９４に記載の
    組成物。
  96. 前記第１のｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子、前記任意選択の第３のｇＲＮＡ分
    子、および前記任意選択の第４のｇＲＮＡ分子の２つ以上は、異なる遺伝子または領域内
    の標的配列と相補的である、請求項９３に記載の組成物。
  97. 第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および第
    ２のｇＲＮＡ分子は、
    （ａ）請求項４に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補
    的であるか；
    （ｂ）請求項５に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補
    的であるか；
    ｃ）請求項６に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的
    であるか；または
    （ｄ）請求項７に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補
    的であるか；または
    （ｅ）請求項４１～５６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、か
    つ異なる標的配列に相補的である、請求項９４または９５に記載の組成物。
  98. 第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および第
    ２のｇＲＮＡ分子は、
    （ａ）請求項１０に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相
    補的であるか；または
    （ｂ）請求項１１に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相
    補的である、請求項９４または９５に記載の組成物。
  99. 第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および第
    ２のｇＲＮＡ分子は、
    （ａ）請求項１３に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相
    補的であるか；または
    （ｂ）請求項１４に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相
    補的である、請求項９４または９５に記載の組成物。
  100. 第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および第
    ２のｇＲＮＡ分子は、
    （ａ）請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相
    補的であるか；
    （ｂ）請求項１７に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相
    補的であるか；
    （ｃ）請求項１８に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相
    補的であるか；または
    （ｄ）請求項５７～６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、か
    つ異なる標的配列に相補的である、請求項９４～９６のいずれか一項に記載の組成物。
  101. 第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、
    （１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項４に記載のｇＲＮＡ分子から選択される
    か、（ｂ）請求項５に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項６に記載のｇ
    ＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）請求項７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、
    または（ｅ）請求項４１～５６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；およ
    び
    （２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１０に記載のｇＲＮＡ分子から選択され
    るか、または（ｂ）請求項１１に記載のｇＲＮＡ分子から選択される、請求項９４～９６
    のいずれか一項に記載の組成物。
  102. 第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、
    （１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項４に記載のｇＲＮＡ分子から選択される
    か、（ｂ）請求項５に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項６に記載のｇ
    ＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）請求項７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、
    または（ｅ）請求項４１～５６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；およ
    び
    （２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１３に記載のｇＲＮＡ分子から選択され
    、（ｂ）請求項１４に記載のｇＲＮＡ分子から選択される、請求項９４～９６のいずれか
    一項に記載の組成物。
  103. 第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、
    （１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項４に記載のｇＲＮＡ分子から選択される
    か、（ｂ）請求項５に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項６に記載のｇ
    ＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）請求項７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、
    または（ｅ）請求項４１～５６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；およ
    び
    （２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子から選択され
    るか、（ｂ）請求項１７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項１８に記
    載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）請求項５７～６８のいずれか一項に記
    載のｇＲＮＡ分子から選択される、請求項９４～９６のいずれか一項に記載の組成物。
  104. 第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、
    （１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１０に記載のｇＲＮＡ分子から選択され
    るか、または（ｂ）請求項１１に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；および
    （２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１３に記載のｇＲＮＡ分子から選択され
    、（ｂ）請求項１４に記載のｇＲＮＡ分子から選択される、請求項９４～９６のいずれか
    一項に記載の組成物。
  105. 第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、
    （１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１０に記載のｇＲＮＡ分子から選択され
    るか、または（ｂ）請求項１１に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；および
    （２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子から選択され
    るか、（ｂ）請求項１７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項１８に記
    載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）請求項５７～６８のいずれか一項に記
    載のｇＲＮＡ分子から選択される、請求項９４～９６のいずれか一項に記載の組成物。
  106. 第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、
    （１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１３に記載のｇＲＮＡ分子から選択され
    、（ｂ）請求項１４に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；および
    （２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子から選択され
    るか、（ｂ）請求項１７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項１８に記
    載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）請求項５７～６８のいずれか一項に記
    載のｇＲＮＡ分子から選択される、請求項９４～９６のいずれか一項に記載の組成物。
  107. 第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、
    （１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子から選択され
    るか、（ｂ）請求項１７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項１８に記
    載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）請求項５７～６８のいずれか一項に記
    載のｇＲＮＡ分子から選択され；および（２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、βグロビン遺
    伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むか、または
    （１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項４に記載のｇＲＮＡ分子から選択される
    か、（ｂ）請求項５に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項６に記載のｇ
    ＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）請求項７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、
    （ｅ）請求項４１～５６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｆ）
    請求項１０に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｇ）請求項１１に記載のｇＲＮＡ
    分子から選択されるか、（ｈ）請求項１３に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、また
    は（ｉ）請求項１４に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；および（２）前記第２のｇＲＮ
    Ａ分子は、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む、請求項９６に
    記載の組成物。
  108. 前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、請求項４１～６８のいずれ
    か一項に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択される、請求項９４～９６のいずれか一項
    に記載の組成物。
  109. 前記組成物の前記ｇＲＮＡ分子成分に関して、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分
    子とからなる、請求項８７～１０８のいずれか一項に記載の組成物。
  110. 前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子、例えば請求項９０ま
    たは９１に記載のＣａｓ９分子と共にリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中にある、請求
    項８７～１０９のいずれか一項に記載の組成物。
  111. 鋳型核酸を含み、前記鋳型核酸は、前記第１のｇＲＮＡ分子の前記標的配列にまたはそ
    の近傍にあるヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む、請求項８７～１１０のいずれ
    か一項に記載の組成物。
  112. 前記鋳型核酸は、
    （ａ）ヒトβグロビン、例えば突然変異Ｇ１６Ｄ、Ｅ２２ＡおよびＴ８７Ｑの１つ以上を
    含むヒトβグロビン、もしくはその断片；または
    （ｂ）ヒトγグロビン、もしくはその断片
    をコードする核酸を含む、請求項１１１に記載の組成物。
  113. エレクトロポレーションに好適な媒体中に製剤化される、請求項８７～１１２のいずれ
    か一項に記載の組成物。
  114. 前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子と共にＲＮＰ中にあり
    、前記ＲＮＰの各々は、約１０μＭ未満、例えば約３μＭ未満、例えば約１μＭ未満、例
    えば約０．５μＭ未満、例えば約０．３μＭ未満、例えば約０．１μＭ未満の濃度である
    、請求項８７～１１３のいずれか一項に記載の組成物。
  115. 請求項１～６８のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列
    。
  116. 前記核酸は、前記１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする前記配列に作動可能に連結され
    たプロモーターを含む、請求項１１５に記載の核酸配列。
  117. 前記プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによっ
    て認識されるプロモーターである、請求項１１６に記載の核酸配列。
  118. 前記プロモーターは、Ｕ６プロモーターまたはＨＩプロモーターである、請求項１１７
    に記載の核酸配列。
  119. 前記核酸は、Ｃａｓ９分子をさらにコードする、請求項１１５～１１８のいずれか一項
    に記載の核酸配列。
  120. 前記Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１、配列番号７８２１、配列番号７８２２、配列
    番号７８２３、配列番号７８２４、配列番号７８２５、配列番号７８２６、配列番号７８
    ２７、配列番号７８２８、配列番号７８２９、配列番号７８３０、または配列番号７８３
    １のいずれかを含む、請求項１１９に記載の核酸配列。
  121. 前記核酸は、Ｃａｓ９分子をコードする前記配列に作動可能に連結されたプロモーター
    を含む、請求項１１９または１２０に記載の核酸配列。
  122. 前記プロモーターは、ＥＦ－１プロモーター、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ
    －１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ（
    ＰＧＫ）プロモーターである、請求項１２１に記載の核酸配列。
  123. 請求項１１５～１２２のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
  124. 前記ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイ
    ルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニ
    サークル、ナノプラスミド、およびＲＮＡベクターからなる群から選択される、請求項１
    ２３に記載のベクター。
  125. 細胞（例えば、細胞の集団）を前記細胞内の標的配列でまたはその近傍で改変する（例
    えば、核酸の構造（例えば、配列）を改変する）方法であって、前記細胞（例えば、細胞
    の集団）を、
    １）請求項１～６８のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分
    子；
    ２）請求項１～６８のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分
    子をコードする核酸；
    ３）請求項１～６８のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、
    およびＣａｓ９分子；
    ４）請求項１～６８のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、
    およびＣａｓ９分子をコードする核酸；
    ５）前記１）～４）のいずれか、および鋳型核酸；
    ６）前記１）～４）のいずれか、および鋳型核酸をコードする配列を含む核酸；
    ７）請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の組成物；または
    ８）請求項１２３または１２４に記載のベクター
    と接触させる（例えば、それに導入する）ステップを含む方法。
  126. 前記ｇＲＮＡ分子または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、前記Ｃａｓ９分子また
    は前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸とは、単一の組成物に製剤化される、請求項１２５
    に記載の方法。
  127. 前記ｇＲＮＡ分子または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、前記Ｃａｓ９分子また
    は前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸とは、２つ以上の組成物に製剤化される、請求項１
    ２５に記載の方法。
  128. 前記２つ以上の組成物は、同時にまたは逐次的に送達される、請求項１２７に記載の方
    法。
  129. 前記細胞は、動物細胞である、請求項１２５～１２８のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記細胞は、哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞である、請求項１２５～１２８
    のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記細胞は、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）である、
    請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記細胞は、ＣＤ３４＋細胞である、請求項１２５～１３１のいずれか一項に記載の方
    法。
  133. 前記細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である、請求項１２５～１３２のいずれか一項
    に記載の方法。
  134. 前記細胞は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物中に配置され
    る、請求項１２５～１３３のいずれか一項に記載の方法。
  135. 前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、動員末梢血または臍帯血から単離されてい
    る、請求項１２５～１３４のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記細胞は、前記細胞が投与される患者にとって自己由来または同種異系由来である、
    請求項１２５～１３５のいずれか一項に記載の方法。
  137. 前記改変は、前記１つ以上のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインと相補的なゲノムＤＮ
    Ａ配列にまたはその近傍にインデルをもたらす、請求項１２５～１３６のいずれか一項に
    記載の方法。
  138. 前記インデルは、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデルで
    ある、請求項１３７に記載の方法。
  139. 前記インデルは、約４０ヌクレオチド未満、例えば３０ヌクレオチド未満、例えば２０
    ヌクレオチド未満、例えば１０ヌクレオチド未満の挿入または欠失である、請求項１３７
    または１３８に記載の方法。
  140. 前記インデルは、単一のヌクレオチド欠失である、請求項１３９に記載の方法。
  141. 細胞の集団をもたらし、前記集団の細胞の少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６
    ０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０
    ％（例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくと
    も約９８％、または少なくとも約９９％）は、改変されている、例えばインデルを含む、
    請求項１３７～１４０のいずれか一項に記載の方法。
  142. 前記改変は、赤血球系統の分化細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞（
    例えば、細胞の集団）をもたらし、前記分化細胞は、胎児ヘモグロビンの増加したレベル
    、例えば非改変細胞（例えば、細胞の集団）と比べて胎児ヘモグロビンの増加したレベル
    を呈する、請求項１２５～１４１のいずれか一項に記載の方法。
  143. 前記改変は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の
    集団）への分化能を有する細胞の集団をもたらし、前記分化細胞の集団は、Ｆ細胞の増加
    した割合、例えば非改変細胞の集団と比べてＦ細胞の増加した割合（例えば、少なくとも
    約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、または少な
    くとも約４０％高い）を有する、請求項１２５～１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 前記改変は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を
    有する細胞をもたらし、前記分化細胞は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例え
    ば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム
    、少なくとも約１０ピコグラム、または約８～約９ピコグラム、または約９～約１０ピコ
    グラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、請求項１２５～１４２のいずれか一項に記載の
    方法。
  145. 請求項１２５～１４４のいずれか一項に記載の方法によって改変された細胞。
  146. 請求項１２５～１４４のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能な細胞。
  147. 請求項１～６８のいずれか一項に記載の第１のｇＲＮＡ分子、または請求項８７～１１
    ４のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１５～１２２のいずれか一項に記載の核酸、
    または請求項１２３もしくは１２４に記載のベクターを含む細胞。
  148. Ｃａｓ９分子を含む、請求項１４７に記載の細胞。
  149. 前記Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１、配列番号７８２１、配列番号７８２２、配列
    番号７８２３、配列番号７８２４、配列番号７８２５、配列番号７８２６、配列番号７８
    ２７、配列番号７８２８、配列番号７８２９、配列番号７８３０、または配列番号７８３
    １のいずれかを含む、請求項１４８に記載の細胞。
  150. 請求項１～６８のいずれか一項に記載の第２のｇＲＮＡ分子、または請求項１～６８の
    いずれか一項に記載の第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含むか、それを含んでいた
    か、またはそれを含むことになり、前記第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は
    、同一でない標的化ドメインを含む、請求項１４５～１４９のいずれか一項に記載の細胞
    。
  151. 胎児ヘモグロビンの発現は、ｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じ細胞型の
    細胞またはその子孫と比べて前記細胞またはその子孫（例えば、その赤血球系子孫、例え
    ばその赤血球細胞子孫）において増加する、請求項１４５～１５０のいずれか一項に記載
    の細胞。
  152. 分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分
    化細胞は、胎児ヘモグロの増加したレベル、例えばｇＲＮＡ分子を含むように修飾されて
    いない同じタイプの細胞と比べて胎児ヘモグロの増加したレベルを呈する、請求項１４５
    ～１５０のいずれか一項に記載の細胞。
  153. 前記分化細胞（例えば、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞）は、少なくとも約６ピ
    コグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも
    約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、または約８～約９ピコグラム、または約
    ９～約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを、例えばｇＲＮＡ分子を含むように修飾さ
    れていない同じタイプの細胞と比べて、産生する、請求項１５２に記載の細胞。
  154. 幹細胞増殖剤と接触されていた、請求項１４５～１５３のいずれか一項に記載の細胞。
  155. 前記幹細胞増殖剤は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、またはこれらの組み
    合わせ（例えば、化合物１および化合物４）である、請求項１５４に記載の細胞。
  156. 前記幹細胞増殖剤は、化合物４である、請求項１５５に記載の細胞。
  157. 請求項１～６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインと相補的な
    ゲノムＤＮＡ配列にまたはその近傍にインデルを含む細胞、例えば請求項１４５～１５６
    のいずれか一項に記載の細胞。
  158. 前記インデルは、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデルで
    ある、請求項１５７に記載の細胞。
  159. 前記インデルは、約４０ヌクレオチド未満、例えば３０ヌクレオチド未満、例えば２０
    ヌクレオチド未満、例えば１０ヌクレオチド未満の挿入または欠失である、請求項１５７
    または１５８に記載の細胞。
  160. 前記インデルは、単一のヌクレオチド欠失である、請求項１５７～１５９のいずれか一
    項に記載の細胞。
  161. 動物細胞である、請求項１４５～１６０のいずれか一項に記載の細胞。
  162. 哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞である、請求項１６１に記載の細胞。
  163. 造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）である、請求項１４５
    ～１６２のいずれか一項に記載の細胞。
  164. ＣＤ３４＋細胞である、請求項１４５～１６３のいずれか一項に記載の細胞。
  165. ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である、請求項１６４に記載の細胞。
  166. 前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、動員末梢血または臍帯血から単離されてい
    る、請求項１４５～１６５のいずれか一項に記載の細胞。
  167. 前記細胞が投与される患者にとって自己由来である、請求項１４５～１６６のいずれか
    一項に記載の細胞。
  168. 前記細胞が投与される患者にとって同種異系由来である、請求項１４５～１６６のいず
    れか一項に記載の細胞。
  169. 請求項１４５～１６８のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞の集団。
  170. 前記集団の細胞の少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも
    約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％（例えば、少なくとも
    約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少な
    くとも約９９％）は、請求項１４５～１６８のいずれか一項に記載の細胞である、請求項
    １６９に記載の細胞の集団。
  171. 分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分
    化能を有し、前記分化細胞の集団は、Ｆ細胞の増加した割合、例えば同じタイプの修飾さ
    れていない細胞の集団と比べてＦ細胞の増加した割合（例えば、少なくとも約１５％、少
    なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０
    ％高い）を有する、請求項１６９または１７０に記載の細胞の集団。
  172. 前記分化細胞の集団のＦ細胞は、１細胞当たり平均で少なくとも約６ピコグラム（例え
    ば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム
    、少なくとも約１０ピコグラム、または約８～約９ピコグラム、または約９～約１０ピコ
    グラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、請求項１７１に記載の細胞の集団。
  173. １）少なくとも１ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ、
    ２）少なくとも２ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ、
    ３）少なくとも３ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ、
    ４）少なくとも４ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ、ま
    たは
    ５）２ｅ６～１０ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ
    を含む、請求項１６９～１７２のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  174. 前記集団の細胞の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％（例えば、少なくと
    も約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％）は
    、ＣＤ３４＋細胞である、請求項１６９～１７３のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  175. 前記集団の細胞の少なくとも約１０％、例えば少なくとも約１５％、例えば少なくとも
    約２０％、例えば少なくとも約３０％は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である、請求項１７
    ４に記載の細胞の集団。
  176. 骨髄に由来する、請求項１６９～１７５のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  177. 哺乳動物細胞、例えばヒト細胞を含む、例えばそれからなる、請求項１６９～１７６の
    いずれか一項に記載の細胞の集団。
  178. 前記細胞の集団が投与される患者に対して自己由来である、請求項１６９～１７７のい
    ずれか一項に記載の細胞の集団。
  179. 前記細胞の集団が投与される患者に対して同種異系由来である、請求項１６９～１７７
    のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  180. 請求項１４５～１６８のいずれか一項に記載の細胞または請求項１６９～１７９のいず
    れか一項に記載の細胞の集団を含む組成物。
  181. 薬学的に許容可能な媒体、例えば凍結保存に好適である薬学的に許容可能な媒体を含む
    、請求項１８０に記載の組成物。
  182. 異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、請求項１４５～１６８のいずれか一項に
    記載の細胞、請求項１６９～１７９のいずれか一項に記載の細胞の集団、または請求項１
    ８０もしくは１８１に記載の組成物を患者に投与するステップを含む方法。
  183. 哺乳動物における胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、請求項１４５～１
    ６８のいずれか一項に記載の細胞、請求項１６９～１７９のいずれか一項に記載の細胞の
    集団、または請求項１８０もしくは１８１に記載の組成物を患者に投与するステップを含
    む方法。
  184. 前記異常ヘモグロビン症は、β－サラセミアまたは鎌状赤血球症である、請求項１８２
    に記載の方法。
  185. 細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法であって、
    （ａ）細胞（例えば、細胞の集団）（例えば、ＨＳＰＣ（例えば、ＨＳＰＣの集団））を
    提供するステップ；
    （ｂ）幹細胞増殖剤を含む細胞培養培地中で前記細胞（例えば、前記細胞の集団）をエキ
    ソビボで培養するステップ；および
    （ｃ）請求項１～６８のいずれか一項に記載の第１のｇＲＮＡ分子、請求項１～６８のい
    ずれか一項に記載の第１のｇＲＮＡ分子をコードする核酸分子、請求項８７～１１４のい
    ずれか一項に記載の組成物、請求項１１５～１２２のいずれか一項に記載の核酸、または
    請求項１２３もしくは１２４に記載のベクターを前記細胞に導入するステップ
    を含む方法。
  186. 前記ステップ（ｃ）の導入の後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、分化細胞（例え
    ば、分化細胞の集団）、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球系統の細胞の集団）、
    例えば赤血球細胞（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞（例え
    ば、分化細胞の集団）は、増加した胎児ヘモグロビン、例えばステップ（ｃ）に供されて
    いない同じ細胞と比べて増加した胎児ヘモグロビンを産生する、請求項１８５に記載の方
    法。
  187. 前記幹細胞増殖剤は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４またはこれらの組み合
    わせ（例えば、化合物１および化合物４）である、請求項１８５または１８６に記載の方
    法。
  188. 前記幹細胞増殖剤は、化合物４である、請求項１８７に記載の方法。
  189. 前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ
    ）、およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む、請求項１８５～１８８のいずれか一項に記
    載の方法。
  190. 前記細胞培養培地は、ヒトインターロイキン－６（ＩＬ－６）をさらに含む、請求項１
    ８９に記載の方法。
  191. 前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ
    ）、およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をそれぞれ約１０ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍ
    Ｌの範囲の濃度で含む、請求項１８９または１９０に記載の方法。
  192. 前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ
    ）、およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をそれぞれ約５０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば５０ｎ
    ｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１９１に記載の方法。
  193. 前記細胞培養培地は、ヒトインターロイキン－６（ＩＬ－６）を約１０ｎｇ／ｍＬ～約
    １０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で含む、請求項１９０～１９２のいずれか一項に記載の
    方法。
  194. 前記細胞培養培地は、ヒトインターロイキン－６（ＩＬ－６）を約５０ｎｇ／ｍＬの濃
    度、例えば５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１９３に記載の方法。
  195. 前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約１ｎＭ～約１ｍＭの範囲の濃度で含む、請求項
    １８５～１９４のいずれか一項に記載の方法。
  196. 前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約１μＭ～約１００μＭの範囲の濃度で含む、請
    求項１９５に記載の方法。
  197. 前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約５０μＭ～約７５μＭの範囲の濃度で含む、請
    求項１９６に記載の方法。
  198. 前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約５０μＭの濃度、例えば５０μＭの濃度で含む
    、請求項１９７に記載の方法。
  199. 前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約７５μＭの濃度、例えば７５μＭの濃度で含む
    、請求項１９７に記載の方法。
  200. 前記ステップ（ｂ）の培養は、前記ステップ（ｃ）の導入の前の培養期間を含む、請求
    項１８５～１９９のいずれか一項に記載の方法。
  201. 前記ステップ（ｃ）の導入の前の前記培養期間は、少なくとも１２時間、例えば約１日
    ～約３日の期間であり、例えば約１日～約２日の期間であり、例えば約２日の期間である
    、請求項２００に記載の方法。
  202. 前記ステップ（ｂ）の培養は、前記ステップ（ｃ）の導入の後の培養期間を含む、請求
    項１８５～２０１のいずれか一項に記載の方法。
  203. 前記ステップ（ｃ）の導入の後の前記培養期間は、少なくとも１２時間、例えば約１日
    ～約１０日の期間であり、例えば約１日～約５日の期間であり、例えば約２日～約４日の
    期間であり、例えば約２日の期間であり、または約３日の期間であり、または約４日の期
    間である、請求項２０２に記載の方法。
  204. 前記細胞の集団は、少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍
    、例えばステップ（ｂ）によって培養されていない細胞と比べて、増殖する、請求項１８
    ５～２０３のいずれか一項に記載の方法。
  205. 前記ステップ（ｃ）の導入は、エレクトロポレーションを含む、請求項１８５～２０４
    のいずれか一項に記載の方法。
  206. 前記エレクトロポレーションは、１～５パルス、例えば１パルスを含み、各パルスは、
    ７００ボルト～２０００ボルトの範囲のパルス電圧であり、かつ１０ｍｓ～１００ｍｓの
    範囲のパルス持続時間を有する、請求項２０５に記載の方法。
  207. 前記エレクトロポレーションは、１パルスを含む、請求項２０６に記載の方法。
  208. 前記パルス電圧は、１５００～１９００ボルトの範囲、例えば１７００ボルトである、
    請求項２０６または２０７に記載の方法。
  209. 前記パルス持続時間は、１０ｍｓ～４０ｍｓの範囲、例えば２０ｍｓである、請求項２
    ０６～２０８のいずれか一項に記載の方法。
  210. ステップ（ａ）で提供される前記細胞（例えば、細胞の集団）は、ヒト細胞（例えば、
    ヒト細胞の集団）である、請求項１８５～２０９のいずれか一項に記載の方法。
  211. ステップ（ａ）で提供される前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、末梢血（例え
    ば、動員末梢血）または臍帯血から単離されたものである、請求項２１０に記載の方法。
  212. ステップ（ａ）で提供される前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄から単離された
    ものである、例えば異常ヘモグロビン症に罹患している患者の骨髄から単離されたもので
    ある、請求項２１１に記載の方法。
  213. ステップ（ａ）で提供される前記細胞の集団は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化されたも
    のである、請求項１８５～２１２のいずれか一項に記載の方法。
  214. 前記ステップ（ｃ）の導入の後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、凍結保存される
    、請求項１８５～２１３のいずれか一項に記載の方法。
  215. 前記ステップ（ｃ）の導入の後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、前記第１のｇＲ
    ＮＡ分子の前記標的化ドメインと相補的なゲノムＤＮＡ配列にまたはその近傍にインデル
    を含む、請求項１８５～２１４のいずれか一項に記載の方法。
  216. 前記インデルは、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデルで
    ある、請求項１３２に記載の方法。
  217. 前記ステップ（ｃ）の導入の後、前記細胞の集団の細胞の少なくとも約５０％、少なく
    とも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なく
    とも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少
    なくとも約９９％は、前記第１のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインと相補的なゲノムＤ
    ＮＡ配列にまたはその近傍にインデルを含む、請求項１８５～２１６のいずれか一項に記
    載の方法。
  218. 前記細胞の集団の細胞の各々における前記インデルは、図２５、表１５、表２６、表２
    ７または表３７に示されるインデルである、請求項２１７に記載の方法。
  219. 請求項１８５～２１８のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能な細胞（例
    えば、細胞の集団）。
  220. 異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、請求項２１９に記載の細胞（例えば、細
    胞の集団）を含む組成物をヒト患者に投与するステップを含む方法。
  221. ヒト患者における胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、請求項２１９に記
    載の細胞（例えば、細胞の集団）を含む組成物を前記ヒト患者に投与するステップを含む
    方法。
  222. 前記異常ヘモグロビン症は、β－サラセミアまたは鎌状赤血球症である、請求項２２０
    に記載の方法。
  223. 前記ヒト患者は、前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ｅ６個の請求項２１
    ９に記載の細胞、例えば前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ｅ６個の請求項
    ２１９に記載のＣＤ３４＋細胞を含む組成物を投与される、請求項２２０～２２２のいず
    れか一項に記載の方法。
  224. 前記ヒト患者は、前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の請求項２１
    ９に記載の細胞、例えば前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の請求項
    ２１９に記載のＣＤ３４＋細胞を含む組成物を投与される、請求項２２３に記載の方法。
  225. 前記ヒト患者は、前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり約２ｅ６～約１０ｅ６個の請求項２
    １９に記載の細胞、例えば前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６～約１０
    ｅ６個の請求項２１９に記載のＣＤ３４＋細胞を含む組成物を投与される、請求項２２３
    に記載の方法。
  226. 薬剤として用いられる、請求項１～８６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項
    ８７～１１４または１８０もしくは１８１のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１５
    ～１２２のいずれか一項に記載の核酸、請求項１２３または１２４に記載のベクター、請
    求項１４５～１６８または２１９のいずれか一項に記載の細胞、あるいは請求項１６９～
    １７９のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  227. 薬剤の製造に用いられる、請求項１～８６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求
    項８７～１１４または１８０もしくは１８１のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１
    ５～１２２のいずれか一項に記載の核酸、請求項１２３または１２４に記載のベクター、
    請求項１４５～１６８または２１９のいずれか一項に記載の細胞、あるいは請求項１６９
    ～１７９のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  228. 疾患の治療に用いられる、請求項１～８６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求
    項８７～１１４または１８０もしくは１８１のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１
    ５～１２２のいずれか一項に記載の核酸、請求項１２３または１２４に記載のベクター、
    請求項１４５～１６８または２１９のいずれか一項に記載の細胞、あるいは請求項１６９
    ～１７９のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  229. 疾患の治療に用いられ、前記疾患は、異常ヘモグロビン症である、請求項１～８６のい
    ずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項８７～１１４または１８０もしくは１８１のい
    ずれか一項に記載の組成物、請求項１１５～１２２のいずれか一項に記載の核酸、請求項
    １２３または１２４に記載のベクター、請求項１４５～１６８または２１９のいずれか一
    項に記載の細胞、あるいは請求項１６９～１７９のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  230. 疾患の治療に用いられ、前記異常ヘモグロビン症は、β－サラセミアまたは鎌状赤血球
    症である、請求項１～８６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項８７～１１４ま
    たは１８０もしくは１８１のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１５～１２２のいず
    れか一項に記載の核酸、請求項１２３または１２４に記載のベクター、請求項１４５～１
    ６８または２１９のいずれか一項に記載の細胞、または請求項１６９～１７９のいずれか
    一項に記載の細胞の集団。
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